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CN115715329A - 确定生物样品中靶核酸位置的方法 - Google Patents

确定生物样品中靶核酸位置的方法 Download PDF

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CN115715329A
CN115715329A CN202180020971.0A CN202180020971A CN115715329A CN 115715329 A CN115715329 A CN 115715329A CN 202180020971 A CN202180020971 A CN 202180020971A CN 115715329 A CN115715329 A CN 115715329A
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CN
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sequence
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minutes
nucleic acid
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M·斯多克尤斯
J·M·彻尔
C·尤汀考
F·A·巴伐
J·陈
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10X Genomics Ltd
Original Assignee
10X Genomics Ltd
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Abstract

本公开涉及确定分析物在固定生物样品中的位置。

Description

确定生物样品中靶核酸位置的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月10日提交的美国临时专利申请号62/959,765，2020年9月16日提交的美国临时专利申请号63/079,189，2020年10月5日提交的美国临时专利申请号63/087,553和2020年3月4日提交的美国临时专利申请号62/985,292的优先权。这些申请各自的内容通过引用全文纳入本文。
背景技术
组织内的细胞由于不同细胞内的不同分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)而在细胞形态和/或功能上存在差异。细胞在组织内的特定位置(例如，细胞相对于邻近细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可以影响，例如，细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为、信号转导，以及与组织中其它细胞的串扰。
先前人们曾利用技术对空间异质性进行过研究，这些技术通常提供完整组织或部分组织(例如组织切片)背景中少数分析物的数据，或提供来自个体、单个细胞的重要分析物数据，但无法提供关于来自原始生物样品(例如，组织)的单细胞位置的信息。
福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品为将获自患者的生物样品存档提供了一种有用的方法。经过大量存储时间(例如，数年)后，可以在对提取的分析物没有任何显著影响的情况下从FFPE样品中成功地再获取和分析分析物。
发明内容
生物样品的保存是有用的，因为保存可以保持生物样品的细胞形态和细节。保存生物样品还可以创建一个存档库，可以对其进行进一步检查或回顾性询问。已知不同类型的保存方法，包括例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)固定、多聚甲醛固定(PFA)和丙酮固定。
目前，先前已经描述了用于从生物样品(例如，新鲜冷冻的)生物样品空间捕获分析物的方法、组合物和试剂盒。然而，仍然需要从保存的生物样品(例如固定生物样品)空间捕获分析物。本公开的特征在于，用于在包含多个捕获探针的阵列上空间捕获分析物的方法、组合物和试剂盒，其中多个捕获探针的捕获探针包括捕获域和空间条形码。
本文提供了用于确定靶核酸在固定生物样品中的位置的方法，所述方法包括：(a)位于包括多个捕获探针的空间阵列上的固定生物样品，其中多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获域；(b)使固定生物样品中的一种或多种交联物去交联，从而使得捕获域结合至靶核酸或其代用物；(c)延伸捕获探针以产生与靶核酸的部分互补的核酸序列；(d)产生与延伸捕获探针杂交的第二链，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和对应于靶核酸中的序列的部分的核酸序列；和(e)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸序列的部分的全部或部分或其互补物，并采用(i)和(ii)中确定的序列来鉴定靶核酸在固定生物样品中的位置。
在一些实施方式中，去交联步骤包括加热固定生物样品。在一些实施方式中，去交联步骤包括进行化学反应或使用酶。
在一些实施方式中，固定生物样品是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)生物样品。
在一些实施方式中，去交联步骤包括使用Tris-EDTA(TE)缓冲液。在一些实施方式中，TE缓冲液具有约7.5至约8.5的pH。在一些实施方式中，TE缓冲液具有约65℃至约75℃的温度，并且与FFPE生物样品接触约10分钟至约200分钟。
在一些实施方式中，固定生物样品是多聚甲醛固定生物样品。在一些实施方式中，去交联步骤包括在约55℃至约65℃的温度使用pH为约8.5至9.5的Tris-HCl缓冲液，并与多聚甲醛固定生物样品接触约10分钟至约200分钟。
在一些实施方式中，在去交联步骤之后，包括使固定生物样品透化的步骤。在一些实施方式中，使固定生物样品透化的步骤包括使用蛋白酶，其中所述蛋白酶是胃蛋白酶或蛋白酶K。
在一些实施方式中，多个捕获探针包括附加捕获探针，其以5′至3′方向包括：空间条形码和多聚(T)捕获域。
在一些实施方式中，靶核酸包括RNA。在一些实施方式中，RNA是mRNA。
在一些实施方式中，所述方法包括在步骤(b)和(c)之间将固定生物样品与5′至3′单链DNA核酸外切酶一起孵育的步骤。在一些实施方式中，所述方法包括，在步骤(b)和(c)之间，将固定生物样品与5′至3′单链DNA核酸外切酶和双链DNA核酸内切酶一起孵育的步骤，其中单链DNA核酸外切酶是T7核酸内切酶或RecJf。在一些实施方式中，所述方法包括将固定生物样品与具有富含AT的限制性核酸内切酶识别序列的限制性核酸内切酶一起孵育。
在一些实施方式中，步骤(d)包括以下步骤：将同型核苷酸序列添加至捕获探针的3′端；使用夹板连接或DNA聚合酶延伸反应将测序或PCR柄连接至均聚核苷酸序列的3′端。在一些实施方式中，添加均聚核苷酸序列的步骤使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)进行。
在一些实施方式中，夹板连接包括使用部分双链核酸，包括与第二寡核苷酸杂交的第一寡核苷酸，其中：第一寡核苷酸包括功能域；第二寡核苷酸以5′至3′方向包括：多聚(G)序列和与功能域基本互补的序列；第二寡核苷酸的多聚(G)序列能与捕获探针的多聚(C)序列结合；并且部分双链核酸在第二链上具有5′突出端，其中5′突出端包括多聚(G)序列的至少部分。在一些实施方式中，功能域是测序或PCR柄并且夹板连接导致将测序或PCR柄添加至捕获域的3′端。在一些实施方式中，步骤(d)包括：杂交包括与捕获探针中的测序或PCR柄基本互补的序列的引物；并延伸引物以产生第二链。
在一些实施方式中，步骤(d)至少部分包括使用连接酶将5′腺苷酸化衔接子连接至捕获探针的3′端的步骤。在一些实施方式中，连接酶是5′App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶2或任何其它单链DNA或RNA连接酶。在一些实施方式中，5′腺苷酸化衔接子包括测序柄(sequencing handle)。在一些实施方式中，步骤(d)包括：杂交包括与捕获探针中的测序或PCR柄基本互补的序列的引物；并延伸引物以产生第二链。
在一些实施方式中，其中步骤(d)至少部分包括以下步骤：将多聚(A)序列添加至捕获探针的3′端；和将衔接子连接至捕获探针中多聚(A)序列的3′端。在一些实施方式中，多聚(A)序列是核糖核酸序列并且使用RNA连接进行连接。
在一些实施方式中，衔接子包括测序或PCR柄。在一些实施方式中，步骤(d)包括：杂交包括与捕获探针中的测序或PCR柄基本互补的序列的引物；并延伸引物以产生第二链。在一些实施方式中，延伸引物以产生第二链的步骤使用DNA聚合酶进行。在一些实施方式中，延伸引物以产生第二链的步骤使用能利用RNA碱基作为底物的DNA聚合酶进行。
在一些实施方式中，步骤(d)包括杂交一种或多种引物，其中一种或多种引物的引物包括随机序列和功能域，其中随机序列能与延伸的捕获探针中基本上与随机序列互补的序列杂交。在一些实施方式中，功能域是测序柄。在一些实施方式中，步骤(d)包括延伸引物以产生第二链。
在一些实施方式中，步骤(d)至少部分包括将衔接子连接至捕获探针的3′端的步骤。在一些实施方式中，衔接子包括测序柄。在一些实施方式中，步骤(d)包括：杂交包括与捕获探针中的测序柄基本互补的序列的引物；并延伸引物以产生第二链。
在一些实施方式中，功能域包括模板转换寡核苷酸序列，后跟随机序列。在一些实施方式中，功能域后跟随机序列，包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5。在一些实施方式中，所述方法包括模板转换寡核苷酸。
在一些实施方式中，所述方法包括对固定生物样品进行成像。在一些实施方式中，固定生物样品是FFPE组织切片或多聚甲醛固定的组织切片。在一些实施方式中，捕获探针包括位于捕获探针中捕获域5′的独特分子标识符(UMI)。
在一些实施方式中，所述方法包括在步骤(b)之后使固定生物样品与第一探针接触，其中第一探针以5′至3′方向包括：第一功能域和与靶核酸的部分基本上互补的第一序列。
在一些实施方式中，所述方法包括(i)使固定生物样品与第二探针接触，其中第二探针以5′至3′方向包括：与靶核酸的部分基本上互补的第二序列和分析物捕获序列，其中所述捕获域能与靶核酸的代用物(proxy)的分析物捕获序列结合；第二探针的5′端包括5′磷酸；并且第一序列和第二序列能与靶核酸结合；(ii)将第一探针的3′端连接至第二探针的5′端以产生靶核酸的代用物；(iii)延伸捕获探针的3′端以产生对应于靶核酸的代用物的部分的序列；(iv)产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和与靶核酸的代用物的部分互补的序列；和(v)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸的代用物的部分的全部或部分或其互补物，并采用(i)和(ii)中确定的序列来鉴定靶核酸在固定生物样品中的位置。
在一些实施方式中，第一功能域是第一测序柄，并且其中分析物捕获序列与捕获域或其部分基本上互补。
在一些实施方式中，使用连接酶将第一探针的3′端连接至第二探针的5′端。
在一些实施方式中，所述方法包括在步骤(b)和(c)之间用RNA酶处理FFPE生物样品的步骤。
在一些实施方式中，步骤(e)包括：将包括第一功能域的至少部分的引物与捕获探针杂交；和延伸引物以产生第二链。在一些实施方式中，第一探针的3′端包括3′二核糖序列(diribo sequence)。
在一些实施方式中，所述方法包括在步骤(a)之后将分析物捕获序列添加至靶核酸。在一些实施方式中，添加分析物捕获序列使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或多聚(A)聚合酶进行。
本文还提供了用于确定靶核酸在固定生物样品中的位置的方法，包括(a)使固定生物样品与第一和第二探针接触，其中第一探针以5′至3′方向包括：第一功能域和与靶核酸的部分基本上互补的第一序列；第二探针以5′至3′方向包括：与靶核酸的部分基本上互补的第二序列和分析物捕获序列；第二探针的5′端包含5′磷酸；且第一序列和第二序列能与靶核酸结合；(b)将第一探针的3′端连接至第二探针的5′端以产生靶核酸的代用物；(c)使固定生物样品与包括捕获探针的阵列接触，所述捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获域，所述捕获域包括与分析物捕获序列基本互补的序列，其中捕获域能与靶核酸的代用物的分析物捕获序列结合；(d)延伸捕获探针的3′端以产生对应于靶核酸的代用物的部分的序列；(e)产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和与靶核酸的代用物的部分互补的序列；和(f)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸的代用物的部分的全部或部分或其互补物，并且采用(i)和(ii)中确定的序列来鉴定靶核酸在固定生物样品中的位置。
本文还提供了用于确定靶核酸在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)生物样品中的位置的方法，包括(a)FFPE生物样品在包括多个捕获探针的空间阵列上，其中多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获域；(b)使FFPE生物样品中的一种或多种甲醛交联物去交联，从而使捕获域与靶核酸结合；(c)延伸捕获探针以产生与靶核酸的部分互补的核酸序列；(d)使延伸的捕获探针接触与带有标记核酸的延伸的捕获探针基本上互补的核酸接触，从而使得标记的核酸与延伸的捕获探针或其部分结合；和(e)检测标记的核酸以鉴定靶核酸在FFPE生物样品中的位置。
本文还提供了用于确定靶核酸在多聚甲醛固定生物样品中的位置的方法，所述方法包括：(a)位于包括多个捕获探针的空间阵列上的多聚甲醛固定生物样品，其中多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获域；(b)使PFA生物样品中的多聚甲醛交联物去交联，从而使得捕获域结合至靶核酸；(c)延伸捕获探针以产生与靶核酸的部分互补的核酸序列；(d)产生与延伸捕获探针杂交的第二链，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和对应于靶核酸中的序列的部分的核酸序列；和(d)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸序列的部分的全部或部分或其互补物，并采用(i)和(ii)中确定的序列来鉴定靶核酸在多聚甲醛固定生物样品中的位置。
本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利、专利申请或信息条目专门和单独地通过引用纳入本文那样。对于通过引用纳入的出版物、专利、专利申请和信息项目与本说明书中所含公开内容相矛盾的内容，均意于以本说明书为准和/或本说明书优先于任何相矛盾的材料。
在以范围来描述值的情况下，应当理解的是，该描述包括在该范围内的所有可能的子范围的公开，以及在该范围内的特定数值的公开，而不管是否明确地说明了特定数值或特定子范围。
术语“每个”提及一组物品时，意在鉴别该集合中的一个单独物品，但不一定指该集合中的每一项物品，除非另有明确说明，或除非用法的上下文另有明确说明。
本文描述了本发明的特征的各种实施方式。然而，应当理解，这些实施方式仅作为示例提供，并且在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员可以作出许多变化、改变和替换。还应理解，本文所描述的特定实施方式的各种替代方案也在本公开的范围内。
附图说明
以下附图说明了本发明的特征和优点的某些实施方式。这些实施方式无意以任何方式限制所附权利要求的范围。附图中的相同附图标记表示相同的元素。
以下附图说明了本发明的特征和优点的某些实施方式。这些实施方式无意以任何方式限制所附权利要求的范围。附图中的相同附图标记表示相同的元素。
图1是示出如本文所述的条码化捕获探针的示例的示意图。
图2A-C显示了使用不同小鼠脑样品的空间聚类。获自新鲜冷冻生物样品的数据示于图2A，获自FFPE生物样品(未去交联)的数据示于图2B，且获自FFPE生物样品(去交联)的数据示于图2C。
图3A-C显示使用不同小鼠脑样品的个体基因(PRKCD)的空间聚类。获自新鲜冷冻生物样品的数据示于图3A，获自FFPE生物样品(未去交联)的数据示于图3B，且获自FFPE生物样品(去交联)的数据示于图3C。
图4A-C显示从不同生物样品获得的数据的样品相关图。图4A是从新鲜冷冻样品获得的数据和从新鲜冷冻样品获得的数据的相关图。图4B是从去交联的FFPE生物样品获得的数据和从去交联的FFPE生物样品获得的数据的相关图。图4C是从去交联的FFPE生物样品获得的数据和从新鲜冷冻的生物样品获得的数据的相关图。
图5A-B显示来自去交联的7年龄化生癌FFPE生物样品的成功空间聚类。图5A是具有由UMI计数着色的点的组织图。图5B是由UMI计数着色的点的t-SNE投影。
图6A-B显示来自去交联的7年龄化生癌FFPE生物样品的成功空间聚类的表现。图6A是具有通过自动聚类着色的点的组织图的表现。图6B是通过自动聚类着色的点的t-SNE投影的表现。
图7是显示利用末端转移酶将多聚(C)序列添加至延伸的捕获探针的3′端，然后通过夹板寡核苷酸进行测序柄的连接的示意图。
图8A-B是显示从新鲜冷冻和去交联的FFPE生物样品产生并使用图7中描述的方法制备的cDNA的重复实验。
图9显示使用图7中描述的方法制备的去交联FFPE生物样品的成功空间分析。
图10显示了使用图7中描述的方法制备的去交联FFPE生物样品的成功空间聚类。
图11是显示可用于在使用包括测序柄的随机引物进行逆转录后产生第二链的方法的示意图。
图12显示由使用图10中描述的方法制备的去交联FFPE生物样品制备的测序文库。
图13显示对使用图11中描述的方法制备的去交联FFPE生物样品进行的成功空间分析。
图14显示对使用图11中描述的方法制备的去交联FFPE生物样品进行的成功空间聚类。
图15显示在逆转录后将包括测序柄的5′腺苷酸化衔接子连接至延伸的捕获探针的3′端的示意图。
图16是显示带有多聚(A)核糖核酸序列的延伸捕获探针的3′端的加尾和采用RNA连接酶进行的测序衔接子的连接的示意图。
图17A-B是以不同透化持续时间长度，在无去交联(图17A)或去交联的1％PFA固定生物样品(图17B)情况下的1％多聚甲醛(PFA)固定生物样品中捕获的核酸的荧光标记的cDNA图像。
图18是显示去交联的PFA固定生物样品中cDNA荧光与背景荧光的信噪比(SNR)的图。
图19A-B是以不同透化持续时间长度，在无去交联(图19A)或去交联的2％PFA固定生物样品(图19B)情况下的2％PFA固定生物样品中捕获的核酸的荧光标记的cDNA图像。
图20A-B是以不同透化持续时间长度，在无去交联(图20A)或去交联的4％PFA固定生物样品(图20B)情况下的4％PFA固定生物样品中捕获的核酸的荧光标记的cDNA图像。
图21A-B是显示在去交联的1％、2％和4％PFA固定生物样品(图21A)和单独的仅去交联的4％PFA固定生物样品(图21B)中cDNA荧光与背景荧光的SNR的图。
图22A-B是以不同透化持续时间长度，在无去交联(图22A)或去交联的4％PFA固定的心脏灌注生物样品(图22B)情况下的4％PFA固定的心脏灌注生物样品中捕获的核酸的荧光标记的cDNA图像。
图23A-B是显示去交联的4％PFA固定心脏灌注生物样品中的cDNA荧光(图23A)和去交联的4％PFA固定心脏灌注生物样品中的背景cDNA荧光(图23B)的图。
图24是显示在去交联的4％PFA固定心脏灌注生物样品中cDNA荧光与背景荧光的SNR的图。
图25A-D是显示去交联的1％、2％和4％PFA固定生物样品、去交联的4％PFA固定的心脏灌注生物样品和对照样品中的测序灵敏度度量(可用读数的分数(图25A)；可靠映射到转录组的读数(图25B)；中值基因/点(图25C)；和中值UMI计数/点(图25D))的图。
图26A-C显示对甲醇对照生物样品(图26A)、非去交联的4％PFA固定生物样品(图26B)和去交联的4％PFA固定生物样品(图26C)进行的空间聚类分析。
图27A-C显示对甲醇对照灌注生物样品(图27A)、非去交联的4％PFA固定灌注生物样品(图27B)和去交联的4％PFA固定灌注生物样品(图27C)进行的空间聚类分析。
图28显示各种条件下的测序灵敏度度量。
图29显示各种条件下的测序文库质量度量。
具体实施方式
生物样品的保存是有用的，因为保存可以保持生物样品的细胞形态和细节。保存生物样品还可以创建一个存档库，可以对其进行进一步检查或回顾性询问。已知不同类型的保存方法，包括例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)固定和多聚甲醛固定(PFA)。
固定(例如，FFPE、PFA)处理的生物样品是有利的，因为它们可以在环境条件(例如，室温)下长期(例如，数年)储存，从而降低与在超低温下储存生物样品(例如，冷冻组织)相关联的成本。此外，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以在对提取的分析物(例如，核酸、蛋白质等)的数量和/或质量没有显著影响的情况下长期(例如，数年)储存(参见Kokkat，T.J.等，存档的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块：用于提取DNA、RNA和蛋白质的宝贵未开发资源(Archived Formalin-Fixed Paraffin-Embedded(FFPE)Blocks：A ValuableUnderexploited Resource for Extraction of DNA，RNA，and Protein)，BiopreservBiobank，11(2)，101-106，10.1089/bio.2012.0052(2013))。
本文所述的空间分析方法和组合物能以高空间分辨率提供生物样品内大量分析物和/或各种各样分析物的表达数据，同时保留天然空间背景信息。空间分析方法和组合物可以包括，例如，使用包括空间条形码(例如，提供关于分析物在细胞或组织样品(例如哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置或方位的信息的核酸序列)的捕获探针，和能够与细胞产生和/或其中存在的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)结合的捕获域。空间分析方法和组合物还可包括使用具有捕获域的捕获探针，其捕获用于间接检测分析物的中间物(intermediate agent)。例如，中间物可以包括与中间物相关联的核酸序列(例如，条形码)。因此，中间物的检测指示细胞或组织样品中的分析物。
空间分析的方法和组合物的非限制性方面描述于美国专利号10,774,374，10,724,078，10,480,022，10,059,990，10,041,949，10,002,316，9,879,313，9,783,841，9,727,810，9,593,365，8,951,726，8,604,182，7,709,198，美国专利申请公开号2020/239946，2020/080136，2020/0277663，2020/024641，2019/330617，2019/264268，2020/256867，2020/224244，2019/194709，2019/161796，2019/085383，2019/055594，2018/216161，2018/051322，2018/0245142，2017/241911，2017/089811，2017/067096，2017/029875，2017/0016053，2016/108458，2015/000854，2013/171621，WO 2018/091676，WO2020/176788，Rodriques等，Science 363(6434)：1463-1467，2019；Lee等，Nat.Protoc.10(3)：442-458，2015；Trejo等，PLoS ONE 14(2)：e0212031，2019；Chen等，Science 348(6233)：aaa6090，2015；Gao等，BMC Biol.15：50，2017；和Gupta等，Nature Biotechnol.36：1197-1202，2018；Visium空间基因表达试剂盒用户指南(Visium Spatial GeneExpression Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年6月)，和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(Visium Spatial Tissue Optimization Reagent Kits UserGuide)(例如，Rev C，日期2020年7月)，两者均可得于10x基因组学有限公司(10xGenomics)支持文档网站，可以任意组合使用。本文描述了空间分析方法和组合物的其它非限制性方面。
可以在本公开中使用的一些通用术语可以见于WO2020/176788的第(I)(b)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。通常，“条形码”是一种标签或标识符，它传递或能够传递信息(例如，关于样品中分析物、珠和/或捕获探针的信息)。条形码可以是分析物的部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接于分析物。特定条形码相对于其它条形码可能是独特的。就本发明而言，“分析物”可包括任何待分析的生物物质、结构、部分或组分。术语“靶标”可以类似地指感兴趣的分析物。
分析物可大致分为两类：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的示例包括但不限于脂质、碳水合合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体，蛋白质泛素化变体、蛋白质硫酸化变体、病毒蛋白(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒附件、病毒糖蛋白、病毒刺突等)、胞外和胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，分析物可定位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、内吞囊泡、排出囊泡、液泡、溶酶体等。在一些实施方式中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。分析物的其它示例可见于WO2020/176788第(I)(c)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。在一些实施方式中，分析物可被间接检测，例如通过中间物的检测，例如连接产物或分析物捕获剂(例如，寡核苷酸偶联的抗体)，例如本文所述的那些。
通常从对象处获取“生物样品”，以使用各种技术中的任一种进行分析，包括但不限于活检、手术和激光捕获显微镜(LCM)，并且通常包括来自对象的细胞和/或其他生物材料。在一些实施方式中，生物样品可以是组织切片。在一些实施方式中，生物样品可以是固定和/或染色的生物样品(例如，固定和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性示例包括组织染色剂(例如，苏木精和/或伊红)和免疫染色剂(例如，荧光染色剂)。在一些实施方式中，可以对生物样品(例如，固定和/或染色的生物样品)成像。生物样品也描述于WO2020/176788第(I)(d)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些实施方式中，生物样品用一种或多种透化试剂透化。例如，生物样品的透化可以促进分析物的捕获。示例性透化剂和条件描述于WO2020/176788的第(I)(d)(ii)(13)部分或示例性实施方式部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列，其中各特征与阵列上的独特空间位置相关。转移分析物的后续分析包括确定分析物的相同性以及生物样品中分析物的空间位置。分析物在生物样品中的空间位置是基于阵列中分析物所结合(例如，直接或间接)的特征以及特征在阵列上的相对空间位置来确定的。
“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方式中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方式中，捕获探针包括条形码(例如，空间条形码和/或独特分子标识符(UMI))和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针可包括裂解域和/或功能域(例如，引物结合位点，例如用于下一代测序(NGS))。参见例如WO2020/176788的第(II)(b)部分(例如，第(i)-(vi)小节)和/或美国专利申请公开号2020/0277663。捕获探针的产生可以通过任何合适的方法来实现，包括在WO2020/176788的第(II)(d)(ii)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的那些。
在一些实施方式中，可采用任何合适的多重化技术(例如，描述于WO 2020/176788的第(IV)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663)来检测(例如同时或依次检测)来自生物样品的多于一种分析物类型(例如，核酸和蛋白质)。
在一些实施方式中，可以使用一种或多种分析物捕获剂进行一种或多种分析物(例如，蛋白质分析物)的检测。如本文所用，“分析物捕获剂”是指某一物质，其与分析物(例如，生物样品中的分析物)以及与捕获探针(例如，连接至基材或特征的捕获探针)相互作用以鉴别分析物。在一些实施方式中，分析物捕获剂包括：(i)分析物结合部分(例如，其能结合至分析物)，例如抗体或其抗原结合片段；(ii)分析物结合部分条形码；和(iii)分析物捕获序列。如本文所用，术语“分析物结合部分条形码”是指与分析物结合部分相关联或以其他方式鉴别分析物结合部分的条形码。如本文所用，术语“分析物捕获序列”是指被配置为杂交到捕获探针的捕获域、结合到捕获探针的捕获域、耦合到捕获探针的捕获域或以其他方式与捕获探针的捕获域相互作用的区域或部分。在一些情况下，分析物结合部分条形码(或其部分)可能能够从分析物捕获剂去除(例如，裂解)。分析物捕获剂的其它描述可见于WO2020/176788的第(II)(b)(ix)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)(viii)部分。
存在将空间条形码与一个或多个相邻细胞相关联的至少两种方法，从而使得空间条形码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容标识为与特定空间位置相关联。一种方法是促进分析物或分析物代用物(proxy)(例如，中间物)移出细胞并朝向空间条码化阵列(例如，包括空间条码化捕获探针)。另一种方法是从阵列裂解空间条码化捕获探针，并促进空间条码化捕获探针朝向生物样品和/或至生物样品中或至生物样品上。
在一些情况下，捕获探针可以用于从模板(例如，DNA或RNA模板，例如分析物或中间物(例如，连接产物或分析物捕获剂)，或其一部分)，或其衍生物，引发、复制并由此产生任选条码化的延伸产物(参见，例如，WO2020/176788的第(II)(b)(vii)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663，关于延伸的捕获探针)。在一些情况下，捕获探针可以用于与模板(例如，DNA或RNA模板，例如分析物或中间物，或其部分)形成连接产物，由此产生用作模板代用物的连接产物。
如本文所用，“延伸的捕获探针”是指具有添加到捕获探针的末端(例如，3′或5′末端)的附加核苷酸从而延伸捕获探针的总长度的捕获探针。例如，“延伸的3′端”表示附加的核苷酸被添加到捕获探针的最3′核苷酸以延伸捕获探针的长度，例如，通过用于延伸核酸分子的聚合反应，包括通过聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)催化的模板化聚合。在一些实施方式中，延伸捕获探针包括向捕获探针的3′末端添加与特异性结合捕获探针的捕获域的分析物或中间物的核酸序列互补的核酸序列。在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种DNA聚合酶延伸。延伸的捕获探针包括捕获探针的序列和捕获探针的空间条形码序列。
在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增(例如，在本体溶液中或在阵列上)以产生足以用于下游分析(例如通过DNA测序)的量。在一些实施方式中，延伸的捕获探针(例如，DNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。
在WO2020/176788的第(II)(a)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述了空间分析方法的其它变化形式，在一些实施方式中包括成像步骤。捕获的分析物(和/或中间物或其部分)的分析，例如，包括样品移出、捕获探针的延伸、测序(例如，裂解的延伸捕获探针和/或与延伸的捕获探针互补的cDNA分子的测序)、阵列上测序(例如，使用例如原位杂交或原位连接方法)、时域分析和/或邻近捕获，描述于WO2020/176788的第(II)(g)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。一些质量控制措施也描述于WO2020/176788的第(II)(h)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
空间信息可以提供具有生物学和/或医学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定疾病或病症的一种或多种生物标志物(例如，诊断、预后和/或用于确定治疗功效)；确定用于治疗疾病或病症的候选药物靶标；将对象鉴定(例如，诊断)为患有疾病或病症；鉴定对象的疾病或病症的阶段和/或预后；将对象鉴定为具有增加的发展疾病或病症的可能性；监测对象的疾病或病症的进展；确定治疗对象的疾病或病症的功效；确定治疗对疾病或病症有效的患者亚群；对患有疾病或病症的对象的治疗的修改；选择参加临床试验的对象；和/或为患有疾病或病症的对象选择治疗。
空间信息可以提供具有生物学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定转录组和/或蛋白质组表达概况(例如，在健康和/或患病组织中)；近距离鉴别多种分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中上调和/或下调的基因和/或蛋白质；肿瘤微环境的表征；肿瘤免疫反应的表征；细胞类型的表征及其在组织中的共定位；组织内遗传变异的鉴定(例如，基于与特定疾病或障碍生物标志物相关的基因和/或蛋白质表达概况)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基材起到支持捕获探针直接或间接附接到阵列特征的作用。“特征”是一个实体，作为空间分析中使用的各种分子实体的支持或存储库。在一些实施方式中，阵列中的一些或全部特征被功能化以用于分析物捕获。示例性基材描述于WO2020/176788的第(II)(c)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。阵列的示例性特征和几何属性可以在WO2020/176788的第(II)(d)(i)、(II)(d)(iii)和(II)(d)(iv)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中找到。
通常，当将生物样品与包括捕获探针的基材(例如，具有嵌入、点样、印刷、制造在基材上的捕获探针的基材，或具有包括捕获探针的特征(例如，珠、孔)的基材)接触时，分析物和/或中间物(或其部分)可被捕获。如本文所用，使生物样品“接触”基材指任何接触(例如，直接或间接)，使得捕获探针可以与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价或非共价结合(例如，杂交))。捕获可以主动(例如，使用电泳)或被动(例如，使用扩散)实现。分析物捕获进一步描述于WO2020/176788的第(II)(e)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些情况下，可以通过将具有条形码(例如空间条形码)的分子(例如肽、脂质或核酸分子)附连和/或引至生物样品(例如，引至生物样品中的细胞)来进行空间分析。在一些实施方式中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入生物样品(例如，生物样品中的多个细胞))用于空间分析。在一些实施方式中，在将具有条形码的分子附连和/或引至生物样品之后，可以将生物样品物理分离(例如，解离)成单细胞或细胞群以进行分析。一些这样的空间分析方法描述于WO2020/176788的第(III)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些情况下，空间分析可以通过检测与分析物杂交的多个寡核苷酸来进行。在一些情况下，例如，可以使用RNA模板连接(RTL)进行空间分析。RTL的方法之前已经描述过。参见例如Credle等，Nucleic Acids Res.2017年8月21日；45(14)：e128。通常，RTL包括两个寡核苷酸与分析物(例如，RNA分子，例如mRNA分子)上的相邻序列的杂交。在一些情况下，寡核苷酸是DNA分子。在一些情况下，寡核苷酸之一在3′末端包括至少两个核糖核酸碱基和/或另一寡核苷酸在5′末端包括磷酸化核苷酸。在一些情况下，两个寡核苷酸之一包括捕获域(例如，聚(A)序列、非均聚序列)。在与分析物杂交后，连接酶(例如，SplintR连接酶)将两个寡核苷酸连接在一起，产生连接产物。连接产物可以作为靶核酸的代用物。例如，靶核酸的代用物(例如，连接产物)可包括能结合(例如，杂交)到捕获探针的捕获域的分析物捕获序列。在一些情况下，两个寡核苷酸与彼此不相邻的序列杂交。例如，两个寡核苷酸的杂交在杂交的寡核苷酸之间产生间隙。在一些情况下，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在连接之前延伸寡核苷酸之一。连接后，连接产物(例如，靶核酸的代用物)从分析物释放。在一些情况下，利用核酸内切酶(例如，RNA酶H)释放连接产物。释放的连接产物然后可以被阵列上的捕获探针(例如，代替分析物的直接捕获)捕获，任选地被扩增和测序，从而确定生物样品中分析物的位置和任选地丰度。
在空间信息分析期间，获得与分析物相关联的空间条形码的序列信息，并且该序列信息可用于提供关于分析物在生物样品中的空间分布的信息。可以使用各种方法来获得空间信息。在一些实施方式中，特定捕获探针和它们捕获的分析物与基材上特征阵列中的特定位置相关联。例如，特定空间条形码可以在阵列制造之前与特定阵列位置相关联，并且空间条形码的序列可以与特定阵列位置信息一起存储(例如，在数据库中)，从而使得每个空间条形码唯一地映射到特定的阵列位置。
或者，特定空间条形码可以在制造期间沉积在特征阵列中的预定位置，从而使得在每个位置，仅存在一种类型的空间条形码，由此空间条形码与阵列的单个特征独特地相关联。必要时，可以使用本文所述的任何方法对阵列进行解码，以便空间条形码与阵列特征位置独特地相关联，并且可以如上所述存储该映射。
当在空间信息分析期间获得捕获探针和/或分析物的序列信息时，可以通过参考存储的将每个空间条形码与阵列特征位置独特关联的信息来确定捕获探针和/或分析物的位置。以此方式，特定捕获探针和捕获分析物与特征阵列中的特定位置相关联。各阵列特征位置表示相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标志物)的位置。因此，各特征位置在阵列的坐标空间中具有“地址”或位置。
一些示例性空间分析工作流程描述于WO2020/176788的示例性实施方式部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。参见例如WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的以“在本文描述的工作流程的一些非限制性示例中，可以将样品浸入......”开头的示例性实施方式。还参见，例如，Visium空间基因表达试剂盒用户指南(Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年6月)，和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(Visium Spatial TissueOptimization Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年7月)。
在一些实施方式中，可以使用专用硬件和/或软件来进行空间分析，例如WO2020/176788的第(II)(e)(ii)和/或(V)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的任何系统，或在WO2020/123320的用于成像的控制载玻片、使用控制载玻片和基材的方法、使用用于成像的控制载玻片和基材的系统和/或样品和阵列对齐装置和方法、信息标签中描述的任何一种或多种装置或方法。
用于执行空间分析的合适系统可以包括部件，例如用于容纳生物样品的室(例如，流动池或可密封的流体密封室)。生物样品可以被固定在例如生物样品容器中。一个或多个流体室可以通过流体导管连接到室和/或样品容器，并且可以通过流体泵、真空源或连接到流体导管的其它装置(产生压强梯度以驱动流体流)将流体输送到室和/或样品容器中。一个或多个阀也可以连接到流体导管以调节试剂从储器到室和/或样品容器的流动。
系统可以任选地包括控制单元，该控制单元包括一个或多个电子处理器、输入接口、输出接口(例如显示器)和存储单元(例如固态存储介质，例如但不限于，磁性、光学或其它固态、持久性、可写和/或可重写存储介质)。控制单元可以任选地通过网络连接到一个或多个远程设备。控制单元(及其组件)通常可以执行本文描述的任何步骤和功能。在系统连接到远程设备的情况下，远程设备(或多个设备)可以执行本文描述的任何步骤或特征。该系统可以任选地包括用于捕获图像的一个或多个检测器(例如，CCD、CMOS)。该系统还可以任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED、基于二极管、激光器)、具有特征的基材、来自捕获在基材上的生物样品的分析物以及各种控制和校准介质。
系统可以可选地包括在一种或多种有形存储介质和硬件组件(例如专用集成电路)中编码和/或实现的软件指令。软件指令在由控制单元(尤其是电子处理器)或集成电路执行时，可以使控制单元、集成电路或其它执行软件指令的组件执行本文所述的任何方法步骤或功能。
在一些情况下，本文描述的系统可以检测(例如配准图像)阵列上的生物样品。检测阵列上的生物样品的示例性方法描述于PCT申请号2020/061064和/或美国专利申请序列号16/951,854。
在将分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列之前，可以将生物样品与阵列对齐。生物样品和包括捕获探针的特征阵列的对齐可以促进空间分析，这可以用于检测生物样品中不同位置内分析物存在和/或水平的差异，例如，生成分析物的存在和/或水平的三维图。用于生成分析物存在和/或水平的二维和/或三维图的示例性方法描述于PCT申请号2020/053655中，空间分析方法一般描述于WO2020/061108和/或美国专利申请序列号16/951,864中。
在一些情况下，可以使用一个或多个基准标志物将分析物存在和/或水平的图与生物样品的图像对齐，例如，放置在成像系统视野中的物体出现在产生的图像中，如WO2020/123320的基材属性部分、用于成像的控制载玻片部分、PCT申请号2020/061066和/或美国专利申请序列号16/951,843中所述。基准标志物可被用作对准的参考点或测量标度(例如，以对准样品和阵列、以对准两个基材、以确定基材上样品或阵列相对于基准标志物的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。
固定生物样品的空间分析
生物样品的保存是有用的，因为保存可以保持生物样品的细胞形态和细节。保存生物样品还可以创建一个存档库，可以对其进行进一步检查或回顾性询问。已知不同类型的保存方法，包括例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)固定和多聚甲醛固定(PFA)。
固定(例如，FFPE、PFA)处理的生物样品是有利的，因为它们可以在环境条件(例如，室温)下长期(例如，数年)储存，从而降低与在超低温下储存生物样品(例如，冷冻组织)相关联的成本。此外，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以在对提取的分析物(例如，核酸、蛋白质等)的数量和/或质量没有显著影响的情况下长期(例如，数年)储存(参见Kokkat，T.J.等，存档的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块：用于提取DNA、RNA和蛋白质的宝贵未开发资源(Archived Formalin-Fixed Paraffin-Embedded(FFPE)Blocks：A ValuableUnderexploited Resource for Extraction of DNA，RNA，and Protein)，BiopreservBiobank，11(2)，101-106，10.1089/bio.2012.0052(2013))。
本文提供了用于确定存在于固定(例如，FFPE、PFA)生物样品中的分析物的位置的方法。虽然可及固定(例如，FFPE、PFA)生物样品中的分析物(例如，RNA)，但高效地从固定(例如，FFPE、PFA)生物样品中捕获和/或扩增分析物以进行空间分析可能会存在挑战。例如，由于与其它分析物(例如核酸、蛋白质等)的交联(例如甲醛诱导的交联)，固定(例如FFPE、PFA)生物样品中的RNA(例如mRNA)通常无法用于空间分析。在另一示例中，可以改变分析物(例如，mRNA)，从而使得mRNA不具有多聚(A)尾或可能缺少多聚(A)尾。此类改变可能源于保存过程中的转录本片段化、降解和/或甲醛修饰(Evers，D.L.等，甲醛固定对RNA的影响：甲醛加合物去除的优化(The effect of formaldehyde fixation on RNA：optimization of formaldehyde adduct removal)，J.Mol Diagn.13(3)：282-8，doi：10.1016/j.jmoldx.2011.01.010(2011))，其通过引用方式纳入本文)。
因此，使用本文所述的空间阵列的此类分析物(例如，mRNA)的捕获和/或扩增效率可因任何上述原因而降低。本文提供了用于提高FFPE生物样品中分析物(例如，核酸、本文所述的任何核酸分析物)的捕获和/或扩增效率的方法。
本文提供了用于确定靶核酸在固定(例如，FFPE、多聚甲醛、丙酮、甲醇)生物样品中的位置的方法，包括：使FFPE生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中多个捕获探针的捕获探针包括空间条形码和捕获域；使固定(例如，FFPE、多聚甲醛)生物样品中的一种或多种交联物去交联，从而使得捕获域特异性结合至靶核酸；延伸捕获探针以添加与靶核酸的部分互补的序列；产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和对应于靶核酸中的部分序列的核酸序列；和，确定空间条形码序列的全部或部分或其互补物，以及靶核酸序列的部分的全部或部分或其互补物，并采用空间条形码序列的全部或部分或其互补物和靶核酸序列的部分的全部或部分或其互补物的确定的序列来鉴定靶核酸在固定(例如，FFPE、多聚甲醛)生物样品中的位置。
本文还提供了用于确定靶核酸在多聚甲醛(PFA)生物样品中的位置的方法，包括(a)使PFA生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获域，(b)使PFA生物样品中的一种或多种多聚甲醛交联物去交联，从而使得捕获域特异性结合至靶核酸，(c)延伸捕获探针以产生与靶核酸的部分互补的核酸序列，(d)产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和对应于靶核酸中的部分序列的核酸序列，和(e)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸序列的部分的全部或部分或其互补物，并采用(i)和(ii)的确定的序列来鉴定靶核酸在PFA生物样品中的位置。
图1是示出如本文所述的捕获探针的示例的示意图。如图所示，捕获探针102任选地通过可裂解接头103(例如光可裂解接头)偶联至特征101。捕获探针可包括对后续处理有用的功能性序列，例如功能性序列104，其可包括测序仪特异性流动池附接序列，例如P5或P7序列，以及功能性序列105，其可包括测序引物序列，例如R1引物结合位点、R2引物结合位点。在一些实施方式中，序列104是P7序列，序列105是R2引物结合位点。空间条形码106可包括在捕获探针内以用于对目标分析物条码化。通常可选择功能性序列以与各种不同测序系统中的任何一种兼容，例如离子激流质子(Ion Torrent Proton)或PGM、Illumina测序仪、PacBio、牛津纳米孔(Oxford Nanopore)等及其要求。在一些实施方式中，可选择功能性序列以与非商业化测序系统兼容。可使用适当功能性序列的此类测序系统和技术的示例包括(但不限于)离子激流质子或PGM测序、Illumina测序、PacBio SMRT测序和牛津纳米孔测序。此外，在一些实施方式中，可以选择功能性序列以与其他测序系统(包括非商业化测序系统)兼容。
在一些实施方式中，空间条形码106、功能性序列104(例如，流动池附接序列)和105(例如，测序引物序列)可以是附接到给定特征的所有探针所共用的。空间条形码还可包括捕获域107以促进目标分析物的捕获。可以包括其它元件，例如独特分子标识符、其它引物位点等，例如位于空间条形码106和捕获域107之间。
去交联
在一些实施方式中，可以通过在合适的溶剂(例如，二甲苯)中孵育生物样品，然后进行一系列漂洗(例如，不同浓度的乙醇)，并在水中再水合，来从生物样品(例如，组织切片)去除石蜡包埋的材料(例如，脱石蜡)。在一些实施方式中，生物样品可以在脱石蜡后干燥。在一些实施方式中，在干燥生物样品的步骤之后，可以对生物样品进行染色(例如，H&E染色剂，本文所述的各种染色剂中的任何一种)。在一些实施方式中，在对生物样品进行染色之后，可以对样品进行成像。
在固定(例如，FFPE、PFA、丙酮、甲醇)生物样品经历脱石蜡后，可以进一步处理固定(例如，FFPE、PFA)生物样品。例如，可以处理固定(例如，FFPE、PFA)生物样品以去除交联物(例如，甲醛诱导的交联物(例如，去交联))。在一些实施方式中，使固定(例如，FFPE、PFA)生物样品中的交联物(例如，甲醛诱导的交联物)去交联可以包括热处理样品。在一些实施方式中，使甲醛诱导的交联物去交联可以包括进行化学反应。在一些实施方式中，使甲醛诱导的交联物去交联可以包括用透化试剂处理样品。在一些实施方式中，使甲醛诱导的交联物去交联可以包括热、化学反应和/或透化试剂。
在一些实施方式中，可以在缓冲液的存在下进行交联物(例如，甲醛诱导的交联物)的去交联。在一些实施方式中，缓冲液是Tris-EDTA(TE)缓冲液(例如，用于FFPE生物样品的TE缓冲液)。在一些实施方式中，缓冲液是Tris-HCl缓冲液(例如，用于PFA固定生物样品的Tris-HCl缓冲液)。在一些实施方式中，缓冲液(例如，TE缓冲液、Tris-HCl缓冲液)具有的pH为约7.0至约10.0，约7.0至约9.9，约7.0至约9.8，约7.0至约9.7，约7.0至约9.6，约7.0至约9.5，约7.0至约9.4，约7.0至约9.3，约7.0至约9.2，约7.0至约9.1，约7.0至约9.0，约7.0至约8.9，约7.0至约8.8，约7.0至约8.7，约7.0至约8.6，约7.0至约8.5，约7.0至约8.4，约7.0至约8.3，约7.0至约8.2，约7.0至约8.1，约7.0至约8.0，约7.0至约7.9，约7.0至约7.8，约7.0至约7.7，约7.0至约7.6，约7.0至约7.5，约7.0至约7.4，约7.0至约7.3，约7.0至约7.2，约7.1至约10.0，约7.2至约9.6，约7.2至约9.5，约7.2至约9.4，约7.2至约9.3，约7.2至约9.2，约7.2至约9.1，约7.2至约9.0，约7.2至约8.9，约7.2至约8.8，约7.2至约8.7，约7.2至约8.6，约7.2至约8.5，约7.2至约8.4，约7.2至约8.3，约7.2至约8.2，约7.2至约8.1，约7.2至约8.0，约7.2至约7.9，约7.2至约7.8，约7.2至约7.7，约7.2至约7.6，约7.2至约7.5，约7.2至约7.4，约7.4至约10.0，约7.4至约9.9，约7.4至约9.8，约7.4至约9.7，约7.4至约9.6，约7.4至约9.5，约7.4至约9.4，约7.4至约9.3，约7.4至约9.2，约7.4至约9.1，约7.4至约9.0，约7.4至约8.9，约7.4至约8.8，约7.4至约8.7，约7.4至约8.6，约7.4至约8.5，约7.4至约8.4，约7.4至约8.3，约7.4至约8.2，约7.4至约8.1，约7.4至约8.0，约7.4至约7.9，约7.4至约7.8，约7.4至约7.7，约7.4至约7.6，约7.6至约10.0，约7.6至约9.9，约7.6至约9.8，约7.6至约9.7，约7.6至约9.6，约7.6至约9.5，约7.6至约9.4，约7.6至约9.3，约7.6至约9.2，约7.6至约9.1，约7.6至约9.0，约7.6至约8.9，约7.6至约8.8，约7.6至约8.7，约7.6至约8.6，约7.6至约8.5，约7.6至约8.4，约7.6至约8.3，约7.6至约8.2，约7.6至约8.1，约7.6至约8.0，约7.6至约7.9，约7.6至约7.8，约7.8至约10.0，约7.8至约9.9，约7.8至约9.8，约7.8至约9.7，约7.8至约9.6，约7.8至约9.5，约7.8至约9.4，约7.8至约9.3，约7.8至约9.2，约7.8至约9.1，约7.8至约9.0，约7.8至约8.9，约7.8至约8.8，约7.8至约8.7，约7.8至约8.6，约7.8至约8.5，约7.8至约8.4，约7.8至约8.3，约7.8至约8.2，约7.8至约8.1，约7.8至约8.0，约7.9至约10.0，约7.9至约9.9，约7.9至约9.8，约8.0至约10.0，约8.0至约9.9，约8.0至约9.8，约8.0至约9.7，约8.0至约9.6，约8.0至约9.5，约8.0至约9.4，约8.0至约9.3，约8.0至约9.2，约8.0至约9.1，8.0至约9.0，约8.0至约8.9，约8.0至约8.8，约8.0至约8.7，约8.0至约8.6，约8.0至约8.5，约8.0至约8.4，约8.0至约8.3，约8.0至约8.2，约8.1至约10.0，约8.2至约9.9，约8.2至约9.8，约8.2至约9.7，约8.2至约9.6，约8.2至约9.5，约8.2至约9.4，约8.2至约9.3，约8.2至约9.2，约8.2至约9.1，约8.2至约9.0，约8.2至约8.9，约8.2至约8.8，约8.2至约8.7，约8.2至约8.6，约8.2至约8.5，约8.2至约8.4，约8.4至约10.0，约8.4至约9.9，约8.4至约9.8，约8.4至约9.7，约8.4至约9.6，约8.4至约9.5，约8.4至约9.4，约8.4至约9.3，约8.4至约9.2，约8.4至约9.1，约8.4至约9.0，约8.4至约8.9，约8.4至约8.8，约8.4至约8.7，约8.4至约8.6，约8.6至约10.0，约8.6至约9.9，约8.6至约9.8，约8.6至约9.7，约8.6至约9.6，约8.6至约9.5，约8.6至约9.4，约8.6至约9.3，约8.6至约9.2，约8.6至约9.1，约8.6至约9.0，约8.6至约8.9，约8.6至约8.8，约8.8至约10.0，约8.8至约9.9，约8.8至约9.8，约8.8至约9.7，约8.8至约9.6，约8.8至约9.5，约8.8至约9.4，约8.8至约9.3，约8.8至约9.2，约8.8至约9.1，约8.8至约9.0，约8.9至约10.0，约8.9至约9.9，约8.9至约9.8，约8.9至约9.7，约8.9至约9.6，约8.9至约9.5，约8.9至约9.4，约8.9至约9.3，约8.9至约9.2，或约8.9至约9.1。
在一些实施方式中，TE缓冲液(例如，用于FFPE生物样品的TE缓冲液)的温度为约60℃至约80℃，60℃至约78℃，约60℃至约76℃，约60℃至约74℃，约60℃至约72℃，约60℃至约70℃，约60℃至约68℃，约60℃至约66℃，约60℃至约64℃，约60℃至约62℃，约62℃至约80℃，62℃至约78℃，约62℃至约76℃，约62℃至约74℃，约62℃至约72℃，约62℃至约70℃，约62℃至约68℃，约62℃至约66℃，约62℃至约64℃，约64℃至约80℃，64℃至约78℃，约64℃至约76℃，约64℃至约74℃，约64℃至约72℃，约64℃至约70℃，约64℃至约68℃，约64℃至约66℃，约66℃至约80℃，66℃至约78℃，约66℃至约76℃，约66℃至约74℃，约66℃至约72℃，约66℃至约70℃，约66℃至约68℃，约68℃至约80℃，68℃至约78℃，约68℃至约76℃，约68℃至约74℃，约68℃至约72℃，约68℃至约70℃，约70℃至约80℃，70℃至约78℃，约70℃至约76℃，约70℃至约74℃，约70℃至约72℃，约72℃至约80℃，72℃至约78℃，约72℃至约76℃，约72℃至约74℃，约74℃至约80℃，74℃至约78℃，约74℃至约76℃，约76℃至约80℃，76℃至约78℃，或约78℃至约80℃。
在一些实施方式中，Tris-HCl缓冲液(例如，用于PFA固定生物样品的Tris-HCl缓冲液)的温度为约50℃至约70℃，约50℃至约68℃，约50°至约66℃，约50℃至约64°，约50°至约62℃，约50℃至约60℃，约50℃至约58℃，约50℃至约56℃，约50℃至约54℃，约50℃至约52℃，约52℃至约70℃，约52℃至约68℃，约52℃至约66℃，约52℃至约64℃，约52℃至约62°，约52℃至约60℃，约52℃至约58℃，约52℃至约56℃，约52℃至约54℃，约54℃至约70℃，约54℃至约68℃，约54℃至约66℃，约54℃至约64℃，约54℃至约62℃，约54℃至约60℃，约54℃至约58℃，约54℃至约56°，约56℃至约70℃，约56℃至约68℃，约56℃至约66℃，约56℃至约64℃，约56℃至约62℃，约56℃至约60°，约56℃至约58℃，约58℃至约70℃，约58℃至约68℃，约58℃至约66℃，约58℃至约64℃，约58℃至约62℃℃，约58℃至约60℃，约60℃至约70℃，约60℃至约68℃，约60℃至约66℃，约60℃至约64℃，约60℃至约62℃，约62℃至约70℃，约62℃至约68℃，约62℃至约66℃，约62℃至约64℃，约64℃至约70℃，约64℃至约68℃，约64℃至约66℃，约66℃至约70℃，约66℃至约68℃，或约68℃至约70℃。
在一些实施方式中，固定生物样品可以与缓冲液接触。在一些实施方式中，PFA固定生物样品可以与Tris-HCl缓冲液接触。在一些实施方式中，FFPE生物样品可以与TE缓冲液接触。在一些实施方式中，FFPE生物样品可以与TE缓冲液接触且PFA固定生物样品可以与Tris-HCl缓冲液接触约10分钟至约200分钟，约10分钟至约190分钟，约10分钟至约180分钟，约10分钟至约170分钟，约10分钟至约160分钟，约10分钟至约150分钟，约10分钟至约140分钟，约10分钟至约130分钟，约10分钟至约120分钟，约10分钟至约110分钟，约10分钟至约100分钟，约10分钟至约90分钟，约10分钟至约80分钟，约10分钟至约70分钟，约10分钟至约65分钟，约10分钟至约60分钟，约10分钟至约55分钟，约10分钟至约50分钟，约10分钟至约40分钟，约10分钟至约30分钟，约10分钟至约20分钟，约20分钟至约120分钟，约20分钟至约110分钟，约20分钟至约100分钟，约20分钟至约90分钟，约20分钟至约80分钟，约20分钟至约70分钟，约20分钟至约65分钟，约20分钟至约60分钟，约20分钟至约55分钟，约20分钟至约50分钟，约20分钟至约40分钟，约20分钟至约30分钟，约30分钟至约120分钟，约30分钟至约110分钟，约30分钟至约100分钟，约30分钟至约90分钟，约30分钟至约80分钟，约30分钟至约70分钟，约30分钟至约65分钟，约30分钟至约60分钟，约30分钟至约55分钟，约30分钟至约50分钟，约30分钟至约40分钟，约40分钟至约120分钟，约40分钟至约110分钟，约40分钟至约100分钟，约40分钟至约90分钟，约40分钟至约80分钟，约40分钟至约70分钟，约40分钟至约65分钟，约40分钟至约60分钟，约40分钟至约55分钟，约40分钟至约50分钟，约50分钟至约120分钟，约50分钟至约110分钟，约50分钟至约100分钟，约50分钟至约90分钟，约50分钟至约80分钟，约50分钟至约70分钟，约50分钟至约65分钟，约50分钟至约60分钟，约50分钟至约55分钟，约55分钟至约120分钟，约55分钟至约110分钟，约55分钟至约100分钟，约55分钟至约90分钟，约55分钟至约80分钟，约55分钟至约70分钟，约55分钟至约65分钟，约55分钟至约60分钟，约60分钟至约200分钟，约60分钟至约120分钟，约60分钟至约110分钟，约60分钟至约100分钟，约60分钟至约90分钟，约60分钟至约80分钟，约60分钟至约70分钟，约60分钟至约65分钟，约65分钟至约120分钟，约65分钟至约110分钟，约65分钟至约100分钟，约65分钟至约90分钟，约65分钟至约80分钟，约65分钟至约70分钟，约70分钟至约200分钟，约70分钟至约190分钟，约70分钟至约180分钟，约70分钟至约170分钟，约70分钟至约160分钟，约70分钟至约150分钟，约70分钟至约140分钟，约70分钟至约130分钟，或约70分钟至约120分钟。
在一些实施方式中，FFPE生物样品可以与温度为约65℃至约75℃的TE缓冲液接触，并与FFPE生物样品接触约30分钟至约90分钟。在一些实施方式中，TE缓冲液可以具有约70℃的温度、约8.0的pH，并且可以与FFPE生物样品接触约60分钟。
在一些实施方式中，PFA固定生物样品可以与温度为约55℃至约65℃、pH为约8.5至9.5的Tris-HCl缓冲液接触，并与PFA固定的样品接触约30-90分钟。在一些实施方式中，Tris-HCl缓冲液具有约60℃的温度、约9.0的pH，并与PFA固定生物样品接触60分钟。
在对FFPE生物样品(例如FFPE组织切片)中的交联物进行去交联(例如，对甲醛或多聚甲醛交联物进行去交联)之后，生物样品可以被透化(例如，通过本文所述的各种方法中的任何一种来透化)。在一些实施方式中，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以用蛋白酶透化。在一些实施方式中，蛋白酶可以是胃蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶可以是蛋白酶K。在一些实施方式中，蛋白酶可以是胃蛋白酶和蛋白酶K。在一些实施方式中，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以用蛋白酶透化约10分钟至约90分钟(例如，约10分钟至约80分钟，约10分钟至约70分钟，约10分钟至约60分钟，约10分钟至约50分钟，约10分钟至约40分钟，约10分钟至约30分钟，约10分钟至约20分钟，约20分钟至约90分钟，约20分钟至约80分钟，约20分钟至约70分钟，约20分钟至约60分钟，约20分钟至约50分钟，约20分钟至约40分钟，约20分钟至约30分钟，约30分钟至约90分钟，约30分钟至约80分钟，约30分钟至约70分钟，约30分钟至约60分钟，约30分钟至约50分钟，约30分钟至约40分钟，约40分钟至约90分钟，约40分钟至约80分钟，约40分钟至约70分钟，约40分钟至约60分钟，约40分钟至约50分钟，约50分钟至约90分钟，约50分钟至约80分钟，约50分钟至约70分钟，或约50分钟至约60分钟)。
固定(例如，FFPE、PFA)生物样品的透化优选发生在基材上，例如包括多个捕获探针(例如，阵列)的基材。例如，可以将固定(例如，FFPE、PFA)生物样品施加于本文所述的各种阵列中的任何一种。在一些实施方式中，多个捕获探针中的附加捕获探针以5′至3′方向包括空间条形码和多聚(T)捕获域。例如，多种捕获探针可以包括具有随机核酸捕获域的一个或多个捕获探针和具有多聚(T)捕获域的一个或多个捕获探针。在一些实施方式中，捕获探针可以包括一个或多个功能域和/或裂解域。功能域通常包括用于整个分析过程中下游分析步骤的功能性核苷酸序列。在一些实施方式中，功能域可以包括测序柄。在一些实施方式中，功能域可以包括PCR柄。在一些实施方式中，捕获探针可以包括本文所述的独特分子标识符。在一些实施方式中，独特分子标识符位于捕获探针中捕获域的5′。在一些实施方式中，多聚(T)捕获域可以捕获靶核酸。在一些实施方式中，靶核酸是DNA。在一些实施方式中，靶核酸是RNA(例如，本文所述的任何RNA分析物)。在一些实施方式中，RNA是mRNA。
在一些实施方式中，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以在分析物(例如，结合至捕获探针的分析物)逆转录(例如，延伸捕获探针的3′端)之前与核酸外切酶孵育。生物样品中存在的游离单链DNA分子可以被消化以减少捕获探针对单链DNA分子的捕获。例如，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以在分析物(例如，结合至捕获探针的分析物)的逆转录之前与5′至3′单链DNA核酸外切酶一起孵育。捕获探针通过它们的5′末端与基材或特征结合，因此受到保护而不被5′至3′核酸外切酶消化。在一些实施方式中，5′至3′核酸外切酶是T7核酸外切酶。在一些实施方式中，5′至3′核酸外切酶是RecJ核酸外切酶。或者或另外，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以在逆转录之前与双链DNA核酸内切酶一起孵育。在一些实施方式中，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以与5′至3′核酸外切酶和双链DNA核酸内切酶一起孵育。
在一些实施方式中，在分析物(例如，结合至捕获探针的分析物)的逆转录(例如，捕获探针3′端的延伸)之后，延伸的捕获探针可以与标记的(例如，用本文所述的任何可检测标记物标记的)与延伸的捕获探针基本上互补的核酸或其部分接触。在一些实施方式中，标记的核酸可以结合(例如杂交)至延伸的捕获探针。在一些实施方式中，可以检测标记的核酸(例如，用可检测的标记物标记的)以鉴定靶核酸在固定(例如，FFPE、PFA)生物样品中的位置。
第二链合成
在一些实施方式中，分析物(例如，与捕获探针结合的分析物)的逆转录可以在放线菌素D的存在下进行。放线菌素D可以特异性地抑制逆转录酶的DNA依赖性DNA聚合酶活性。可以用本文所述的多种逆转录酶中的任何一种以及通过本文所述的任何方法进行逆转录。在一些实施方式中，在逆转录期间，逆转录酶可以将均聚核苷酸序列添加至延伸的捕获探针的3′端。在一些实施方式中，在逆转录(例如，延伸捕获探针)期间，逆转录酶可以将多聚(C)序列添加至延伸的捕获探针的3′端。在一些实施方式中，可以在dCTP存在下通过末端转移酶(例如，TdT)添加多聚(C)序列。在一些实施方式中，末端转移酶可以是末端脱氧核苷酸转移酶。在一些实施方式中，可以在去除FFPE生物样品之后添加多聚(C)序列。
在一些实施方式中，可以向FFPE生物样品提供与添加的多聚(C)序列互补的模板转换寡核苷酸(例如，本文所述的模板转换寡核苷酸)。在一些实施方式中，功能域(例如，测序或PCR柄)可以被连接至附加多聚(C)序列的3′端。在一些实施方式中，测序柄可以用夹板寡核苷酸连接至附加的多聚(C)序列(例如，添加至捕获探针的多聚(C)序列)的3′端。连接酶可以是本文所述的任何连接酶。在一些实施方式中，连接酶是T4 DNA连接酶(Gansaunge，M.T.，使用T4 DNA连接酶从高度降解的DNA制备单链DNA文库(Single-stranded DNAlibrary preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase)，NucleicAcids Research，45，10e79 doi：10.1093narlgkx033(2017)，其通过引用纳入本文)。例如，部分双链夹板寡核苷酸可包括具有功能域(例如，测序或PCR柄)的第一寡核苷酸和在5′到3′方向上包括以下的第二寡核苷酸：能特异性结合至捕获探针的添加的多聚(C)序列的多聚(G)序列和与功能域(例如，测序柄)基本上互补的单链部分。在一些实施方式中，部分双链夹板寡核苷酸的第二寡核苷酸可以具有5′突出端(例如，单链部分)，其包括多聚(G)序列的至少部分。在一些实施方式中，可以通过DNA聚合酶延伸反应将功能域(例如测序或PCR柄)添加至附加的均聚核苷酸序列(例如多聚(C)序列)的3′端。
在一些实施方式中，在将功能域(例如，测序或PCR柄)连接至捕获探针的3′端(例如，将测序柄连接至附加的多聚(C)序列)或通过DNA聚合酶延伸反应添加功能域之后，夹板寡核苷酸的第二寡核苷酸可以与具有连接的功能域(例如，测序或PCR柄)的捕获探针解离。在一些实施方式中，第二寡核苷酸可以与氢氧化钾(KOH)解离。在一些实施方式中，与捕获探针的测序柄基本上互补的引物可以与测序柄杂交并延伸以产生第二链。
在一些实施方式中，在逆转录产生与延伸的捕获探针杂交的第二链(其包括与空间条形码互补的序列和靶核酸的序列或其部分)之后，可将衔接子直接连接至捕获探针(例如，延伸的捕获探针)的3′端。在一些实施方式中，衔接子可以包括功能域(例如，测序或PCR柄)。在一些实施方式中，与衔接子的功能域基本上互补的引物可以与测序柄杂交并延伸以产生第二链。
在一些实施方式中，在产生与延伸的捕获探针杂交的第二链(其包括与空间条形码互补的序列和靶核酸的序列或其部分)的逆转录之后，可使衔接子(例如，5′腺苷酸化衔接子)连接至捕获探针(例如，延长的捕获探针)的3′端。在一些实施方式中，衔接子是5′腺苷酸化衔接子。在一些实施方式中，衔接子可以包含5′磷酸。在一些实施方式中，5′腺苷酸化衔接子可以用连接酶连接。在一些实施方式中，连接酶是单链RNA连接酶。在一些实施方式中，连接酶是单链DNA连接酶。在一些实施方式中，连接酶是T4 RNA连接酶2。在一些实施方式中，连接酶是5′App DNA/RNA连接酶(参见，Hafner，M.等，使用cDNA文库测序鉴定微小RNA和其他小调节RNA(Identification of microRNAs and other small regulatoryRNAs using cDNA library sequencing)，Methods 44(1)：3-12doi：10.1016/j.ymeth.2007.09.009(2008)，其通过引用方式纳入本文)。在一些实施方式中，5′腺苷酸化衔接子可以包括功能域(例如，测序或PCR柄)。在一些实施方式中，与5′腺苷酸化衔接子中的功能域基本上互补的引物可以与功能域(例如测序或PCR柄)杂交并延伸以产生第二链。
在一些实施方式中，在产生与延伸的捕获探针杂交的第二链(其包括与空间条形码互补的序列和靶核酸的序列或其部分)的逆转录之后，可以添加多聚(A)序列至捕获探针(例如，延伸的捕获探针)的末端，并且衔接子可以被连接至捕获探针中多聚(A)序列的3′端(例如，TdT辅助的腺苷酸连接子介导的单链DNA连接(TACS连接))。在一些实施方式中，多聚(A)序列可以是核糖核酸序列。在一些实施方式中，多聚(A)序列可以在ATP存在的情况下用末端转移酶(例如末端脱氧核苷酸转移酶)添加至捕获探针的3′端(Boule，J.等，末端脱氧核苷酸转移酶不加选择地掺入核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase Indiscriminately Incorporates Ribonucleotidesand Deoxyribonucleotides)，The Journal of Biological Chemistry，276，31388-31393，doi：10.1074/jbc.M105272200(2001)，其通过引用纳入本文)。例如，捕获探针(例如，延伸的捕获探针)包括DNA(例如，通过逆转录产生的cDNA)，然后是RNA序列(例如，多聚(A)RNA序列)。在一些实施方式中，将衔接子连接至核糖核酸多聚(A)序列可以用RNA连接酶进行(Miura，F.等，高效的单链DNA连接技术通过亚硫酸氢盐后接头标记改进低输入全基因组亚硫酸氢盐测序(Highly efficient single-stranded DNA ligation techniqueimproves low-input whole-genome bisulfite sequencing by post-bisulfiteadaptor tagging)，Nucleic Acids Research，47，15e85 doi：10.1093/narlgkz435(2019)，其通过引用纳入本文)。在一些实施方式中，可以使用CircLigase将衔接子连接至多聚(A)序列。在一些实施方式中，衔接子可以包括功能域(例如，测序或PCR柄)。在一些实施方式中，与衔接子中的功能域(例如，测序或PCR柄)基本上互补的引物可以与功能域(例如，测序或PCR柄)杂交并延伸以产生第二链。在一些实施方式中，延伸引物以产生第二链可以用能够加工作为底物的RNA碱基的DNA聚合酶来进行。在一些实施方式中，DNA聚合酶可以是Taq聚合酶。在一些实施方式中，Taq聚合酶是衍生的或修饰的Taq-聚合酶。
在一些实施方式中，在逆转录后，产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其包括与空间条形码互补的序列和靶核酸的序列或其部分。在一些实施方式中，第二链通过杂交包括随机序列和功能域的一种或多种引物而产生。在一些实施方式中，可以在已从阵列移除固定生物样品之后进行包含随机序列和功能域的一种或多种引物的杂交。在一些实施方式中，功能域包括模板转换寡核苷酸(TSO)序列，后跟随机序列。在一些实施方式中，功能域之后是包含SEQ ID NO：4的随机序列。在一些实施方式中，功能域之后是包含SEQ ID NO：5的随机序列。在一些实施方式中，包括功能域后跟随机序列的引物(例如本文所述的任何引物)可以产生与模板转换寡核苷酸组合的第二链。例如，与TSO互补的序列可以在逆转录过程中掺入延伸的捕获探针中，并且可以使用TSO引物和包括功能域后跟随机序列的引物的组合来产生第二链。
在一些实施方式中，随机序列可以与捕获探针(例如，延伸的捕获探针)中与随机序列基本上互补的序列杂交。在一些实施方式中，随机序列可以是约6个核苷酸、约7个核苷酸、约8个核苷酸、约9个核苷酸或约10个核苷酸。在一些实施方式中，功能域可以包括测序柄。在一些实施方式中，功能域可以包括PCR柄。在一些实施方式中，与捕获探针(例如，延伸的捕获探针)杂交的一种或多种探针可以被延伸以产生第二链(Hughes，T.K.，高效、大规模并行的单细胞RNA-Seq揭示人类皮肤病理学的细胞状态和分子特征(Highly Efficient，Massively-Parallel Single-Cell RNA-Seq Reveals Cellular States and MoleculeFeatures of Human Skin Pathology)，doi：https：//doi.org/10.1101/689273(2019))。在一些实施方式中，与捕获探针杂交的一种或多种探针可以用链置换聚合酶延伸。在一些实施方式中，链置换聚合酶可以是K1enow片段。
在一些实施方式中，产生第二链可以在约30℃至约40℃的温度进行。在一些实施方式中，产生第二链可以在约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃，或约39℃的温度进行。
在一些实施方式中，可以在进行逆转录后用一种或多种限制性核酸内切酶处理FFPE生物样品。逆转录过程使用捕获的靶核酸作为模板延伸捕获探针的3′端。在一些实施方式中，包含随机核酸捕获域的捕获探针可以非特异性地捕获核酸(例如，RNA和/或DNA)。在一些实施方式中，在逆转录之后，延伸的捕获探针可以包含DNA-RNA(例如，捕获的RNA)双链分子和DNA-DNA(例如，捕获的DNA)双链分子。在一些实施方式中，在逆转录反应之后，由非特异性捕获的核酸(例如，基因组DNA)产生的DNA-DNA双链分子可以被消化。在一些实施方式中，DNA-DNA双链分子可以用具有富含AT的限制性核酸内切酶识别序列的一种或多种限制性核酸内切酶消化(例如，片段化)。例如，具有富含AT的识别序列的限制性核酸内切酶的一些非限制性示例包括HindIII、Ssp1、EcoR1和MfeI。
在一些实施方式中，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以是FFPE组织切片。在一些实施方式中，固定生物样品是PFA固定的组织切片。在一些实施方式中，可以对固定(例如，FFPE、PFA)生物样品进行成像(例如，通过本文所述的任何方法进行成像)。
在本文提供的另一个方面，靶核酸在固定(例如，FFPE、PFA)生物样品中的位置可以通过原位杂交使用连接来鉴定。例如，该方法可以包括使FFPE生物样品与第一探针和第二探针接触。在一些实施方式中，第一探针可以以5′至3′方向具有：第一功能域和与靶核酸的部分基本上互补的第一序列。在一些实施方式中，第一探针可以具有包含3′二核糖序列的3′端。在一些实施方式中，第一探针可以具有包括3′脱氧核苷酸序列的3′端。例如，第一探针可以是DNA/RNA杂交探针。在一些实施方式中，第一探针可以是DNA探针。在一些实施方式中，第二探针可以以5′至3′方向具有：与靶核酸的部分基本上互补的第二序列和分析物捕获序列。在一些实施方式中，分析物捕获序列可以是与捕获探针的捕获域(例如，本文所述的任何捕获域)互补的序列。在一些实施方式中，第二探针可以具有5′端磷酸。在一些实施方式中，第一序列和第二序列可以特异性结合至靶核酸(例如，mRNA)。
在一些实施方式中，第一探针的3′端可以连接至第二探针的5′端，由此产生连接产物。在一些实施方式中，第一探针和第二探针可以用连接酶连接。在一些实施方式中，连接酶可以是能够将RNA和DNA连接在一起的任何连接酶。在一些实施方式中，连接酶可以是任何DNA连接酶。在一些实施方式中，连接酶可以是T4 RNA连接酶2。在一些实施方案中，在使固定(例如，FFPE、PFA)生物样品与阵列接触之前以及在第一探针和第二探针连接之后，可以用RNA酶处理固定(例如，FFPE、PFA)生物样品。
在一些实施方式中，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以与包括多个捕获探针的阵列接触。在一些实施方式中，多个捕获探针中的捕获探针可以以5′到3′方向具有：空间条形码和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针还可以包括裂解域、独特的分子标识符、一个或多个功能域或其组合。在一些实施方式中，捕获域可以具有与分析物捕获序列基本上互补的序列。在一些实施方式中，捕获域可以特异性结合至连接产物的分析物捕获序列域。
在一些实施方式中，未连接的探针(例如，未连接的第一探针和未连接的第二探针)可以被去除或被阻止与阵列的捕获探针结合。例如，包括分析物捕获序列(例如，与捕获域互补的序列)的未连接的第二探针可以结合(例如，杂交)至捕获域(例如，本文所述的任何捕获域)。在一些实施方式中，当未连接的第二探针与捕获域结合时，它会阻止连接的探针与捕获域结合(例如杂交)。在一些实施方式中，第一探针可非特异性结合至捕获探针中的序列(例如，空间条形码、独特分子标识符等)。
在一些实施方式中，阵列上的捕获探针的捕获域可以被封闭以防止未连接的第二探针结合。在一些实施方式中，在封闭连接的探针和/或捕获域的捕获位点后，可以将核酸外切酶添加至生物样品中。在一些实施方式中，核酸外切酶可以是RecJf。在一些实施方式中，核酸外切酶可以是5′至3′核糖核酸外切酶。在一些实施方式中，核糖核酸外切酶可以是TerminatorTM核酸酶。在一些实施方式中，核酸外切酶可以是RecJf和TerminatorTM核酸酶的组合。在一些实施方式中，可以将核酸内切酶添加至固定(例如，FFPE、PFA)生物样品中。在一些实施方式中，核酸内切酶是RNA酶HI或RNA酶HII。在一些实施方式中，核酸内切酶可以对非特异性结合(例如杂交)至捕获探针或其部分的未连接的第一探针进行切口。
在一些实施方式中，捕获探针的3′端可以被延伸以添加与靶核酸的部分、空间条形码、独特分子标识符、一个或多个功能域和分析物捕获序列相对应(例如互补)的序列。在一些实施方式中，可以产生第二链(例如，产生与捕获探针(例如，延伸的捕获探针)互补的第二链序列)。在一些实施方式中，第二链可以包括与空间条形码互补的序列和与靶核酸的部分反向互补的序列。在一些实施方式中，连接产物(例如，连接的第一探针和第二探针)被去除(例如，随着温度升高而解链掉)并且延伸的捕获探针可以用于产生测序文库。在一些实施方式中，在除去连接产物后，可以在延伸的捕获探针上进行第二链合成(例如，通过本文所述的任何方法)。生成的第二链可以被去除(例如，随着温度升高而解链掉)并用于生成测序文库。
在一些实施方式中，可以确定空间条形码或其互补物的全部或部分的序列和靶核酸或其互补物的全部或部分的序列。在一些实施方式中，所确定的序列可用于鉴定靶核酸在固定(例如，FFPE、PFA)生物样品中的位置。在一些实施方式中，确定序列可以通过本文所述的任何测序方法进行。
在一些实施方式中，第一功能域可以是第一测序柄。在一些实施方式中，分析物捕获序列是与捕获域或其部分基本上互补的序列。
在一些实施方式中，引物可以与捕获探针的第一功能域的至少部分杂交。
在一些实施方式中，在使固定(例如，FFPE、PFA)生物样品与第一探针和第二探针接触之前，FFPE生物样品中的甲醛交联物可以被去交联(例如，通过本文描述的任何方法去交联)。例如，甲醛交联物可以通过使用酶和/或缓冲液(例如，用于FFPE样品的TE缓冲液、用于PFA固定样品的Tris-HCl缓冲液)通过加热、进行化学反应来去交联。在一些实施方式中，可以在本文所述的任何条件下使用缓冲液(例如TE缓冲液、Tris-HCl缓冲液)使交联物(例如甲醛交联物)去交联。在一些实施方式中，固定(例如，FFPE、PFA)生物样品可以在通过本文所述的任何方法(例如，用蛋白酶例如胃蛋白酶和/或蛋白酶K的透化)使甲醛交联物去交联之后被透化。
本文提供的方法和组合物在下文实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求中描述的方法和组合物的范围。
劣质生物样品的空间分析
生物样品中存在的核酸通常会在劣质生物样品中降解或片段化。例如，DNA和/或RNA在组织固定时可能会降解或片段化，例如当通过FFPE方法固定组织进行病理学研究时。就分子而言，DNA和/或RNA降解或片段化可能是由多种因素造成的：组织采集和固定之间的时间、细胞过程和自溶、固定过程中组织的高温孵育(例如，在包埋过程中)、固定组织的长时间储存或组织染色时的染色过程。DNA和/或RNA的降解或片段化会极大地影响空间阵列分析中DNA和/或RNA序列的捕获效率。
添加分析物捕获序列
例如，当mRNA被片段化时，一些mRNA片段被聚腺苷酸化，而其它mRNA片段不会被聚腺苷酸化。然而，未聚腺苷酸化的mRNA片段对于捕获分析仍然很重要。在一些实施方式中，可以将分析物捕获序列添加至缺少捕获序列的分析物(例如，DNA和/或RNA)，例如缺少聚腺苷酸化序列的mRNA的片段。如本文所用，“分析物捕获序列”包括与捕获探针的捕获域基本上互补的序列。在一些实施方式中，分析物捕获序列可包括与捕获域(例如，本文所述的任何示例性捕获域)至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％互补的序列。
在一些实施方式中，分析物捕获序列可以包括均聚核苷酸序列。在其它实施方式中，分析物捕获序列可以包括杂聚核苷酸序列。在一些实施方式中，可以将分析物捕获序列(例如，均聚核苷酸序列或杂聚核苷酸序列)添加至生物样品中存在的分析物中。在一些实施方式中，可以将分析物捕获序列(例如，均聚核苷酸序列或杂聚核苷酸序列)添加至DNA(例如，基因组DNA)。在一些实施方式中，基因组DNA包括突变或单核苷酸多态性。
在一些实施方式中，可以将分析物捕获序列(例如，均聚核苷酸序列或杂聚核苷酸序列)添加至RNA(例如，mRNA、miRNA、siRNA、snRNA和tRNA)(Slomovic，S.等，在人类细胞的细胞质中RNA降解过程中添加多聚(A)和富含多聚(A)的尾部(Addition of poly(A)andpoly(A)-rich tails during RNA degradation in the cytoplasm ofhuman cells)，PNAS，107(16)，7407-7412，(2010))。在一些实施方式中，mRNA包括单核苷酸多态性或突变。在一些实施方式中，mRNA包括剪接变体。在一些实施方式中，可以捕获多种类型的分析物(例如，至少两种、至少三种、至少四种不同类型的分析物)。在一些实施方式中，可以将分析物捕获序列(例如，均聚核苷酸序列或杂聚核苷酸序列)的添加添加至其它情况下不会被阵列的捕获探针的多聚(T)或多聚(A)捕获域捕获的RNA物质(例如，miRNA)。
在一些实施方式中，均聚核苷酸序列可以是多聚(A)序列或多聚(T)序列。在一些实施方式中，杂聚核苷酸序列可以是核苷酸的混合物。例如，可以将均聚核苷酸序列，例如多聚(A)尾，添加至生物样品中的RNA(例如，mRNA)。在一些实施方式中，可将多聚(A)尾添加至生物样品中的DNA(例如基因组DNA)。在一些实施方式中，可以在缓冲液和dATP存在下用多聚(A)聚合酶将多聚(A)尾添加至生物样品中存在的核酸分析物(例如，DNA或RNA)。在一些实施方式中，可以在缓冲液和寡聚d(A)存在下用多聚(A)聚合酶将多聚(A)尾添加至生物样品中存在的核酸分析物(例如，DNA或RNA)。在一些实施方式中，可以用不依赖模板的聚合酶(例如，TdT)将分析物捕获序列(例如，多聚(A)尾)添加至存在于劣质生物样品中的RNA。在一些实施方式中，可以用不依赖模板的聚合酶(例如，TdT)将分析物捕获序列(例如，杂聚核苷酸序列)添加至存在于劣质生物样品中的RNA。在一些实施方式中，可以将分析物捕获序列(例如，均聚核苷酸序列或杂聚核苷酸序列)添加至生物样品中的分析物(例如，RNA或DNA)的3′端。在一些实施方式中，添加的均聚核苷酸序列(例如，多聚(A)或多聚(T)序列)或杂聚核苷酸序列可以具有总计约1至约50个核苷酸(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50核苷酸，或约1至约45核苷酸，约1至约40核苷酸，约1至约35核苷酸，约1至约30核苷酸，约1至约25核苷酸，约1至约20核苷酸，约1至约15核苷酸，约1至约10核苷酸，约1至约5核苷酸，约5至约50核苷酸，约5至约45核苷酸，约5至约40核苷酸，约5至约35核苷酸，约5至约30核苷酸，约5至约25核苷酸，约5至约20核苷酸，约5至约15核苷酸，约5至约10核苷酸，约10至约50核苷酸，约10至约45核苷酸，约10至约40核苷酸，约10至约35核苷酸，约10至约30核苷酸，约10至约25核苷酸，约10至约20核苷酸，约10至约15核苷酸，约15至约50核苷酸，约15至约45核苷酸，约15至约40核苷酸，约15至约35核苷酸，约15至约30核苷酸，约15至约25核苷酸，约15至约20核苷酸，约20至约50核苷酸，约20至约45核苷酸，约20至约40核苷酸，约20至约35核苷酸，约20至约30核苷酸，约20至约25核苷酸，约25至约50核苷酸，约25至约45核苷酸，约25至约40核苷酸，约25至约35核苷酸，约25至约30核苷酸，约30至约50核苷酸，约30至约45核苷酸，约30至约40核苷酸，约30至约35核苷酸，约35至约50核苷酸，约35至约45核苷酸，约35至约40核苷酸，约40至约50核苷酸，约40至约45核苷酸，或约45至约50核苷酸)。
在一些实施方式中，分析物捕获序列(例如，均聚多核苷酸序列或杂聚多核苷酸序列)可以连接至生物样品中存在的核酸分析物(例如，DNA或RNA)。在一些实施方式中，分析物捕获序列(例如，均聚多核苷酸序列或杂聚多核苷酸)可以采用连接酶(例如，本文所述的任何连接酶)连接。在一些实施方式中，连接酶是RNA连接酶(例如，T4连接酶)。在一些实施方式中，连接酶是DNA连接酶。
在一些实施方式中，在将分析物捕获序列(例如，多聚(A)序列、多聚(T)序列、杂聚核苷酸序列、均聚多核苷酸序列、杂聚多核苷酸序列)添加至存在于劣质生物样品(例如，通过使用聚合酶或通过连接)中的核酸分析物，所述劣质生物样品可以与包括捕获探针的阵列接触。在一些实施方式中，添加的分析物捕获序列(例如，多聚(A)序列、多聚(T)序列、杂聚核苷酸序列)可以特异性结合(例如，杂交)阵列的捕获探针的捕获域。在一些实施方式中，可以使用捕获的分析物作为模板进行逆转录以延伸捕获探针的3′端。在一些实施方式中，可以产生与延伸的捕获探针杂交的第二链(例如，通过本文所述的任何方法产生)，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和分析物序列的至少部分。本文所述的任何方法的一些实施方式包括从延伸的捕获探针释放第二链。
在一些实施方式中，在将分析物捕获序列(例如，多聚(A)序列、多聚(T)序列、杂聚核苷酸序列)添加至存在于劣质生物样品(例如，通过使用聚合酶或通过连接)中的核酸分析物之后，所述劣质生物样品可以与包括捕获探针的阵列接触。在一些实施方式中，添加的分析物捕获序列(例如，多聚(A)序列、多聚(T)序列、杂聚核苷酸序列)可以特异性结合(例如，杂交)阵列的捕获探针的捕获域。在一些实施方式中，可以使用捕获的分析物作为模板进行逆转录以延伸捕获探针的3′端。在一些实施方式中，可以产生与延伸的捕获探针杂交的第二链(例如，通过本文所述的任何方法产生)，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和分析物序列的至少部分。本文所述的任何方法的一些实施方式包括从延伸的捕获探针释放第二链。
在一些实施方式中，分析物在生物样品中的位置通过确定延伸的捕获探针或第二链的序列(使用本文所述的任何示例性测序方法，例如高通量测序)来确定。
本文提供了用于确定分析物在生物样品中的位置的方法，包括将分析物捕获序列添加至生物样品中的分析物，使生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中多个捕获探针的捕获探针包括空间条形码和能特异性结合至分析物捕获序列的捕获域，确定空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和特异性结合至捕获域的分析物序列的部分的全部或部分或其互补物，和利用空间条形码或其互补物和分析物或其互补物的确定的序列来鉴定分析物在生物样品中的位置。
在一些实施方式中，确定与捕获域特异性结合的分析物序列的全部或部分或其互补物包括：利用与捕获域特异性结合的分析物作为模板来延伸捕获探针的3′端以产生延伸的捕获探针。在一些实施方式中，可以产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和分析物序列的至少部分。在一些实施方式中，第二链可用于鉴定分析物在生物样品中的位置。在一些实施方式中，与延伸捕获探针基本上互补的一种或多种标记探针可用于鉴定分析物在生物样品中的位置。例如，一种或多种标记的(例如，用本文所述的任何可检测标记物标记的)探针可以在产生延伸的捕获探针之后提供给阵列。一种或多种标记的探针可以特异性结合(例如杂交)至延伸的捕获探针并且可以被检测，由此鉴定分析物在生物样品中的位置。
在一些实施方式中，捕获探针可以还包括独特的分子标识符。在一些实施方式中，捕获探针可以包括一个或多个功能域(例如，本文所述的任何功能域中的一个或多个)。在一些实施方式中，捕获探针可以包括裂解域。在一些实施方式中，裂解域位于捕获探针中捕获域的5′。在一些实施方式中，捕获探针可以包括以下中的一种或多种：独特的分子标识符、一个或多个功能域和位于捕获域5’的裂解域。
在一些实施方式中，分析物可以从生物样品迁移到包括多个捕获探针的阵列。在一些实施方式中，分析物的迁移包括利用被动迁移(例如，扩散)。在一些实施方式中，分析物的迁移包括采用本文描述的任何示例性方法(例如，电泳)利用主动迁移。在一些实施方式中，在将分析物捕获序列添加至生物样品中存在的分析物之前，可以使生物样品透化(例如，使用本文所述的用于透化生物样品的任何方法)。在一些实施方式中，可以对生物样品进行成像(例如，通过本文所述的任何方法成像)。在一些实施方式中，生物样品是组织切片(例如，本文所述的任何示例性组织切片)或本文所述的任何其它类型的生物样品。
RNA完整性数
如本文所用，术语“RNA完整性数”或“RIN”是指基于完整性评分的RNA质量指示，即来自样品的RNA降解与否的程度(例如，见述于Schroeder，A.等，RIN：RNA完整性数，用于将完整性值分配给RNA测量值(The RIN：an RNA integrity number for assigningintegrity values to RNA measurements)，BMC Molecular Biology，7：3(2006)和Ahlfen，S.V.等，FFPE样品中RNA质量的决定因素(Determinants of RNA Quality fromFFPE Samples)，PLoS ONE，2(12)：e1261(2007)，Mueller，O.等，RNA完整性编号(RIN)-RNA质量控制的标准化(RNA Integrity Number(RIN)-Standardization of RNA QualityControl)，Agilent Technologies(2004)，其均通过引用方式纳入本文)。例如，RIN评分约为1的生物样品包括完全降解的RNA，而RIN评分约为10的生物样品包括未降解的RNA。在一些实施方式中，可以计算生物样品、生物样品的一个或多个区域或单个细胞的RIN分数。在一些实施方式中，可以在对相似的生物样品进行本文所述的任何方法之前计算RIN分数。例如，可以确定第一生物样品的RIN分数，并且可以采用第二(例如，下一个或相邻的)生物样品(例如，组织切片)来进行本文所述的任何方法。在一些示例中，第一生物样品的RIN分数可用于模拟(approximate)第二(例如，相似或相邻的)生物样品的RIN值。
如本文所用，术语“劣质生物样品”是指RIN分数小于5的生物样品。在一些实施方式中，劣质生物样品的RIN分数可以小于4.5、小于4.0、小于3.5、小于3.0、小于2.5、小于2.0、小于1.5、小于1.0、小于0.8、小于0.6、小于0.4或小于0.2。在一些实施方式中，可以在生物样品用于进行本文所述的任何方法之前或之后确定生物样品(例如，组织切片)的RIN值。例如，可以在与用于进行本文所述的任何方法的生物样品不同的(例如，相似或相邻的)生物样品上预先确定RIN值。在一些实施方式中，如本文所述的空间分析可以对RIN分数在约4至约10之间的样品进行。在一些实施方式中，劣质生物样品的RIN分数可以是约0.1至约5.0(例如，约0.1至约4.5，约0.1至约4.0，约0.1至约3.5，约0.1至约3.0，约0.1至约2.5，约0.1至约2.0，约0.1至约1.5，约0.1至约1.0，约0.1至约0.8，约0.1至约0.6，约0.1至约0.4，约0.1至约0.2，约0.2至约5.0，约0.2至约4.5，约0.2至约4.0，约0.2至约3.5，约0.2至约3.0，约0.2至约2.5，约0.2至约2.0，约0.2至约1.5，约0.2至约1.0，约0.2至约0.8，约0.2至约0.6，约0.2至约0.4，约0.4至约5.0，约0.4至约4.5，约0.4至约4.0，约0.4至约3.5，约0.4至约3.0，约0.4至约2.5，约0.4至约2.0，约0.4至约1.5，约0.4至约1.0，约0.4至约0.8，约0.4至约0.6，约0.6至约5.0，约0.6至约4.5，约0.6至约4.0，约0.6至约3.5，约0.6至约3.0，约0.6至约2.5，约0.6至约2.0，约0.6至约1.5，约0.6至约1.0，约0.6至约0.8，约0.8至约5.0，约0.8至约4.5，约0.8至约4.0，约0.8至约3.5，约0.8至约3.0，约0.8至约2.5，约0.8至约2.0，约0.8至约1.5，约0.8至约1.0，约1.0至约5.0，约1.0至约4.5，约1.0至约4.0，约1.0至约3.5，约1.0至约3.0，约1.0至约2.5，约1.0至约2.0，约1.0至约1.5，约1.5至约5.0，约1.5至约4.5，约1.5至约4.0，约1.5至约3.5，约1.5至约3.0，约1.5至约2.5，约1.5至约2.0，约2.0至约5.0，约2.0至约4.5，约2.0至约4.0，约2.0至约3.5，约2.0至约3.0，约2.0至约2.5，约2.5至约5.0，约2.5至约4.5，约2.5至约4.0，约2.5至约3.5，约2.5至约3.0，约3.0至约5.0，约3.0至约4.5，约3.0至约4.0，约3.0至约3.5，约3.5至约5.0，约3.5至约4.5，约3.5至约4.0，约4.0至约5.0，约4.0至约4.5，或约4.5至约5.0)。
在一些实施方式中，通过在基材上提供包括多个捕获探针的阵列来计算给定生物样品(例如，组织切片、组织的一个或多个区域或单个细胞)的一个或多个RIN分数，其中捕获探针包括捕获域和空间条形码，生物样品可以用组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)染色，使阵列与生物样品(例如，组织切片)接触，用捕获域捕获来自生物样品的分析物(例如，18S rRNA分子)，从捕获的生物分析物(例如，18SrRNA)产生cDNA分子(例如，延伸的捕获探针)，将一种或多种标记的寡核苷酸探针与cDNA杂交，对标记的cDNA和组织学染色进行成像，和针对空间阵列中的位置生成RNA完整性数，其中RNA完整性数包括对该位置的标记的cDNA图像和组织学染色(例如，本文所述的任何染色)图像的分析。
在一些实施方式中，生物样品(例如，组织切片)用组织学染色剂染色。如本文所用，“组织学染色剂”可以是本文所述的任何染色剂。例如，可以用本文所述的任何示例性IF/IHC染色剂对生物样品进行染色。在一些实施方式中，生物样品(例如，组织切片)可以用苏木精和曙红染色。在一些实施方式中，在用标记的寡核苷酸探针标记cDNA之前、之时或之后，用组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)染色生物样品(例如，组织切片)。在一些实施方式中，染色的生物样品可以任选地被脱色(例如，使用本文所述的任何示例性方法，例如，在HCl中洗涤)。例如，在进一步处理之前，可以通过在稀HCl(0.01M)中洗涤来任选地从生物样品中去除来自H&E染色剂的苏木精。在一些实施方式中，染色的生物样品可以任选地在成像之后和透化之前脱色。
在一些实施方式中，阵列包括基材上或基材上的特征上的多个捕获探针，其中捕获探针包括捕获域和空间条形码。在一些实施方式中，捕获域包括均聚核苷酸序列。在一些实施方式中，均聚核苷酸序列是多聚(T)序列。例如，捕获域可以包括能够从生物样品中捕获18S rRNA转录本的多聚(T)序列，其先前已用多聚(A)序列(例如，均聚或异聚序列)标记。
在一些实施方式中，计算生物样品的一个或多个RIN分数可以包括将至少一个(例如，至少两个、至少三个、至少四个或至少五个)标记的寡核苷酸探针与由18S rRNA生成的cDNA(例如，延伸的捕获探针)杂交。在一些实施方式中，标记的寡核苷酸探针包括与18ScDNA的部分基本上互补的序列(例如，延伸的捕获探针)。在一些实施方式中，四个标记的寡核苷酸探针(P1-P4)被设计成在跨越18S rRNA的整个序列的四个不同位置杂交。在一些实施方式中，标记的寡核苷酸探针可包括如本文所述的任何可检测标记物。例如，寡核苷酸标记的探针可以包括荧光标记物(例如，本文所述的任何荧光标记物，例如Cy3)。在一些实施方式中，设计成与18S cDNA序列内的不同位置基本上互补的两个或更多个标记的寡核苷酸探针包括相同的可检测标记物。例如，四个标记的寡核苷酸探针(P1-P4)各自都可以设计成与18S cDNA序列内的不同位置具有基本互补性，并且都可以具有相同的可检测标记物(例如Cy3)。在一些实施方式中，设计成与18S cDNA(例如，延伸的捕获探针)序列内的不同位置基本上互补的两个或更多个标记的寡核苷酸探针可以包括不同的可检测标记物。例如，四个标记的寡核苷酸探针(P1-P4)可以各自设计成与18S cDNA(例如，延伸的捕获探针)序列内的不同位置具有基本互补性，并且可以包括不同的可检测标记物。
在一些实施方式中，确定生物样品(例如，组织切片、组织的一个或多个区域或单个细胞)的RNA完整性数包括分析对于相同位置的获自空间阵列和组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)的图像。例如，对于阵列，所有图像都通过在荧光标记(例如，Cy3标记)寡核苷酸探针已与18S cDNA杂交(例如，延伸的捕获探针)杂交之后用激光(例如，532-nm波长)扫描而产生。每个探针可以生成一张图像(P1-P4)，并且可以在没有荧光标记的探针杂交的情况下生成一张图像(P0)。荧光单位(FU)数据的归一化是通过减去用P0记录的自发荧光并除以P1来进行的。对齐后，五个图像(每个探针一个图像，P1-P4，和来自没有结合探针的区域的一个图像)被加载到脚本中。该脚本生成两个不同的图，一个RIN值的热图和一个图像对齐误差图，它结合了组织学染色剂(例如，本文描述的任何染色剂)图像。图像对齐误差图用于观察哪些像素和位置由于P0-P4图像之间的对齐误差而应从分析中排除。
示例性实施方式
实施方式1是一种用于确定靶核酸在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)生物样品中的位置的方法，所述方法包括：(a)使FFPE生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获域，(b)使FFPE生物样品中的一种或多种甲醛交联物去交联，从而使得捕获域特异性结合至靶核酸，(c)延伸捕获探针以产生与靶核酸的部分互补的核酸序列，(d)产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和对应于靶核酸中的部分序列的核酸序列，和(e)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸序列的部分的全部或部分或其互补物，并采用(i)和(ii)的确定的序列来鉴定靶核酸在FFPE生物样品中的位置。
实施方式2是实施方式1的方法，其中去交联步骤包括加热FFPE生物样品。
实施方式3为实施方式1或2的方法，其中去交联步骤包括化学反应的进行。
实施方式4是实施方式1-3中任一项所述的方法，其中所述去交联步骤包括使用酶。
实施方式5是实施方式1-4中任一项所述的方法，其中去交联步骤包括使用Tris-EDTA(TE)缓冲液。
实施方式6是实施方式5的方法，其中TE缓冲液具有约7.5至约8.5的pH。
实施方式7是实施方式6的方法，其中TE缓冲液具有约65℃至约75℃的温度，并且与FFPE生物样品接触约10分钟至约200分钟。
实施方式8是实施方式1-7中任一项所述的方法，其还包括在去交联步骤之后，使FFPE生物样品透化的步骤。
实施方式9是实施方式8的方法，其中使FFPE生物样品透化的步骤包括使用蛋白酶。
实施方式10是实施方式9的方法，其中蛋白酶是胃蛋白酶或蛋白酶K。
实施方式11是实施方式1-10中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针包括附加捕获探针，其以5′至3′方向包含：空间条形码和多聚(T)捕获域。
实施方式12是实施方式1-11中任一项所述的方法，其中所述靶核酸包括RNA。
实施方式13是实施方式12的方法，其中所述RNA是mRNA。
实施方式14是实施方式12或13的方法，其中所述方法在步骤(b)和(c)之间还包括将FFPE生物样品与5′至3′单链DNA核酸外切酶一起孵育的步骤。
实施方式15是实施方式12或13的方法，其中所述方法在步骤(b)和(c)之间还包括将FFPE生物样品与5′至3′单链DNA核酸外切酶和双链DNA核酸内切酶一起孵育的步骤。
实施方式16是实施方式14或15的方法，其中5′至3′单链DNA核酸外切酶是T7核酸内切酶或RecJf。
实施方式17是实施方式1-16中任一项所述的方法，其中延伸捕获探针的步骤在放线菌素D的存在下进行。
实施方式18是实施方式1-17中任一项所述的方法，其中所述方法在步骤(a)和(b)、(b)和(c)或(c)和(d)之间还包括将FFPE生物样品与具有富含AT的限制性核酸内切酶识别序列的限制性核酸内切酶一起孵育的步骤。
实施方式19是实施方式1-18中任一项所述的方法，其中步骤(d)至少部分地包括以下步骤：将均聚核苷酸序列添加至捕获探针的3′端；和使用夹板连接或DNA聚合酶延伸反应将测序或PCR柄连接至均聚核苷酸序列的3′端。
实施方式20是实施方式19的方法，其中添加均聚核苷酸序列的步骤使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)进行。
实施方式21是实施方式19或20的方法，其中夹板连接包括使用包含与第二寡核苷酸杂交的第一寡核苷酸的部分双链核酸，其中：第一寡核苷酸包含功能域；第二寡核苷酸以5′至3′方向包含：多聚(G)序列和与功能域基本上互补的序列；第二寡核苷酸的多聚(G)序列能与捕获探针的多聚(C)序列特异性结合；并且，部分双链核酸在第二链上具有5′突出端，其中5′突出端包含多聚(G)序列的至少部分。
实施方式22是实施方式21的方法，其中功能域是测序或PCR柄。
实施方式是实施方式22的方法，其中夹板连接导致将测序或PCR柄添加至捕获探针的3′端。
实施方式24是实施方式23的方法，其中步骤(d)还包括：杂交包含与捕获探针中的测序或PCR柄基本上互补的序列的引物；和延伸引物以产生第二链。
实施方式25是实施方式1-18中任一项所述的方法，其中步骤(d)至少部分地包括：将5′腺苷酸化衔接子连接至捕获探针的3′端的步骤。
实施方式26是实施方式25的方法，其中将5′腺苷酸化衔接子连接至捕获探针的3′端使用连接酶进行。
实施方式27是实施方式26的方法，其中连接酶是5′App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶2或任何其它单链DNA或RNA连接酶。
实施方式28是实施方式25-27中任一项所述的方法，其中所述5′腺苷酸化衔接子包含测序柄。
实施方式29是实施方式28的方法，其中步骤(d)还包括：杂交包含与捕获探针中的测序或PCR柄基本上互补的序列的引物；和延伸引物以产生第二链。
实施方式30是实施方式1-18中任一项所述的方法，其中步骤(d)至少部分地包括以下步骤：将多聚(A)序列添加至捕获探针的3′端；和将衔接子连接至捕获探针中多聚(A)序列的3′端。
实施方式31是实施方式30的方法，其中多聚(A)序列是核糖核酸序列。
实施方式32是实施方式30或31的方法，其中所述连接使用RNA连接酶进行。
实施方式33是实施方式30或31的方法，其中连接使用CircLigase进行。
实施方式34是实施方式30-33中任一项所述的方法，其中衔接子包括测序或PCR柄。
实施方式35是实施方式34的方法，其中步骤(d)还包括：杂交包含与捕获探针中的测序或PCR柄基本上互补的序列的引物；和延伸引物以产生第二链。
实施方式36是实施方式35的方法，其中延伸引物以产生第二链的步骤使用DNA聚合酶进行。
实施方式37是实施方式35的方法，其中延伸引物以产生第二链的步骤使用可使用RNA碱基作为底物的DNA聚合酶进行。
实施方式38是实施方式1-18中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括杂交一种或多种引物，其中所述一种或多种引物的引物包含随机序列和功能域，其中所述随机序列与捕获探针中与随机序列基本上互补的序列杂交。
实施方式39是实施方式38的方法，其中功能域是测序柄。
实施方式40是实施方式38或39的方法，其中步骤(d)还包括延伸引物以产生第二链。
实施方式41是实施方式1-18中任一项所述的方法，其中步骤(d)至少部分地包括将衔接子连接至捕获探针的3′端的步骤。
实施方式42是实施方式41的方法，其中衔接子包括测序柄。
实施方式43是实施方式42的方法，其中步骤(d)还包括：杂交包含与捕获探针中的测序柄基本上互补的序列的引物；和延伸引物以产生第二链。
实施方式44是实施方式1-43中任一项所述的方法，其中该方法还包括对FFPE生物样品进行成像。
实施方式45是实施方式1-44中任一项所述的方法，其中FFPE生物样品是FFPE组织切片。
实施方式46是实施方式1-45中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含位于所述捕获探针中的捕获域5′的独特分子标识符(UMI)。
实施方式47是一种确定靶核酸在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)生物样品中的位置的方法，所述方法包括：(a)使FFPE生物样品与第一和第二探针接触，其中：第一探针以5′至3′方向包含：第一功能域和与靶核酸的部分基本上互补的第一序列；第一探针的3′端包含3′二核糖序列；第二探针以5′至3′方向包含：与靶核酸的部分基本上互补的第二序列和分析物捕获序列；第二探针的5′端包含5′磷酸；且第一序列和第二序列能与靶核酸特异性结合；(b)将第一探针的3′端与第二探针的5′端连接，以产生连接产物；(c)将FFPE生物样品与包含捕获探针的阵列接触，所述捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域，所述捕获域包含与分析物捕获序列基本上互补的序列，其中捕获域能与连接产物的分析物捕获序列特异性结合；(d)延伸捕获探针的3′端以产生对应于靶核酸的部分的序列；(e)产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包含与空间条形码互补的序列和与靶核酸的部分互补的序列；和(f)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸序列的部分的全部或部分或其互补物，并利用(i)和(ii)的确定的序列来鉴定靶核酸在FFPE生物样品中的位置。
实施方式48是实施方式47的方法，其中第一功能域是第一测序柄。
实施方式49是实施方式47或48的方法，其中分析物捕获序列与捕获域或其部分基本上互补。
实施方式50是实施方式47-49中任一项所述的方法，其中第一探针的3′端与第二探针的5′端的连接使用连接酶进行。
实施方式51是实施方式47-50中任一项所述的方法，其中所述方法在步骤(b)和(c)之间还包括用RNA酶处理FFPE生物样品的步骤。
实施方式52是实施方式47-51中任一项所述的方法，其中步骤(e)包括：
使包含第一功能域的至少部分的引物与捕获探针杂交；和延伸引物以产生第二链。
实施方式53是实施方式47-52中任一项所述的方法，其中所述方法还包括，在步骤(a)之前，使FFPE生物样品中的一个或多个甲醛交联物去交联。
实施方式54是实施方式53的方法，其中去交联步骤包括加热FFPE生物样品。
实施方式55为实施方式53或54的方法，其中去交联步骤包括化学反应的进行。
实施方式56是实施方式53-55中任一项所述的方法，其中所述去交联步骤包括使用酶。
实施方式57是实施方式53-56中任一项所述的方法，其中去交联步骤包括使用TE缓冲液。
实施方式58是实施方式57的方法，其中TE缓冲液具有约7.5至约8.5的pH。
实施方式59是实施方式58的方法，其中TE缓冲液具有约65℃至约75℃的温度，并且与FFPE生物样品接触约30分钟至约90分钟。
实施方式60是实施方式53-59中任一项所述的方法，其进一步包括在去交联步骤之后，使FFPE生物样品透化的步骤。
实施方式61是实施方式60的方法，其中使FFPE生物样品透化的步骤包括使用蛋白酶。
实施方式62是实施方式61的方法，其中蛋白酶是胃蛋白酶或蛋白酶K。
实施方式63是实施方式47-62中任一项所述的方法，其中FFPE生物样品是FFPE组织切片。
实施方式64是实施方式47-63中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含位于所述捕获探针中的捕获域5′的独特分子标识符(UMI)。
实施方式65是一种用于确定靶核酸在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)生物样品中的位置的方法，所述方法包括：(a)使FFPE生物样品与包含多个捕获探针的空间阵列接触，其中多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域；(b)使FFPE生物样品中的一种或多种甲醛交联物去交联，从而使捕获域与靶核酸特异性结合；(c)延伸捕获探针以产生与靶核酸的部分互补的核酸序列；(d)使延伸的捕获探针接触与带有标记核酸的延伸的捕获探针基本上互补的核酸，从而使得标记的核酸与延伸的捕获探针或其部分特异性结合；和(e)检测标记的核酸以鉴定靶核酸在FFPE生物样品中的位置。
实施方式66是一种确定靶核酸在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)生物样品中的位置的方法，所述方法包括：(a)使FFPE生物样品与第一和第二探针接触，其中：第一探针以5′至3′方向包含：第一功能域和与靶核酸的部分基本上互补的第一序列；第二探针以5′至3′方向包含：与靶核酸的部分基本上互补的第二序列和分析物捕获序列；第二探针的5′端包含5′磷酸；且第一序列和第二序列能与靶核酸特异性结合；(b)将第一探针的3′端与第二探针的5′端连接，以产生连接产物；(c)将FFPE生物样品与包含捕获探针的阵列接触，所述捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域，所述捕获域包含与分析物捕获序列基本上互补的序列，其中捕获域能与连接产物的分析物捕获序列特异性结合；(d)延伸捕获探针的3′端以产生对应于靶核酸的部分的序列；(e)产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包含与空间条形码互补的序列和与靶核酸的部分互补的序列；和(f)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸的部分的全部或部分或其互补物，并利用(i)和(ii)的确定的序列来鉴定靶核酸在FFPE生物样品中的位置。
实施方式67是一种用于确定靶核酸在多聚甲醛固定生物样品中的位置的方法，所述方法包括：(a)使多聚甲醛固定生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)捕获域，(b)使PFA生物样品中的多聚甲醛交联物去交联，从而使得捕获域特异性结合至靶核酸，(c)延伸捕获探针以产生与靶核酸的部分互补的核酸序列，(d)产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包括与空间条形码互补的序列和对应于靶核酸中的部分序列的核酸序列，和(d)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸序列的部分的全部或部分或其互补物，并采用(i)和(ii)的确定的序列来鉴定靶核酸在多聚甲醛固定生物样品中的位置。
实施方式68是实施方式1的方法，其中去交联步骤包括加热多聚甲醛固定生物样品。
实施方式69是实施方式67或68的方法，其中去交联步骤包括化学反应的进行。
实施方式70是实施方式67-69中任一项所述的方法，其中所述去交联步骤包括使用酶。
实施方式71是实施方式67-70中任一项所述的方法，其中去交联步骤包括使用Tris-HCl缓冲液。
实施方式72是实施方式71的方法，其中Tris-HCl缓冲液具有约8.5至约9.5的pH。
实施方式73是实施方式72的方法，其中Tris-HCl缓冲液具有约55℃至约65℃的温度，并且与多聚甲醛固定生物样品接触约10分钟至约200分钟。
实施方式74是实施方式67-73中任一项所述的方法，还包括在去交联步骤之后使多聚甲醛固定生物样品透化的步骤。
实施方式75是实施方式74的方法，其中使多聚甲醛固定生物样品透化的步骤包括使用蛋白酶。
实施方式76是实施方式75的方法，其中蛋白酶是胃蛋白酶。
实施方式77是实施方式67-76中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针包括附加捕获探针，其以5′至3′方向包含：空间条形码和多聚(T)捕获域。
实施方式78是实施方式67-77中任一项所述的方法，其中所述靶核酸包括RNA。
实施方式79是实施方式78的方法，其中所述RNA是mRNA。
实施方式80是实施方式67-79中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对多聚甲醛固定生物样品进行成像。
实施方式81是实施方式67-80中任一项所述的方法，其中多聚甲醛固定生物样品是多聚甲醛固定的组织切片。
实施方式82是一种用于确定分析物在生物样品中的位置的方法，所述方法包括：(a)将分析物捕获序列添加至生物样品中的分析物；(b)使生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)能特异性结合至分析物捕获序列的捕获域；(c)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)与捕获域特异性结合的分析物序列的部分的全部或部分或其互补物，并使用(i)和(ii)的确定的序列来鉴定分析物在生物样品中的位置。
实施方式83是实施方式82的方法，其中步骤(c)中的确定包括：
使用与捕获域特异性结合的分析物作为模板来延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包含与空间条形码互补的序列和分析物序列的至少部分。
实施方式84是实施方式82或83的方法，其中所述生物样品是先前已知具有小于5的RIN分数的样品类型。
实施方式85是实施方式84的方法，其中所述生物样品是先前已知具有小于3的RIN分数的样品类型。
实施方式86是实施方式82-85中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中添加分析物捕获序列的步骤包括使用聚合酶。
实施方式87是实施方式86的方法，其中聚合酶是多聚(A)聚合酶。
实施方式88是实施方式86的方法，其中聚合酶是不依赖模板的聚合酶。
实施方式89是实施方式88的方法，其中不依赖模板的聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶。
实施方式90是实施方式86至898中任一项所述的方法，其中聚合酶将多聚(A)序列添加至分析物的3′端。
实施方式91是实施方式82-85中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中添加分析物捕获序列的步骤包括使用连接酶。
实施方式92是实施方式91的方法，其中所述连接酶是RNA连接酶。
实施方式93是实施方式92的方法，其中所述RNA连接酶是T4连接酶。
实施方式94是实施方式91-93中任一项所述的方法，其中分析物捕获序列包含均聚多核苷酸序列。
实施方式95是实施方式94的方法，其中均聚多核苷酸序列包含多聚(A)序列。
实施方式96是实施方式82-95中任一项所述的方法，其中分析物是RNA。
实施方式97是实施方式96的方法，其中所述RNA是mRNA miRNA、siRNA、snRNA、tRNA及其组合。
实施方式98是实施方式97的方法，其中所述RNA是mRNA。
实施方式99是实施方式98的方法，其中所述mRNA包含单核苷酸多态性。
实施方式100是实施方式98的方法，其中所述mRNA包含突变。
实施方式101是实施方式98的方法，其中所述mRNA是剪接变体。
实施方式102是实施方式82-91中任一项所述的方法，其中分析物是DNA。
实施方式103是实施方式102的方法，其中所述DNA是基因组DNA。
实施方式104是实施方式10322的方法，其中基因组DNA包含单核苷酸多态性。
实施方式105是实施方式103的方法，其中基因组DNA包含突变。
实施方式106是实施方式1至24中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将生物样品中的分析物迁移至捕获探针。
实施方式107是实施方式106的方法，其中迁移包括被动迁移。
实施方式108是实施方式106的方法，其中迁移包括主动迁移。
实施方式109是实施方式82-108中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(a)之前使生物样品透化。
实施方式110是实施方式82-109中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含位于所述捕获探针中的捕获域5′的独特分子标识符、功能域和裂解域中的一种或多种。
实施方式111是实施方式82-110中任一项所述的方法，其中该方法还包括对生物样品进行成像。
实施方式112是实施方式82-111中任一项所述的方法，其中所述生物样品是组织切片。
序列表
多聚(dT)捕获域
SEQ ID NO：1：TTTTTTTTTT
定制测序引物
SEQ ID NO：2AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG
具有10bp随机序列的模板转换寡核苷酸
SEQ ID NO：3AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGNNNNNNNNNN
x22_6mer
SEQ ID NO：4TTGCTAGGACCGGCCTTAAAGCNNNNNN
x22_10mer
SEQ ID NO：5TTGCTAGGACCGGCCTTAAAGCNNNNNNNNNN
实施例
实施例1.处理FFPE生物样品
FFPE生物样品最初在40℃水浴中孵育以进行附接。接下来，FFPE生物样品在40℃干燥2小时。在干燥步骤之后，FFPE生物样品按照下述方案进行脱蜡和再水化：在二甲苯中洗涤2×10分钟；在100％乙醇中洗涤2×3分钟，在96％乙醇中洗涤1×3分钟，在70％乙醇中洗涤1×3分钟，在H，O中洗涤2×1分钟。脱蜡和再水化后，FFPE生物样品经历H&E染色、干燥和成像。
在使甲醛诱导的交联物去交联之前，FFPE生物样品在37℃用胶原酶(0.2U/μL)预透化。接下来，为了去除甲醛诱导的交联物和/或修饰，FFPE生物样品在TE缓冲液(10mMTris，1mM EDTA，pH8.0)中于70℃孵育60分钟。在TE缓冲液中孵育后，FFPE生物样品另用胃蛋白酶透化30分钟。然后可以将去交联的FFPE生物样品与阵列接触，然后使用捕获的分析物作为模板进行逆转录以延伸捕获探针的3′端。
实施例2.去交联小鼠脑FFPE样品的空间分析
下文表1和1A总结了对小鼠脑FFPE生物样品进行的空间分析结果。前两行代表从新鲜冷冻组织获得的数据。第3行和第4行代表从未用实施例1中的去交联方案处理的FFPE生物样品(对照)获得的数据。第5-7行代表从根据实施例1中的方案去交联的FFPE生物样品获得的数据。与在空间分析之前未去交联的FFPE生物样品相比，在空间分析之前去交联的FFPE生物样品之间观察到每个点的中值基因显著增加。此外，与在空间分析之前未去交联的FFPE生物样品相比，在空间分析之前去交联的FFPE生物样品之间观察到每个点的中值独特分子标识符(UMI)计数显著增加。
表1.
Figure BDA0003843681780000481
表1A.
Figure BDA0003843681780000482
Figure BDA0003843681780000491
下文表2和2A总结了深度测序、去交联的小鼠脑FFPE生物样品和新鲜冷冻的小鼠脑组织的结果。前两行代表从新鲜冷冻小鼠脑样品中获得的数据。第3-5行代表从去交联的小鼠脑FFPE生物样品中获得的数据。这些数据表明，小鼠脑FFPE生物样品中的测序文库并不像新鲜冷冻组织那样复杂。然而，FFPE生物样品表现为新鲜冷冻样品的30％。
表2.
Figure BDA0003843681780000492
表2A.
Figure BDA0003843681780000493
Figure BDA0003843681780000501
图2A-C显示了新鲜冷冻样品和两种不同FFPE小鼠脑样品中的空间基因聚类。使用新鲜冷冻生物样品获得的数据示于图2A，使用FFPE生物样品(未去交联)获得的数据示于图2B，且使用FFPE生物样品(去交联)的获得数据示于图2C。图2C显示了当小鼠脑FFPE生物样品用TE缓冲液在70℃去交联60分钟时，与新鲜冷冻样品(图2A)相似的空间基因表达和聚类重现(与图2B中没有明显的聚类相比)。
图3A-C显示使用小鼠脑样品的个体基因(PRKCD)的空间聚类。使用新鲜冷冻生物样品获得的数据示于图3A，使用FFPE生物样品(未去交联)获得的数据示于图3B，且使用FFPE生物样品(去交联)的获得数据示于图3C。图3C显示当小鼠脑FFPE生物样品在70℃用TE缓冲液去交联60分钟时，观察到的个体基因(PRKCD)的空间分辨率类似于新鲜冷冻样品(图3A)。
图4A-C显示从不同生物样品获得的数据的样品相关图。图4A是从新鲜冷冻样品获得的数据和从新鲜冷冻样品获得的数据的相关图。图4B是从去交联的FFPE生物样品获得的数据和从去交联的FFPE生物样品获得的数据的相关图。
图4C是从去交联的FFPE生物样品获得的数据和从新鲜冷冻的生物样品获得的数据的相关图。这些数据表明，FFPE生物样品的去交联方案具有高度可重复性。
实施例3.去交联人类癌症FFPE样品的空间分析
表3A、3B和3C汇总了对人类癌症样品进行的空间分析。第1-4行代表使用来自患有侵袭性小叶癌的两名个体的新鲜冷冻样品获得的数据。根据实施例1中的方案将两份三阴性FFPE乳腺癌样品去交联。第5-8行代表使用7年龄化生癌FFPE生物样品获得的数据。第9-12行代表使用4年龄管癌生物样品获得的数据。与新鲜冷冻样品相比，使用7年龄化生性癌FFPE生物样品可实现约25-30％的表现。
表3A.
Figure BDA0003843681780000511
Figure BDA0003843681780000521
表3B.
Figure BDA0003843681780000522
Figure BDA0003843681780000531
表3C.
Figure BDA0003843681780000532
Figure BDA0003843681780000541
图5A-B和图6A-B中表示的数据由去交联的7年龄化生癌FFPE生物样品(样品151683，表3A-C中的第5行)产生。图5A-B显示采用去交联的7年龄化生癌FFPE生物样品的成功空间聚类。图5A是具有由UMI计数着色的点的组织图。图5B是由UMI计数着色的点的t-SNE投影。图6A-B也显示来自去交联的7年龄化生癌FFPE生物样品的成功空间聚类。图6A是具有通过自动聚类着色的点的组织图的表现。图6B是通过自动聚类着色的点的t-SNE投影的表现。
实施例4.去交联FFPE样品上的TdT/T4DNA连接酶夹板连接
用于提高去交联的FFPE生物样品中的文库制备效率的示例性方法显示在图7中。遵循示意图的方案可用于在dCTP存在下向用末端脱氧核苷酸转移酶逆转录生成的cDNA的3′端添加多聚(C)尾。提供了一种部分双链夹板寡核苷酸，其包含具有测序柄的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸所具有的序列以5′至3′方向包括：与添加的多聚(C)基本上互补的多聚(G)序列和与测序柄基本上互补的单链部分。夹板寡核苷酸的第一个寡核苷酸用T4 DNA连接酶连接至多聚(C)序列。在存在KOH的情况下，夹板寡核苷酸的第二寡核苷酸与包含第一寡核苷酸的捕获探针解离，并且使用与连接至延伸捕获探针的测序柄基本上互补的引物进行第二链合成。
图8A-B显示了由去交联的FFPE生物样品制备的cDNA。例如，图8A显示了与用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和T4 DNA连接酶(8.8ng/μL)产生的cDNA相比，由标准制备物(3.3ng/μL)产生的cDNA。图8B显示了与用TdT和T4 DNA连接酶产生的cDNA(7.1ng/μL)相比，由标准制备物(2.2ng/μL)产生的cDNA。两幅图都表明使用TdT和连接策略获得了更高的产量。
图9-10显示了对去交联的FFPE生物样品进行的成功空间分析，其中TdT和T4 DNA连接酶策略用于产生第二链。图10显示了在去交联的FFPE生物样品中成功的空间聚类，包括TdT和T4 DNA连接酶策略以将测序柄连接至延伸的捕获探针。
实施例5.在去交联的FFPE生物样品上使用随机引物进行第二链合成
图11是可用于在使用随机引物进行逆转录后产生第二链的方法的示意图。在从阵列中移出去交联的FFPE生物样品后，将包括测序柄的随机六聚体或八聚体引物提供给阵列。随机引物在逆转录后在随机位置与延伸的捕获探针杂交。超过一种的随机引物可以与延伸的捕获探针杂交。提供了标准置换聚合酶(Klenow片段)来延伸杂交的随机引物并产生第二链。反应在37℃进行。
图12显示了使用已固定21小时的去交联FFPE生物样品(小鼠脑)制备的测序文库。测序文库通过15个循环的标准索引PCR直接从第二链扩增。最终的文库比从新鲜冷冻样品制备的文库短，其在预期中。
图13和14显示了对去交联的FFPE生物样品进行的成功空间分析，其中第二链是用包括测序柄的随机引物和链置换聚合酶产生的。
实施例6.使用5′App DNA/RNA连接酶的单链连接
图15是可用于在逆转录后将测序柄连接至延伸捕获探针的3’端的示意图。在该实施例中，可在逆转录后将5′腺苷酸化衔接子提供给去交联的FFPE生物样品。5′腺苷酸化衔接子可以连接至延伸捕获探针的3′端。也可以封闭腺苷酸化衔接子的3′端，以防止5′腺苷酸化衔接子与其自身连接。例如，腺苷酸化衔接子的3′端可以具有3′端封闭基团，例如双脱氧核苷酸或3′-氨基接头，它们缺少3′-OH基团。5′腺苷酸化衔接子可以通过5′App DNA/RNA连接酶连接。与连接的5′腺苷酸化衔接子中的测序柄基本上互补的引物可以与测序柄杂交并延伸以产生第二链。
实施例7.使用TACS连接的单链连接
图16是可用于在逆转录后将测序柄连接至延伸捕获探针的3′端的方法的示意图。在该实施例中，可以将多聚(A)序列添加至延伸捕获探针的3′端。多聚(A)序列可以是核糖核酸序列并且可以在ATP存在下添加TdT。可以使用RNA连接酶将包含测序柄的衔接子连接至核糖核酸多聚(A)序列。RNA连接酶可以是CircLigase。与衔接子中的测序柄基本上互补的引物可以与测序柄杂交并延伸以产生第二链。引物可以用可以加工作为底物的RNA碱基的DNA聚合酶进行延伸。DNA聚合酶可以是Taq种类衍生的聚合酶。
实施例8.处理FFPE生物样品
根据伦理许可编号4570-2019提取了体重25克、8-12周龄的雄性小鼠的FFPE小鼠脑样品(样品编号C57BL6J(Adlego Biomedical))。RIN计算为2.9，DV200为65％。
在伦理许可号2018/2264-31下提取了高级别浆液性卵巢癌肉瘤转移至网膜的FFPE妇科癌肉瘤样品。计算了两个区域的RIN和DV200：1919-1样品RIN 2.5，DV20069％，而1919-2样品RIN 2.30，DV20064％。
FFPE样品的切片、脱蜡和染色：在43C的水浴中漂浮后，将妇科癌肉瘤切片(12μm厚)置于空间阵列载玻片(Visium，10X Genomics)上。对FFPE小鼠脑(10μm厚)和FFPE肺SARS-CoV-2感染活检物(10μm厚)重复该过程。切片后，载玻片在烘箱中于40℃干燥1小时45分钟。然后将载玻片放入载玻片收发机(mailer)内，用封口膜密封并在4℃放置过夜。通过浸入以下试剂和指定的持续时间使载玻片脱蜡：二甲苯7分钟、二甲苯7分钟、EtOH 99％2分钟、EtOH 99％2分钟、EtOH 96％2分钟、EtOH 96％2分钟。染色根据Visium空间基因表达试剂盒用户指南(10x Genomics公司，https://support.10Xgenomics.com/spatial-gene-expression/library-prep/doc/user-gui de-visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-user-guide)步骤1.3进行，包括以下变动：步骤1.3.q，载玻片在Dako蓝化缓冲液(#CS70230-2Agilent)中孵育30秒。步骤1.3.z后，将载玻片用200μl85％甘油85％封固，并在载玻片上盖上盖玻片。
H&E成像：在高分辨率显微镜下扫描载玻片以获得组织图像。成像后，通过将载玻片保持在800ml烧杯中并让甘油扩散直至盖玻片移位并且水中不再可见密度变化来去除甘油和盖玻片。然后使载玻片在37℃干燥。
分析物回收和透化：将载玻片封固在Array-It金属孵育室中。胶原酶平衡至37℃，每孔加入75μl。将载玻片密封并在带加热盖的Thermo-block中37℃孵育20分钟。孵育后，用移液管吸出胶原酶，并通过向各孔添加和去除100μl0.1×SSC缓冲液来冲洗孔。接下来将100μl Tris-EDTA(TE)缓冲液添加至各孔中，将载玻片密封并在带加热盖的Thermo-block中70℃孵育1小时。孵育后，取出载玻片并在室温平衡5分钟。接下来，将0.1％胃蛋白酶溶液(P7000-25G)溶解在0.1M HCl(#319865-1000ML SigmaAldrich)中并在37℃平衡。孵育后，每孔用100μl0.1×SSC缓冲液清洗一次，用75μl制备的胃蛋白酶溶液透化组织样品，将载玻片密封并用加热的盖在37℃孵育30分钟。如用户指南的步骤1.2中所述进行逆转录，但载玻片在Array-It金属孵育盒而不是Visium载玻片盒中被遮蔽。
第二链合成和变性：第二链合成和变性是根据标准用户指南(步骤2)进行的，但是，载玻片在Array-It金属孵育室而不是载玻片盒中被遮蔽。
cDNA扩增、清理和定量：从小鼠脑和肉瘤获得的cDNA通过14个PCR循环进行扩增，其中根据用户指南(步骤3.2)进行设置。样品使用0.8×SPRIselect珠净化，而不是Visium空间基因表达中指定的0.6×，因此将80μl SPRIselect珠添加至100μl样品中，而不是60μl(步骤3.3.a)。此外，洗脱缓冲液体积减少到15μl而不是40.5μl(步骤3.3.j)。使用1μl样品在Agilent BioAnalyzer高灵敏度芯片上进行质量控制来检查cDNA产量(步骤3.4)。
片段化、末端修复和A加尾：10μl各样品在热循环仪(步骤4.1)中片段化，片段化运行时间为1分钟而不是5分钟。样品通过0.8×SPRI珠选择步骤在片段化后进行清理。将40μlSPRIselect珠添加至50μl样品中，并室温孵育5分钟。将试管置于高磁体位置直至溶液变清。弃上清，用125μl80％乙醇洗涤珠两次，每次30秒。除去80％乙醇后，让磁珠在磁体上干燥约2分钟(避免过度干燥)，然后向各样品添加50.5μl洗脱缓冲液。将样品从磁体移出，涡旋并短暂旋转，然后室温孵育2分钟。孵育后，将样品置于低磁体位置，直到溶液变清。将50μl各样品转移到新的排管中。
衔接子连接SPRIselect连接后清理：这些步骤按照用户指南中描述的说明进行(步骤4.3和4.4)。
样品索引PCR和清理：根据用户指南(步骤4.5)中的制造商说明对样品进行8个循环PCR的索引。根据步骤4.6对样品进行清理，但是，添加了40.5μl洗脱缓冲液(EB)而不是35.5μl，致使最终洗脱体积为40μl，然后转移到新的排管中。还另进行了0.8×SPRIselect珠纯化步骤(将32μl SPRIselect珠添加至40μl样品，并室温孵育5分钟)。将试管置于高磁体位置直至溶液变清。弃上清，将珠在200μl 80％乙醇中冲洗两次，每次30秒。冲洗后，让磁珠在磁体上干燥约2分钟(避免过度干燥)，并向各样品添加15μl洗脱缓冲液。将样品从磁体移出，涡旋并短暂离心，然后室温孵育2分钟。孵育后，将样品置于低磁体位置，直到溶液变清。洗脱的样品被转移至新的排管中。
成库后质量控制和稀释：根据用户指南(步骤4.7)进行成库后质量控制和稀释。此外，各样品取2μl用于dsDNA高灵敏度量子位试验(Thermo Fisher Scientific)以确定样品浓度。
测序：使用Illumina的Nextseq 500对文库进行测序。每次运行共4个样品，使用75个循环的高输出试剂盒，采用双末端双指数测序和定制测序引物(SEQ ID NO：2)而不是Read 2引物。将总共2ml的0.3μM定制测序引物加载到测序盒的8号孔中。库的上样浓度为1.8pM，加入1％PhiX。Read 1：28个循环，i7索引：10个循环，i5索引：10个循环，定制测序引物(SEQ ID NO：2)：44个循环(而不是制造商说明中的120个循环)。
数据预处理：使用cutadapt(v2.8)3对包含cDNA序列(Read2)的原始fastq文件进行预处理，以去除模板转换寡核苷酸(TSO)引物序列和多聚(A)均聚物。通过将TSO序列定义为非内部5′衔接子(这将从5′端移除部分或全部TSO序列)，最小重叠为5bp，容错率为0.1，来修整TSO序列。多聚(A)均聚物通过将10个A定义为常规3′衔接子来修剪(这将去除序列中任何位置出现的多聚(A)延伸序列以及最小重叠为5bp的尾随碱基对)。为了从相同的读取序列中搜索和修整两种衔接子类型，时间选项设置为2。
数据处理：所有成对的fastq文件(在TSO和多聚(A)修整之后)使用Space Rangerv1.0.0以及相应的jpeg格式的苏木精和曙红(H&E)染色图像进行处理。为了映射数据，mm10-3.0.0小家鼠(mus musculus)参考基因组用于小鼠样品，GRCh38-3.0.0智人(homosapiens)参考基因组用于人类样品(均包含在Space Ranger发行版v1.0.0中)。
实施例9.处理PFA固定生物样品
用多聚甲醛(PFA)在载玻片上以1％、2％和4％的浓度将小鼠脑样品固定10分钟，然后用冷甲醇孵育5分钟。冷甲醇孵育后进行标准H&E染色。小鼠脑样品在60℃用20mMTris-HCl在pH9.0下去交联1小时。去交联之后，从阵列上捕获的核酸产生标记的cDNA。小鼠脑样品在1×PBS(100μl)中洗涤两次。用胃蛋白酶测试了各种透化时间，包括：无胃蛋白酶、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟和70分钟。
图17A显示对照小鼠脑样品中标记的cDNA，其中在图17A所示的各种透化条件(例如透化孵育的次数和持续时间)下没有进行去交联。图17B显示了小鼠脑样品中标记的cDNA，其中样品(1％PFA固定)在60℃用Tris-HCl(pH9.0)去交联l小时并在各种条件(例如，透化孵育次数和持续时间)下透化，如图17B所示。图18是显示在各种透化时间和去交联条件(x轴)下标记的cDNA与背景噪声(y轴)的信噪比的图。图18中的底线代表没有透化作用(例如，没有胃蛋白酶)并且在背景噪声上几乎没有检测到信号的对照样品。数据代表在20mM Tris-HCl处理的样品中改进的荧光信号，例如具有1或2个去交联期和10分钟透化孵育的20mM Tris-HCl处理的样品。此外，增加去交联持续时间似乎会降低TE缓冲液处理样品中的信噪比。
图19A和19B显示在如图19A所示的不同透化持续时间下未进行去交联的一组对照样品(图19A)或在如图19B所示的不同的透化持续时间下的一组去交联样品(图19B)中检测到的cDNA信号。图19A-B中显示的未去交联和去交联的样品均先前用2％PFA固定。如图所示，对于该实验，50分钟的透化孵育在去交联后提供了最强的信号(图19B)。
图20A和20B显示在如图20A所示的不同透化持续时间下未进行解交联的一组对照样品(图20A)或在如图20B所示的不同的透化持续时间下的一组去交联样品(图20B)中检测到的cDNA信号。图20A和20B中显示的未去交联和去交联的样品均先前用4％PFA固定。如图所示，对于该实验，30分钟的透化在去交联后提供了最强的信号(图20B)。
图21A和21B是显示在不同PFA固定条件(例如，1％、2％或4％PFA)和不同透化持续时间(例如，10、20、30、40、50、60或70分钟)(x轴)下样品的标记cDNA与背景(y轴)的信噪比。图21B显示了来自图21A的4％PFA固定对照和去交联的4％PFA固定样品。数据显示，去交联改善了载玻片上PFA固定样品的信号检测。数据还表明，增加透化持续时间并不一定会导致增加的cDNA/背景噪声比。
实施例10.处理心脏灌注的PFA固定生物样品(心脏灌注数据)
小鼠心脏组织在组织分离前用1xPBS灌注，然后是4％PFA溶液。然后将灌注的样品在冷甲醇中孵育5分钟。冷甲醇孵育后进行标准H&E染色。小鼠脑样品在60℃用20mM Tris-HCl在pH9.0下去交联1小时。去交联之后，从阵列上捕获的核酸产生标记的cDNA。小鼠脑样品在1×PBS(100μl)中洗涤两次。用胃蛋白酶测试了各种透化时间，包括：无胃蛋白酶(对照)、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟或70分钟。
图22A和22B显示在如图22A所示的不同透化持续时间下未进行去交联的一组对照样品(图22A)或在如图22B所示的不同的透化持续时间下的一组去交联样品(图22B)中检测到的标记cDNA信号。图22A和22B中显示的未去交联和去交联的样品均先前用4％PFA固定。如图所示，对于该实验，20分钟的透化孵育在去交联后提供了最强的信号(图22B)。
图23A和23B是显示来自甲醇对照样品、4％PFA固定对照样品和4％PFA固定样品的总cDNA荧光(y轴)检测的图，所述样品经历1小时或2小时的去交联，结果来自生物样品(图23A)或背景荧光(图23B)。样品被透化10、20、30、40、50、60或70分钟，或根本不透化(例如，没有胃蛋白酶)(对照样品)。
图24是显示在各种透化时间和去交联条件(x轴)下标记的cDNA与背景荧光(y轴)的信噪比的图。数据显示4％的心脏灌注样品产生大量背景信号(图23A)。如上所述去交联的心脏灌注样品导致增加的信噪比并且延长去交联孵育(例如，2小时)导致荧光信号降低。
实施例11.PFA固定生物样品中的基因表达分析
小鼠脑样品在1％、2％或4％PFA中固定在载玻片上10分钟，然后冷甲醇孵育5分钟。冷甲醇孵育后进行标准H&E染色。小鼠脑样品在60℃用20mM Tris-HCl在pH9.0下去交联1小时。去交联之后，从阵列上捕获的核酸产生标记的cDNA。小鼠脑样品在1×PBS(100μl)中洗涤两次。用胃蛋白酶对不同的样品测试了不同的透化时间(如下所示)，如下所示：
仅甲醇固定(20分钟)(对照)
4％PFA载玻片上固定(30分钟)(对照)
4％PFA载玻片上固定，去交联(30分钟)
2％PFA载玻片上固定，去交联(50分钟)
1％PFA载玻片上固定，去交联(20分钟)
4％PFA固定，心脏灌注(20分钟)(对照)
4％PFA固定，心脏灌注，去交联(20分钟)
图25-D显示了上述样品的测序灵敏度指标。图25A显示了从各样品获得的可用读数的分数。图25B显示了置信地映射到转录组的读数。图25C显示各点的中值基因(每个点30k原始读数)。图25D显示了各点的中值UMI计数(每个点30k原始读数)。显示在图25B-D中的数据与小鼠mm10参考基因组进行了比较。
数据显示，相对于4％心脏灌注PFA固定对照样品(无去交联)，添加去交联步骤提高了4％心脏灌注PFA固定样品的灵敏度。向载玻片上PFA固定的小鼠脑样品添加去交联步骤导致各灵敏度指标相对于4％PFA对照样品(无去交联)增加。
图26A-C显示了使用不同小鼠脑样品进行的空间基因聚类。图26A中所示数据是仅甲醇孵育样品(对照)，图26B中所示数据是4％PFA载玻片上固定小鼠脑样品，无去交联，而图26C中所示数据是4％PFA载玻片上固定小鼠脑样品，经历了如上所述的去交联。图26C显示了空间基因表达和空间聚类的改善，特别是皮质的层状区别(箭头)。
图27A-C显示心脏灌注样品中的空间基因聚类。图27A中所示数据是仅甲醇孵育样品(对照)，图27B中所示数据是4％PFA灌注对照，无去交联，图27C中所示数据是4％PFA灌注样品，经历了如上所述的去交联。相对于没有去交联的5％PFA灌注对照，经历了去交联的4％灌注样品显示空间基因聚类(箭头)的灵敏度提高。
实施例12-基于随机的第二链合成
测试随机引发的第二链合成以确定其对检测在逆转录(例如，第一链cDNA合成)期间未掺入模板转换寡核苷酸(TSO)的分析物的灵敏度的作用。在空间阵列上捕获分析物(例如，mRNA)，进行逆转录，并在不同条件下进行第二链合成。根据Visium空间基因表达试剂盒用户指南(例如，RevC，日期为2020年6月)进行逆转录和透化。测试了多种第二链合成条件，包括在逆转录过程中包含TSO但仅采用包括TSO序列后跟随机序列(SEQ ID NO：3)的引物的样品，在逆转录过程中包含TSO且采用包括TSO序列后跟随机序列(SEQ ID NO：3)的引物和TSO引物的组合的样品，以及在逆转录期间不包括TSO然后采用包括TSO序列后跟随机序列(SEQ ID NO：3)的引物的第三样品(对照)。
此外，在上述各第二链合成条件下测试了多种DNA聚合酶。对DNA聚合酶Bst 2.0和Bst 3.0分别进行了测试，发现两者都具有中等热稳定性和高链置换活性。Bst3.0显示出更高的逆转录活性和改善的扩增和抑制剂耐受性。在所有条件下，引物在4℃保持10分钟以进行杂交，然后在37℃保持60分钟以进行延伸。
图28显示了x轴上显示的各种条件的30K原始读数度量。与Bst 3.0相比，显示Bst2.0对于采用TSO序列后跟随机序列(SEQ ID NO：3)的第二链合成具有更高的灵敏度。图28还显示其中采用TSO序列后跟随机序列(“随机物”)的所有第二链合成条件与对照条件相比检测到的中值基因增加。与用于对照的5150个基因相比，使用Bst2.0以及TSO和TSO序列后跟随机序列(随机物)的组合检测到大约5,800个基因，灵敏度提高了约13％。检测到的中值UMI在TSO条件下的逆转录中是相似的。
图29显示了x轴上显示的各种条件的中值基因和UMI(映射读数)。在比较映射读数(20K)时，观察到采用TSO序列后跟随机序列(随机物)以及TSO和TSO序列后跟随机序列的组合的第二链合成的中值基因和UMI均增加。
总而言之，数据表明基于随机物的第二链合成导致检测到的中值基因增加(10-20％)，但由于包括TSO序列在内的更多读数，映射和可用读数减少。测试的最成功的条件是TSO和含随机序列(10bp随机序列)TSO的组合，采用Bst 2.0。数据还显示，基于随机物的第二链合成与无TSO逆转录化学相容，但与在RT中采用TSO的基于随机物的第二链合成相比，测序质量和灵敏度略有下降。
实施例13-基于随机的第二链合成
测试随机引发的第二链合成以确定检测在逆转录(例如，第一链cDNA合成)期间未掺入模板转换寡核苷酸(TSO)的分析物的灵敏度是否增加。在空间阵列上捕获分析物(例如，mRNA)，进行逆转录，并在不同条件下进行第二链合成。根据Visium空间基因表达试剂盒用户指南(例如，RevC，日期为2020年6月)进行逆转录和透化。测试了多种第二链合成条件，包括在逆转录过程中包含TSO但采用包含22nt(x22)序列后跟6 nt随机序列(SEQ ID NO：4)或10nt随机序列(SEQ ID NO：5)的引物的样品，在逆转录过程中包含TSO且采用包含x22序列后跟6nt或10nt随机序列(分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)的引物与TSO引物的组合的样品，和在逆转录过程中不包含TSO(对照)然后采用包含x22序列后跟6nt或10nt随机序列(分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)的引物的第三样品。用两个不同的循环程序测试了逆转录，如下表4和表5所示。用表6中列出的试剂进行第二链合成，并用具有6nt随机序列(SEQ ID NO：4)或10nt随机序列(SEQ ID NO：5)的x22序列进行测试。
表4. 37℃循环程序
步骤 温度 时间
预冷 4℃ ∞
杂交 4℃ 10分钟
延伸 37℃ 60分钟
保持 4℃ ∞
表5. 60℃循环程序
Figure BDA0003843681780000631
Figure BDA0003843681780000641
表6.第二链合成试剂
试剂 终浓度
等温缓冲液(NEB) 1X
MgSO4 6mM
dNTP 0.5mM
第二链引物 5μM
x22-随机物(6聚体或10聚体) 15μM
Bst2.0DNA聚合酶 0.5U/μL
表7和7A中显示的数据表明，与TSO和TSO后跟随机序列(实施例12)的组合相比，使用替代序列(x22序列)代替TSO序列导致检测到的中值基因和中值UMI均增加(约10％)。数据还显示，37℃循环程序在库质量和灵敏度方面优于60℃慢速调制。在6碱基对和10碱基对随机序列之间检测到最小差异。
表7.
Figure BDA0003843681780000651
表7A.
Figure BDA0003843681780000652
Figure BDA0003843681780000661
序列表
<110> 10x基因组学有限公司（10x Genomics, Inc）
空间转录组学公司（Spatial Transcriptomics AB）
<120> 确定生物样品中靶核酸位置的方法
<130> 47706-0155WO1
<150> US 63/087,553
<151> 2020-10-05
<150> US 62/985,292
<151> 2020-03-04
<150> US 62/959,765
<151> 2019-01-10
<150> US 63/079,189
<151> 2020-09-16
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 多聚(dT)捕获域
<400> 1
tttttttttt 10
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 定制测序引物
<400> 2
aagcagtggt atcaacgcag agtacatggg 30
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 模板转换寡核苷酸，具有10 nt随机序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(32)
<223> n是a, c, g或t
<400> 3
aagcagtggt atcaacgcag agnnnnnnnn nn 32
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> x22_6mer
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(28)
<223> n是a, c, g或t
<400> 4
ttgctaggac cggccttaaa gcnnnnnn 28
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> x22_10mer
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(32)
<223> n是a, c, g或t
<400> 5
ttgctaggac cggccttaaa gcnnnnnnnn nn 32

Claims (53)

1.一种确定靶核酸在固定生物样品中的位置的方法，所述方法包括：
(a)在包含多个捕获探针的空间阵列上的固定生物样品，其中多个捕获探针中的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域；
(b)使固定生物样品中的一个或多个交联物去交联，从而使得捕获域结合至靶核酸或其代用物；
(c)延伸捕获探针以产生与靶核酸的部分互补的核酸序列；
(d)产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包含与空间条形码互补的序列和对应于靶核酸中的序列的部分的核酸序列；和
(e)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸序列的全部或部分或其互补物，和采用(i)和(ii)的确定的序列来鉴定靶核酸在固定生物样品中的位置。
2.如权利要求1所述的方法，其中去交联步骤包括加热固定生物样品。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中去交联步骤包括进行化学反应或使用酶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述固定生物样品是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)生物样品。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述固定生物样品是多聚甲醛固定生物样品。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中去交联步骤包括使用Tris-EDTA(TE)缓冲液。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述TE缓冲液具有约7.5至约8.5的pH。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述TE缓冲液具有约65℃至约75℃的温度，并且与所述FFPE生物样品接触约10分钟至约200分钟。
9.如权利要求1-5所述的方法，其中去交联步骤包括在约55℃至约65℃的温度使用具有约8.5至9.5的pH的Tris-HCl缓冲液，并且与多聚甲醛固定生物样品接触约10分钟至约200分钟。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，还包括在去交联步骤之后使所述固定生物样品透化的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中使所述固定生物样品透化的步骤包括使用蛋白酶，其中所述蛋白酶是胃蛋白酶或蛋白酶K。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针包括附加捕获探针，其以5′至3′方向包含：空间条形码和多聚(T)捕获域。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述靶核酸包括RNA。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述方法在步骤(b)和(c)之间还包括将固定生物样品与5′至3′单链DNA核酸外切酶一起孵育的步骤。
16.如权利要求13或14所述的方法，其中所述方法还包括，在步骤(b)和(c)之间，将固定生物样品与5′至3′单链DNA核酸外切酶和双链DNA核酸内切酶一起孵育的步骤，其中单链DNA核酸外切酶是T7核酸内切酶或RecJf。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述固定生物样品与具有富含AT的限制性核酸内切酶识别序列的限制性核酸内切酶一起孵育。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括以下步骤：将均聚核苷酸序列添加至捕获探针的3′端；和使用夹板连接或DNA聚合酶延伸反应将测序或PCR柄连接至均聚核苷酸序列的3′端。
19.如权利要求18所述的方法，其中添加均聚核苷酸序列的步骤使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)进行。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中夹板连接包括使用部分双链核酸，其包含与第二寡核苷酸杂交的第一寡核苷酸，其中：
第一寡核苷酸包含功能域；
第二寡核苷酸以5′至3′方向包含：多聚(G)序列和与功能域基本上互补的序列；
第二寡核苷酸的多聚(G)序列与捕获探针的多聚(C)序列结合；和
部分双链核酸在第二链上具有5′突出端，其中所述5′突出端包含多聚(G)序列的至少部分。
21.如权利要求20所述的方法，其中功能域是测序或PCR柄并且夹板连接导致将测序或PCR柄添加至捕获域的3′端。
22.如权利要求21所述的方法，其中步骤(d)还包括：将包含与捕获探针中的测序或PCR柄基本上互补的序列的引物杂交；并延伸引物以产生第二链。
23.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中步骤(d)至少部分地包括使用连接酶将5′腺苷酸化衔接子连接至所述捕获探针的3′端的步骤。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述连接酶是5′App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶2或任何其它单链DNA或RNA连接酶。
25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述5′腺苷酸化衔接子包括测序柄。
26.如权利要求25所述的方法，其中步骤(d)还包括：将包含与捕获探针中的测序或PCR柄基本上互补的序列的引物杂交；并延伸引物以产生第二链。
27.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中步骤(d)至少部分地包括以下步骤：
在捕获探针的3′端添加多聚(A)序列；和
将衔接子连接至捕获探针中多聚(A)序列的3′端。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述多聚(A)序列是核糖核酸序列并且所述连接使用RNA连接进行。
29.如权利要求27或28中任一项所述的方法，其中，所述衔接子包括测序或PCR柄。
30.如权利要求29所述的方法，其中步骤(d)还包括：将包含与捕获探针中的测序或PCR柄基本上互补的序列的引物杂交；并延伸引物以产生第二链。
31.如权利要求30所述的方法，其中延伸引物以产生第二链的步骤使用DNA聚合酶进行。
32.如权利要求30所述的方法，其中延伸引物以产生第二链的步骤使用可使用RNA碱基作为底物的DNA聚合酶进行。
33.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括杂交一种或多种引物，其中所述一种或多种引物的引物包含随机序列和功能域，其中所述随机序列与延伸的捕获探针中与随机序列基本上互补的序列杂交。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述功能域是测序柄。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中步骤(d)还包括延伸所述引物以产生所述第二链。
36.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中步骤(d)至少部分地包括将衔接子连接至所述捕获探针的3′端的步骤。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述衔接子包括测序柄。
38.如权利要求37所述的方法，其中步骤(d)还包括：
杂交包含与捕获探针中的测序柄基本上互补的序列的引物；和
延伸引物以产生第二链。
39.如权利要求33所述的方法，其中所述功能域包含模板转换寡核苷酸序列，后跟随机序列。
40.如权利要求33所述的方法，其中所述功能域后跟包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的随机序列。
41.如权利要求39或40所述的方法，其还包括模板转换寡核苷酸。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对所述固定生物样品进行成像。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中，所述固定生物样品是FFPE组织切片或多聚甲醛固定的组织切片。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含位于所述捕获探针中的捕获域5′的独特分子标识符(UMI)。
45.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其包括在步骤(b)之后使固定生物样品与第一探针接触，其中第一探针以5′至3′方向包括：第一功能域和与靶核酸的部分基本上互补的第一序列。
46.如权利要求45所述的方法，其还包括：
(i)使固定生物样品与第二探针接触，其中第二探针以5′到3′方向包含：与靶核酸的部分基本上互补的第二序列和分析物捕获序列，其中捕获域结合至靶核酸的代用物的分析物捕获序列；
第二探针的5′端包含5′磷酸；和
第一序列和第二序列与靶核酸结合；
(ii)将第一探针的3′端连接至第二探针的5′端以产生靶核酸的代用物；
(iii)延伸捕获探针的3′端以产生对应于靶核酸的代用物的部分的序列；
(iv)产生与延伸的捕获探针杂交的第二链，其中第二链包含与空间条形码互补的序列和与靶核酸的代用物的部分互补的序列；和
(v)确定(i)空间条形码序列的全部或部分或其互补物，和(ii)靶核酸的代用物的全部或部分或其互补物，和采用(i)和(ii)的确定的序列来鉴定靶核酸在固定生物样品中的位置。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中第一功能域是第一测序柄并且其中所述分析物捕获序列与所述捕获域或其部分基本上互补。
48.如权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述第一探针的3′端与所述第二探针的5′端的连接使用连接酶进行。
49.如权利要求45-48中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)和(c)之间用RNA酶处理所述FFPE生物样品的步骤。
50.如权利要求45-49中任一项所述的方法，其中步骤(e)包括：将包含所述第一功能域的至少部分的引物与所述捕获探针杂交；和延伸引物以产生第二链。
51.如权利要求45-50中任一项所述的方法，其中所述第一探针的3′端包含3′二核糖序列。
52.如权利要求1-17中任一项所述的方法，包括在步骤(a)之后将分析物捕获序列添加至所述靶核酸。
53.如权利要求52所述的方法，其中添加所述分析物捕获序列使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或多聚(A)聚合酶进行。
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