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CN109715214B - Tlr7激动剂和hbv衣壳组装抑制剂的组合治疗 - Google Patents

Tlr7激动剂和hbv衣壳组装抑制剂的组合治疗 Download PDF

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CN109715214B CN201780054239.9A CN201780054239A CN109715214B CN 109715214 B CN109715214 B CN 109715214B CN 201780054239 A CN201780054239 A CN 201780054239A CN 109715214 B CN109715214 B CN 109715214B
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Abstract

本发明涉及用于治疗乙型肝炎病毒感染的组合物和方法。具体而言，本发明涉及组合疗法，其包括施用TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂，用于治疗慢性乙型肝炎患者。

Description

TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂的组合治疗
本发明涉及用于治疗乙型肝炎病毒感染的组合物和方法。具体而言，本发明涉及包括施用TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂的组合疗法，其用于治疗慢性乙型肝炎患者。
发明领域
乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染是一种严重的全球公共健康问题，全球有超过2.4亿人受到慢性感染。HBV属于嗜肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)家族。进入肝细胞后，其病毒基因组被递送到细胞核中，在此通过部分双链病毒基因组的DNA修复形成共价闭合的环状DNA(cccDNA)，cccDNA用作病毒RNA转录的模板。病毒前基因组RNA与另外两种病毒组分(衣壳蛋白和聚合酶)相互作用以形成其中发生病毒DNA复制的衣壳颗粒。HBV具有包含240个衣壳(或核心)蛋白拷贝的二十面体核心。衣壳蛋白的主要生物学功能是用作结构蛋白以使前基因组RNA壳体化并在细胞质中形成不成熟的衣壳颗粒。该步骤是病毒DNA复制的先决条件。当通过病毒前基因组RNA的逆转录形成接近全长的松弛环状DNA时，不成熟的衣壳变成成熟的衣壳。大多数壳体化基因组的拷贝有效地与细胞脂质和病毒包膜蛋白(S、M和L)结合以进行病毒体组装和分泌。然而，非感染性颗粒的产生量远远超过感染性病毒体。这些空的包膜颗粒被称为亚病毒颗粒(SVP)。S、M和L包膜蛋白由含有三个不同起始密码子的单个ORF(可读框)表达。所有三种蛋白质在它们的C-末端共享226aa序列，即S-结构域。S-结构域含有HBsAg表位(Lambert,C.&R.Prange.Virol J,2007,4,45)。
许多观察结果表明，多种HBV病毒蛋白可通过干扰病毒识别信号系统和随后的干扰素(IFN)抗病毒活性来抵消最初的宿主细胞应答。其中，HBV空亚病毒颗粒的过度分泌可能参与维持慢性感染患者(CHB)中观察到的免疫耐受状态。持续暴露于HBsAg和其它病毒抗原可导致HBV特异性T细胞缺失或进行性功能受损(Kondo等人Journal of Immunology1993,150,4659–4671；Kondo等人Journal of Medical Virology 2004,74,425–433；Fisicaro等人Gastroenterology,2010,138,682-93；)。此外，已经报道了HBsAg通过直接相互作用抑制免疫细胞功能，例如单核细胞、树突细胞(DC)和天然杀伤(NK)细胞(Op denBrouw等人Immunology,2009b,126,280-9；Woltman等人PLoS One,2011,6,e15324；Shi等人J Viral Hepat.2012,19,e26-33；Kondo等人ISRN Gasteroenterology,2013,Article ID935295)。
HBsAg定量是慢性乙型肝炎预后和治疗响应的生物标志物。HBsAg缺失和血清转变是临床治愈的目标，但在慢性感染患者中很少观察到。目前的治疗例如抑制HBV DNA合成的核苷(酸)类似物不直接影响HBsAg水平。即使延长治疗，核苷(酸)类似物也显示出非常低的HBsAg清除率，与天然观察到的HBsAg清除率相当(Janssen等人Lancet,2005,365,123-9；Marcellin等人N.Engl.J.Med.,2004,351,1206-17；Buster等人Hepatology,2007,46,388-94)。
Toll样受体(TLR)检测广泛的保守的病原体相关分子模式(PAMP)。它们在觉察入侵病原体和随后启动先天免疫反应方面发挥重要作用。在人中有10个已知的TLR家族成员，其是I型跨膜蛋白，特征为细胞外富含亮氨酸的结构域和含有保守Toll/白细胞介素(IL)-1受体(TIR)结构域的胞质尾部。在该家族内，TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于核内体内。TLR7可以通过与特定的小分子配体(即TLR7激动剂)或其天然配体(即单链RNA、ssRNA)结合来活化。在ssRNA与TLR7结合后，其二聚形式的受体被认为进行结构变化，从而导致随后在其细胞质结构域募集衔接蛋白质，包括骨髓分化初级应答基因88(MyD88)。在通过MyD88途径启动受体信号级联后，激活细胞质转录因子如干扰素调节因子7(IRF-7)和核因子κB(NF-κB)。然后这些转录因子转位到细胞核并启动各种基因例如IFN-α和其它抗病毒细胞因子基因的转录。TLR7主要在浆细胞样细胞上、还有B细胞上表达。免疫细胞的反应性改变可能有助于在慢性病毒感染期间降低先天免疫反应。因此，激动剂诱导的TLR7的激活可能代表了治疗慢性病毒感染的新方法。(D.J Connolly和L.AJ O’Neill,Current Opinion inPharmacology 2012,12:510–518,P.A.Roethle等人,J.Med.Chem.2013,56,7324-7333)。
用口服TLR7激动剂治疗代表了一种提供更大功效且耐受性更好的有前景的解决方案。聚乙二醇化IFN-α(PEG-IFN-α)目前用于治疗慢性HBV，是用抗病毒核苷(酸)类似物进行潜在终身治疗的替代方法。在慢性HBV患者的一个亚组中，PEG-IFN-α治疗可以在有限的治疗持续时间后诱导病毒的持续免疫控制。然而，用干扰素治疗实现血清转变的HBV患者的百分比较低(对于HBeAg阳性患者，至多27％)，且该治疗通常耐受性差。此外，使用PEG-IFN-α和核苷(酸)二者进行治疗功能性治愈(定义为HBsAg缺失和血清转变)也很少见。鉴于这些局限性，迫切需要改进的治疗选择以治疗和诱导慢性HBV的功能性治愈。使用口服小分子TLR7激动剂的治疗是一种有前景的方法，其具有提供更大功效和耐受性的潜力(T.Asselah等人,Clin Liver Dis 2007,11,839–849)。
HBV衣壳蛋白在HBV复制中发挥重要作用。在基于组织培养的筛选中发现了杂芳基二氢嘧啶类化合物或HAP，包括名为Bay 41-4109、Bay 38-7690和Bay 39-5493的化合物(Deres K.等人Science 2003,893)。这些HAP类似物用作合成的变构激活剂并且能诱导导致核心蛋白质降解的异常衣壳形成。HAP类似物还将来自预装配的衣壳的核心蛋白质重组入非衣壳聚合物中，推定是通过HAP与衣壳'呼吸'期间释放的二聚体的相互作用、即各亚基间键的瞬时断裂实现的。将Bay 41-4109施用于HBV感染的转基因小鼠或人源化小鼠模型，显示出了体内功效，伴有HBV DNA减少(Deres K.等人Science 2003,893；Brezillon N.等人PLoS ONE 2011,e25096)。还表明双-SEA(用作分子“楔”的一种小分子)干扰正常衣壳蛋白几何形状和衣壳形成(Zlotnick A.等人J.Virol.2002,4848-4854)。
现在，HBV感染的临床治愈标准是HBsAg的缺失和/或血清转变。尽管PEG-IFN-α和核苷(酸)可用于HBV患者，但大多数(约90％或大于90％)的治疗患者未能实现这一目标，这主要是因为目前的疗法无法在大多数慢性感染的患者中引发抗HBsAg的中和抗体(抗HBs)的出现，这是HBV感染的解决的标志。因此，对于在诱导HBsAg缺失和/或血清转变以及促进抗HBs产生方面具有提高的成功率的治疗确实存在医疗需求。
发明概述
本发明涉及包含在药学上可接受的载体中的TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂的药物组合物。本文中的“TLR7激动剂”是式(I)或(II)的化合物，特别地，本文的“TLR7激动剂”是6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基(sulfonimidoyl)]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(S)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮；或6-氨基-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮；或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。本文的HBV衣壳组装抑制剂是式(III)的化合物或专利WO2014/037480、WO 2014/184328和WO2015/132276中公开的化合物中的任意一种，特别地，本文的HBV衣壳组装抑制剂是3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。
附图简述
图1是化合物1的单晶X-射线衍射。
图2是化合物3的单晶X-射线衍射。
图3是化合物4-a的单晶X-射线衍射。
图4显示了用介质、每周一次10mg/kg化合物4、每日一次20mg/kg化合物5和组合治疗治疗42天、然后经历42天脱治疗期的AAV-HBV感染小鼠的HBV DNA(图4A)、HBsAg(图4B)和抗-HB抗体水平(图4C)。结果表示为平均值±SEM。LLOQ:定量下限。
图4-D显示了在实施例5中第84天收获的脾，以通过ELISPOT鉴定产生抗-HB抗体的B细胞。Combo组中的斑点表示存在主动产生抗-HB抗体的B细胞。
图5显示了用介质、每隔一周一次1mg/kg化合物、每日一次20mg/kg化合物5和组合治疗治疗42天、然后经历42天脱治疗期的AAV-HBV感染小鼠的HBV DNA(图5A)、HBsAg(图5B)和抗-HB抗体水平(图5C)。结果表示为平均值±SEM。LLOQ:定量下限。
发明详述
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文所用，术语“C1-6烷基”是指1-6个碳原子的一价的直链或支链的饱和烃基。在特定的实施方案中，C1-6烷基具有1-6个碳原子，在更特定的实施方案中，具有1-4个碳原子。C1-6烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
如本文所用，术语“C1-6烷氧基”是指基团C1-6烷基-O-，其中的“C1-6烷基”如上文所定义；例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、2-丁氧基、叔丁氧基等。特定的“C1-6烷氧基”是甲氧基和乙氧基。
如本文所用，术语“卤代”或“卤素”在本文中可以互换使用，是指氟、氯、溴或碘。
术语“卤代C1-6烷基”是指其中所述烷基的至少一个氢原子已经被相同或不同的卤素原子、特别是氟原子代替的所述烷基。卤代C1-6烷基的实例包括一氟-、二氟-或三氟-甲基、-乙基或-丙基，例如3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟甲基、二氟乙基或三氟甲基。
单独的或组合使用的术语“羰基”是指基团-C(O)-。
术语“C1-6烷基羰基”是指基团C1-6烷基-C(O)-，其中“C1-6烷基”如上文所定义。具体的“C1-6烷基羰基”基团是乙酰基。
术语“C1-6烷氧基羰基”是指基团C1-6烷氧基-C(O)-，其中“C1-6烷氧基”如上文所定义。
单独的或组合使用的术语“C3-7环烷基”是指含有3-7个碳原子、特别是3-6个碳原子的饱和碳环，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。具体的“C3-7环烷基”是环丙基、环戊基和环己基。
单独的或组合使用的术语“-CmH2m-”表示含有m个(m≠0)碳原子或价键(m＝0)的饱和的直链或支链烷基。特别地，单独的或组合使用的“-CmH2m-”表示含有1-4个碳原子的饱和的直链或支链烷基。
术语“羧基-CmH2m-”是指基团“-CmH2m-COOH”，其中“-CmH2m-”如上文所定义。
术语“C3-7环烷基-CmH2m-”是指其中“C3-7环烷基”的氢原子之一被“-CmH2m-”基团代替的上文所定义的“C3-7环烷基”。
术语“杂环基”表示3至10个环原子的单价的饱和或部分不饱和的单环或二环的环系，其包含1-5个选自N、O和S的杂原子，其余环原子是碳。在具体的实施方案中，杂环基是4至7个环原子的单价饱和单环，其包含1、2或3个选自N、O和S的环杂原子，其余环原子是碳。单环饱和杂环基的实例是氮丙啶基、环氧乙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、二甲基吡咯烷基、乙氧基羰基吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、硫吗啉基、二氧代硫吗啉基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、高哌嗪基或氧杂氮杂环庚基。单环饱和杂环基可以进一步被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基和C1-6烷氧基羰基。取代的单环饱和杂环基的实例是4-甲基哌嗪基、二甲基吡咯烷基、乙氧基羰基吡咯烷基、二氟吡咯烷基、氟(甲基)吡咯烷基。二环饱和杂环基的实例是氮杂二环[3.2.1]辛基、奎宁环基、氧杂氮杂二环[3.2.1]辛基、氮杂二环[3.3.1]壬基、氧杂氮杂二环[3.3.1]壬基、硫杂氮杂二环[3.3.1]壬基、氮杂螺[3.3]庚基和氧杂氮杂螺[3.3]庚基。部分不饱和的杂环基的实例是二氢呋喃基、咪唑啉基、二氢噁唑基、四氢吡啶基和二氢吡喃基。
如本文所用，术语“非对映体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子彼此不互为镜像的立体异构体。非对映体具有不同的物理性质例如熔点、沸点、光谱性质、活性和反应性。
如本文所用，术语“对映体”是指彼此是不可叠加的镜像的化合物的两种立体异构体。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在生物学方面或其它方面不具有不期望的性质的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。
如本文所用，术语“前药”是指一种形式的化合物或化合物的衍生物，其在体内代谢、例如在施用后被个体的生物流体或酶代谢成化合物的药理学活性形式，以产生期望的药理学作用。前药描述在例如Richard B.Silverman,Organic Chemistry of Drug Designand Drug Action,Academic Press,San Diego,2004,第8章Prodrugs and Drug DeliverySystems,pp.497-558中。
术语“药学上可接受的酸加成盐”是指与无机酸和有机酸形成的那些药学上可接受的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸，所述有机酸选自脂肪族、脂环族、芳族、芳脂族、杂环、羧酸和磺酸类的有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、双羟萘酸(embonic acid)、苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸。
术语“药学上可接受的碱加成盐”是指与有机碱或无机碱形成的那些药学上可接受的盐。可接受的无机碱的实例包括钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐和铝盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐；取代的胺，包括天然存在的取代的胺，环状胺和碱性离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、三甲胺、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶和聚胺树脂。
包含一个或几个手性中心的式(I)的化合物可以以外消旋体、非对映体混合物或旋光单一异构体的形式存在。
如本文所用，“combo”是指组合。
如本文所用，“RT-PCR”是指逆转录聚合酶链反应。
如本文所用，“CLIA”是指化学发光免疫测定。
如本文所用，“AAV”是指腺相关病毒。
如本文所用，“AAV-HBV”是指携带1.3个拷贝的包装在AAV衣壳中的HBV基因组的重组病毒。通过给小鼠尾静脉注射AAV-HBV建立持续性HBV感染小鼠模型。在该小鼠模型中，活性HBV复制导致持续的HBV病毒标记物(例如HBV DNA、HBsAg、HBeAg等)。
如本文所用，“HBsAg”是指乙型肝炎表面抗原。
如本文所用，“HBeAg”是指乙型肝炎e抗原。
如本文所用，“抗HBs”是指抗HBsAg的抗体。
如本文所用，“HBV特异性引物”是指用作HBV DNA区域的特异性扩增的起点和终点的一对单链核酸。
如本文所用，“TLR7”是指任何物种来源的(例如人、鼠、土拨鼠等)的Toll样受体7。
如本文所用，“TLR7激动剂”是指作为TLR7的激动剂的化合物。除非另有说明，否则TLR7激动剂可以包括任何药学上可接受的形式的化合物，包括任何异构体(例如非对映体或对映体)、盐、溶剂化物、多晶型物等。特定化合物的TLR激动作用可以以任何合适的方式测定。例如，用于检测测试化合物的TLR激动作用的测定法描述于例如2002年12月11日提交的系列号为60/432,650的美国临时专利申请中，适用用于这些测定法的重组细胞系描述于例如2002年12月11日提交的系列号为60/432,651的美国临时专利申请中。
本发明涉及包含在药学上可接受的载体中的TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，“TLR7激动剂”是式(I)的化合物：
Figure BDA0001985118120000091
其中
R1是C1-6烷基；
R2是苄基，所述苄基是未被取代的或被1、2或3个独立地选自卤素和C1-6烷基的取代基取代；
R3是-NR4R5，其中
R4是C1-6烷基或C1-6烷氧基C1-6烷基；
R5是(C1-6烷基)2NCOOC1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基(苯基)C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基氧基C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷基羰基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基或吡咯烷基氨基甲酰基氧基C1-6烷基；或
R4和R5与它们所连接的氮一起形成杂环基；
或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。
在本发明的另一个实施方案中，“TLR7激动剂”是式(II)的化合物：
Figure BDA0001985118120000092
其中
R4是C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-7环烷基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基或吡咯烷基C1-6烷基；
R5是C1-6烷基、苯基C1-6烷基、吡啶基C1-6烷基或嘧啶基C1-6烷基，所述苯基C1-6烷基、吡啶基C1-6烷基和嘧啶基C1-6烷基是未被取代的或被1、2或3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、羧基、氨基甲酰基、卤代C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基氨基羰基、吡咯烷基羰基和哌啶基羰基；
R6是H；
或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。
更具体地，本发明的TLR7激动剂涉及6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺；或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。在施用后，式(I)的化合物被代谢为它们的活性形式，为有用的TLR7激动剂。
如本文所用，“乙型肝炎病毒”或“HBV”是指嗜肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)家族的成员，其具有约3,200个碱基对的小双链DNA基因组和对肝细胞的趋向性。“HBV”包括感染各种哺乳动物(例如人、非人灵长动物等)和禽(鸭等)宿主中的任一种的乙型肝炎病毒。“HBV”包括任何已知的HBV基因型，例如血清型A，B，C，D，E，F和G；任何HBV血清型或HBV亚型；任何HBV分离物；HBV变体，例如HBeAg阴性变体、耐药HBV变体(例如拉米夫定抗性变体；阿德福韦抗性突变体；替诺福韦抗性突变体；恩替卡韦抗性突变体等)等。
如本文所用，“HBV衣壳组装抑制剂”是指抑制和/或破坏和/或加速和/或阻碍和/或延迟和/或减少和/或改变正常HBV衣壳组装(例如在成熟过程中)和/或正常衣壳分解(例如在感染期间)和/或干扰衣壳稳定性、从而诱导异常衣壳形态和功能的化合物。
在本发明的一个实施方案中，HBV衣壳组装抑制剂是式(III)的化合物：
Figure BDA0001985118120000111
其中
R7是氢、卤素或C1-6烷基；
R8是氢或卤素；
R9是氢或卤素；
R10是C1-6烷基；
R11是氢、羟基C1-6烷基、氨基羰基、C1-6烷氧基羰基或羧基；
R12是氢、C1-6烷氧基羰基或羧基-CmH2m-；
X是羰基或磺酰基；
Y是-CH2-、-O-或-N(R13)-，
其中R13是氢、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-7环烷基-CmH2m-、C1-6烷氧基羰基-CmH2m-、-CtH2t-COOH、-卤代C1-6烷基-COOH、-(C1-6烷氧基)C1-6烷基-COOH、-C1-6烷基-O-C1-6烷基-COOH、-C3-7环烷基-CmH2m-COOH、-CmH2m-C3-7环烷基-COOH、羟基-CtH2t-、羧基螺[3.3]庚基或羧基苯基-CmH2m-、羧基吡啶基-CmH2m-；
W是-CH2-、-C(C1-6烷基)2-、-O-或羰基；
n是0或1；
m是0-7；
t是1-7；
或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。
更具体地，本发明的HBV衣壳组装抑制剂涉及3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。在另一个实施方案中，“HBV衣壳组装抑制剂”是专利WO2015/132276、WO 2014/184328和WO2014/037480中公开的化合物中的任意一种。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂，其中TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂独立地选自表1。(化合物5和化合物6公开在专利WO2015/132276中)。
表1.TLR7激动剂和HBV衣壳抑制剂的列表
Figure BDA0001985118120000121
Figure BDA0001985118120000131
Figure BDA0001985118120000141
更具体地，本发明涉及包含选自以下组合中的任意一种的TLR7激动剂和HBV衣壳抑制剂的药物组合物：
化合物1和化合物5；化合物1和化合物6；
化合物2和化合物5；化合物2和化合物6；
化合物3和化合物5；化合物3和化合物6；
化合物4和化合物5；化合物4和化合物6；
化合物1e-A和化合物5；化合物1e-A和化合物6；
化合物1e-B和化合物5；化合物1e-B和化合物6；
化合物4f-A和化合物5；以及化合物4f-A和化合物6。
上述组合的化合物1-6、1e-A、1e-B和4f-A可以被其相应的药学上可接受的盐、对映体或非对映体代替，这是本发明的另一个方面。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物由在药学上可接受的载体中的TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂组成。更具体地，所述组合物由在药学上可接受的载体中的以下化合物组成：
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(S)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(S)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮和3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮和3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；
6-氨基-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或
6-氨基-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮和3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸。
本发明的另一个实施方案涉及由在药学上可接受的载体中的以下化合物组成的药物组合物：
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或
6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸。
在本发明的另一个实施方案中，所述药物组合物可另外包含一种或多种其它抗病毒剂，其包括但不限于拉米夫定、阿德福韦、替诺福韦、替比夫定和恩替卡韦。
TLR7激动剂和/或HBV衣壳组装抑制剂的典型剂量可以在制造商推荐的范围内，并且如果在动物模型中体外响应指示，可以减少高达约一个数量级的浓度或量。因此，实际剂量将取决于医师的判断、患者的状况以及基于适当动物模型的体外响应性的治疗方法的有效性。
本发明的另一个实施方案涉及制备用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的方法，其特征在于在所述药物中使用TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂。
本发明的另一个实施方案涉及制备用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的方法，其特征在于，将TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂在相同的制剂中或以不同的制剂共同施用。
对于本发明的目的而言，“共同施用”是指TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂作为两种活性剂的任何分开施用或一起施用，其中所述两种活性剂作为适宜的剂量方案的一部分被施用，所述剂量方案被设计用于获得组合疗法益处。因此，所述两种活性剂可以作为相同药物组合物的一部分被施用或在分开的药物组合物中被施用。而且，所述两种活性剂可以在相同的时间施用或依次施用。
TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂可以与各种药学上可接受的惰性载体一起以片剂、胶囊、锭剂(lozengen)、药片、硬糖、散剂、喷雾剂、乳膏、药膏(salve)、栓剂、胶冻剂(jelly)、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、酏剂、糖浆剂等形式施用。这类剂型的施用可以以单剂量或多剂量进行。载体包括填充剂的固体稀释剂、无菌水介质和各种无毒的有机溶剂。这类剂型的施用可以通过口服施用、肠胃外施用、兽医施用来进行，但不限于这些。
本发明的另一个实施方案涉及制备用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的方法，其特征在于TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂通过相同途径或不同途径被施用于个体。
本发明的另一个实施方案涉及制备用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的方法，其特征在于TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂通过肠胃外或口服施用被施用于个体。
本发明的另一个实施方案涉及制备用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的方法，其特征在于将TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂施用于个体是同时的或依次的。在本发明的任意一种方法中，同时施用活性剂可以通过在相同的时间分开或依次施用活性剂或者以固定组合的形式一起施用活性剂来进行。而且，在本发明的任意一种方法中，分开或依次施用活性剂可以以任何顺序进行。
本发明的另一个实施方案涉及制备用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的方法，其特征在于其TLR7激动剂是式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。特别地，所述TLR7激动剂是6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(S)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮；或6-氨基-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮；或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。
本发明的另一个实施方案涉及制备用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的方法，其特征在于其HBV衣壳组装抑制剂是式(III)的化合物或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。特别地，所述HBV衣壳组装抑制剂是3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。
本发明的另一个实施方案涉及制备用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的方法，其特征在于所述药物还包含一种或多种其它抗病毒剂，其包括但不限于拉米夫定、阿德福韦、替诺福韦、替比夫定和恩替卡韦。
本发明的另一个实施方案涉及制备用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的方法，其中所述药物中使用的TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂是在药学上可接受的载体中的：
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或
6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸。
本发明的另一个实施方案涉及一种药盒，其包含：含有TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂的容器，所述药盒可以还包含无菌稀释剂。
本发明的另一个实施方案涉及所述药盒，其中所述药盒可以还包含包装插页，所述包装插页包括指导使用TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂的组合治疗作为治疗或预防乙型肝炎病毒感染的方法的印刷说明书。
本发明的另一个实施方案涉及所述药盒，其中TLR7激动剂是：
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺；
6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(S)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮；
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮；或
6-氨基-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮；
或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。
本发明的另一个实施方案涉及所述药盒，其中所述容器中使用的TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂是在药学上可接受的载体中的：
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或
6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸。
本发明的另一个实施方案涉及用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的方法，其包括给个体施用有效的第一个量的TLR7激动剂或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体；和第二个量的HBV衣壳组装抑制剂或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体；其中所述TLR7激动剂是6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(S)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮；6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮；或6-氨基-2-(S(R)-乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮；或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体；HBV衣壳组装抑制剂是3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或3-[(8aS)-7-[[(4R)-4-(2-氯-3-氟-苯基)-5-乙氧基羰基-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或其药学上可接受的盐、对映体或非对映体。
本发明的另一个实施方案涉及上文所述的药物组合物作为抗病毒药物的用途，特别是作为用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的用途。
本发明的另一个实施方案涉及TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂在制备上文所述的作为抗病毒药物、特别是用于治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物的药物组合物中的用途。
实施例
通过参考下面的实施例将更全面地理解本发明。然而，它们不应被解释为是对本发明的范围的限制。
实施例1
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺(化合物1)和6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺(化合物2)
Figure BDA0001985118120000211
步骤1:4-氨基-3-[(4-氯苯基)甲基]-2-氧代-1H-咪唑-5-甲腈的制备
Figure BDA0001985118120000212
在-80℃向三光气(5.9g)在干燥THF(40mL)中的溶液中加入在干燥THF(80mL)中的(4-氯苯基)甲胺(8.5g,Accela ChemBio Inc,目录号:SY004062-25g)和DIPEA(12.4g)。将该溶液在-80℃搅拌15min。在-80℃加入氨基丙二腈对甲苯磺酸盐(15.2g,TCI,目录号:A1119-25G)和DIPEA(6.2g)在干燥THF(40mL)中的溶液。在室温搅拌24h后，将反应真空浓缩，使残余物在EtOAc(300mL)与水(150mL)之间分配。将分离的有机层用盐水(50mL)洗涤两次，用氢氧化钠溶液(50mL,1N)萃取两次。将合并的氢氧化钠溶液层用10％重量的硫酸氢钠溶液中和，用EtOAc(50mL)萃取两次。用盐水洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。将残余物与乙醚一起研磨，收集得到的沉淀物，干燥，得到4-氨基-3-[(4-氯苯基)甲基]-2-氧代-1H-咪唑-5-甲腈(8.0g,化合物1a)，为黄色固体。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:249。
步骤2:6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-硫烷基-7H-嘌呤-8-酮的制备
Figure BDA0001985118120000221
向4-氨基-3-[(4-氯苯基)甲基]-2-氧代-1H-咪唑-5-甲腈(8.0g,32.0mmol,化合物1a)在THF(100mL)中的溶液中滴加异硫氰酸苯甲酰酯(11.5g,70.4mmol,TCI,目录号:A11596-100G)。在室温搅拌12h后，真空浓缩反应混合物。将残余物在乙醚(100mL)中研磨，通过过滤收集得到的沉淀物。
向得到的沉淀物在THF(300mL)中的溶液中加入氢氧化钠(30mL,2N)。将反应混合物回流50h，然后用10％重量的硫酸氢钠水溶液酸化至pH3。通过过滤收集得到的沉淀物，得到粗产物6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-硫烷基-7H-嘌呤-8-酮，为黄色固体(6.4g,化合物1b),将其不经进一步纯化即用于下一步。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:308。
步骤3:6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-乙基硫烷基-7H-嘌呤-8-酮的制备
Figure BDA0001985118120000222
在0℃，向6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-硫烷基-7H-嘌呤-8-酮(4.40g,化合物1b)在DMF(50mL)中的溶液中加入碳酸钾(3.95g,28.59mmol)，然后加入碘乙烷(2.68g,17.16mmol)。在室温搅拌12h后，将反应混合物倾入水(200mL)中，用10重量％的硫酸氢钠水溶液酸化。通过过滤收集得到的沉淀物，干燥，得到6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-乙基硫烷基-7H-嘌呤-8-酮(2.50g,化合物1c)，为白色固体，将其不经进一步纯化即用于下一步。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:336.0
步骤4:6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-乙基亚磺酰基-7H-嘌呤-8-酮的制备
Figure BDA0001985118120000231
在0℃向6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-乙基硫烷基-7H-嘌呤-8-酮(2.2g,化合物1c)中THF(100mL)中的混悬液中加入m-CPBA(1.36g,7.86mmol)。将反应混合物在0℃搅拌30min后，将反应混合物的体积真空减少至约50mL。通过过滤收集得到的沉淀物，用甲醇洗涤，干燥，得到6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-乙基亚磺酰基-7H-嘌呤-8-酮(1.94g,化合物1d)，为白色固体。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:352.0
步骤5:6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮的制备
Figure BDA0001985118120000232
在60℃向6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-乙基亚磺酰基-7H-嘌呤-8-酮(1.94g,5.51mmol)在Eaton试剂(30mL)中的溶液中分份加入NaN3(1.08g)，将混合物在该温度下搅拌30min。冷却后，将反应混合物倾入冰和氢氧化铵混合物(100mL,1M)中。通过过滤收集得到的沉淀物。通过制备型-HPLC纯化残余物，得到6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-(乙基磺亚氨酰基)-7H-嘌呤-8-酮(217mg,化合物1e)，为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:10.61(s,1H),7.42-7.35(m,4H),6.98(s,2H),4.96(s,2H),4.05(s,1H),3.42-3.37(m,2H),1.16(t,J＝7.4Hz,3H)。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:367.0。
通过手性HPLC分离化合物1e(100mg)，得到化合物1e-A(较快洗脱,31.8mg)和化合物1e-B(较慢洗脱,10mg)，为白色固体，其中使用甲醇5％-40％(0.05％DEA)/CO2，ChiralPak IC-3柱。
Figure BDA0001985118120000241
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-(乙基磺亚氨酰基)]-7H-嘌呤-8-酮(化合物1e-A):1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:10.76(s,1H),7.45-7.33(m,4H),7.01(s,2H),4.96(s,2H),4.03(s,1H),3.40-3.34(m,2H),1.17(t,J＝7.4Hz,3H)。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:367.0。
Figure BDA0001985118120000242
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基)]-7H-嘌呤-8-酮(化合物1e-B):1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:10.70(s,1H),7.46-7.28(m,4H),7.01(s,2H),4.96(s,2H),4.03(s,1H),3.44-3.36(m,2H),1.17(t,J＝7.4Hz,3H)。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:367.0。
步骤6:6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺(化合物1)和6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺(化合物2)的制备
Figure BDA0001985118120000251
向6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-(乙基磺亚氨酰基)]-7H-嘌呤-8-酮(100mg,化合物1e-A)在DIPEA/吡啶(v/v,1/12,2.0mL)中的混悬液中滴加N-丙基-N-甲基-氨基甲酰氯溶液(148mg,1.09mmol)。在25℃搅拌2h后，用MeOH(5mL)淬灭反应混合物，浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺(78.0mg,化合物1)，为白色固体。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:466.2
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm:7.43-7.41(m,4H),6.90(s,2H),5.00(s,2H),4.20(s,1H),3.46-3.41(m,2H),3.40-3.39(m,2H),3.10-3.00(m,3H),1.69-1.50(m,2H),1.24-1.12(m,3H),0.93-0.73(m,3H).
Figure BDA0001985118120000252
向6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-(乙基磺亚氨酰基)]-7H-嘌呤-8-酮(100mg,化合物1e-B)在DIPEA/吡啶(v/v,1/12,2.0mL)中的混悬液中滴加N-丙基-N-甲基-氨基甲酰氯溶液(148mg,1.09mmol)。在25℃搅拌2h后，用MeOH(5mL)淬灭反应混合物，浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-嘌呤-7-甲酰胺(38.6mg,化合物2)，为白色固体。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:466.1
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm:7.43-7.41(m,4H),6.90(s,2H),5.00(s,2H),4.19(s,1H),3.46-3.39(m,2H),3.39-3.38(m,2H),3.09-2.99(m,3H),1.69-1.52(m,2H),1.19(t,J＝7.28Hz,3H),0.95-0.66(m,3H)
通过单晶X-射线衍射测定化合物1的立体化学，如图1所示。
实施例2
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2-[S(S)-(乙基磺亚氨酰基)]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺(化合物3)
Figure BDA0001985118120000261
向6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-(乙基磺亚氨酰基)]-7H-嘌呤-8-酮(100mg,化合物1e-A)在DIPEA/吡啶(v/v＝1/12,2.0mL)中的混悬液中滴加N-乙基-N-甲基-氨基甲酰氯溶液(132mg,1.09mmol)。在25℃搅拌2h后，用MeOH(5mL)淬灭反应混合物，浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-乙基-8-氧代-N-甲基-嘌呤-7-甲酰胺(31.9mg,化合物3)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:7.43-7.41(m,4H),6.90(s,2H),4.99(s,2H),4.18(s,1H),3.48-3.40(m,2H),3.39(s,2H),3.05–3.01(m,3H),1.20-1.14(m,6H)。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:452.2。
通过单晶X-射线衍射测定化合物3的立体化学，如图2所示。
实施例3
6-氨基-2-[S(R)-(乙基磺亚氨酰基)]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺(化合物4)
Figure BDA0001985118120000271
步骤1：1-(异氰酰基甲基)-4-甲基苯的制备
Figure BDA0001985118120000272
在-78℃、氮气下向三光气(40.5g,136.3mmol)在无水DCM(1.2L)中的溶液中滴加对甲苯基甲胺(50.0g,413.2mmol)和Et3N(83.4g,826.4mmol)在DCM(800mL)中的溶液。搅拌1h后，将反应混合物升至20℃，再搅拌12h。用DCM(2.0L)稀释反应混合物，通过过滤除去固体。真空浓缩滤液。通过蒸馏(b.p.150℃,10mmHg)纯化残余物，得到1-(异氰酸基甲基)-4-甲基苯(30.0g，化合物4a)，为无色油状物。
步骤2:5-氨基-1-(4-甲基苄基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-咪唑-4-甲腈的制备
Figure BDA0001985118120000273
在室温下向氨基丙二腈4-甲基苯磺酸盐(32.7g，129.5mmol)在干燥THF(800mL)中的溶液中加入1-(异氰酸基甲基)-4-甲基苯(20.0g，化合物4a)和DIPEA(12.2g，94.2mmol)。在20℃下搅拌16小时后，将反应真空浓缩，将残余物倾入水(500mL)中，通过过滤收集得到的灰色固体。将滤液用EtOAc(300mL)萃取三次。将分离的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物与灰色固体合并。向合并的固体中加入THF(200mL)和氢氧化钠水溶液(300mL，1N)。将混合物在50℃下搅拌1小时，冷却至室温，用15％硫酸氢钠中和，用EtOAc(500mL)萃取三次，将分离的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到5-氨基-1-(4-甲基苄基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-咪唑-4-甲腈(26.6g，化合物4b)，为灰色固体，将其不经进一步纯化即用于下一步。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:229.2。
步骤3:6-氨基-9-(对甲苯基甲基)-2-硫烷基-7H-嘌呤-8-酮的制备
Figure BDA0001985118120000281
向5-氨基-1-(4-甲基苄基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-咪唑-4-甲腈(27.0g,化合物4b)在THF(500mL)中的溶液中滴加异硫氰酸苯甲酰酯(48.3g)。在20℃搅拌16小时后，将反应混合物真空浓缩。将残余物与THF(200mL)一起研磨，通过过滤收集得到的沉淀物。
向得到的沉淀物在THF(200mL)中的溶液中加入氢氧化钠水溶液(70mL，2N)。将混合物在80℃下回流20小时，然后用15％硫酸氢钾水溶液酸化至pH 5，通过过滤收集得到的沉淀物，得到6-氨基-9-(对甲苯基甲基)-2-硫烷基-7H-嘌呤-8-酮(20.0g,化合物4c)，为黄色固体。将该产物不经进一步纯化即用于下一步骤。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:288。
步骤4:6-氨基-2-乙基硫烷基-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮的制备
Figure BDA0001985118120000282
向6-氨基-9-(对甲苯基甲基)-2-硫烷基-7H-嘌呤-8-酮(19.0g,化合物4c)在DMF(150mL)中的溶液中加入碳酸钾(13.7g，99.3mmol)，然后加入碘乙烷(7.2g，46.3mmol)。在25℃搅拌16小时后，将混合物倾入水(800mL)中，分离出所得沉淀物，干燥，得到6-氨基-2-乙基硫烷基-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮(13.0g,化合物4d)的粗产物，为黄色固体。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:316.1。
步骤5:6-氨基-2-乙基亚磺酰基-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮的制备
Figure BDA0001985118120000291
在0℃下向6-氨基-2-乙基硫烷基-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮(8.8g,化合物4d)在DMF(100mL)中的溶液中滴加在DMF(20.0mL)中的m-CPBA(8.7g，50.0mmol)。在该温度搅拌2小时后，将反应混合物倾入水(400mL)中。过滤得到的黄色沉淀物，用MTBE(50mL)洗涤，干燥，得到6-氨基-2-乙基亚磺酰基-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮(3.5g,化合物4e)，为黄色固体。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:332.2。
步骤6:6-氨基-2-(乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮的制备
Figure BDA0001985118120000292
在55℃向6-氨基-2-乙基亚磺酰基-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮(4.3g,化合物4e)在Eaton试剂(30.0mL)中的溶液中分份加入NaN3(2.1g,32.0mmol)。在55℃下搅拌30分钟后，将反应混合物在0℃下倾入2M氢氧化铵溶液(200mL)中，过滤得到的黄色沉淀物。通过制备型HPLC纯化粗产物，得到6-氨基-2-(乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮(2.0g,化合物4f)，为白色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:10.53(s,1H),7.24(d,J＝8.03Hz,2H),7.13(d,J＝8.03Hz,2H),6.94(br.s.,2H),4.91(s,2H),4.03(s,1H),3.36-3.41(m,2H),2.26(s,3H),1.18(t,J＝7.28Hz,3H)。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:347。
通过手性HPLC分离化合物4f，得到化合物4f-A(较快洗脱,56.8mg)和化合物4f-B(较慢洗脱,56.7mg)，为白色固体，其中使用甲醇5％-40％(0.05％DEA)/CO2，ChiralPakIC-3柱。
Figure BDA0001985118120000301
化合物4f-A:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:10.52(br.s.,1H),7.23(d,J＝8.0Hz,2H),7.13(d,J＝7.9Hz,2H),6.94(br.s.,2H),4.90(s,2H),4.03(s,1H),3.42-3.33(m,2H),2.25(s,3H),1.17(t,J＝7.3Hz,3H)。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:347。
Figure BDA0001985118120000302
化合物4f-B:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:10.56(br.s.,1H),7.23(d,J＝8.0Hz,2H),7.13(d,J＝8.0Hz,2H),6.95(br.s.,2H),4.90(s,2H)4.03(s,1H),3.44-3.29(m,2H),2.25(s,3H),1.17(t,J＝7.3Hz,3H)。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:347。
步骤6:6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺的制备
Figure BDA0001985118120000311
(R)-6-氨基-2-(乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮(200.0mg,化合物4f-A)在DIPEA/Py(v/v＝1/1,3.0mL)中的混悬液中滴加N-甲基-N-丙基-氨基甲酰氯(308mg,2.28mmol)。在25℃搅拌2小时后，将反应混合物用水稀释，用EtOAc(10mL)萃取三次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到甲基(丙基)氨基甲酸6-氨基-2-[S(R)-(乙基磺亚氨酰基)]-9-(4-甲基苄基)-9H-嘌呤-8-基酯(58.1mg,化合物4)，为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:7.28(d,J＝7.8Hz,2H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.88(br.s.,2H),5.03-4.87(m,2H),4.19(s,1H),3.61-3.36(m,4H),3.11–2.96(m,3H),2.26(s,3H),1.72-1.45(m,2H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),0.97-0.65(m,3H)。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:446。
Figure BDA0001985118120000312
按照与化合物4步骤6类似的方式，通过使用6-氨基-2-(乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮(化合物4f-B)替代((R)-6-氨基-2-(乙基磺亚氨酰基)-9-(对甲苯基甲基)-7H-嘌呤-8-酮(化合物4f-A)制备化合物4-a。得到6-氨基-2-[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺(化合物4-a,40.1mg)，为白色固体：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:7.28(d,J＝7.5Hz,2H),7.15(d,J＝7.5Hz,2H),6.89(br.s.,2H),5.03-4.86(m,2H),4.19(s,1H),3.49-3.37(m,4H),3.08-3.00(m,3H),2.27(s,3H),1.70-1.48(m,2H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),0.95-0.71(m,3H)。MS测定值(ESI+)[(M+H)+]:446.3。
通过单晶X-射线衍射测定化合物4-a的立体化学，如图3所示。
实施例4
HEK293-Blue-hTLR-7细胞测定法：
从InvivoGen(Cat.#:hkb-htlr7，圣地牙哥，加利福尼亚，美国)购买稳定的HEK293-Blue-hTLR-7细胞系。这些细胞被设计用于通过监测NF-κB的活化来研究人TLR7的刺激。将分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因置于与5个NF-κB和AP-1结合位点融合的IFN-β最小启动子的控制下。通过用TLR7配体刺激HEK-Blue hTLR7细胞激活NF-κB和AP-1来诱导SEAP。使用QUANTI-BlueTM试剂盒(Cat.#:rep-qb1，Invivogen，圣地牙哥，加利福尼亚，美国)在640nm的波长下测定细胞培养物上清液中的SEAP活性。这类报道基因测定法已经被广泛用于评价TLR7激动作用(Tsuneyasu Kaisho和Takashi Tanaka,Trends inImmunology,第29卷,第7期,2008年7月,P329.sci；Hiroaki Hemmi等人,NatureImmunology 3,196-200(2002)。
具体地，将HEK293-Blue-hTLR7细胞以250,000～450,000个细胞/mL的密度、180μL的体积在含有4.5g/L葡萄糖、50U/mL青霉素、50mg/mL链霉素、100mg/mL Normocin、2mM L-谷氨酰胺、10％(v/v)热灭活的胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium,DMEM)中在96孔板中孵育24小时。然后将细胞与20μL测试化合物系列稀释液一起在CO2培养箱中在37℃孵育20小时。然后将来自每个孔的20ml上清液与180μLQuanti-blue底物溶液一起在37℃孵育2小时，使用分光光度计测定620～655nm处的吸光度。化合物4和化合物3分别被有效地转化成了活性部分——化合物4f-A和化合物1e-A。如表1中所示，化合物4f-A和化合物1e-A在HEK293-hTLR7测定法中激活TLR7的效能分别为0.11μM和0.071μM。化合物1和化合物2分别被有效地转化成活性部分——化合物1e-A和化合物1e-B，且化合物1e-A和化合物1e-B在HEK293-hTLR7测定法中激活TLR7的效能分别为0.071μM和0.085μM。由于ASIP化合物的活性部分在体外需要低于微摩尔的浓度来激活hTLR7，所以这种格外高的效能使得能评价并且导致预料不到地发现了这些化合物单独使用或与衣壳抑制剂组合使用每周或每两周施用的体内抗病毒效能。
表1:HEK293-hTLR-7测定法中化合物(活性形式和前药)的活性
Figure BDA0001985118120000331
实施例5
TLR7激动剂(化合物4)和HBV衣壳组装抑制剂(化合物5)的组合在AAV-HBV小鼠模型中强效降低HBVDNA和HBsAg
动物模型
4周龄雄性C57BL/6小鼠，无特异性病原体，购自中国科学院上海实验动物中心(SLAC)，根据动物护理机构指南在受控的温度和光照条件下将其饲养在动物护理设施的各自通风的笼子里。AAV/HBV病毒购自北京五加和分子医学研究所(北京，中国)。该重组病毒携带1.3个拷贝的HBV基因组，其被包在AAV血清型8(AAV8)衣壳中。通过尾静脉注射向C57BL/6小鼠注射200μL稀释在盐水缓冲液中的重组病毒。3-4周后，将动物放血，以监测血清中的HBV基因组DNA和表面抗原(HBsAg)，然后根据这些HBV生物标志物随机分组。
HBV生物标志物的测定
根据制造商的说明书，使用CLIA试剂盒(Autobio Diagnostics Co.，Ltd，郑州，中国)测定血清HBsAg。HBsAg的检测下限(LLOQ)为0.05IU/mL。使用500倍的血清稀释获得在标准曲线的线性范围内的值。按照制造商的说明书，使用MagNA Pure 96DNA和Viral NASmall Volume试剂盒(Roche)提取血清HBV DNA。使用用于来自核苷酸2969至3096的128bpHBV基因组区域的特异性扩增和检测的HBV特异性引物和探针组，通过实时定量PCR(qPCR)分析DNA样品。引物和探针的序列如下所示：
正向引物:AAGAAAAACCCCGCCTGTAA(SEQ ID 1)；
反向引物:CCTGTTCTGACTACTGCCTCTCC(SEQ ID 2)；
HBV-探针:5'TAMRA-CCTGATGTGATGTTCTCCATGTTCAGC-BHQ2-3'(SEQ ID 3)。
根据制造商的说明书并进行改进，使用抗HBs CLIA试剂盒(Antobio,郑州,中国)在小鼠血清中检验抗HBs抗体。将～15μL稀释的(1:3)小鼠血清样品在室温下解冻10分钟。将6μL样品在30μL PBS中进一步稀释，以制成用于抗体试验的最终稀释液1:18。用稀释的首次接受试验的小鼠血清(在PBS中1:18稀释)中的单克隆小鼠抗体抗乙型肝炎病毒表面抗原(Ad/Ay)抗体[S35](Abcam ab20402)制备标准曲线。将1μL 1mg/ml抗HBs抗体加入到500μL稀释的小鼠血清中，制成标准品1，终浓度为2000ng/ml。然后将50μL标准品1加入到150μL稀释的小鼠血清中，制成标准品2(1:4稀释)。试验需要7个点的标准品。标准品7的最终浓度为(0.488ng/ml)。空白血清用作背景对照。将25μL稀释的血清样品/标准品/空白转移到96孔板中。将样品在室温下孵育1小时，然后用300μL PBST洗涤3次。将0.5mg/ml生物素化的山羊抗小鼠IgG(Mabtech 3825-6-250)稀释到PBS中至终浓度为1μg/ml(1:500稀释)。将50μl稀释的抗小鼠IgG Bio加入板中，在室温下孵育1小时，然后用300μL PBST洗涤3次。将链霉抗生物素蛋白-HRP(Mabtech 3310-9)稀释到PBS(1:250)中。将50μL稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP在室温下孵育1小时，然后用300μL PBST洗涤3次。将底物A和底物B(AntuBio)混合。将50μL混合物加入到板中并孵育10分钟，然后用Envision酶标仪进行发光读数。抗HBsAb的检测下限为36ng/mL。由通过SoftMax Pro(v5.4.1)软件在抗HBsAb标准曲线上拟合的发光原始数据计算抗HBsAb结果。
使用小鼠IgG ELISPot Basic(HRP)试剂盒(Mabtech 3825-2H)用脾细胞进行ELISPOT测定法以检测分泌抗HBs的B细胞。将HBsAg(AYW)50ug(1mg/ml)(Abcam Ab7374)在PBS中稀释100倍，稀释到10μg/ml。将PVDF板(Millipore型MSIP)用15μL 35％乙醇/孔处理最多1分钟，然后用200μL ddH2O洗涤5次。将100μL稀释的HBsAg加入孔中，在4-8℃孵育过夜。用200μL无菌PBS洗涤板以除去过量的抗体。加入200μL含有10％FBS的RPMI1640，在37℃孵育2小时以封板。将在PBS中的新鲜脾转移到含有5ml 2％RPMI1640的温和MACS C管(Milterny 130-096-334)中。然后使样品在程序m_spleen_03_02下用gentleMacsDissociator处理。然后将解离的混合物在70μM细胞过滤器(cell strainer)上过滤。使用15ml 2％RPMI1640洗涤细胞过滤器。将细胞在室温下以300×g离心5分钟。加入1ml ACK裂解缓冲液，在室温下孵育5分钟以裂解红细胞。加入15ml 2％RPMI1640以洗涤细胞。将细胞在室温下以300×g离心5分钟，然后重新混悬于5ml完全RPMI1640中，然后在70μM细胞过滤器上过滤。用BioRad细胞计数器对细胞进行计数。将2x106个细胞/200μL加入孔中并在37℃孵育过夜。在板中除去细胞，然后用200μL PBS洗涤5次。将0.5mg/ml生物素化的山羊抗小鼠IgG(Mabtech 3825-6-250)稀释入含有0.5％FBS的PBS中至终浓度1μg/ml(1:500稀释)。将100μl稀释的抗小鼠IgG Bio加入板中，在室温下孵育2小时，然后用200μL PBS洗涤5次。将链霉抗生物素蛋白-HRP(Mabtech 3310-9)稀释入含有0.5％FBS的PBS中(1:200)。将100μL稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP在室温下孵育1小时，然后用300μL PBS洗涤5次。将100μLAEC底物溶液(BD 551951)加入孔中并显色直至出现不同的斑点(小于10分钟)。通过用ddH2O充分洗涤来停止显色。将板放置以干燥，用显微镜AID ELISPOT对斑点进行拍照和计数。
实验设计和结果
如表2所示，将总共20只小鼠分成4组进行研究。在01组中，将动物每隔一天一次(QOD)用介质治疗42天，用作安慰剂对照。在02组中，将化合物4每周一次(QW)以10mg/kg给药42天。将化合物5每日一次(QD)以20mg/kg给药42天，在03组中是单独给药，在04组中是与10mg/kg化合物4QW组合给药。所有测试品均通过口服管饲(PO)施用，总剂量体积为10mL/kg。42天的治疗之后是42天的脱治疗期。每周一次对动物进行下颌下放血以进行血清收集，直至研究结束。对血清样品进行HBV生物标志物分析。在第84天终止研究后，还收集小鼠脾用于ELISPOT测定以检测产生抗HBs抗体的B细胞。
表2.化合物4和5在AAV-HBV小鼠模型中的组合研究设计
Figure BDA0001985118120000361
说明：Tx Grp＝治疗组；Vol＝体积；p.o.＝口服管饲；QD＝每日一次；QOD＝每隔一天一次；QW＝每周一次；No.An＝动物数量
如图4所示，在治疗42天后，10mg/kg QW的化合物4和20mg/kg QD的化合物5的单一疗法本身导致HBV DNA和HBsAg显著减少。此外，化合物4和化合物5的组合表现出甚至更大的抗病毒益处，HBsAg减少更多。在所有接受组合疗法的动物中，在治疗42天后，血清中的HBsAg均被减少到不可检测到的水平，低于定量下限(LLOQ)，并且这种HBsAg缺失在整个42天的脱治疗期中是可持续的。随着HBsAg减少，所有这些动物均产生比其它组显著更高水平的抗HBs抗体。在脱治疗期结束时，在来自接受组合治疗的动物的脾中仍然可检测到活跃产生抗HBs抗体的B细胞(如图4-D所示)。因此，这种组合疗法在慢性HBV感染患者中具有实现HBsAg缺失和抗HBs血清转变的潜能。
实施例6
在AAV-HBV小鼠模型中TLR7激动剂(化合物3)和HBV衣壳组装抑制剂(化合物5)的组合强效降低HBV DNA和HBsAg
如实施例5中所述，使用相同的AAV-HBV小鼠模型和测量HBV生物标志物的方法，评估了化合物3和化合物5的组合以及它们的单一疗法。
如表3所示，将总共24只小鼠分成4组进行研究。在01组中，将动物每日一次(QD)用介质治疗42天，用作安慰剂对照。在02组中，将化合物3每隔一周一次(QOW)以1mg/kg给药42天。将化合物5每日一次(QD)以20mg/kg给药42天，在03组中是单独给药，或者在04组中是与1mg/kg化合物3QOW组合给药。所有测试品均通过口服管饲(PO)施用，总剂量体积为10mL/kg。42天的治疗之后是45天的脱治疗期。每周一次对动物进行下颌下放血以进行血清收集，直至研究结束。对血清样品进行HBV生物标志物分析。
表3.化合物3和5在AAV-HBV小鼠模型中的组合研究设计
Figure BDA0001985118120000371
缩写：Tx Grp＝治疗组；Vol＝体积；p.o.＝口服管饲；QD＝每日一次；QOD＝每隔一天一次；QW＝每周一次；No.An＝动物数量
如图5所示，在治疗42天后，1mg/kg QOW的化合物3和20mg/kg QD的化合物5的单一疗法本身导致HBV DNA和HBsAg显著减少。化合物3和化合物5的组合表现出甚至更大的抗病毒益处，HBsAg减少更多。在组合疗法组中，在治疗42天后，6只动物中有4只在血清中具有不可检测到的HBsAg水平(低于LLOQ)，并且这种HBsAg缺失在整个45天的脱治疗期中是可持续的。随着HBsAg减少，用组合疗法治疗的组比其它组显示出显著更高水平的抗HBs抗体。因此，这种组合疗法在慢性HBV感染患者中具有实现HBsAg缺失和抗HBs血清转变的潜能。
Figure IDA0001985118180000011

Claims (7)

1.一种用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂，其中所述TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂由以下化合物组成：
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或
6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸。
2.制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物的方法，其特征在于在所述药物中使用TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂,其中所述TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂由以下化合物组成：
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或
6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸。
3.权利要求2的方法，其中所述TLR7激动剂和所述HBV衣壳组装抑制剂在相同制剂中或在不同制剂中共同施用。
4.权利要求3的方法，其中所述TLR7激动剂和所述HBV衣壳组装抑制剂旨在通过相同途径或不同途径被施用于个体。
5.权利要求2的方法，其中所述TLR7激动剂和所述HBV衣壳组装抑制剂旨在通过胃肠外或口服施用被施用于个体。
6.权利要求2的方法，其中所述TLR7激动剂和所述HBV衣壳组装抑制剂被同时施用或依次施用。
7.TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的用途，
其中所述TLR7激动剂和HBV衣壳组装抑制剂由以下化合物组成：
6-氨基-9-[(4-氯苯基)甲基]-N-乙基-2[S(S)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸；或
6-氨基-2-[S(R)-乙基磺亚氨酰基]-N-甲基-8-氧代-N-丙基-9-(对甲苯基甲基)嘌呤-7-甲酰胺和3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸。
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