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CN109652573A - 用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的vntr位点、检测引物组及检测分析方法 - Google Patents

用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的vntr位点、检测引物组及检测分析方法 Download PDF

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CN109652573A
CN109652573A CN201910105788.5A CN201910105788A CN109652573A CN 109652573 A CN109652573 A CN 109652573A CN 201910105788 A CN201910105788 A CN 201910105788A CN 109652573 A CN109652573 A CN 109652573A
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Abstract

本发明公开了一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的VNTR位点、检测引物组及检测分析方法。本发明针对鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:‑新筛选2个VNTR位点，并联用已知的5个VNTR位点，建立MLVA‑2位点法和MLVA‑7位点法。经过大量鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:‑菌株检测验证，本发明的检测分析方法可直接对鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:‑进行稳定的分型检测，仅分析2个基因，分型效率与传统的MLST分型方法相当，仅分析7个基因，分型效率高于联用原有MLST和MLVA‑5位点分型方法。

Description

用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的VNTR位点、检 测引物组及检测分析方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的VNTR位点、检测引物组及检测分析方法。
背景技术：
沙门菌(Salmonella spp)是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病病原菌，可引起人和动物的伤寒、副伤寒、胃肠炎和败血症等许多严重疾病，使全球遭受巨大的经济损失。目前，全世界已发现约2610种沙门菌血清型。其中，鼠伤寒沙门菌(Salmonellaenterica subsp.enterica serovar Typhimurium，STM)是存在于畜禽及食品中的优势血清型，也是引起人类感染的主要血清型。21世纪以来，一种新出现的高致病性血清型——沙门菌1,4,[5],12:i:-，在多个国家不断被检出，并引起食源性疾病暴发流行。沙门菌1,4,[5],12:i:-与鼠伤寒沙门菌(抗原式：1,4,[5],12:i:1,2)具有相似抗原形式，两者的区别在于沙门菌1,4,[5],12:i:-缺失了第Ⅱ相鞭毛抗原。多项研究显示沙门菌1,4,[5],12:i:-与鼠伤寒沙门菌具有很高的遗传相似度，是鼠伤寒沙门菌的单相菌变种。
采用有效的分型方法对不同来源、不同血清型甚至不同致病力的沙门菌加以区分，对沙门菌危害溯源、风险预警和疫情监测具有重要意义。分子分型即使用不同的分子技术反映致病菌基因组DNA序列差异的方法，具有稳定、准确、快速、分辨力高和操作性强等优点。一些常用的基于核酸序列的分子分型方法，如多位点序列分型(Multilocus sequencetyping,MLST)和多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple-locus variable-numbertandem-repeat analysis，MLVA)，准确、重复性好，实现了数据交换和共享，使得不同实验室间的结果具有可比性，在病原菌的追溯、传播链的确认、新的流行菌株的发现、系统发生分析甚至于疫情的预警预报等方面发挥了重要作用。
MLST分型是通过分析沙门菌基因组上相对保守的7个管家基因(arcC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA)，借助DNA测序技术及BLAST比对技术得到管家基因的等位基因，根据碱基突变揭露致病菌基因谱的改变。7个管家基因的等位基因型组成一个等位基因谱，每个等位基因谱对应唯一一个序列型，即ST型(Sequence type，ST)。研究显示，MLST分型方法将鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-菌株分为两大簇，称作eBGs(eBurstGroups)，一大簇是由ST19、ST34等主要型别菌株组成的eBG1簇，另一簇是由ST36型菌株组成的eBG138簇(见图1)。而鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-血清型目前仅发现具有存在于eBG1簇的ST19、ST34，以及eBG138簇的ST36三种型别的菌株(见图1)。
MLVA分型方法是利用微生物基因组中不同位点串联重复序列(Variable-numbertandem-repeat，VNTR)数目的不同，对其进行分型，被广泛用于微生物，尤其是细菌的研究。MLVA方法操作简单、快速、分辨率高。2004年Lindstedt等利用鼠伤寒沙门菌的5个VNTR位点-STTR9、STTR5、STTR6、STTR10、STTR3成功建立了用于鼠伤寒沙门菌的MLVA-5位点分型方法，该方法大大提高了对鼠伤寒沙门菌多态性的分辨能力。
基于7个管家基因的MLST方法，其ST型不仅可以判断沙门菌菌株之间的亲缘关系，还与沙门菌血清型具有对应关系，相比于MLST方法，MLVA提供一种分辨率更高的分型效果，因此，联合应用MLST和MLVA两种分型方法对沙门菌进行分型，对沙门菌危害溯源、风险预警和疫情监测具有重要意义。在实际工作中，如果分别采用MLST和MLVA两种分型方法对鼠伤寒沙门菌分型，共要分析12个基因的核酸序列，工作量大，耗时长、费用高。
发明内容：
本发明的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供一种更有效、更简便、高分辨率的用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的VNTR位点、检测引物组及检测分析方法。
针对上述问题，本发明在实际工作中筛选到两个新的VNTR位点——STMV1和STMV2，针对这两个位点设计特异性核苷酸引物序列，建立MLVA-2位点法对鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-进行分型，其分型结果与MLST分型方法中的菌株ST型具有一定的相关性。
MLVA-2位点法应用于鼠伤寒沙门菌时，eBG138簇ST36型菌株的STMV1位点的重复数全部为8，同时，eBG1簇的ST19、ST34、ST313、ST213、ST128、ST568和ST302等型别菌株的STMV1位点的重复数全部为9。联合STMV2位点，eBG1簇的ST34型菌株的STMV1位点的重复数全部为9和STMV2的重复数全部为4，eBG1簇的ST19、ST313、ST213、ST128、ST568和ST302型菌株的STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为3。对于分为eBG1和eBG138两大簇和具有众多MLST型别的鼠伤寒沙门菌，STMV1和STMV2可以鉴别eBG1和eBG138两簇菌株，以及eBG1簇中的ST34型菌株。
MLVA-2位点法应用于仅具有ST19、ST34、ST36三种型别菌株的鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-，eBG138簇的ST36型菌株的STMV1位点的重复数全部为8，同时，eBG1簇的ST19、ST34型菌株的STMV1位点的重复数全部为9。联合STMV2位点，eBG1簇的ST34型菌株的STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为4，eBG1簇的ST19型菌株STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为3。
进一步联用7个VNTR位点STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10、STTR3的引物组合，建立一种鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型新方法——MLVA-7位点法，提高分型效率。根据各位点PCR扩增片段测序结果中每一个位点重复序列的数目进行分型，结果表示为n-n-n-n-n-n-n。
因此，本发明的第一个目的是提供一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的VNTR位点，所述的VNTR位点编号为STMV1和STMV2；
所述的STMV1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的STMV2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的检测引物组，由下列引物组成：
针对STMV1位点：
STMV1-F：5’-GCAAAAGCAGGCTGAAG-3’(如SEQ ID NO.8所示)，STMV1-R：5’-GGCGCATTCTTACCCGAG-3’(如SEQ ID NO.9所示)；
针对STMV2位点：
STMV2-F：5’-CGTGATGCTCTGATTTTGCT-3’(如SEQ ID NO.10所示)，STMV2-R：5’-CCGTAAGCGGGAATCGTA-3’(如SEQ ID NO.11所示)。
本发明的第三个目的是提供一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的VNTR位点，所述的VNTR位点编号为STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3；
所述的STMV1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的STMV2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的STTR9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的STTR5的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的STTR6的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的STTR10的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的STTR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的第四个目的是提供一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的检测引物组，由下列引物组成：
针对STMV1位点：
STMV1-F：5’-GCAAAAGCAGGCTGAAG-3’(如SEQ ID NO.8所示)，STMV1-R：5’-GGCGCATTCTTACCCGAG-3’(如SEQ ID NO.9所示)；
针对STMV2位点：
STMV2-F：5’-CGTGATGCTCTGATTTTGCT-3’(如SEQ ID NO.10所示)，STMV2-R：5’-CCGTAAGCGGGAATCGTA-3’(如SEQ ID NO.11所示)；
针对STTR9位点：
STTR9-F：5’-AGAGGCGCTGCGATTGACGATA-3’(如SEQ ID NO.12所示)，STTR9-R：5’-CATTTTCCACAGCGGCAGTTTTTC-3’(如SEQ ID NO.13所示)；
针对STTR5位点：
STTR5-F：5’-ATGGCGAGGCGAGCAGCAGT-3’(如SEQ ID NO.14所示)，STTR5-R：5’-GGTCAGGCCGAATAGCAGGAT-3’(如SEQ ID NO.15所示)；
针对STTR6位点：
STTR6-F：5’-TCGGGCATGCGTTGAAA-3’(如SEQ ID NO.16所示)，STTR6-R：5’-CTGGTGGGGAGAATGACTGG-3’(如SEQ ID NO.17所示)；
针对STTR10位点：
STTR10-F：5’-CGGGCGCGGCTGGAGTATTTG-3’(如SEQ ID NO.18所示)，STTR10-R：5’-GAAGGGGCCGGGCAGAGACAGC-3’(如SEQ ID NO.19所示)；
针对STTR3位点：
STTR3-F：5’-CCCCCTAAGCCCGATAATGG-3’(如SEQ ID NO.20所示)，STTR3-R：5’-TGACGCCGTTGCTGAAGGTAATAA-3’(如SEQ ID NO.21所示)。
本发明的第五个目的是提供一种鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测试剂盒，包括PCR扩增试剂、所述的检测引物组。
本发明的第六个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测分析方法，包括以下步骤：提取待测鼠伤寒沙门菌的基因组DNA作为模板，分别以所述的STMV1-F/STMV1-R和STMV2-F/STMV2-R作为扩增引物，或者分别以所述的STMV1-F/STMV1-R、STMV2-F/STMV2-R、STTR9-F/STTR9-R、STTR5-F/STTR5-R、STTR6-F/STTR6-R、STTR10-F/STTR10-R和STTR3-F/STTR3-R作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，根据测序结果对待测鼠伤寒沙门菌进行分型。
所述的PCR扩增的反应体系优选为25μL，包括10×PCR buffer 2.5μL，3.0mmol/LMgCl2，250μmol/L dNTP，上下游引物各120nmol/L，1.5U Taq酶，模板2μL，余量为ddH2O。
所述的PCR扩增的扩增条件优选为95℃预变性5min；95℃变性45s、58℃退火45s、72℃延伸45s，共进行30个循环；72℃延伸10min。
本发明的第七个目的是提供所述的检测引物组在鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测中的应用。
本发明针对鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-新筛选的VNTR位点(STMV1和STMV2)设计特异性核苷酸引物序列。并联用针对7个VNTR位点-STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3的引物组，分别建立MLVA-2位点法(检测STMV1和STMV2位点)和MLVA-7位点法(检测STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3位点)。经过大量鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-菌株检测验证，本发明的检测分析方法可直接对鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-进行稳定的分型检测，仅分析2个基因，分型效率与传统的MLST分型方法相当，仅分析7个基因，分型效率高于联用原有MLST和MLVA-5位点分型方法。
附图说明：
图1是鼠伤寒沙门菌及其血清变种沙门菌1,4,[5],12:i:-的MLST聚类分析(Achtman et al.,2012,PLoS Pathog)；图注：每一个圆圈代表一种ST型，圆圈中以扇形分割代表一株菌，圆圈旁边的数字代表ST型。直线相连代表不同ST型之间的主要亲缘关系，尾部有短横线的直线代表同一水平的交叉联系，eBG的命名标记在圆形白色框中。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、特异性引物序列的设计：
分析已知的鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2序列信息，新筛选到2个特异性的VNTR位点——STMV1和STMV2(表1)，分别设计特异性核苷酸引物序列。
1)针对鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-的新筛选的2个特异性VNTR位点——STMV1和STMV2，以及5个已知VNTR位点，不同的VNTR位点见表1。
表1.VNTR位点在标准菌株鼠伤寒沙门菌LT2中的位置(nt)
位点 VNTR位点在标准菌株鼠伤寒沙门菌LT2中的位置(nt)
STMV1 814967-815497
STMV2 1958188-1958366
STTR9 3246601-3246781
STTR5 3184509-3184767
STTR6 2730724-2731065
STTR10 53512-53883
STTR3 3629466-3629955
2)针对鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-的新筛选的2个特异性VNTR位点——STMV1和STMV2，设计的2对引物，以及5个已知VNTR位点的引物，不同的VNTR位点的引物见表2。
表2.VNTR位点扩增引物
以鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2为例，各VNTR位点引物及扩增序列：
1)STMV1引物及扩增序列531bp(如SEQ ID NO.1所示，下划线部分序列分别为STMV1-F序列及STMV1-R的碱基互补序列，加粗区域为侧翼序列，加粗区域的中间为重复单位也称为核心序列)
2)STMV2引物及扩增序列179bp(如SEQ ID NO.2所示，下划线部分序列分别为STMV2-F序列及STMV2-R的碱基互补序列，加粗区域为侧翼序列，加粗区域的中间为重复单位也称为核心序列)
3)STTR9引物及扩增序列180bp(如SEQ ID NO.3所示，下划线部分序列分别为STTR9-F序列及STTR9-R的碱基互补序列，加粗区域为侧翼序列，加粗区域的中间为重复单位也称为核心序列)
4)STTR5引物及扩增序列259bp(如SEQ ID NO.4所示，下划线部分序列分别为STTR5-F序列及STTR5-R的碱基互补序列，加粗区域为侧翼序列，加粗区域的中间为重复单位也称为核心序列)
5)STTR6引物及扩增序列342bp(如SEQ ID NO.5所示，下划线部分序列分别为STTR6-F序列及STTR6-R的碱基互补序列，加粗区域为侧翼序列，加粗区域的中间为重复单位也称为核心序列)
6)STTR10引物及扩增序列371bp(如SEQ ID NO.6所示，下划线部分序列分别为STTR10-F序列及STTR10-R的碱基互补序列，加粗区域为侧翼序列，加粗区域的中间为重复单位也称为核心序列)
7)STTR3引物及扩增序列490bp(如SEQ ID NO.7所示，下划线部分序列分别为STTR3-F序列及STTR3-R的碱基互补序列，加粗区域为侧翼序列，加粗区域的中间为重复单位也称为核心序列)
2、利用上述位点和引物对鼠伤寒沙门菌MLVA基因分型的应用，具体步骤：
(1)细菌DNA提取
可采用自有方法或者商用细菌DNA提取试剂盒提取所测菌株的DNA。
(2)PCR反应体系及扩增条件
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，3.0mmol/L MgCl2，250μmol/L dNTP，上下游引物各120nmol/L，1.5U Taq酶，模板2μL，双蒸水补齐至总体积25μL。
PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性45s、58℃退火45s、72℃延伸45s，共进行30个循环；72℃延伸10min。同时设立阳性对照(鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2基因组DNA)和空白对照(ddH2O)。
(3)测序分析
将扩增样品进行测序分析，获得目标VNTR位点的序列信息。
(4)结果判定参照下面的公式进行：
根据测序结果，重复序列的数目(Repeart number)＝{产物大小(Length ofproduct)-重复序列周围的片段大小(Flanking size)}/每个重复序列的大小(Length ofeach repeat)。
(5)结果表示
根据各位点PCR扩增片段测序结果中每一个位点重复序列的数目，MLVA-2位点法(仅检测STMV1和STMV2这2个位点)结果以n-n表示，MLVA-7位点法(检测STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3这7个位点)结果以n-n-n-n-n-n-n表示；菌株1为ST19型鼠伤寒沙门菌的7个VNTR位点STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3特异性引物PCR反应产物测序验证结果，其重复序列数目分别为STMV1：重复序列数Rep＝9；STMV2：重复序列数Rep＝3；STTR9：重复序列数Rep＝4；STTR5：重复序列数Rep＝13；STTR6：重复序列数Rep＝13；STTR10：重复序列数Rep＝10；STTR3：重复序列数Rep＝2/11；菌株1的MLVA-2位点法MLVA型别表示为9-3，菌株1的MLVA-7位点法MLVA型别表示为9-3-4-13-13-10-211。
菌株2为ST34型鼠伤寒沙门菌的7个VNTR位点STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3特异性引物PCR反应产物测序验证结果，其重复序列数目分别为STMV1：重复序列数Rep＝9；STMV2：重复序列数Rep＝4；STTR9：重复序列数Rep＝3；STTR5：重复序列数Rep＝11；STTR6：重复序列数Rep＝9；STTR10：重复序列数Rep＝8；STTR3：重复序列数Rep＝2/11；菌株2的MLVA-2位点法MLVA型别表示为9-4，菌株2的MLVA-7位点法MLVA型别表示为9-4-3-11-9-8-211。
菌株3为ST36型鼠伤寒沙门菌的7个VNTR位点STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3特异性引物PCR反应产物测序验证结果，其重复序列数目分别为STMV1：重复序列数Rep＝8；STMV2：重复序列数Rep＝3；STTR9：重复序列数Rep＝2；STTR5：重复序列数Rep＝12；STTR6：重复序列数Rep＝6；STTR10：重复序列数Rep＝10；STTR3：重复序列数Rep＝3/11；菌株3的MLVA-2位点法MLVA型别表示为8-3，菌株3的MLVA-7位点法MLVA型别表示为8-3-2-12-6-10-311。
对实验室保藏的46株鼠伤寒沙门菌进行分析，MLST将46株菌分为22株ST19、19株ST34和5株ST36。MLVA的分型结果见表3，22株ST19型菌株STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为3，19株ST34型菌株的STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为4，5株ST36型菌株的STMV1位点的重复数为8和STMV2位点的重复数为3。MLVA-2位点法仅分析2个基因，分型效率与传统的MLST分型方法相当，MLVA-7位点法仅分析7个基因，极大地简化了操作步骤，提高了分型效率，节省了大量的人力、物力和财力等。
表3. 46株鼠伤寒沙门菌菌株分型结果
*注：表中“NA”代表没有检测到该位点
从NCBI-ENA数据库下载了150株鼠伤寒沙门菌相关ST型别菌株的测序原始数据，进行拼接和组装，对成功组装的菌株基因组进行MLST分析，确认菌株ST型别，并对菌株进行STMV1和STMV2位点的分析。从NCBI-Genome数据库下载了60株鼠伤寒沙门菌相关ST型别菌株的基因组完成图序列，分析菌株ST型别，并对菌株进行STMV1和STMV2位点的分析。最终获得了80株菌株的STMV1和STMV2位点分析结果(见表4)。25株ST36型菌株的STMV1位点的重复数全部为8，37株ST19型菌株STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为3，5株ST34型菌株的STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为4，其他ST菌株详见表4。
表4. 80株鼠伤寒沙门菌菌株数据库下载基因组STMV1和STMV2位点分析结果
3、利用上述位点和引物对鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-MLVA基因分型的应用，具体步骤：
(1)细菌DNA提取
可采用自有方法或者商用细菌DNA提取试剂盒提取所测菌株的DNA。
(2)PCR反应体系及扩增条件
PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，3.0mmol/L MgCl2，250μmol/L dNTP，上下游引物各120nmol/L，1.5U Taq酶，模板2μL，双蒸水补齐至总体积25μL。
PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性45s、58℃退火45s、72℃延伸45s，共进行30个循环；72℃延伸10min。同时设立阳性对照(鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2基因组DNA)和空白对照(ddH2O)。
(3)测序分析
将扩增样品进行测序分析，获得目标VNTR位点的序列信息。
(4)结果判定参照下面的公式进行：
根据测序结果，重复序列的数目(Repeart number)＝{产物大小(Length ofproduct)-重复序列周围的片段大小(Flanking size)}/每个重复序列的大小(Length ofeach repeat)。
(5)结果表示
根据各位点PCR扩增片段测序结果中每一个位点重复序列的数目，MLVA-2位点法(仅检测STMV1和STMV2这2个位点)结果以n-n表示，MLVA-7位点法(检测STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3这7个位点)结果以n-n-n-n-n-n-n表示；菌株4为ST19型鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-的7个VNTR位点STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3特异性引物PCR反应产物测序验证结果，其重复序列数目分别为STMV1：重复序列数Rep＝9；STMV2：重复序列数Rep＝3；STTR9：重复序列数Rep＝2；STTR5：重复序列数Rep＝10；STTR6：重复序列数Rep＝5；STTR10：重复序列数Rep＝NA；STTR3：重复序列数Rep＝2/12；菌株4的MLVA-2位点法MLVA型别表示为9-3，菌株4的MLVA-7位点法MLVA型别表示为9-3-2-10-5-NA-212。
菌株5为ST34型鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-的7个VNTR位点STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3特异性引物PCR反应产物测序验证结果，其重复序列数目分别为STMV1：重复序列数Rep＝9；STMV2：重复序列数Rep＝4；STTR9：重复序列数Rep＝3；STTR5：重复序列数Rep＝13；STTR6：重复序列数Rep＝5；STTR10：重复序列数Rep＝NA；STTR3：重复序列数Rep＝2/11；菌株5的MLVA-2位点法MLVA型别表示为9-4，菌株5的MLVA-7位点法MLVA型别表示为9-4-3-13-5-NA-211。
对实验室保藏的13株鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-进行分析，13株鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-全部为ST34型。MLVA分型结果见表5，13株ST34型菌株的STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为4。
表5. 13株鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-菌株分型结果
菌株 ST(MLST) STMV1 STMV2 STTR9 STTR5 STTR6 STTR10 STTR3
1 34 9 4 3 10 9 NA 2/11
2 34 9 4 3 14 12 NA 2/11
3 34 9 4 3 13 9 13 2/11
4 34 9 4 3 13 9 6 2/11
5 34 9 4 3 11 9 NA 2/11
6 34 9 4 3 12 9 NA 2/11
7 34 9 4 3 5 9 NA 2/11
8 34 9 4 3 14 9 11 2/11
9 34 9 4 3 13 13 NA 2/11
10 34 9 4 3 13 9 11 2/11
11 34 9 4 3 13 9 10 2/11
12 34 9 4 3 13 13 NA 2/11
13 34 9 4 3 14 11 NA 2/11
从NCBI-Genome数据库下载了57株鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-相关ST型别菌株的基因组序列，分析菌株的ST型别，并对菌株进行STMV1和STMV2位点的分析。获得了57株菌株的STMV1和STMV2位点分析(MLVA-2位点法)结果(见表6)。8株ST19型菌株STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为3，49株ST34型菌株的STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为4。
表6.鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-菌株数据库下载基因组MLVA-2位点法分析结果
序列表
<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
<120> 用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的VNTR位点、检测引物组及检测分析方法
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 531
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门菌LT2(Salmonella typhimurium LT2)
<400> 1
gcaaaagcag gctgaagaag cggcaaaact ggcgcaacag cagcagcaac aggccgaaga 60
agcggcgaaa gcggcggcgg acgcgaagaa aaaagcggag gccgaggcgg cgaaagcggc 120
ggcggacgcg aagaagaaag cggaagccga agcggtaaaa gcggcagcgg acgcgaagaa 180
gaaagcggaa gccgaagcgg cgaaagcggc ggcggacgcg aagaagaaag cagaggccga 240
agcggcgaaa gcggcggcgg aggcgaagaa gaaagcggaa gccgaagcgg cgaaagcggc 300
ggcggaggcg aagaagaaag cggatgccga ggcggcgaaa gcggcggcgg aggcgaagaa 360
gaaagcggat gccgcggcgg cgaaagcggc ggcggaggcg aagaagaaag cggatgccgc 420
ggcggcgaaa gcagcggcgg acgctaagaa gaaagcggct gccgaaaaag cggccgccgc 480
agaaggcgtc gacgatctgc ttggcgatct cagctcgggt aagaatgcgc c 531
<210> 2
<211> 179
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门菌LT2(Salmonella typhimurium LT2)
<400> 2
cgtgatgctc tgattttgct gtaaaagaaa tgttaaactg gatttggatc tgatataacg 60
aaaaagcccg gaatacagaa attctggaaa atttcggaaa tttcggaaat ttcggattat 120
tgatcataag caactgattt ataagaaaaa aagagaccga atacgattcc cgcttacgg 179
<210> 3
<211> 180
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门菌LT2(Salmonella typhimurium LT2)
<400> 3
agaggcgctg cgattgacga tatctatgac tttatggaat agcatattca ctatgtgggt 60
tgcggaggca tcgcgtcgtt tgcgatgtct gcgatgtctg cgatgtctgc gatgtctgcg 120
gtggatatcg ccctttggga tttgaaaggc aaacgtgaaa aactgccgct gtggaaaatg 180
<210> 4
<211> 259
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门菌LT2(Salmonella typhimurium LT2)
<400> 4
atggcgaggc gagcagcagt ggctggcggg aaaccaccat cacgaccacg accacgacca 60
cgaccacgac cacgaccacg accacgacca cgaccacgac cacgaccacg accacgacca 120
tcatggtcac atacatccgg aaggtgcaac gtcaaaagcg tatcaggatg cccatgaacg 180
cgcccatgct gccgatattc aacgccgttt tgatggtcaa acagtgacta atggacagat 240
cctgctattc ggcctgacc 259
<210> 5
<211> 342
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门菌LT2(Salmonella typhimurium LT2)
<400> 5
tcgggcatgc gttgaaaacc tgcaaaaaaa gaaaaatatc gatgcttatt attttttctt 60
taattaaatt ttcgctcaac aaacttaatt attaatccaa tgacagtgaa gtgtgaacta 120
tgctgagcat aaacgacatc aatagcaagg gcaagggcaa gggcaagggc aagggcaagg 180
gcaagggcaa gggcaagggc aagggcaagg gcaagggcaa gggcaatctg agtatttaca 240
ggtgaaatta tgaaaaatag tatattttta ccattgcttc tggtgctgtc ggcaacgacc 300
ttttcggcat tggtgatggc tgccagtcat tctccccacc ag 342
<210> 6
<211> 371
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门菌LT2(Salmonella typhimurium LT2)
<400> 6
cgggcgcggc tggagtattt gcgcaactcc cggacaagaa tgccccggaa tatgccagaa 60
aagaggatga ggttaaaaaa tagcgccatt cctgatgcat tctgcctgtc gctggccgga 120
ttttacgcat gccgggtgat gtttttttct ggccggggtg tgtgattttc ttcctgccgg 180
tgataatacg ctgcctgttc ctgttcctgt tcctgttcct gttcctgttc ctgttcctgt 240
tcctgttcct gttcattctg ctgctgatat tccctgacag atttcgctga cgccgggcga 300
cttccctgac gggaaccggg actgtcatgc tgcgcaccga gccagctgcg ctgtctctgc 360
ccggcccctt c 371
<210> 7
<211> 490
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门菌LT2(Salmonella typhimurium LT2)
<400> 7
ccccctaagc ccgataatgg cggcgacgtc accccgcccg acgatggcgg caacgtcacc 60
ccgcccgacg atggcggcaa cgtcaccccg cccgacgatg gcggcgatga caatgtgacc 120
ccgcccgacg atagtggcga tgacgatgtg gccccgcctg acgatagcgg cgatgacgat 180
gtaaccccgc ccgacgatag cggcgatgat gatgtgaccc cgcccgacga tagcggcgat 240
ggcgatgtga ccccgcccga cgatagcggc gatgacgatg taaccccgcc cgacgatagc 300
ggcgatgacg atgtgacccc gcctgacgat agcggcgatg acgatgtaac cccgcccgac 360
gatagcggcg atgacgatgt gaccccgccc gatgatagcg gcgatgacga tgtaaccccg 420
cccgatgata gcggcgatga cgacgacacg cccccagatg actctgttat taccttcagc 480
aacggcgtca 490
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaaaagcag gctgaag 17
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcgcattct tacccgag 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtgatgctc tgattttgct 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgtaagcgg gaatcgta 18
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agaggcgctg cgattgacga ta 22
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cattttccac agcggcagtt tttc 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggcgaggc gagcagcagt 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtcaggccg aatagcagga t 21
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcgggcatgc gttgaaa 17
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctggtgggga gaatgactgg 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgggcgcggc tggagtattt g 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaggggccg ggcagagaca gc 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccccctaagc ccgataatgg 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgacgccgtt gctgaaggta ataa 24

Claims (9)

1.一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的VNTR位点，其特征在于，所述的VNTR位点编号为STMV1和STMV2；
所述的STMV1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的STMV2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：
针对STMV1位点：
STMV1-F：5’-GCAAAAGCAGGCTGAAG-3’，STMV1-R：5’-GGCGCATTCTTACCCGAG-3’；
针对STMV2位点：
STMV2-F：5’-CGTGATGCTCTGATTTTGCT-3’，STMV2-R：5’-CCGTAAGCGGGAATCGTA-3’。
3.一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的VNTR位点，其特征在于，所述的VNTR位点编号为STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3；
所述的STMV1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的STMV2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的STTR9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的STTR5的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的STTR6的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的STTR10的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的STTR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：
针对STMV1位点：
STMV1-F：5’-GCAAAAGCAGGCTGAAG-3’，STMV1-R：5’-GGCGCATTCTTACCCGAG-3’；
针对STMV2位点：
STMV2-F：5’-CGTGATGCTCTGATTTTGCT-3’，STMV2-R：5’-CCGTAAGCGGGAATCGTA-3’；
针对STTR9位点：
STTR9-F：5’-AGAGGCGCTGCGATTGACGATA-3’，STTR9-R：5’-CATTTTCCACAGCGGCAGTTTTTC-3’；
针对STTR5位点：
STTR5-F：5’-ATGGCGAGGCGAGCAGCAGT-3’，STTR5-R：5’-GGTCAGGCCGAATAGCAGGAT-3’；
针对STTR6位点：
STTR6-F：5’-TCGGGCATGCGTTGAAA-3’，STTR6-R：5’-CTGGTGGGGAGAATGACTGG-3’；
针对STTR10位点：
STTR10-F：5’-CGGGCGCGGCTGGAGTATTTG-3’，STTR10-R：5’-GAAGGGGCCGGGCAGAGACAGC-3’；
针对STTR3位点：
STTR3-F：5’-CCCCCTAAGCCCGATAATGG-3’，STTR3-R：5’-TGACGCCGTTGCTGAAGGTAATAA-3’。
5.一种鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增试剂、权利要求2或4所述的检测引物组。
6.一种非疾病的诊断和治疗目的的鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测鼠伤寒沙门菌的基因组DNA作为模板，分别以权利要求2所述的STMV1-F/STMV1-R和STMV2-F/STMV2-R作为扩增引物，或者分别以权利要求4所述的STMV1-F/STMV1-R、STMV2-F/STMV2-R、STTR9-F/STTR9-R、STTR5-F/STTR5-R、STTR6-F/STTR6-R、STTR10-F/STTR10-R和STTR3-F/STTR3-R作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，根据测序结果对待测鼠伤寒沙门菌进行分型。
7.根据权利要求6所述的鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测分析方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为25μL，包括10×PCR buffer 2.5μL，3.0mmol/L MgCl2，250μmol/L dNTP，上下游引物各120nmol/L，1.5U Taq酶，模板2μL，余量为ddH2O。
8.根据权利要求6所述的鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测分析方法，其特征在于，所述的PCR扩增的扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性45s、58℃退火45s、72℃延伸45s，共进行30个循环；72℃延伸10min。
9.权利要求2或4所述的检测引物组在鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测中的应用。
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