KR101648114B1

KR101648114B1 - Trap1 유전자를 이용한 미토콘드리아 기능 장애 치료제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101648114B1
Application number: KR1020140159204A
Authority: KR
Inventors: 고형종
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2016-08-12
Anticipated expiration: 2034-11-14
Also published as: KR20160057941A

Abstract

본 발명은 시험제제가 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법, TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA, TRAP1에 특이적인 항체 및 TRAP1 억제물질(TRAP1 inhibitor)의 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명의 스크리닝 방법은 미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환의 예방 및 치료 기능을 갖는 물질들을 효과적으로 스크리닝 할 수 있다. 또한 본 발명에서TRAP1 및 이의 유전자에 대한 억제 기능을 갖는 조성물들은 산화 스트레스에 대한 저항성을 높이고 미토콘드리아 기능 장애를 정상 상태로 회복시키는 효과가 있다.

Description

TRAP1 유전자를 이용한 미토콘드리아 기능 장애 치료제 스크리닝 방법{Screening method for therapeutic agent of mitochondria dysfunction using TRAP1 gene}

본 발명은 TRAP1 유전자를 이용한 미토콘드리아 기능 장애 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 (a) TRAP1을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계; 및 (b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도를 측정하고 시험제제 없이 배양된 세포에 대한 발현 정도와 비교하여 상기 시험제제가 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법, TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA, TRAP1에 특이적인 항체 및 TRAP1 억제물질(TRAP1 inhibitor)의 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

미토콘드리아는 그동안 단순히 세포에 에너지를 공급하는 세포소기관으로 간주되었으나, 세포사멸과정을 수행하는 중요한 세포신호 조절자라는 사실이 1990년대 들어 밝혀지면서 미토콘드리아의 다양한 생체기능에 대한 연구가 활발히 이루어지게 되었다. 최근 들어 미토콘드리아의 기능 이상이 노화과정 및 노화와 관련된 여러 질환들-암과 당뇨 등의 중요 만성질환, 순환기, 호흡기, 내장 및 내분비계 등의 중요장기의 기능 이상, 그리고 알츠하이머병이나 파킨슨병 등의 퇴행성 신경질환-의 발병과 악화에 밀접한 관련이 있다는 연구결과들이 속속 보고 되고 있다. 인슐린(insulin) 저항성을 나타내는 2형 당뇨 환자의 근육 및 간 조직에서 미토콘드리아 전자 전달계의 기능이 저하되는 것이 보고되었으며 [1], 또한 대표적인 퇴행성 신경질환인 파킨슨병 환자의 병변조직에서 미토콘드리아 전자전달계를 이루는 중요요소인 complex I의 활성이 감소됨이 관찰된 바 있다 [2]. 더욱이 파킨슨병 관련 유전자인 Parkin과 PINK1을 초파리 모델에서 결손시켰을 때, 근육과 도파민 신경세포내의 미토콘드리아가 심각하게 손상되면서 인간환자와 유사한 운동성 상실과 도파민 신경세포 손실이 발생함이 발견되어, 미토콘드리아 기능 이상과 질병발생 및 악화 기전과의 밀접한 관계를 한층 더 뒷받침 한 바 있다 [3,4]. 따라서 위에서 언급한 다양한 미토콘드리아 관련 질병의 예방 및 치료법을 개발하려는 연구 들이 활발히 이루어져, 현재 미토콘드리아를 구성하는 중요한 component 들의 활성을 조절하여 환자 체내에서 저하된 미토콘드리아의 기능을 정상화 시키려는 시도가 국내외에서 수행 중에 있다.

PINK1과 Parkin은 결손 시 autosomal recessive juvenile parkinsonism (AR-JP)발병을 유도하는 파킨슨병 관련 유전자로 cloning된 후 [5,6], 그 생체 기능 및 병태 생리적 역할에 대한 활발한 연구가 진행되어 왔다. 초기에는 Parkin이 특정 단백질에 유비퀴틴(ubiquitin)을 결합시키는 유비퀴틴 연결효소(ubiquitin ligase)임에 착안하여, Parkin과 결합하는 단백질을 발굴하여 이들과 파킨슨병과의 연관성을 탐구하는 연구가 많이 수행되었으나, 발굴된 Parkin 결합단백질과 파킨슨병의 병태생리기전과의 상관관계가 명확하지 아니하였다. 그러던 중 미토콘드리아에 위치하는 인산화효소인 PINK1의 유전자를 초파리에서 결손시키자 미토콘드리아 기능이상을 수반하는 파킨슨병 관련증상 (도파민 신경세포 감소, 운동성 저하)이 발생하였고, PINK1 유전자 결손 초파리에 Parkin을 발현시키자 미토콘드리아 기능이상과 파킨슨병 관련 증상이 모두 치유되는 실험 결과가 발표되면서 [4], PINK1과 Parkin의 미토콘드리아에서의 역할을 규명하기 위한 연구가 활발히 진행되어 현재, 기능저하를 일으켜 내막의 membrane potential이 저하된 미토콘드리아에 위치한 PINK1이 특이적으로 활성화되면서 Parkin을 손상된 미토콘드리아로 유도하여, 손상된 미토콘드리아의 remodeling을 촉발시켜 이를 수리하거나 제거하여 세포내 미토콘드리아의 기능을 유지한다는 사실이 규명되었다 [7-9]. 또한 PINK1 유전자를 활용한 다양한 유전학 및 세포생물학 실험에서 PINK1이 Parkin외의 다른 신호전달자를 통해서도 미토콘드리아의 기능을 유지한다는 사실이 규명되고 있으며 [10,11], PINK1이 Parkin 외에 신경세포보호 및 노화방지에 중요한 역할을 하는 유전자 Sir2와 FOXO를 통해 미토콘드리아 기능을 유지하고 도파민 신경세포를 보호한다는 사실이 밝혀진바있다. [12].

TRAP1(TNF receptor-associated protein 1)은 미토콘드리아에 특이적으로 존재하는 heat shock protein (HSP)로써 세포질에 존재하는 90-kDa heat shock protein (HSP90)과 대단히 유사하다 [13]. 기존의 연구에서는 TRAP1이 존재할 때, 다양한 동물 세포주에서 활성산소로부터 세포를 보호하는 역할을 함이 보고되어 왔지만[14], 실질적으로 TRAP1에 의한 세포보호의 구체적인 분자기전은 밝혀지지 아니하였다.

[1] Lowell BB, Shulman GI. (2005) Mitochondrial dysfunction and type 2 diabetes. Science 307:384-387. [2] Hoepken HH, Gispert S, Morales B, Wingerter O, Del Turco D, et al. (2007) Mitochondrial dysfunction, peroxidation damage and changes in glutathione metabolism in PARK6. Neurobiol Dis 25: 401-411. [3] Cha GH, Kim S, Park J, Lee E, Kim M, et al. (2005) Parkin negatively regulates JNK pathway in the dopaminergic neurons of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 10345-10350. [4] Park J, Lee SB, Lee S, Kim Y, Song S, et al. (2006) Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature 441: 1157-1161. [5] Kitada T, Asakawa S, Hattori N, Matsumine H, Yamamura Y, et al. (1998) Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature 392: 605-608. [6] Valente EM, Abou-Sleiman PM, Caputo V, Muqit MMK, Harvey K, et al. (2004) Hereditary early-onset Parkinson's disease caused by mutations in PINK1. Science 304: 1158-1160. [7] Park J, Lee G, Chung J (2009) The PINK1-Parkin pathway is involved in the regulation of mitochondrial remodeling process. Biochem Biophys Res Commun 378: 518-523. [8] Kim Y, Park J, Kim S, Song S, Won SK, et al. (2008) PINK1 controls mitochondrial localization of Parkin through direct phosphorylation. Biochem Biophys Res Commun 377: 975-980. [9] Geisler S, Holmstrom KM, Skujat D, Fiesel FC, Rothfuss OC, et al. (2010) PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1. Nature Cell Biol 12: 119-131. [10] Pridgeon JW, Olzmann JA, Chin LS, Li L (2007) PINK1 protects against oxidative stress by phosphorylating mitochondrial chaperone TRAP1. Plos Biol 5: e172. doi:10.1371/journal.pbio.0050172. [11] Imai Y, Kanao T, Sawada T, Kobayashi Y, Moriwaki Y, et al. (2010) The Loss of PGAM5 Suppresses the Mitochondrial Degeneration Caused by Inactivation of PINK1 in Drosophila. Plos Genet 6: e1001229. doi:10.1371/journal.pgen.1001229. [12] Koh H, Kim H, Kim MJ, Park J, Chung J (2012) Sir2 and FOXO Complement Mitochondrial Dysfunction and Dopaminergic Neuron Loss in Drosophila PINK1 Mutants. J Biol Chem 287: 12750-12758. [13] Kang BH (2012) TRAP1 regulation of mitochondrial life or death decision in cancer cells and ccsmitochondria-targeted TRAP1 inhibitors. BMB Rep 45:1-6. [14] Montesano Gesualdi N, Chirico G, Pirozzi G, Costantino E, Landriscina M, Esposito F. Tumor necrosis factor-associated protein 1 (TRAP-1) protects cells from oxidative stress and apoptosis. Stress 2007; 10: 342-350.

이에 본 발명자들은 TRAP1의 세포 내 역할 규명 및 분자기전에 대해 연구하던 중, TRAP1의 활성 또는 발현을 억제하면 세포가 활성산소에 대한 저항능력이 향상될 뿐만 아니라 PINK1 결손에 의해 유도된 미토콘드리아의 기능 장애가 회복됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 (a) TRAP1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1)을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계; 및 (b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서의 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현 정도와 비교하여 상기 시험제제가 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TRAP1에 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TRAP1 억제물질(TRAP1 inhibitor)을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) TRAP1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1)을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계; 및 (b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서의 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현 정도와 비교하여 상기 시험제제가 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본발명은 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TRAP1에 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TRAP1 억제물질(TRAP1 inhibitor)을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 세포 내에서 TRAP1의 활성 또는 발현이 억제될 때, 세포의 활성산소에 대한 저항능력이 향상될 뿐만 아니라 PINK1 결손에 의해 유도된 미토콘드리아의 기능 장애가 회복된다는 사실을 처음으로 규명하였으며, 이는 본 명세서에서 최초로 공개하는 것이다.

정의

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); 및 Hale ＆ Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자(reader)에게 도움을 주기 위해 제공된다.

본 명세서에서 용어 "단백질"은 "폴리펩티드(polypeptide)" 또는 “펩티드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 "핵산", "DNA 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 발명에서 용어 "상동체(homologues)"는 단백질 및/또는 단백질 서열을 언급하는 경우에는 공통의 조상 단백질(common ancestral protein) 또는 단백질 서열에서 자연적으로 또는 인위적으로 유래된 것을 나타낸다. 유사하게 핵산 및/또는 핵산 서열은 그들이 공통의 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인위적으로 유래되었을 때 상동하다.

본 명세서에서 용어 "아날로그(analog)"는 표준 물질(reference molecule)과 구조적으로 유사하지만, 표준 물질의 특이적 치환기가 치환에 의해 대체됨으로써 표적이나 조절 방법이 변형된 물질을 말한다. 표준물질과 비교할 때, 아날로그는 당업자에 의해 예상될 수 있는 바와 같이 동일 또는 유사하거나 향상된 유용성(utility)를 가진다. 향상된 성질(예: 표적 물질에 대한 더 높은 결합 친화력)을 갖는 공지의 화합물 변이체를 규명하기 위한 아날로그의 합성 및 스크리닝은 약리 화학적 분야에 공지된 방법이다.

본 발명은

(a) TRAP1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1)을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계; 및

(b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도와 비교하여 상기 시험제제가 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) 단계는 TRAP1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1)을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계이다.

본 발명의 상기‘TRAP1’은 hsp90와 높은 상동성을 지니며, 타입 1 종양 괴사 인자 수용체에 결합한다(하기 문헌 참조: Song et al., J. Biol. Chem., 270:3574-3581 (1995)). TNFR1의 세포내 도메인을 베이트(bait)로 하여 Gal4/HeLa cDNA library의 yeast 2-hybrid screen 및 5-prime RACE를 수행하여, Song et al. (1995)는 TRAP1을 인코딩(encoding)하는 cDNA 부분을 분리해내었다. 이로부터 추론된(deduced) 661-아미노산 단백질은 HSP90 패밀리 일원과 60% 유사하나, HSP90 단백질에서 발견되는 고도로 하전된 도메인이 결여되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Felts et al., J Biol Chem. 2000; 275(5):3305-12. 또한 상기 TRAP1은 열-충격 단백질 75-KD(HSP75); 종양 괴사 인자 수용체-연관 단백질 1; TRAP1; 및 TNFR-연관 단백질 1으로도 공지되어 있다.

본 발명의 상기‘TRAP1’은 TRAP1으로서 공지된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 가지는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 1(Genbank Accession No. NP_057376.2) 또는 서열번호 3(Genbank Accession No.NP_477439.2)으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 TRAP1은 이의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 기능적 동등물이란 TRAP1의 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 상기 기능적 동등물은 TRAP1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 TRAP1 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 TRAP1 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 TRAP1 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 TRAP1의 아미노산 서열(서열번호 1 또는 서열번호 3) 과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 TRAP1의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, TRAP1의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.

본 발명에 따른 단백질(폴리펩티드)는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예를 들어, 서열번호 2 또는 서열번호 4)을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제 할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

본 발명에서 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 "숙주세포(host cell)"이라 함은 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 말한다.

본 발명에서‘TRAP1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드' 는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산서열, 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산서열을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2(Genbank Accession No. NM_016292.2) 또는 서열번호 4(Genbank Accession No. NM_058091.3)로 표시되는 염기서열을 갖는다. 상기 핵산은 천연에서 분리되거나 위에서 기술한 바와 같이 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미하는 것으로, 프로모터에 의해 유발된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사와 번역을 모두 포함하는 의미이다. 따라서 본 발명의‘TRAP1 발현’이란, 바람직하게 TRAP1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(예를들어 서열번호 2 또는 서열번호 4)의 전사와 번역 과정을 모두 포함하는 의미이다.

상기‘TRAP1을 발현하는 세포’는 세포 내에서 TRAP1 유전자의 발현이 일어나는 세포라면 이에 한정되지 않으나, 바람직하게 진핵세포이며, 더욱 바람직하게 미토콘드리아(mitochondria, 사립체)를 세포 소기관으로서 포함하는 세포일 수 있다.

본 발명에서 ‘제제(agent)’ 또는 ‘시험제제(test agent)’라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.

본 발명의 방법으로 스크리닝되거나 동정될 수 있는 시험제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험제제는 합성 물질일 수 있으며, 다른 시험제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO 93/06121, WO94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될수 있다. 상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약5-20개, 보다 바람직하게는 약7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스화(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 "핵산”일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스화” 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 위에서 기재한 대로 소분자 시험 제제의 조합 라이브러리가 본 발명의 스크리닝 방법에 용이하게 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).

본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는 TRAP1 단백질이나 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 TRAP1에 결합할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다. TRAP1의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 문헌에 잘 알려져 있다: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, K. E.(Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp.221-239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisengerg ＆ D.Crothers(Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). TRAP1의 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다: Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986).

본 발명에서 상기‘TRAP1을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 배양하는 것’은 TRAP1 자체 및 이의 발현에 영향을 주는 인자와 시험제제의 접촉을 유도하는 과정을 의미하는 것이다. 상기 시험제제의 접촉 방법은 예를 들어, 시험관 내(in vitro)에서 시험제제가 세포막 외부에 처리되어 세포 내로 도입되는 것에 의한 것일 수도 있고, 또는 공지의 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술에 의해 시험제제가 세포 내에서 발현됨에 따른 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

(b) 단계는 상기 (a) 단계의 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도와 비교하여 수치의 감소에따라 상기 시험제제가 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계이다.

본 발명의 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제 스크리닝 방법은, TRAP1의 발현 정도를 측정하여 수행될 수 있으며, 이때 상기‘TRAP1의 발현정도 측정’은 TRAP1 유전자의 발현수준 측정을 의미하는 것으로 mRNA 발현수준 측정 및 단백질발현 수준 측정(단백질 양 변화 측정)을 모두 포함하는 의미이다. 상기 'mRNA 발현수준 측정'이란 대상 세포에서 TRAP1 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 상기‘단백질 발현수준 측정’이란 대상세포에서 TRAP1 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 TRAP1 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기한 바와 같이 본 발명의 스크리닝 방법을 TRAP1의 발현을 분석하여 실시하는 경우, TRAP1 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 발현수준은 RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular 및 Cellular Methods in Biology 및 Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), DNA 칩 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시험물질을 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, TRAP1 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 TRAP1 유전자의 발현량 변화를 측정한다.

또한, 단백질발현 수준 측정(즉, TRAP1 단백질의 양의 변화)은 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, TRAP1 단백질의 양의 변화는 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석등을 사용할 수 있고, 이외에도 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 웨스턴 블랏, 단백질 칩(protein chip) 등이 사용될수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의‘미토콘드리아 기능 장애’는 정상적인 세포에서 나타나는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 감소된 상태로서 이에 제한되지 않으나 예를 들어, 미토콘드리아 효소 활성의 감소, 전자전달계(electron transport chain) 활성 감소, 막전위 감소, 활성산소종(reactive oxygen species) 생산의 증가, 미토콘드리아 단편화(mitochondria fragmentaion), 칼슘 조절장애, 및 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 돌연변이 현상을 포함한다.

본 발명의‘미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환’은 바람직하게 PINK1 유전자 결손에 의한 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환인 것을 특징으로 한다.

상기‘결손’은 유전자의 기능이 결실되어있는 것을 의미하는 것으로 본 발명의‘PINK1 유전자 결손’은 PINK1 유전자에 기능 결실형 변이가 생기는 경우 및 PINK1 유전자를 결실시키는 경우를 포함한다. 상기 PINK1유전자의 기능 결실형 변이는 유전자에 부가된 임의의 조작(치환, 역위, 부가, 중복 등의 돌연변이)을 통해 정상적인 PINK1 유전자의 발현이 불능하게 되거나 또는 유전자로부터 발현된 단백질이 본래 PINK1의 생물학적 활성을 가지지 않는 것을 포함하는 의미이다.

상기 PINK1(PTEN-induced putative kinase 1) 유전자는 바람직하게 서열번호 6(Genbank Accession No.NM_032409.2) 또는 서열번호 8(Genbank Accession No.NM_132112.4)로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 폴리뉴클레오타이드에 의하여 발현되는 PINK1 단백질은 서열번호 5 (Genbank Accession No.NP_115785.1) 또는 서열번호 7 (Genbank Accession No.NP_572340.2)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것 일 수 있다.

구체적으로 상기‘미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환’은 퇴행성 뇌질환, NARP 증후군(Neurogenic muscular weakness-Ataxia-Retinitis pigmentosa syndrome), 다발성 경화증 증후군(Multiple Sclerosis-like Syndrome), 모성 유전 심근증( Maternally Inherited CardioMyopathy), 진행성 외안근 마비(Progressive External Ophthalmoplegia), MERRF 증후군(Myoclonic Epilepsy with Ragged-Red Fibers syndrome), MNGIE 증후군(Myoneurogastrointestinal disorder and encephalopathy), 피어슨 골수 증후군(Pearson Marrow syndrome), 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre syndrome), 레버씨 시신경 위축증(Leber hereditary optic neuropathy), 아미노글루코시드 연관 난청(Aminoglycoside-associated deafness), 난청을 동반하는 당뇨(Diabetes with deafness), Luft 병(Luft disease), 리증후군(Leigh syndrome), 알퍼스병(Alpers Disease), 중쇄 아실코에이 탈수효소 결핍증 (medium chain acyl-CoA dehydrogenase [MCAD] deficiency), 경쇄 아실 코에이 탈수효소 결핍증(Segmental colitis associated with diverticular [SCAD] disease), 단쇄 수산화 코에이 탈수효소 결핍증(Short chain 3- hydroxyacyl CoA dehydrogenase[SCHAD] deficiency), 초장쇄 아실코에이 탈수효소 결손증(Very long chain acyl-CoA dehydrogenase [VLCAD] deficiency ), 장쇄 수산화 아실코에이 탈수효소 결핍증(long chain 3-hydroxy acyl-CoA dehydrogenase [LCHAD] deficiency), 글루타르산뇨증 II형(Glutaric aciduria II) 및 치사성 유아 심근증(Lethal infantile cardiomyopathy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이며병(Alzheimer's disease), 헌팅턴병(Huntington's Disease) 및 치매(dementia)로 이루어지는 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 스크리닝 방법은 전술한 (a) 및 (b) 단계 이후에

‘(c) 상기 (b) 단계에서 TRAP1의 발현을 억제하는 것으로 확인된 시험제제를 미토콘드리아 기능장애로 인한 질환을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료효과를 나타내는지를 검사하는 단계’를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 (c) 단계에서 동물은 인간이 아닌 동물(non-human animal)인 것이 바람직하다. 또한 상기 '치료 효과'란 미토콘드리아 기능장애로 인한 질환 및 이의 증상을 완화 또는 개선하는 효과, 미토콘드리아 기능 장애의 진행을 억제하는 효과의 일부 또는 전부를 포함하는 의미이다.

또한 본 발명은 (a) TRAP1 또는 상기 TRAP1을 발현하는 세포와 시험제제를 배양하는 단계; 및

(b) 상기 TRAP1의 활성을 측정하여, 상기 시험제제가 TRAP1의 활성을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 (b) 단계에서 시험제제가 TRAP1의 활성을 억제하는 지 여부는, 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 활성 정도를 측정하고 시험제제 없이 배양된 세포에서의 TRAP1 활성 정도와 비교하여 수치의 감소에 따라 판정할 수 있다.

상기 스크리닝 방법은 전술한 (a) 및 (b) 단계 이후에

‘(c) 상기 (b) 단계에서 TRAP1의 활성을 억제하는 것으로 확인된 시험제제를 미토콘드리아 기능장애로 인한 질환을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료효과를 나타내는지를 검사하는 단계’를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제 스크리닝 방법에 있어서, TRAP1 단백질의 활성을 억제하는 약제의 스크리닝 방법은 이에 제한되지 않으나, 예를들어 간접적으로 다른 인자를 통해 TRAP1 단백질의 활성을 억제하거나 또는 TRAP1 단백질에 결합하는 물질을 스크리닝하여 실시할 수 있다. 후자의 경우, TRAP1 단백질로서, 분리된 형태의 TRAP1 또는 세포 내에 포함되어 있는 TRAP1 단백질 등 어떠한 형태의 것도 사용할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은 다양한 방식으로 실시할 수 있으며, 특히 당업계에 공지된 다양한 결합 분석(binding assay)에 따라 고성능(high throughput) 방식으로 실시할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질 또는 TRAP1 단백질은 검출가능한 표지(detectable label)로 표지 될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³²P 및 ³⁵S), 형광 표지(예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 6G, 로다민 B, TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지, 화학 발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다.

검출가능한 표지가 표지된 TRAP1 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, TRAP1 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 신호를 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌과 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.

택일적으로, 시험물질의 TRAP1 단백질로의 결합 여부는 상호작용물(interactants)의 표지 없이 분석할 수도 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터(microphysiometer)를 이용하여 시험물질이 TRAP1 단백질에 결합하는지 여부를 분석할 수 있다. 마이크로피지오미터는 LAPS(light-addressable potentiometric sensor)를 이용하여 세포가 그의 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 도구이다. 산성화 속도의 변화는, 시험물질과 TRAP1 단백질 사이의 결합에 대한 지시자로 이용될 수 있다(McConnell et al., Science 257:19061912(1992)).

시험물질의 TRAP1 단백질과의 결합 능력은 실시간 이분자 상호작용 분석(BIA)를 이용하여 분석할 수 있다(Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem.,. 63:2338-2345(1991), 및 Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705(1995)). BIA는 실시간으로 특이적 상호작용을 분석하는 기술로서, 상호작용물(interactants)의 표지없이 실시할 수 있다(예컨대, BIAcore™). 표면 플라즈몬 공명(SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반응에대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법은, 투-하이브리드 분석 또는 쓰리-하이브리드 분석 방법에 따라 실시할 수 있다(U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72, 223232, 1993; Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 1204612054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 16931696, 1993; 및 W0 94/10300). 이 경우, TRAP1 단백질을 "베이트(bait)" 단백질로 이용할 수 있다. 이 방법에 따르면, TRAP1 단백질에 결합하는 물질, 특히 단백질을 스크리닝 할 수 있다. 투-하이브리드시스템은 분할 가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모듈 특성에 기초한다. 간단하게는, 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다. 예컨대, 하나의 컨스트럭트에서, TRAP1-코딩 폴리뉴클레오타이드를 공지의 전사 인자(예컨대, GAL4)의 DNA 결합 도메인-코딩 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 다른 컨스트럭트에서, 분석 대상의 단백질(“프레이” 또는 “시료(시험제제)”)을 코딩하는 DNA 서열을 상기 공지의 전사인자의 활성화 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 만일, 베이트 및 프레이가 생체 내에서 상호작용하여 복합체를 형성하면, 전사인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 인접하게 되며, 이는 리포터 유전자(예컨대, LacZ)의 전사를 촉발하게 된다. 리포터 유전자의 발현을 검출할 수 있으며, 이는 분석 대상의 단백질이 TRAP1 단백질과 결합할 수 있음을 나타내는 것이며, 결론적으로 세포의 항산화능 증가 및 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료제로 이용될 수 있음을 나타내는 것이다.

이어, 시험물질이 처리된 TRAP1 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과, TRAP1 단백질의 활성이 하향-조절(down-regulation)되는 것이 측정되면, 상기 시험물질은 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료제로 판정될 수 있다.

상기 본 발명의 스크리닝 방법은 시험 제제가 TRAP1의 활성 또는 TRAP1 의 발현을 저해(또는 억제)하는지 여부를 판정함으로써, 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환에 대하여 예방 및 치료효과를 보이는 물질들을 선별하는 것을 특징으로 한다. 상기와 같은 방법은 TRAP1의 활성 또는 TRAP1 유전자 발현이 억제됨에 따라, 산화스트레스에 대한 저항성이 커지고 PINK1유전자 결손에 의해 유발된 미토콘드리아 기능 장애가 회복되는 원리를 이용하는 것으로서, 이러한 사실은 본 발명에서 처음 공개되는 것이다.

이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.

본 발명의 일실시예에서는 TRAP1 유전자가 결손된 초파리 모델을 제작하고, TRAP1 결손 초파리에 산화스트레스 작용제로 알려진 파라콰트(paraquat) 및 로테논(rotenone)을 처리하고 초파리의 생존률을 측정하였다. 그 결과 정상 초파리에 비해서 TRAP1이 결손된 초파리의 생존률이 높은 것으로나타났다. 또한 TRAP1 mRNA 발현을 저해시킨 초파리에서도 상기와 같은 결과가 나타났다. 이로서 TRAP1 유전자를 억제하면 산화 스트레스에 대한 저항성이 높아지는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 PINK1 유전자가 결손되어 미토콘드리아 기능장애를 나타내는 초파리에서, TRAP1 유전자를 결손시켰을때 산화 스트레스에 대한 저항성 및 미토콘드리아 기능 장애의 회복 정도를 평가하였다. 그 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 rotenone 저항성 감소를 TRAP1 유전자 결손이 정상화 시킴을 확인하였고, 가슴근육 사멸 및 미토콘드리아 외형이상, 가슴근육 내 미토콘드리아 양 및 ATP level 감소, 운동성 감소 및 도파민성 신경세포 사멸 등의 PINK1 mutant phenotype들이 TRAP1 유전자 결손 시 모두 정상화됨을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 TRAP1 specific inhibiter로 알려진 gammitrinib-TPP(G-TPP)를 초파리에 투여하고 PINK1 결손에 의한 미토콘드리아 기능이상을 정상화 시킬 수 있는지 확인하였다. 그 결과G-TPP 용액을 투여한 PINK1 유전자 결손 초파리의 운동성이 통계적으로 유의미하게 회복되었고 , G-TPP 용액을 30일간 투여하면 PINK1 결손에 의한 도파민성 신경세포의 사멸이 억제됨을 확인하였다 . 또한 PINK1 결손 세포주는 정상 세포주와는 달리 carbon source를 gulcose에서 galactose로 교체하면 미토콘드리아 막전위가 감소하게 되는데 , G-TPP를 처리할 경우 감소된 막전위가 증가하였다.

전술한 바와 같이, TRAP1 유전자의 발현 억제제 또는 TRAP1 단백질의 활성 억제제는 미토콘드리아의 기능장애, 특히 PINK1 유전자 결손에 의한 미토콘드리아 기능장애 및 이에 의한 질환을 예방 및 치료하며 세포의 항산화력을 상승시킨다.

따라서 본발명은 TRAP1 유전자(TRAP1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)에 대해 특이적인 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 상기 “특이적인”은 세포내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 타겟 유전자만 억제하는 능력을 의미한다.

상기‘안티센스 RNA'란 표적 유전자의 제1전사체 또는 mRNA 전체 또는 일부에 상보성이고, 제1전사체 또는 mRNA의 프로세싱, 수송 및(또는) 번역을 방해함으로써 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 말한다. 안티센스 RNA는 5' 비코딩 서열, 3' 비코딩 서열, 인트론 또는 코딩 서열에서 특정 유전자 전사체의 일부와 상보성일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 안티센스 RNA는 유전자 발현을 차단하는 안티센스 RNA의 효능성을 증가시키는, 리보자임 서열 영역을 포함할 수 있다.‘리보자임’이란 촉매 RNA를 말하고, 서열 특이적 엔도리보뉴클레아제를 포함한다. 상기‘표적 유전자’는 본 발명의 목적상 TRAP1이다.

상기‘RNA 전사체’란 DNA 서열의 RNA 폴리머라제에 의해 촉매된 전사에 기인한 생성물을 말한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완전한 상보성 카피인 경우, 제1 전사체로서 또는 제1 전사체의 전사 후 프로세싱으로부터 유래된 RNA 서열일 수 있다. "전령 RNA(mRNA)"란 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 말한다.

상기 “siRNA”는 표적 유전자의 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 의미하고, 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법 또는 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에서 "miRNA(마이크로 RNA)"는 유전자 발현의 전사후 조절자로서 작용하는, 내인성 유전자에서 유래된 짧은 비코딩 RNA를 의미한다. miRNA는 표적 유전자의 mRNA와 염기쌍을 이룸으로써 유전자 발현의 전사 후 조절자로서 작용한다. 본 발명의 miRNA는 TRAP1유전자의 발현을 억제하는 활성이 있는 한 그 염기 서열 및 길이는 특별히 제한되지 않는다.

상기 본 발명의 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA는 공지의 방법을 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어 상기 본 발명의 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA는 벡터에 포함되어 개체에 제공될 수 있다. 즉, 프로모터; 및 이와 작동 가능하게 연결된 상기 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터의 형태로 세포 또는 개체에 제공될 수 있다.

상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

상기 제조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 숙주 세포로의 도입방법은 바람직하게는 염화칼슘법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등 공지의 방법을 이용할 수 있다.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 진균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 인간 세포일 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

상기‘미토콘드리아 기능 장애’및‘미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환’에 대한 설명은, 상기 스크리닝 방법에서 전술한 바와 같다.

본 발명은 TRAP1에 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 항체에서“특이적” 또는 “특이적인”이란 세포내에서 항체가 오직 하나의 항원에만 결합할 수 있는 특이성을 의미하며, 또한 항원 결합 도메인이 어떤 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 사용된다. 본 발명에서 상기 항원은 TRAP1 이다.

상기‘항체’란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 TRAP1을 특이적으로 인지하는 항체를 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다.

TRAP1 단백질의 서열 및 구조는 이미 해당분야에 규명되어있으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 TRAP1 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,567호) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 TRAP1 억제를 통한 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

상기 항체는 기존의 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 상기 커플링 될수 있는 치료제는 미토콘드리아의 기능 장애를 회복시키는 활성이 있는 한 그 종류가 제한되지 않으나, 예를 들어 젤다나마이신(Geldanamycin) 등 일 수 있다.

항체는 그 자체 또는 항체를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 치료용 조성물의 경우 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고, 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함한다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.

본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환을 치료하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 항체를 포함하는 조성물은 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내, 및 국부적 면역억제치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 제제의 pH는 항체 안정성(화학적 및 물리적 안정성)의 균형을 맞추고 투여되는 환자에게 적절하도록 하는데 일반적으로, pH 4와 pH 8 범위이다. 그 외에도 경피 투여 및 경구 투여 등의 투여를 위한 다른 기술들을 적절하게 변형시켜 이용하여, 적당한 제제를 고안할 수 있다. 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 항체를 암호화하는 핵산의 형태로 투여되어 세포내에서 항체가 생성되도록 할 수 있다(WO 96/07321).

본 발명은 TRAP1 억제물질(TRAP1 inhibitor)을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 TRAP1 억제 물질은 미토콘드리아에서 TRAP1의 활성을 일부 감소시키거나 완전히(실질적으로 완전히) 저해하는 물질을 의미한다. 따라서 상기 TRAP1 억제물질은 TRAP1의 발현을 억제하는 물질 또는 발현된 TRAP1의 활성 억제제를 모두 포함하는 의미이다. 또한, 상기 TRAP1은 Hsp90과 높은 상동성을 가지고 있는 것으로 알려져 있어 Hsp90과 결합하여 이의 활성을 억제하는 물질은 TRAP1과도 결합하여 이의 활성을 억제할 가능성이 높기 때문에, 본 발명에서 상기 TRAP1 억제물질은 미토콘드리아 관통 가능한 Hsp90 활성 억제물질을 포함할 수 있다.

상기 발현의 억제는 전사 단계에서의 조절 또는 전사후 단계에서의 조절을 통해 억제될 수 있다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법, 예를 들면 프로모터 또는 유전자 부위의 돌연변이를 유도하여 프로모터 활성 또는 단백질의 기능을 저해하는 방법일 수 있고，전술한 바와 같이　안티센스(antisense) 유전자를　발현시키는　방법,　iRNA(iRNA는 siRNA, shRNA 등 당업계에 공지된 다양한 형태 또는 명칭의 간섭 RNA를 포함하는 의미)　또는　마이크로RNA(microRNA)　방법 등에 의해 수행될 수 있다.

전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 저해시키기 위한 방법, 예를 들면 서열번호 1 또는 3으로 표시되는 TRAP1 단백질 또는 이들에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 유전자(예를 들어, 서열번호 2 또는 서열번호 4)를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 저해하는 방법, 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성을 저해하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

Hsp90 또는 TRAP1을 특이적으로 저해하는 물질이 당업계에 공지되어있으며, Hsp90 또는 TRAP1 억제물질의 종류에 관하여는 WO 2009/036092를 참고 문헌으로 할수 있다.

바람직하게 본 발명의 TRAP1 억제물질은 가미트리닙(gamitrinib), 안테나페디아 세포 관통성 서열(ANT)과 컨쥬게이션된 젤다나마이신 및 쉬페르딘(Shepherdin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이다.

가미트리닙은 미토콘드리아로 약물을 전달하는 부위(운반체)와 목적 단백질을 저해하는 부위(젤다나마이신) 및 이들을 연결하는 링커(linker)로 이루어져 있으며, 상기 약물전달부위의 구조에 따라 가미트리닙 G1, G2, G3, G4 또는 TPP로 구분된다. 모든 가미트리닙들은 미토콘드리아로 운반되어 Hsp90/TRAP1을 저해하는 공통된 작용기전을 가지고 있으나 운반체에 따라서 운반효능 및 약물 반응 속도에서 약간의 차이를 보인다.

본 발명에서‘가미트리닙(Gamitrinib)’은 링커를 통해 C17 위치에서 미토콘드리아 관통 모이어티(예를들어, 테트라구아니디늄(G4), 트리구아니디늄(G3), 디구아니디늄(G2), 모노구아니디늄(G1), 또는 트리페닐포스포늄(TPP) 모이어티)에 컨주게이션된 젤다나마이신 유사체(예를 들어, 17-AAG)를 지칭한다. 이러한 적용을 통해, 특정 가미트리닙의 일부가 되는 미토콘드리아 관통 모이어티가 때때로 지시된다. 예를 들어, 가미트리닙-G4는 테트라구아니디늄 모이어티가 존재하는 가미트리닙을 지칭한다. 예를 들어, 가미트리닙-TPP는 트리페닐포스포늄 모이어티가 존재하는 가미트리닙을 지칭한다.

바람직하게 본 발명의 가미트리닙은 가미트리닙-G1, 가미트리닙-G2, 가미트리닙-G3, 가미트리닙-G4 및 가미트리닙-TPP로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게 가미트리닙-G4 또는 가미트리닙-TPP일 수 있다.

상기 가미트리닙-G1은 바람직하게 하기 화학식 1의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

<화학식 1>

상기 가미트리닙-G2는 바람직하게 하기 화학식 2의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

<화학식 2>

상기 가미트리닙-G3은 바람직하게 하기 화학식 3의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

<화학식 3>

상기 가미트리닙-G4는 바람직하게 하기 화학식 4의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

<화학식 4>

상기 가미트리닙-TPP는 바람직하게 하기 화학식 5의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

<화학식 5>

본 발명의 일실시예에서 사용된 가미트리닙-TPP는 다른 가미트리닙과 비교하여 우수한 약물 반응 속도 및 경제적인 합성이 가능한 화합물이다. 상기 가미트리닙의 유기합성 과정은 문헌[J. Clin. Invest., 2009, Mar, 119(3):454-64; US 2009/0099080]에 상세히 설명되어 있다. 본 발명은 가미트리닙-TPP를 이용하여 수행되었으나, 본 기술분야의 숙련자라면 다른 가미트리닙도 동일한 작용 기전을 가지므로 상기 가미트리닙 TPP 대신에 다른 가미트리닙을 사용하여도 동일한 효과를 얻을 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 가미트리닙 G1, G2, G3 및 G4를 사용하는 약학 조성물도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에서‘안테나페디아 세포 관통성 서열(ANT)’은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 11로 표시되는 펩타이드 서열일 수 있다.

상기 안테나페디아 세포 관통성 서열(ANT)과 컨주게이션(conjugation)된 젤다나마이신(ANT-GA 으로 표기)은 바람직하게 하기 화학식 6의 구조를 가진다(도 12 참조).

<화학식 6>

상기 쉬페르딘(Shepherdin)은 안테나페디아 세포 관통성 서열 및 수비빈(survivin) 유래 Hsp90(또는 TRAP1) 억제 펩타이드 서열이 포함된 펩타이드를 의미한다. 상기 수비빈 유래 Hsp90(또는 TRAP1) 억제 펩타이드 서열에 관하여서는 WO 2009/036092를 참고문헌으로 할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 수비빈 유래 Hsp90(또는 TRAP1) 억제 펩타이드는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

또한 상기 쉬페르딘 서열은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명의 용어‘조성물’은 약학적 조성물과 식품 조성물 및 화장료 조성물을 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게 약학적 조성물을 의미한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 TRAP1 억제 활성 성분들을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

상기‘TRAP1 억제 활성 성분’이란 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나, TRAP1 에 특이적인 항체, 가미트리닙, ANT-GA 및 쉬페르딘 등을 포함하는 TRAP1 억제 물질을 포함하며, 이제 제한되지 않는다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 스크리닝 방법은 미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환의 예방 및 치료 기능을 갖는 물질들을 효과적으로 스크리닝 할 수 있다. 또한 본 발명에서 TRAP1 및 이의 유전자에 대한 억제 기능을 갖는 조성물들은 산화 스트레스에 대한 저항성을 높이고 미토콘드리아 기능 장애를 정상 상태로 회복시키는 효과가 있다.

도 1은 각각 TRAP1 ^P 초파리(a) 및 TRAP1 ^D6 초파리(b)에서, TRAP1 유전자 및 주변 유전자들의 상대적 위치와 조작 상태를 나타낸 모식도이다. 구체적으로 (a)는 TRAP1 ^P 초파리에서 p-element 삽입 위치 및 TRAP1 유전자를 중심으로한 주변 유전자들의 위치를 나타내고, (b)는 TRAP1 ^D6 초파리에서 TRAP1의 C-terminal coding sequence가 손실된 위치를 나타낸다.
도 2의 B는 TRAP1 recombinant protein을 이용하여 제작한 초파리 TRAP1 antibody를 사용하여, TRAP1 ^P 및 TRAP1 ^D6 초파리 체내에 TRAP1 단백질 발현 여부를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다(ACT: β-actin (loading control), TRAP1: TRAP1 단백질, RV: 정상초파리, TRAP1 ^P : TRAP1의 exon에 p-element가 삽입되어 있는 초파리, TRAP1 ^D6 : TRAP1의 C-terminal coding sequence가 손실된 초파리, hs>TRAP1 : TRAP1 과발현 초파리로서 hs-GAL4와 UAS-TRAP1으로 초파리 몸 전체에서 TRAP1을 발현시킴).
도 2의 C는 TRAP1 ^P 및 TRAP1 ^D6 초파리에서 TRAP1 mRNA 발현 정도를 RT-PCR 기법을 통해 확인한 결과를 나타낸다( RV: 정상초파리, TRAP1 ^P : TRAP1의 exon에 p-element가 삽입되어 있는 초파리, TRAP1 ^D6 : TRAP1의 C-terminal coding sequence가 손실된 초파리).
도 3의 D는 TRAP1 ^P 및 TRAP1 ^D6 초파리에서, TRAP1 발현 유전자의 바로 옆 유전자인 Vha 16-1의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR기법을 통해 확인한 결과를 나타낸다(RV: 정상초파리, TRAP1 ^P : TRAP1의 exon에 p-element가 삽입되어 있는 초파리, TRAP1 ^D6 : TRAP1의 C-terminal coding sequence가 손실된 초파리).
도 3의 E에서 윗줄은 초파리 S2 세포주에 TRAP1^WT(야생형 초파리 TRAP1 단백질)의 cDNA를 발현시켰을때 TRAP1 단백질이 모두 미토콘드리아로 특이적으로 이동한 모습을 나타내며, 아랫줄은 초파리 S2 세포주에 TRAP1^△N(TRAP^WT에서 N-terminal의 미토콘드리아 이동신호 펩티드를 제거한 TRAP1 단백질)의 cDNA를 발현시켰을때 TRAP1 단백질이 세포기질에만 존재하는 모습을 나타낸다(HA : hamagglutinin, mito: 미토콘드리아, merge : 이미지 통합).
도 4의 A는 정상(RV) 초파리와 TRAP1 mutant (TRAP1^D6)의 수명을 조사한 결과를 나타낸다.
도 5의 B는 각각의 초파리군에 산화 스트레스 작용제인 파라콰트(paraquat)를 처리한 후, 각 초파리군별 생존률을 나타낸다 (RV: 정상 초파리).
도 5의 C는 각각의 초파리군에 산화 스트레스 작용제인 로테논(rotenone)을 처리한 후, 각 초파리군별 생존률을 나타낸다 (RV: 정상 초파리).
도 6의 D는 서열번호 10으로 표시되는 TRAP1 특이적 RNAi를 몸 전체에 발현시켜 TRAP1 mRNA 발현을 저해시킨 초파리에서 oxidative stress에 대한 저항성정도를 측정한 것이다(da/+♂: 수컷 control로서 da-GAL4만 가짐, da/+♀: 암컷 control로서 da-GAL4만 가짐, da>TRAP1i♂: TRAP1 RNAi를 발현시킨 수컷 실험군으로서 da-GAL4와 UAS-TRAP1 RNAi를 활용하여 몸 전체에서 TRAP1 RNAi를 발현시킴, da>TRAP1i♀: TRAP1 RNAi를 발현시킨 암컷 실험군으로서 da-GAL4와 UAS-TRAP1 RNAi를 활용하여 몸 전체에서 TRAP1 RNAi를 발현시킴 ).
도 7의 A는 야생형 초파리(WT), PINK1 유전자 결손 초파리(B9), PINK1 및 TRAP1 유전자 동시 결손 초파리('B9,TRAP1^D6' 및 'B9,TRAP1^P')군에서, 산화 스트레스 작용제인 로테논(rotenone)을 처리한 후 각 초파리군별 생존률을 나타낸다.
도 8의 B는 각각의 초파리군에서 날개(wing) 및 가슴(thorax)근육에 대한 결손 표현형(defective phenotype)을 가진 개체들의 비율을 조사한 결과이다.
도 8의 C에서 윗줄은 각각의 초파리군에서 초파리 가슴근육 조직내 미토콘드리아 외형을 toluidine blue 염색으로 확인한 모습을 나타내며, 아랫줄은 각각의 초파리군에서 초파리 가슴 근육세포의 사멸정도를 TUNEL assay로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9의 D는 각각의 초파리군에서 운동성 테스트를 수행한 결과를 나타낸다.
도 10의 E는 각각의 초파리군에서 가슴근육 내 미토콘드리아 양(미토콘드리아 DNA의 양)을 측정한 결과를 나타낸 것이다(coxⅠ: cytochrome c oxidase subunit I, coxⅢ: cytochrome oxidase III gene , cyt B: cytochrome B).
도 10의 F는 각각의 초파리군에서 가슴근육 내 ATP level을 측정한 결과를 나타낸다.
도 11의 G는 각각의 초파리군에서, 뇌조직의 도파민성 신경세포를 anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody staining으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 11의 H는 각각의 초파리군에서, 뇌의 Dorso-lateral (DL) region에 위치한 도파민성 신경세포의 개수를 나타낸 것이다.
도 12는 TRAP1 inhibitor 물질들의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다 (Kang BH, BMB Rep. 45, 1-6).
도 13의 A는 각각의 초파리군 별로 갓 우화한 adult 초파리에 G-TPP를 3일간 투여했을 때, G-TPP 투여 농도에 따른 초파리의 운동성 테스트 결과이다(WT: wilde type 초파리, B6: PINK1 유전자 결손 초파리).
도 14의 B는 각각의 초파리군 별로 G-TPP를 30일간 투여했을 때, G-TPP 투여 농도에 따른 도파민성 신경세포의 상태를 anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody staining으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 14의 C는 각각의 초파리군 별로 G-TPP를 30일간 투여했을 때, G-TPP 투여 농도에 따른 도파민성 신경세포의 개수를 나타낸 것이다.
도 15의 D는 각각의 세포주에서, 탄소원(글루코오스 또는 갈락토오스), G-TPP, 17-AAG 처리 조건별 미토콘드리아 막전위를 나타낸 결과이다(PINK1^+/+ : 정상 세포주, PINK1^-/-: PINK1 유전자 결손 세포주).
도 16의 A는 각각의 초파리군에 대하여 운동성 테스트를 수행한 결과를 나타낸다.
도 16의 B는 각각의 초파리군에 대하여 가슴근육 내 ATP level을 측정한 결과를 나타낸다.
도 16의 C는 각각의 초파리군에 대하여 가슴근육 내 미토콘드리아 양 (미토콘드리아 DNA의 양)을 측정한 결과를 나타낸 것이다(coxⅠ: cytochrome c oxidase subunit I, coxⅢ: cytochrome oxidase III gene , cyt B: cytochrome B).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

TRAP1 유전자 조작 모델 제작

<1-1> TRAP1 결손 초파리 모델 및 초파리 사육

TRAP1의 생체기능을 규명하고자 TRAP1의 exon에 초파리의 transposon인 p-element가 삽입되어 있는 초파리(TRAP1 ^P )를 블루밍턴 스탁 센터[Bloomington Drosophila Stock Center(BDSC) Indiana, USA]로부터 입수하였다 (도 1의 (a)). 이 초파리를 p-element의 excision을 유도하는 transposase를 발현하는 초파리와 교배함으로써 p-element의 imprecise excision을 통한 TRAP1 유전자의 결손을 시도하여, p-element 삽입부위 주위가 1kb 가량 결손되어 TRAP1의 C-terminal coding sequence가 손실된 초파리 (TRAP1 ^D6 )를 제작하였다 (도 1의 (b)).

별도의 언급이 없는 한, 모든 실험에 있어서 초파리는 25℃, 60% 습도를 유지한 상태에서 표준 콘밀 배지(Standard Conmeal media)(7% 슈크로즈(sucrose),5% 효모, 2.5% 아가(agar))를 이용하여 사육된 것이다.

<1-2> TRAP1 결손 초파리 모델에서 TRAP1 단백질 발현여부 확인

TRAP1 ^P 와 상기 실시예<1-1>에서 제작된 초파리 mutant TRAP1 ^D6 에서 TRAP1 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 초파리 TRAP1 재조합 단백질(서열번호 9)을 뉴질랜드흰토끼(New Zealand white rabbit)에 투여하여 수득한 초파리 TRAP1 antibody로 웨스턴 블롯을 수행하였으며, 또한 qRT-PCR을 수행하였다.

대조군으로서 정상 초파리(RV) 및 hs>TRAP1을 사용하였으며, 상기 hs>TRAP1는 TRAP1 과발현 초파리주로서 하기와 같은 방법으로 제작되었다. 간략하게, TRAP1 발현 핵산(서열번호 4, NM_058091.3)을 pUAST 벡터(Drosophila genome resource center, DGRC, Indiana, USA)에 삽입하여 UAS-TRAP1 발현 벡터를 제조하였다. 공지의 방법인 P-인자 매개 생식세포 형질전환(P-element-mediated germ line transformation)법으로서 UAS-TRAP1 발현벡터를 w-초파리(BDSC로부터 수득)에 미세주입하여 UAS-TRAP1 발현벡터로 형질전환된 초파리를 제작하였다. UAS/Gal4 system(A.H. Brand and N. Perrimon., Development 1993 118, 401-15)을 이용하여, 상기 UAS-TRAP1 발현벡터로 형질전환된 초파리를 hs-GAL4 초파리(BDSC로부터 수득)와의 교미를 통해 차세대에서 TRAP1을 초파리 몸 전체에 발현시킨 hs>TRAP1 초파리를 수득하였다.

상기 웨스턴 블롯은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 간략하게, 상기 각각의 실험군 초파리로부터 수득한 protein sample을 SDS-PAGE 후 nitrocellulose membrane에 electro-blotting한다. Membrane을 2% BSA TBS-T (Tris-buffered saline with 0.1% TWEEN20)에 30분간 blocking 한 다음, blocking solution에 1:1000 비율로 상기 초파리 TRAP1 antibody를 희석한 용액에 membrane을 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 incubation 시킨다. 이후 Anti-rabbit IgG HRP 2^nd antibody (Rockland) 를 1:5000으로 희석한 TBS-T에 membrane을 상온에서 1시간 incubation한 다음 ECL kit (Amersham)로 형광 반응을 시킨 후 LAS-4000 (GE health care)으로 관찰하였다.

또한 상기 qRT-PCR(Quantitative RT-PCR)은 간략하게 하기의 방법으로 수행되었다. 상기 각각의 실험군에서 3day old 수컷 초파리 5마리로부터 Total RNA를 Easy-Blue kit (Intron)를 이용하여 분리한 다음, random hexamer (Promega) 와 MMLV reverse transcriptase (Promega)로 cDNA를 합성하였다. SYBR Premix Ex Taq (Takara) kit와 Prism 7000 Real-Time PCR system (ABI)을 이용하여 섭씨 94도에서 30초, 55도에서 30초, 72도에서 30초의 조건으로 Quantitative real-time PCR을 수행하였다. 본 실험에서 사용된 TRAP1 특이적 프라이머 서열은 하기 [표 1]과 같다.

서열번호	target	Primer sequence (5' to 3')
14	TRAP1-Forward	GCA GCG TTC AAT ATC ACC ATT G
15	TRAP1-Reverse	GAC CTC GTG GTC GGA GTC TAA GG

상기 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 결과 TRAP1 ^P 및 TRAP1 ^D6 모두 체내에서 TRAP1 단백질 및 mRNA 발현이 성공적으로 억제된 것을 확인하였다(도2의 B 및 C).

<1-3> TRAP1 결손 초파리 모델에서, TRAP1 주변 유전자에대한 영향 평가

TRAP1 ^P 와 상기 실시예<1-1>에서 제작된 초파리 mutant TRAP1 ^D6 에서, TRAP1 옆의 유전자인 Vha-16의 mRNA 발현 정도를 qRT-PCR기법으로 조사하였다. qRT-PCR은 상기 실시예 <1-2>에 기재된 것과 같은 방법으로 수행되었으며, 이때 사용된 Vha-16 특이적 프라이머는 하기 [표 2]의 서열을 가진다.

서열번호	target	Primer sequence (5' to 3')
16	Vha16-1-Forward	GTC TTC TGA AGT GAG CAG CGA C
17	Vha16-1-Reverse	CAT CAC TGA CAT GGC AGC AAT ACC

실험결과, 제작된 초파리 mutant TRAP1 ^D6 의 체내에서 Vha-16의 발현은 별다른 영향을 받지 않은 것을 확인하였다(도 3의 D). 즉 초파리 mutant TRAP1 ^D6 는 TRAP1 유전자만 결손되고, TRAP1 주변의 다른 유전자들의 기능은 정상적임을 확인하였다.

<1-4> 세포내 TRAP1 단백질의 존재 위치 확인

초파리 TRAP1 단백질이 미토콘드리아 단백질임을 확인하기 위하여 초파리 세포주 Drosophila Schneider 2 (S2) cell에 각각 TRAP1^WT(야생형 초파리 TRAP1 단백질)의 cDNA 및 TRAP1^△N(TRAP^WT에서 N-terminal의 미토콘드리아 이동신호 펩티드를 제거한 TRAP1 단백질)의 cDNA를 발현시켜, 세포 내 존재 위치를 확인하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다. pUAST vector에 C-terminal hamagglutinin (HA) tagging 된 TRAP1 full length cDNA (TRAP1^WT)와 N-terminal deletion mutant (TRAP1^△N) cDNA를 cloning하고, 이 plasmid들을 pMT-GAL4 plasmid 와 함께 DDAB 법 (Han K, Nucleic Acids Res., 1996)으로 S2 세포주에 transfection 하였다. Transfection 후 48시간 뒤에 0.5mM CuSO₄를 세포에 처리하여 pMT-GAL4의 metallothionein promoter를 활성화시켜 GAL4가 발현되게 함으로써 TRAP1 단백질을 발현시키고, 24시간 후에 5 mg/mL MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes)을 1시간 처리하여 mitochondria를 염색하였다. 이후 4% paraformaldehyde를 함유한 PBS로 세포를 고정시킨 다음, 3% BSA PBS-T (0.3% Triton X-100 in PBS)로 상온에서 1시간 blocking한 다음 1:200 Anti-HA monoclonal antibody를 포함한 blocking solution을 세포에 처리하여 섭씨 4도에서 하룻밤 incubation 하였다. 이후 1:200 anti-mouse FITC antibody를 함유한 PBS-T에 세포를 2시간 incubation 한 다음, LSM 700 공초점 형광현미경 (Carl Zeiss)로 세포 내 TRAP1 단백질의 위치를 조사하였다.

그 결과, 야생형 초파리 TRAP1 cDNA를 입수하여 초파리 세포주 Drosophila Schneider 2 (S2) cell에 발현 시키자 TRAP1 단백질이 모두 미토콘드리아로 특이적으로 이동하였으며, N-terminal의 미토콘드리아 이동신호 펩티드를 제거하자 cytosol에만 존재하여, 초파리 TRAP1 또한 미토콘드리아 단백질임을 확인하였다 (도 3의 E).

<실시예 2>

TRAP1 유전자 결손에 의한 산화 스트레스(oxidative stress) 저항성

<2-1> TRAP1 결손 돌연변이체에서의 산화스트레스 저항성

TRAP1 유전자의 생체기능을 조사하기 위하여 정상 초파리(RV)와 TRAP1 mutant TRAP1^D6의 수명 및 산화 스트레스 저항성을 조사하였다. 상기 정상 초파리(RV)는 TRAP1^P초파리에서 p-element를주변의 DNA에 아무런 손상을 주지 않고 정확하게 뽑아내어 TRAP1 유전자의 기능을 정상화 시킨 초파리이다.

상기 수명 조사 방법은 구체적으로, RV 및 TRAP1^D6 각각의 실험군 genotype당 초파리 120 마리를 30마리씩 나누어 초파리 배양배지 10ml이 들어있는 vial에 넣고 3-4일 간격으로 초파리를 새 vial로 옮겨주며 동시에 살아있는 초파리와 죽은 초파리의 마리 수를 check한다. Test가 완료되면 Kaplan-Meier estimator와 log-rank test를 통해 genotype 간 생존률이 통계적으로 의미있게 차이가 나는지 검증하였다.

또한 상기 산화 스트레스 저항성을 측정하기 위하여, 상기 RV, TRAP1^p 및 TRAP1^D6 각각의 실험군 genotype당 120마리의 초파리 (3 day old)를 각 30마리씩의 4개 그룹으로 나누어 6시간 동안 starvation 시키고, 5% sucrose, 1% agar, 20mM paraquat (또는 5mM rotenone) 함유 PBS gel 3ml이 담긴 oxidative agent vial에 초파리를 30마리씩 넣어 일정 시간마다 생존율을 측정한다. 상기 oxidative agent vial은 하루에 한번씩 새것으로 교체한다. Test가 완료되면 Kaplan-Meier estimator와 log-rank test를 통해 genotype 간 생존률이 통계적으로 의미있게 차이가 나는지 검증하였다.

실험 결과, 수명에 있어서는 상기 정상 초파리(RV))와 TRAP1 mutant TRAP1^D6간에 별다른 차이가 없었다 (도4의 A). 그러나 놀랍게도 paraquat (도5의 B), rotenone (도5의 C)등의 oxidative stress agent들을 초파리에 처리하여 본 결과 기존에 알려진 사실과는 달리 TRAP1 유전자 결손이 oxidative stress에 대한 저항성을 항진 시킨다는 결과를 얻었다.

<2-2> TRAP1 넉다운(knock-down) 초파리에서의 산화스트레스에 대한 저항성

BDSC로 부터 수득한 암·수 da-GAL4 초파리주(da/+로 표시)에, TRAP1 특이적 RNAi(서열번호 10)를 몸 전체에 발현시켜, TRAP1 mRNA 발현을 저해시킨 초파리 da>TRAP1를 제작하였다. 간략하게, UAS promoter가 붙어있는 TRAP1 특이적 RNAi(서열번호 10)가 염색체에 삽입된 형질전환 초파리를 Vienna Drosophila Resource Center (VDRC) (Vienna, Austria)에서 수득한 후, 상기 da-GAL4 초파리와 교미를 통해 차세대에서 온몸에서 TRAP1 mRNA의 발현이 억제된 da>TRAP1 초파리를 제작하였다. 대조군인 암·수 da-GAL4 초파리주(da/+)와 실험군 암수 da>TRAP1 초파리에 산화물질로서 로테논(rotenone)을 사용하여 상기 실시예 2-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 산화 스트레스 저항성을 측정하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, TRAP1 특이적 RNAi(서열번호 10)를 몸 전체에 발현시켜 TRAP1 mRNA 발현을 저해시킨 초파리를 이용한 실험에서도 TRAP1 유전자 결손이 oxidative stress에 대한 저항성을 항진시킴이 확인되었다 (도6의 D).

<실시예 3>

PINK1 유전자 결손 초파리 모델에서, TRAP1 유전자 결손에 의한 oxidative stress 저항성 및 미토콘드리아 기능 항진

PINK1 유전자 결손시 oxidaive stress에 대한 저항성이 감소한다는 사실이 보고된 바 있어(Clark et al., (2006) Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature 441: 1162-6), PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리를 제작하여 하기와 같은 실험을 하였다.

<3-1> 초파리 주(line) 및 PINK1 결손 세포주(cell line)

PINK1 유전자 결손 초파리(B9)는 서울대학교 정종경 교수로부터 제공 받았다. 제공받은 PINK1 유전자 결손 초파리를 상기 실시예<1-1>의 TRAP1^D6 및 TRAP1^p과 각각 교배하여 PINK1 및 TRAP1 유전자 동시 결손 초파리 'B9,TRAP1^D6' 및‘B9,TRAP1^p’를 제작하였다. TRAP1 과량발현 초파리는 상기 실시예<1-2>에서 제작한 cDNA를 이용하여 KAIST 초파리 연구지원실에 의뢰하여 제작하였다(하기 실시예<3-8> 참조).

시카고 의대의 Xiaoxi Zhuang 교수 연구실에서 제작된 PINK1 유전자 결손 생쥐로부터 얻은 mouse embryonic fibroblast (MEF) [Xiong et al., J Clin Invest., 2009]를 입수하여 섭씨 37도, 5% CO₂ incubator에서 10% FBS를 함유한 DMEM으로 배양하여 실험에 사용하였다 .

<3-2> PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리에서, 산화스트레스 작용제(rotenone)에 대한 저항성 평가

정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1^D6' 및‘B9,TRAP1^p’각각을 이용하여, 로테논(rotenone)에대한 산화스트레스 저항성을 평가하였다. 산화스트레스 저항성은 상기 실시예<2-1>에 기재된 방법과 동일하게 수행되었다.

그 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 rotenone 저항성 감소를 TRAP1 유전자 결손이 정상화시킴을 확인하였다 (도7의 A).

<3-3> 결손 표현형(defective phenotype)의 회복

정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1^D6' 및‘B9,TRAP1^p’각각의 실험군에서, 초파리 200마리의 날개와 가슴을 관찰하여 날개가 처진 초파리와 가슴이 우그러든 초파리의 비율을 각각 %로 환산하여 결손 표현형 비율을 산출하였다.

PINK1 유전자가 결손된 초파리들은 가슴근육이 결손됨에 따라 날개가 처지고 가슴부위가 우그러드는 표현형을 보이는 데, TRAP1 유전자 결손에 의해서 PINK1 유전자 결손 초파리의 처진 날개와 우그러든 가슴이 정상으로 회복됨을 확인하였다(도8의 B 참조).

<3-4> 근육 조직 내 세포사멸 정도 측정 및 미토콘드리아 외형 관찰

근육 조직 내 미토콘드리아 기능이상이 근육세포 사멸을 초래함이 보고되어, 다음과 같은 방법으로 근육세포의 세포사멸 정도를 조사하였다. 정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1^D6' 및‘B9,TRAP1^p’각각의 실험군에서, 초파리의 가슴 부위를 절개하여 근육조직을 분리한 다음, 4% formaldehyde로 고정시킨 후 TUNEL assay를 실시하여 가슴 근육에서의 세포사멸 정도를 조사하였다. 또한 근육 내 미토콘드리아 외형을 확인하기 위하여, 초파리 가슴 부위를 분리하여 Spurr's resin에 넣고 응고 시킨 후 rotary microtome을 이용하여 10 미크론 두께로 절편을 제작한 후 toluidine blue 염색제로 염색하여 광학현미경으로 근육조직 내 미토콘드리아 외형을 관찰 하였다.

실험 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 가슴근육 사멸 (도8의 C에서 아랫줄) 및 미토콘드리아 외형이상 (도8의 C에서 윗줄) 의 PINK1 mutant phenotype들이 TRAP1 유전자 결손 시 모두 정상화되었다.

<3-5> 모델동물 운동성 test

정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1^D6' 및‘B9,TRAP1^p’각각의 실험군에서, 초파리의 운동성을 측정하기위해 climbing assay를 수행하였다, 초파리는 중력을 감지하여 중력의 반대방향으로 움직이는 특성이 있어, 이를 이용하여 초파리의 운동성을 측정하는 실험기법을 climbing assay라 부른다. 일단 초파리를 온도가 일정히 유지되는 암실에 1시간 동안 보관하여 안정화시킨 다음, 초파리가 들어있는 vial을 두드려 초파리를 vial 바닥에 위치시킨 후 10초 동안 15cm이상을 올라오는 초파리의 수를 세어 전체 초파리 중 이러한 기준을 충족시키는 운동성을 보이는 초파리의 비율을 구하고, 이를 5회 반복하여 평균값을 구하였다.

실험 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 운동성 감소 (도9의 D)의 PINK1 mutant phenotype이 TRAP1 유전자 결손 시 모두 정상화되었다.

<3-6> 근육 조직 내 mitochondria 양 측정 및 ATP 농도 측정

정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1^D6' 및‘B9,TRAP1^p’각각의 실험군에서, 조직 내 미토콘드리아 양 및 기능을 측정하였다. 구체적으로 quantitative real-time PCR 기법을 사용하여 조직 내 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 양을 측정하여 미토콘드리아의 양을 측정 하였다. 또한 미토콘드리아의 기능을 조사하기 위하여 미토콘드리아가 생산하는 에너지 전달물질인 ATP의 양을 측정하였다. mtDNA 양 측정은 실험군별로 초파리 5마리의 가슴을 분리하여 모은 다음, qiagen 사의 DNeasy Blood & tissue kit (#69506)을 이용하여 근육조직 내 total DNA 만을 분리하였다. mtDNA에 존재하는 3가지 미토콘드리아 단백질 유전자 coxⅠ, coxⅢ, cyt B 에 대한 프라이머를 각각 제작한 후(표 3 참조), SYBR Premix Ex Taq (Takara) kit와 Prism 7000 Real-Time PCR system (ABI)을 이용하여 섭씨 94도에서 30초, 55도에서 30초, 72도에서 30초의 조건으로 Quantitative real-time PCR을 수행하여 mtDNA양을 구하였다. 또한 nuclear DNA (nDNA)에 위치한 유전자인 rp49에 대한 프라이머(표 3 참조)를 이용하여 상기와 같은 방법으로 nDNA양을 구한 후, normalization하여 mtDNA 양을 정확하게 확인하였다.

또한, 근육 조직내 ATP 양을 구하기 위하여 실험군별로 초파리 5마리의 가슴 근육을 0.1ml extraction buffer (6M guanidine-HCl, 10mM Tris, 4mM EDTA, pH 7.8)에 넣고 homogenize 한 후, 액체질소로 급속 냉동시키고 3분간 끓인 다음 원심분리하여 상층액을 모아 추출액을 제조하였다. 상기 추출액에 Enlighten Kit (Promega)를 사용하여 추출액의 ATP 농도를 구하고, BCA assay를 통해 얻은 추출액 내의 단백질 농도로 normalization하여 근육 내 ATP level을 확인 하였다.

서열번호	target	Primer sequence (5’to 3')
18	COX I-Forward	GTG CCT TTA ATA TTA GGT GCT C
19	COX I-Reverse	GTA ATA GCT CCT GCT AGT ACT G
20	COX III-Forward	CGA GAT GTA TCA CGA GAA GG
21	COX III-Reverse	GAA TTC CGT GGA ATC CTG TTG
22	CytB-Forward	CGA ACT TTA CAT GCT AAC GGT G
23	CytB-Reverse	CCG ATA GGA TTA TTA GAT CCT G
24	rp49-Forward	GCT TCA AGA TGA CCA TCC GCC C
25	rp49-Reverse	GGT GCG CTT GTT CGA TCC GTA AC

실험 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 가슴근육 내 미토콘드리아 양 (도10의 E) 및 ATP level 감소 (도10의 F)의 PINK1 mutant phenotype들이 TRAP1 유전자 결손 시 모두 정상화되었다.

<3-7> 초파리 도파민 신경세포 사멸 정도 측정

정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1^D6' 및‘B9,TRAP1^p’각각의 실험군에서, 우화 후 30일 지난 초파리의 뇌를 분리하여 4% paraformaldehyde 용액에 고정 시킨 후 Pel-freez 회사의 anti-tyrosine hydroxylase (TH) 항체로 염색한 다음, Dorso-lateral (DL) region 에 위치한 도파민 신경세포의 개수를 측정하였다 (n=40) (Koh H, Kim H, Kim MJ, Park J, Chung J (2012) Sir2 and FOXO Complement Mitochondrial Dysfunction and Dopaminergic Neuron Loss in Drosophila PINK1 Mutants. J Biol Chem 287: 12750-12758).

실험 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 도파민성 신경세포 사멸 (도11의 G 및 H) 의 PINK1 mutant phenotype들이 TRAP1 유전자 결손 시 모두 정상화되었다.

<3-8> TRAP1 유전자의 조직 특이적 과량발현 및 이의 효과

BDSC로 부터 수득한 da-GAL4 초파리(da로 표시), 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리(B9)와 da-GAL4 초파리의 교미를 통해 수득한‘B9, da’초파리 및 상기‘B9, da’초파리와 상기 실시예 <1-2>에서 제작한 UAS-TRAP1 발현벡터로 형질전환된 초파리의 교미를 통해 차세대에서 TRAP1 유전자가 과량발현된 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9, da TRAP1’를 대상으로 운동성평가, 근육 조직 내 mitochondria 양 측정 및 ATP 농도 측정을 수행하였다.

또한 운동성 평가는 상기 실시예<3-5>에 기재된 방법으로, 근육 조직 내 mitochondria 양 측정 및 ATP 농도 측정은 상기 실시예 <3-6>에 기재된 방법으로 수행되었다.

그 결과 PINK1 mutant (B9, da) 에서 관찰되는 운동성 저하 (도 16의 A), 근육 내 ATP 농도 감소 (도 16의 B), 근육내 mitochondria content 감소 (도 16의 C)가 TRAP1을 과량발현 중인 PINK1 결손 mutant (B9, da TRAP1)에서 전혀 정상화 되지 않는 것을 확인하였다. 즉, TRAP1 유전자 과량 발현은 PINK1 결손 mutant phenotype에 별다른 영향을 주지 못하였다.

이러한 상기 실시예 <3-1> 내지 <3-8>의 결과로부터, TRAP1 유전자 결손이 oxidative stress에 대한 저항성을 증가시키고, PINK1 유전자 결손에 의한 mitochondrial dysfunction을 정상화 시킨다는 사실을 발견하였다.

<실시예 4>

TRAP1 specific inhibitor에 의한 미토콘드리아 기능이상 정상화

미토콘드리아에 특이적으로 위치한 TRAP1을 억제하기 위하여 HSP90 inhibitor인 geldanamycin (17-AAG)및 이에 mitochondria targeting group들을 결합시킨 TRAP1 inhibitor 중 gammitrinib (G-TPP) (도12 참조)을 초파리에 투여하고 PINK1 결손에 의한 미토콘드리아 기능이상을 정상화 시킬 수 있는지 확인하였다.

<4-1> TRAP1 specific inhibitor 처리 및 운동성 테스트

정상초파리(WT) 및 PINK1 결손초파리 모델(B9)을 이용하여, 갓 우화한 adult 초파리에 G-TPP를 3일간 투여한 후 운동성을 조사하였다.

G-TPP 투여는 하기와 같은 방법으로 수행되었다. 초파리 배양배지 5ml이 담긴 vial을 만들고 18G 주사바늘로 배지에 구멍을 50개 이상 뚫은 다음, 1mM 또는 5mM 농도의 G-TPP를 함유한 증류수 0.2ml을 넣고 하룻밤 상온에 놓아두어 G-TPP 용액을 배지에 흡수 시킨다. 상기 완성된 G-TPP 함유 vial에 초파리를 30마리씩 넣고 3일간 배양한 다음 실험에 사용하였다. 운동성 테스트 방법은 실시예 <3-5>에 기재된 방법과 동일하게 climbing assay가 수행되었다.

그 결과 5mM G-TPP 용액을 투여한 PINK1 유전자 결손 초파리의 운동성이 통계적으로 유의미하게 회복되었다 (도13의 A).

<4-2> TRAP1 specific inhibitor 처리 및 도파민성 신경세포 사멸 억제

상기 실시예<4-1>에 기재된 방법으로 제작된 G-TPP 함유 vial을 3-4일 마다 새것으로 교환하여, 정상초파리(WT) 및 PINK1 결손초파리(B9)에 G-TPP 용액을 30일간 투여하였고, 이의 도파민성 신경세포 사멸에 대한 영향을 상기 실시예 <3-7>에 기재된 방법으로 평가하였다.

G-TPP 용액을 30일간 투여하면 PINK1 결손에 의한 도파민성 신경세포의 사멸이 억제됨을 확인하였다 (도14의 B 및 C).

<4-3> TRAP1 specific inhibitor 처리 및 미토콘드리아 막전위 측정

정상(PINK1^+/+) 및 PINK1 유전자 결손 MEF cell(PINK1^-/-)에 도 15에 기재된 조건으로 glucose (4.5g/L) 함유 DMEM, Galactose (4.5g/L) 함유 DMEM, G-TPP, 17-AAG, DMSO를 각실험군 별로 처리하고 16시간 동안 배양하였다. 그리고나서, trypsin을 처리하여 세포를 분리하고, 1 mg/mL JC-1을 함유한 DMEM에 섭씨 37도에서 20분간 incubation 하였다. 이후 red 및 green fluorescence를 EPICS XL cytometer (Beckman Coulter)로 측정한 다음 red fluorescence intensity를 green fluorescence intensity로 나누어 미토콘드리아 막 전위를 측정하였다.

그 결과 도 15에서 보는 바와 같이, PINK1 결손 MEF 세포주는 정상 세포주와는 달리 carbon source를 gulcose에서 galactose로 교체하면 미토콘드리아 막전위가 감소하게 되는데, G-TPP를 처리할 경우 감소된 막전위가 증가하였다(도15의 D). 반면에 17-AAG를 처리하였을 경우 감소된 막전위에 별다른 변화가 없었다 (도15의 D).

상기 실시예<4-1> 내지 <4-3>의 실험결과를 통해 TRAP1 유전자 결손으로 얻어진 실험결과들을 약리학적인 실험기법으로 다시 한 번 확인할 수 있었으며, 파킨슨병과 같은 미토콘드리아 기능이상관련 질환 치료제로 TRAP1 inhibitor를 활용할 수 있는 가능성을 확인하였다.

본 발명의 스크리닝 방법은 미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환의 예방 및 치료 기능을 갖는 물질들을 효과적으로 스크리닝 할 수 있다. 또한 본 발명에서 TRAP1 및 이의 유전자에 대한 억제 기능을 갖는 조성물들은 산화 스트레스에 대한 저항성을 높이고 미토콘드리아 기능 장애를 정상 상태로 회복시키는 효과가 있어 산업상 이용 가능성이 크다.

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Screening method for therapeutic agent of mitochondria dysfunction using TRAP1 gene <130> NP13-0046 <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 704 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human TRAP1 amino acid sequece(NP_057376.2) <400> 1 Met Ala Arg Glu Leu Arg Ala Leu Leu Leu Trp Gly Arg Arg Leu Arg 1 5 10 15 Pro Leu Leu Arg Ala Pro Ala Leu Ala Ala Val Pro Gly Gly Lys Pro 20 25 30 Ile Leu Cys Pro Arg Arg Thr Thr Ala Gln Leu Gly Pro Arg Arg Asn 35 40 45 Pro Ala Trp Ser Leu Gln Ala Gly Arg Leu Phe Ser Thr Gln Thr Ala 50 55 60 Glu Asp Lys Glu Glu Pro Leu His Ser Ile Ile Ser Ser Thr Glu Ser 65 70 75 80 Val Gln Gly Ser Thr Ser Lys His Glu Phe Gln Ala Glu Thr Lys Lys 85 90 95 Leu Leu Asp Ile Val Ala Arg Ser Leu Tyr Ser Glu Lys Glu Val Phe 100 105 110 Ile Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Glu Lys Leu Arg 115 120 125 His Lys Leu Val Ser Asp Gly Gln Ala Leu Pro Glu Met Glu Ile His 130 135 140 Leu Gln Thr Asn Ala Glu Lys Gly Thr Ile Thr Ile Gln Asp Thr Gly 145 150 155 160 Ile Gly Met Thr Gln Glu Glu Leu Val Ser Asn Leu Gly Thr Ile Ala 165 170 175 Arg Ser Gly Ser Lys Ala Phe Leu Asp Ala Leu Gln Asn Gln Ala Glu 180 185 190 Ala Ser Ser Lys Ile Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala 195 200 205 Phe Met Val Ala Asp Arg Val Glu Val Tyr Ser Arg Ser Ala Ala Pro 210 215 220 Gly Ser Leu Gly Tyr Gln Trp Leu Ser Asp Gly Ser Gly Val Phe Glu 225 230 235 240 Ile Ala Glu Ala Ser Gly Val Arg Thr Gly Thr Lys Ile Ile Ile His 245 250 255 Leu Lys Ser Asp Cys Lys Glu Phe Ser Ser Glu Ala Arg Val Arg Asp 260 265 270 Val Val Thr Lys Tyr Ser Asn Phe Val Ser Phe Pro Leu Tyr Leu Asn 275 280 285 Gly Arg Arg Met Asn Thr Leu Gln Ala Ile Trp Met Met Asp Pro Lys 290 295 300 Asp Val Arg Glu Trp Gln His Glu Glu Phe Tyr Arg Tyr Val Ala Gln 305 310 315 320 Ala His Asp Lys Pro Arg Tyr Thr Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Pro 325 330 335 Leu Asn Ile Arg Ser Ile Phe Tyr Val Pro Asp Met Lys Pro Ser Met 340 345 350 Phe Asp Val Ser Arg Glu Leu Gly Ser Ser Val Ala Leu Tyr Ser Arg 355 360 365 Lys Val Leu Ile Gln Thr Lys Ala Thr Asp Ile Leu Pro Lys Trp Leu 370 375 380 Arg Phe Ile Arg Gly Val Val Asp Ser Glu Asp Ile Pro Leu Asn Leu 385 390 395 400 Ser Arg Glu Leu Leu Gln Glu Ser Ala Leu Ile Arg Lys Leu Arg Asp 405 410 415 Val Leu Gln Gln Arg Leu Ile Lys Phe Phe Ile Asp Gln Ser Lys Lys 420 425 430 Asp Ala Glu Lys Tyr Ala Lys Phe Phe Glu Asp Tyr Gly Leu Phe Met 435 440 445 Arg Glu Gly Ile Val Thr Ala Thr Glu Gln Glu Val Lys Glu Asp Ile 450 455 460 Ala Lys Leu Leu Arg Tyr Glu Ser Ser Ala Leu Pro Ser Gly Gln Leu 465 470 475 480 Thr Ser Leu Ser Glu Tyr Ala Ser Arg Met Arg Ala Gly Thr Arg Asn 485 490 495 Ile Tyr Tyr Leu Cys Ala Pro Asn Arg His Leu Ala Glu His Ser Pro 500 505 510 Tyr Tyr Glu Ala Met Lys Lys Lys Asp Thr Glu Val Leu Phe Cys Phe 515 520 525 Glu Gln Phe Asp Glu Leu Thr Leu Leu His Leu Arg Glu Phe Asp Lys 530 535 540 Lys Lys Leu Ile Ser Val Glu Thr Asp Ile Val Val Asp His Tyr Lys 545 550 555 560 Glu Glu Lys Phe Glu Asp Arg Ser Pro Ala Ala Glu Cys Leu Ser Glu 565 570 575 Lys Glu Thr Glu Glu Leu Met Ala Trp Met Arg Asn Val Leu Gly Ser 580 585 590 Arg Val Thr Asn Val Lys Val Thr Leu Arg Leu Asp Thr His Pro Ala 595 600 605 Met Val Thr Val Leu Glu Met Gly Ala Ala Arg His Phe Leu Arg Met 610 615 620 Gln Gln Leu Ala Lys Thr Gln Glu Glu Arg Ala Gln Leu Leu Gln Pro 625 630 635 640 Thr Leu Glu Ile Asn Pro Arg His Ala Leu Ile Lys Lys Leu Asn Gln 645 650 655 Leu Arg Ala Ser Glu Pro Gly Leu Ala Gln Leu Leu Val Asp Gln Ile 660 665 670 Tyr Glu Asn Ala Met Ile Ala Ala Gly Leu Val Asp Asp Pro Arg Ala 675 680 685 Met Val Gly Arg Leu Asn Glu Leu Leu Val Lys Ala Leu Glu Arg His 690 695 700 <210> 2 <211> 2310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TRAP1 cDNA (NM_016292.2) <400> 2 gaggaagccc cgccccgcgc agccccgtcc cgccccttcc catcgtgtac ggtcccgcgt 60 ggctgcgcgc ggcgctctgg gagtacgaca tggcgcgcga gctgcgggcg ctgctgctgt 120 ggggccgccg cctgcggcct ttgctgcggg cgccggcgct ggcggccgtg ccgggaggaa 180 aaccaattct gtgtcctcgg aggaccacag cccagttggg ccccaggcga aacccagcct 240 ggagcttgca ggcaggacga ctgttcagca cgcagaccgc cgaggacaag gaggaacccc 300 tgcactcgat tatcagcagc acagagagcg tgcagggttc cacttccaaa catgagttcc 360 aggccgagac aaagaagctt ttggacattg ttgcccggtc cctgtactca gaaaaagagg 420 tgtttatacg ggagctgatc tccaatgcca gcgatgcctt ggaaaaactg cgtcacaaac 480 tggtgtctga cggccaagca ctgccagaaa tggagattca cttgcagacc aatgccgaga 540 aaggcaccat caccatccag gatactggta tcgggatgac acaggaagag ctggtgtcca 600 acctggggac gattgccaga tcggggtcaa aggccttcct ggatgctctg cagaaccagg 660 ctgaggccag cagcaagatc atcggccagt ttggagtggg tttctactca gctttcatgg 720 tggctgacag agtggaggtc tattcccgct cggcagcccc ggggagcctg ggttaccagt 780 ggctttcaga tggttctgga gtgtttgaaa tcgccgaagc ttcgggagtt agaaccggga 840 caaaaatcat catccacctg aaatccgact gcaaggagtt ttccagcgag gcccgggtgc 900 gagatgtggt aacgaagtac agcaacttcg tcagcttccc cttgtacttg aatggaaggc 960 ggatgaacac cttgcaggcc atctggatga tggaccccaa ggatgtccgt gagtggcaac 1020 atgaggagtt ctaccgctac gtcgcgcagg ctcacgacaa gccccgctac accctgcact 1080 ataagacgga cgcaccgctc aacatccgca gcatcttcta cgtgcccgac atgaaaccgt 1140 ccatgtttga tgtgagccgg gagctgggct ccagcgttgc actgtacagc cgcaaagtcc 1200 tcatccagac caaggccacg gacatcctgc ccaagtggct gcgcttcatc cgaggtgtgg 1260 tggacagtga ggacattccc ctgaacctca gccgggagct gctgcaggag agcgcactca 1320 tcaggaaact ccgggacgtt ttacagcaga ggctgatcaa attcttcatt gaccagagta 1380 aaaaagatgc tgagaagtat gcaaagtttt ttgaagatta cggcctgttc atgcgggagg 1440 gcattgtgac cgccaccgag caggaggtca aggaggacat agcaaagctg ctgcgctacg 1500 agtcctcggc gctgccctcc gggcagctaa ccagcctctc agaatacgcc agccgcatgc 1560 gggccggcac ccgcaacatc tactacctgt gcgcccccaa ccgtcacctg gcagagcact 1620 caccctacta tgaggccatg aagaagaaag acacagaggt tctcttctgc tttgagcagt 1680 ttgatgagct caccctgctg caccttcgtg agtttgacaa gaagaagctg atctctgtgg 1740 agacggacat agtcgtggat cactacaagg aggagaagtt tgaggacagg tccccagccg 1800 ccgagtgcct atcagagaag gagacggagg agctcatggc ctggatgaga aatgtgctgg 1860 ggtcgcgtgt caccaacgtg aaggtgaccc tccgactgga cacccaccct gccatggtca 1920 ccgtgctgga gatgggggct gcccgccact tcctgcgcat gcagcagctg gccaagaccc 1980 aggaggagcg cgcacagctc ctgcagccca cgctggagat caaccccagg cacgcgctca 2040 tcaagaagct gaatcagctg cgcgcaagcg agcctggcct ggctcagctg ctggtggatc 2100 agatatacga gaacgccatg attgctgctg gacttgttga cgaccctagg gccatggtgg 2160 gccgcttgaa tgagctgctt gtcaaggccc tggagcgaca ctgacagcca gggggccaga 2220 aggactgaca ccacagatga cagccccacc tccttgagct ttatttacct aaatttaaag 2280 gtatttctta acccgaaaaa aaaaaaaaaa 2310 <210> 3 <211> 691 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Drosophila TRAP1 amino acid sequence(NP_477439.2) <400> 3 Met Ser Val Arg Ala Met Gly Val Leu Gly Gln Ala Cys Arg Leu Gly 1 5 10 15 Arg Cys Ala Gln Val Leu Arg Gln Ser His Arg Ser Ala Pro Ala Ala 20 25 30 Phe Asn Ile Thr Ile Gly Ser Gln His Ser Pro Gly Ala Leu Ser Leu 35 40 45 Arg Arg Tyr Ser Thr Glu Thr Lys Gln Ala Ser Gly Ser Val Val Asp 50 55 60 Lys His Glu Phe Gln Ala Glu Thr Arg Gln Leu Leu Asp Ile Val Ala 65 70 75 80 Arg Ser Leu Tyr Ser Asp His Glu Val Phe Val Arg Glu Leu Ile Ser 85 90 95 Asn Ala Ser Asp Ala Leu Glu Lys Phe Arg Tyr Thr Ser Leu Ser Ala 100 105 110 Gly Gly Glu Asn Leu Ala Gly Lys Asp Arg Pro Leu Glu Ile Arg Ile 115 120 125 Thr Thr Asp Lys Pro Leu Met Gln Leu Ile Ile Gln Asp Thr Gly Ile 130 135 140 Gly Met Thr Lys Glu Glu Leu Val Ser Asn Leu Gly Thr Ile Ala Arg 145 150 155 160 Ser Gly Ser Lys Lys Phe Leu Glu Gln Met Lys Gly Thr Gln Gln Gly 165 170 175 Ala Ser Ser Glu Ala Ser Ser Asn Ile Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly 180 185 190 Phe Tyr Ser Ser Phe Ile Val Ala Asn Lys Val Glu Val Phe Thr Arg 195 200 205 Ala Ala Val Pro Asn Ala Pro Gly Leu Arg Trp Ser Thr Asp Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Tyr Glu Ile Glu Glu Val Pro Asp Val Glu Leu Gly Thr Arg 225 230 235 240 Ile Val Leu His Leu Lys Thr Asp Cys Arg Glu Tyr Ala Asp Glu Glu 245 250 255 Arg Ile Lys Ala Val Ile Lys Lys Tyr Ser Asn Phe Val Gly Ser Pro 260 265 270 Ile Leu Leu Asn Gly Lys Gln Ala Asn Glu Ile Lys Pro Leu Trp Leu 275 280 285 Leu Glu Pro Gln Ser Ile Ser Lys Glu Gln His His Asp Phe Tyr Arg 290 295 300 Phe Ile Ser Asn Ser Phe Asp Val Pro Arg Phe Thr Leu His Tyr Asn 305 310 315 320 Ala Asp Val Pro Leu Ser Ile His Ala Leu Leu Tyr Phe Pro Glu Gly 325 330 335 Lys Pro Gly Leu Phe Glu Met Ser Arg Asp Gly Asn Thr Gly Val Ala 340 345 350 Leu Tyr Thr Arg Lys Val Leu Ile Gln Ser Lys Thr Glu His Leu Leu 355 360 365 Pro Lys Trp Leu Arg Phe Val Lys Gly Val Val Asp Ser Glu Asp Ile 370 375 380 Pro Leu Asn Leu Ser Arg Glu Leu Leu Gln Asn Ser Ser Leu Ile Arg 385 390 395 400 Lys Leu Ser Ser Val Ile Ser Thr Arg Val Ile Arg Phe Leu Gln Glu 405 410 415 Arg Ser Lys Lys Gln Pro Glu Glu Tyr Glu Ala Phe Tyr Arg Asp Tyr 420 425 430 Gly Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ile Val Thr Ser Ser Asp Ala Ser Glu 435 440 445 Lys Glu Glu Ile Ala Lys Leu Leu Arg Phe Glu Ser Ser Lys Ser Glu 450 455 460 Thr Ala Ser Gly Arg Met Ser Leu Glu Glu Tyr Tyr Asn Ala Val Pro 465 470 475 480 Ala Glu Gln Gln Asn Ile Tyr Tyr Leu Ala Ala Pro Asn Arg Val Leu 485 490 495 Ala Glu Ser Ser Pro Tyr Tyr Glu Ser Leu Lys Lys Arg Asn Glu Leu 500 505 510 Val Leu Phe Cys Tyr Glu Pro Tyr Asp Glu Leu Val Leu Met Gln Leu 515 520 525 Gly Lys Phe Lys Ser Lys Lys Leu Val Ser Val Glu Lys Glu Met Arg 530 535 540 Glu Glu Ser Lys Glu Thr Thr Ala Thr Thr Asp Phe Gly Glu Gly Ser 545 550 555 560 Leu Leu Arg Ser Glu Leu Asp Thr Leu Ile Pro Trp Leu Glu Glu Glu 565 570 575 Leu Arg Gly Gln Val Ile Lys Val Lys Ala Thr Thr Arg Leu Asp Thr 580 585 590 His Pro Cys Val Ile Thr Val Glu Glu Met Ala Ala Ala Arg His Phe 595 600 605 Ile Arg Thr Gln Ser His Gln Val Pro Glu Gln Asn Arg Phe Ala Leu 610 615 620 Leu Gln Pro Glu Leu Glu Ile Asn Pro Lys His Pro Ile Ile Lys Lys 625 630 635 640 Leu Asn Lys Leu Arg Glu Ser Asp Lys Asp Leu Ala Gln Leu Ile Ala 645 650 655 Lys Gln Leu Phe Ala Asn Ala Met Val Gly Ala Gly Leu Ala Glu Asp 660 665 670 Pro Arg Met Leu Leu Thr Asn Met Asn Thr Leu Leu Ser Arg Ala Leu 675 680 685 Glu Lys Tyr 690 <210> 4 <211> 2478 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Drosophila TRAP1 cDNA (NM_058091.3) <400> 4 ggcagtttgc ttcagttttg agctgaataa tgtgatgaaa ctgaactctc cattacatgt 60 agtaactctt attcaaacca actaagcatt tgagtccaaa attcattaca gcccagaaat 120 ttggaagaaa acaccgttat gagtagggtt ttaccagttt actattatcg aatacttaca 180 atcgattgat ttggctacac tgtgcacaca tgtgcgctgg aacaaacttc gtagttgggt 240 aacattaaag ttgggcaaaa cattaaaaca acaagatgtc tgtacgagcg atgggagtgc 300 tgggccaggc gtgccgcctc ggtcgctgtg cccaagtgtt gaggcagagt caccgatccg 360 ccccagcagc gttcaatatc accattggat cgcagcattc gccgggtgct ctctcgctcc 420 gtcgctactc cacggagacc aagcaggcat caggatcagt ggtggacaag catgagttcc 480 aggcagagac gcgccagcta cttgacattg tggctcgttc cttatactcc gaccacgagg 540 tctttgtgcg cgagcttatt tcgaatgcaa gcgatgcgct ggagaaattt cggtacacct 600 cgttgagcgc tggaggcgag aatctggctg gaaaggaccg gcctctggag attcgtatca 660 ccaccgacaa gccactgatg cagctaatca tccaggacac gggcatcggc atgaccaagg 720 aggagctggt cagcaacctg ggcaccattg cacgcagcgg ctcgaagaag ttcctggagc 780 agatgaaggg gacccagcag ggagccagct cggaggcatc ctcgaacatt attggtcagt 840 tcggcgtggg cttttactct tccttcattg tcgccaataa ggtggaggtg ttcacgaggg 900 cggctgtgcc taatgcaccc ggactgcgtt ggtccacgga tggcagtgga acctacgaga 960 tcgaagaggt gcctgacgtt gagttgggaa cgcgaatcgt gcttcattta aagaccgatt 1020 gccgtgaata tgcggacgag gagaggatca aggcggtaat caagaaatac agcaactttg 1080 tgggctcacc catcttgctt aacggaaagc aggccaatga gatcaagcct ctgtggcttc 1140 ttgagccaca aagcatcagc aaggagcagc accatgactt ctatcggttc attagcaata 1200 gcttcgatgt cccgcgcttc accttacact ataatgctga cgtacccttg agcatccatg 1260 cactgctcta cttccccgaa ggaaagcctg gtttattcga gatgtctcgg gacggaaaca 1320 ccggtgtggc tctttacacc cgcaaggtgc ttattcagtc caagactgag catctgctgc 1380 ccaagtggct gcgttttgta aagggtgttg tcgactctga ggacattcca ctcaacctga 1440 gtcgcgagct gctccagaac agcagcctga ttcgcaaact gtccagtgtg atttccaccc 1500 gcgttatccg tttcctgcaa gagcggtcca agaagcagcc agaagagtac gaggccttct 1560 accgggacta tgggcttttc ctgaaggaag gaattgtaac ctccagcgac gcctccgaga 1620 aagaagaaat agctaaactt ctgcgttttg aatcctccaa gtcggagacc gccagtgggc 1680 gcatgtcgct ggaggagtac tacaacgccg ttcccgcaga acagcagaat atttactact 1740 tggcagcacc caaccgcgtt cttgccgagt cctcgcccta ctacgagagt ctgaagaagc 1800 gcaacgagct ggtgctcttc tgctacgaac cctatgatga gctggtgctc atgcagctgg 1860 gcaagttcaa aagcaaaaaa ctcgtttccg tggagaagga gatgcgcgaa gagtccaagg 1920 agacaacagc gaccaccgac tttggcgagg gcagtctgct gcgctcagag ctcgacactt 1980 tgattccctg gctggaggag gagctcaggg ggcaggttat taaagtaaaa gccaccactc 2040 gtctagacac ccatccctgt gtaatcaccg tagaggaaat ggctgccgct cgccacttca 2100 ttcgcaccca gagtcaccag gtgccagaac agaatcgatt tgccctgctt caaccagaac 2160 tggagatcaa cccaaagcac cccatcatca agaagcttaa caagctccgt gagagcgaca 2220 aggatctggc ccaacttatc gccaagcagc tctttgcaaa cgcaatggtg ggcgccggtt 2280 tggctgagga tccccgcatg ctgctaacca acatgaacac tctgctatcg cgggccctgg 2340 agaaatacta gagtgcgccg tagaaggaac agtgtagata taccgactat gtaatattaa 2400 tttctataat taatttcata aaacgtgttg aaatagtttt aaatatgtat aattaaacgt 2460 tttaaatatt ttaattcc 2478 <210> 5 <211> 581 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human PINK1 amino acid sequence(NP_115785.1) <400> 5 Met Ala Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Gln Leu Gly Arg Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Arg Phe Thr Gly Lys Pro Gly Arg Ala Tyr Gly Leu Gly 20 25 30 Arg Pro Gly Pro Ala Ala Gly Cys Val Arg Gly Glu Arg Pro Gly Trp 35 40 45 Ala Ala Gly Pro Gly Ala Glu Pro Arg Arg Val Gly Leu Gly Leu Pro 50 55 60 Asn Arg Leu Arg Phe Phe Arg Gln Ser Val Ala Gly Leu Ala Ala Arg 65 70 75 80 Leu Gln Arg Gln Phe Val Val Arg Ala Trp Gly Cys Ala Gly Pro Cys 85 90 95 Gly Arg Ala Val Phe Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ile Glu 100 105 110 Glu Lys Gln Ala Glu Ser Arg Arg Ala Val Ser Ala Cys Gln Glu Ile 115 120 125 Gln Ala Ile Phe Thr Gln Lys Ser Lys Pro Gly Pro Asp Pro Leu Asp 130 135 140 Thr Arg Arg Leu Gln Gly Phe Arg Leu Glu Glu Tyr Leu Ile Gly Gln 145 150 155 160 Ser Ile Gly Lys Gly Cys Ser Ala Ala Val Tyr Glu Ala Thr Met Pro 165 170 175 Thr Leu Pro Gln Asn Leu Glu Val Thr Lys Ser Thr Gly Leu Leu Pro 180 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aaaatccaag agaggtccca agcaactagc 900 ccctcacccc aacatcatcc gggttctccg cgccttcacc tcttccgtgc cgctgctgcc 960 aggggccctg gtcgactacc ctgatgtgct gccctcacgc ctccaccctg aaggcctggg 1020 ccatggccgg acgctgttcc tcgttatgaa gaactatccc tgtaccctgc gccagtacct 1080 ttgtgtgaac acacccagcc cccgcctcgc cgccatgatg ctgctgcagc tgctggaagg 1140 cgtggaccat ctggttcaac agggcatcgc gcacagagac ctgaaatccg acaacatcct 1200 tgtggagctg gacccagacg gctgcccctg gctggtgatc gcagattttg gctgctgcct 1260 ggctgatgag agcatcggcc tgcagttgcc cttcagcagc tggtacgtgg atcggggcgg 1320 aaacggctgt ctgatggccc cagaggtgtc cacggcccgt cctggcccca gggcagtgat 1380 tgactacagc aaggctgatg cctgggcagt gggagccatc gcctatgaaa tcttcgggct 1440 tgtcaatccc ttctacggcc agggcaaggc ccaccttgaa agccgcagct accaagaggc 1500 tcagctacct gcactgcccg agtcagtgcc tccagacgtg agacagttgg tgagggcact 1560 gctccagcga gaggccagca agagaccatc tgcccgagta gccgcaaatg tgcttcatct 1620 aagcctctgg ggtgaacata ttctagccct gaagaatctg aagttagaca agatggttgg 1680 ctggctcctc caacaatcgg ccgccacttt gttggccaac aggctcacag agaagtgttg 1740 tgtggaaaca aaaatgaaga tgctctttct ggctaacctg gagtgtgaaa cgctctgcca 1800 ggcagccctc ctcctctgct catggagggc agccctgtga tgtccctgca tggagctggt 1860 gaattactaa aagaacatgg catcctctgt gtcgtgatgg tctgtgaatg gtgagggtgg 1920 gagtcaggag acaagacagc gcagagaggg ctggttagcc ggaaaaggcc tcgggcttgg 1980 caaatggaag aacttgagtg agagttcagt ctgcagtcct ctgctcacag acatctgaaa 2040 agtgaatggc caagctggtc tagtagatga ggctggactg aggaggggta ggcctgcatc 2100 cacagagagg atccaggcca aggcactggc tgtcagtggc agagtttggc tgtgaccttt 2160 gcccctaaca cgaggaactc gtttgaaggg ggcagcgtag catgtctgat ttgccacctg 2220 gatgaaggca gacatcaaca tgggtcagca cgttcagtta cgggagtggg aaattacatg 2280 aggcctgggc ctctgcgttc ccaagctgtg cgttctggac cagctactga attattaatc 2340 tcacttagcg aaagtgacgg atgagcagta agtaagtaag tgtggggatt taaacttgag 2400 ggtttccctc ctgactagcc tctcttacag gaattgtgaa atattaaatg caaatttaca 2460 actgcagatg acgtatgtgc cttgaactga atatttggct ttaagaatga ttcttatact 2520 ctgaaggtga gaatattttg tgggcaggta tcaacattgg ggaagagatt tcatgtctaa 2580 ctaactaact ttatacatga tttttaggaa gctattgcct aaatcagcgt caacatgcag 2640 taaaggttgt cttcaactga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2680 <210> 7 <211> 721 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Drosophila PINK1 amino acid sequence(NP_572340.2) <400> 7 Met Ser Val Arg Leu Leu Thr Val Arg Leu Ile Lys His Gly Arg Tyr 1 5 10 15 Ile Leu Arg Ser Tyr Cys Lys Arg Asp Ile His Ala Asn Ile Leu Asp 20 25 30 Gln Asn Gln Leu Lys Thr Arg Ser Lys Arg Gly Phe Pro Leu Pro Ser 35 40 45 Thr Ala Ala Asn Val Leu Arg Thr Thr Pro Gln Gln Ala Ala Lys Ser 50 55 60 Val Val Asn Val Val Pro Arg Thr Ile Asn Ser Pro Ser Gly Ser Pro 65 70 75 80 Phe Asn Gly Ser Gly Ser Ser Pro Thr Ser Ser Ser Gly Ile Phe Arg 85 90 95 Val Gly Gln His Ala Arg Lys Leu Phe Ile Asp Asn Ile Leu Ser Arg 100 105 110 Val Thr Thr Thr Tyr Ser Glu Asp Leu Arg Gln Arg Ala Thr Arg Lys 115 120 125 Leu Phe Phe Gly Asp Ser Ala Pro Phe Phe Ala Leu Ile Gly Val Ser 130 135 140 Leu Ala Ser Gly Ser Gly Val Leu Ser Lys Glu Asp 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cgcacatttt ccgtgacaaa tgaaaagatc cagctgacca 180 gcgattatct aacgaccaaa tcgaatcgaa acgaaacgtt gaagtaggcg cattacatta 240 aaaattggct gccagcccac acagatatcg aaaaaggcga tatatctttg gataatcatt 300 gcaaaaataa accctttcga ttcgacgatt tcgccttgta gttctgccac caccgccccc 360 acacttcgcc ccgcagctgc accacaacca ccaccaccca caaacagaaa atttatttgc 420 gacgcaaaaa caaaacaatc gaatcgaaac gaaccgaacc gaaacgaaac gacagcagct 480 gtttggttat aaatcggcgc tatcgatcgc acacatgagc aaaattggcg gagaagaaga 540 ggaagcagca gcaagagtta agcaccacaa atcttaaaga ataggcacta ggagccgagg 600 tctttgcggg ccgaaagatg tctgtgagac tgctgaccgt gcgactgatc aaacatggtc 660 gctacatttt gcgcagctat tgtaaacgtg atatacacgc caacattttg gaccagaatc 720 aattgaagac aagaagcaag cgaggctttc ccctaccctc caccgctgcc aatgtgctgc 780 ggacaacgcc ccagcaggcg gccaaatcgg tggtcaatgt agtgccccgc accatcaact 840 ccccgtcggg atcaccgttt aatggcagcg gcagtagccc caccagcagc agtggaatct 900 tccgagtggg ccagcatgcg cgcaaattgt tcatcgacaa catcctcagc cgggtgacca 960 ccacctactc ggaggatctg cgccagcgcg ctacccgcaa gctattcttt ggcgattcag 1020 cgcccttctt cgccctgatt ggcgttagtc tggcctccgg atcgggtgtg ctcagcaagg 1080 aggatgaact ggagggcgtg tgctgggaga ttcgggaggc agctagccgg ctgcagaacg 1140 cctggaatca cgacgagatc tccgatacgc tagacagcaa gttcaccatc gatgacttgg 1200 aaatcggtcc gcccatagcc aaaggttgtg ccgctgtcgt ctatgcagcg gatttcaaga 1260 aagatgttgc ctcggatggt gcatccctgc ataccgatgc gcagccgcag gcaacgccag 1320 cctttgcgcc gaatagctgg agtacccacg agatgatgtc gccgctgcag aacatgtcgc 1380 gctttgttca caactttggc ggctctgtgg acaacgtctt ccactacagc cagccatctg 1440 cggccagtga tttcgtgggc gcccagtcga gggaacagga ccagcggcac cacgagcaac 1500 agcagcatca gaatcaggaa caagagcagc atcagaacca ggagcccagc agcagtgcct 1560 tcaatgtgac ttctccagcg aattcaaaca tcaacagctc tgtggacagt tatccactgg 1620 cactcaaaat gatgttcaac tacgacatcc agagcaacgc tctgtccata ctgcgtgcca 1680 tgtacaagga gacggtaccg gcacgccagc gcggcatgaa tgaggccgcc gatgagtggg 1740 aacgtttgct gcagaatcaa actgttcacc tgccgcggca tccgaacatt gtctgtatgt 1800 ttggcttctt ttgcgacgag gtgcgcaact ttcccgatgg ccatctcctg tatccggtgg 1860 cgcagccgca acgcatcaat ccacagggct atggccgcaa tatgtcgctg tatctgctga 1920 tgaaacgcta cgatcacagt cttcgcggcc tgctcgatag ccaggatctg agcacgcgca 1980 atcgcatcct gctgctggct caaatgctcg aggctgtcaa ccatttgagc cgtcacggcg 2040 ttgcccatcg tgacctaaag tctgataatg tgctaatcga gctgcaggac gatgcggcgc 2100 cggtgctagt gctctccgac tttggctgtt gtctggcgga caaggtgcat ggcctgcgcc 2160 tgccgtacgt ttcgcacgac gtcgacaagg gcggcaatgc ggcgttgatg gcgccagaga 2220 tcttcaatac gatgcccggt ccgtttgccg tactcaatta tggcaaggcc gatctgtggg 2280 cttgcggtgc cctggcttac gaaatctttg gcaaccgcaa tccgttctat tcgagcagcg 2340 gtgggatggc gcgcgaacgc ggtgagatga cgctttcgct gaggaacagc gattaccgac 2400 aggaccaatt gccgccaatg agcgatgctt gcccgccgct gctgcaacag ctggtctaca 2460 acatcctcaa tcccaacccg tccaagcggg tcagtccgga tattgcggca aatgtggtgc 2520 agctgttcct ctgggcccca tccaattggc ttaaggcggg cggcatgccc aacagtccgg 2580 agatcctaca gtggctcctt tcgctgacca ctaagattat gtgcgagggt cgtccacaga 2640 tgggcgccgg attgatgcca gtggccagct gtggcaatag gcgcgcctat gtggagtacc 2700 tgctcatatg cagctttctg gcacgcgccc ggctgcgtcg cattcgcggc gccctcaact 2760 ggatccagaa tgtggtggcg taggagaaaa gccttctact tgttactctg agaaaatcaa 2820 atggaaaagc gtgtgatacc tatattttac atatgtattt ataaatgaaa tcaaaattaa 2880 cgcc 2884 <210> 9 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP1 recombinant protein amino acid sequence <400> 9 Met Ser Val Arg Ala Met Gly Val Leu Gly Gln Ala Cys Arg Leu Gly 1 5 10 15 Arg Cys Ala Gln Val Leu Arg Gln Ser His Arg Ser Ala Pro Ala Ala 20 25 30 Phe Asn Ile Thr Ile Gly Ser Gln His Ser Pro Gly Ala Leu Ser Leu 35 40 45 Arg Arg Tyr Ser Thr Glu Thr Lys Gln Ala Ser Gly Ser Val Val Asp 50 55 60 Lys His Glu Phe Gln Ala Glu Thr Arg Gln Leu Leu Asp Ile Val Ala 65 70 75 80 Arg Ser Leu Tyr Ser Asp His Glu Val Phe Val Arg Glu Leu Ile Ser 85 90 95 Asn Ala Ser Asp Ala Leu Glu Lys Phe Arg Tyr Thr Ser Leu Ser Ala 100 105 110 Gly Gly Glu Asn Leu Ala Gly Lys Asp Arg Pro Leu Glu Ile Arg Ile 115 120 125 Thr Thr Asp Lys Pro Leu 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Ala Thr Thr Asp Phe Gly Glu Gly Ser 545 550 555 560 Leu Leu Arg Ser Glu Leu Asp Thr Leu Ile Pro Trp Leu Glu Glu Glu 565 570 575 Leu Arg Gly Gln Val Ile Lys Val Lys Ala Thr Thr Arg Leu Asp Thr 580 585 590 His Pro Cys Val Ile Thr Val Glu Glu Met Ala Ala Ala Arg His Phe 595 600 605 Ile Arg Thr Gln Ser His Gln Val Pro Glu Gln Asn Arg Phe Ala Leu 610 615 620 Leu Gln Pro Glu Leu Glu Ile Asn Pro Lys His Pro Ile Ile Lys Lys 625 630 635 640 Leu Asn Lys Leu Arg Glu Ser Asp Lys Asp Leu Ala Gln Leu Ile Ala 645 650 655 Lys Gln Leu Phe Ala Asn Ala Met Val Gly Ala Gly Leu Ala Glu Asp 660 665 670 Pro Arg Met Leu Leu Thr Asn Met Asn Thr Leu Leu Ser Arg Ala Leu 675 680 685 Glu Lys Tyr Leu Gly His His His His His His 690 695 <210> 10 <211> 346 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for expressing TRAP1 specific RNAi <400> 10 ccgacttgga ggattcaaaa cgcagaagtt tagctatttc ttctttctcg gaggcgtcgc 60 tggaggttac aattccttcc ttcaggaaaa gcccatagtc ccggtagaag gcctcgtact 120 cttctggctg cttcttggac cgctcttgca ggaaacggat aacgcgggtg gaaatcacac 180 tggacagttt gcgaatcagg ctgctgttct ggagcagctc gcgactcagg ttgagtggaa 240 tgtcctcaga gtcgacaaca ccctttacaa aacgcagcca cttgggcagc agatgctcag 300 tcttggactg aataagcacc ttgcgggtgt aaagagccac accggt 346 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antennapedia(ANT0) <400> 11 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> survivin derived peptide inhibiting the activity of Hsp90 (or TRAP1) <400> 12 Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu 1 5 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shepherdin amino acid sequence <400> 13 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu 20 25 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP1-Forward primer <400> 14 gcagcgttca atatcaccat tg 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP1-Reverse primer <400> 15 gacctcgtgg tcggagtcta agg 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vha16-1-Forward primer <400> 16 gtcttctgaa gtgagcagcg ac 22 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vha16-1-Reverse primer <400> 17 catcactgac atggcagcaa tacc 24 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX I-Forward primer <400> 18 gtgcctttaa tattaggtgc tc 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX I-Reverse primer <400> 19 gtaatagctc ctgctagtac tg 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX III-Forward primer <400> 20 cgagatgtat cacgagaagg 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX III-Reverse primer <400> 21 gaattccgtg gaatcctgtt g 21 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CytB-Forward primer <400> 22 cgaactttac atgctaacgg tg 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CytB-Reverse primer <400> 23 ccgataggat tattagatcc tg 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rp49-Forward primer <400> 24 gcttcaagat gaccatccgc cc 22 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rp49-Reverse primer <400> 25 ggtgcgcttg ttcgatccgt aac 23

Claims

(a) TRAP1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1)을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계; 및
(b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도와 비교하여 상기 시험제제가 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 PINK1 유전자 결손에 의한 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, (b) 단계 이후에
(c) 상기 (b) 단계에서 TRAP1의 발현을 억제하는 것으로 확인된 시험제제를 미토콘드리아 기능장애로 인한 질환을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료효과를 나타내는지를 검사하는 단계를 추가적으로 포함하는 스크리닝 방법.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미토콘드리아 기능 장애는 미토콘드리아 효소 활성의 감소, 전자전달계(electron transport chain)활성 감소, 막전위 감소, 활성산소종(reactive oxygen species) 생산의 증가, 미토콘드리아 단편화(mitochondria fragmentaion), 칼슘 조절장애, 및 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 돌연변이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미토콘드리아 기능 장애로인한 질환은 퇴행성 뇌질환, NARP 증후군(Neurogenic muscular weakness-Ataxia-Retinitis pigmentosa syndrome), 다발성 경화증 증후군(Multiple Sclerosis-like Syndrome), 모성 유전 심근증( Maternally Inherited CardioMyopathy), 진행성 외안근 마비(Progressive External Ophthalmoplegia), MERRF 증후군(Myoclonic Epilepsy with Ragged-Red Fibers syndrome), MNGIE 증후군(Myoneurogastrointestinal disorder and encephalopathy), 피어슨 골수 증후군(Pearson Marrow syndrome), 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre syndrome), 레버씨 시신경 위축증(Leber hereditary optic neuropathy), 아미노글루코시드 연관 난청(Aminoglycoside-associated deafness), 난청을 동반하는 당뇨(Diabetes with deafness), Luft 병(Luft disease), 리증후군(Leigh syndrome), 알퍼스병(Alpers Disease), 중쇄 아실코에이 탈수효소 결핍증 (medium chain acyl-CoA dehydrogenase [MCAD] deficiency), 경쇄 아실 코에이 탈수효소 결핍증(Segmental colitis associated with diverticular [SCAD] disease), 단쇄 수산화 코에이 탈수효소 결핍증(Short chain 3- hydroxyacyl CoA dehydrogenase[SCHAD] deficiency), 초장쇄 아실코에이 탈수효소 결손증(Very long chain acyl-CoA dehydrogenase [VLCAD] deficiency ), 장쇄 수산화 아실코에이 탈수효소 결핍증(long chain 3-hydroxy acyl-CoA dehydrogenase [LCHAD] deficiency), 글루타르산뇨증 II형(Glutaric aciduria II) 및 치사성 유아 심근증(Lethal infantile cardiomyopathy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제5항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이며병(Alzheimer's disease), 헌팅턴병(Huntington's Disease) 및 치매(dementia)로 이루어지는 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 PINK1 유전자 결손에 의한미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물.
TRAP1에 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 PINK1 유전자 결손에 의한미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물.
TRAP1 억제물질(TRAP1 inhibitor)을 유효성분으로 포함하는 PINK1 유전자 결손에 의한 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 TRAP1 억제물질은 가미트리닙(gamitrinib) 또는 안테나페디아 세포 관통성 서열(ANT)과 컨쥬게이션된 젤다나마이신인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 TRAP1 억제물질은 서열번호 13으로 표시되는 쉬페르딘(Shepherdin)인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물.
(a) TRAP1 또는 상기 TRAP1을 발현하는 세포와 시험제제를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 TRAP1의 활성을 측정하여, 상기 시험제제가 TRAP1의 활성을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 PINK1 유전자 결손에 의한 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법.