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CN109789228B - 高度复用荧光成像 - Google Patents

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CN109789228B
CN109789228B CN201780052323.7A CN201780052323A CN109789228B CN 109789228 B CN109789228 B CN 109789228B CN 201780052323 A CN201780052323 A CN 201780052323A CN 109789228 B CN109789228 B CN 109789228B
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Abstract

本文提供了用于分析样品的方法和系统。在一些实施方案中，所述方法利用各自与不同寡核苷酸连接的多种捕获剂和相应多个经标记的核酸探针，其中所述经标记的核酸探针中的每一种仅与所述寡核苷酸中的一种特异性杂交。所述样品全体经捕获剂标记，并且使用所述经标记的核酸探针的相应亚组，使用迭代循环检测捕获剂的亚组。

Description

高度复用荧光成像
政府支持
本发明是按食品和药物管理局授予的合同HHSF223201210194C受政府支 持完成的。政府拥有本发明的某些权利。
交叉引用
本申请要求2016年7月27日提交的美国临时申请序列号62/367,530的权益， 所述申请通过引用并入本文。
发明背景
抗体首先在1942年用于组织切片分析，以显现来自输注了活细菌的小鼠 的器官活组织检查中的肺炎球菌抗原。从那时起，免疫组织化学已成为临床诊 断和基础研究的支柱。
然而，传统的免疫组织化学方法受到限制，因为它们只能够评估组织切 片中一个、两个或三个(很少有更多个)表位的空间分布。这种约束条件限制了 免疫组织化学在临床诊断中的应用，在该领域中非常期望分析更多数量的表位。 已经描述了用于样品中表位检测的更新方法，并且涉及例如用DNA标记捕获剂， 随后通过引物延伸检测该DNA，例如，如WO 2015/200139和US20150368697中 一样。
本发明的方法是自动化的并且允许高度复用分析。因而，认为该方法满 足常规免疫组织化学方法的一些不足之处。
发明内容
本文提供了一种用于分析样品的方法。在一些实施方案中，所述方法利 用各自与不同寡核苷酸连接的多种捕获剂和相应多个经标记的核酸探针，其中 所述经标记的核酸探针中的每一种仅与所述寡核苷酸中的一种特异性杂交。所 述样品全体经捕获剂标记，并且使用所述经标记的核酸探针的相应亚组，使用 杂交/标记去除或灭活迭代循环进行检测捕获剂的亚组。在一些实施方案中，捕 获剂未在杂交/去杂交循环之间从样品上剥离。根据如何执行该方法，该方法可 用于检测样品中超过40个表位，而无需从样品上剥离捕获剂。
附图说明
技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图并非旨在以任 何方式限制本教导的范围。
图1：每个抗体偶联到长度为38-40个核苷酸的寡核苷酸(a)，其与较短的 经染料标记的寡核苷酸(b)互补。
图2：染料-寡核苷酸与DNA偶联抗体的杂交/去除。用DNA偶联的CD3 抗体和Alexa647-偶联的CD19抗体为新鲜冷冻的人淋巴结组织染色。显示了相 同组织区域跨越十个杂交/甲酰胺去除循环的合并的和单独的FITC/A647通道。
图3：杂交迭代循环给出一致的染色图案。示出了来自图2的合并图像的 放大区域。通过FITC-寡核苷酸与DNA偶联的CD3抗体的杂交显示的CD3染 色在十个循环中是等同的。
图4：DNA-寡核苷酸杂交动力学。在与DNA偶联的CD3抗体互补的经 FITC标记的寡核苷酸杂交后测量荧光强度。在六个时间点测量杂交效率：30 秒(A)、1分钟(B)、2分钟(C)、5分钟(D)、10分钟(E)和20分钟(F)。
图5：通过甲酰胺动力学去除经染料标记的寡核苷酸。使用图4中使用的 组织测量去除与DNA偶联的CD3抗体杂交的染料-寡核苷酸的最短时间。测试了 四个时间点：30秒(A)、1分钟(B)、2.5分钟(C)和55分钟(D)。
图6：随长度/Tm变化的经染料标记的寡核苷酸杂交效率。将与DNA偶 联的CD3抗体互补的经染料标记的寡核苷酸设计成具有不同长度(8-30个核苷 酸)和相应的Tm(分别为14.6-65.9℃)。使每个探针与用CD19-Alexa647和DNA 偶联的CD3染色的不同人淋巴结组织切片杂交。通过所得FITC荧光强度测量 杂交效率。
图7：随长度/Tm变化的经染料标记的寡核苷酸甲酰胺去除效率。通过 FITC荧光(绿色)失去量测量去除杂交的经染料标记的寡核苷酸的最小甲酰胺溶 液量。
图8：交叉杂交矩阵。筛选经染料标记的寡核苷酸文库和与CD45抗体偶 联的寡核苷酸之间的交叉杂交。具有交叉杂交的寡核苷酸对具有非对角荧光强 度。
图9：每个寡核苷酸对的代表性细胞迹线。针对所有其他周期筛选具有正 荧光强度的细胞。每条迹线的颜色与染料修饰对应：绿色＝FITC，蓝色＝Cy3， 红色＝Cy5。
图10：第一代序列正交寡核苷酸对。
图11：自动化流体装置筛选。将成对的染料-寡核苷酸置于96孔板上的 奇数/偶数孔中。每个流体循环递送T11-Cy5和T18-Cy3或T24-Cy5和T26-Cy3。 绘制了五条代表性细胞迹线。
图12：使用退火/去除经染料标记的寡核苷酸的循环对人扁桃体进行多重 免疫荧光染色。
图13：使用退火/去除经染料标记的寡核苷酸的循环对人扁桃体进行多重 免疫荧光染色。
定义
除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本公开所 属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或 等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或试验中，但是描述的是优选方 法和材料。
本文提及的所有专利和出版物，包括在此类专利和出版物中公开的所有 序列，都明确地通过引用并入。
数字范围包括限定该范围的数字。除非另有说明，否则核酸以5'至3'方向 从左向右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左向右书写。
本文所提供的标题不是对本发明各个方面或实施方案的限制。因此，通 过参考整个说明书，可以更全面地定义下面定义的术语。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属 领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wiley和 Sons，New York(1994)，以及Hale&Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，N.Y.(1991)向技术人员提供本 文使用的许多术语的一般含义。尽管如此，为了清楚和便于参考，下面定义了 某些术语。
如本文所用，术语“目标生物学特征”是指可通过与捕获剂的结合来指示 的细胞的任何部分。目标示例性生物学特征包括细胞壁、细胞核、细胞质、膜、 角蛋白、肌纤维、胶原、骨、蛋白质、核酸(例如，mRNA或基因组DNA等)、 脂肪等。目标生物学特征也可以通过免疫组织学方法指出，例如，与寡核苷酸 连接的捕获剂。在这些实施方案中，捕获剂结合样品中的位点，例如蛋白质表 位。示例性表位包括但不限于癌胚抗原(用于鉴定腺癌)、细胞角蛋白(用于鉴定 癌但也可在一些肉瘤中表达)、CD15和CD30(对于霍奇金病)、甲胎蛋白(对于 卵黄囊肿瘤和肝细胞癌)、CD117(对于胃肠道间质瘤)、CD10(对于肾细胞癌和 急性淋巴细胞白血病)、前列腺特异性抗原(对于前列腺癌)、雌激素和孕酮(用于 肿瘤鉴定)、CD20(用于鉴定B-细胞淋巴瘤)、CD3(用于鉴定T细胞淋巴瘤)。
如本文所用，术语“复用”是指使用一种以上的标记同时或依次检测和测 量生物活性物质。
如本文所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并且为本 领域技术人员所熟知。那些术语是指由一种或多种特异性结合抗原的多肽组成 的蛋白质。一种形式的抗体构成抗体的基本结构单元。这种形式是四聚体，由 两对相同的抗体链组成，每对具有一条轻链和一条重链。每对中，轻链和重链 可变区一起负责结合抗原，恒定区负责抗体效应功能。
公认的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链及α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、 δ、ε和μ重链或其他物种中的等同物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或约 214个氨基酸)包含在NH2末端的约110个氨基酸的可变区和COOH末端的κ或 λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或约446个氨基酸)类似地包含可变 区(约116个氨基酸)和上述重链恒定区之一，例如γ(约330个氨基酸)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白；保持与 抗原特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段；嵌合抗 体、人源化抗体、微抗体、单链抗体和融合蛋白，融合蛋白包含抗体的抗原结 合部分和非抗体蛋白。该术语还包括Fab'、Fv、F(ab’)2和/或保持与抗原特异性 结合的其他抗体片段，以及单克隆抗体。抗体可以各种其他形式存在，包括， 例如FV、Fab和(Fab')2，以及双功能(即，双特异性)杂交抗体(例如， Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))和单链(例如，Huston等人， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-5883(1988)和Bird等人，Science,242, 423-426(1988))，其通过引用并入本文。(通常参见Hood等人，"Immunology", Benjamin,N.Y.，第2版(1984)，及Hunkapiller和Hood,Nature,323,15-16 (1986))。
术语“特异性结合”是指结合试剂优先结合存在于不同分析物的均匀混合 物中的特定分析物的能力。在某些实施方案中，特异性结合相互作用将区别样 品中期望和不期望的分析物，在一些实施方案中，大于约10至100倍或更多 (例如，大于约1000或10,000倍)。
在某些实施方案中，结合试剂与分析物在捕获剂/分析物复合物中特异性 结合时的亲和力的特征在于KD(解离常数)小于10-6M，小于10-7M，小于10-8M， 小于10-9M，小于10-9M，小于10-11M，或小于约10-12M或更小。
“多个”包含至少2个成员。在某些情况下，多个可具有至少2个、至少5 个、至少10个、至少100个、至少1000个、至少10,000个、至少100,000个、 至少106个、至少107个、至少108个或至少109个或更多个成员。
如本文所用，术语“标记”是指将捕获剂附着于样品中的特定位点(例如， 含有所用抗体的表位的位点)，使得位点的存在和/或丰度可以通过评估捕获剂 的存在和/或丰度来确定。术语“标记”是指一种产生经标记样品的方法，其中任 何必要步骤以任何方便的顺序来进行，只要产生所需的经标记样品。例如，在 一些实施方案中并且如下文将举例说明的那样，捕获剂可以在抗体与样品结合 之前与寡核苷酸连接，在这种情况下，可以使用相对较少的步骤标记样品。
如本文所用，术语“平面样品”是指基本上是平面的，即二维的材料(例如 玻璃、金属、陶瓷、有机聚合物表面或凝胶)，其含有细胞或源自细胞的生物分 子的任何组合，例如蛋白质、核酸、脂质、寡糖/多糖，生物分子复合物、细胞 器、细胞碎片或排泄物(外泌体、微泡)。平面细胞样品可以通过以下方式制备： 例如使细胞在平面上生长，使细胞在平面上沉积，例如通过离心，通过将包含 细胞的三维物体切成切片并将切片固定到平面上，即产生组织切片，将细胞组 分吸收到用亲和试剂(例如抗体、半抗原、核酸探针)功能化的表面上，将生物 分子引入聚合物凝胶中或通过电泳或通过其他方式将其转移到聚合物表面上。 细胞或生物分子可以使用任何数量的试剂固定，包括福尔马林、甲醇、多聚甲 醛、甲醇:乙酸、戊二醛、双功能交联剂如双(琥珀酰亚胺)辛二酸酯、双(琥珀酰 亚胺)聚乙二醇等。该定义旨在涵盖细胞样品(例如，组织切片等)、电泳凝胶和 其印迹、蛋白质印迹、点印迹、ELISA、抗体微阵列、核酸微阵列等。
如本文所用，术语“组织切片”是指已经从受试者获得、固定、切片并固 定在平面(例如显微镜载玻片)上的一片组织。
如本文所用，术语“福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织切片”是指一片 组织，例如活检，其已经从受试者获得，在甲醛(例如，3％-5％于磷酸盐缓冲盐 水中的甲醛)或Bouin溶液中固定，包埋在蜡中，切成薄切片，然后固定在显微 镜载玻片上。
如本文所用，术语“非平面样品”是指基本上不平的样品，例如整个或部 分器官支架(例如，淋巴结、脑、肝等)，其已经通过折射率匹配技术，例如透 明脂质交换的丙烯酰胺杂交的刚性成像相容性组织-水凝胶(CLARITY)制成透明 的。参见，例如，Roberts等人JVis Exp.2016；(112):54025。可以使用诸如苯 甲醇/苯甲酸苄酯(BABB)或苄醚的清洁剂来使样本透明。
如本文所用，术语“空间上可寻址的测量值”是指一组各自与表面上的特 定位置相关联的值。空间上可寻址的测量值可以映射到样品中的位置，并且可 以用于重建样品的图像，例如二维或三维图像。
“诊断标志物”是体内特定的生物化学物质，其具有特定的分子特征，使 其可用于检测疾病，测量疾病进展或治疗效果，或用于测量目标过程。
“病理指示性”细胞是当存在于组织中时指示组织所处(或从中获得组织)的 动物患有疾病或病症的细胞。举例而言，动物肺组织中一种或多种乳腺细胞的 存在表明动物患有转移性乳腺癌。
术语“互补位点”用于指抗体或适体的表位。具体地，如果捕获剂是抗体 或适体，则捕获剂的互补位点是样品中抗体所结合的表位。
如本文所用的术语“表位”定义为抗原分子上与抗体或适体结合的小化学 基团。抗原可具有一个或多个表位。在许多情况下，表位大小为大致五个氨基 酸或糖。本领域技术人员理解，通常分子的整个三维结构或特定线性序列可以 是抗原特异性的主要标准。
诊断或治疗的“受试者”是植物或动物，包括人。经受诊断或治疗的非人 动物包括例如牲畜和宠物。
如本文所用，术语“孵育”是指将样品和捕获剂保持在适合捕获剂与样品 中的分子(例如，表位或互补核酸)特异性结合的条件下(所述条件包括时间期间、 温度、适当的结合缓冲液和洗涤)。
如本文所用，术语“捕获剂”是指可以特异性结合样品中的互补位点的试 剂。示例性捕获剂包括抗体和适体。如果使用抗体或适体，则在许多情况下它 们可以与蛋白质表位结合。
如本文所用，术语“与寡核苷酸连接的捕获剂”是指与单链寡核苷酸非共 价(例如，通过链霉抗生物素蛋白/生物素相互作用)或共价(例如，通过点击反应 等)连接的捕获剂，例如抗体或适体，其连接方式是捕获剂仍能与其结合位点结 合。核酸和捕获剂可以通过许多不同的方法连接，包括使用马来酰亚胺或含卤 素基团，具半胱氨酸反应性的的那些。捕获剂和寡核苷酸可以连接在寡核苷酸 5'末端的近端或在寡核苷酸5'末端，寡核苷酸的3'末端的近端或寡核苷酸的3' 末端或其间的任何位置。
如本文所用，在去除与样品相关，即与样品杂交的标记和/或探针的上下 文中，术语“去除”是指用于物理分离标记和/或探针与样品的任何方法。可以通 过变性或通过裂解探针中的连键或将标记附接到探针的接头而将标记和/或探针 从样品中去除，例如其中使用的去除方法使附接至其他抗体的未杂交寡核苷酸 完整并且可以自由地与下一个循环中使用的经标记探针杂交。
如本文所用，术语“灭活”在灭活标记的上下文中是指化学修饰标记以使 其不再产生可检测的信号。光漂白是使标签灭活的一种方法，尽管已知其他方 法。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用以描述任何长度的聚合物， 例如，大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱 基、大于约1000个碱基、至多约10,000个或更多个由核苷酸(例如脱氧核糖核苷 酸、核糖核苷酸或其组合)组成的碱基，并且可以通过酶促或合成产生(例如， 如美国专利号5,948,902和其中引用的参考文献中所述的PNA)，其可以以与两种 天然存在的核酸类似的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如，可以参 与Watson-Crick碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、 腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。DNA和RNA分别具有脱 氧核糖和核糖糖骨架，而PNA的骨架由重复的通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)- 甘氨酸单元组成。在PNA中，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键与骨架连 接。通常称为不可及RNA的锁核酸(LNA)是修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的 核糖部分用连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。该桥将核糖“锁定”在3'-内(北)构象中， 这通常在A型双链体中发现。只要需要，LNA核苷酸可以与寡核苷酸中的DNA 或RNA残基混合。术语“非结构化核酸”或“UNA”是含有彼此结合从而降低稳定 性的非天然核苷酸的核酸。例如，非结构化核酸可含有G'残基和C'残基，其中 这些残基对应于G和C的非天然存在形式，即类似物，它们彼此碱基配对，稳定 性降低，但保留分别与天然存在的C和G残基碱基配对的能力。非结构化核酸描 述于US20050233340中，其通过引用并入本文以用于UNA的公开。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指至少10个，例如至少15个或至少30 个核苷酸的多聚体。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度可以在15-200个核苷 酸或更多的范围内。本文使用的任何寡核苷酸可以由G、A、T和C，或能够 与互补核苷酸可靠地碱基配对的碱基组成。7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-鸟嘌呤、腺 嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、2-去氮-2-硫代-鸟苷、2-硫代-7-去 氮-鸟苷、2-硫代-腺嘌呤、2-硫代-7-去氮-腺嘌呤、异鸟嘌呤、7-去氮-鸟嘌呤、 5,6-二氢尿苷、5,6-二氢胸腺嘧啶、黄嘌呤、7-去氮-黄嘌呤、次黄嘌呤，7-去氮 -黄嘌呤、2,6-二氨基-7-去氮嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿苷、5-丙炔基- 胞苷、2-硫代-胸腺嘧啶或2-硫代-尿苷是此类碱基的实例，尽管已知许多其他 实例。如上所述，寡核苷酸可以是例如LNA、PNA、UNA或吗啉代寡聚物。 本文使用的寡核苷酸可含有天然或非天然核苷酸或连键。
如本文所用，在读取荧光信号的上下文中，术语“读取”是指通过扫描或 通过显微镜术获得图像，其中图像显示荧光图案以及视野中的荧光强度。
如本文所用，术语“由...产生的信号”在读取通过添加荧光核苷酸产生的荧 光信号的上下文中是指直接由荧光核苷酸发射的信号，通过向另一种荧光核苷 酸的能量转移(即通过FRET)间接发射的信号。例如，在一些实施方案中，该方 法可以使用分子倒置探针实施，其一端具有供体荧光体，另一端具有受体荧光 体，用于荧光能量转移。当探针在溶液中游离时，两个荧光体相距很远。当它 们与抗体上的寡核苷酸杂交时，两个荧光体彼此紧邻。
整个说明书中可能出现术语的其他定义。
具体实施方式
提供了一种用于分析样品(例如平面样品)的方法。在一些实施方案中，该 方法可包括获得：i.各自与不同寡核苷酸连接的多种捕获剂和ii.相应多个经标 记的核酸探针(其中术语“相应”旨在意指经标记的核酸探针的数量与所用捕获剂 的数量相同)，其中所述经标记的核酸探针中的每一种仅与所述寡核苷酸中的一 种互补并特异性杂交。例如，如果存在50种捕获剂，则它们各自与不同的寡 核苷酸连接，并且存在50个经标记的核酸探针，其中所述经标记的核酸探针 中的每一个仅与所述寡核苷酸中的一种互补并且特异性杂交。该方法中使用的 捕获剂和经标记的核酸探针的数量可以变化。在一些实施方案中，该方法可以 使用以下进行：i.至少10种或至少20种和至多50种或100种或更多种各自与不同寡核苷酸连接的捕获剂，和ii.相应数量的经标记的核酸探针。
在一些实施方案中，该方法可包括用所述多种捕获剂标记样品。该步骤 包括将样品(例如，固定在平面上，例如显微镜载玻片上的FFPE切片)与所有捕 获剂全体在捕获剂与样品中的互补位点(例如，蛋白质表位)结合的条件下接触。 使抗体和适体与样品中的位点结合的方法是公知的。在一些实施方案中，捕获 剂可以与样品交联，从而防止捕获剂在后续步骤中解离。该交联步骤可以使用 任何胺-胺交联剂(例如甲醛，二琥珀酰基氨基丁酸酯或具有类似作用的另一种 试剂)进行，但是如果需要，可以使用多种其他化学品使捕获剂与样品交联。
样品与捕获剂结合之后，该方法可涉及使第一亚组的经标记核酸探针与 所述样品特异性杂交，其中第一亚组中的探针经可区别地标记，以产生经标记 的探针/寡核苷酸双链体。“亚组”意指至少两个，例如两个、三个或四个，术语 “可区别地标记”表示可以单独检测标签，即使它们位于相同位置。因而，在一 些实施方案中，该方法可以涉及使两个、三个或四个经标记的核酸探针与样品 特异性杂交，从而产生连接到与样品中的位点结合的抗体的经标记的探针/寡核 苷酸双链体。标记可以是前荧光团前体、二次活化荧光团、荧光蛋白、可见染 剂、多色条形码、质量标签(例如同位素或限定大小的聚合物)、用于无标记检测的结构标签、辐射敏感标签(由THz相机激活)、放射性标签或吸收标签(例如 仅吸收特定频率的光)。在一些实施方案中，寡核苷酸可以递送酶、酶递送荧光 团，或者可以存在信号的酶促扩增。在一些实施方案中，检测到的信号可以是 通过荧光共振能量转移(FRET)产生的，并且在其他实施方案中，检测可以通过 拉曼光谱、红外检测或磁/电检测完成。在一些实施方案中，检测步骤可以涉及 二次核酸扩增步骤，包括但不限于，杂交链反应、支链DNA(bDNA)扩展等。
可用于主题方法的合适的可区别荧光标记对包括Cy-3和Cy-5(Amersham Inc.,Piscataway,NJ)、Quasar 570和Quasar 670(Biosearch Technology,Novato CA)、Alexafluor555和Alexafluor647(Molecular Probes,Eugene,OR)、BODIPY V-1002和BODIPY V1005(Molecular Probes,Eugene,OR)、POPO-3和TOTO- 3(Molecular Probes,Eugene,OR)及POPRO3和TOPRO3(Molecular Probes, Eugene,OR)。在Kricka等人(Ann ClinBiochem.39:114-29,2002)、Ried等人 (Proc.Natl.Acad.Sci.1992:89:1388-1392)和Tanke等人(Eur.J.Hum.Genet. 1999 7:2-11)和其他参考文献中可以找到其他合适的可区别的可检测标记。在一 些实施方案中，可以使用三种或四种可区别的染料。目标特定荧光染料包括： 呫吨染料，例如荧光素和罗丹明染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(通常以缩写FAM和F表示)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧 基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明 (TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、 6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)和若丹明110；花青染料，例如Cy3、Cy5和Cy7 染料；香豆素，例如伞形酮；苯并酰亚胺染料，例如Hoechst 33258；菲啶染料， 例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料； 聚甲炔染料，例如BODIPY染料和喹啉染料。在主题应用中常用的特定目标荧 光团包括：芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、FAM、荧光素氯三嗪、荧光素、 R110、曙红、JOE、R6G、四甲基罗丹明、TAMRA、丽丝胺、萘并荧光素、德 克萨斯红、Cy3和Cy5等。如上所述，探针的每个亚组内，荧光团可以选择， 使其彼此可区别，即，可独立地检测，这意味着即使当标记是混合的，也可以 独立地检测和测量标记。换言之，即使当标记共同定位时(例如，在相同的管中 或在切片的相同区域中)，每个标记存在的标记量(例如，荧光量)也可单独测定。
在洗涤样品去除未杂交的经标记的核酸探针后，该方法包括读取样品以 获得显示在先前步骤中杂交的每个探针亚组的结合模式的图像。该步骤可以使 用任何方便的读取方法来进行，并且在一些实施方案中，例如，不同探针的杂 交可使用配备有用于每个荧光团的适当滤波器的荧光显微镜，或通过使用双或 三带通滤波器装置单独读取以观察多个荧光团(参见，例如，美国专利第 5,776,688号)。
在读取样品后，该方法可以包括灭活或去除与样品相关(即，与样品杂交) 的标记，使多种捕获剂及其相关的寡核苷酸(即，未杂交的寡核苷酸)仍然与样 品结合。与样品相关的标记可以通过多种方法去除或灭活，包括但不限于变性 (在这种情况下标记和探针整体可以释放并且可以洗掉)，通过裂解探针中的连 键(在这种情况下探针和部分探针可以释放并且可以洗掉)，通过裂解探针和探 针杂交的寡核苷酸(以释放可以洗掉的片段)，通过裂解探针和标记之间的连键 (在这种情况下标签将被释放并且可以洗掉并且可以洗掉)，或者通过使标记本 身灭活(例如，通过破坏标记中的键，从而防止标记产生信号)。在所有这些去 除方法中，附着于其他抗体的未杂交的寡核苷酸是完整的并且可以自由地与下 一循环中使用的经标记的探针组杂交。在一些实施方案中，荧光可以通过基于 过氧化物漂白或裂解通过可裂解接头连接至核苷酸的荧光团(例如，使用TCEP 作为裂解试剂)灭活。
在一些实施方案中，通过变性从样品中去除杂交探针完成去除步骤，使 其他捕获剂(即未与探针杂交的捕获剂)及其相关的寡核苷酸仍然与样品结合。 在其他实施方案中，未通过变性从样品中去除杂交探针完成去除步骤，使其他 捕获剂(即未与探针杂交的捕获剂)及其相关的寡核苷酸仍然与样品结合。在这 些实施方案中，可以通过裂解与样品相关的探针中的至少一个键，或将探针连 接至标记的接头，从而使标记从探针上释放来去除标记。该裂解可以经酶促、 化学或通过曝光而进行。可替代地，可以通过光漂白或通过化学改变标记)来使 标记灭活。
如果去除步骤不是通过变性从样品中去除杂交探针来进行的，则可以使 用各种基于化学药品的、酶催化的或光致裂解的方法。例如，在一些实施方案 中，探针可含有化学或光可裂解的连键，使其可通过暴露于化学物质或光而片 段化。在一些实施方案中，例如双链体(因为它们是双链的)可以被限制酶或双 链DNA特异性内切核酸酶(片段酶)裂解。在一些实施方案中，探针可含有尿嘧 啶(其可被USER裂解)，或者可含有包含错配的发夹，其可使用错配特异性内 切核酸酶裂解。在这些实施方案的一些中，在裂解后，含有标记的探针片段的 Tm可能不够高以保持与寡核苷酸碱基配对，因此，该片段将与寡核苷酸解离。 在一些实施方案中，探针和标记可通过光可裂解或化学可裂解的接头连接。该 接头的裂解将使标记从样品释放。在其他实施方案中，探针可以是RNA，并且 可以使用RNA酶降解探针。在一些实施方案中，可以使用酶促可裂解连键。 例如，酯可以被酯酶裂解，聚糖可以被糖酶清除。可替代地，可以通过修饰标 记来使标记本身灭活。在一个实例中，可以光漂白染料，但还已知其他方法。
在一些实施方案中，在读取样品后，该方法可以包括(e)通过变性从样品 中去除步骤(c)中杂交的探针(即，通过使寡核苷酸中的经标记探针退火并将其 洗掉)，使(b)的捕获剂及其相关的寡核苷酸仍然与样品结合。该步骤可以使用 任何合适的化学变性剂，例如甲酰胺、DMSO、尿素或离液剂(例如，氯化胍 等)，使用立足释放策略(参见，例如Kennedy-Darling, Chembiochem.2014 15:2353–2356)，或使用加热、碱、拓扑异构酶或单链结合 剂(例如SSBP)来完成。该步骤也可以通过具有更高亲和力的寡核苷酸(例如 PNA)的杂交来实现。在一些情况下，可以通过将样品在70％至90％甲酰胺(例 如，75％至85％甲酰胺)中孵育至少1分钟(例如1至5分钟)的时间，随后洗涤 去除探针。如果需要，可以重复该变性步骤，以便去除所有杂交探针。显而易 见的是，该步骤不是酶促执行的，即不使用核酸酶如DNA酶或限制酶，并且 不会导致例如任何探针或寡核苷酸中任何共价键的裂解，或任何捕获剂从样品 的去除。在该步骤中，探针/寡核苷酸双链体的链彼此分开(即变性)，并且分离的探针(其现在在溶液中是游离的)被洗掉，使捕获剂及其相关的寡核苷酸完整 并且就位。
如果使用可裂解连键(例如，在探针中或将探针连接到标记上，则可裂解 接头应该能够使用刺激(例如，光或其环境变化)选择性地裂解，而不会破坏附 着于抗体的寡核苷酸中的键。在一些实施方案中，可裂解连键可以是二硫键， 其可以使用还原剂(例如，β-巯基乙醇等)容易地破坏。可以使用的合适的可裂 解键键包括但不限于以下：碱基可裂解位点，例如酯，特别是琥珀酸酯(可用例 如氨或三甲胺裂解)、季铵盐(可用例如二异丙胺裂解)和氨基甲酸酯(可用氢氧化 钠水溶液裂解)；酸可裂解位点，例如苄醇衍生物(可用三氟乙酸裂解)、替考拉 宁糖苷配基(可用三氟乙酸裂解，然后用碱洗涤)、缩醛和硫缩醛(也可用三氟乙 酸裂解)、硫醚(可用例如HF或甲酚裂解)和磺酰(可用三氟甲磺酸、三氟乙酸， 茴香硫醚等裂解)；亲核试剂可裂解的位点，例如邻苯二甲酰胺(可用经取代的 肼裂解)、酯(可用例如三氯化铝裂解)；和Weinreb酰胺(可用氢化铝锂裂解)； 和其他类型的化学可裂解位点，包括硫代磷酸酯(可用银或汞离子裂解)和二异 丙基二烷氧基甲硅烷基(可用氟离子裂解)。其他可裂解键对于本领域技术人员 来说是显而易见的，或者在相关文献和教科书中有描述(例如，Brown(1997) Contemporary Organic Synthesis 4(3)；216-237)。在一些实施方案中，可裂解键 可以被酶裂解，
在特定实施方案中，可以使用光可裂解(“PC”)接头(例如，紫外可裂解接 头)。使用的合适的光可裂解接头可以包括基于邻硝基苄基的接头、苯甲酰基接 头、烷氧基苯偶姻接头、铬芳烃络合物接头、NpSSMpact接头和新戊二醇接头， 如Guillier等人(ChemRev.2000年6月14日；100(6):2091-158)中所述。可以在 主题方法中使用的示例性连接基团可以在Guillier等人，同上和Olejnik等人 (Methods in Enzymology 1998 291:135-154)中进行描述，并在U.S.P.N.6,027,890； Olejnik等人(Proc.Natl.Acad Sci,92:7590-94)；Ogata等人(Anal.Chem.2002 74:4702-4708)；Bai等人(Nucl.Acids Res.2004 32:535-541)；Zhao等人(Anal. Chem.2002 74:4259-4268)；及Sanford等人(Chem Mater.199810:1510-20)中进 一步描述，并且可购自Ambergen(Boston,MA；NHS-PC-LC-Biotin)、LinkTechnologies(Bellshill,Scotland)、Fisher Scientific(Pittsburgh,PA)和Calbiochem- Novabiochem Corp.(La Jolla,CA)。
在去除探针后，样品可以与经标记探针的不同亚组杂交(例如，两个到四 个经标记探针的第二亚组，其中探针可区别地标记，并且可以重新读取样品以 产生显示每个最近杂交的探针亚组的结合模式的图像。在读取样品后，可以从 样品中去除探针，例如通过变性或另一方法(如上所述)，并且可以用不同的可 区别标记的探针亚组重复杂交和读取步骤。换言之，该方法可以包括用两到四 个经标记的核酸探针的不同亚组多次重复杂交、标记去除或灭活和读取步骤， 其中每个亚组中的探针可区别地标记并且每次重复之后，例如通过变性或另一 方法(除最后一次重复之外)去除探针以产生样品的多个图像，其中每个图像对 应于经标记的核酸探针的一个亚组。可以重复杂交/读取/标记去除或灭活步骤，直到分析了所有探针。
显而易见的是，可以选择使用的DNA序列以使来自非特异性吸附或通过 结合内源基因组序列(RNA或DNA)的背景染色最小化。同样，杂交和洗涤缓冲 液可以设计成使非特异性吸附或通过与内源基因组序列(RNA或DNA)结合或通 过与其他报告序列结合的背景染色最小化。
在一些实施方案中，在用捕获剂标记样品后，该方法可以包括：使经标 记的核酸探针的第一亚组与样品特异性杂交，其中第一亚组中的探针经可区别 地标记，以产生经标记的探针/寡核苷酸双链体；读取样品以获得显示在先前步 骤中杂交的每种探针的结合模式的图像；通过变性或另一方法从样品中去除在 先前步骤中杂交的探针，使多种捕获剂及其相关的寡核苷酸仍与样品结合；使 经标记的核酸探针的第二亚组与样品特异性杂交，其中第二亚组中的探针经可 区别地标记，以产生经标记的探针/寡核苷酸双链体；读取样品以获得显示探针 第二亚组中每个探针的结合模式的图像；通过变性或另一方法去除第二亚组探 针中与样品杂交的探针，使多种捕获剂及其相关的寡核苷酸仍然与样品结合。 然后可以针对第三、第四和第五或更多个探针亚组重复杂交/读取/标记去除或 灭活循环，直到所有探针已经杂交并读取，除了在最后一个循环中探针不需要 从样品中去除外。在一些情况下，杂交/读取步骤可以重复2至20次或更多次， 除了最后一次重复之外，在每次读取后进行变性步骤。
在一些实施方案中，经标记的核酸探针长度为8至20个核苷酸，例如长 度为10至18个核苷酸或11至17个核苷酸，但是在一些实施方案中，探针长 度可以短至5个核苷酸到长度长达150个核苷酸(例如，长度为6个核苷酸至长 度为100个核苷酸)。在一些实施方案中，探针可具有在15℃至70℃(例如， 20℃-60℃或35℃-50℃)范围内的计算Tm，使得杂交步骤的双链体具有同一范 围内的Tm。在这些实施方案中，可以使用IDT寡聚物分析程序(在IDT的网站 可用并在Owczarzy等人Nucleic Acids Res.2008 36:W163-9中进行了描述)，使 用50mM Na+、250nM寡核苷酸的默认设置计算Tm。探针的序列可以是任何 序列，但在一些实施方案中，每个经标记的核酸探针可以具有选自SEQ ID NO： 1-47的序列，或其互补序列。在一些实施方案中，探针是Tm匹配的，其中术 语“Tm匹配的”是指解链温度在限定范围内，例如，低于限定温度的15℃，低于 10℃或低于5℃的序列。显而易见的是，探针可以在5'末端、3'末端或其间的任 何位置标记。在一些实施方案中，探针可以是特异性可裂解的，例如，可以含 有可裂解的接头(例如，光可裂解或化学可裂解的接头)。同样，寡核苷酸的长度可以是至少5个核苷酸，例如，长度为至少10个，至少15个或至少20个， 例如30-40个核苷酸。
在一些实施方案中，与捕获剂连接的寡核苷酸的序列长度相同并且与经 标记的探针完美互补。在这些实施方案中，寡核苷酸可以通过使寡核苷酸与捕 获剂间隔开的接头与捕获剂连接。在其他实施方案中，与捕获剂连接的寡核苷 酸的序列：i.比经标记的核酸探针的序列长，并且ii.除了与单个标记的核酸探 针互补的子序列外，在其他方面彼此相同。在这些实施方案中，额外序列充当 接头以将寡核苷酸与捕获剂间隔开。在某些实施方案中，与捕获剂连接的寡核 苷酸长度为38至40个核苷酸。可以使用任何方便的方法将寡核苷酸与捕获剂 连接(参见，例如，Gong等人，Bioconjugate Chem.2016 27:217–225和Kazane 等人，Proc Natl Acad Sci 2012 109:3731-3736)。有多种标记方法可用。例如，可以使用捕获剂上的任何合适的化学部分(例如，半胱氨酸残基或通过工程化位 点)将独有寡核苷酸直接连接至捕获剂上。在其他实施方案中，可以使用任何合 适的化学方法将共有寡核苷酸直接偶联至所有捕获剂，并且可以例如通过连接 将独有寡核苷酸酶促连接至共有寡核苷酸。在其他实施方案中，独有寡核苷酸 可以通过非共价相互作用直接或间接地与捕获剂连接，例如通过生物素/链霉抗 生物素蛋白或其等效物，通过适体或二抗，或通过蛋白质-蛋白质相互作用，例 如亮氨酸-拉链标签相互作用等。在替代实施方案中，本方法的寡核苷酸和探针 可以取代可以以特定方式彼此结合的其他实体，例如亮氨酸拉链对或抗原/抗体 对。
每个读取步骤都会生成样品图像，显示探针亚组的结合模式。在一些实 施方案中，所述方法还可包括分析、比较或重叠至少两个图像。在一些实施方 案中，该方法还可包括重叠所有图像，以产生显示所有捕获剂与样品的结合图 案的图像。使用的图像分析模块可以转换来自每个荧光团的信号以产生多个假 彩色图像。图像分析模块可以重叠多个假彩色图像(例如，在每个像素处叠加假 彩色)以获得复用假彩色图像。可以将多个图像(例如，未加权的或加权的)转换 成单一假彩色，例如，以便表示以特定捕获剂的结合为特征的目标生物特征。 可以基于来自用户的手动输入将假彩色分配给特定捕获剂或捕获剂的组合。在 某些方面，图像可以包括仅与和目标特征相关联的标记(例如在核隔室中)的强 度有关的假彩色。图像分析模块还可配置为调整(例如，归一化)强度和/或信号 强度的对比或假彩色，以进行卷积运算(例如，强度或假彩色的模糊或锐化)， 或进行任何其他合适的操作来增强图像。图像分析模块可以进行任何上述操作 以对准从连续图像获得的像素和/或模糊或平滑化从连续图像获得的像素上的强 度或假彩色。
在一些实施方案中，可以在z方向上的不同焦平面处拍摄样品的图像。 这些光学切面可以用于重构样品的三维图像。尽管已知其他方法，但可以使用 共聚焦显微镜术拍摄光学切面。图像分析方法可以在计算机上实现。在某些实 施方案中，通用计算机可以配置为用于本文公开的方法和程序的功能布置。此 类计算机的硬件架构是本领域技术人员熟知的，并且可包括硬件组件，其包括 一个或多个处理器(CPU)、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、内部 或外部数据存储介质(例如，硬盘驱动)。计算机系统也可包括一个或多个图形 板，用于处理和输出图形信息至显示装置。上述组件可通过计算机内的总线适 当地相互连接。计算机还包括适当的接口，用于与通用外部组件，比如显示器、 键盘、鼠标、网络等通信。在一些实施方案中，计算机可能够平行处理或可为 配置为平行或分布式计算的网络的一部分，以提高对于本方法和程序的处理能 力。在一些实施方式中，从存储介质读取的程序代码可写入插入计算机中的扩 充板中，或与计算机连接的扩充单元中提供的存储器，并且扩充板或扩充单元 中提供的CPU等可根据程序代码的指令实际实施部分或所有操作，以便完成下 面描述的功能。在其他实施方案中，可以使用云计算系统来执行该方法。在这 些实施方案中，数据文件和编程可以导出到运行该程序的云计算机中，并将输 出返回给用户。
除了上述标记方法之外，可以在进行上述方法之前或之后使用细胞学染 色对样品进行染色。在这些实施方案中，染剂可以是，例如，鬼笔环肽 (phalloidin)、钆双胺(gadodiamide)、吖啶橙、俾斯麦棕(bismarck brown)、钡、 考马斯蓝(Coomassie blue)、甲酚紫、结晶紫、DAPI、苏木精、曙红、溴化乙锭、 酸性品红、苏木精、赫斯特染剂(hoechststains)、碘、孔雀石绿、甲基绿、亚甲 蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇(正式名称：四氧化锇)、罗丹明、番 红、磷钨酸、四氧化锇、四氧化钌、钼酸铵、碘化镉、碳酰肼、氯化铁、六胺、 三氯化铟、硝酸镧、醋酸铅、柠檬酸铅、硝酸铅(II)、高碘酸、磷钼酸、铁氰化 钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白银、氯金酸钠、硝酸铊、氨基硫脲、乙 酸双氧铀、硝酸双氧铀、硫酸氧钒或其任何衍生物。染剂可能对任何目标特征 具有特异性，例如蛋白质或一类蛋白质、磷脂、DNA(例如，dsDNA、ssDNA)、 RNA、细胞器(例如，细胞膜、线粒体、内质网、高尔基体、核包膜等)，或细 胞的隔室(例如，细胞溶质、核成分等)。染剂可以增强细胞内或细胞外结构的 对比度或成像。在一些实施方案中，样品可以用苏木精和曙红(H&E)染色。
试剂盒
本公开内容还提供了含有用于实施如上所述的主题方法的试剂的试剂盒。 在一些实施方案中，试剂盒可包含至少10种寡核苷酸的第一群体(例如，至少 15种、至少20种、至少30种、至少40种或全部47种)，其中所述至少10种 寡核苷酸的序列由选自SEQ ID NO：1-47的序列或其互补序列组成。在许多实 施方案中，这些寡核苷酸处于水溶液中并且不与固体支持物连接。在一些实施 方案中，寡核苷酸经标记(例如，与荧光团连接)，但在其他实施方案中，它们 未标记。这些寡核苷酸可以处于单独的容器中或在同一容器中混合。在一些实 施方案中，寡核苷酸是呈包含多达3种所述寡核苷酸的混合物，其中寡核苷酸 可区别地标记。在一些实施方案中，试剂盒可含有寡核苷酸第二群体，其中第 二群体中的寡核苷酸各自包含与所述第一群体中寡核苷酸的全长互补的序列。 在这些实施方案中，第二群体中的寡核苷酸可各自与捕获剂连接。在一些实施 方案中，第二群体中的寡核苷酸可以比第一群体中的寡核苷酸长。试剂盒的各 种组分可以存在于单独的容器中，或者某些相容性组分可以根据需要预先组合 到单个容器中。在一些实施方案中，所用探针可含有可裂解连键(例如，化学或 光可裂解的连键)。
除了上述组分之外，本试剂盒还可包括使用试剂盒的组分来实施本方法 的说明书，即样品分析说明书。用于实施本方法的说明书通常记录在合适的记 录介质上。例如，说明书可以印刷在基材上，例如纸或塑料等。因此，说明书 可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器或其组件的标签中(即 与包装或分包装相关联)等。在其它实施方案中，说明书作为存在于合适的计算 机可读存储介质上的电子存储数据文件存在，例如CD-ROM、软盘等。在又其 它实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，而是提供用于例如通过互联网 从远程源获得说明书的手段。该实施方案的实例是包括网址的试剂盒，其中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，这种用于获得说明书 的手段记录在合适的基材上。
系统
本发明的方面包括配置用于分析样品的系统和装置。在一些实施方案中， 本系统包括样品槽、自动采样器、控制器、处理器和计算机可读介质，所述计 算机可读介质包括在由所述处理器执行时使所述控制器分析样品的指令。现在 更详细地进一步描述这些组件中的每一个。
在一些实施方案中，该系统包括样品槽，并且每个分析循环涉及将三种 类型的溶液输送到样品槽：1)寡核苷酸混合物，2)洗涤溶液和3)甲酰胺溶液。 在一些实施方案中，为了易于使用和再现性目的，流控技术是完全自动化的。 在某些实施方案中，自动取样器编程与控制每种溶液的一系列泵一致。
如上概述，本发明的方面包括配置为或适于控制或操作本系统的一个或 多个组件的控制器、处理器和计算机可读介质。在一些实施方案中，系统包括 控制器，该控制器与如本文所述系统的一个或多个组件通信，并且被配置为控 制系统的各方面和/或执行本系统的一个或多个操作或功能。在一些实施方案中， 系统包括处理器和计算机可读介质，其可包括记忆介质和/或存储介质。在计算 机可读存储器上体现为计算机可读指令的应用程序和/或操作系统可以由处理器 执行以提供本文所述的一些或全部功能。在某些实施方案中，完成单个分析周 期的整组命令是完全自动化的并且通过python程序控制。
在一些实施方案中，系统包括用户界面，例如图形用户界面(GUI)，其适 于或配置成从用户接收输入，并执行如本文所述的一种或多种方法。在一些实 施方案中，GUI被配置为向用户显示数据或信息。
实用性
本文所述的方法和组合物可广泛用于分析任何样品(例如，分析组织切片、 细胞片、离心细胞、电泳凝胶印迹、蛋白质印迹、点印迹、ELISA、抗体微阵 列、核酸微阵列、整个组织或其部分等)的各种应用中。该方法可用于分析任何 组织，包括例如通过脂质消除澄清的组织。可以使用扩展显微镜方法制备样品(参见，例如，Chozinski等人Nature Methods2016 13:485–488)，其涉及产生通 过有机聚合物和细胞组分的选择性共聚而产生的生物系统的聚合物复制品。该 方法可用于分析例如细胞、外泌体、细胞外结构、沉积在固体支持物或凝胶中 的生物分子(Elisa、蛋白质印迹、点印迹)、整个生物体、个别器官、组织、细胞、细胞外组分、细胞器、细胞组分、染色质和表观遗传标志物、生物分子和 生物分子复合物的扩散。捕获剂可以结合任何类型的分子，包括蛋白质、脂质、 多糖、蛋白多糖、代谢物或人造小分子等。该方法可以在高通量筛选和药物发 现等中具有许多生物医学应用。此外，该方法具有多种临床应用，包括但不限 于诊断、预后、疾病分层、个性化医疗、临床试验和药物伴随试验。
在特定实施方案中，样品可以是从患者获得的组织活检的一部分。目标 活检包括皮肤肿瘤和非肿瘤活检(黑色素瘤、癌等)、软组织、骨、乳腺、结肠、 肝、肾、肾上腺、胃肠、胰腺、胆囊、唾液腺、宫颈、卵巢、子宫、睾丸、前 列腺、肺、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、垂体(腺瘤等)、脑、脊髓、眼、神经和 骨骼肌等。
在某些实施方案中，捕获剂特异性结合生物标志物，包括癌症生物标志 物，其可以是蛋白质的。示例性癌症生物标志物包括但不限于癌胚抗原(用于鉴 定腺癌)、细胞角蛋白(用于鉴定癌但也可在一些肉瘤中表达)、CD15和 CD30(对于霍奇金病)、甲胎蛋白(对于卵黄囊肿瘤和肝细胞癌)、CD117(对于胃 肠道间质瘤)、CD10(对于肾细胞癌和急性淋巴细胞白血病)、前列腺特异性抗原 (对于前列腺癌)、雌激素和孕酮(用于肿瘤鉴定)、CD20(用于鉴定B-细胞淋巴瘤) 和CD3(用于鉴定T细胞淋巴瘤)。
上述方法可用于分析来自受试者的细胞以确定例如细胞是否正常或确定 细胞是否对治疗有反应。在一个实施方案中，该方法可用于确定癌细胞中的发 育异常程度。在这些实施方案中，细胞可以是来自多细胞生物的样品。生物样 品可以分离自个体，例如分离自软组织。在特定情况下，该方法可用于区别 FFPE样品中不同类型的癌细胞。
上述方法特别适用于使用多种抗体检查样品，每种抗体识别不同的标志 物。癌症和可用于鉴定那些癌症的生物标志物的实例如下所示。在这些实施方 案中，为了进行诊断不需要检查下面列出的所有标志物。
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Figure BDA0001978114350000191
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在一些实施方案中，该方法可涉及获得如上所述的图像(其电子形式可能 已经从远程位置转发)，并且该图像可由医生或其他医疗专业人员分析以确定患 者是否具有异常细胞(例如，癌细胞)或存在哪种类型的异常细胞。该图像可以 用作诊断以确定受试者是否患有疾病或病状，例如癌症。在某些实施方案中， 该方法可用于例如确定癌症的阶段，鉴定转移的细胞，或监测患者对治疗的反 应。
本文所述的组合物和方法可用于诊断患有疾病的患者。在一些情况下， 患者样品中存在或不存在生物标志物可以指示患者患有特定疾病(例如，癌症)。 在一些情况下，通过将来自患者的样品与来自健康对照的样品进行比较，可以 诊断患者患有疾病。在该实例中，可以测量相对于对照的生物标志物水平。患 者样品中生物标志物水平相对于对照的差异可以指示疾病。在一些情况下，分 析一种或多种生物标志物以便诊断患有疾病的患者。本公开的组合物和方法特 别适用于鉴定样品中多种生物标志物存在或不存在，或测定其表达水平。
在一些情况下，本文的组合物和方法可用于确定患者的治疗计划。生物 标志物存在或不存在可以指示患者对特定疗法有反应或是难以治疗。例如，一 种或多种生物标志物存在或不存在可以指示疾病是特定疗法难治的，并且可以 施用替代疗法。在一些情况下，患者当前正在接受治疗，并且一种或多种生物 标志物存在或不存在可以指示该治疗不再有效。
在任何实施方案中，数据都可以转发到“远程位置”，其中“远程位置”意指 除了检查图像的位置之外的位置。例如，远程位置可以是同一城市的另一个位 置(例如，办公室、实验室等)，不同城市的另一个位置，不同州的另一个位置， 不同国家的另一个位置等。因而，当指示一个物品与另一个物品“远程”时，意 指两个物品可以在同一个房间但是分开的，或者至少在不同的房间或不同的建 筑物中，并且可以相距至少一英里、十英里，或至少一百英里。“通信”信息是 指通过合适的通信信道(例如，私有或公共网络)将表示该信息的数据作为电信 号传输。“转发”项目是指将该物品从一个位置送到下一个位置的任何方式，无 论是通过物理运输该物品还是以其他方式(在可能的情况下)，并且包括至少在 数据的情况下，物理运输携带数据的介质或进行数据通信。通信介质的示例包 括无线电或红外传输信道以及与另一计算机或联网设备的网络连接，和因特网 或包括电子邮件传输和记录在网站上的信息等。在某些实施方案中，可以由 MD或其他合格的医疗专业人员分析图像，并且可以将基于图像分析结果的报 告转发给从其获得样品的患者。
在一些情况下，该方法可以用于各种诊断、药物发现和研究应用中，包 括但不限于诊断或监测疾病或病状(其中图像标识疾病或病状的标志物)，发现 药物靶标(其中图像中的标志物可以是药物治疗的靶标)，药物筛选(其中通过图 像中示出的标志物监测药物作用)，确定药物敏感性(其中药物敏感性与标志物 相关和基础研究(在需要测量样品中细胞之间的差异时)。
在某些实施方案中，可以使用上述方法比较两个不同的样品。不同的样 品可以由“实验”样品，即目标样品和可以与实验样品进行比较的“对照”样品组 成。在许多实施方案中，不同的样品是成对细胞类型或其成分，一种细胞类型 是目标细胞类型，例如异常细胞，另一种是对照，例如正常细胞。如果比较细 胞的两种成分，则成分通常是来自两种细胞中的每一种的相同成分。然而，在 某些实施方案中，可以比较相同细胞的两种成分。示例性细胞类型对包括，例 如，从组织活检分离的细胞(例如，来自具有诸如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、 肺癌、皮肤癌的疾病或病原体感染等的组织)和来自相同组织，通常来自相同患 者的正常细胞；在组织培养中生长的永生化细胞(例如，具有增生性突变或永生 化转基因的细胞)，病原体感染或经过处理(例如，经环境或化学试剂如肽、激 素、温度变化、生长条件、物理应激、细胞转化等)的细胞和正常细胞(例如， 除了不是永生、受感染或治疗等细胞以外，在其他方面与实验细胞相同的细胞)； 从患有癌症、疾病的哺乳动物、老年哺乳动物或暴露于病状的哺乳动物分离的 细胞，和来自相同物种的哺乳动物的细胞，优选来自相同家族的健康或年轻哺 乳动物的细胞；来自相同哺乳动物的分化细胞和未分化细胞(例如，一个细胞是 哺乳动物中另一个细胞的祖细胞)。在一个实施方案中，可以使用不同类型的细 胞，例如神经元和非神经元细胞，或不同状态的细胞(例如，在细胞上刺激之前 和之后)。在本发明的另一个实施方案中，实验材料包含易受病原体如病毒，例 如人免疫缺陷病毒(HIV)等感染细胞，并且对照材料包含对病原体感染有抗性 的细胞。在另一个实施方案中，样品对以未分化细胞，例如干细胞和分化细胞 为代表。
可以并排查看通过该方法产生的图像，或者在一些实施方案中，图像可 以叠加或组合。在一些情况下，图像可以是彩色的，其中图像中使用的颜色可 以对应于所使用的标记。
来自任何生物的细胞，例如来自细菌、酵母、植物和动物，例如鱼类、 鸟类、爬行动物、两栖动物和哺乳动物的细胞均可用于本发明方法中。在某些 实施方案中，可以使用哺乳动物细胞，即来自小鼠、兔、灵长类动物或人的细 胞，或其培养的衍生物。
实施方案
实施方案1.一种用于分析样品的方法，其包括按顺序进行的以下步骤：
(a)获得：
i.多种捕获剂，每种捕获剂与不同的寡核苷酸连接；和
ii.相应多个经标记的核酸探针，其中所述经标记的核酸探针中的 每一种仅与(a)(i)中所述寡核苷酸中的一种特异性杂交；
(b)用(a)(i)的所述多种捕获剂标记样品；
(c)使(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的第一亚组与所述样品特异性杂交， 其中所述第一亚组中的探针可区别地标记，以产生经标记的探针/寡核苷酸双链 体；
(d)读取所述样品以获得显示步骤(c)中杂交的每个探针的结合模式的图像；
(e)使步骤(c)中与所述样品相关的所述标记失活或去除，使(b)的所述多种 捕获剂及其相关的寡核苷酸仍然与所述样品结合；并且
(f)用(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的不同亚组重复步骤(c)和(d)多次， 除最后一次重复外，每次重复之后进行步骤(e)，以产生所述样品的多个图像， 每个图像对应于(c)中使用的经标记的核酸探针亚组。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述样品是平面细胞样品。
实施方案2A.根据先前任何实施方案所述的方法，其中所述样品是平面 样品。
实施方案2B.根据先前任何实施方案所述的方法，其中所述样品是非平 面样品。
实施方案3A.根据先前任何实施方案所述的方法，其中所述(a)(i)的寡核 苷酸长度至少为5个核苷酸。
实施方案3B.根据先前任何实施方案所述的方法，其中(a)(i)的所述寡核 苷酸长度为30-40个核苷酸。
实施方案4A.根据先前任何实施方案所述的方法，其中(a)(ii)的所述经标 记的核酸探针长度为至少5个核苷酸。
实施方案4B.根据先前任何实施方案所述的方法，其中(a)(ii)的所述经标 记的核酸探针长度为8至30个核苷酸。
实施方案5.根据先前任何实施方案所述的方法，其中与(a)(i)的所述捕获 剂连接的所述寡核苷酸的序列：i.比(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的序列长并 且ii.除了与(a)(ii)的单个标记的核酸探针互补的子序列外，在其他方面彼此相同。
实施方案6A6A.根据先前任何实施方案所述的方法，其中(c)的所述双链 体的Tm为至少15℃。
实施方案6B.根据先前任何实施方案所述的方法，其中(c)的所述双链体 的Tm在35℃-75℃的范围内。
实施方案7.根据先前任何实施方案所述的方法，其中(c)的所述杂交持续 约2分钟的时间期间。
实施方案8.根据先前任何实施方案所述的方法，其中每个经标记的核酸 探针具有选自SEQ ID NO:1-47的序列或其互补序列。
实施方案9.根据先前任何实施方案所述的方法，其中与捕获剂连接的每 个寡核苷酸选自SEQ ID NO:48-94或其互补序列。
实施方案10.根据先前任何实施方案所述的方法，其中所述多种捕获剂是 至少10种捕获剂。
实施方案11.根据先前任何实施方案所述的方法，其中每个亚组独立地为 2至4个经标记的核酸探针。
实施方案12.根据先前任何实施方案所述的方法，其中所述探针在步骤(e) 中使用甲酰胺去除。
实施方案13.根据先前任何实施方案所述的方法，其中在步骤(e)中通过 将样品在70％至90％甲酰胺中孵育至少1分钟的时间期间，随后洗涤而去除所 述探针。
实施方案14.根据先前任何实施方案所述的方法，其中步骤(f)包括重复步 骤(c)和(d)2至20次。
实施方案15.根据先前任何实施方案所述的的方法，其还包括分析至少两 个图像。
实施方案16.根据实施方案15所述的方法，其中所述分析包括比较或重 叠至少两个图像。
实施方案17.根据先前任何实施方案所述的方法，其还包括重叠所有图像， 以产生显示所有所述捕获剂与所述样品的结合图案的图像。
实施方案18.根据先前任何实施方案所述的方法，其中所述经标记核酸探 针经荧光标记。
实施方案19.根据先前任何实施方案所述的方法，其中通过荧光显微术进 行读取。
实施方案20.根据先前任何实施方案所述的方法，其中所述捕获试剂是抗 体或适体。
实施方案21.根据先前任何实施方案所述的方法，其中所述样品是经福尔 马林固定、石蜡包埋(FFPE)的切片或细胞涂片。
实施方案22.根据先前任何权利要求所述的方法，其中步骤(e)通过变性 从所述样品中去除在步骤(c)中杂交的探针来进行，使(b)的所述多种捕获剂及其 相关的寡核苷酸仍然与所述样品结合。
实施方案23.根据先前任何实施方案所述的方法，其中步骤(e)未通过变 性从所述样品中去除在步骤(c)中杂交的探针来进行，使(b)的所述多种捕获剂及 其相关的寡核苷酸仍然与所述样品结合。
实施方案24.根据权利要求实施方案23所述的方法，其中步骤(e)是通过 裂解步骤(c)中与所述样品相关的所述探针中的至少一个键，或将所述探针连接 至所述标记的接头来进行，从而使所述标记从所述探针上释放。
实施方案25.根据实施方案24所述的方法，其中所述裂解经酶促、化学 或通过曝光而进行。
实施方案26.根据实施方案23所述的方法，其中步骤(e)是通过使所述标 记灭活而进行。
实施方案27.一种试剂盒，其包含：
至少10个核酸探针的第一群体，其中所述至少10种寡核苷酸的序列由 选自SEQID NO：48-94的序列或其互补序列组成。
实施方案28.根据实施方案27所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸经标记。
实施方案29.根据实施方案27-28中任一项所述的试剂盒，其中所述寡核 苷酸处于单独容器中。
实施方案30.根据实施方案27-29中任一项所述的试剂盒，其中所述寡核 苷酸是呈包含多达3种所述寡核苷酸的混合物。
实施方案31.根据实施方案27-30中任一项所述的试剂盒，其还包含：
寡核苷酸第二群体，其中所述第二群体中的所述寡核苷酸各自包含与所 述第一群体中寡核苷酸的全长互补的序列。
实施方案32.根据实施方案27-31中任一项所述的试剂盒，其中所述第二 群体中的所述寡核苷酸各自与捕获剂连接。
实施方案33.根据实施方案27-32中任一项所述的试剂盒，其中所述第二 群体中的所述寡核苷酸比所述第一群体中的所述寡核苷酸长。
实施方案34.根据实施方案27-33中任一项所述的试剂盒，其中所述第二 群体中的所述寡核苷酸选自SEQ ID NO:48-94或其互补序列。
实施方案35.根据实施方案27-34中任一项所述的试剂盒，其中所述探针 包含不是磷酸二酯键的可裂解连键。
实施方案36.一种用于分析样品的系统，其包括样品槽、自动采样器、控 制器、处理器和计算机可读介质，所述计算机可读介质包括在由所述处理器执 行时使所述控制器分析样品的指令，其中所述分析包括：
(a)用多种捕获剂标记所述样品；
(b)使多个经标记的核酸探针的第一亚组与所述样品特异性杂交；
(c)读取所述样品以获得显示步骤(b)中杂交的每个探针的结合模式的图像；
(d)从样品中去除步骤(b)中杂交的标记和/或探针；并且
(e)用所述多个经标记的核酸探针的不同亚组重复步骤(b)和(c)多次，除最 后一次重复外，每次重复之后进行步骤(d)。
实施方案37.根据实施方案36所述的系统，其中(b)的所述杂交持续约2 分钟期间。
实施方案38.根据实施方案36-37中任一项所述的系统，其中步骤(e)包括 重复步骤(b)和(c)2至20次。
实施方案39.根据实施方案36-38中任一项所述的系统，其中所述多种捕 获剂是至少10种捕获剂。
实施方案40.根据实施方案36-39中任一项所述的系统，其中每个亚组独 立地为2至4个经标记的核酸探针。
实施方案41.根据实施方案36-40中任一项所述的系统，其中在步骤(d)中 通过变性去除所述探针。
实施方案40.根据实施方案41所述的方法，其中在步骤(d)中通过将样品 在70％至90％甲酰胺中孵育至少1分钟的时间期间，随后洗涤而去除所述探针。
实施方案41.一种用于分析样品的方法，其包括按顺序进行的以下步骤： (a)获得：i.多种捕获剂，每种捕获剂与不同的寡核苷酸连接；和ii.相应多个经 标记的核酸探针，其中所述经标记的核酸探针中的每一种仅与(a)(i)中所述寡核 苷酸中的一种特异性杂交；(b)用(a)(i)的所述多种捕获剂标记平面样品；(c)使 (a)(ii)的所述经标记的核酸探针的第一亚组与所述样品特异性杂交，其中所述第 一亚组中的探针可区别地标记，以产生经标记的探针/寡核苷酸双链体；(d)读 取所述样品以获得显示步骤(c)中杂交的每个探针的结合模式的图像；(e)通过变 性从样品上去除步骤(c)中杂交的探针，使(b)的所述捕获剂及其相关的寡核苷酸 仍然与所述样品结合；并且(f)用(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的不同亚组重复 步骤(c)和(d)多次，除最后一次重复外，每次重复之后进行步骤(e)，以产生所述 样品的多个图像，每个图像对应于(c)中使用的经标记的核酸探针亚组。
实施方案42.根据实施方案41所述的方法，其中所述样品是平面细胞样 品。
实施方案43.根据实施方案41-42中任一项所述的方法，其中(a)(i)的寡核 苷酸长度为30-40个核苷酸。
实施方案44.根据实施方案41-43中任一项所述的方法，其中(a)(ii)的所 述经标记的核酸探针长度为8至30个核苷酸。
实施方案45.根据实施方案41-44中任一项所述的方法，其中与(a)(i)的所 述捕获剂连接的所述寡核苷酸的序列：i.比(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的序 列长并且ii.除了与(a)(ii)的单个标记的核酸探针互补的子序列外，在其他方面彼 此相同。
实施方案46.根据实施方案41-45中任一项所述的方法，其中(c)的所述双 链体的Tm在35℃-75℃的范围内。
实施方案47.根据实施方案41-46中任一项所述的方法，其中(c)的所述杂 交持续约2分钟的时间期间。
实施方案48.根据实施方案41-47中任一项所述的方法，其中每个经标记 的核酸探针具有选自SEQ ID NO:1-47的序列或其互补序列。
实施方案49.根据实施方案41-48中任一项所述的方法，其中与捕获剂连 接的每个寡核苷酸选自SEQ ID NO:48-94或其互补序列。
实施方案50.根据实施方案41-49中任一项所述的方法，其中所述多种捕 获剂是至少10种捕获剂。
实施方案51.根据实施方案41-50中任一项所述的方法，其中每个亚组独 立地为2至4个经标记的核酸探针。
实施方案52.根据实施方案41-51中任一项所述的方法，其中所述探针在 步骤(e)中使用甲酰胺去除。
实施方案53.根据实施方案41-52中任一项所述的方法，其中在步骤(e)中 通过将样品在70％至90％甲酰胺中孵育至少1分钟的时间期间，随后洗涤而去 除所述探针。
实施方案54.根据实施方案41-53中任一项所述的方法，其中步骤(f)包括 重复步骤(c)和(d)2至20次。
实施方案55.根据实施方案41-54中任一项所述的方法，其还包括分析至 少两个图像。
实施方案56.根据实施方案55所述的方法，其中所述分析包括比较或重 叠至少两个图像。
实施方案57.根据实施方案41-56中任一项所述的方法，其还包括重叠所 有图像，以产生显示所有所述捕获剂与所述样品的结合图案的图像。
实施方案58.根据实施方案41-57中任一项所述的方法，其中所述经标记 核酸探针经荧光标记。
实施方案59.根据实施方案41-58中任一项所述的方法，其中读取是通过 荧光显微镜进行的。
实施方案60.根据实施方案41-59中任一项所述的方法，其中所述捕获试 剂是抗体或适体。
实施方案61.根据实施方案41-60中任一项所述的方法，其中所述平面样 品是经福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的切片或细胞涂片。
为了进一步说明本发明，给出以下具体实施例，应理解，提供他们是为 了说明本发明，并且不应以任何方式解释为限制其范围。
实施例
总体程序
每种抗体与独有寡核苷酸偶联，其与偶联染料分子的较短互补寡核苷酸 杂交。合并所有抗体，并使用该混合物为靶组织(或细胞扩散)染色。使组织附 着于流动室上，并使用自动取样器进行寡核苷酸退火和去除的迭代循环，以三 个一组标准四色显微镜递送染料-寡核苷酸文库。在每个杂交步骤后，将组织或 细胞扩散在荧光显微镜上成像。在每个循环之间使用甲酰胺溶液除去染料-寡核 苷酸。重叠每个循环的荧光图像，并在所有循环和荧光通道中提取单细胞分辨 率信息。
试剂设计
寡核苷酸文库
根据以下标准设计序列正交寡核苷酸探针组的文库：1)每个探针组包含与 抗体偶联的介于30-40个核苷酸之间的寡核苷酸序列(oligo a)和长度较短(10-20 个核苷酸)的与荧光染料偶联的互补寡核苷酸(oligo b)。2)每个oligo b的解链温 度(Tm)均在35℃-50℃之间。如果Tm低于35℃，则在成像持续时间oligo b不 与oligo a杂交。如果Tm高于75℃，则在甲酰胺孵育步骤中无法去除染料-寡 核苷酸(b)。
筛选探针组文库的序列重叠。发现以下序列没有序列相似性。
Figure BDA0001978114350000291
寡核苷酸去除
使用含2mM Tris pH＝7.5Hz、2mM MgCl2、25mM NaCl和0.02％(v/v) TritonX的80％甲酰胺溶液去除杂交的经染料标记的寡核苷酸。为了在每个周 期中完全去除经染料标记的寡核苷酸，在样品上进行三次甲酰胺溶液的120秒 孵育，随后用10mM Tris pH＝7.5、10mM MgCl2、150mM NaCl和 0.1％(v/v)TritonX进行4个洗涤步骤。
自动化流体学设计
每个周期涉及以下步骤：
1.去除孔中的溶液并递送染料-寡核苷酸组
2.杂交孵育
3.去除染料-寡核苷酸组溶液并洗涤样品(4X)
4.样品成像
5.去除孔中的溶液并递送甲酰胺溶液
6.甲酰胺溶液孵育
7.去除孔中的溶液并洗涤样品(4X)
8.去除孔中的溶液并递送甲酰胺溶液
9.甲酰胺溶液孵育
10.去除孔中的溶液并洗涤样品(4X)
11.去除孔中的溶液并递送甲酰胺溶液
12.甲酰胺溶液孵育
13.去除孔中的溶液并洗涤样品(4X)
该过程使用由定制电子板/python程序控制的泵系统与96孔板兼容性自动 取样器完全自动化。
实施例1
染料-寡核苷酸可以与抗体-DNA偶联物杂交并且 在重复循环中去除
该技术的基础是能够使染料标记的寡核苷酸与DNA偶联的抗体退火和从 DNA偶联的抗体中去除。为了证明这种可行性，用DNA偶联的CD3抗体(克 隆UCHT1)为新鲜冷冻的人淋巴结组织染色。将针对CD19的直接染料标记的 (Alexa647)抗体用作复染剂。进行退火/去杂交的迭代循环。在杂交/甲酰胺步骤 后，在Keyence显微镜上观察到相同的组织区域。在每个循环期间，使针对 CD3偶联序列的互补的FAM标记的寡核苷酸(14个核苷酸，Tm＝42.4℃)在室温 (～23℃)下杂交5分钟。将甲酰胺溶液(30％)添加到组织中并孵育5分钟以去除 染料标记的寡核苷酸(图2和3)。
实施例2
DNA-寡核苷酸杂交动力学
该技术的实用性随着每个循环的时间减少而得到改善。为了确定最小杂 交时间，用DNA偶联的CD3抗体和Alexa647偶联的CD19抗体为新鲜冷冻的 人淋巴结组织染色。将互补的FITC标记的寡核苷酸添加到组织(1μM)中孵育不 同时间，并测量细胞染色强度。每次杂交孵育后进行甲酰胺孵育(30％)以去除 所有杂交的寡核苷酸。对于所有测试的孵育时间对相同组织区域成像，以进行 直接荧光强度比较。在两分钟杂交期内，荧光强度最大化(图4)。
实施例3
甲酰胺去除动力学
每个循环涉及杂交步骤和使用甲酰胺的去除步骤。测定去除所有杂交的 染料标记的寡核苷酸的最短时间。用于测试杂交动力学的相同组织用于测试甲 酰胺去除动力学。使互补的染料标记的寡核苷酸(1μM)杂交5分钟。将甲酰胺 溶液(30％)孵育不同的时间段，之后洗掉溶液以停止去除(图5)。在每个测试时 间点之间，添加另外的染料标记的寡核苷酸。一分钟后，完全去除染料标记的 寡核苷酸。
实施例4
染料-寡核苷酸特征：长度、Tm
用14个核苷酸的互补的染料标记的寡核苷酸进行测量杂交/去除重复循环 可行性的初步研究，Tm＝42.4℃。为了确定成像持续期间(长达2小时)获得足够 抗体染色的最小长度/Tm和用甲酰胺溶液可以去除的最大长度，测试不同长度 的染料标记的寡核苷酸的杂交倾向/去除(图5和6)。发现Tm低于28℃，长度 为10个核苷酸的染料标记的寡核苷酸在所用条件下不能有效地与用CD3DNA 偶联抗体染色的组织杂交(图6)。具有下一个最接近特征，长度为12个核苷酸 且Tm＝34.4℃的寡核苷酸与所测试的所有其他较长的染料标记的寡核苷酸一样 有效杂交。将每种杂交的染料标记的寡核苷酸与甲酰胺溶液一起孵育两分钟(图 7)。测试的最长的染料标记的寡核苷酸为30个核苷酸，Tm＝65.9℃。该探针在80％甲酰胺溶液中有效去除。基于这些发现，用于该测定的最佳染料标记的寡 核苷酸的Tm应至少为35℃。
实施例5
用于抗体偶联的序列正交寡核苷酸对文库的设计
每个寡核苷酸对由与抗体偶联的寡核苷酸和具有染料修饰的互补序列组 成。与抗体结合的寡核苷酸的长度比染料标记的寡核苷酸长，以允许系链序列， 使得杂交不需要紧邻抗体发生。设计并合成了30个寡核苷酸对的文库。为了 筛选交叉杂交，将每种马来酰亚胺寡核苷酸与小鼠CD45抗体偶联。将小鼠脾 细胞等分试样用单个寡核苷酸标记的CD45抗体染色。充分洗涤后，将细胞合 并并置于盖玻片上。进行三个一组的染料标记的寡核苷酸杂交的迭代循环。在 每次杂交之间使用甲酰胺进行染料标记的寡核苷酸的去除。测量细胞上对应每 个染料标记的寡核苷酸的的荧光强度，并与对应所有其他染料标记的寡核苷酸 的荧光强度进行比较。图8中绘制了荧光强度值。图9中给出了每个细胞群的 荧光强度曲线的代表性迹线。一些寡核苷酸对显示出交叉杂交活性(例如T9和 T10)。基于图8中给出的荧光强度数据，从30个的文库中去除最小组的寡核苷 酸对，以产生序列-正交文库组。得到的24个寡核苷酸对的文库如图10所示。
设计另外的寡核苷酸对并筛选类似于第一组探针。目前，有45个序列正 交探针组。
实施例6
自动化流体装置
每个循环涉及将三种类型的溶液输送到样品槽：1)寡核苷酸混合物，2)洗 涤溶液和3)甲酰胺溶液。为了易于使用和再现性目的，流控技术是完全自动化 的。自动取样器编程与控制每种溶液的一系列泵一致。在每个循环中，从96 孔板内的指定孔中取出相应的一组三种寡核苷酸。将溶液泵入样品并孵育。完 成单个周期的整组命令是完全自动化的并且通过python程序控制。为了证明自 动取样器的用途，将成对的染料标记的寡核苷酸添加到96孔板的前八个位置。 每个奇数循环孔含有染料-寡核苷酸T11-cy5和T18-cy3，而每个偶数循环含有 T24-Cy5和T26-Cy3。用偶联不同寡核苷酸的CD45抗体染色的小鼠脾细胞群 体使用该平台成像。来自每个循环的染色细胞的图像如图11所示，以及来自 每个群体的五个细胞的代表性细胞迹线。如图所示，荧光强度在所有奇数和偶 数循环中是等效的，表明自动取样器将染料标记的寡核苷酸溶液递送至样品而 没有任何残留。
实施例7
使用与寡核苷酸文库偶联的抗体对人组织染色
用偶联至一种马来酰亚胺寡核苷酸的抗体混合物对人组织进行染色。进 行杂交/去除的迭代循环，在每个杂交步骤之后进行成像。使用该平台对人扁桃 体(图12)和人淋巴结(图13)进行成像。几乎每个循环都发生预期的染色。
尽管前述发明已通过说明和实例为了清楚理解的目的相当详细地描述， 但是本领域的普通技术人员显而易见的是鉴于本发明的教导，在不背离所附权 利要求的精神或范围的情况下可以对其进行某些变化和修改。
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Claims (20)

1.用于分析包含固定的细胞的样品的非疾病诊断目的的方法，其包括：
(a)获得：
(i)多种捕获剂，每种捕获剂与不同的寡核苷酸连接；和
(ii)相应多个经标记的核酸探针，其中所述经标记的核酸探针中的每一种仅与(a)(i)中所述寡核苷酸中的一种特异性杂交；
(b)用(a)(i)的所述多种捕获剂标记所述包含固定的细胞的样品；
(c)使(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的第一亚组与所述包含固定的细胞的样品特异性杂交，其中所述第一亚组中的探针可区别地标记，以产生经标记的探针/寡核苷酸双链体；
(d)读取所述包含固定的细胞的样品以获得显示步骤(c)中杂交的每个探针的结合模式的图像；
(e)通过使用DMSO或甲酰胺变性来从所述包含固定的细胞的样品完全去除步骤(c)中杂交的探针，所述变性不是通过用置换探针置换DNA探针来进行的，使(b)的多种捕获剂及其相关的寡核苷酸仍然与所述包含固定的细胞的样品结合；并且
(f)用(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的不同亚组重复步骤(c)和(d)多次，除最后一次重复外，每次重复之后进行步骤(e)，以产生所述包含固定的细胞的样品的多个图像，每个图像对应于(c)中使用的经标记的核酸探针的不同亚组。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是平面细胞样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中(a)(i)的所述寡核苷酸长度为至少5个核苷酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中(a)(ii)的所述经标记的核酸探针长度为至少5个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中与(a)(i)的所述捕获剂连接的所述寡核苷酸的序列：
(i)比(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的序列长，并且
(ii)除了与(a)(ii)的单个标记的核酸探针互补的子序列外，在其他方面彼此相同。
6.根据权利要求1所述的方法，其中(c)的所述双链体的Tm为至少15℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其中(c)的所述杂交持续约2分钟的时间期间。
8.根据权利要求1所述的方法，其中每个经标记的核酸探针具有选自SEQ ID NO:1～47的序列或其互补序列。
9.根据权利要求1所述的方法，其中与捕获剂连接的每个寡核苷酸选自SEQ ID NO:48～94或其互补序列。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种捕获剂是至少10种捕获剂。
11.根据权利要求1所述的方法，其中不同亚组的每个独立地为2至4个经标记的核酸探针。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中通过将样品在70％至90％甲酰胺中孵育至少1分钟的时间期间，随后洗涤而去除所述探针。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)包括重复步骤(c)和(d)2至20次。
14.根据权利要求1所述的方法，其还包括分析至少两个图像。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述分析包括比较或重叠至少两个图像。
16.根据权利要求1所述的方法，其还包括重叠所有图像，以产生显示所有所述捕获剂与所述样品的结合图案的图像。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述经标记的核酸探针经荧光标记。
18.根据权利要求1所述的方法，其中读取是通过荧光显微镜进行的。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获试剂是抗体或适体。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是经福尔马林固定或石蜡包埋(FFPE)的切片。
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