CN113481311B

CN113481311B - 用于鉴定布鲁氏菌疫苗株m5的snp分子标记及其应用

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Publication number: CN113481311B
Application number: CN202111041179.1A
Authority: CN
Inventors: 姜海; 张雯; 朴东日; 杨晓雯; 田国忠; 赵鸿雁; 范玉
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2021-09-07
Filing date: 2021-09-07
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2041-09-07
Also published as: CN113481311A

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记及其应用。本发明提供的SNP分子标记，其包含位于如SEQ ID NO.1所示序列第37位多态性为A/C的核苷酸序列，该SNP分子标记的多态性位点为A，对应于布鲁氏菌疫苗株M5，多态性位点为C，对应于野毒株或其他布鲁氏菌疫苗株。本发明的SNP分子标记及其检测引物和探针可实现布鲁氏菌疫苗株M5和野毒株、其他布鲁氏菌疫苗株的简便和高效鉴别，准确性较高，可应用于布鲁氏菌病病原监测和流行病学分析，为布鲁氏菌病防控提供精准的技术支撑。

Description

用于鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及用于鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记及其应用。

背景技术

布鲁氏菌（Brucella）是一种细胞内寄生的革兰阴性球杆菌，引起布鲁氏菌病（简称布病）。2006年以前布鲁氏菌分为6个种，共19个生物型，包括牛种(Brucella abortus)8个生物型、羊种(Brucella melitensis)3个生物型、猪种(Brucella suis)5个生物型、犬种(Brucella canis)、绵羊附睾种(Brucella ovis)和沙漠森林野鼠种(Brucella neotomae)各1个生物型。目前布鲁氏菌增加了5个新种：Brucella ceti(分离自鲸鱼和海豚)、Brucella pinnipedialis(分离自鳍足类)、Brucella microti(分离自田鼠)、Brucellainopinata(分离自乳房移植病人的血液和伤口分泌液)和 Brucella papionis（分离自狒狒）。布鲁氏菌各生物型的G+C含量为55％～59％，DNA高度同源，同源性均在90％以上，基因组大小和组成相似。

免疫家畜既可保护牲畜不受布鲁氏菌感染，也间接地保护了人群。羊种布鲁氏菌5号菌种（M5菌苗）是免疫家畜常用的畜用疫苗。此疫苗用于免疫羊群（绵羊、山羊），免疫方法是皮下注射或气雾免疫，使用方便，保护期1年，效果良好。牛群的免疫常用牛种布鲁氏菌19号菌株活菌苗（皮下注射）和猪种布鲁氏菌2号菌株活菌苗（S2菌苗）的免疫效果均很好。

布鲁氏菌野毒株和疫苗株的鉴别诊断一直是布鲁氏菌研究的热点。动物流行病学调查和疫情处置中，通过血清学检测来鉴别自然感染和疫苗感染往往不具有特异性，因此从分子生物学角度来寻找特异鉴别位点已迫在眉睫。比较基因组学不仅可以进行全基因组的比较和系统发生的进化关系分析，还可进行细菌基因组多态性的研究，从而揭示基因潜在的功能、阐明物种进化关系及基因组的内在结构。布鲁氏菌的比较基因组学研究不仅加快了新的功能基因和主要致病差异基因的发现，而且为临床实践中疫苗株和野毒株感染鉴别诊断提供了重要技术支撑。随着二代测序技术的发展，常见的疫苗株和亲本菌株的全基因组测序完成，利用比较基因组学分析疫苗株和野毒株在基因组水平的差异，有助于开发疫苗株和野毒株鉴别诊断的新方法。对羊种强毒株M28-12和羊种疫苗株M5、M111的比较基因组学研究发现M5、M28-12和M111共有1370个单核苷酸多态性，其中89个来自M5和Mlll以及M28-12，这些多核苷酸多态性位点可能来自于疫苗株的突变。这些突变位点的发现对设计新的更加安全的疫苗具有重要的启示。

随着测序技术的发展，细菌基因组测序及全基因组比较提供了一种全新的基于细菌全基因组进行分析进而对种群结构进行分组和聚类的方法。但是该方法缺陷是成本较高，且高度依赖于测序仪，不能应用于缺乏测序仪的基层机构。基于细菌基因组两两比较所得到的SNP仅能代表菌株间差异，是否可能用于鉴定或分型需进行实验评估。然而细菌基因组间比较所得到的SNP少则几百个，多则几万个，如果依次进行评估，则工作量非常巨大，需采用多重细菌基因组比对新技术对SNP位点进行筛选。

目前，实时荧光定量PCR（RT-PCR）方法在布鲁氏菌检测、布鲁氏菌菌种鉴别、疫苗株与野毒株区分等方面得到了广泛应用，满足了检验检疫、流行病学调查、人和动物布病诊断等多方面的需求。

布鲁氏菌疫苗株M5可能造成人感染，且动物接种M5疫苗后产生的抗体很难和自然感染的野毒株产生的抗体进行鉴别诊断，影响了动物布病监测和疫情处置。因此，开发可区分鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的分子标记以及简便、快速、特异、而低成本的RT-PCR鉴定方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记及其引物探针组合。本发明的另一目的是提供该SNP分子标记及其引物探针组合的应用。

为实现上述目的，本发明首次基于最小核心组分型技术对布鲁氏菌全基因组信息进行系统的分析。具体从NCBI公开数据库下载羊种布鲁氏菌（共136株）公开的Complete和Scaffold基因组，基于Blast方法，将中国疾控中心传染病所布鲁氏菌病控制室保存的M5疫苗株经测序的genome GCA_000348645.1作为参考基因组，与135株羊种布鲁氏菌的基因组依次比对，如相似度大于60%且比对序列超过原序列的70%，则认为该基因存在于该基因组中。按照此分析策略，搜索出在135株羊种布氏菌中存在的Core gene。利用Mummer程序，将Core gene序列与135个基因组依次比对，查找SNP位点，并构建SNP矩阵。

将5株M5疫苗株（两株来自中国疾控中心传染病所布鲁氏菌病控制室测序的序列，三株来自NCBI数据库）定义为Group 1（疫苗组）；将131株布鲁氏菌野毒株（136株中131株为野毒株）及两株非M5布鲁氏菌疫苗株S2（猪种）和A19（牛种）定义为Group2。基于上一步获得的SNP矩阵，共119756个SNP，筛查可以区分两组菌株的单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphism, SNP）位点。可区分两组菌株的SNP位点应具有在该位点组内各菌株间无差异，组间不同的特点。按照以上策略，共筛选出4个SNP位点。进一步在这4个位点中进行筛选（由于另外三个位点所在序列中仍有1-3个SNP，会干扰疫苗株的鉴定，故只选择了除靶基因中存在唯一SNP，而无任何其他SNP的一个位点位点），最终得到可准确鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记，并设计和筛选用于检测该SNP分子标记的引物和探针。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供用于鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记，其包含位于如SEQ IDNO.1所示序列第37位多态性为A/C的核苷酸序列。

本发明所述的SNP分子标记的多态性位点位于布鲁氏菌MKPBFDOI_01277hypothetical protein的第37位，多态性为A/C。

布鲁氏菌不同菌株的MKPBFDOI_01277 基因序列可通过数据库获取，其中，布鲁氏菌疫苗株M5的MKPBFDOI_01277 基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的SNP分子标记具体可为序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段。

以上所述SNP分子标记的多态性位点为A，对应于布鲁氏菌疫苗株M5，多态性位点为C，对应于野毒株或其他疫苗株。

进一步地，本发明提供用于鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的引物组，其核苷酸序列如SEQID NO.2-3所示。

SEQ ID NO.2：MKPBFDOI_01277-F:

5’-AGGCGTCGCAAATCTGGTAA-3’；

SEQ ID NO.3：MKPBFDOI_01277-R:

5’-AACTGGTAGAAGCGCGCCC-3’。

本发明还提供与上述引物组配套使用的探针组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

SEQ ID NO.4：MKPBFDOI_01277-A:

5’- CTGAAAAATATAGCGAAGAC-3’；

SEQ ID NO.5：MKPBFDOI_01277-C:

5’-CTGAAAAATCTAGCGAAGA-3’。

SEQ ID NO.4-5所示探针分别配对于MKPBFDOI_01277基因（SEQ ID NO.1所示）第37位的A/C多态性序列。

以上所述的探针为MGB探针。

优选地，SEQ ID NO.4所示探针与SEQ ID NO.5所示探针采用不同的荧光基团标记。荧光基团可选自FAM、VIC、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种。

作为本发明的一种实施方式，SEQ ID NO.4所示探针的5’端采用FAM标记，3’端采用BHQ1标记。SEQ ID NO.5所示探针的5’端采用VIC标记，3’端采用BHQ1标记。

本发明提供所述SNP分子标记或其检测试剂或所述引物组或所述探针组在鉴定布鲁氏菌疫苗株M5中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记或其检测试剂或所述引物组或所述探针组在制备用于鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的试剂盒中的应用。

本发明提供鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的试剂盒，其包括SEQ ID NO.2-3所示的引物组，或者包括SEQ ID NO.2-3所示的引物组和SEQ ID NO.4-5所示的探针组。

以上所述的试剂盒还可包括用于RT-PCR检测的其他试剂，包括但不限于反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、ddH₂O、标准阳性质粒模板、阴性对照等。

具体地，所述试剂盒的工作程序包括如下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）以所述基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-3所示引物组与SEQ ID NO.4-5所示探针组进行RT-PCR；

（3）根据扩增曲线判断待测样品是否为布鲁氏菌疫苗株M5。

以上步骤（2）中，RT-PCR的反应程序包括：95℃，5-10分钟；95℃，10-30秒，62℃，20-30秒，35-45个循环。

优选地， RT-PCR的反应程序为：95℃，10分钟；95℃，15秒，62℃，30秒，40个循环。

以上步骤（2）中，RT-PCR的反应体系中SEQ ID NO.2-3所示引物组的浓度为300-350nM，SEQ ID NO.4-5所示探针组的浓度为200-250nM。

以上步骤（3）中，若SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ ID NO.4所示的探针能够获得扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌疫苗株M5；若SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ IDNO.5所示的探针能够获得扩增曲线，则待测样品为野毒株或布鲁氏菌其他疫苗株。

本发明提供一种鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的方法，其包括如下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）以所述基因组DNA为模板，分别利用SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ IDNO.4所示的探针和SEQ ID NO.5所示的探针进行RT-PCR；

（3）根据扩增曲线判断待测样品是否为布鲁氏菌疫苗株M5。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明基于最小核心组分型技术进行布鲁氏菌疫苗株M5与其他疫苗株、野毒株的全基因组比对分析，分析覆盖了NCBI数据库所有公开的中国流行菌株、国际参考菌株和国际流行株，有效保证了筛选得到的SNP位点的高特异性和准确性。

（2）基于筛选得到的SNP分子标记，本发明开发了一对用于鉴别布鲁氏菌疫苗株M5和野毒株的引物对和一对MGB探针，探针之间可相互验证，利用该引物对和探针对可实现布鲁氏菌疫苗株M5和野毒株、其他布鲁氏菌疫苗株的高效、准确的鉴别。

（3）本发明的SNP分子标记及其检测引物对和探针对可进行布鲁氏菌疫苗株M5和野毒株、布鲁氏菌其他疫苗株快速同步检测和分析，有效提高了检测效率，可实现布鲁氏菌的快速检测和分型，对分离菌株进行简便和高效的鉴定，对于布鲁氏菌的快速识别和鉴定、布鲁氏菌病病原监测和流行病学分析具有重要的意义，为布鲁氏菌病防控提供高效的技术支撑。

附图说明

图1为本发明实施例1中用含有布鲁氏菌疫苗株M5的MKPBFDOI_01277基因的阳性质粒验证引物和探针特异性的评价结果。

图2为本发明实施例1中用含有布鲁氏菌野毒株的MKPBFDOI_01277基因的阳性质粒验证引物和探针特异性的评价结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别说明，以下实施例所用的方法为常规方法，实施例所用的耗材、试剂均为市售可得。

实施例1 用于鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的核心SNP分子标记的获得

1、利用最小核心组分型方法对布鲁氏菌全基因组信息进行系统的分析

（1）从美国生物技术信息中心（National Center for BiotechnologyInformation, NCBI）GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov /genome/）下载羊种布鲁氏菌（共136株）公开的Complete和Scaffold基因组。

（2）基于Blast方法，将M5GCA_000348645.1的基因与135株布鲁氏菌的基因组依次比对，如相似度大于60%且比对序列超过原序列的70%，则认为该基因存在于该基因组中。按照此分析策略，搜索出在所有菌株中存在的Core gene，共计1291个。

（3）利用Mummer程序，将Core gene序列与134个基因组依次比对，查找SNP位点，并构建SNP矩阵。将5株M5疫苗株定义为Group 1（疫苗组）；将131株布鲁氏菌野毒株定义为Group2。基于上一步获得的SNP矩阵，筛查可以区分两组菌株的SNP位点。可区分两组菌株的SNP位点应具有在该位点组内各菌株间无差异，组间不同的特点。按照以上策略，共筛选出4个候选靶基因SNP位点。

（4）在各候选SNP位点上下游设计引物和探针，对不同的羊种布鲁氏菌野毒株和两株非M5布鲁氏菌疫苗株S2（猪种）和A19（牛种）以及M5疫苗株进行扩增验证，经筛选，最终得到可准确区分布鲁氏菌疫苗株M5和不同布鲁氏菌野毒株和两株非M5布鲁氏菌疫苗株S2（猪种）和A19（牛种）的SNP分子标记，该SNP分子标记位于布鲁氏菌MKPBFDOI_01277基因的第37位（布鲁氏菌疫苗株M5的MKPBFDOI_01277基因序列如SEQ ID NO.1所示序列），多态性为A/C，多态性位点为A，对应于布鲁氏菌疫苗株M5，多态性位点为C，对应于野毒株或布鲁氏菌其他疫苗株。

2、SNP分子标记的检测引物、探针以及检测方法

上述1中最终筛选得到的SNP分子标记的检测引物和探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.2-5所示：

SEQ ID NO.2：MKPBFDOI_01277-F:

5’-AGGCGTCGCAAATCTGGTAA-3’；

SEQ ID NO.3：MKPBFDOI_01277-R:

5’-AACTGGTAGAAGCGCGCCC-3’。

SEQ ID NO.4：MKPBFDOI_01277-A:

5’- FAM-CTGAAAAATATAGCGAAGAC-BHQ1-3’；

SEQ ID NO.5：MKPBFDOI_01277-C:

5’-VIC-CTGAAAAATCTAGCGAAGA-BHQ1-3’。

分别以含有布鲁氏菌疫苗株M5的MKPBFDOI_01277基因的阳性质粒和含有布鲁氏菌野毒株的MKPBFDOI_01277基因的阳性质粒为模板，采用如SEQ ID NO.2-5所示的引物和探针进行RT-PCR扩增。

RT-PCR的20μl反应体系为：2×RT-PCR Mix 10μl，引物和探针混合液（SEQ IDNO.2-3所示引物和SEQ ID NO.4-5所示探针）2μl，去离子水 6μl，阳性质粒模板DNA 2μl。SEQ ID NO.2-3所示引物在反应体系中的终浓度为300nM，SEQ ID NO.4-5所示探针在反应体系中的终浓度为200nM。

RT-PCR的反应条件为： 95℃，10分钟；95℃，15秒，62℃，30秒，40个循环。

阳性质粒模板的扩增曲线如图1，图2所示，利用该SNP分子标记的检测引物和探针可对布鲁氏菌疫苗株M5和野毒株分别扩增得到特异性扩增曲线。若SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ ID NO.4所示的探针能够获得扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌疫苗株M5；若SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ ID NO.5所示的探针能够获得扩增曲线，则待测样品为羊种布鲁氏菌野毒株。

实施例2 SNP分子标记检测的特异性评价

以与布鲁氏菌存在血清学交叉反应或与布鲁氏菌种近缘的汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、金黄葡萄球菌以及其他种布鲁氏菌野毒株，多个疫苗株如S2（猪种），A19（牛种）等作为特异性对照作为待测样品，对实施例1筛选得到的SNP分子标记及其引物对和探针对（见表1）进行检测特异性评价，具体方法如下：

1、基因组DNA的提取

采用北京天根生化试剂有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒内的说明书对包括上述汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、金黄葡萄球菌在内的所有待测菌样品进行基因组DNA的提取。

2、RT-PCR

分别以步骤（1）提取得到的各细菌的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-3所示引物和SEQ ID NO.4-5所示探针进行RT-PCR。

RT-PCR的20μl反应体系为：2×RT-PCR Mix10μl，引物和探针混合液（SEQ IDNO.2-3所示引物和SEQ ID NO.4-5所示探针）2μl，去离子水 6μl，基因组DNA 2μl。SEQ IDNO.2-3所示引物在反应体系中的终浓度为300nM，SEQ ID NO.4-5所示探针在反应体系中的终浓度为200nM。

3、根据RT-PCR扩增曲线，分析结果。

结果显示，布鲁氏菌疫苗株M5的扩增曲线荧光信号为FAM，对应SNP位点为A，布鲁氏菌疫苗株S2（猪种）和A19（牛种）扩增曲线荧光信号为VIC，对应SNP位点为C，各标准株和野毒株的扩增曲线荧光信号为VIC，对应SNP位点为C。其它非布鲁氏菌样品均没有扩增，表明本发明的SNP分子标记及其检测引物和探针对于布鲁氏菌具有较高的特异性。

实施例3 SNP分子标记在鉴别布鲁氏菌疫苗株M5和地方布鲁氏菌菌株中的应用

利用实施例1筛选得到的SNP分子标记及其引物（SEQ ID NO.2-3）和探针（SEQ IDNO.4-5）对布鲁氏菌疫苗株M5、布鲁氏菌标准株、120株地方分离的布鲁氏菌野毒株及布鲁氏菌疫苗株S2（猪种），A19（牛种）进行区分鉴别，基因组DNA的提取和RT-PCR方法同实施例2。

鉴定结果如表2、表3和表4所示，布鲁氏菌疫苗株M5的扩增曲线荧光信号为SEQ IDNO.4所示探针标记的荧光（FAM），对应SNP位点为A，各标准株（标准株的名称见表4）的扩增曲线荧光信号为SEQ ID NO.5所示探针标记的荧光（VIC），对应SNP位点为C ，120株野毒株的扩增曲线荧光信号为VIC，对应SNP位点为C，布鲁氏菌疫苗株S2（猪种）和A19（牛种）扩增曲线荧光信号为VIC，对应SNP位点为C。

以上结果表明，本发明的SNP分子标记可实现布鲁氏菌疫苗株M5和地方布鲁氏菌菌株的特异性区分鉴别，特异度为100%。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 用于鉴定布鲁氏菌疫苗株M5的SNP分子标记及其应用

<130> KHP 211117252.2YS

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaggcgtc gcaaatctgg taagcgactg aaaaatatag cgaagacgct tcgggcgcgc 60

ttctaccagt tcgcccgcaa ggcggcgatc cagatattcc gaacattcct cgatcagttc 120

ttcgccctga ccggtaaaga agtggtttgc gctggcaatg gtcttctgcg tgatggtgat 180

gcccttctgg gtcttgagct tgtcaaccag cgcctgcacg tctttcggcg gagcaacctt 240

gtcctggtcc ccgtgaatga taaggccgga cgaagggcag ggtgcgagga atga 294

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggcgtcgca aatctggtaa 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aactggtaga agcgcgccc 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgaaaaata tagcgaagac 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgaaaaatc tagcgaaga 19

Claims

1.一种SNP分子标记在制备鉴别布鲁氏菌疫苗株M5与非布鲁氏菌疫苗株M5的试剂盒中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记包含位于如SEQ ID NO.1所示序列第37位多态性为A/C的核苷酸序列；

所述SNP分子标记的多态性位点为A，对应于布鲁氏菌疫苗株M5，多态性位点为C，对应于非布鲁氏菌疫苗株M5；

所述非布鲁氏菌疫苗株M5包括：羊种1型标准菌株16M，羊种2型标准菌株63/9，羊种3型标准菌株Ether，牛种1型标准菌株544A，牛种2型标准菌株86/8159，牛种3型标准菌株Tulya，牛种4型标准菌株292，牛种5型标准菌株B3196，牛种6型标准菌株870，牛种7型标准菌株63/75，牛种9型标准菌株L68，猪种1型标准菌株1330S，猪种2型标准菌株Tholnson，猪种3型标准菌株686，猪种4型标准菌株40，犬种标准菌株RM6/66，沙林鼠种标准菌株5K33，绵羊附睾种标准菌株63/290，疫苗株S2，疫苗株A19，野毒株。

2.一种引物和探针组合在制备鉴别布鲁氏菌疫苗株M5与非布鲁氏菌疫苗株M5的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；其中SEQ ID NO.4所示的探针用于检测布鲁氏菌疫苗株M5，SEQ ID NO.5所示的探针用于检测非布鲁氏菌疫苗株M5；

3.鉴别布鲁氏菌疫苗株M5的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）以所述基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-3所示引物与SEQ ID NO.4-5所示探针进行RT-PCR；

（3）根据扩增曲线判断待测样品是否为布鲁氏菌疫苗株M5；若SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ ID NO.4所示的探针能够获得扩增曲线，则待测样品为布鲁氏菌疫苗株M5；若SEQ ID NO.2-3所示的引物组与SEQ ID NO.5所示的探针能够获得扩增曲线，则待测样品为非布鲁氏菌疫苗株M5；

4.根据权利要求3所述的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述RT-PCR的反应程序包括：95℃，5-10分钟；95℃，10-30秒，62℃，20-30秒，35-45个循环。

5.根据权利要求3或4所述的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述RT-PCR的反应体系中，SEQ ID NO.2-3所示引物组的浓度为300-350nM，SEQ ID NO.4-5所示探针组的浓度为200-250nM。