CN109844108A - 通过调控丝氨酰-trna合成酶(serrs)的磷酸化控制血管发生 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于通过调控丝氨酰‑tRNA合成酶(SerRS)的磷酸化来调节血管发生并减少肿瘤进展的方法和组合物。还公开了用于治疗疾病诸如癌症的相关的组合物和方法。

Description

通过调控丝氨酰-TRNA合成酶(SERRS)的磷酸化控制血管发生

关于联邦赞助的研发的声明

本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的R01 GM088278和NS085092在政府支持下做出的。政府在本发明中具有某些权利。

对序列表的引用

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列列表以名为PCTSEQLISTING.TXT的文件提供，该文件创建于2017年8月9日，其大小为56Kb。电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入本文。

背景

本公开内容涉及分子生物学领域和医学领域。本文公开的内容包括用于通过调控丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)的磷酸化来调控受试者中血管发生(angiogenesis)和肿瘤进展的组合物和方法，以及用于治疗疾病诸如癌症的相关的组合物和方法。

SerRS是氨基酰-tRNA合成酶家族的成员，负责将丝氨酸加载到其关联tRNA(cognate tRNA)上以生成用于蛋白生物合成的底物。研究已经表明SerRS在血管发育中独立于其氨基酰化活性的作用。

概述

本文公开了一种减少受试者中肿瘤进展的方法，其中所述方法包括：向有需要的受试者施用包含突变体丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)蛋白的组合物，其中所述突变体SerRS蛋白是磷酸化缺陷的突变体SerRS蛋白，由此减少受试者中的肿瘤进展。

在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白具有降低的通过共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ataxia telangiectasiamutated kinase；ATM)、共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶(ataxiatelangiectasia and Rad3-related kinase；ATR)或两者的磷酸化水平。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白的最大磷酸化水平小于对应的野生型SerRS蛋白的最大磷酸化水平的50％。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白的最大磷酸化水平小于对应的野生型SerRS蛋白的最大磷酸化水平的10％。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基S101、S241或两者处的氨基酸取代。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含相对于对应的野生型SerRS蛋白的氨基酸取代X101A、S241A或两者，其中X是丝氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸缺失，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在残基X101、S241或两者处的氨基酸缺失，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白是脊椎动物SerRS蛋白。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白是人类SerRS蛋白。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46的残基X101和S241中的一个或两者处的氨基酸缺失，其中X是丝氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中氨基酸取代选自由以下组成的组：丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸和丝氨酸-至-苯丙氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中氨基酸取代是丝氨酸-至-丙氨酸或丝氨酸-至-甘氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。

在一些实施方案中，肿瘤进展的减少通过减少受试者中的血管发生实现。在一些实施方案中，血管发生是低氧诱导的血管发生。在一些实施方案中，肿瘤进展是转移。在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤是肉瘤、癌(carcinoma)、淋巴瘤或其组合。在一些实施方案中，肿瘤是血液恶性肿瘤(hematological malignancy)。在一些实施方案中，肿瘤是宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、黑素瘤、卵巢癌、肺癌、肾细胞癌、神经鞘瘤、间皮瘤、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia)、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤或其组合。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的突变体SerRS蛋白阻遏受试者中血管内皮生长因子(VEGF)的转录。在一些实施方案中，VEGF是VEGFA。在一些实施方案中，与未接受治疗的受试者相比，受试者中的肿瘤进展减少了至少50％。

本文还公开了突变体丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)蛋白，其中突变体SerRS蛋白是磷酸化缺陷的。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的X101、S241或两者处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含相对于对应的野生型SerRS蛋白的氨基酸取代X101A、S241A或两者，其中X是丝氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸缺失，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的丝氨酸101、丝氨酸241或两者处的氨基酸缺失。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白是脊椎动物蛋白。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白是人类蛋白。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44或SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在残基X101和S241中的一个或两者处的氨基酸缺失，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1中的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中氨基酸取代选自：丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸和丝氨酸-至-苯丙氨酸。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1中的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中氨基酸取代是丝氨酸-至-丙氨酸或丝氨酸-至-甘氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。

本文还公开了突变体丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)蛋白，其中与对应的野生型SerRS蛋白相比，突变体SerRS蛋白在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的，或者在刺激VEGF转录方面是有效的。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基X101、S241或两者处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含相对于对应的野生型SerRS蛋白的氨基酸取代X101D、S241D或两者，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白是脊椎动物蛋白。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白是人类蛋白。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44或SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46中的氨基酸残基X101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸或苏氨酸，并且其中氨基酸取代是丝氨酸-至-天冬氨酸、丝氨酸-至-谷氨酸、苏氨酸-至-天冬氨酸或苏氨酸-至-谷氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白不阻遏VEGF转录。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白刺激VEGF转录。

本文还公开了一种药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或更多种本文公开的突变体SerRS蛋白；以及药学上可接受的赋形剂。

本文还公开了一种促进受试者中血管发生的方法。在一些实施方案中，该方法包括：向有需要的受试者施用包含突变体丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)蛋白的组合物，其中与对应的野生型SerRS蛋白相比，突变体SerRS蛋白在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的，或者在刺激VEGF转录方面是有效的，由此促进受试者中的血管发生。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物。在一些实施方案中，受试者罹患缺血性心脏病、心血管疾病和神经疾病中的一种或更多种。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的50％。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白不阻遏VEGF转录。在一些实施方案中，突变体SerRS刺激VEGF转录。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的X101、S241或两者处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含相对于对应的野生型SerRS蛋白的氨基酸取代X101D、S241D或两者，其中X是丝氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白是脊椎动物蛋白。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白是人类蛋白。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44或SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46中的残基X101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸或苏氨酸，并且其中氨基酸取代是丝氨酸-至-天冬氨酸、丝氨酸-至-谷氨酸、苏氨酸-至-天冬氨酸或苏氨酸-至-谷氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

本文还公开了一种减少受试者中血管发生的方法。在一些实施方案中，该方法包括：向有需要的受试者施用包含丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)磷酸化抑制剂的组合物，由此减少受试者中的血管发生。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂是用于共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ATM)、共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶(ATR)或两者的抑制剂。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂是ATM抑制剂。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂是ATR抑制剂。

附图简述

图1A-图1G示出了SerRS对于低氧诱导的VEGFA表达是重要的，并且SerRS在低氧下在丝氨酸101残基和丝氨酸241残基处通过ATM激酶和ATR激酶被磷酸化。在图1A中，将HEK293细胞用靶向SerRS(sh-SerRS)或GlyRS(sh-GlyRS)的shRNA或非特异性对照shRNA(sh-对照)转染。在转染后48小时，将细胞在低氧或常氧(normoxia)条件下培养12小时。将细胞裂解物用抗SerRS、抗GlyRS和抗β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹(左)。通过qRT-PCR测量VEGFA表达水平(右)，并且在低氧下VEGFA转录的相对诱导被绘图(右，插图)(来自四组独立实验的平均值±SEM；*P<0.01，**P<0.0001)。图1B示出了人类SerRS的丝氨酸101和丝氨酸241(阴影部分)的侧翼序列与其他无脊椎动物和脊椎动物SerRS序列的相同区域的比对。保守的ATM/ATR底物基序残基标有下划线。在图1C中，将重组的加his6标签的人类SerRS或GlyRS与γ-³²P-ATP和HEK293细胞核提取物孵育，所述HEK293细胞核提取物用或不用模拟DNA损伤刺激以活化ATM/ATR/DNA-PK激酶的双链DNA寡聚物处理。然后将重组蛋白通过Ni-NTA珠纯化，并经受SDS-PAGE和放射自显影术。在图1D中，将重组的加his6标签的两种人类氨基酰tRNA合成酶(AARS)：TyrRS和GlyRS、野生型SerRS或具有丝氨酸101和丝氨酸241被丙氨酸单取代或双取代的SerRS突变体(S101A、S241A和S101A/S241A)如图1C中描述的处理，并且在将磷酸化的重组蛋白通过Ni-NTA珠纯化之后用指示的抗体进行免疫印迹。在图1E中，将HEK293细胞在低氧下培养3小时、6小时和12小时。在SerRS蛋白被免疫沉淀(IP)后，将磷酸化的SerRS用特异性抗p-SQ抗体进行免疫印迹。将细胞裂解物用用于已知的ATM和ATR底物(Chk1和P53)的指示的抗体进行免疫印迹。在图1F中，将加Flag标签的野生型SerRS构建体和突变体SerRS构建体转染到HEK293细胞中。在转染后24小时，将细胞用低氧应激处理12小时，并且然后将异位表达的SerRS使用抗Flag抗体通过免疫沉淀(IP)纯化，并用抗P-SQ抗体和抗Flag抗体进行免疫印迹(IB)。在图1G中，将HEK293细胞用针对ATM(si-ATM)或ATR(si-ATR)的siRNA转染，并用低氧应激处理12小时。将磷酸化的SerRS如图1E中描述的进行免疫印迹。将细胞裂解物用抗ATM抗体和抗ATR抗体进行免疫印迹。

图2A-图2G示出了在丝氨酸101和丝氨酸241处的SerRS磷酸化抑制了其在阻遏VEGFA表达和血管发育中的功能。在图2A中，野生型SerRS(SerRS^WT)、其具有丝氨酸101和丝氨酸241被丙氨酸或天冬氨酸残基双取代的突变体(SerRS^S101A/S241A和SerRS^S101D/S241D)、或空载体被转染到HEK293细胞中。SerRS蛋白的表达水平通过免疫印迹测量(下图)，并且VEGFA表达通过qRT-PCR确定(来自三组独立实验的平均值±SEM；***P<0.0001)。在图2B-图2D中，通过将SerRS^S101A/S241AmRNA和SerRS^S101D/S241DmRNA共注射到斑马鱼单细胞期胚胎中，检查了SerRS^S101A/S241A和SerRS^S101D/S241D在斑马鱼中体内调控血管发育中的作用，该斑马鱼单细胞期胚胎的内源性SerRS通过注射反义吗啉代(antisense morpholino)(SerRS-MO)被敲低，导致Vegfa的异常高表达和过度血管化(在图2C中用短粗箭头示出)。在受精后3天(dpf)，收获胚胎并通过qRT-PCR测量Vegfa表达水平(平均值±SEM，n＝125-211；*P<0.01，**P<0.001)(B)。在3dpf，检查节间血管(ISV)的发育(C)，并分析通过SerRS^WTmRNA或突变体SerRSmRNA注射补救的ISV异常分支的统计数据(D；χ²-检验，*相比于SerRS^WT，P>0.05，**相比于SerRS-MO，P>0.1，***相比于对照-MO，P<1×10^-28)。在图2E中，通过EMSA检查SerRS^WT或SerRS^S101D/S241D与³²P标记的对应于人类VEGFA启动子上的SerRS结合位点的DNA片段的结合亲和力。在图2F中，通过染色质免疫沉淀(ChIP)和qPCR检查HEK293细胞中VEGFA启动子上SerRS^WT、SerRS^S101A/S241A或SerRS^S101D/S241D的结合(来自两组独立实验的平均值±SEM；***P<0.0001)。在图2G中，通过ChIP监测低氧过程期间VEGFA启动子上内源性SerRS的结合(来自三组独立实验的平均值±SEM；*P<0.05、**P<0.005，相比于正常)。

图3A-图3C示出了SerRS通过ATM/ATR的磷酸化是调控低氧下VEGFA诱导的重要途径。在图3A中，将HEK293细胞用特异性ATM抑制剂KU-55933(5μM)或特异性ATR抑制剂VE-821(5μM)预处理，然后在低氧下应激处理另外12小时。然后通过qRT-PCR测量VEGFA mRNA水平(来自两组独立实验的平均值±SEM；*P<0.05、**P<0.0001)。在图3B中，将HEK293细胞用SerRS^WT构建体或SerRS^S101A/S241A构建体或空的对照载体瞬时转染。在转染后24小时，通过qRT-PCR监测12小时低氧处理对VEGFA mRNA的诱导(来自四组独立实验的平均值±SEM；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.005)。在图3C中，将HEK293细胞用指示的构建体瞬时转染。在转染后36小时，通过qRT-PCR监测12小时低氧处理对VEGFA mRNA的诱导(来自四组独立实验的平均值±SEM；*P<0.01、**P<0.001、***P<0.0001)。SerRS、HIF-1α和β-肌动蛋白的蛋白水平通过蛋白印迹检查(下图)。

图4A-图4C示出了通过在丝氨酸101和丝氨酸241处磷酸化的SerRS失活对在低氧下的血管发生是重要的。在图4A中，将小鼠3B11内皮细胞用小鼠野生型SerRS或突变体SerRS稳定转染，并且SerRS的表达通过用抗SerRS抗体的免疫印迹检查并通过条带的密度进行定量。在图4B-图4C中，基质胶栓(matrigel plug)血管发生测定用稳定转染的3B11细胞在C3H/HeJ小鼠中进行。将在植入后14天切下的基质胶栓(虚线包围的区域)通过针对CD31的免疫组织化学进行分析(图4B)，并量化微血管密度(图4C)(n＝10-15)。

图5A-图5F示出了磷酸化缺陷的SerRS可以强烈地阻抑肿瘤血管发生和肿瘤生长。在图5A中，将人类乳腺癌细胞MDA-MB-231用人类野生型(SerRS^WT)和突变体SerRS(SerRS^AA、SerRS^DD)稳定转染。SerRS的表达通过免疫印迹监测。在图5B-图5C中，将工程化的MDA-MB-231细胞(每只小鼠10⁶个)植入小鼠的哺乳动物腺体中的脂肪垫中以形成肿瘤异种移植物。14天后，切下肿瘤异种移植物，并经受针对CD31的免疫组织化学(图5B)，以及随后的血管定量(图5C)(n＝5-6)。在图5D-图5F中，将稳定转染了SerRS^WT、SerRS^AA、HIF1特异性shRNA(HIF^KD)、SerRS^AA和HIF^KD两者或空载体的MDA-MB-231细胞(每只小鼠10⁶个)植入小鼠的哺乳动物腺体中的脂肪垫中。测量肿瘤异种移植物的大小，直至小鼠在35天被处死(图5D)，并通过针对CD31(图5E)和VEGFA(图5F)的免疫组织化学测量肿瘤血管发生(n＝4-10)。比例尺代表100μm。

图6示出了低氧诱导的血管发生中ATM/ATR-SerRS途径的说明性示意图。

图7A-图7D与图1A-图1G相关，示出了SerRS在低氧和UV辐射下通过ATM/ATR激酶被磷酸化。图7A是示出了在低氧应激下12小时，HEK293细胞中SerRS蛋白水平未改变的免疫印迹。在图7B中，将重组野生型SerRS蛋白和突变体SerRS蛋白与HEK293细胞核提取物在含有γ-³²P-ATP和活化ATM/ATR/DNA-PK激酶的双链DNA寡聚物的缓冲液中孵育。然后将加his6标签的SerRS蛋白通过Ni-NTA纯化并经受SDS-PAGE和放射自显影术。在图7C中，将HEK293细胞用特异性ATM抑制剂KU-55933和ATR抑制剂VE-821预处理1小时，并然后在低氧条件下培养12小时。使细胞裂解物经受用抗SerRS抗体的IP，随后为用抗P-SQ抗体的免疫印迹(IB)，以检测磷酸化的SerRS(P-SerRS)。已知的ATM/ATR底物(Chk1和Chk2)的磷酸化也被免疫印迹。在图7D中，将HEK293细胞暴露于50J/cm²UV光，并如图7C中描述的使细胞裂解物经受IP和IB。

图8A-图8D与图2A-图2G相关，示出了在丝氨酸101和丝氨酸241处的SerRS磷酸化不影响其细胞核定位及其与SIRT2的相互作用。在图8A中，将HEK293细胞在低氧下培养12小时，并经受细胞分级分离(cell fractionation)。通过用抗SerRS抗体、抗细胞核蛋白核纤层蛋白A/C抗体和抗胞质蛋白α-微管蛋白抗体的免疫印迹检查胞质级分(Cy)、细胞核级分(Nu)和全细胞裂解物(WCL)。在图8B中，将HEK293细胞用加Flag标签的SerRS^WT、SerRS^{S101A /S241A}或SerRS^S101D/S241D转染，并经受细胞分级分离以及用抗Flag抗体、抗核纤层蛋白A/C抗体和抗α-微管蛋白抗体的IB。在图8C中，将HEK293细胞在低氧下培养6小时和12小时。然后将细胞裂解，并经受用抗SerRS抗体的IP，以及用抗SerRS抗体和抗SIRT2抗体两者的IB。在图8D中，将HEK293细胞用加V5标签的SIRT2和加Flag标签的野生型SerRS或突变体SerRS共转染。在转染之后24小时，使细胞裂解物经受用抗Flag抗体的IP，以及用抗V5抗体的IB。

图9与图4A-图4F相关，示出了来自用小鼠3B11细胞进行基质胶栓血管发生测定的图像。通过使用抗HIF-1α抗体的免疫组织化学检查基质胶栓中的低氧环境(以虚线包围)。

图10示出了对SerRS上潜在磷酸化位点的修饰如何影响VEGFA表达。

图11示出了人类SerRS蛋白、小鼠SerRS蛋白、斑马鱼SerRS蛋白和蛙SerRS蛋白的序列比对。人类SerRS上的多个磷酸化位点(例如T22、S79、S86、S101、S142、T214、S217、Y220、Y248、S255、S258、S262、Y263、T501和S241)以及它们在小鼠SerRS蛋白、斑马鱼SerRS蛋白和蛙SerRS蛋白中的对应氨基酸残基以粗体并突出示出。

图12示出了通过染色质IP(ChIP)监测的在低氧过程期间在HEK293细胞中VEGFA启动子上内源性SerRS、c-Myc和Hif1α的结合(来自三组独立实验的平均值±SEM；**相比于0h，P<0.005)。

详述

在以下的详述中，参考了形成详述的一部分的附图。在附图中，相似的符号通常识别相似的组分，除非上下文另外规定。详述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案不意味是限制性的。可以利用其他实施方案，并且可以作出其他变化，而不偏离本文提出的主题的精神或范围。将容易地理解的是，如本文通常描述的和附图中说明的，本公开内容的方面可以以多种不同的配置被布置、取代、组合、分离和设计，其全部在本文中被明确地预期。

一般技术

除非另外指出，本文描述的技术的实践可以采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学、测序技术以及微米制造和纳米制造的常规技术和描述，这些都在本领域技术人员的技术内。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接以及利用标记物的杂交检测。合适的技术的具体说明可以通过参考本文的实施例获得。然而，当然也可以使用其他等同的常规程序。这样的常规技术和描述可见于标准实验室手册，诸如Green等人编辑，Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)(1999)；Weiner,Gabriel,Stephens编辑，Genetic Variation:A LaboratoryManual(2007)；Dieffenbach,Dveksler编辑，PCR Primer:A Laboratory Manual(2003)；Bowtell和Sambrook,DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual(2003)；Mount,Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis(2004)；Sambrook和Russell,CondensedProtocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2006)；以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2002)(全部来自Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Stryer,Biochemistry(第4版)(1995)W.H.Freeman,New YorkN.Y.；Gait,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(2002)IRL Press,London；Nelson和Cox,Lehninger,Principles of Biochemistry(2000)第3版，W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Berg等人，Biochemistry(2002)第5版，W.H.FreemanPub.,New York,N.Y.,Jaeger,Introduction to Microelectronic Fabrication(2002)第2版，Prentice Hall和Madou,Fundamentals of Microfabrication(2002)，以上全部通过引用以其整体并入本文，以用于所有目的。

一些定义

除非另外定义，本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。参见，例如Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第2版，J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)。本文提及的所有公开物通过引用并入本文，以用于描述和公开可以结合当前描述的方法和公开内容使用的装置、制剂和方法的目的。

为了本公开内容的目的，下文定义了以下术语。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物，例如至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、1,000个或更多个氨基酸的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包括例如修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还包括天然地修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。该定义中还包括例如含有氨基酸的一种或更多种类似物(包括例如非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其他修饰的多肽。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，指聚合形式的任何长度的核苷酸，例如至少8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、1,000个或更多个核苷酸，并且可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)、以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。它还包括例如通过烷基化和/或通过加帽修饰的多核苷酸，以及未修饰的形式的多核苷酸。更具体地，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，无论是剪接的或非剪接的，为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷的任何其他类型的多核苷酸，以及含有非核苷酸(nonnucleotidic)骨架的其他聚合物，例如聚酰胺(例如肽核酸(“PNA”))和聚吗啉代(作为Neugene从Anti-Virals,Inc.、Corvallis、OR.商购可得)聚合物以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是聚合物包含呈允许诸如可见于DNA和RNA中的碱基配对和碱基堆积的构型的核碱基(nucleobase)。因此，这些术语包括，例如3'-脱氧-2',5'-DNA、寡脱氧核糖核苷酸N3'至P5'氨基磷酸酯、2'-O-烷基取代的RNA、DNA和RNA之间的杂交体或者PNA和DNA或RNA之间的杂交体，并且还包括已知类型的修饰，例如标记；烷基化；“帽”；用类似物取代一个或更多个核苷酸；核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷的连接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的那些修饰、具有带负电荷的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些修饰、以及具有带正电荷的连接(例如氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯)的那些修饰；含有悬垂部分(pendant moiety)诸如例如蛋白(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的那些修饰；含有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些修饰；含有螯合物(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些修饰；含有烷化剂的那些修饰；具有修饰连接(例如α异头(anomeric)核酸等)的那些修饰；以及未修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。

如本文使用的，在两个蛋白序列或两个核苷酸序列的上下文中，“序列同一性”或“同一性”或“同源性”包括意指当在指定的比较窗口上进行最大一致性(maximumcorrespondence)比对时，两个序列中相同的氨基酸残基或核苷酸。为了对两个序列进行最佳比对，比较窗口中的氨基酸序列或核苷酸序列的部分可以包含与参考序列相比的添加或缺失(即空位)。当序列同一性的百分比用于提及蛋白时，应当认识到，不相同的残基位置通常由保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸被取代为具有相似的化学特性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并因此不改变分子的功能特性。在序列在保守取代中不同的情况下，序列同一性百分比可以被向上调整来校正取代的保守性质。以这样的保守取代不同的序列被表述为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这些调整的手段是本领域技术人员熟知的。百分比被如下计算：通过确定两个序列中存在相同的氨基酸残基或核酸碱基残基所在的位置的数量来产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数量，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。通常，这包括将保守取代作为部分而非完全错配来评分，从而增加序列同一性百分比。因此，例如当相同的氨基酸被给予1分的评分并且非保守取代被给予0分的评分时，保守取代被给予0分和1分之间的评分。保守取代的评分根据例如Meyers和Miller的算法(Computer Applic.Biol.Sci.,1998,4,11-17)计算。

如本文使用的，术语“同源物”用于指通过对天然存在的核酸(即“原型(prototype)”或“野生型”核酸)或氨基酸进行微小修饰而与天然存在的核酸或蛋白不同，但保持天然存在的形式的基本核苷酸或蛋白结构的核酸或蛋白。这样的变化包括但不限于：在一个或几个核苷酸中的变化，包括缺失(例如核酸的截短形式)、插入和/或取代。与天然存在的核酸相比，同源物可以具有增强的、降低的或基本相似的特性。同源物可以与天然存在的核酸互补或匹配。同源物可以使用本领域已知的用于核酸产生的技术产生，包括但不限于重组DNA技术、化学合成或其任何组合。

如本文使用的，“互补或匹配”是指两个核酸序列具有至少50％的序列同一性。例如，两种核酸序列可以具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。“互补或匹配”还指两个核酸序列可以在低、中和/或高严谨条件下杂交。

如本文使用的，“实质互补或实质匹配”是指两个核酸序列具有至少90％的序列同一性。例如，两个核酸序列可以具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可选地，“实质互补或实质匹配”是指两个核酸序列可以在高严谨条件下杂交。

如本文使用的，术语“受试者”是诸如脊椎动物(例如斑马鱼)的动物，优选地是哺乳动物。术语“哺乳动物”被定义为属于哺乳动物纲的个体，并且包括但不限于人类、家畜和农场动物、以及动物园动物、运动或宠物动物，诸如绵羊、狗、马、猫或牛。在一些实施方案中，受试者是小鼠或大鼠。在一些实施方案中，受试者是人类。

如本文使用的，术语“治疗”是指响应于由患者，特别是罹患一种或更多种血管发生相关疾病和/或癌症的患者表现的疾病、紊乱或生理状况进行的干预。治疗的目的可以包括但不限于以下中的一种或更多种：减轻(alleviation)或预防症状，减缓或停止疾病、紊乱或状况的进展或恶化以及减轻(remission)疾病、紊乱或状况。在一些实施方案中，“治疗”是指治疗性治疗和/或预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施。需要治疗的那些患者包括已经被疾病或紊乱或不希望的生理状况影响的那些患者，以及其中疾病或紊乱或不希望的生理状况待被预防的那些患者。如本文使用的，术语“预防(prevention)”是指减少以后表现疾病症状的个体的负担的任何活动。这可以在一级、二级和/或三级预防水平进行，其中：a)一级预防避免症状/紊乱/状况的发展；b)二级预防活动针对状况/紊乱/症状治疗的早期阶段，由此增加干预预防状况/紊乱/症状的进展和症状的出现的机会；和c)三级预防通过例如恢复功能和/或减少任何状况/紊乱/症状或相关并发症以减少已经建立的状况/紊乱/症状的负面影响。

“药学上可接受的”载体是在所采用的剂量和浓度对正被暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的载体。“药学上可接受的”载体可以是但不限于适合用于所选择的应用模式诸如口服应用或注射，并以诸如固体(诸如片剂、颗粒、粉末、胶囊)和液体(诸如溶液、乳液、悬浮液等)的常规药物制剂的形式施用的有机的或无机的、固体或液体赋形剂。通常，生理学上可接受的载体是水性pH缓冲溶液，诸如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。生理学上可接受的载体还可以包括以下中的一种或更多种：抗氧化剂(包括抗坏血酸)，低分子量(小于约10个残基)多肽，蛋白诸如血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸，碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂诸如EDTA，糖醇类诸如甘露醇或山梨醇，成盐抗衡离子诸如钠离子，以及非离子型表面活性剂诸如Tween^TM、聚乙二醇(PEG)和Pluronics^TM。助剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂、粘合剂、pH调节剂控制剂、等渗剂和其他常规添加剂也可以被添加到载体中。

药学上可接受的或适当的载体可以包括已知对胃肠(GI)道受损情况有益的其他化合物(例如，抗氧化剂诸如维生素C、维生素E、硒或锌)；或食品组合物。食品组合物可以是但不限于牛奶、酸奶、凝乳、奶酪、发酵奶、基于牛奶的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于牛奶的粉末、婴儿配方、片剂、液体细菌悬浮液、干口服补充剂或湿口服补充剂。

治疗剂或保护剂可以包含“药物”。如本文使用的，“药物”是指治疗剂或诊断剂，并且包括除食品以外的在预防、诊断、减轻、治疗或治愈疾病中使用的任何物质。Stedman'sMedical Dictionary，第25版(1990)。药物可以包括以下中的至少一项中公开的任何物质：The Merck Index，第12版(1996)；Pei-Show Juo,Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,(1996)；U.S.Pharmacopeia Dictionary，2000版和Physician'sDesk Reference，2001版。在一些实施方案中，治疗剂是本文描述的组合物的实施方案中的一种。

在一些实施方案中，在治疗系统中使用的药物将通常被放置于递送基质上、嵌入、封装或以其他方式掺入递送基质中。递送基质可以被包括在第一骨架结构中或第二缓冲结构中或两者中或包括在第一骨架结构上或第二缓冲结构上或两者上。递送基质依次地包括生物可降解材料或生物不可降解材料。递送基质可以包括但不限于聚合物。生物可降解聚合物的实例包括：蛋白、水凝胶、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(L-乙醇酸)(PLGA)、聚乙交酯(polyglycolide)、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯、聚(氨基酸)、聚对二氧环己酮、聚已内酯、聚葡萄糖酸酯(polygluconate)、聚乳酸-聚环氧乙烷共聚物、改性纤维素、胶原、聚原酸酯(polyorthoester)、聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚磷酸酯、聚(α-羟基酸)及其组合。生物不可降解聚合物可以包括硅氧烷、丙烯酸酯、聚乙烯、聚氨酯、聚氨酯、水凝胶、聚酯(例如来自E.I.Du Pont de Nemoursand Company,Wilmington,Del.的)、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、膨胀PTFE(ePTFE)、聚醚醚酮(PEEK)、尼龙、挤出(extruded)胶原、聚合物泡沫、硅氧烷橡胶、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate)、超高分子量聚乙烯、聚碳酸酯聚氨酯、聚氨酯、聚酰亚胺、不锈钢、镍钛合金(例如镍钛诺(Nitinol))、钛、不锈钢、钴铬合金(例如来自Elgin Specialty Metals,Elgin,Ill.的来自Carpenter Metals Corp.,Wyomissing,Pa.的)。在一个实施方案中，水凝胶可以包含聚(环氧烷(alkyleneoxides))，诸如也称为聚乙二醇或PEG的聚(环氧乙烷)。

如本文使用的术语“包含/包括(comprise)”与“包含/包括(including)”、“含有(containing)”或“以……为特征”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除附加的、未提及的要素或方法步骤。

肿瘤(tumor)，也称为赘生物(neoplasm)，通常是指可以是例如固体或非固体的异常的组织团块。肿瘤可以是例如良性的(即非癌性的)、恶化前的(即癌前的)或恶化的(即癌性的)。如本文使用的术语“实体瘤”是指通常不含有囊肿或液体区域的异常的组织团块。实体瘤可能是良性的、恶化前的或恶化的。不同类型的实体瘤有时以形成它们的细胞的类型命名。实体瘤可以存在于各种部位，例如骨骼、肌肉和器官。实体瘤的实例包括但不限于肉瘤、癌(carcinoma)、淋巴瘤及其组合。肉瘤通常被认为是血管、骨骼、脂肪组织、韧带、淋巴管、肌肉或肌腱的肿瘤，例如Ewing肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)。癌通常被认为是在上皮细胞中形成的肿瘤，例如在皮肤、腺体和器官内膜(包括但不限于膀胱、输尿管和肾脏)中发现的上皮细胞。癌的非限制性实例包括肾上腺皮质癌。非实体瘤有时被称为分散肿瘤，例如血液中的肿瘤(也称为白血病)。非实体瘤的非限制性实例包括血液恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤(例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤)。肿瘤的实例包括但不限于宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、黑素瘤、卵巢癌、肺癌、肾细胞癌、神经鞘瘤、间皮瘤、急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤或其组合。

在本公开内容全文中，各种方面以范围格式提出。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本公开内容的范围的不可改变的限制。因此，对范围的描述应当被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的各个数值。例如，诸如从1至6的范围的描述应当被认为是已经具体地公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围，以及在该范围内的例如1、2、3、4、5、和6的单独的数。不论范围的广度如何，这都适用。

从随后结合附图的说明书中，本公开内容的其他目的、优点和特征将变得明显。

在随后的描述中，多种具体的细节被阐述以提供对本公开内容更全面的理解。然而，对本领域的技术人员将明显的是，可以在不具有这些具体细节中的一个或更多个的情况下，实践本公开内容的方法。在其他情况中，为了避免使本公开内容不明显，未描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。

SerRS蛋白和多核苷酸

丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS，也称为丝氨酸-tRNA连接酶)是一种属于II类氨基酰tRNA合成酶(aaRS)家族的酶。aaRS是一种将适当的氨基酸附接到其tRNA上的酶。aaRS通过催化特定的关联氨基酸或其前体与其所有兼容的关联tRNA中的一个的酯化以形成氨基酰tRNA来进行所述附接。SerRS催化将丝氨酸加载到丝氨酸的关联tRNA上的氨基酰化反应以用于蛋白合成。这种进化上保守的至关重要的反应以两步进行：(1)丝氨酸被ATP活化以形成丝氨酸-腺苷酸(serine-adenylate；Ser-AMP)，作为酶结合反应的中间物；和(2)Ser-AMP上的丝氨酰部分被转移到关联tRNA的3'端，以产生将被递送到核糖体的最终产物Ser-tRNA^Ser。如本文描述的，令人惊讶的是，SerRS被鉴定为血管发生的转录阻抑物，所述血管发生是癌症发展中的标志。

脊椎动物SerRS酶由SARS基因编码，该SARS基因与细菌和酵母对应物在进化上相关。脊椎动物SerRS蛋白的非限制性实例包括人类SerRS、小鼠SerRS、斑马鱼SerRS和蛙SerRS。人类SARS基因、小鼠SARS基因、斑马鱼SARS基因和蛙SARS基因的编码序列(CDS)分别在SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:45中示出。本文还公开了包含与SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:45具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的SerRS核苷酸序列或由与SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:45具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的SerRS核苷酸序列组成的核苷酸序列。在一些实施方案中，SerRS核苷酸序列与SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:45是100％相同的或是约100％相同的。在一些实施方案中，SerRS核苷酸序列包含编码SerRS^S101A/S241A蛋白的SEQ ID NO:40的核苷酸序列或由编码SerRS^S101A/S241A蛋白的SEQ ID NO:40的核苷酸序列组成。

野生型人类SerRS蛋白的氨基酸序列在下文示出(SEQ ID NO:1)。野生型小鼠SerRS蛋白、斑马鱼SerRS蛋白和蛙SerRS蛋白的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44和SEQ ID NO:46中提供。本文还公开了包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44或SEQ ID NO:46具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的SerRS蛋白序列或由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的SerRS蛋白序列组成的蛋白。在一些实施方案中，SerRS蛋白序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46是100％相同的或是约100％相同的。

具有修饰的磷酸化能力的SerRS蛋白及其多核苷酸

已经在SerRS蛋白中发现了各种磷酸化位点。例如，野生型人类SerRS蛋白(SEQ IDNO:1)中的非限制性磷酸化位点包括T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263。这些丝氨酸(S)磷酸化位点、苏氨酸(T)磷酸化位点和酪氨酸(Y)磷酸化位点已经被发现在脊椎动物SerRS蛋白中高度保守，但可以在非人类SerRS蛋白中变化。例如，如图11中例示的，在一些脊椎动物中，在SerRS蛋白中，这些磷酸化位点处的一个或更多个丝氨酸可以是苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸或缬氨酸；在SerRS蛋白中，这些磷酸化位点处的一个或更多个苏氨酸可以是丝氨酸、酪氨酸、丙氨酸或缬氨酸；并且在人类SerRS蛋白中，这些磷酸化位点处的一个或更多个酪氨酸可以是苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。例如，在蛙SerRS蛋白和斑马鱼SerRS蛋白中，与人类SerRS蛋白中S101对应的残基是T，并且在蛙SerRS蛋白中，与人类SerRS蛋白中S142对应的残基是T(参见图11)。在本公开内容中，SerRS蛋白中氨基酸的位置被称为人类SerRS蛋白中对应的氨基酸的位置。例如，一种或更多种感兴趣的SerRS蛋白和野生型人类SerRS蛋白的序列比对(例如在图11中示出的序列比对)可以用于确定感兴趣SerRS蛋白中一种或更多种氨基酸的位置。在一些实施方案中，本文公开的SerRS蛋白能够被磷酸化，例如通过共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ATM)、共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶(ATR)或两者被磷酸化。不受任何特定理论的约束，认为SerRS蛋白的磷酸化程度可以通过在SerRS蛋白上的一个或更多个磷酸化位点处或其附近进行氨基酸取代、缺失、添加或其组合来调节(例如，减少或增强)。例如，变体SerRS蛋白(例如突变体SerRS蛋白)可以通过在对应亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)上的一个或更多个磷酸化位点处或其附近进行氨基酸取代、缺失、添加或其组合来生成。

本文公开的一些实施方案提供了与对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)相比是磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白(例如突变体SerRS蛋白)。如本文公开的，如果变体SerRS蛋白的最大磷酸化水平小于对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)的最大磷酸化水平或人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大磷酸化水平的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％，则变体SerRS蛋白被认为是磷酸化缺陷的。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白的最大磷酸化水平是对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)的最大磷酸化水平的90％、85％、80％、75％、65％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或这些值中任何两个之间的范围，或者是对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)的最大磷酸化水平的约90％、约85％、约80％、约75％、约65％、约60％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％或这些值中任何两个之间的范围。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白的最大磷酸化水平是人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大磷酸化水平的90％、85％、80％、75％、65％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或这些值中任何两个之间的范围，或者是人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大磷酸化水平的约90％、约85％、约80％、约75％、约65％、约60％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％或这些值中任何两个之间的范围。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白不能被磷酸化。还如本文公开的，如果变体SerRS蛋白的平均磷酸化水平小于对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)的平均磷酸化水平或人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的平均磷酸化水平的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、50％、45％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％，则变体SerRS蛋白被认为是磷酸化缺陷的。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白的平均磷酸化水平是对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)的平均磷酸化水平的90％、85％、80％、75％、65％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或这些值中的任何两个之间的范围，或者是对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)的平均磷酸化水平的约90％、约85％、约80％、约75％、约65％、约60％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％或这些值中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白的平均磷酸化水平是人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的平均磷酸化水平的90％、85％、80％、75％、65％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或这些值中任何两个之间的范围，或者是人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的平均磷酸化水平的约90％、约85％、约80％、约75％、约65％、约60％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，变体SerRS蛋白包含在对应于相对的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)的残基位置22、79、86、101、142、217、241、255、258、262、368、394、396、214、501、220、248和263中的一个或更多个处的氨基酸取代。例如，变体SerRS蛋白包含在对应于人类野生型SerRS蛋白的T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263的一个或更多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白包含在相对于对应的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)的残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262(或T262)、S368、S394、S396、T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。氨基酸取代可以是，例如丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸、丝氨酸-至-苯丙氨酸、苏氨酸-至-丙氨酸、苏氨酸-至-甘氨酸、苏氨酸-至-赖氨酸、苏氨酸-至-精氨酸、苏氨酸-至-天冬酰胺、苏氨酸-至-谷氨酰胺、苏氨酸-至-组氨酸、苏氨酸-至-半胱氨酸、苏氨酸-至-缬氨酸、苏氨酸-至-亮氨酸、苏氨酸-至-异亮氨酸、苏氨酸-至-脯氨酸、苏氨酸-至-甲硫氨酸、苏氨酸-至-色氨酸、苏氨酸-至-苯丙氨酸、酪氨酸-至-丙氨酸、酪氨酸-至-甘氨酸、酪氨酸-至-赖氨酸、酪氨酸-至-精氨酸、酪氨酸-至-天冬酰胺、酪氨酸-至-谷氨酰胺、酪氨酸-至-组氨酸、酪氨酸-至-半胱氨酸、酪氨酸-至-缬氨酸、酪氨酸-至-亮氨酸、酪氨酸-至-异亮氨酸、酪氨酸-至-脯氨酸、酪氨酸-至-甲硫氨酸、酪氨酸-至-色氨酸和酪氨酸-至-苯丙氨酸。如本文公开的，与对应的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)相比，变体SerRS蛋白可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸取代。如本文公开的，变体SerRS蛋白的序列与对应的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)相比可以是70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高相同的，或者可以是约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或更高相同的。在一些实施方案中，亲本SerRS蛋白是人类SerRS蛋白。在一些实施方案中，亲本SerRS蛋白是人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)。在一些实施方案中，相对于对应的亲本SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)和人类变体SerRS蛋白)，变体SerRS蛋白包含在丝氨酸101(S101)、丝氨酸241(S241)或两者处的氨基酸取代。

在一些实施方案中，变体SerRS蛋白包含在对应于相对的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)的残基位置22、79、86、101、142、217、241、255、258、262、368、394、396、214、501、220、248和263中的一个或更多个处的氨基酸缺失。例如，变体SerRS蛋白包含在对应于人类野生型SerRS蛋白的T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263的一个或更多个残基处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白包含在相对于对应的亲本SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白))的残基T22、S79、S86、S101(或T101)、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸缺失。如本文公开的，与对应的亲本SerRS蛋白相比，变体SerRS蛋白可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸缺失。如本文公开的，变体SerRS蛋白的序列与对应的亲本SerRS蛋白相比可以是约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或更高相同的。在一些实施方案中，亲本SerRS蛋白是人类SerRS蛋白。在一些实施方案中，亲本SerRS蛋白是人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)。在一些实施方案中，相对于对应的亲本SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白(SEQ ID NO:1))，变体SerRS蛋白包含在丝氨酸101(S101)、苏氨酸101(T101)或丝氨酸241(S241)或两者处的氨基酸缺失。

如本文公开的，亲本SerRS蛋白可以是脊椎动物蛋白，例如哺乳动物蛋白(包括但不限于人类蛋白)。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白是脊椎动物蛋白，例如人类蛋白。

作为非限制性实例，人类SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的人类野生型SerRS蛋白)可以被修饰以减少SerRS蛋白被磷酸化的能力。例如，SEQ ID NO:1的残基T22、S79、S86、S101(或T101)、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263中的一个或更多个可以被取代、缺失、或被取代并被缺失，以生成突变体人类SerRS蛋白，该突变体人类SerRS蛋白的最大或平均磷酸化水平与亲本人类SerRS蛋白(包括但不限于人类野生型SerRS蛋白)相比是减少的。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性的氨基酸序列组成，并且包含在SEQ ID NO:1的残基T22、S79、S86、S101(或T101)、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，氨基酸缺失是在S101和S241中的一个或两者处。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列组成，并且包含在SEQ IDNO:1的残基T22、S79、S86、S101(或T101)、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代在S101和S241中的一个或两者处。在一些实施方案中，氨基酸取代是以下中的一个或更多个：丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸、丝氨酸-至-苯丙氨酸、苏氨酸-至-丙氨酸、苏氨酸-至-甘氨酸、苏氨酸-至-赖氨酸、苏氨酸-至-精氨酸、苏氨酸-至-天冬酰胺、苏氨酸-至-谷氨酰胺、苏氨酸-至-组氨酸、苏氨酸-至-半胱氨酸、苏氨酸-至-缬氨酸、苏氨酸-至-亮氨酸、苏氨酸-至-异亮氨酸、苏氨酸-至-脯氨酸、苏氨酸-至-甲硫氨酸、苏氨酸-至-色氨酸、苏氨酸-至-苯丙氨酸、酪氨酸-至-丙氨酸、酪氨酸-至-甘氨酸、酪氨酸-至-赖氨酸、酪氨酸-至-精氨酸、酪氨酸-至-天冬酰胺、酪氨酸-至-谷氨酰胺、酪氨酸-至-组氨酸、酪氨酸-至-半胱氨酸、酪氨酸-至-缬氨酸、酪氨酸-至-亮氨酸、酪氨酸-至-异亮氨酸、酪氨酸-至-脯氨酸、酪氨酸-至-甲硫氨酸、酪氨酸-至-色氨酸和酪氨酸-至-苯丙氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1中的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中氨基酸取代是丝氨酸-至-丙氨酸或丝氨酸-至-甘氨酸。突变体SerRS蛋白的非限制性实例包括包含SEQ ID NO:2(人类SerRS^S101A突变体)、SEQ ID NO:3(人类SerRS^S241A突变体)或SEQ ID NO:4(人类SerRS^S101/S241A突变体)中列出的氨基酸序列的蛋白或由SEQ ID NO:2(人类SerRS^S101A突变体)、SEQ ID NO:3(人类SerRS^S241A突变体)或SEQ ID NO:4(人类SerRS^S101/S241A突变体)中列出的氨基酸序列组成的蛋白。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白的序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中列出的序列相比是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同的。

在一些实施方案中，变体SerRS蛋白包含在对应于相对的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)的残基位置22、79、86、101、142、217、241、255、258、262、368、394、396、214、501、220、248和263中的一个或更多个处的氨基酸取代，和在对应于相对的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)的残基位置22、79、86、101、142、217、241、255、258、262、368、394、396、214、501、220、248和263中的一个或更多个处的氨基酸缺失。例如，变体SerRS蛋白包含在对应于人类野生型SerRS蛋白的T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263的一个或更多个残基处的氨基酸取代，和在对应于人类野生型SerRS蛋白的T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263的一个或更多个残基处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白具有在相对于对应的亲本SerRS蛋白的残基T22、S79、S86、S101(或T101)、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501、Y220、Y248和Y263处的至少一个氨基酸缺失和至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白具有在相对于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)或其变体的残基T22、S79、S86、S101(或T101)、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501、Y220、Y248和Y263处的至少一个氨基酸缺失和至少一个氨基酸取代。

本文公开的一些实施方案提供了变体SerRS蛋白(例如突变体SerRS蛋白)，所述变体SerRS蛋白(例如突变体SerRS蛋白)是被组成型磷酸化的SerRS蛋白或模拟磷酸化的SerRS蛋白。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白不能被去磷酸化。在一些实施方案中，与对应的亲本SerRS蛋白相比，变体SerRS蛋白在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的。例如，与对应的亲本SerRS蛋白(例如对应的野生型SerRS蛋白)或其变体相比，突变体SerRS蛋白在阻遏VEGF转录方面可以是缺陷性的。例如，变体SerRS蛋白阻遏VEGF转录的程度可以是对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)阻遏VEGF转录的程度的90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或这些值中任何两个之间的范围，或者是对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)阻遏VEGF转录的程度的约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或这些值中任何两个之间的范围。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白可以阻遏VEGF转录的程度小于对应的亲本SerRS蛋白阻遏VEGF转录的程度的90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白可以阻遏VEGF转录的程度小于野生型人类SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)或其变体阻遏VEGF转录的程度的90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白不阻遏VEGF转录。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白将VEGF转录阻遏了不多于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。

在一些实施方案中，变体SerRS蛋白包含在相对于对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)的残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。如本文公开的，与对应的亲本SerRS蛋白相比，变体SerRS蛋白可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸取代。如本文公开的，变体SerRS蛋白的序列与对应的亲本SerRS蛋白相比可以是约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或更高相同的。在一些实施方案中，亲本SerRS蛋白是人类SerRS蛋白。在一些实施方案中，亲本SerRS蛋白是人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)或其变体。在一些实施方案中，相对于对应的亲本SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白(SEQ ID NO:1)或其变体)，变体SerRS蛋白包含丝氨酸101(S101)、丝氨酸241(S241)或两者处的氨基酸取代。

如本文公开的，亲本SerRS蛋白可以是脊椎动物蛋白，例如哺乳动物蛋白(包括但不限于人类蛋白、小鼠蛋白、斑马鱼蛋白或蛙蛋白)。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白是脊椎动物蛋白，例如人类蛋白、小鼠蛋白、斑马鱼蛋白或蛙蛋白。

作为非限制性实例，人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)可以被修饰以增强其磷酸化的程度。例如，SEQ ID NO:1的残基T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263中的一个或更多个可以被取代以生成具有减少的被磷酸化的能力的人类突变体SerRS蛋白。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或由与SEQ IDNO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成，并且包含在SEQ ID NO:1的残基T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在S101和S241中的一个或两者处。在一些实施方案中，氨基酸取代是丝氨酸-至-天冬氨酸或丝氨酸-至-谷氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列并且包含在SEQ IDNO:1中的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中氨基酸取代是丝氨酸-天冬氨酸或丝氨酸-谷氨酸。突变体SerRS蛋白的非限制性实例包括包含SEQ ID NO:5(人类SerRS^S241D突变体)或SEQ ID NO:6(人类SerRS^S241E突变体)中列出的氨基酸序列的蛋白或由SEQ ID NO:5(人类SerRS^S241D突变体)或SEQ ID NO:6(人类SerRS^S241E突变体)中列出的氨基酸序列组成的蛋白。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白的序列与SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6中列出的序列相比是至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同的。

在一些实施方案中，亲本SerRS蛋白是非天然存在的蛋白。例如，亲本SerRS可以是包含来自二种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同SerRS蛋白的序列的嵌合蛋白。在一些实施方案中，亲本SerRS是包含来自人类SerRS蛋白和一种或更多种其他哺乳动物SerRS蛋白(例如小鼠SerRS蛋白和大鼠SerRS蛋白)的序列的嵌合蛋白。在一些实施方案中，亲本SerRS是包含来自人类SerRS蛋白和一种或更多种脊椎动物SerRS蛋白(例如小鼠SerRS蛋白、大鼠SerRS蛋白、斑马鱼SerRS蛋白或蛙SerRS蛋白)的序列的嵌合蛋白。在一些实施方案中，亲本SerRS是包含来自人类SerRS蛋白和一种或更多种无脊椎生物(invertebrate)SerRS蛋白(例如酵母SerRS蛋白和大肠杆菌SerRS蛋白)的序列的嵌合蛋白。在一些实施方案中，亲本SerRS是包含来自人类SerRS蛋白和一种或更多种植物SerRS蛋白(例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)SerRS蛋白)的序列的嵌合蛋白。已经显示，对于SerRS蛋白而言，蛋白序列是进化上保守的。在一些实施方案中，亲本SerRS蛋白包含通过比对两种或更多种不同SerRS蛋白的部分或全部序列获得的一个或更多个共有序列。例如，共有序列可以通过比对人类SerRS序列、酵母SerRS序列和大肠杆菌SerRS序列构建。作为另一个实例，共有序列可以通过比对两种或更多种脊椎动物SerRS序列(包括但不限于小鼠SerRS序列、人类SerRS序列、蛙SerRS序列和/或斑马鱼SerRS序列)来构建。该共有序列的一个或更多个部分(例如，所鉴定的保守区域)可以被用于替换野生型人类SerRS中的对应的序列，以生成亲本SerRS蛋白。在一些实施方案中，包含共有序列或由共有序列组成的蛋白被用作亲本SerRS蛋白。

与参考SerRS蛋白相比，本文公开的变体SerRS蛋白可以在沿其序列的一个或更多个位置处包含保守氨基酸取代。参考SerRS蛋白的非限制性实例包括对应的亲本SerRS蛋白、人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)或其变体。如本文使用的，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸的组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸的组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸的组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸的组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的氨基酸的组是半胱氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸，用谷氨酸替换天冬氨酸，用丝氨酸替换苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸替换氨基酸的相似的替换预期不会对所得的变体多肽的特性产生重大影响。如本文描述的，氨基酸变化是否产生功能性多肽可以通过测定其活性容易地确定。示例性保守氨基酸取代在表1中示出。落入本公开内容的范围内的氨基酸取代通常通过选择它们在维持(a)取代的区域中肽骨架的结构，(b)靶位点处的分子的电荷或疏水性，(c)侧链的体积，或(d)生物学功能方面的作用不具有显著差异的取代实现的。在引入取代之后，筛选变体的生物学活性。

表1.示例性保守氨基酸取代

本文还公开了包含本文公开的任何SerRS蛋白(包括野生型和变体SerRS蛋白)的编码序列的多核苷酸序列，或由本文公开的任何SerRS蛋白(包括野生型和变体SerRS蛋白)的编码序列组成的多核苷酸序列。

SerRS蛋白的表达

适用于本公开内容的实施方案的SerRS蛋白可以例如通过重组DNA技术在各种宿主细胞中产生。例如，能够表达真核蛋白的表达载体(例如病毒载体、穿梭载体和细菌质粒)可以被用于表达重组SerRS蛋白。在一些实施方案中，宿主细胞可以是细菌、真菌、植物、酵母、昆虫或脊椎动物细胞(包括但不限于哺乳动物细胞)。术语“宿主细胞”包括从用于产生根据本公开内容的SerRS蛋白的细胞、细胞的子代和由细胞产生的原生质体两者。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如细菌宿主细胞。

作为非限制性实例，为了用重组DNA技术产生SerRS蛋白，可以构建包含编码SerRS蛋白的氨基酸序列的核酸的DNA构建体，并将其转移到例如大肠杆菌宿主细胞中。载体可以是当被引入大肠杆菌宿主细胞时，可以被整合到宿主细胞基因组中并可以被复制的任何载体。编码SerRS的核酸可以被可操作地连接到在大肠杆菌宿主细胞中显示转录活性的合适的启动子。启动子可以来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白的基因。如本文使用的，“诱导型启动子”可以指在环境调控或发育调控下活跃的启动子。

在一些实施方案中，SerRS编码序列可以被可操作地连接到信号序列。在一些实施方案中，表达载体还可以包括终止序列。在一些实施方案中，终止序列和启动子序列可以来源于相同的来源。在另一个实施方案中，终止序列可以与宿主细胞同源。

在一些实施方案中，表达载体包括一个或更多个选择标记。代表性选择标记的实例包括赋予抗微生物抗性的标记(例如潮霉素和腐草霉素)。在一些实施方案中，营养选择性标记，包括本领域已知的那些标记如amdS、argB和pyr4，可以被用作选择标记。

包含具有编码SerRS的多核苷酸的DNA构建体的表达载体可以是能够在给定宿主生物体中自主复制或能够整合到宿主的DNA中的任何载体。在一些实施方案中，表达载体可以是质粒或病毒构建体。

在一些实施方案中，考虑了用于获得基因的表达的两种类型的表达载体。例如，第一种表达载体可以包含DNA序列，其中启动子、SerRS编码区和终止子都来源于将被表达的基因。在一些实施方案中，基因截短可以通过删除不需要的DNA序列(例如编码不需要的结构域的DNA)获得，以使将被表达的结构域处于其自身转录和翻译调控序列的控制下。第二种类型的表达载体可以被预组装并包含高水平转录所需的序列和选择标记。在一些实施方案中，SARS基因的编码区或其部分可以被插入该通用目的表达载体中，使其处于表达构建体启动子和终止子序列的转录控制之下。在一些实施方案中，基因或其部分可以被插入到强启动子的下游。

用于连接包含编码SerRS的多核苷酸、启动子、终止子和其他序列的DNA构建体和将它们插入到合适的载体中的方法是本领域熟知的。连接通常可以通过在方便的限制位点连接来完成。如果不存在这样的位点，则根据常规操作使用合成的寡核苷酸接头(Bennett&Lasure,More Gene Manipulations In Fungi,Academic Press,San Diego(1991)70页-76页)。此外，可以使用已知的重组技术(例如Invitrogen Life Technologies，GatewayTechnology)构建载体。

将DNA构建体或载体引入宿主细胞包括技术诸如转化、电穿孔、细胞核显微注射、转导、转染(例如脂质体介导的转染和DEAE-糊精介导的转染)、与磷酸钙DNA沉淀孵育、用DNA包被的微弹高速轰击、和原生质体融合。一般转化技术是本领域已知的(参见例如Campbell等人，(1989)Curr.Genet.16:53-56)。

在一些实施方案中，遗传上稳定的转化体可以用载体系统构建，由此编码SerRS的核酸被稳定整合到宿主菌株染色体中。然后转化体可以通过已知技术被纯化。

用于减少肿瘤进展的方法和组合物

本文公开了用于减少肿瘤进展的方法和组合物。在一些实施方案中，该方法包括：向有需要的受试者施用包含突变体SerRS蛋白的组合物，其中突变体SerRS蛋白是磷酸化缺陷的突变体SerRS蛋白，由此减少受试者中的肿瘤进展。例如，突变体SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平是对应的亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或对应的野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的50％、40％、30％、20％、10％、5％、3％、1％或这些值的任何两个之间的范围，或者是对应的亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或对应的野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％、约3％、约1％或这些值的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平小于对应的亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或对应的野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于1％。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平小于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大和/或平均磷酸化水平的50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于1％。

组合物可以是例如药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含低氧诱导因子(HIF)的一种或更多种抑制剂，例如HIF-1的一种或更多种抑制剂。在一些实施方案中，药物组合物不包含HIF的任何抑制剂，例如HIF-1抑制剂。在一些实施方案中，与未接受治疗的受试者相比，肿瘤进展减少了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或这些值中的任何两个之间的范围。不受任何特定理论的束缚，认为磷酸化的SerRS蛋白可以阻遏受试者中血管内皮生长因子(VEGF)的转录，这可以导致血管发生的减少。在一些实施方案中，肿瘤进展的减少通过减少受试者中的血管发生实现。例如，与未接受治疗的受试者相比，受试者中的血管发生可以减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或这些值中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，与未接受治疗的受试者相比，受试者中的血管发生减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，与未接受治疗的受试者相比，受试者中的血管发生减少了多于10％、多于20％、多于30％、多于40％、多于50％、多于60％、多于70％、多于80％、多于90％、多于95％、多于98％或多于99％。在一些实施方案中，血管发生是低氧诱导的血管发生。在一些实施方案中，肿瘤进展是转移。在一些实施方案中，实体瘤是肉瘤、癌、淋巴瘤或其组合。在一些实施方案中，肿瘤是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、黑素瘤、卵巢癌、肺癌、肾细胞癌、神经鞘瘤、间皮瘤、急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤或其组合。在一些实施方案中，与未接受治疗的受试者相比，受试者中的肿瘤进展减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，与未接受治疗的受试者相比，受试者中的肿瘤进展减少了多于10％、多于20％、多于30％、多于40％、多于50％、多于60％、多于70％、多于80％、多于90％、多于95％、多于98％或多于99％。

本文公开的方法可以用于治疗或改善实体瘤或血液恶性肿瘤，例如选自由以下组成的组的癌：乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、黑素瘤、卵巢癌、肺癌、肾细胞癌、神经鞘瘤、间皮瘤、急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤及其组合。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白具有降低的通过共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ATM)、共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶(ATR)或两者的磷酸化水平。

本文公开的任何磷酸化缺陷的SerRS蛋白可以在用于减少肿瘤进展的方法和组合物中使用。例如，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白可以包含在相对于对应的亲本SerRS蛋白或对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含在相对于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的残基T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501、Y220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是以下中的一种或更多种：丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸、丝氨酸-至-苯丙氨酸、苏氨酸-至-丙氨酸、苏氨酸-至-甘氨酸、苏氨酸-至-赖氨酸、苏氨酸-至-精氨酸、苏氨酸-至-天冬酰胺、苏氨酸-至-谷氨酰胺、苏氨酸-至-组氨酸、苏氨酸-至-半胱氨酸、苏氨酸-至-缬氨酸、苏氨酸-至-亮氨酸、苏氨酸-至-异亮氨酸、苏氨酸-至-脯氨酸、苏氨酸-至-甲硫氨酸、苏氨酸-至-色氨酸、苏氨酸-至-苯丙氨酸、酪氨酸-至-丙氨酸、酪氨酸-至-甘氨酸、酪氨酸-至-赖氨酸、酪氨酸-至-精氨酸、酪氨酸-至-天冬酰胺、酪氨酸-至-谷氨酰胺、酪氨酸-至-组氨酸、酪氨酸-至-半胱氨酸、酪氨酸-至-缬氨酸、酪氨酸-至-亮氨酸、酪氨酸-至-异亮氨酸、酪氨酸-至-脯氨酸、酪氨酸-至-甲硫氨酸、酪氨酸-至-色氨酸和酪氨酸-至-苯丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在残基S101和S241中的一个或更多个处。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白可以包含相对于对应的亲本SerRS蛋白的氨基酸取代S101A、S241A或两者。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白可以包含相对于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的氨基酸取代S101A、S241A或两者。在一些实施方案中，氨基酸取代是以下中的一种或更多种：丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸和丝氨酸-至-苯丙氨酸。

在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白可以包含在相对于对应的亲本SerRS蛋白或对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸缺失。即，在这些实施方案中，对应的亲本SerRS蛋白中的一个或更多个氨基酸残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263在磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白中可以不存在。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的SerRS蛋白包含在相对于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的残基T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501；Y220、Y248、Y263中的一个或更多个处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，氨基酸缺失在残基S101和S241中的一个或更多个处。

在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白具有在相对于对应的亲本SerRS蛋白或对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263处的至少一个氨基酸缺失和至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白具有在相对于人类野生型SerRS蛋白的残基T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501、Y220、Y248和Y263处的至少一个氨基酸缺失和至少一个氨基酸取代。

在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高序列同一性的氨基酸序列并且包含在SEQ ID NO:1的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代。氨基酸取代可以是，例如丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸和丝氨酸-至-苯丙氨酸。

在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列并且包含在SEQ ID NO:1的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中氨基酸取代是丝氨酸-至-丙氨酸或丝氨酸-至-甘氨酸。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高序列同一性的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白是脊椎动物SerRS蛋白(例如人类变体SerRS蛋白)。

用于调控血管发生的方法和组合物

本文提供了用于调控血管发生的方法和组合物。该方法和组合物可以在例如罹患一种或更多种血管发生相关疾病的受试者，或处于发展一种或更多种血管发生相关疾病的风险中的受试者中使用。血管发生相关疾病的实例包括但不限于癌症、关节炎、皮肤紊乱(例如皮肤老化、晒伤、伤口愈合、银屑病、湿疹、血管瘤、纤维血管瘤和卡波西肉瘤)、眼部疾病(例如糖尿病视网膜病变、晶状体后纤维增生、黄斑变性、角膜血管形成和新生血管性青光眼)和心血管疾病。

用于促进血管发生的方法和组合物

在一些实施方案中，方法和组合物用于促进血管发生。例如，促进受试者中血管发生的方法可以包括：向有需要的受试者施用包含突变体SerRS蛋白的组合物，其中与对应的野生型SerRS蛋白相比，突变体SerRS蛋白在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的，或者在刺激VEGF转录方面是有效。在一些实施方案中，促进受试者中血管发生的方法可以包括：向有需要的受试者施用包含突变体SerRS蛋白的组合物，其中与人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)相比，突变体SerRS蛋白在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的，由此促进受试者中血管发生。在一些实施方案中，促进受试者中血管发生的方法可以包括：向有需要的受试者施用包含突变体SerRS蛋白的组合物，其中突变体SerRS蛋白刺激VEGF转录，由此促进受试者中血管发生。组合物可以是例如药物组合物。该方法和组合物可以在例如罹患涉及不良血管形成或异常血管系统的一种或更多种疾病或紊乱的受试者中使用。在一些实施方案中，受试者罹患缺血性心脏病、心血管疾病和神经疾病中的一种或更多种，或处于发展缺血性心脏病、心血管疾病和神经疾病中的一种或更多种的风险。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏小于对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的70％、小于对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的60％、小于对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的50％、小于对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的40％、小于对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的30％、小于对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的20％、小于对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的10％、小于对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的5％、小于对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的3％或小于对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的1％。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏是对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、3％、1％或这些值中的任何两个之间的范围，或是对应的亲本SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％、约3％、约1％或这些值中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的70％、小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的60％、小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的50％、小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的40％、小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的30％、小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的20％、小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的10％、小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的5％、小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的3％或小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的1％。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏是对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、3％、1％或这些值中的任何两个之间的范围，或是对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％、约3％、约1％或这些值中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏小于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的70％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的60％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的50％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的40％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的30％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的20％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的10％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的5％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的3％或小于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的1％。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏是人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、3％、1％或这些值中的任何两个之间的范围，或是人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)对VEGF转录的阻遏的约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％、约3％、约1％或这些值中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白不阻遏VEGF转录。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白刺激VEGF转录。

本文公开的在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的任何变体SerRS蛋白或本文公开的可以刺激VEGF转录的任何变体SerRS蛋白可以在用于促进血管发生的方法和组合物中使用。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白包含在对应于相对的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)的残基位置22、79、86、101、142、217、241、255、258、262、368、394、396、214、501、220、248和263中的一个或更多个处的氨基酸取代。例如，变体SerRS蛋白包含在对应于人类野生型SerRS蛋白的T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263的一个或更多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白可以包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白可以包含在相对于对应的亲本SerRS蛋白的残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白可以包含在相对于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQID NO:1的序列的SerRS蛋白)的残基T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501；Y220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。氨基酸取代的非限制性实例包括丝氨酸-至-天冬氨酸、丝氨酸-至-谷氨酸、苏氨酸-至-天冬氨酸和苏氨酸-至-谷氨酸。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白或对应的亲本SerRS蛋白的S101(或T101)、S241或两者处的氨基酸取代。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ IDNO:1的序列的SerRS蛋白)的S101、S241或两者处的氨基酸取代。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含相对于对应的野生型SerRS蛋白的氨基酸取代S101D(或T101D)、S241D或两者。在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白包含在相对于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的氨基酸取代S101D、S241D或两者。突变体SerRS蛋白可以是例如脊椎动物蛋白(例如哺乳动物蛋白(包括但不限于突变体人类蛋白))、嵌合SerRS蛋白或具有共有SerRS序列的亲本SerRS的变体。

在一些实施方案中，在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的变体SerRS蛋白包含与SEQID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列并且包含在SEQ ID NO:1中的残基S101和S241中的一个或两者上的氨基酸取代，其中氨基酸取代为丝氨酸-至-天冬氨酸或丝氨酸-至-谷氨酸。在一些实施方案中，在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，可以刺激VEGF转录的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列并且包含在SEQ ID NO:1中的残基S101和S241中的一个或两者上的氨基酸取代，其中氨基酸取代为丝氨酸-至-天冬氨酸或丝氨酸-至-谷氨酸。在一些实施方案中，可以刺激VEGF转录的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。

用于减少血管发生的方法和组合物

本文公开了用于减少血管发生的方法和组合物。例如，减少受试者中血管发生的方法可以包括：向有需要的受试者施用包含变体SerRS蛋白(例如突变体SerRS蛋白)的组合物，其中变体SerRS蛋白是磷酸化缺陷的，由此减少受试者中的血管发生。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平小于对应野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的50％、小于对应野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的40％、小于对应野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的30％、小于对应野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的20％、小于对应野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的10％、小于对应野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的5％、小于对应野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的3％、小于对应野生型SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平或亲本SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平的1％。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白的最大和/或平均磷酸化水平小于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大和/或平均磷酸化水平的50％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ IDNO:1的序列的SerRS蛋白)的最大和/或平均磷酸化水平的40％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大和/或平均磷酸化水平的30％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大和/或平均磷酸化水平的20％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大和/或平均磷酸化水平的10％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大和/或平均磷酸化水平的5％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大和/或平均磷酸化水平的3％、小于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的最大和/或平均磷酸化水平的1％。

组合物可以是例如药物组合物。在一些实施方案中，与未接受治疗的受试者相比，血管发生减少了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更多。不受任何特定理论的束缚，认为磷酸化的SerRS蛋白可以阻遏受试者中血管内皮生长因子(VEGF)的转录，这可以导致血管发生的减少。在一些实施方案中，血管发生的减少可以导致在罹患肿瘤的受试者中肿瘤进展的减少。与未接受治疗的受试者相比，受试者中的血管发生可以减少例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或这些值中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，血管发生是低氧诱导的血管发生。在一些实施方案中，与未接受治疗的受试者相比，受试者中的血管发生减少了多于10％、多于20％、多于30％、多于40％、多于50％、多于60％、多于70％、多于80％、多于90％、多于95％、多于98％或多于99％。在一些实施方案中，与未接受治疗的受试者相比，受试者中的血管发生减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。

在一些实施方案中，突变体SerRS蛋白具有降低的通过共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ATM)、共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶(ATR)或两者的磷酸化水平。

本文公开的任何磷酸化缺陷的SerRS蛋白可以在用于减少血管发生的方法和组合物中使用。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白包含在对应于相对的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)的残基位置22、79、86、101、142、217、241、255、258、262、368、394、396、214、501、220、248和263中的一个或更多个处的氨基酸取代。例如，变体SerRS蛋白包含在对应于人类野生型SerRS蛋白的T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263的残基中的一个或更多个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白可以包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白或亲本SerRS蛋白的残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含在相对于人类野生型SerRS蛋白(例如，具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的残基T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501、Y220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代。氨基酸取代的实例包括但不限于丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸、丝氨酸-至-苯丙氨酸、苏氨酸-至-丙氨酸、苏氨酸-至-甘氨酸、苏氨酸-至-赖氨酸、苏氨酸-至-精氨酸、苏氨酸-至-天冬酰胺、苏氨酸-至-谷氨酰胺、苏氨酸-至-组氨酸、苏氨酸-至-半胱氨酸、苏氨酸-至-缬氨酸、苏氨酸-至-亮氨酸、苏氨酸-至-异亮氨酸、苏氨酸-至-脯氨酸、苏氨酸-至-甲硫氨酸、苏氨酸-至-色氨酸、苏氨酸-至-苯丙氨酸、酪氨酸-至-丙氨酸、酪氨酸-至-甘氨酸、酪氨酸-至-赖氨酸、酪氨酸-至-精氨酸、酪氨酸-至-天冬酰胺、酪氨酸-至-谷氨酰胺、酪氨酸-至-组氨酸、酪氨酸-至-半胱氨酸、酪氨酸-至-缬氨酸、酪氨酸-至-亮氨酸、酪氨酸-至-异亮氨酸、酪氨酸-至-脯氨酸、酪氨酸-至-甲硫氨酸、酪氨酸-至-色氨酸和酪氨酸-至-苯丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代在残基S101(或T101)和S241中的一个或更多个处。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白可以包含相对于对应的野生型SerRS蛋白或亲本SerRS蛋白的氨基酸取代S101A、S241A或两者。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白可以包含相对于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的氨基酸取代S101A、S241A或两者。在一些实施方案中，氨基酸取代是丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸和丝氨酸-至-苯丙氨酸，或其组合。

在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含在对应于相对的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)的残基位置22、79、86、101、142、217、241、255、258、262、368、394、396、214、501、220、248和263中的一个或更多个处的氨基酸缺失。例如，变体SerRS蛋白包含在对应于人类野生型SerRS蛋白的T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263的一个或更多个残基处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白可以包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白或亲本SerRS蛋白的残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸缺失。换言之，对应的野生型SerRS蛋白或亲本SerRS蛋白中的一个或更多个氨基酸残基T22、S79(或T79)、S86、S101(或T101)、S142(或T142)、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220(或T220)、Y248和Y263在磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白中是不存在的。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的SerRS蛋白包含在相对于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的残基T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，氨基酸缺失在残基S101和S241中的一个或更多个处。

在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含在对应于相对的亲本SerRS蛋白或野生型SerRS蛋白(例如人类野生型SerRS蛋白)的残基位置22、79、86、101、142、217、241、255、258、262、368、394、396、214、501、220、248和263处的一个或更多个氨基酸缺失和一个或更多个氨基酸取代。例如，变体SerRS蛋白包含在对应于人类野生型SerRS蛋白的T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263的残基处的一个或更多个氨基酸缺失和一个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白或亲本SerRS蛋白的残基T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396；T214、T501、Y220、Y248和Y263处的一个或更多个氨基酸缺失和一个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含在相对于人类野生型SerRS蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的序列的SerRS蛋白)的残基T22、S79、S86、S101、S142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、Y220、Y248和Y263处的一个或更多个氨基酸缺失和一个或更多个氨基酸取代。

在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列并且包含在SEQ ID NO:1的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列并且包含在SEQ ID NO:1的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代选自由以下组成的组：丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸和丝氨酸-至-苯丙氨酸。

在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列并且包含在SEQ ID NO:1的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中氨基酸取代是丝氨酸-至-丙氨酸或丝氨酸-至-甘氨酸。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，磷酸化缺陷的变体SerRS蛋白是脊椎动物变体SerRS蛋白(例如哺乳动物变体SerRS蛋白(包括但不限于人类变体SerRS蛋白))。

在一些实施方案中，减少受试者中血管发生的方法包括：向有需要的受试者施用包含SerRS磷酸化抑制剂的组合物，由此减少受试者中的血管发生。该方法还可以包括鉴定有需要的受试者，其中受试者罹患具有异常高血管形成的疾病或紊乱，或处于发展具有异常高血管形成的疾病或紊乱的风险中。在一些实施方案中，组合物可以是药物组合物。

术语“SerRS磷酸化抑制剂”在本文中以广义使用，并且包括部分地或完全地阻断、抑制或抵消SerRS的磷酸化的任何分子。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂可以减少、预防或消除SerRS的磷酸化。抑制SerRS的磷酸化的方法/机制不以任何方式受到限制。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂可以直接作用于SerRS，例如通过与SerRS结合，以预防或减少SerRS的磷酸化。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂可以直接作用于可以使SerRS磷酸化的磷酸化酶，例如通过与磷酸化酶结合，以预防或减少SerRS的磷酸化。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂可以干扰，优选地消除或减少SerRS与可以使SerRS磷酸化的磷酸化酶的相互作用。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂可以调节编码可以使SerRS磷酸化的磷酸化酶的基因的表达水平，例如通过抑制或减少磷酸化酶基因的转录。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂可以通过例如抑制或减少磷酸化酶mRNA的翻译，或增加磷酸化酶mRNA或磷酸化酶蛋白的降解来调节细胞中磷酸化酶水平。

SerRS磷酸化抑制剂的类型不以任何方式受到限制。例如，SerRS磷酸化抑制剂可以是小分子、核酸、抗体、肽或其任何组合。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂可以是与SerRS、磷酸化SerRS的磷酸化酶或两者结合的小分子。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂可以是阻断SerRS与使SerRS磷酸化的一种或更多种磷酸化酶相互作用的分子。SerRS磷酸化抑制剂的非限制性实例包括用于共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ATM)的抑制剂、用于共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶(ATR)的抑制剂，或其组合。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂是ATM抑制剂。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂是ATR抑制剂。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂是核酸，例如，反义ATM小发夹RNA(shRNA)、ATM反义RNA、反义ATR小发夹RNA(shRNA)或ATR反义RNA。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂是ATR抑制剂VE-821。在一些实施方案中，SerRS磷酸化抑制剂是ATM抑制剂KU-55933。

化学化合物对SerRS磷酸化的潜在抑制或结合作用可以在其实际合成和测试之前通过使用计算机模拟技术来分析。如果给定化合物的理论结构表明其与磷酸化酶和SerRS之间的相互作用和缔合不足，则排除该化合物的合成和测试。然而，如果计算机模拟表明强相互作用，然后可以合成该分子，并使用合适的测定测试其与SerRS结合和抑制的能力。以这种方式，可以避免合成不起作用的化合物。SerRS的抑制性化合物或其他结合性化合物可以通过一系列步骤的方式来计算地评价和设计，在该步骤中，筛选和选择化学实体或片段与SerRS的单独的结合口袋或其他区域缔合的能力。本领域的技术人员可以使用各种方法来测试化学实体或片段与SerRS更特别是与SerRS的磷酸化位点缔合的能力。在一些实施方案中，已知的SerRS磷酸化抑制剂，诸如ATR抑制剂VE-821和ATM抑制剂KU-55933，可以被用作用于设计抑制SerRS磷酸化的化合物的起点。

药物组合物

本文公开的一些实施方案提供了包含一种或更多种变体SerRS蛋白(例如突变体SerRS蛋白)的药物组合物。在一些实施方案中，变体SerRS蛋白是磷酸化缺陷的。在一些实施方案中，与例如对应的亲本SerRS蛋白(例如野生型SerRS蛋白)相比，变体SerRS蛋白(例如突变体SerRS蛋白)在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的。本文公开的一些实施方案提供了包含一种或更多种SerRS磷酸化抑制剂(例如ATM抑制剂、ATR抑制剂或两者)的药物组合物。药物组合物可以包含一种或更多种药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以用于治疗各种紊乱/疾病，包括但不限于血管发生相关的紊乱/疾病、肿瘤和癌症。

还提供了药物组合物的药学上可接受的前体药物，以及采用这样的药学上可接受的前体药物的治疗方法。术语“前体药物”是指指定的化合物的前体，在施用至受试者之后，通过化学过程或生理过程(诸如溶剂分解或酶裂解)或在生理条件(例如前体药物在达到生理pH时转化为该剂)下在体内产生该化合物。“药学上可接受的前体药物”是无毒的、生物学上可耐受的、并且以其他方式在生物学上适合施用至受试者的前体药物。用于选择和制备合适的前体药物衍生物的说明性程序在例如Bundgaard，Design of Prodrugs(ElsevierPress,1985)中描述。

还提供了药物组合物的药学上的活性代谢物，以及这样的代谢物在本发明的方法中的用途。“药学上的活性代谢物”是指化合物或其盐在体内代谢的药理学上的活性产物。化合物的前体药物和活性代谢物可以使用本领域已知或可用的常规技术确定。参见，例如Bertolini等人，J.Med.Chem.1997,40,2011-2016；Shan等人，J.Pharm.Sci.1997,86(7),765-767；Bagshawe,Drug Dev.Res.1995,34,220-230；Bodor,Adv.Drug Res.1984,13,255-331；Bundgaard,Design of Prodrugs(Elsevier Press,1985)；和Larsen,Design and Application of Prodrugs,Drug Design and Development(Krogsgaard-Larsen等人编辑，Harwood Academic Publishers,1991)。

可以制备本文描述的化合物的任何合适的制剂。通常地，参见Remington'sPharmaceutical Sciences,(2000)Hoover,J.E.编辑，第20版，Lippincott Williams andWilkins Publishing Company,Easton,Pa.，780页-857页。制剂被选择以适用于适当的施用途径。一些施用途径是口服、肠胃外、通过吸入、局部、直肠、鼻、经颊、阴道、通过植入的储库或其他药物施用方法。在化合物足够碱性或酸性以形成稳定的无毒的酸或碱盐的情况中，施用作为盐的化合物可以是适当的。药学上可接受的盐的实例是与形成生理学上可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。也可以形成合适的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。药学上可接受的盐是使用本领域熟知的标准程序获得的，例如通过足够碱性的化合物诸如胺和合适的酸，提供生理学上可接受的阴离子。还制备了羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。

当考虑的化合物以药理学组合物施用时，考虑该化合物可以与药学上可接受的赋形剂和/或载体配制为混合物。例如，考虑的化合物可以以中性化合物或药学上可接受的盐口服施用，或在生理盐水溶液中静脉内施用。常规缓冲剂诸如磷酸盐、碳酸氢盐或柠檬酸盐可用于这样的目的。当然，本领域普通技术人员可以在本说明书的教导内修改制剂，以提供用于特定施用途径的多种制剂。特别地，可以修饰考虑的化合物以使其更可溶于水或其他媒介物，例如，可以通过本领域普通技术人员熟知的较小修改(盐制备(formulation)、酯化等)容易地实现。也是本领域普通技术人员熟知的，修改特定化合物的施用途径和剂量方案，以便为了在患者中的最大的有益作用管理本发明化合物的药物代谢动力学。

本文描述的药物组合物通常可溶于有机溶剂，诸如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、甘油、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜或其任何组合。在一个实施方案中，本发明提供了通过将剂与药学上可接受的载体混合制备的制剂。在一个方面，制剂可以使用包括以下的方法制备：a)将描述的剂溶解在水溶性有机溶剂、非离子溶剂、水溶性脂质、环糊精、维生素诸如生育酚、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂或其组合中，以提供溶液；和b)添加盐水或含有1％-10％碳水化合物溶液的缓冲液。在一个实例中，碳水化合物包括右旋糖。使用本发明方法获得的药物组合物是稳定的，并可用于动物和临床应用。

用于在本发明方法中使用的水溶性有机溶剂的说明性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、醇类、乙腈、N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜或其组合。醇类的实例包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、甘油或丙二醇。

用于在本发明方法中使用的水溶性非离子表面活性剂的说明性实例包括但不限于EL、聚乙二醇修饰的(聚氧乙烯甘油三蓖麻酸酯(polyoxyethyleneglyceroltriricinoleate 35)、氢化RH40、氢化RH60、PEG-琥珀酸酯、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、HS(聚乙二醇660 12-羟基硬脂酸酯)、脱水山梨糖醇单油酸酯(sorbitan monooleate)、泊洛沙姆(poloxamer)、(乙氧基化桃仁(persic)油、(辛酰基-已酰基聚乙二醇-8-甘油酯(capryl-caproyl macrogol-8-glyceride))、(甘油酯)、(PEG 6辛酸甘油酯)、甘油、乙二醇-聚山梨酸酯(glycol-polysorbate)或其组合。

用于在本发明方法中使用的水溶性脂质的说明性实例包括但不限于植物油(vegetable oil)、甘油三酯、植物性油(plant oil)或其组合。脂质油(lipid oil)的实例包括但不限于蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油、玉米油、橄榄油、棉籽油、花生油、薄荷油、红花油、芝麻油、大豆油、氢化植物油、氢化大豆油、椰子油的甘油三酯、棕榈籽油及其氢化形式、或其组合。

用于在本发明方法中使用的脂肪酸和脂肪酸酯的说明性实例包括但不限于油酸、甘油单酯、甘油二酯、PEG的单脂肪酸酯或PEG的二脂肪酸酯、或其组合。

用于在本发明方法中使用的环糊精的说明性实例包括但不限于α-环糊精、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精或磺丁基醚β-环糊精。

用于在本发明方法中使用的磷脂的说明性实例包括但不限于大豆磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰甘油、及其氢化形式、或其组合。

本领域技术人员可以在本说明书的教导内修改制剂，以提供用于特定施用途径的多种制剂。例如，可以修饰化合物以使其更可溶于水或其他媒介物。也是本领域普通技术人员熟知的，修改特定化合物的施用途径和剂量方案，以便为了在患者中的最大的有益作用管理本发明化合物的药物代谢动力学。

本文公开的药物组合物，例如包含磷酸化缺陷的突变体SerRS蛋白的组合物、包含在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的突变体SerRS蛋白的组合物、以及包含能够刺激VEGF转录的突变体SerRS蛋白的组合物，可以口服、肠胃外、通过吸入、局部、直肠、鼻、经颊、阴道、通过植入的储库或其他药物施用方法施用。如本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)、鞘内(intrathecal)、病灶内(intralesional)和颅内注射或输注技术。

可注射的组合物诸如无菌的可注射的水性悬浮液或油质悬浮液，可以根据本领域已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌的可注射的制剂还可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射的溶液或悬浮液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括甘露醇、水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。合适的载体和其他药物组合物组分通常是无菌的。

此外，无菌的不挥发性油被常规地作为溶剂或悬浮介质(例如合成的甘油单酯或甘油二酯)使用。脂肪酸，诸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射剂，即如药学上可接受的油，诸如橄榄油或蓖麻油，尤其是以它们的聚氧乙烯化的形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或相似的分散剂。通常在制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型中使用的各种乳化剂或生物利用度增强剂也可以用于配制的目的。

用于口服施用的组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括但不限于片剂、胶囊、乳液和水性悬浮液、分散体和溶液。在用于口服使用的片剂的情况中，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。也可以添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服施用，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服施用水性悬浮液或乳液时，活性成分可以悬浮或溶解在与乳化剂或悬浮剂组合的油相中。如果需要，可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。经鼻气雾剂或吸入组合物可以根据药物制剂领域熟知的技术制备，并且可以采用合适的防腐剂(例如苯甲醇)、增强生物利用度的吸收促进剂、和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂，制备为在例如盐水中的溶液。

实施例

上文讨论的实施方案的一些方面在随后的实施例中被进一步详细地公开，这些实施例不意图以任何方式限制本公开内容的范围。

实验材料和方法

以下实验材料和方法用于下文描述的实施例1-8。

细胞系

HEK293细胞、3B11细胞和MDA-MB-231细胞购自美国典型培养物保藏中心(American type culture collection)(ATCC,Manassas,VA,USA)，并在补充了热灭活胎牛血清(Omega Scientific,Tarzana,CA,USA)至10％终浓度的Dulbecco改良eagle培养基(Dulbecco's modified eagle medium)(ThermoFisher Scientific,Grand Island,NY,USA)中培养。使用Lipofectamine 2000(ThermFisher Scientific)进行瞬时转染。我们通过pBabe-puro(Addgene,Cambridge,MA,USA)逆转录病毒感染并用嘌呤霉素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)选择建立了表达小鼠或人类SerRS突变体的稳定3B11细胞系和稳定MDA-MB-231细胞系。低氧条件是用密封低氧室(Stemcell Technologies,Vancouver,BC,Canada)在血清减少(1％)培养基中实现的。

质粒构建体

将人类全长SerRS基因和小鼠全长SerRS基因克隆到pFlag-CMV-2载体(Sigma-Aldrich)和pBabe-puro载体(Addgene)中，并将人类SIRT2基因克隆到pCDNA6-V5/His-C载体(ThermoFisher Scientific)中。对于SerRS中的突变，我们进行了定点诱变PCR以获得SerRS^S101A/S241A和SerRS^S101D/S241D构建体。用于人类SerRS突变体构建体的引物序列是：对于S101A，5’GAA AGT CGC ACA AAT CAA AAA AGT CCG ACT CCT CAT TG 3’(SEQ ID NO:7)和5’TGA TTT GTG CGA CTT TCA GGT TAG CTA AAG CGT C 3’(SEQ ID NO:8)；对于S101D，5’GAA AGT CGA CCA AAT CAA AAA AGT CCG ACT CCT CAT TG 3’(SEQ ID NO:9)和5’TGA TTTGGT CGA CTT TCA GGT TAG CTA AAG CGT C 3’(SEQ ID NO:10)；对于S241A，5’AGC TCGCAC AGT TTG ATG AAG AAC TTT ATA AGG 3’(SEQ ID NO:11)和5’AAC TGT GCG AGC TGTGCC ACC TCC TGC ATG ACC TCC 3’(SEQ ID NO:12)；对于S241D，5’AGC TCG ACC AGT TTGATG AAG AAC TTT ATA AGG 3’(SEQ ID NO:13)和5’AAC TGG TCG AGC TGT GCC ACC TCCTGC ATG ACC TCC 3’(SEQ ID NO:14)。用于小鼠SerRS突变体构建体的引物序列是：对于S101A，5’GAA AGT CGC ACA GAT TAA AAA AGT CCG ACT CCT CAT TG 3’(SEQ ID NO:15)和5’TAA TCT GTG CGA CTT TCA GGG CAG CTA GCG CGT C 3’(SEQ ID NO:16)；对于S101D，5’GAA AGT CGA CCA GAT TAA AAA AGT CCG ACT CCT CAT TG 3’(SEQ ID NO:17)和5’TAATCT GGT CGA CTT TCA GGG CAG CTA GCG CGT C 3’(SEQ ID NO:18)；对于S241A，5’CAGCTC GCC CAG TTT GAT GAA GAA CTT TAT AAG GTG 3’(SEQ ID NO:19)和5’CAA ACT GGGCGA GCT GGG CCA CTT CCT GCA TG3’(SEQ ID NO:20)；对于S241D，5’CAG CTC GAC CAGTTT GAT GAA GAA CTT TAT AAG GTG 3’(SEQ ID NO:21)和5’CAA ACT GGT CGA GCT GGGCCA CTT CCT GCA TG 3’(SEQ ID NO:22)。在本段的序列中以粗体显示的核苷酸编码取代的残基。

为了蛋白纯化，将人类SerRS及其突变体基因亚克隆到pET-20b(+)质粒中(Novagen,Darmstadt,Germany)，并在大肠杆菌(E.coli)中过表达。重组的C末端加His₆标签的蛋白使用Ni-NTA珠(Qiagen,Valencia,CA,USA)纯化。重组蛋白的纯度通过4％-12％Mini Gel(ThermoFisher Scientific)电泳、随后通过考马斯蓝染色评价。蛋白浓度使用Bradford蛋白测定(BioRad,Hercules,CA,USA)确定。

RNAi

将针对人类SerRS(5’GGC ATA GGG ACC CAT CAT TGA 3’(SEQ ID NO:23)，在3’-UTR中)、GlyRS(5’GCA TGG AGT ATC TCA CAA AGT3’(SEQ ID NO:24)，在开放阅读框中)设计的编码短发夹RNA(shRNA)的DNA寡聚物插入到pLentiLox-hH1质粒中，该质粒由pLentiLox 3.7质粒修饰获得，以包含H1启动子(在Xba I和Xho I位点之间)来驱动shRNA表达。对于非靶向对照shRNA，我们使用了序列5’TAA GGC TAT GAA GAG ATA C 3’(SEQ IDNO:25)。针对ATM和ATR的SiRNA双链体购自Cell Signaling Technology(Danvers,MA,USA)。

实时PCR测定

用TRIzol试剂(ThermoFisher Scientific)从细胞和斑马鱼胚胎中分离出总RNA。用M-MLV逆转录酶(Promega,Madison,WI,USA)将来自每个样品的一微克总RNA逆转录成cDNA。所有实时PCR反应都使用StepOnePlus Real-Time PCR系统(ThermFisherScientific)使用SYBR Select主混合物(ThermFisher Scientific)进行。用于PCR反应的引物对是：对于人类VEGFA，5’GAG GGC AGA ATC ATC ACG AAG 3’(SEQ ID NO:26)和5’TGTGCT GTA GGA AGC TCA TCT CTC 3’(SEQ ID NO:27)；对于人类β-肌动蛋白，5’CGT CAC CAACTG GGA CGA 3’(SEQ ID NO:28)和5’ATG GGG GAG GGC ATA CC 3’(SEQ ID NO:29)；对于斑马鱼vegfa，5’GGC TCT CCT CCA TCT GTC TGC 3’(SEQ ID NO:30)和5’CAG TGG TTT TCTTTC TTT GCT TTG 3’(SEQ ID NO:31)；对于斑马鱼β-肌动蛋白，5’TCA CCA CCA CAG CCGAAA GAG 3’(SEQ ID NO:32)和5’GTC AGC AAT GCC AGG GTA CAT 3’(SEQ ID NO:33)。PCR反应程序在95℃开始持续10分钟，随后进行在95℃持续20秒和在60℃持续1分钟的45个循环。每个实验一式三份地进行。VEGFA基因表达针对β-肌动蛋白的表达被归一化。使用软件SigmaPlot(10.0版)进行统计学分析。使用学生t检验以分析不同组之间的变化。

在斑马鱼中的体内研究

将转基因Tg(Fli1a:EGFP)斑马鱼如我们之前描述的进行维持(参考(Ref))。在显微注射之前和之后，将鱼胚胎保持在28.5℃。将靶向SerRS的反义吗啉代(MO)以每个胚胎4～5ng的剂量注射到1细胞期胚胎的卵黄中。SerRS-MO的序列是(参考)。SerRS-MO(5’AGGAGA ATG TGA ACA AAC CTG ACA C 3’(SEQ ID NO:34))和标准对照MO(5’CCT CTT ACC TCAGTT ACA ATT TAT A 3’(SEQ ID NO:35))购自Gene Tools,LLC(Philomath,OR,USA)。在注射之后，将胚胎在补充了0.003％1-苯基-2-硫脲(PTU)的E3胚胎培养基中在28.5℃培养，以预防色素形成。将胚胎用0.168mg mL^-1三卡因(Sigma-Aldrich)麻醉，固封在2％甲基纤维素中，并用配备有Nikon CCD相机(Qimaging Retiga 2000R)的Nikon荧光显微镜(AZ100)拍摄照片。涉及斑马鱼的所有实验都已经根据由动物护理和使用机构委员会(theInstitutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)制定的指南在斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institute)进行，IACUC批准号为09-0009。使用软件SPSSStatistics 19进行统计学分析。用χ2检验分析不同SerRS突变体对ISV发育的补救作用。

免疫印迹和免疫沉淀

用裂解缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM EGTA、1mM EGTA、1％Triton X-100、2.5mM焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸盐、1mM Na₃VO₄和蛋白酶抑制剂混合物)在冰上重悬细胞。将上清液与指示的抗体和蛋白-G-缀合的琼脂糖珠(ThermoFisherScientific)孵育至少2小时。将珠用洗涤缓冲液(与裂解缓冲液相同，除了将Triton X-100从1％减少至0.1％)洗涤5次，并然后经受SDS-PAGE以及用指示的抗体的免疫印迹分析。使用TRIzol试剂(ThermoFisher Scientific)制备来自斑马鱼的蛋白样品。用于免疫沉淀的单克隆抗Flag抗体购自Sigma-Aldrich。定制的兔抗人类SerRS抗体是针对纯化的人类重组SerRS产生并亲和纯化的。抗ATM/ATR底物p-SQ、抗ATM、抗p-ATM(丝氨酸1981)、抗ATR、抗SIRT2、抗α-微管蛋白、抗β-肌动蛋白、抗核纤层蛋白A/C、抗P53、抗p-P53(丝氨酸15)、抗RPA32、抗p-RPA32(丝氨酸33)、抗CHK1、抗p-CHK1(丝氨酸345)、抗CHK2、抗p-CHK2(苏氨酸68)和抗HIF1β(ARNT)抗体购自Cell Signaling Technology。抗HIF1α抗体购自NovusBiologicals(Littleton,CO,USA)。抗V5抗体和抗GlyRS抗体分别购自ThermoFisherScientific和Abnova(Walnut,CA,USA)。

基质胶栓血管发生测定

将总共10⁶个稳定转染的3B11细胞重悬于100μl补充了10％FBS的DMEM培养基中，并然后与200μl冰冷的基质胶(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)液体在冰上混合。将300μl细胞和基质胶混合物皮下注射到C3H/HeJ小鼠的胁腹(每只小鼠两个注射部位且每组中5-6只小鼠)(Jackson Laboratory)。在接种后14天，将基质胶栓切下，并在OCT化合物中冷冻，用于低温恒温器切片。所有小鼠实验都根据由动物护理和使用机构委员会(IACUC)制定的指南在斯克里普斯研究所进行，IACUC批准协议号为13-0003。

异种移植物肿瘤模型

将10⁶个稳定转染了表达野生型人类SerRS、SerRS^S101A/S241A或SerRS^S101D/S241D的载体的MDA-MB-231细胞皮下注射到6-8周龄雌性NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ小鼠的哺乳动物腺体中(每组中6只小鼠)(Jackson Laboratory)。在注射后14天，从小鼠分离肿瘤异种移植物，并在OCT化合物中冷冻用于低温恒温器切片。

免疫组织化学

将来自新鲜冷冻的肿瘤异种移植物和基质胶栓的5μm切片用丙酮和3％H₂O₂处理以封闭内源过氧化物酶。在3-5次洗涤和山羊血清封闭后，将切片与抗CD31抗体(1:3000；CellSignaling Technology)在4℃孵育过夜。在肿瘤异种移植物样品的5-10个随机的可行的视野(120倍)中对血管进行计数，并使用Image J软件通过测量CD31染色密度对基质胶栓中的微血管密度进行定量。为了检测低氧，我们将切片与抗HIF1α抗体(1:100；NovusBiologicals)孵育。

EMSA

对应于VEGFA启动子上的SerRS结合位点的27bp DNA寡核苷酸(5’GGC GGG GCGGAG CCA TGC GCC CCC CCC 3’(SEQ ID NO:36))被合成、退火，并通过T4 DNA激酶(NewEngland Biolabs,Ipswich,MA,USA)在5’端进行[³²P]标记，然后使用sephadex G-25离心柱(GE Healthcare,Pittsburgh,PA,USA)进行脱盐。将标记的寡核苷酸(0.08pmol)与指示浓度的重组SerRS在结合缓冲液(20mM Tris-HCl、pH 8.0、60mM KCl、5mM MgCl₂、0.1mg ml^{- 1}BSA、10ng μl^-1聚(dG-dC)、1mM DTT)中在室温孵育30分钟。将样品加载到5％非变性聚丙烯酰胺凝胶(native polyacrylamide gel)(17.5cm长)中，并在250V在运行缓冲液(25mMTris，pH 8.3，190mM甘氨酸)中进行电泳。然后凝胶被干燥并通过放射自显影术检查。

细胞分级分离

通过使用细胞核和胞质提取试剂盒(ThermoFisher Scientific)分离和提取胞质级分和细胞核级分。外源表达的SerRS蛋白或内源SerRS蛋白使用抗flag多克隆抗体(Sigma-Aldrich)或多克隆抗SerRS抗体通过蛋白印迹分析检测。

染色质免疫沉淀(ChIP)

将细胞用甲醛(1％终浓度)在室温固定10分钟。通过添加125mM甘氨酸终止反应。根据ChIP-IT Express Enzymatic试剂盒(Active Motif)的方案，用亲和纯化的多克隆抗SerRS抗体进行ChIP测定。在3次洗涤后，使用SYBR Select主混合物(Applied Biosystems)在StepOnePlus实时PCR系统上分析染色质免疫沉淀的DNA。使用靶向VEGFA启动子的引物组(5'-GGGCGGATGGGTAATTTTCA-3’(SEQ ID NO:37)和5’-CTGCGGACGCCCAGTGAA-3’(SEQ IDNO:38))。

实施例1

SerRS参与低氧应答以调控VEGFA

本实施例示出了SerRS参与低氧应答以调控VEGFA的表达。

用靶向SerRS基因的3’非翻译区(3’-UTR)的短发夹RNA(shRNA)敲低HEK293细胞中SerRS表达(图1A)。在正常氧气浓度(常氧)，如先前观察到的(Shi等人，2014)，与用非特异性对照shRNA(sh-对照)或靶向另一种氨基酰-tRNA合成酶的shRNA(sh-GlyRS)转染的对照细胞相比，在敲低SerRS后，VEGFA表达上调(图1A)。然而，在低氧下，尽管对照细胞中的VEGFA表达如预期地显著增强，但SerRS敲低的细胞中的低氧应答大幅减少(图1A和插图)，表明SerRS参与低氧应答以调控VEGFA。

实施例2

SerRS参与低氧应答以调控VEGFA

该实施例描述了测试在SerRS敲低的细胞中减少的VEGFA刺激是否是由SerRS在阻抑由低氧诱导的VEGFA中的作用的失活引起的实验。

如图7A中示出的，低氧不影响SerRS的表达。研究了SerRS的潜在翻译后修饰。在Matsuoka等人2007年描述的大规模质谱研究中，发现SerRS通过由DNA损伤活化的ATM/ATR激酶在丝氨酸241(S241)处被磷酸化。在PhosphoSitePlus数据库(Hornbeck等人，2015)中，还发现了另一个可能的SerRS磷酸化位点丝氨酸101(S101)。两个位点具有保守ATM/ATR底物基序，其中丝氨酸或苏氨酸之后是谷氨酰胺并且之前是两个疏水残基(在相对于丝氨酸/苏氨酸的-1和-3的位置)(图1B)。多序列比对揭示了脊椎动物SerRS中S/T101和S/T241以及侧翼的ATM/ATR底物基序残基的严格保守性(图1B)，同时揭示了SerRS在调控血管发育和血管发生中的作用。

DNA片段诱导的SerRS磷酸化通过体外³²P标记证实。将双链DNA寡核苷酸添加到HEK293细胞的细胞核提取物中以模拟DNA损伤以活化ATM/ATR。“活化的”细胞核提取物特异性地诱导纯化的重组SerRS而非GlyRS的稳健的磷酸化(图1C)。通过使用特异性磷酸化-ATM/ATR底物(phosphor-ATM/ATR substrate)(p-SQ)抗体进一步证实SerRS磷酸化(图1D)。为了证实SerRS上的磷酸化位点，我们分别用丙氨酸取代S101和S241以生成SerRS^S101A和SerRS^S241A，并同时生成SerRS^S101A/S241A。如通过p-SQ抗体(图1D)和³²P标记(图7B)两者检查的，SerRS^S101A示出了降低的磷酸化水平，而SerRS^S241A和SerRS^S101A/S241A几乎不具有体外磷酸化，表明SerRS可以通过ATM/ATR激酶在S101和S241两者处被磷酸化，并且S241是SerRS上的主要磷酸化位点。

为了在细胞中证实SerRS磷酸化，将HEK293细胞用包括低氧的应激和可以活化ATM/ATR的UV辐射进行刺激。在低氧下，HEK293细胞中内源SerRS的磷酸化在12小时内被检测到(图1E)。在低氧的HEK293细胞中，外源表达的SerRS^S101A/S241A示出了比野生型SerRS(SerRS^WT)弱得多的磷酸化(图1F)，证实了S241和/或S101是低氧应激下的主要磷酸化位点。

为了进一步证实ATM和ATR负责低氧下SerRS磷酸化，通过siRNA分别或同时敲低ATM和ATR。当ATM或ATR被敲低时，低氧诱导的SerRS磷酸化被大幅抑制；并且当两种激酶同时被敲低时，低氧诱导的SerRS磷酸化被完全阻断(图1G)。与这些结果一致，低氧下SerRS磷酸化也可以分别被特异性ATM和ATR抑制剂KU-55933和VE-821阻断(图7C)。UV辐射下也检测到SerRS磷酸化(图7D)。

实施例3

磷酸化使作为人类细胞和斑马鱼中VEGFA的转录阻遏物的SerRS失活

本实施例示出了SerRS的磷酸化导致SerRS的转录阻遏物活性的损失。

为了理解SerRS的磷酸化是否影响其作为VEGFA转录阻遏物的作用，生成了携带S101和S241被天冬氨酸残基双重取代的突变形式的SerRS(SerRS^S101D/S241D或SerRS^{S101D /S241D})，以模拟磷酸化的SerRS。在HEK293细胞中，与SerRS^WT和SerRS^S101A/S241A不同，SerRS^S101D/S241D不再可以阻遏VEGFA转录(图2A)，表明磷酸化可以完全抑制SerRS的转录阻遏物活性。

为了研究体内SerRS磷酸化的作用，使用了Fukui等人2009年和Xu等人2012年描述的先前建立的斑马鱼系统。在斑马鱼胚胎中，用反义吗啉代(SerRS-MO)敲低内源SerRS表达，这导致Vegfa的mRNA水平的4倍增加(图2B)。该作用可以通过共注射人类SerRS^WTmRNA或SerRS^S101A/S241AmRNA与SerRS-MO来补救或很大程度上补救。然而，如图2B中示出的，共注射SerRS^S101D/S241DmRNA完全不具有补救作用，证实了在S101和S241处的磷酸化完全阻断了体内SerRS的转录阻遏物活性。

实施例4

磷酸化消除了斑马鱼中SerRS的抗血管发生活性

在本实施例中，检测了SerRS磷酸化对斑马鱼中血管发育的作用。

图2C和图2示出了，通过注射SerRS-MO敲低SerRS如预期地导致69.7％(n＝211个中的147个)的斑马鱼胚胎中异常的过度节间血管(ISV)分支表型。相比之下，只有9.2％(n＝142个中的13个)的注射了对照吗啉代(对照-MO)的斑马鱼胚胎显示出过度ISV表型。共注射人类SerRS^S101A/S241AmRNA很大程度上补救了异常ISV分支(26.4％，n＝125个中的33个)，这与SerRS^WTmRNA的补救作用(17.9％，n＝162个中的29个)相当(图2C和2D)。相比之下，SerRS^S101D/S241D不能补救异常ISV分支(62.7％，n＝134个中的84个)(图2C和2D)，证实了SerRS磷酸化阻断了SerRS在体内的抗血管发生活性。

实施例5

磷酸化通过减弱SerRS的DNA结合能力使其失活

本实施例示出了磷酸化的SerRS具有减少的DNA结合能力。

为了探索SerRS磷酸化如何使其作为转录阻遏物的功能失活的分子机制，检查了低氧对HEK293细胞中SerRS细胞核定位的作用。结果是阴性的(图8A)。一致地，在HEK293细胞中还发现了外源表达的SerRS^WT、SerRS^S101D/S241D和SerRS^S101A/S241A蛋白的相似的胞质/细胞核分布(图8B)。

Shi等人2014年已经描述了SIRT2作为SerRS表观遗传上沉默VEGFA表达的必要的辅因子。检测了低氧下SerRS和SIRT2之间的相互作用。在将HEK293细胞在低氧下培养6或12小时之前和之后，HEK293细胞中相似的量的SIRT2与SerRS免疫共沉淀(图8C)。一致地，SIRT2与SerRS^S101A/S241A和SerRS^S101D/S241D的相互作用与SIRT2与SerRS^WT的相互作用一样强烈(图8D)，表明低氧不影响SerRS-SIRT2相互作用。

还探讨了低氧对SerRS与VEGFA启动子的相互作用的影响。如通过电泳迁移率变换测定(EMSA)检测的，SerRS与³²P标记的27-bp DNA片段(先前在Shi等人2014年中被鉴定为来自VEGFA启动子的SerRS结合位点)之间的直接结合通过模拟磷酸化(phosphor-mimicking)的突变体SerRS^S101D/S241D被减弱(图2E)。在HEK293细胞中，SerRS^S101D/S241D还示出了在VEGFA启动子上的降低的结合，如通过染色质免疫沉淀测定确定的(图2F)。还在低氧期间用HEK293细胞进行了该测定，并且示出了结合到VEGFA启动子的内源SerRS的逐渐降低的水平(图2G)。这些数据示出了低氧诱导的磷酸化通过减弱SerRS的DNA结合能力来阻断SerRS的转录阻遏物活性。

实施例6

ATM/ATR-SerRS是调控低氧诱导的血管发生的关键途径

本实施例描述了研究ATM/ATR-SerRS途径在多大程度上促进低氧诱导的VEGFA表达的实验。

在HEK293细胞中通过特异性抑制剂阻断ATM或ATR。如图3A中示出的，ATR抑制剂VE-821显著抑制低氧下VEGFA诱导，而ATM抑制剂KU-55933的作用较小，但仍是统计学上显著的，表明ATM和ATR是在低氧期间刺激VEGFA表达的重要参与者。

ATM和ATR具有许多底物，其中大部分参与DNA损伤应答。为了测试SerRS是否是介导ATM/ATR在低氧下刺激VEGFA表达的作用的主要底物，磷酸化缺陷的SerRS^S101A/S241A被引入到HEK293细胞中以阻断ATM/ATR-SerRS途径。SerRS^S101A/S241A的过表达显著阻抑了VEGFA诱导，而SerRS^WT的过表达则不具有作用(图3B)。这些结果表明，ATM/ATR介导的SerRS磷酸化以使SerRS的转录阻遏物失活，在低氧下的VEGFA诱导中起重要作用。

实施例7

阻断ATM/ATR-SerRS途径可以与HIF敲低合作，以实现低氧诱导的VEGFA表达的完 全抑制

虽然HIF被认为是促进VEGFA表达和血管发生的主要的低氧诱导的转录因子，但是单独抑制HIF并不能完全阻断血管发生。不受任何特定理论的约束，认为这是因为独立于HIF的途径的参与。参见，例如Lee和Lee,2013，Mizukami等人，Mizukami等人,2004。鉴于ATM/ATR介导的SerRS磷酸化在低氧应答中的重要作用，本实施例测试VEGFA诱导的大幅抑制或完全抑制是否可以通过抑制HIF并同时通过表达SerRS^S101A/S241A来阻断ATM/ATR-SerRS途径来实现。

用shHIF-1α构建体和shHIF-2α构建体两者一起转染HEK293细胞；然而，HIF-2α在细胞中是不可检测的，这与其组织特异性表达模式一致。如图3C中示出的，通过shRNA(shHIF)敲低HEK293细胞中的HIF不能完全阻断通过低氧的VEGFA诱导。然而，如果在HIF被敲低时，我们同时表达具有组成型活性的SerRS^S101A/S241A，则我们完全抑制了低氧下的VEGFA诱导(图3C)。该结果不仅证明了ATM/ATR-SerRS途径独立于HIF，而且表明了SerRS^S101A/S241A与HIF抑制组合使用以实现低氧诱导的血管发生的完全阻抑的潜力。进一步的结果示出，在过表达SerRS^S101A/S241A的基础上敲低HIF并未提供任何附加的效力，表明SerRS^S101A/S241A可以完全替代和推翻(overthrow)HIF-1抑制的作用。

实施例8

SerRS^S101A/S241A绕过低氧应答并强烈抑制小鼠中的血管发生

本实施例描述了研究SerRS^S101A/S241A的活性和哺乳动物中SerRS磷酸化在低氧诱导的血管发生中的作用的实验。它示出，对于三阴性人类乳腺癌的鼠动物模型，磷酸化缺陷形式的SerRS(SerRS^S101A/S241A)的过表达可以比HIF-1敲低稳健得多地阻抑血管发生和肿瘤生长，表明SerRS^S101A/S241A抑制HIF依赖性的和独立于HIF的低氧应答途径两者。

使用了基质胶栓血管发生测定。将小鼠内皮3B11细胞用小鼠SerRS^WT、SerRS^{S101A /S241A}或SerRS^S101D/S241D基因稳定转染，以实现与内源性小鼠SerRS的表达水平相似的表达水平(图4A)。将工程化的3B11细胞与基质胶在体外在低温混合。将每种混合物皮下注射到小鼠中以固化成栓(plug)，其中在血管系统的诱导之前将形成低氧环境。在注射后两周，通过升高的Hif-1α蛋白水平证实了基质胶栓内存在低氧环境(图9)。同时，通过CD31免疫染色评价栓中的微血管。如同SerRS^S101D/S241D，SerRS^WT的表达不阻抑微血管形成(图4B和4C)，表明SerRS^WT的抗血管发生活性在低氧下被失活。然而，如图4B和4C中示出的，磷酸化缺陷的SerRS^S101A/S241A的表达强烈阻抑了基质胶栓中微血管的形成，证明SerRS磷酸化/失活对体内低氧诱导的血管发生是重要的。

由于低氧诱导的血管发生对实体瘤生长是至关重要的，因此进行了实验以确定低氧诱导的SerRS磷酸化/失活对肿瘤血管发生是否重要。将人类乳腺癌细胞MDA-MB-231用人类SerRS^WT、SerRS^S101A/S241A或SerRS^S101D/S241D基因稳定转染，以提供与内源蛋白的表达水平相比的高水平的过表达(约10倍)(图4D)。将工程化的细胞皮下植入到免疫缺陷的NOD scidgamma(NSG)小鼠的哺乳动物腺体中。两周后，通过CD31染色检查肿瘤异种移植物中的血管系统(图4E和4F)。在该系统中，SerRS^WT阻抑肿瘤血管发生，可能是因为SerRS的高表达水平使ATM/ATR的磷酸化能力饱和。然而，与SerRS^WT相比，SerRS^S101A/S241A示出了强得多的血管发生抑制(图4E和4F)。有趣的是，SerRS^S101D/S241D在促进肿瘤血管发生方面具有强活性。可能地，SerRS^S101D/S241D的过表达已经隔离(sequestered)了已知具有抗血管发生功能的SIRT2(Shi等人，2014)。这些结果证明了SerRS的磷酸化在低氧诱导的肿瘤血管发生中的至关重要的作用。

实施例9

SerRS中磷酸化位点的鉴定

研究了人类SerRS蛋白的翻译后修饰。将对应于SerRS大小的凝胶条带脱色、还原(10mM DTT)、烷基化(55mM碘乙酰胺)并用胰蛋白酶消化过夜，然后通过nano-LC-MS/MS分析。针对含有提供的序列的定制序列数据库搜索原始数据，并且感兴趣的蛋白被鉴定具有31个独特的肽和62％序列覆盖率。针对给定序列搜索MS/MS数据，以确认丝氨酸上可能的磷酸化。在人类SerRS蛋白的S79、S86、S394和S396上发现磷酸化位点。

实施例10

对SerRS上的磷酸化位点的修饰对VEGFA表达的作用

在本实施例中，研究了野生型人类SerRS蛋白和多种突变体人类SerRS蛋白，以确认它们影响VEGFA表达的能力。

将HEK293细胞用野生型(WT)SerRS或SerRS突变体转染。将潜在的可磷酸化残基(丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或酪氨酸(Y))分别用丙氨酸(A)或天冬氨酸(D)取代，以模拟未磷酸化的和磷酸化的状态。在转染后24小时，收获细胞，并通过qRT-PCR测量VEGFA表达水平，并在针对β-肌动蛋白归一化后，对相对VEGFA转录绘图(平均值±SEM)。结果在图10中示出。如图10中示出的，对SerRS上的磷酸化位点的修饰可以改变SerRS调控VEGFA表达的能力。

实施例11

在低氧期间内源性SerRS与VEGFA启动子的结合

低氧对HEK293细胞中SerRS、c-Myc和Hif1α与VEGFA启动子的结合的影响用染色质IP(ChIP)检查。如图12中示出的，在低氧期间，SerRS的DNA结合减少，这与c-Myc和Hif1α的DNA结合的增加同时发生。

SerRS的DNA结合的降低被认为是由低氧期间SerRS磷酸化引起的。同时发生的Hif1α和c-Myc的DNA结合的增加表明SerRS的失活可能是Myc和Hif1α两者的活化所需要的。

在先前描述的实施方案中的至少一些中，在一个实施方案中使用的一个或更多个要素可以在另一个实施方案中互换使用，除非这样的替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，可以对上文描述的方法和结构进行各种其他省略、添加和修改，而不背离所要求保护的主题的范围。所有这样的修改和改变都意图落入如所附权利要求定义的主题的范围内。

关于本文的大体上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以适于上下文和/或应用来将复数翻译为单数和/或将单数翻译为复数。各种单数/复数排列可以为了清楚而在本文中清楚地列出。

本领域技术人员将理解，通常地，本文所使用的术语，且尤其是在所附的权利要求(例如，所附的权利要求的主体)中所使用的术语，通常意指“开放式的”术语(例如，术语“包括(including)”应当被理解为“包括但不限于”，术语“具有”应当被理解为“至少具有”，术语“包括(includes)”应当被理解为“包括但不限于”等)。本领域技术人员还将理解，如果意图得到特定数量的引入的权利要求表述，则这样的意图将明确地在权利要求中表述，并且在不存在这样的表述时，则不存在这样的意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包含引导性措辞“至少一个”和“一个或更多个”的使用以引入权利要求表述。然而，这样的措辞的使用不应当解释为意味着通过不定冠词“一(a)”或“一(an)”引入权利要求表述将包含这样的引入的权利要求表述的任何特定的权利要求限制为包含仅仅一个这样的表述的实施方案，甚至当相同的权利要求包括引导性短语“一个或更多个”或“至少一个”和不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”(例如，“一(a)”和/或“一(an)”应当被解释为表示“至少一个”或“一个或更多个”)时；这对于用于引导权利要求表述的定冠词的使用同样是适用的。另外，即使被引入的权利要求叙述的具体数量被明确引用，本领域技术人员将认识到，这样的叙述应当被理解为意指至少所引用的数量(例如，“两个叙述”的不具有其他修饰语的单纯叙述，意指至少两个叙述，或者是指两个或更多个叙述)。另外，在使用与“A、B和C等中的至少一个”相似的惯例的那些情况下，通常地，这样的结构在意义上意图是本领域技术人员在惯例中所理解的意思(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于只具有A、只具有B、只具有C、具有A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B和C一起的系统，等等)。在使用与“A、B和C等中的至少一个”相似的惯例的那些情况下，通常地，这样的结构在意义上意图是本领域中技术人员在惯例中所理解的意思(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”可能包括但不限于只具有A、只具有B、只具有C、具有A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B和C一起的系统，等等)。本领域技术人员还应当理解，实际上表示两个或更多个可选术语的任何转折性词语和/或短语，无论是在说明书、权利要求或附图中，都应当被理解为考虑了包括一个术语、术语中的任一个、或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，当本公开内容的特征或方面以马库什组来描述时，本领域技术人员将认识到，本公开内容从而还根据马库什组的任何单独的成员或成员的子组来描述。

如将被本领域技术人员所理解的，出于任何的和所有的目的，诸如在提供书面描述的方面，本文公开的所有范围还涵盖任何的和所有可能的子范围和其子范围的组合。任何所列出的范围可以很容易地被识别为足够描述并且使相同的范围能被分解成至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等等，都包括所列举的数量，并且指的是可以被随后分解成如上文讨论的子范围的范围。最后，如将被本领域技术人员所理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组指的是具有1个、2个或3个物品的组。相似地，具有1-5个物品的组指的是具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组等。

虽然本文公开了各个方面和实施方案，但是其他的方面和实施方案对于本领域技术人员来说将是明显的。本文公开的各个方面和实施方案是为了说明的目的并且不意图是限制性的，其中真正的范围和精神通过所附权利要求指示。

序列表

<110> 斯克利普斯研究所

X-L·杨

师义

Z·刘

<120> 通过调控丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)的磷酸化控制血管发生

<130> AARS.004WO

<150> 62/375592

<151> 2017-08-16

<160> 46

<170> 用于Windows 4.0 版本的FastSEQ

<210> 1

<211> 514

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 1

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Val Asp Lys Gly Gly Asp Pro

1 5 10 15

Ala Leu Ile Arg Glu Thr Gln Glu Lys Arg Phe Lys Asp Pro Gly Leu

20 25 30

Val Asp Gln Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Trp Arg Arg Cys Arg Phe

35 40 45

Arg Ala Asp Asn Leu Asn Lys Leu Lys Asn Leu Cys Ser Lys Thr Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Pro Val Gly Asp Asp Glu Ser Val

65 70 75 80

Pro Glu Asn Val Leu Ser Phe Asp Asp Leu Thr Ala Asp Ala Leu Ala

85 90 95

Asn Leu Lys Val Ser Gln Ile Lys Lys Val Arg Leu Leu Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Ile Leu Lys Cys Asp Ala Glu Arg Ile Lys Leu Glu Ala Glu Arg

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Ser Val Pro

130 135 140

Ile Ser Asn Asp Glu Asp Val Asp Asn Lys Val Glu Arg Ile Trp Gly

145 150 155 160

Asp Cys Thr Val Arg Lys Lys Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met

165 170 175

Val Asp Gly Phe Glu Gly Glu Lys Gly Ala Val Val Ala Gly Ser Arg

180 185 190

Gly Tyr Phe Leu Lys Gly Val Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile

195 200 205

Gln Tyr Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Arg Gly Tyr Ile Pro Ile Tyr

210 215 220

Thr Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Ser Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu

245 250 255

Lys Ser Asp Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser

260 265 270

Glu Gln Pro Ile Ala Ala Leu His Arg Asp Glu Trp Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Asp Leu Pro Ile Lys Tyr Ala Gly Leu Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu

290 295 300

Val Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln

305 310 315 320

Phe Glu Lys Ile Glu Gln Phe Val Tyr Ser Ser Pro His Asp Asn Lys

325 330 335

Ser Trp Glu Met Phe Glu Glu Met Ile Thr Thr Ala Glu Glu Phe Tyr

340 345 350

Gln Ser Leu Gly Ile Pro Tyr His Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ser

355 360 365

Leu Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro

370 375 380

Gly Ser Gly Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met

405 410 415

Met Asp Lys Val Glu Phe Val His Met Leu Asn Ala Thr Met Cys Ala

420 425 430

Thr Thr Arg Thr Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Thr Glu Lys

435 440 445

Gly Ile Thr Val Pro Glu Lys Leu Lys Glu Phe Met Pro Pro Gly Leu

450 455 460

Gln Glu Leu Ile Pro Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Glu Gln Glu Pro

465 470 475 480

Ser Lys Lys Gln Lys Lys Gln His Glu Gly Ser Lys Lys Lys Ala Ala

485 490 495

Ala Arg Asp Val Thr Leu Glu Asn Arg Leu Gln Asn Met Glu Val Thr

500 505 510

Asp Ala

<210> 2

<211> 514

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Val Asp Lys Gly Gly Asp Pro

1 5 10 15

Ala Leu Ile Arg Glu Thr Gln Glu Lys Arg Phe Lys Asp Pro Gly Leu

20 25 30

Val Asp Gln Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Trp Arg Arg Cys Arg Phe

35 40 45

Arg Ala Asp Asn Leu Asn Lys Leu Lys Asn Leu Cys Ser Lys Thr Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Pro Val Gly Asp Asp Glu Ser Val

65 70 75 80

Pro Glu Asn Val Leu Ser Phe Asp Asp Leu Thr Ala Asp Ala Leu Ala

85 90 95

Asn Leu Lys Val Ala Gln Ile Lys Lys Val Arg Leu Leu Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Ile Leu Lys Cys Asp Ala Glu Arg Ile Lys Leu Glu Ala Glu Arg

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Ser Val Pro

130 135 140

Ile Ser Asn Asp Glu Asp Val Asp Asn Lys Val Glu Arg Ile Trp Gly

145 150 155 160

Asp Cys Thr Val Arg Lys Lys Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met

165 170 175

Val Asp Gly Phe Glu Gly Glu Lys Gly Ala Val Val Ala Gly Ser Arg

180 185 190

Gly Tyr Phe Leu Lys Gly Val Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile

195 200 205

Gln Tyr Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Arg Gly Tyr Ile Pro Ile Tyr

210 215 220

Thr Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Ser Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu

245 250 255

Lys Ser Asp Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser

260 265 270

Glu Gln Pro Ile Ala Ala Leu His Arg Asp Glu Trp Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Asp Leu Pro Ile Lys Tyr Ala Gly Leu Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu

290 295 300

Val Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln

305 310 315 320

Phe Glu Lys Ile Glu Gln Phe Val Tyr Ser Ser Pro His Asp Asn Lys

325 330 335

Ser Trp Glu Met Phe Glu Glu Met Ile Thr Thr Ala Glu Glu Phe Tyr

340 345 350

Gln Ser Leu Gly Ile Pro Tyr His Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ser

355 360 365

Leu Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro

370 375 380

Gly Ser Gly Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met

405 410 415

Met Asp Lys Val Glu Phe Val His Met Leu Asn Ala Thr Met Cys Ala

420 425 430

Thr Thr Arg Thr Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Thr Glu Lys

435 440 445

Gly Ile Thr Val Pro Glu Lys Leu Lys Glu Phe Met Pro Pro Gly Leu

450 455 460

Gln Glu Leu Ile Pro Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Glu Gln Glu Pro

465 470 475 480

Ser Lys Lys Gln Lys Lys Gln His Glu Gly Ser Lys Lys Lys Ala Ala

485 490 495

Ala Arg Asp Val Thr Leu Glu Asn Arg Leu Gln Asn Met Glu Val Thr

500 505 510

Asp Ala

<210> 3

<211> 514

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Val Asp Lys Gly Gly Asp Pro

1 5 10 15

Ala Leu Ile Arg Glu Thr Gln Glu Lys Arg Phe Lys Asp Pro Gly Leu

20 25 30

Val Asp Gln Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Trp Arg Arg Cys Arg Phe

35 40 45

Arg Ala Asp Asn Leu Asn Lys Leu Lys Asn Leu Cys Ser Lys Thr Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Pro Val Gly Asp Asp Glu Ser Val

65 70 75 80

Pro Glu Asn Val Leu Ser Phe Asp Asp Leu Thr Ala Asp Ala Leu Ala

85 90 95

Asn Leu Lys Val Ser Gln Ile Lys Lys Val Arg Leu Leu Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Ile Leu Lys Cys Asp Ala Glu Arg Ile Lys Leu Glu Ala Glu Arg

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Ser Val Pro

130 135 140

Ile Ser Asn Asp Glu Asp Val Asp Asn Lys Val Glu Arg Ile Trp Gly

145 150 155 160

Asp Cys Thr Val Arg Lys Lys Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met

165 170 175

Val Asp Gly Phe Glu Gly Glu Lys Gly Ala Val Val Ala Gly Ser Arg

180 185 190

Gly Tyr Phe Leu Lys Gly Val Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile

195 200 205

Gln Tyr Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Arg Gly Tyr Ile Pro Ile Tyr

210 215 220

Thr Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Ala Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu

245 250 255

Lys Ser Asp Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser

260 265 270

Glu Gln Pro Ile Ala Ala Leu His Arg Asp Glu Trp Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Asp Leu Pro Ile Lys Tyr Ala Gly Leu Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu

290 295 300

Val Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln

305 310 315 320

Phe Glu Lys Ile Glu Gln Phe Val Tyr Ser Ser Pro His Asp Asn Lys

325 330 335

Ser Trp Glu Met Phe Glu Glu Met Ile Thr Thr Ala Glu Glu Phe Tyr

340 345 350

Gln Ser Leu Gly Ile Pro Tyr His Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ser

355 360 365

Leu Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro

370 375 380

Gly Ser Gly Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met

405 410 415

Met Asp Lys Val Glu Phe Val His Met Leu Asn Ala Thr Met Cys Ala

420 425 430

Thr Thr Arg Thr Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Thr Glu Lys

435 440 445

Gly Ile Thr Val Pro Glu Lys Leu Lys Glu Phe Met Pro Pro Gly Leu

450 455 460

Gln Glu Leu Ile Pro Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Glu Gln Glu Pro

465 470 475 480

Ser Lys Lys Gln Lys Lys Gln His Glu Gly Ser Lys Lys Lys Ala Ala

485 490 495

Ala Arg Asp Val Thr Leu Glu Asn Arg Leu Gln Asn Met Glu Val Thr

500 505 510

Asp Ala

<210> 4

<211> 514

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Val Asp Lys Gly Gly Asp Pro

1 5 10 15

Ala Leu Ile Arg Glu Thr Gln Glu Lys Arg Phe Lys Asp Pro Gly Leu

20 25 30

Val Asp Gln Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Trp Arg Arg Cys Arg Phe

35 40 45

Arg Ala Asp Asn Leu Asn Lys Leu Lys Asn Leu Cys Ser Lys Thr Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Pro Val Gly Asp Asp Glu Ser Val

65 70 75 80

Pro Glu Asn Val Leu Ser Phe Asp Asp Leu Thr Ala Asp Ala Leu Ala

85 90 95

Asn Leu Lys Val Ala Gln Ile Lys Lys Val Arg Leu Leu Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Ile Leu Lys Cys Asp Ala Glu Arg Ile Lys Leu Glu Ala Glu Arg

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Ser Val Pro

130 135 140

Ile Ser Asn Asp Glu Asp Val Asp Asn Lys Val Glu Arg Ile Trp Gly

145 150 155 160

Asp Cys Thr Val Arg Lys Lys Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met

165 170 175

Val Asp Gly Phe Glu Gly Glu Lys Gly Ala Val Val Ala Gly Ser Arg

180 185 190

Gly Tyr Phe Leu Lys Gly Val Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile

195 200 205

Gln Tyr Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Arg Gly Tyr Ile Pro Ile Tyr

210 215 220

Thr Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Ala Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu

245 250 255

Lys Ser Asp Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser

260 265 270

Glu Gln Pro Ile Ala Ala Leu His Arg Asp Glu Trp Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Asp Leu Pro Ile Lys Tyr Ala Gly Leu Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu

290 295 300

Val Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln

305 310 315 320

Phe Glu Lys Ile Glu Gln Phe Val Tyr Ser Ser Pro His Asp Asn Lys

325 330 335

Ser Trp Glu Met Phe Glu Glu Met Ile Thr Thr Ala Glu Glu Phe Tyr

340 345 350

Gln Ser Leu Gly Ile Pro Tyr His Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ser

355 360 365

Leu Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro

370 375 380

Gly Ser Gly Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met

405 410 415

Met Asp Lys Val Glu Phe Val His Met Leu Asn Ala Thr Met Cys Ala

420 425 430

Thr Thr Arg Thr Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Thr Glu Lys

435 440 445

Gly Ile Thr Val Pro Glu Lys Leu Lys Glu Phe Met Pro Pro Gly Leu

450 455 460

Gln Glu Leu Ile Pro Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Glu Gln Glu Pro

465 470 475 480

Ser Lys Lys Gln Lys Lys Gln His Glu Gly Ser Lys Lys Lys Ala Ala

485 490 495

Ala Arg Asp Val Thr Leu Glu Asn Arg Leu Gln Asn Met Glu Val Thr

500 505 510

Asp Ala

<210> 5

<211> 514

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Val Asp Lys Gly Gly Asp Pro

1 5 10 15

Ala Leu Ile Arg Glu Thr Gln Glu Lys Arg Phe Lys Asp Pro Gly Leu

20 25 30

Val Asp Gln Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Trp Arg Arg Cys Arg Phe

35 40 45

Arg Ala Asp Asn Leu Asn Lys Leu Lys Asn Leu Cys Ser Lys Thr Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Pro Val Gly Asp Asp Glu Ser Val

65 70 75 80

Pro Glu Asn Val Leu Ser Phe Asp Asp Leu Thr Ala Asp Ala Leu Ala

85 90 95

Asn Leu Lys Val Asp Gln Ile Lys Lys Val Arg Leu Leu Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Ile Leu Lys Cys Asp Ala Glu Arg Ile Lys Leu Glu Ala Glu Arg

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Ser Val Pro

130 135 140

Ile Ser Asn Asp Glu Asp Val Asp Asn Lys Val Glu Arg Ile Trp Gly

145 150 155 160

Asp Cys Thr Val Arg Lys Lys Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met

165 170 175

Val Asp Gly Phe Glu Gly Glu Lys Gly Ala Val Val Ala Gly Ser Arg

180 185 190

Gly Tyr Phe Leu Lys Gly Val Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile

195 200 205

Gln Tyr Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Arg Gly Tyr Ile Pro Ile Tyr

210 215 220

Thr Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Asp Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu

245 250 255

Lys Ser Asp Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser

260 265 270

Glu Gln Pro Ile Ala Ala Leu His Arg Asp Glu Trp Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Asp Leu Pro Ile Lys Tyr Ala Gly Leu Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu

290 295 300

Val Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln

305 310 315 320

Phe Glu Lys Ile Glu Gln Phe Val Tyr Ser Ser Pro His Asp Asn Lys

325 330 335

Ser Trp Glu Met Phe Glu Glu Met Ile Thr Thr Ala Glu Glu Phe Tyr

340 345 350

Gln Ser Leu Gly Ile Pro Tyr His Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ser

355 360 365

Leu Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro

370 375 380

Gly Ser Gly Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met

405 410 415

Met Asp Lys Val Glu Phe Val His Met Leu Asn Ala Thr Met Cys Ala

420 425 430

Thr Thr Arg Thr Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Thr Glu Lys

435 440 445

Gly Ile Thr Val Pro Glu Lys Leu Lys Glu Phe Met Pro Pro Gly Leu

450 455 460

Gln Glu Leu Ile Pro Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Glu Gln Glu Pro

465 470 475 480

Ser Lys Lys Gln Lys Lys Gln His Glu Gly Ser Lys Lys Lys Ala Ala

485 490 495

Ala Arg Asp Val Thr Leu Glu Asn Arg Leu Gln Asn Met Glu Val Thr

500 505 510

Asp Ala

<210> 6

<211> 514

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Val Asp Lys Gly Gly Asp Pro

1 5 10 15

Ala Leu Ile Arg Glu Thr Gln Glu Lys Arg Phe Lys Asp Pro Gly Leu

20 25 30

Val Asp Gln Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Trp Arg Arg Cys Arg Phe

35 40 45

Arg Ala Asp Asn Leu Asn Lys Leu Lys Asn Leu Cys Ser Lys Thr Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Pro Val Gly Asp Asp Glu Ser Val

65 70 75 80

Pro Glu Asn Val Leu Ser Phe Asp Asp Leu Thr Ala Asp Ala Leu Ala

85 90 95

Asn Leu Lys Val Glu Gln Ile Lys Lys Val Arg Leu Leu Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Ile Leu Lys Cys Asp Ala Glu Arg Ile Lys Leu Glu Ala Glu Arg

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Ser Val Pro

130 135 140

Ile Ser Asn Asp Glu Asp Val Asp Asn Lys Val Glu Arg Ile Trp Gly

145 150 155 160

Asp Cys Thr Val Arg Lys Lys Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met

165 170 175

Val Asp Gly Phe Glu Gly Glu Lys Gly Ala Val Val Ala Gly Ser Arg

180 185 190

Gly Tyr Phe Leu Lys Gly Val Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile

195 200 205

Gln Tyr Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Arg Gly Tyr Ile Pro Ile Tyr

210 215 220

Thr Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Glu Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu

245 250 255

Lys Ser Asp Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser

260 265 270

Glu Gln Pro Ile Ala Ala Leu His Arg Asp Glu Trp Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Asp Leu Pro Ile Lys Tyr Ala Gly Leu Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu

290 295 300

Val Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln

305 310 315 320

Phe Glu Lys Ile Glu Gln Phe Val Tyr Ser Ser Pro His Asp Asn Lys

325 330 335

Ser Trp Glu Met Phe Glu Glu Met Ile Thr Thr Ala Glu Glu Phe Tyr

340 345 350

Gln Ser Leu Gly Ile Pro Tyr His Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ser

355 360 365

Leu Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro

370 375 380

Gly Ser Gly Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met

405 410 415

Met Asp Lys Val Glu Phe Val His Met Leu Asn Ala Thr Met Cys Ala

420 425 430

Thr Thr Arg Thr Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Thr Glu Lys

435 440 445

Gly Ile Thr Val Pro Glu Lys Leu Lys Glu Phe Met Pro Pro Gly Leu

450 455 460

Gln Glu Leu Ile Pro Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Glu Gln Glu Pro

465 470 475 480

Ser Lys Lys Gln Lys Lys Gln His Glu Gly Ser Lys Lys Lys Ala Ala

485 490 495

Ala Arg Asp Val Thr Leu Glu Asn Arg Leu Gln Asn Met Glu Val Thr

500 505 510

Asp Ala

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 7

gaaagtcgca caaatcaaaa aagtccgact cctcattg 38

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 8

tgatttgtgc gactttcagg ttagctaaag cgtc 34

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 9

gaaagtcgac caaatcaaaa aagtccgact cctcattg 38

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 10

tgatttggtc gactttcagg ttagctaaag cgtc 34

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 11

agctcgcaca gtttgatgaa gaactttata agg 33

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 12

aactgtgcga gctgtgccac ctcctgcatg acctcc 36

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 13

agctcgacca gtttgatgaa gaactttata agg 33

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 14

aactggtcga gctgtgccac ctcctgcatg acctcc 36

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 15

gaaagtcgca cagattaaaa aagtccgact cctcattg 38

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 16

taatctgtgc gactttcagg gcagctagcg cgtc 34

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 17

gaaagtcgac cagattaaaa aagtccgact cctcattg 38

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 18

taatctggtc gactttcagg gcagctagcg cgtc 34

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 19

cagctcgccc agtttgatga agaactttat aaggtg 36

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 20

caaactgggc gagctgggcc acttcctgca tg 32

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 21

cagctcgacc agtttgatga agaactttat aaggtg 36

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 22

caaactggtc gagctgggcc acttcctgca tg 32

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 23

ggcataggga cccatcattg a 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 24

gcatggagta tctcacaaag t 21

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 25

taaggctatg aagagatac 19

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 26

gagggcagaa tcatcacgaa g 21

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 27

tgtgctgtag gaagctcatc tctc 24

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 28

cgtcaccaac tgggacga 18

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 29

atgggggagg gcatacc 17

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 30

ggctctcctc catctgtctg c 21

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 31

cagtggtttt ctttctttgc tttg 24

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 32

tcaccaccac agccgaaaga g 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 33

gtcagcaatg ccagggtaca t 21

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 34

aggagaatgt gaacaaacct gacac 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 35

cctcttacct cagttacaat ttata 25

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 36

ggcggggcgg agccatgcgc ccccccc 27

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 37

gggcggatgg gtaattttca 20

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 38

ctgcggacgc ccagtgaa 18

<210> 39

<211> 1545

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 39

atggtgctgg atctggattt gtttcgggtg gataaaggag gggacccagc cctcatccga 60

gagacgcagg agaagcgctt caaggacccg ggactagtgg accagctggt gaaggcagac 120

agcgagtggc gacgatgtag atttcgggca gacaacttga acaagctgaa gaacctatgc 180

agcaagacaa tcggagagaa aatgaagaaa aaagagccag tgggagatga tgagtctgtc 240

ccagagaatg tgctgagttt cgatgacctt actgcagacg ctttagctaa cctgaaagtc 300

tcacaaatca aaaaagtccg actcctcatt gatgaagcca tcctgaagtg tgacgcggag 360

cggataaagt tggaagcaga gcggtttgag aacctccgag agattgggaa ccttctgcac 420

ccttctgtac ccatcagtaa cgatgaggat gtggacaaca aagtagagag gatttggggt 480

gattgtacag tcaggaagaa gtactctcat gtggacctgg tggtgatggt agatggcttt 540

gaaggcgaaa agggggccgt ggtggctggg agtcgagggt acttcttgaa gggggtcctg 600

gtgttcctgg aacaggctct catccagtat gcccttcgca ccttgggaag tcggggctac 660

attcccattt ataccccctt tttcatgagg aaggaggtca tgcaggaggt ggcacagctc 720

agccagtttg atgaagaact ttataaggtg attggcaaag gcagtgaaaa gtctgatgac 780

aactcctatg atgagaagta cctgattgcc acctcagagc agcccattgc tgccctgcac 840

cgggatgagt ggctccggcc ggaggacctg cccatcaagt atgctggcct gtctacctgc 900

ttccgtcagg aggtgggctc ccatggccgt gacacccgtg gcatcttccg agtccatcag 960

tttgagaaga ttgaacagtt tgtgtactca tcaccccatg acaacaagtc atgggagatg 1020

tttgaagaga tgattaccac cgcagaggag ttctaccagt ccctggggat tccttaccac 1080

attgtgaata ttgtctcagg ttctttgaat catgctgcca gtaagaagct tgacctggag 1140

gcctggtttc cgggctcagg agccttccgt gagttggtct cctgttctaa ttgcacggat 1200

taccaggctc gccggcttcg aatccgatat gggcaaacca agaagatgat ggacaaggtg 1260

gagtttgtcc atatgctcaa tgctaccatg tgcgccacta cccgtaccat ctgcgccatc 1320

ctggagaact accagacaga gaagggcatc actgtgcctg agaaattgaa ggagttcatg 1380

ccgccaggac tgcaagaact gatccccttt gtgaagcctg cgcccattga gcaggagcca 1440

tcaaagaagc agaagaagca acatgagggc agcaaaaaga aagcagcagc aagagacgtc 1500

accctagaaa acaggctgca gaacatggag gtcaccgatg cttga 1545

<210> 40

<211> 1545

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 40

atggtgctgg atctggattt gtttcgggtg gataaaggag gggacccagc cctcatccga 60

gagacgcagg agaagcgctt caaggacccg ggactagtgg accagctggt gaaggcagac 120

agcgagtggc gacgatgtag atttcgggca gacaacttga acaagctgaa gaacctatgc 180

agcaagacaa tcggagagaa aatgaagaaa aaagagccag tgggagatga tgagtctgtc 240

ccagagaatg tgctgagttt cgatgacctt actgcagacg ctttagctaa cctgaaagtc 300

gcvcaaatca aaaaagtccg actcctcatt gatgaagcca tcctgaagtg tgacgcggag 360

cggataaagt tggaagcaga gcggtttgag aacctccgag agattgggaa ccttctgcac 420

ccttctgtac ccatcagtaa cgatgaggat gtggacaaca aagtagagag gatttggggt 480

gattgtacag tcaggaagaa gtactctcat gtggacctgg tggtgatggt agatggcttt 540

gaaggcgaaa agggggccgt ggtggctggg agtcgagggt acttcttgaa gggggtcctg 600

gtgttcctgg aacaggctct catccagtat gcccttcgca ccttgggaag tcggggctac 660

attcccattt ataccccctt tttcatgagg aaggaggtca tgcaggaggt ggcacagctc 720

gcvcagtttg atgaagaact ttataaggtg attggcaaag gcagtgaaaa gtctgatgac 780

aactcctatg atgagaagta cctgattgcc acctcagagc agcccattgc tgccctgcac 840

cgggatgagt ggctccggcc ggaggacctg cccatcaagt atgctggcct gtctacctgc 900

ttccgtcagg aggtgggctc ccatggccgt gacacccgtg gcatcttccg agtccatcag 960

tttgagaaga ttgaacagtt tgtgtactca tcaccccatg acaacaagtc atgggagatg 1020

tttgaagaga tgattaccac cgcagaggag ttctaccagt ccctggggat tccttaccac 1080

attgtgaata ttgtctcagg ttctttgaat catgctgcca gtaagaagct tgacctggag 1140

gcctggtttc cgggctcagg agccttccgt gagttggtct cctgttctaa ttgcacggat 1200

taccaggctc gccggcttcg aatccgatat gggcaaacca agaagatgat ggacaaggtg 1260

gagtttgtcc atatgctcaa tgctaccatg tgcgccacta cccgtaccat ctgcgccatc 1320

ctggagaact accagacaga gaagggcatc actgtgcctg agaaattgaa ggagttcatg 1380

ccgccaggac tgcaagaact gatccccttt gtgaagcctg cgcccattga gcaggagcca 1440

tcaaagaagc agaagaagca acatgagggc agcaaaaaga aagcagcagc aagagacgtc 1500

accctagaaa acaggctgca gaacatggag gtcaccgatg cttga 1545

<210> 41

<211> 1539

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 41

atggtgctgg acctggattt gtttcgggtg gataaaggag gggacccagc cctcattcga 60

gagacgcagg agaagcgctt caaggacccg gggctggtgg accagctggt gaaagcagac 120

agtgagtggc gacgatgcag atttcgggca gacaacttga acaagctgaa gaatttatgc 180

agcaaaacta ttggggagaa aatgaagaaa aaggaagcag tgggagacga cgagtccgtc 240

ccagagaacg tgctgaattt cgatgacctc actgcagacg cgctagctgc cctgaaagtc 300

tcacagatta aaaaagtccg actcctcatt gatgaagcca tccagaagtg tgatggggag 360

cgggtaaagc tggaagcaga gcgatttgag aacctccgcg agattgggaa ccttctgcac 420

ccctctgtgc ccattagtaa tgatgaggac gcagacaaca aagtagaacg tatttgggga 480

gattgtacag tcaggaagaa gtattcccat gtggacctgg tggtgatggt agatggcttt 540

gaaggcgaaa agggagccgt ggtggctggt agtcgggggt acttcctgaa ggggcccctg 600

gtgttcctgg agcaggcgct tatccaatat gcactgcgta ccttggggag tcggggctac 660

actccaatct acaccccctt cttcatgagg aaagaggtca tgcaggaagt ggcccagctc 720

agccagtttg atgaagaact ttataaggtg attggcaaag gcagcgaaaa gtcagatgac 780

aactcctatg acgagaaata cttgattgcc acctcagagc agcccatcgc ggctctgcac 840

cgggacgagt ggctgcggcc agaggatctg cccatcaagt acgctggcct ctccacctgc 900

tttcgtcagg aagtgggctc gcatggccgt gacacccgtg gtatcttccg agtccatcag 960

tttgagaaga ttgagcagtt tgtgtactca tcgccccatg acaataagtc gtgggagatg 1020

tttgatgaga tgatcgccac cgcagaagaa ttctaccagt ctttggggat cccttaccac 1080

attgtgaata ttgtctcagg ctccttgaat cacgctgcca gtaagaagct cgacctggag 1140

gcctggttcc caggctcggg tgccttccgt gagttggtgt cctgttctaa ttgcacggat 1200

taccaagctc gccgcctgag aatccgatat gggcagacca agaagatgat ggacaaggtg 1260

gagtttgtcc atatgcttaa tgctacaatg tgtgctacca cccggaccat ctgcgccatc 1320

ctggagaact accaggcaga gaagggcatc gctgtgccag agaagttgag ggagttcatg 1380

ccgccagggc tccaagagct gatcccgttt gtgaagcctg cacccattga ccaggagcca 1440

tctaagaagc agaagaagca acatgaaggc agcaaaaaga aagcgaaaga ggtccccctg 1500

gagaaccagc tgcagagcat ggaggtcact gaggcctga 1539

<210> 42

<211> 512

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 42

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Val Asp Lys Gly Gly Asp Pro

1 5 10 15

Ala Leu Ile Arg Glu Thr Gln Glu Lys Arg Phe Lys Asp Pro Gly Leu

20 25 30

Val Asp Gln Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Trp Arg Arg Cys Arg Phe

35 40 45

Arg Ala Asp Asn Leu Asn Lys Leu Lys Asn Leu Cys Ser Lys Thr Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Ala Val Gly Asp Asp Glu Ser Val

65 70 75 80

Pro Glu Asn Val Leu Asn Phe Asp Asp Leu Thr Ala Asp Ala Leu Ala

85 90 95

Ala Leu Lys Val Ser Gln Ile Lys Lys Val Arg Leu Leu Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Ile Gln Lys Cys Asp Gly Glu Arg Val Lys Leu Glu Ala Glu Arg

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Ser Val Pro

130 135 140

Ile Ser Asn Asp Glu Asp Ala Asp Asn Lys Val Glu Arg Ile Trp Gly

145 150 155 160

Asp Cys Thr Val Arg Lys Lys Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met

165 170 175

Val Asp Gly Phe Glu Gly Glu Lys Gly Ala Val Val Ala Gly Ser Arg

180 185 190

Gly Tyr Phe Leu Lys Gly Pro Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile

195 200 205

Gln Tyr Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Arg Gly Tyr Thr Pro Ile Tyr

210 215 220

Thr Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Ser Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu

245 250 255

Lys Ser Asp Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser

260 265 270

Glu Gln Pro Ile Ala Ala Leu His Arg Asp Glu Trp Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Asp Leu Pro Ile Lys Tyr Ala Gly Leu Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu

290 295 300

Val Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln

305 310 315 320

Phe Glu Lys Ile Glu Gln Phe Val Tyr Ser Ser Pro His Asp Asn Lys

325 330 335

Ser Trp Glu Met Phe Asp Glu Met Ile Ala Thr Ala Glu Glu Phe Tyr

340 345 350

Gln Ser Leu Gly Ile Pro Tyr His Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ser

355 360 365

Leu Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro

370 375 380

Gly Ser Gly Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met

405 410 415

Met Asp Lys Val Glu Phe Val His Met Leu Asn Ala Thr Met Cys Ala

420 425 430

Thr Thr Arg Thr Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Ala Glu Lys

435 440 445

Gly Ile Ala Val Pro Glu Lys Leu Arg Glu Phe Met Pro Pro Gly Leu

450 455 460

Gln Glu Leu Ile Pro Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Asp Gln Glu Pro

465 470 475 480

Ser Lys Lys Gln Lys Lys Gln His Glu Gly Ser Lys Lys Lys Ala Lys

485 490 495

Glu Val Pro Leu Glu Asn Gln Leu Gln Ser Met Glu Val Thr Glu Ala

500 505 510

<210> 43

<211> 1548

<212> DNA

<213> 斑马鱼(Danio rerio)

<400> 43

atggtgctcg atttagacct gtttcgcacc gacaaaggcg gcgatcctga aattatccgg 60

gaaactcaga ggaaacggtt caaagatgtg tctctggtgg ataaactggt ccaggcggac 120

acagaatgga gaaaatgtcg tttcacagca gataacctta acaaggccaa gaatctctgc 180

agcaaatcca tcggtgaaaa gatgaagaag aaagagccag taggggatga tgacactctt 240

ccagaagagg ctcagaatct ggaagccctc actgcagaaa cgttatcgcc gcttactgtg 300

actcagataa agaaagtgcg ggttctggtg gatgaggctg tgcagaagac agacagtgac 360

cggctgaagc tggaggcaga gcgctttgag tatctgcgag agatcggcaa cctcctacat 420

ccctctgtgc ccatcagcaa cgatgaggat gctgataata aagtggagcg cacctggggt 480

gactgcacgg tgcagaagaa gtactctcat gtggacctgg tcgtcatggt tgatggatat 540

gagggggaaa aaggagccat tgttgctgga agcagaggat actttctcaa ggggccttta 600

gtgttcttgg agcaagcttt gattaactat gcgctgcgga tcctgtacag caagaactac 660

aacctcctgt acacaccctt cttcatgagg aaagaagtca tgcaggaggt cgctcagctc 720

agccagtttg acgaggagct ctacaaggtg atcgggaaag gaagtgagaa gtctgatgat 780

aacacagtgg acgagaagta cttgattgcc acatcagagc agccaatcgc agccttcctg 840

agagatgagt ggctgaagcc agaagaactt cctatccgct acgctggcct ctccacctgc 900

ttcagacagg aagtgggctc tcatggcaga gacacgcgcg ggatcttcag ggtccatcag 960

tttgagaaga ttgagcagtt tgtgtacgcc tctcctcatg atggcaaatc ctgggagatg 1020

tttgatgaaa tgattggaac cgctgaatcc ttttatcaaa cattaggaat tccttatcga 1080

attgtcaaca tcgtgtcagg tgctttgaac cacgcagcta gtaaaaagct ggatttagag 1140

gcttggtttc ctggttccca ggcttttaga gagcttgtgt catgctcaaa ctgtacagac 1200

tatcaggctc gtcgcttgcg gattcgatac gggcaaacta agaaaatgat ggacaaggct 1260

gagtttgtgc acatgctcaa tgccaccatg tgtgcgacca ctcgtgtcat ctgtgccatc 1320

ctggagaact tccaaacaga ggaaggcatc attgttccag aacccctcaa ggcattcatg 1380

cctccaggtt taacagaaat aattaagttt gtgaagccag cccccattga ccaggaaacc 1440

acaaagaagc agaagaaaca gcaggaagga ggaaagaaga agaaacatca gggcggcgat 1500

gctgatctag agaacaaagt ggagaacatg tctgtcaatg actcttag 1548

<210> 44

<211> 515

<212> PRT

<213> 斑马鱼(Danio rerio)

<400> 44

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Thr Asp Lys Gly Gly Asp Pro

1 5 10 15

Glu Ile Ile Arg Glu Thr Gln Arg Lys Arg Phe Lys Asp Val Ser Leu

20 25 30

Val Asp Lys Leu Val Gln Ala Asp Thr Glu Trp Arg Lys Cys Arg Phe

35 40 45

Thr Ala Asp Asn Leu Asn Lys Ala Lys Asn Leu Cys Ser Lys Ser Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Pro Val Gly Asp Asp Asp Thr Leu

65 70 75 80

Pro Glu Glu Ala Gln Asn Leu Glu Ala Leu Thr Ala Glu Thr Leu Ser

85 90 95

Pro Leu Thr Val Thr Gln Ile Lys Lys Val Arg Val Leu Val Asp Glu

100 105 110

Ala Val Gln Lys Thr Asp Ser Asp Arg Leu Lys Leu Glu Ala Glu Arg

115 120 125

Phe Glu Tyr Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Ser Val Pro

130 135 140

Ile Ser Asn Asp Glu Asp Ala Asp Asn Lys Val Glu Arg Thr Trp Gly

145 150 155 160

Asp Cys Thr Val Gln Lys Lys Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met

165 170 175

Val Asp Gly Tyr Glu Gly Glu Lys Gly Ala Ile Val Ala Gly Ser Arg

180 185 190

Gly Tyr Phe Leu Lys Gly Pro Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile

195 200 205

Asn Tyr Ala Leu Arg Ile Leu Tyr Ser Lys Asn Tyr Asn Leu Leu Tyr

210 215 220

Thr Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Ser Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu

245 250 255

Lys Ser Asp Asp Asn Thr Val Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser

260 265 270

Glu Gln Pro Ile Ala Ala Phe Leu Arg Asp Glu Trp Leu Lys Pro Glu

275 280 285

Glu Leu Pro Ile Arg Tyr Ala Gly Leu Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu

290 295 300

Val Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln

305 310 315 320

Phe Glu Lys Ile Glu Gln Phe Val Tyr Ala Ser Pro His Asp Gly Lys

325 330 335

Ser Trp Glu Met Phe Asp Glu Met Ile Gly Thr Ala Glu Ser Phe Tyr

340 345 350

Gln Thr Leu Gly Ile Pro Tyr Arg Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ala

355 360 365

Leu Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met

405 410 415

Met Asp Lys Ala Glu Phe Val His Met Leu Asn Ala Thr Met Cys Ala

420 425 430

Thr Thr Arg Val Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Phe Gln Thr Glu Glu

435 440 445

Gly Ile Ile Val Pro Glu Pro Leu Lys Ala Phe Met Pro Pro Gly Leu

450 455 460

Thr Glu Ile Ile Lys Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Asp Gln Glu Thr

465 470 475 480

Thr Lys Lys Gln Lys Lys Gln Gln Glu Gly Gly Lys Lys Lys Lys His

485 490 495

Gln Gly Gly Asp Ala Asp Leu Glu Asn Lys Val Glu Asn Met Ser Val

500 505 510

Asn Asp Ser

515

<210> 45

<211> 1536

<212> DNA

<213> 热带爪蟾(Xenopus tropicalis)

<400> 45

atggttctag atttggatct tttccgggag gacaagggag gaaacccgga gctcatcaga 60

gagactcaga gaaagagatt taaggacccg gggctggtgg atgcattgct gaactcagac 120

acggcctgga gaaagtgcag gtttcaggca gacaatctta ataaacagaa aaatctttgc 180

agcaaaatca tcggggagaa aatgaagaaa aaggagccgt tgggagacag tgatgttctt 240

cctgaaaata tccagcttga ccagctaact gctgaagttc ttagtgctct gtcagttaca 300

cagataaaaa gactccgggt cttaatagat gaagccatag cagcaactga cacagaacgt 360

atcaagctgg aggctgagag gtttgaaagt ttacgtgaga ttggaaacct gcttcaccca 420

acagtgccta tcagtaacga tgaggacaat gataataagg tggaacgcac ttggggagac 480

tgtgaagttc gaaagagata ctcacatgtg gaccttgtgg ttatggtgga tggctttgag 540

ggggaaaaag gagctgtagt agctggtagc agaggatatt tcttaaaggg tcctctggtg 600

tttctagagc aggccctcat acagtttgct ttgcataccc tggcagaaaa gcaatacacc 660

cccatatata ccccattttt catgagaaaa gaggtcatgc aggaggtggc tcagctcagt 720

caatttgatg aagaactgta caaggtgata ggtaaaggta gtgagaaatc tgatgataac 780

tccatagatg agaagtacct aatagccact tcagaacagc caatagctgc attacatcgg 840

gatgagtggc tgaagcctga agagttgcct ctacgatatg ctggcatatc aacttgtttc 900

cgtcaggaag tgggctccca tggaagagac acaagaggca tatttagagt acaccagttt 960

gagaagattg agcagtttat ttatgcctca cctaatgata acaagtcctg ggaattgttt 1020

gaagaaatga ttatgacagc tgaatcattt taccagaagc ttggcattcc ctatcgtatt 1080

gtgaatattg tttcaggctc cttgaaccac gctgccagta aaaagctgga tttagaggcc 1140

tggtttcctg gctcaggtgc attcagagag ctggtctctt gttcaaactg cactgactac 1200

caagcccggc ggctacggat ccgatatggg cagacaaaga agatgatgga caaggtagag 1260

tttgtacaca tgttaaatgc caccatgtgt gccacgaccc gtgcaatttg tgcaattcta 1320

gagaactatc aaaccgagga agggataatt ataccagaga aactcaggga ctttatgcct 1380

ccaggtctga attatataat aaagtttgta aaaccagctc caattgacca ggaactcacc 1440

aaaaaacaga agaagcagca gcaggaaaaa ggaaagaaaa cagaaaattg tggtttagat 1500

aatcaaatgg agaacatgaa agttaattca gcttaa 1536

<210> 46

<211> 511

<212> PRT

<213> 热带爪蟾(Xenopus tropicalis)

<400> 46

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Glu Asp Lys Gly Gly Asn Pro

1 5 10 15

Glu Leu Ile Arg Glu Thr Gln Arg Lys Arg Phe Lys Asp Pro Gly Leu

20 25 30

Val Asp Ala Leu Leu Asn Ser Asp Thr Ala Trp Arg Lys Cys Arg Phe

35 40 45

Gln Ala Asp Asn Leu Asn Lys Gln Lys Asn Leu Cys Ser Lys Ile Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Pro Leu Gly Asp Ser Asp Val Leu

65 70 75 80

Pro Glu Asn Ile Gln Leu Asp Gln Leu Thr Ala Glu Val Leu Ser Ala

85 90 95

Leu Ser Val Thr Gln Ile Lys Arg Leu Arg Val Leu Ile Asp Glu Ala

100 105 110

Ile Ala Ala Thr Asp Thr Glu Arg Ile Lys Leu Glu Ala Glu Arg Phe

115 120 125

Glu Ser Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Thr Val Pro Ile

130 135 140

Ser Asn Asp Glu Asp Asn Asp Asn Lys Val Glu Arg Thr Trp Gly Asp

145 150 155 160

Cys Glu Val Arg Lys Arg Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met Val

165 170 175

Asp Gly Phe Glu Gly Glu Lys Gly Ala Val Val Ala Gly Ser Arg Gly

180 185 190

Tyr Phe Leu Lys Gly Pro Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile Gln

195 200 205

Phe Ala Leu His Thr Leu Ala Glu Lys Gln Tyr Thr Pro Ile Tyr Thr

210 215 220

Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu Ser

225 230 235 240

Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu Lys

245 250 255

Ser Asp Asp Asn Ser Ile Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser Glu

260 265 270

Gln Pro Ile Ala Ala Leu His Arg Asp Glu Trp Leu Lys Pro Glu Glu

275 280 285

Leu Pro Leu Arg Tyr Ala Gly Ile Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu Val

290 295 300

Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln Phe

305 310 315 320

Glu Lys Ile Glu Gln Phe Ile Tyr Ala Ser Pro Asn Asp Asn Lys Ser

325 330 335

Trp Glu Leu Phe Glu Glu Met Ile Met Thr Ala Glu Ser Phe Tyr Gln

340 345 350

Lys Leu Gly Ile Pro Tyr Arg Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ser Leu

355 360 365

Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro Gly

370 375 380

Ser Gly Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp Tyr

385 390 395 400

Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met Met

405 410 415

Asp Lys Val Glu Phe Val His Met Leu Asn Ala Thr Met Cys Ala Thr

420 425 430

Thr Arg Ala Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Thr Glu Glu Gly

435 440 445

Ile Ile Ile Pro Glu Lys Leu Arg Asp Phe Met Pro Pro Gly Leu Asn

450 455 460

Tyr Ile Ile Lys Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Asp Gln Glu Leu Thr

465 470 475 480

Lys Lys Gln Lys Lys Gln Gln Gln Glu Lys Gly Lys Lys Thr Glu Asn

485 490 495

Cys Gly Leu Asp Asn Gln Met Glu Asn Met Lys Val Asn Ser Ala

500 505 510

Claims (67)

1.一种减少受试者中肿瘤进展的方法，所述方法包括：

向有需要的受试者施用包含突变体丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)蛋白的组合物，其中所述突变体SerRS蛋白是磷酸化缺陷的突变体SerRS蛋白，

由此减少所述受试者中的肿瘤进展。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白具有降低的通过共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ATM)、共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶(ATR)或两者的磷酸化水平。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白的最大磷酸化水平小于对应的野生型SerRS蛋白的最大磷酸化水平的50％。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白的最大磷酸化水平小于对应的野生型SerRS蛋白的最大磷酸化水平的10％。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基S101、S241或两者处的氨基酸取代。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含相对于对应的野生型SerRS蛋白的氨基酸取代X101A、S241A或两者，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸缺失，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含在残基X101、S241或两者处的氨基酸缺失，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白是脊椎动物SerRS蛋白。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白是人类SerRS蛋白。

13.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46的残基X101和S241中的一个或两者处的氨基酸缺失，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

14.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含与SEQ IDNO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自由以下组成的组：丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸和丝氨酸-至-苯丙氨酸。

15.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含与SEQ IDNO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1的残基S101和S241的一个或两者处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是丝氨酸-至-丙氨酸或丝氨酸-至-甘氨酸。

16.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中肿瘤进展的减少通过减少受试者中的血管发生实现。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述血管发生是低氧诱导的血管发生。

19.如权利要求1-16中任一项所述的方法，所述肿瘤进展是转移。

20.如权利要求1-16中任一项所述的方法，所述肿瘤是实体瘤。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述实体瘤是肉瘤、癌、淋巴瘤或其组合。

22.如权利要求1-16中任一项所述的方法，所述肿瘤是血液恶性肿瘤。

23.如权利要求1-16中任一项所述的方法，所述肿瘤是宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、黑素瘤、卵巢癌、肺癌、肾细胞癌、神经鞘瘤、间皮瘤、急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤或其组合。

24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述磷酸化缺陷的突变体SerRS蛋白阻遏受试者中血管内皮生长因子(VEGF)的转录。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述VEGF是VEGFA。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中与未接受治疗的受试者相比，所述受试者中的肿瘤进展减少了至少50％。

27.一种突变体丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白是磷酸化缺陷的。

28.如权利要求27所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。

29.如权利要求27所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的X101、S241或两者处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

30.如权利要求29所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含相对于对应的野生型SerRS蛋白的氨基酸取代X101A、S241A或两者，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

31.如权利要求27所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸缺失，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。

32.如权利要求26所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的丝氨酸101、丝氨酸241或两者处的氨基酸缺失。

33.如权利要求27-32中任一项所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白是脊椎动物蛋白。

34.如权利要求33所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白是人类蛋白。

35.如权利要求27所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在残基X101和S241中的一个或两者处的氨基酸缺失，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

36.如权利要求27所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含与SEQ IDNO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1中的残基S101和S241的一个或两者处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代选自：丝氨酸-至-丙氨酸、丝氨酸-至-甘氨酸、丝氨酸-至-赖氨酸、丝氨酸-至-精氨酸、丝氨酸-至-天冬酰胺、丝氨酸-至-谷氨酰胺、丝氨酸-至-组氨酸、丝氨酸-至-半胱氨酸、丝氨酸-至-缬氨酸、丝氨酸-至-亮氨酸、丝氨酸-至-异亮氨酸、丝氨酸-至-脯氨酸、丝氨酸-至-甲硫氨酸、丝氨酸-至-色氨酸和丝氨酸-至-苯丙氨酸。

37.如权利要求27所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含与SEQ IDNO:1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1中的残基S101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是丝氨酸-至-丙氨酸或丝氨酸-至-甘氨酸。

38.如权利要求27所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。

39.一种突变体丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)蛋白，其中与对应的野生型SerRS蛋白相比，所述突变体SerRS蛋白在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的，或者在刺激VEGF转录方面是有效的。

40.如权利要求39所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。

41.如权利要求40所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基X101、S241或两者处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

42.如权利要求41所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含相对于对应的野生型SerRS蛋白的氨基酸取代X101D、S241D或两者，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

43.如权利要求39-42中任一项所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白是脊椎动物蛋白。

44.如权利要求43所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白是人类蛋白。

45.如权利要求39所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46中的氨基酸残基X101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸或苏氨酸，并且其中所述氨基酸取代是丝氨酸-至-天冬氨酸、丝氨酸-至-谷氨酸、苏氨酸-至-天冬氨酸或苏氨酸-至-谷氨酸。

46.如权利要求39所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白包含SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

47.如39所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白不阻遏VEGF转录。

48.如39所述的突变体SerRS蛋白，其中所述突变体SerRS蛋白刺激VEGF转录。

49.一种药物组合物，所述药物组合物包含

如权利要求27-48中任一项所述的突变体SerRS蛋白；和

药学上可接受的赋形剂。

50.一种促进受试者中血管发生的方法，所述方法包括：

向有需要的受试者施用包含突变体丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)蛋白的组合物，其中与对应的野生型SerRS蛋白相比，所述突变体SerRS蛋白在阻遏VEGF转录方面是缺陷性的，或者在刺激VEGF转录方面是有效的，

由此促进所述受试者中的血管发生。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。

52.如权利要求50或51所述的方法，其中所述受试者罹患缺血性心脏病、心血管疾病和神经疾病中的一种或更多种。

53.如权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏小于对应的野生型SerRS蛋白对VEGF转录的阻遏的50％。

54.如权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白不阻遏VEGF转录。

55.如权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白刺激VEGF转录。

56.如权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的残基T22、X79、S86、X101、X142、S217、S241、S255、S258、S262、S368、S394、S396、T214、T501、X220、Y248和Y263中的一个或更多个处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸。

57.如权利要求55所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含在相对于对应的野生型SerRS蛋白的X101、S241或两者处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含相对于对应的野生型SerRS蛋白的氨基酸取代X101D、S241D或两者，其中X是丝氨酸或苏氨酸。

59.如权利要求50-58中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白是脊椎动物蛋白。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白是人类蛋白。

61.如权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:46中的残基X101和S241中的一个或两者处的氨基酸取代，其中X是丝氨酸或苏氨酸，并且其中所述氨基酸取代是丝氨酸-至-天冬氨酸、丝氨酸-至-谷氨酸、苏氨酸-至-天冬氨酸或苏氨酸-至-谷氨酸。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述突变体SerRS蛋白包含SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6的氨基酸序列。

63.一种减少受试者中血管发生的方法，所述方法包括：

向有需要的受试者施用包含丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)磷酸化抑制剂的组合物，

由此减少所述受试者中的血管发生。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。

65.如权利要求63或64所述的方法，其中所述SerRS磷酸化抑制剂是用于共济失调毛细血管扩张症突变激酶(ATM)、共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶(ATR)或两者的抑制剂。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述SerRS磷酸化抑制剂是ATM抑制剂。

67.如权利要求65所述的方法，其中所述SerRS磷酸化抑制剂是ATR抑制剂。