CN109641940B - 原卟啉原氧化酶变体及使用其赋予和/或增强除草剂耐受性的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

提供了使用来源于原核生物的原卟啉原氧化酶的氨基酸变体赋予植物和/或藻类增强的除草剂耐受性和/或增强植物和/或藻类的除草剂耐受性的技术。

Description

原卟啉原氧化酶变体及使用其赋予和/或增强除草剂耐受性 的方法和组合物

技术领域

提供了来源于原核生物的原卟啉原氧化酶或其变体，以及使用该原卟啉原氧化酶或其变体赋予和/或增强植物和/或藻类的除草剂耐受性的技术。

背景技术

卟啉生物合成途径用于合成在植物代谢中起重要作用的叶绿素和血红素，并且其发生在叶绿体中。在该途径中，原卟啉原IX氧化酶(下文称为PPO；EC：1.3.3.4)催化原卟啉原IX氧化成原卟啉IX。原卟啉原IX氧化成原卟啉IX后，原卟啉IX通过镁螯合酶与镁结合合成叶绿素，或通过铁螯合酶与铁结合合成血红素。

因此，当PPO活性受到抑制时，叶绿素和血红素的合成受到抑制，并且底物原卟啉原IX离开正常的卟啉生物合成途径，导致原卟啉原IX从叶绿体快速输出到细胞质，以及由氧化引起的细胞质原卟啉IX的累积。累积的原卟啉IX在光和氧分子的存在下产生高反应性的单线态氧(¹O₂)，它们破坏细胞膜并迅速导致植物细胞死亡。基于该原理，已经开发出抑制PPO活性的除草剂。迄今为止，已有根据其化学结构分类的9个家族的PPO抑制性除草剂，包括嘧啶二酮、二苯基醚、苯基吡唑、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、噻二唑、

二唑、三唑啉酮、

唑烷二酮和其它除草剂。

此外，为了在使用除草剂时防止这些除草剂对作物生长的影响，需要为作物提供除草剂耐受性。

同时，藻类是光合生物，其可将光能转化为可用于合成各种有用的化合物的化学能。例如，藻类可通过光合作用固定碳并将二氧化碳转化为糖、淀粉、脂质、脂肪或其他生物分子，从而从大气中除去温室气体。此外，藻类的大规模培养可以产生多种物质，例如工业酶、治疗化合物和蛋白、营养素、商业物质和燃料物质。

然而，在生物反应器或开放或封闭池塘中大规模培养藻类的情况下，可能发生由不期望的竞争性生物(例如不期望的藻类、真菌、轮虫或浮游动物)导致的污染。

因此，需要一种技术来在赋予对所期望的植物和/或藻类的除草剂耐受性后通过在抑制竞争性生物生长而没有除草剂耐受性的浓度下处理除草剂来大规模地收获所期望的植物和/或藻类。

参考文献

(专利文献1)美国专利申请登记公开US 6,308,458(2001年10月30日)

(专利文献2)美国专利申请登记公开US 6,808,904(2004年10月26日)

(专利文献3)美国专利申请登记公开US 7,563,950(2009年07月21日)

(专利文献4)国际专利申请公开WO2011/085221(2011年07月14日)

(非专利文献1)Li X，Volrath SL，Chilcott CE，Johnson MA，Ward ER，Law MD，原卟啉原氧化酶作为根癌农杆菌介导的玉米转化的有效选择标记的开发(Development ofprotoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of maize)，植物生理学(Plant physiology)133：736-747，2003

发明内容

技术问题

在本说明书中，发现来源于原核生物的hemY型PPO基因及其突变体对原卟啉原氧化酶(PPO)抑制性除草剂显示出广泛的除草剂耐受性，从而提出如果向植物和/或藻类提供hemY型PPO基因及其突变体，可以赋予和/或增强除草剂耐受性。

一种实施方式提供了多肽变体，其包含、基本上由以下组成或由以下组成：

(1)以下氨基酸序列，所述氨基酸序列中，选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQ ID NO：1之间相互作用的氨基酸(例如位于与PPO抑制性除草剂相互作用的SEQ ID NO：1多肽的结合位点上的氨基酸)组成的组中的一种或多种分别并且独立地缺失或被与相应位置上的原始氨基酸不同的氨基酸取代，或

(2)与氨基酸序列(1)具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高序列同源性的氨基酸序列。

选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQ ID NO：1之间相互作用的氨基酸组成的组中的一种或多种可以是选自由SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的S63、P91、R92、F169、V173、A175、E228、L229、P316、V318、F337、L340、G351、T352、I353和Y373组成的组中的一种或多种。

另一种实施方式提供了多肽变体，其包含、基本上由以下组成或由以下组成：

(1)以下氨基酸序列，所述氨基酸序列中选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQ ID NO：3之间相互作用的氨基酸(例如位于与PPO抑制性除草剂相互作用的SEQ ID NO：3多肽的结合位点上的氨基酸)组成的组中的一种或多种分别并且独立地缺失或被与相应位置上的原始氨基酸不同的氨基酸取代，或者

(2)与氨基酸序列(1)具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高序列同源性的氨基酸序列。

选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQ ID NO：3之间相互作用的氨基酸组成的组中的一种或多种可以是选自由SEQ ID NO：3的氨基酸序列中的N63、S64、S66、P67、P92、R93、F170、S172、G173、V174、Y175、A176、R190、E230、L231、P318、V320、F339、G340、N341、L342、L352、G353、T354、I355、Y375、I424、V458和R465组成的组中的一种或多种。

其它实施方式提供了多肽变体，其包含、基本上由以下或由以下组成：

(1)以下氨基酸序列，所述氨基酸序列中选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQ ID NO：5之间相互作用的氨基酸(例如位于与PPO抑制性除草剂相互作用的SEQ ID NO：5多肽的结合位点上的氨基酸)组成的组中的一种或多种分别并且独立地缺失或被与相应位置上的原始氨基酸不同的氨基酸取代，或者

(2)与氨基酸序列(1)具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高序列同源性的氨基酸序列。

自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQ ID NO：5之间相互作用的氨基酸组成的组中的一种或多种可以是选自由SEQ ID NO：5的氨基酸序列中的P84、R85、F156、V160、A162、Q179、P306、V308、F327、L330、I343、N362和F363组成的组中的一种或多种。

其他实施方式提供了编码多肽变体或SEQ ID NO：1、3或5的多肽的多核苷酸。

其他实施方式提供了包含该多核苷酸的重组载体。

其他实施方式提供了包含该重组载体的重组(转化)细胞。

其他实施方式提供了用于赋予或增强植物或藻类的除草剂耐受性的组合物，其包含选自由以下组成的组中的一种或多种：

SEQ ID NO：1的多肽、SEQ ID NO：3的多肽、SEQ ID NO：5的多肽、所述多肽的变体、和与所述多肽或变体具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高序列同源性的氨基酸序列的多肽；

编码所述多肽或变体的多核苷酸；

包含该多核苷酸的重组载体；和

包含该重组载体的重组(转化)细胞。

除草剂可以是原卟啉原氧化酶抑制性除草剂。

作为具体实施方式，除草剂可以是选自由嘧啶二酮、二苯基醚、苯基吡唑、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、苯基酯、噻二唑、

二唑、三唑啉酮、

唑烷二酮和其他除草剂组成的组中的一种或多种，但不限于此。

作为具体实施方式，除草剂可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：氟丙嘧草酯、苯嘧磺草胺、双苯嘧草酮、汰芬那(tiafenacil)、氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、苯草醚、三氟羧草醚、治草醚(bifenox)、氯乳醚(ethoxyfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、甲氧除草醚(chlomethoxyfen)、氯除草醚(chlorintrofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、氟硝磺酰胺(halosafen)、氟唑草酯(pyraflufen-ethyl)、异丙吡草酯(fluazolate)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟烯草酸(flumiclorac-pentyl)、嗪草酸(fluthiacet)、噻二唑草胺(thidiazimin)、丙炔

草酮(oxadiargyl)、

草酮(oxadiazon)、唑酮草酯(carfentrazone)、甲磺草胺(sulfentrazone)、唑啶草酮(azafenidin)、环戊

草酮(pentoxazone)、双唑草腈(pyraclonil)、氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)、氟唑草胺(profluazol)、吡落草(phenopylate)(2，4-二氯苯基-1-吡咯烷羧酸酯)、吡落草的氨基甲酸酯类似物(例如，O-苯基吡咯烷基-和哌啶子基氨基甲酸酯类似物(参考“Ujjana B.Nandihalli、Mary V.Duke、Stephen O.Duke、O-苯基吡咯烷基-和哌啶子基氨基甲酸酯除草剂的分子性质与生物活性之间的关系(Relationships betweenmolecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino-andpiperidinocarbamate herbicides.)，J.Agric.Food Chem.，1992，40(10)1993-2000”))、其农业上可接受的盐及其组合，但不限于此。

植物是指具有光合能力的多细胞真核生物，其可以是单子叶植物或双子叶植物，并且可以是草本植物或木本植物。藻类是指具有光合能力的单细胞生物，其可以是原核藻类或真核藻类。

在一种实施方式中，对植物和藻类进行遗传操作以进一步包含第二除草剂耐受性多肽或其编码基因，并且可以赋予和/或增强对第二除草剂的更广泛的除草剂耐受性。为了包含第二除草剂耐受性多肽或其编码基因而对植物和藻类进行遗传操作，所述植物和藻类可以使用用于赋予和/或增强对除草剂的耐受性的组合物来制备，所述组合物中进一步包含第二除草剂耐受性多肽或其编码基因。因此，用于赋予和/或增强对除草剂的耐受性的组合物可以进一步包含第二除草剂耐受性多肽或其编码基因。

作为具体实施方式，第二除草剂可包括细胞分裂抑制性除草剂、光合作用抑制性除草剂、氨基酸合成抑制性除草剂、质体抑制性除草剂和细胞膜抑制性除草剂，但不限于此。

作为具体实施方式，第二除草剂的实例可以是草甘膦、草铵膦、麦草畏、2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)、异

唑草酮、ALS(乙酰乳酸合酶)抑制性除草剂、光系统II抑制性除草剂、苯脲基除草剂、溴苯腈基除草剂及其组合，但不限于此。

作为具体实施方式，第二除草剂的实例可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：草甘膦除草剂耐受性EPSPS(草甘膦抗性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)、GOX(草甘膦氧化酶)、GAT(草甘膦-N-乙酰转移酶)或草甘膦脱羧酶；草铵膦除草剂耐受性PAT(草丁膦-N-乙酰转移酶)；麦草畏除草剂耐受性DMO(麦草畏单加氧酶)；2，4-D除草剂耐受性2，4-D单加氧酶或AAD(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)；ALS抑制性磺酰脲基除草剂耐受性ALS(乙酰乳酸合酶)、AHAS(乙酰羟酸合酶)或Athahasl(乙酰羟酸合酶大亚基)；光系统II抑制性除草剂耐受性光系统II蛋白D1；苯脲基除草剂耐受性细胞色素P450；质体抑制性除草剂耐受性HPPD(羟基苯丙酮酸双加氧酶)；溴苯腈除草剂耐受性腈水解酶；及其组合，但不限于此。

进一步地，编码第二除草剂耐受性多肽的基因的实例可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：草甘膦除草剂耐受性cp4 epsps、mepsps、2mepsps、goxv247、gat4601或gat4621基因；草铵膦除草剂耐受性bar、pat或pat(SYN)基因；麦草畏除草剂耐受性dmo基因；2，4-D除草剂耐受性AAD-1、AAD-12基因；ALS抑制性磺酰脲基除草剂耐受性ALS、GM-HRA、S4-HRA、ZM-HRA、Csr1、Csr1-1、Csr1-2、SurA或SurB；光系统II抑制性除草剂耐受性psbA基因；苯脲除草剂耐受性CYP76B1基因；异

唑草酮除草剂耐受性HPPDPF W336基因和溴苯腈除草剂耐受性bxn基因；及其组合，但不限于此。

其他实施方式提供了具有除草剂耐受性的植物和/或藻类的转化体，其用多核苷酸、其克隆或后代转化。

其他实施方式提供了制备具有除草剂耐受性的转基因植物或转基因藻类的方法，其包括用所述多核苷酸转化植物和/或藻类的步骤。

其他实施方式提供赋予或增强植物和/或藻类的除草剂耐受性的方法，其包括用所述多核苷酸或其编码基因转化植物和/或藻类的步骤。

可以对藻类和/或植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、枝条或整株植物进行转化。

转化体可以是藻类和/或植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、枝条或整株植物。

其他实施方式提供了一种控制农田中杂草的方法，包括：

向农田提供植物的步骤，所述植物包含选自由SEQ ID NO：1、3或5的多肽、或多肽变体、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的重组载体和包含该重组载体的重组细胞组成的组中的一种或多种；和

将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于农田(或植物)的步骤。

作为一种具体实施方式，将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于农田的步骤可以通过依次或同时施用有效剂量的两种或更多种原卟啉原氧化酶抑制性除草剂来进行。

作为其他实施方式，可以对植物进行基因操作以进一步包含第二除草剂耐受性多肽或其编码基因，并且可以依次或同时施用有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂和第二除草剂。

其他实施方式提供了从培养基中除去不希望的水生生物的方法，包括：向培养基提供藻类的步骤，所述藻类包含选自由多肽，多肽变体、编码多肽或多肽变体的多核苷酸、包含该多核苷酸的重组载体、和包含该重组载体的重组细胞组成的组中的一种或多种；以及将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于培养基的步骤。

技术方案

提供了赋予和/或增强植物或藻类的除草剂耐受性的技术。

如本文使用的，“赋予和/或增强植物或藻类的除草剂耐受性”或“增强植物或藻类的除草剂耐受性”被解释为对不具有除草剂耐受性的植物或藻类赋予耐受性，或增强具有除草剂耐受性的植物或藻类的耐受性，或涵盖两者的广泛含义。

如本文所用，使用“由序列组成”、“基本上由序列组成”或“包括序列”，是为了指包括所描述的序列或必要地包括该序列的两种情况，并且可以被解释为包括除了所描述的序列之外的序列和/或包含突变(氨基酸或核酸的添加、缺失和/或取代)的意思，只要其保持蛋白、多肽或核酸分子的内在活性并显示预期的功能。

在一种实施方式中，提供了选自由以下组成的组中的一种或多种多肽变体：

多肽变体，其包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成，在所述氨基酸序列中，选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQ ID NO：1之间相互作用的氨基酸(例如位于与PPO抑制性除草剂相互作用的SEQ ID NO：1的结合位点上的氨基酸)组成的组中的一种或多种分别并且独立地缺失或被与相应位置上的原始氨基酸不同的其它氨基酸取代；或与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列；

多肽变体，其包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成，在所述氨基酸序列中，选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQ ID NO：3之间相互作用的氨基酸(例如位于与PPO抑制性除草剂相互作用的SEQ ID NO：3的结合位点上的氨基酸)组成的组中的一种或多种分别并且独立地缺失或被与相应位置上的原始氨基酸不同的其它氨基酸取代；或与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列；

多肽变体，其包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成，在所述氨基酸序列中，选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQ ID NO：5之间相互作用的氨基酸(例如位于与PPO抑制性除草剂相互作用的SEQ ID NO：5的结合位点上的氨基酸)组成的组中的一种或多种分别并且独立地缺失或被与相应位置上的原始氨基酸不同的其它氨基酸取代；或与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列；

及其组合。

在其他实施方式中，提供了编码多肽变体的多核苷酸、包含该多核苷酸的重组载体、和包含该重组载体的重组细胞。可以设计多核苷酸，以使编码每个氨基酸的密码子中优化的密码子被包含在待转化的细胞中。优化的密码子对本领域技术人员来说是容易知道的(例如，参照“http：//www.genscript.com/codon-opt.html”，“http：//sg.idtdna.com/CodonOpt”等)。

在其他实施方式中，提供了用于赋予或增强植物或藻类的除草剂耐受性的组合物，其包含选自由以下组成的组中的一种或多种：多肽变体、编码多肽变体的多核苷酸、包含该多核苷酸的重组载体、和包含该重组载体的重组细胞及其组合。

在其它实施方式中，提供了具有除草剂耐受性的转化体，该转化体用多核苷酸转化。

在其他实施方式中，提供了制备具有除草剂耐受性的转基因植物或转基因藻类的方法，其包括用所述多核苷酸转化藻类，或植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、枝条或整株植物的步骤。

在其他实施方式中，提供了赋予或增强植物或藻类的除草剂耐受性的方法，其包括用所述多核苷酸转化藻类，或植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、枝条或整株植物的步骤。

在下文中，将更详细地描述本发明。

在本文中提供的SEQ ID NO：1、3、5的氨基酸序列的多肽、或其变体是来源于原核生物(例如蓝细菌)的PPO蛋白，并且是对于PPO抑制性除草剂具有耐受性的除草剂耐受性PPO蛋白。具体地，提供来源于黑绿颤藻(Oscillatoria nigro-viridis)PCC 7112的PPO蛋白，其命名为CyPPO2，其氨基酸序列由SEQ ID NO：1表示，并且其编码基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：2表示。另外，提供了来源于鞘丝藻属(Lyngbya sp.)PCC 8106株的PPO蛋白，其命名为CyPPO4，其氨基酸序列由SEQ ID NO：3表示，并且其编码基因的核苷酸序列由SEQ IDNO：4表示。另外，提供了来源于盐杆藻属(Halothece sp.)PCC 7418株的PPO蛋白，其命名为CyPPO8，其氨基酸序列由SEQ ID NO：5表示，并且其编码基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：6表示。本文中，上述多肽和多肽变体可分别表示为对PPO抑制性除草剂具有耐受性的除草剂耐受性PPO蛋白或除草剂耐受性PPO蛋白变体。此外，如本文所用，“除草剂耐受性PPO或其变体”可用于表示上述除草剂耐受性PPO蛋白或除草剂耐受性PPO蛋白变体、除草剂耐受性PPO蛋白编码基因或除草剂耐受性PPO蛋白变体编码基因、或它们全部。

蓝细菌来源的PPO蛋白可以具有对PPO抑制性除草剂的增强的耐受性，和/或通过维持整体酶活性的范围内包含相对于野生型PPO蛋白的氨基酸突变(变异)来增强对PPO抑制性除草剂的耐受性。这种氨基酸突变可以包括取代、缺失、添加和/或导入选自PPO蛋白与除草剂之间相互作用位点的氨基酸残基中的氨基酸的一种或多种。

将更详细地如下描述PPO蛋白变体。

一种实施方式提供了多肽变体，其包含、基本上由以下组成或由以下组成：

以下氨基酸序列，所述氨基酸序列中选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQID NO：1(CyPPO2)之间相互作用的氨基酸(例如位于SEQ ID NO：1的多肽与PPO抑制性除草剂的结合位点上的氨基酸)组成的组中的一种或多种分别独立地缺失或被与原始氨基酸(即野生型的相应位置上的氨基酸)不同的其它氨基酸取代，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

缺失或被与原始氨基酸不同的其他氨基酸取代的SEQ ID NO：1的多肽的氨基酸残基(例如，选自由位于SEQ ID NO：1的多肽与PPO抑制性除草剂的结合位点上的氨基酸组成的组中的一种或多种残基)可以是选自由SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的S63(意指“第63位上的S(Ser)”；以下氨基酸残基的表示以相同方式解释)、P91、R92、F169、V173、A175、E228、L229、P316、V318、F337、L340、G351、T352、I353和Y373组成的组中的一种或多种。

在一种具体实施方式中，多肽变体可包含、基本上由以下组成或由以下组成：

以下氨基酸序列，所述氨基酸序列中，选自由SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的S63、P91、R92、F169、V173、A175、E228、L229、P316、V318、F337、L340、G351、T352、I353和I408组成的组中的一种或多种分别独立地缺失或被选自由M(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)、S(Ser)、F(Phe)、P(Pro)、W(Trp)、N(Asn)、Q(Gln)、G(Gly)、Y(Tyr)、D(Asp)、E(Glu)、R(Arg)、H(His)、K(Lys)等组成的组且与野生型相应位置上的氨基酸不同的氨基酸取代(例如，被选自由M(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)、S(Ser)、F(Phe)等组成的组且与野生型相应位置上的氨基酸不同的氨基酸取代)，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

例如，多肽变体可包含、基本上由以下组成或由以下组成：

以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的选自由Y373M(意指“第373位上的氨基酸残基由Y(Tyr)被取代成M(Met)”；以下氨基酸突变的表示以相同方式解释)、Y373V、Y373I、Y373T、Y373L、Y373C、F169A、A175C、A175L、A175I、P316A、P316L、V318M、V318T、V318L、G351A、S63T、P91L、R92A、V173S、V173C、V173T、V173L、E228A、L229F、F337V、L340T、L340I、L340V、T352V、I353T、I353L、I353V和I353C组成的组中的一种或多种氨基酸突变，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

例如，多肽变体可包含、基本上由以下组成或由以下组成：

以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的选自由Y373M、Y373V、Y373I、Y373T、Y373L、Y373C、F169A、A175C、A175L、A175I、P316A、P316L、V318M、V318T、V318L、G351A、S63T、P91L、R92A、V173S、V173C、V173T、V173L、E228A、L229F、F337V、L340T、L340I、L340V、T352V、I353T、I353L、I353V、I353C、S63T+Y373M(意指包括所有第63位残基由S到T的取代和第373位残基由Y到M的取代的突变体或突变；以下两种或更多种突变的表示以相同方式解释)、R92A+Y373M、V173S+Y373M、V173S+Y373I、V173S+Y373L、V173S+Y373V、V173C+Y373M、V173C+Y373I、V173T+Y373M、V173T+Y373I、V173L+Y373M、A175L+Y373M、A175L+Y373I、A175C+Y373M、A175C+Y373I、A175I+Y373M、E228A+Y373M、L229F+Y373T、V318M+Y373M、V318M+Y373I、V318M+Y373V、V318T+Y373I、L340I+Y373M、L340I+Y373I、L340V+Y373M、G351A+Y373M、I353T+Y373M、I353T+Y373I、I353T+Y373L、I353L+Y373M、I353V+Y373M、I353C+Y373M、S63T+V173S+Y373M、S36T+V173S+Y373I、S63T+I353T+Y373M、S63T+I353T+Y373I、V173S+V318M+Y373M、V173T+L340I+Y373M、V173S+A175C+Y373M、A175C+V318M+Y373M、A175L+V318M+Y373M、A175C+I353L+Y373M、A175C+I353V+Y373M、P316A+V318L、P316L+V318L、F337V+Y373M、T352V+Y373M、G351A+T352V+Y373M、或P91L+Y373M的氨基酸突变组成的组中的一种或多种氨基酸突变，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

其他实施方式提供了多肽变体，其包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

氨基酸序列，所述氨基酸序列中选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQ IDNO：3(CyPPO4)之间相互作用的氨基酸(例如位于SEQ ID NO：3的多肽与PPO抑制性除草剂的结合位点上的氨基酸)组成的组中的一种或多种分别独立地缺失或被与原始氨基酸(即野生型的相应位置上的氨基酸)不同的其它氨基酸取代，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

缺失或被与原始氨基酸不同的其他氨基酸取代的SEQ ID NO：3的多肽的氨基酸残基(例如，选自由位于SEQ ID NO：3的多肽与PPO抑制性除草剂的结合位点上的氨基酸组成的组中的一种或多种)可以是选自由SEQ ID NO：3的氨基酸序列的N63、S64、S66、P67、P92、R93、F170、S172、G173、V174、Y175、A176、R190、E230、L231、P318、V320、F339、G340、N341、L342、L352、G353、T354、I355、Y375、I424、V458和R465组成的组中的一种或多种，例如选自由SEQ ID NO：3的氨基酸序列的A176、P318、V320和Y375组成的组中的一种或多种。

在一种具体实施方式中，多肽变体可包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

氨基酸序列，所述氨基酸序列中，选自由SEQ ID NO：3的氨基酸序列中的N63、S64、S66、P67、P92、R93、F170、S172、G173、V174、Y175、A176、R190、E230、L231、P318、V320、F339、G340、N341、L342、L352、G353、T354、I355、Y375、I424、V458和R465组成的组中的一种或多种，例如选自由SEQ ID NO：3的氨基酸序列中的A176、P318、V320和Y375组成的组中的一种或多种分别独立地缺失或被选自由M(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)、S(Ser)、F(Phe)、P(Pro)、W(Trp)、N(Asn)、Q(Gln)、G(Gly)、Y(Tyr)、D(Asp)、E(Glu)、R(Arg)、H(His)、K(Lys)等组成的组且与野生型相应位置上的氨基酸不同的氨基酸取代(例如，被选自由M(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)等组成的组且与野生型相应位置上的氨基酸不同的氨基酸取代)，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

例如，多肽变体可包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO：3的氨基酸序列中的Y375M、Y375V、Y375I、Y375T、Y375C、A176C、A176L、P318L、V320L、V320M和P318A组成的组中的一种或多种氨基酸突变，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

更具体地，多肽变体可包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列中的Y375M、Y375V、Y375I、Y375T、Y375C、A176C、A176L、P318L+V320L、V320M或P318A+V320L的氨基酸突变，或与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

其它实施方式提供了多肽变体，其包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

以下氨基酸序列，所述氨基酸序列中，选自由影响PPO抑制性除草剂与PPO多肽SEQID NO：5(CyPPO8)之间相互作用的氨基酸(例如位于SEQ ID NO：5的多肽与PPO抑制性除草剂的结合位点上的氨基酸)组成的组中的一种或多种分别独立地缺失或被与原始氨基酸不同的其它氨基酸取代，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

缺失或被与原始氨基酸不同的其他氨基酸取代的SEQ ID NO：5的多肽的氨基酸残基(例如，选自由位于SEQ ID NO：5的多肽与PPO抑制性除草剂的结合位点上的氨基酸组成的组中的一种或多种)可以是选自由SEQ ID NO：5的氨基酸序列中的P84、R85、F156、V160、A162、Q179、P306、V308、F327、L330、I343、N362和F363组成的组中的一种或多种。

在一种具体实施方式中，多肽变体可包含、基本上由以下组成或由以下组成：

以下氨基酸序列，所述氨基酸序列中，选自由SEQ ID NO：5的氨基酸序列中的P84、R85、F156、V160、A162、Q179、P306、V308、F327、L330、I343、N362和F363组成的组中的一种或多种分别独立地缺失或被选自由M(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)、S(Ser)、F(Phe)、P(Pro)、W(Trp)、N(Asn)、Q(Gln)、G(Gly)、Y(Tyr)、D(Asp)、E(Glu)、R(Arg)、H(His)、K(Lys)等组成的组且与野生型相应位置上的氨基酸不同的氨基酸取代(例如，被选自由M(Met)、V(Val)、I(Ile)、T(Thr)、L(Leu)、C(Cys)、A(Ala)、S(Ser)、H(His)、G(Gly)等组成的组且与野生型相应位置上的氨基酸不同的氨基酸取代)，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

例如，多肽变体可包含、基本上由以下组成或由以下组成：

以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO：5的氨基酸序列中的P84L、R85A、R85C、R85H、R85L、R85T、R85V、F363M、F363V、F363L、F363C、F363I、F363T、A162C、A162L、P306L、P306A、V308L、V308M、N362S、V160S、V160C、I343V、I343T、F156A、Q179G、F327V和L330T组成的组中的一种或多种氨基酸突变，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

更具体地，多肽变体可包含、基本上由以下组成或由以下组成：

以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO：5的氨基酸序列中的P84L、R85A、R85C、R85H、R85L、R85T、R85V、F363M、F363V、F363L、F363C、F363I、F363T、A162C、A162L、P306L、P306A、V308L、V308M、N362S、V160S、V160C、I343V、I343T、F156A、Q179G、F327V、L330T、P84L+F363M、R85A+F363M、R85A+F363I、R85C+F363M、R85H+F363M、R85L+F363M、R85T+F363M、R85V+F363M、R85A+A162L+F363M、R85A+A162L+F363I、R85A+A162C+F363M、R85A+A162C+F363I、R85A+V308M+F363M、V160S+F363M、V160S+F363I、V160S+V308M+F363I、A162L+F363M、A162C+F363M、A162C+F363I、A162C+F363L、A162C+V308M+F363M、A162C+V308L+F363M、A162L+Q179G+F363M、P306A+V308L、P306L+V308L、V308M+F363M、V308M+F363I、I343T+F363M、I343V+F363M和N362S+F363M的氨基酸突变组成的组中的一种或多种，或

与所述氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列。

包含具有本文所描述的序列同源性(例如95％或更高、98％或更高、或99％或更高的序列同源性)的氨基酸序列、基本由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成的多肽变体可保持与具有作为序列同源性鉴定标准的氨基酸序列的多肽(例如，具有上述氨基酸突变的PPO蛋白)等价的酶活性，例如，与植物中(整株植物中、植物细胞或细胞培养物中、植物组织中等)、藻类中、和/或体外的具有作为标准的氨基酸序列的多肽相比，所述多肽变体具有5％或更高、10％或更高、20％或更高、30％或更高、40％或高于、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、或95％或更高的酶活性，并且具有赋予除草剂耐受性的功能。使用序列同源性的描述是为了阐明本文所描述的除草剂耐受性PPO蛋白变体或多肽变体可包含满足上述条件范围内的所有序列突变(维持酶活性，并具有赋予除草剂耐受性的功能)。

说明书中使用的氨基酸名称排列如下：

多肽变体(除草剂耐受性PPO蛋白变体)可以维持PPO蛋白的酶活性，并且与野生型相比表现出增强的除草剂耐受性。

此外，除草剂耐受性PPO蛋白变体可以包含对由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5或具有上述氨基酸突变的氨基酸序列组成的多肽表现出生物学上相同活性的进一步突变。例如，另外的突变可以是氨基酸取代，其不会总体改变分子活性，并且这种氨基酸取代在本领域是公知的。在一种实例中，额外的取代可以是氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu或Asp/Gly的取代，但不限于此。在一些情况下，除草剂耐受性PPO蛋白变体可以具有通过选自由磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化等组成的组中的一种或多种而进行的修饰。此外，除草剂耐受性PPO蛋白变体可包含蛋白变体，其中蛋白对热、pH等的结构稳定性或蛋白活性通过氨基酸变异(突变)和/或修饰而增加。

术语“序列同源性”是指与野生型或参比氨基酸序列或核苷酸序列的相似程度，并且任何蛋白可包括在本发明的范围内，只要其包含与除草剂耐受性PPO蛋白的氨基酸序列具有60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、或99％或更高同一性的氨基酸残基并且保持与除草剂耐受性PPO蛋白变体等价的生物学活性即可。这些蛋白同源物可包含与靶蛋白等价的活性位点。通过眼可以进行这种同源性比较或借助于容易获得的比较程序进行这种同源性比较。商业上可获得的的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的百分比(％)同源性，并且可以在连续序列中计算同源性(％)。用于比较的序列比对可以通过本领域已知的方法进行，例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。

除草剂耐受性PPO蛋白或其变体可以通过本领域熟知的方法通过从自然界中提取并纯化而获得。另外，它可以使用基因重组技术作为重组蛋白而获得。在使用基因重组技术的情况下，重组蛋白可以通过以下方法获得：将编码除草剂耐受性PPO蛋白或其变体的核酸导入适当的表达载体，并用该载体转化宿主细胞以表达靶蛋白，然后从宿主细胞收集除草剂耐受性PPO蛋白或其变体。蛋白在选定的宿主细胞中表达后，可以使用一般的生化分离技术来对其分离和纯化，例如用蛋白沉淀剂处理(盐析)、离心、超声破碎、超滤、透析、色谱(例如分子筛色谱(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱)等，并且为了以高纯度分离蛋白，这些方法可以组合使用。

可以使用标准分子生物学技术(例如化学合成或重组方法)分离或制备除草剂耐受性PPO核酸分子(编码PPO蛋白或其变体的多核苷酸)，或者可以使用商业上可获得的技术。

在一种具体实施方式中，在使用PPO缺陷型大肠杆菌(E.coli)BT3(ΔPPO)的除草剂耐受性测试系统中，发现PPO蛋白对根据化学结构分类的代表性的9个家族的PPO抑制性除草剂表现出广泛的除草剂耐受性。还发现蛋白可以通过农杆菌介导的转化在烟叶中表达，并且它们也可以通过使用转运肽(TP)在植物的叶绿体中表达。进一步地，发现PPO蛋白也可以通过植物表达载体在拟南芥哥伦比亚生态型-0(Arabidopsis thaliana ecotypeColumbia-0，A.thaliana)中表达。即使用PPO抑制性除草剂处理转化的植物，也观察到植物的萌发和生长。此外，通过遗传研究证实了上述除草剂耐受性的性状对下一代的遗传。

因此，可将本文提供的PPO蛋白及其变体导入植物或藻类中，从而用于增强植物或藻类的除草剂耐受性。

一种实施方式提供了赋予和/或增强植物和/或藻类的除草剂耐受性的组合物，包含选自由以下组成的组中的一种或多种：

(1)多肽，其包含、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5，或与所述多肽的氨基酸序列具有95％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的氨基酸序列；

(2)上述多肽变体；

(3)编码多肽(1)或多肽变体(2)的多核苷酸；

(4)包含该多核苷酸的重组载体；以及

(5)包含该重组载体的重组细胞。

本文的除草剂是指杀死、控制或以其他方式不利地改变植物或藻类生长的活性成分。此外，除草剂耐受性或除草剂耐受性是指，与正常植物或野生型植物相比，甚至在用通常杀死正常或野生型植物或通常抑制其生长的除草剂处理后，植物生长的抑制也会减弱或消除，因此植物继续生长。除草剂包括抑制植物或藻类的原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂。根据它们的化学结构，这种PPO抑制性除草剂可分为嘧啶二酮类、二苯基醚类、苯基吡唑类、N-苯基邻苯二甲酰亚胺类、噻二唑类、

二唑类、三唑啉酮类、

唑烷二酮类和其它除草剂。

作为具体实施方式，嘧啶二酮类除草剂包括氟丙嘧草酯、苯嘧磺草胺、双苯嘧草酮和汰芬那，但不限于此。

二苯基醚类除草剂包括氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、苯草醚、三氟羧草醚、治草醚、氯乳醚、乳氟禾草灵、甲氧除草醚、氯除草醚(chlorintrofen)、乙羧氟草醚和氟硝磺酰胺，但不限于此。

苯基吡唑类除草剂包括氟唑草酯和异丙吡草酯，但不限于此。

苯基邻苯二甲酰亚胺类除草剂包括丙炔氟草胺、吲哚酮草酯和氟烯草酸，但不限于此。

苯基酯类除草剂包括吡落草(2，4-二氯苯基1-吡咯烷羧酸盐)和吡落草的氨基甲酸酯类似物(例如，O-苯基吡咯烷基-和哌啶子基氨基甲酸酯类似物(参考“UjjanaB.Nandihalli、Mary V.Duke、Stephen O.Duke，O-苯基吡咯烷基-和哌啶子基氨基甲酸酯除草剂的分子性质与生物活性之间的关系(Relationships between molecular propertiesand biological activities of O-phenyl pyrrolidino-and piperidinocarbamateherbicides.)，J.Agric.Food Chem.，1992，40(10)1993-2000”))，但不限于此。在一种实施方式中，吡落草的氨基甲酸酯类似物可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：吡咯烷-1-羧酸苯酯(CAS号55379-71-0)、1-吡咯烷羧酸、2-氯苯酯(CAS号143121-06-6)、4-氯苯基吡咯烷-1-羧酸酯(CAS号1759-02-0)、氨基甲酸、二乙基-、2，4-二氯-5-(2-丙炔氧基)苯基酯(9CI)(CAS号143121-07-7)、1-吡咯烷羧酸、2，4-二氯-5-羟基苯基酯(CAS号143121-08-8)、2，4-二氯-5-(甲氧基羰基)苯基吡咯烷-1-羧酸酯(CAS号133636-94-9)、2，4-二氯-5-[(丙-2-基氧基)羰基]苯基吡咯烷-1-羧酸酯(CAS号133636-96-1)、1-哌啶羧酸、2，4-二氯-5-(2-丙炔氧基)苯酯(CAS号87374-78-5)、2，4-二氯-5-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基吡咯烷-1-羧酸酯(CAS号87365-63-7)、2，4-二氯-5-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基4，4-二氟哌啶-1-羧酸酯(CAS号138926-22-4)、1-吡咯烷羧酸、3，3-二氟-、2，4-二氯-5-(2-丙炔-1-基氧基)苯基酯(CAS号143121-10-2)、4-氯-2-氟-5-[(丙-2-基氧基)羰基]苯基吡咯烷-1-羧酸酯(CAS号133636-98-3)等。

噻二唑类除草剂包括嗪草酸和噻二唑草胺，但不限于此。

二唑类除草剂包括丙炔

草酮和

草酮，但不限于此。

三唑啉酮类除草剂包括唑酮草酯、甲磺草胺和唑啶草酮，但不限于此。

唑烷二酮类除草剂包括环戊

草酮，但不限于此。

其他除草剂包括双唑草腈、氟哒嗪草酯和氟唑草胺，但不限于此。

可以通过本领域已知的各种方法，优选地，通过使用用于植物或藻类转化的表达载体，将本文提供的除草剂耐受性PPO基因导入植物或藻类中。

在植物转化的情况下，可以包含在载体中的合适的启动子可以是本领域通常用于将基因导入植物的任何启动子。例如，启动子可包括SP6启动子、T7启动子、T3启动子、PM启动子、玉米泛素启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、丽春碱合酶(nos)启动子、玄参花叶病毒35S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草属黄斑驳病毒启动子、来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRuBISCO)的光诱导型启动子、水稻细胞溶质磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子、拟南芥的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)启动子、章鱼碱合酶启动子和BCB(蓝铜结合蛋白)启动子，但不限于此。

进一步地，载体可以包括引起3′-末端多聚腺苷酸化的poly A信号序列，例如，它可以包括来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的丽春碱合酶基因的NOS 3′-端、来自根癌农杆菌的章鱼碱合酶的章鱼碱合酶终止子、番茄或马铃薯的蛋白酶抑制剂I或II基因的3′-端、CaMV 35S终止子、水稻α淀粉酶终止子RAmy1 A和菜豆碱终止子，但并不限于此。

另外，叶绿体特异性启动子，核启动子，组成型启动子或诱导型启动子可作为启动子用于将基因导入藻类中。可以设计本文提供的除草剂耐受性PPO基因或其变体，以便可操作地连接到5′UTR或3′UTR，从而在藻类的细胞核中表达功能。此外，载体可以进一步包含适合于藻类转化的转录调控序列。可以将赋予除草剂耐受性的重组基因整合到宿主藻类的叶绿体的基因组或细胞核的基因组中，但不限于此。

另外，在载体中，靶向于叶绿体所需的转运肽可以与PPO基因的5′-端连接，以便在叶绿体中表达除草剂耐受性PPO基因。

此外，任选地，载体可以进一步包括作为报告分子的编码选择标记的基因，该选择标记的实例可以包括抗生素(例如，新霉素、羧苄青霉素、卡那霉素、壮观霉素、潮霉素、博来霉素、氯霉素、氨苄青霉素等)或除草剂(草甘膦、草铵膦、草丁膦等)耐受基因，但不限于此。

进一步地，用于植物表达的重组载体可以包括农杆菌二元载体、共整合载体或不具有T-DNA区域但设计为在植物中表达的一般载体。其中，二元载体是指含有两种独立的载体系统的载体，该两种独立的载体系统含有负责迁移的一种质粒，所述质粒由Ti(肿瘤诱导型)质粒中的左边界(LB)和右边界(RB)组成，另一种质粒用于靶基因-转移，该载体可包括用于在植物中表达的启动子区和多腺苷酸化信号序列。

当使用二元载体或共整合载体时，用于将重组载体转化到植物中的菌株优选是农杆菌(农杆菌介导的转化)。在这方面，可以使用根癌农杆菌或毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。另外，当使用不具有T-DNA区域的载体时，可以使用电穿孔、粒子轰击、聚乙二醇介导的摄取等将重组质粒导入植物中。

通过上述方法用基因转化的植物可以使用本领域已知的标准技术通过愈伤组织诱导、根茎生长和土壤适应性再分化成植物。

本文中经历转化的植物通过包括植物细胞(含有悬浮培养的细胞)、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、枝条以及成熟植物的含义来理解。

此外，转化体的范围包括导入基因的转化体以及其克隆或后代(T₁代、T₂代、T₃代、T₄代、T₅代或任何后代)。例如，转化的植物还包括作为用本文提供的基因转化的植物的有性和无性后代的具有遗传的除草剂耐受性性状的植物。本发明的范围还包括显示初始转化的植物的特征的所有突变体和变体，以及用本文提供的基因转化的植物的所有杂交和融合产物。此外，本发明的范围还包括植物的一部分，例如种子、花、茎、果实、叶、根、块茎和/或块根，该部分来源于通过本发明的方法预先转化的转化植物或其后代，以及由至少一部分转化细胞组成。

施用本发明的植物不特别限于，但可以是选自由单子叶植物或双子叶植物组成的组中的至少一种。此外，该植物包括草本植物或木本植物。单子叶植物可包括属于如下科的植物：泽泻科(Alismataceae)、水鳖科(Hydrocharitaceae)、水麦冬科(Juncaginaceae)、芝菜科(Scheuchzeriaceae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)、茨藻科(Najadaceae)、大叶藻科(Zosteraceae)、百合科(Liliaceae)、血皮草科(Haemodoraceae)、龙舌兰科(Agavaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、雨久花科(Pontederiaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、水玉簪科(Burmanniaceae)、灯芯草科(Juncaceae)、鸭跖草科(Commelinaceae)、谷精草科(Eriocaulaceae)、禾本科(Gramineae/Poaceae)、天南星科(Araceae)、浮萍科(Lemnaceae)、黑三棱科(Sparganiaceae)、香蒲科(Typhaceae)、莎草科(Cyperaceae)、芭蕉科(Musaceae)、姜科(Zingiberaceae)、美人蕉科(Cannaceae)、兰科(Orchidaceae)，但不限于此。

双子叶植物可包括属于如下科的植物：岩梅科(Diapensiaceae)、山柳科(Clethraceae)、鹿蹄草科(Pyrolaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、紫金牛科(Myrsinaceae)、报春花科(Primulaceae)、蓝雪科(Plumbaginaceae)、柿树科(Ebenaceae)、安息香科(Styracaceae)、山矾科(Symplocaceae)、木犀科(Oleaceae)、马钱科(Loganiaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、睡菜科(Menyanthaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、萝藦科(Asclepiadaceae)、茜草科(Rubiaceae)、花荵科(Polemoniaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、马鞭草(Verbenaceae)、唇形科(Labiatae)、茄科(Solanaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、紫葳科(Bignoniaceae)、爵床科(Acanthaceae)、胡麻科(Pedaliaceae)、列当科(Orobanchaceae)、苦苣苔科(Gesneriaceae)、狸藻科(Lentibulariaceae)、透骨草科(Phrymaceae)、车前科(Plantaginaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、五福花科(Adoxaceae)、败酱科(Valerianaceae)、川续断科(Dipsacaceae)、桔梗科(Campanulaceae)、菊科(Compositae)、杨梅科(Myricaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、杨柳科(Salicaceae)、桦科(Betulaceae)、壳斗科(Fagaceae)、榆科(Ulmaceae)、桑科(Moraceae)、荨麻科(Urticaceae)、檀香科(Santalaceae)、桑寄生科(Loranthaceae)、蓼科(Polygonaceae)、商陆科(Phytolaccaceae)、紫茉莉科(Nyctaginaceae)、番杏科(Aizoaceae)、马齿苋科(Portulacaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜亚科(Chenopodiaceae)、苋科(Amaranthaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、八角茴香科(Illiciaceae)、樟科(Lauraceae)、连香树科(Cercidiphyllaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、小檗科(Berberidaceae)、木通科(Lardizabalaceae)、防己科(Menispermaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、金鱼藻科(Ceratophyllaceae)、莼菜科(Cabombaceae)、三白草科(Saururaceae)、胡椒科(Piperaceae)、金粟兰科(Chloranthaceae)、马兜铃科(Aristolochiaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、山茶科(Theaceae)、藤黄科(Guttiferae)、茅膏菜(Droseraceae)、罂粟科(Papaveraceae)、白花菜科(Capparidaceae)、十字花科(Cruciferae)、悬铃木科(Platanaceae)、金缕梅科(Hamamelidaceae)、景天科(Crassulaceae)、虎耳草科(Saxiffagaceae)、杜仲科(Eucommiaceae)、海桐花科(Pittosporaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、豆科(Leguminosae)、酢浆草科(Oxalidaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、旱金莲科(Tropaeolaceae)、蒺藜科(Zygophyllaceae)、亚麻科(Linaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、水马齿科(Callitrichaceae)、芸香科(Rutaceae)、苦木科(Simaroubaceae)、楝科(Meliaceae)、远志科(Polygalaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、槭树科(Aceraceae)、无患子科(Sapindaceae)、七叶树科(Hippocastanaceae)、清风藤科(Sabiaceae)、凤仙花科(Balsaminaceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、卫矛科(Celastraceae)、省沽油科(Staphyleaceae)、黄杨科(Buxaceae)、岩高兰科(Empetraceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae)、杜英科(Elaeocarpaceae)、椴树(Tiliaceae)、锦葵科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、瑞香科(Thymelaeaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、大风子科(Flacourtiaceae)、堇菜科(Violaceae)、西番莲科(Passifloraceae)、柽柳科(Tamaricaceae)、沟繁缕科(Elatinaceae)、秋海棠科(Begoniaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、千屈菜科(Lythraceae)、石榴科(Punicaceae)、柳叶菜科(Onaraceae)、小二仙草科(Haloragaceae)、八角枫科(Alangiaceae)、山茱萸科(Cornaceae)、五加科(Araliaceae)和伞形科(Umbelliferae/Apiaceae)，但不限于此。

在一种具体实施方式中，植物可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：粮食作物，例如水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、红豆、燕麦和高粱；蔬菜作物，例如大白菜、萝卜、红辣椒、草莓、番茄、西瓜、黄瓜、卷心菜、薄皮甜瓜、南瓜、威尔士负离子(welshanion)、负离子(anion)和胡萝卜；特殊用途作物，例如人参、烟草、棉花、青饲料(soilage)、草料(forage)、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏属(Perilla sp.)、花生、油菜籽、草和蓖麻油植物；果树，例如苹果树、梨树、枣树、桃树、猕猴桃果树、葡萄树、柑橘果树、柿子树、李子树、杏树和香蕉树；木本植物，例如松树、棕榈油和桉树；开花作物，例如玫瑰、唐菖蒲、非洲菊、康乃馨、菊花、百合和郁金香；饲料作物，例如黑麦草、红三叶草、果树草、苜蓿、高羊茅和多年生黑麦草，但不限于此。作为具体实施方式，植物可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：双子叶植物，例如拟南芥属、马铃薯、茄子、烟草、红辣椒、番茄、牛蒡、茼蒿、莴苣、桔梗花、菠菜、甜菜、红薯、芹菜、胡萝卜、水芹、欧芹、大白菜、卷心菜、萝卜、西瓜、薄皮甜瓜、黄瓜、南瓜、葫芦、草莓、大豆、绿豆、芸豆和豌豆；以及单子叶植物，例如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等、但不限于此。

施用本发明的藻类不特别限于，但包括原核藻类或真核藻类。例如，藻类可以是蓝细菌、绿藻、红藻、褐藻，大型藻类或微型藻类。

蓝细菌包括：色球藻门(Chroococcales phylum)(例如，隐球藻属(Aphanocapsa)、隐杆藻属(Aphanothece)、管孢藻属(Chamaesiphon)、骨囊藻属(Chondrocystis)、色球藻属(Chroococcus)、色粘囊藻属(Chroogloeocystis)、鳄球藻属(Crocosphaera)、藻青菌属(Cyanobacterium)、蓝菌属(Cyanobium)、蓝网藻属(Cyanodictyon)、蓝八联藻属(Cyanosarcina)、蓝杆藻属(Cyanothece)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、粘球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)、盐杆藻属(Halothece)、拟丝藻属属(Johannesbaptistia)、平裂藻属(Merismopedia)、微囊藻属(Microcystis)、放射囊藻属(Radiocystis)、棒条藻属(Rhabdoderma)、小雪藻属(Snowella)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)、乌龙藻属(Woronichinia))，粘菌藻门(Gloeobacteria phylum)、念珠藻门(Nostocalesphylum)(例如，微毛藻科(Microchaetaceae)、念珠藻科(Nostocaceae)、胶须藻科(Rivulariaceae)、伪枝藻科(Scytonemataceae))、颤藻门(Oscillatoriales phylum)(例如，节藻属(Arthronema)、节旋藻属(Arthrospira)、布棱藻属(Blennothrix)、发毛针藻属(Crinalium)、盖丝藻属(Geitlerinema)、盐微藻(Halomicronema)、盐螺旋藻属(Halospirulina)、水鞘藻属(Hydrocoleum)、贾丝藻属(Jaaginema)、假膜藻(Katagnymene)、柯孟藻(Komvophoron)、细鞘丝藻属(Leptolyngbya)、湖丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属(Lyngbya)、微鞘藻属(Microcoleus)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、拟浮丝藻属(Planktothricoides)、浮丝藻属(Planktothrix)、织线藻属(Plectonema)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、假席藻属(Pseudophormidium)、裂须藻属(Schizothrix)、螺旋藻属(Spirulina)、斯特藻属(Starria)、束藻属(Symploca)、束毛藻属(Trichodesmium)、常丝藻属(Tychonema))，宽球藻门(Pleurocapsales phylum)(例如，拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、皮果藻属(Dermocarpa)、小皮果藻属(Dermocarpella)、粘囊藻属(Myxosarcina)、厚皮藻属(Pleurocapsa)、索伦藻属(Solentia)、立毛藻属(Stanieria)、异球藻属(Xenococcus))、原绿藻门(Prochlorales phylum)或真枝藻门(Stigonematales phylum)(例如，蒴链藻属(Capsosira)、拟绿粘藻属(Chlorogloeopsis)、侧生藻属(Fischerella)、软管藻属(Hapalosiphon)、拟鞭枝藻属(Mastigocladopsis)、鞭枝藻属(Mastigocladus)、拟念珠藻属(Nostochopsis)、真枝藻属(Stigonema)、聚线藻属(Symphyonema)、拟聚线藻属(Symphonemopsis)、梅崎藻属(Umezakia)、拟惠氏藻属(Westiellopsis))等。

作为藻类的另一个实例，可以例示绿藻门(Chlorophyta)、衣藻属(Chlamydomonas)、团藻目(Volvacales)、杜氏藻属(Dunaliella)、栅藻属(Scenedesmus)、小球藻属(Chlorella)或红球藻属(Hematococcm)。

作为藻类的其他实例，可以例示三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、透明茧形藻(Amphiprora hyaline)、双眉藻属(Amphora spp.)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、腐生舟形藻(Navicula saprophila)、普通菱形藻(Nitzschia communis)、二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、瑞典四爿藻(Tetraselmis suecica)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)、细长聚球藻(Synechococcus elongatus)、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、紫色粘菌藻(Gloeobacter violaceus)、集胞藻属(Synechocystis)、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)、眼点微拟球藻(Nannochloropsis oculata)、盐微拟球藻(Nannochloropsis salina)、海洋富油微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、苏德台葡萄藻(Botryococcus sudeticus)、纤细眼虫藻(Euglena gracilis)、富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)、谷皮菱形藻(Nitzschia palea)、卡特颗石藻(Pleurochrysis carterae)、朱氏四爿藻(Tetraselmis chuii)、巴夫藻属(Pavlova spp.)、隐球藻属(Aphanocapsaspp.)、集胞藻属(Synechosystis spp.)、微绿藻属(Nannochloris spp.)等。然而，不仅限于上面列出的种类，可以包括属于其他不同的属和科的藻类。

导入本文提供的除草剂耐受性PPO或其变体的植物或藻类可表现出对两种或更多种PPO抑制性除草剂的耐受性。

因此，通过依次或同时使用两种或更多种抑制PPO的除草剂，本文提供的技术可用于控制杂草或除去不希望的水生生物。

一种实施方式提供了一种控制农田中杂草的方法，包括向农田提供包含上述除草剂耐受性PPO蛋白、其变体或其编码基因的植物的步骤，以及将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于农田的步骤。

另一种实施方式提供了从培养基中除去不希望的水生生物的方法，包括向培养基提供包含上述除草剂耐受性PPO蛋白、其变体或其编码基因的藻类的步骤，以及将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于培养基的步骤。

此外，本文提供的除草剂耐受性PPO蛋白、其变体或其编码基因可以与第二除草剂耐受性多肽或其编码基因组合使用。

因此，导入本文提供的除草剂耐受性PPO的植物或藻类可以表现出对作用机理上彼此不同的两种或更多种除草剂的耐受性。在本发明中，可以依次或同时使用作用机理上彼此不同的两种或更多种不同的除草剂(包括PPO抑制性除草剂)，从而控制杂草和/或除去不希望的水生生物。在下文中，作用机理上与PPO抑制性除草剂不同的除草剂被称为“第二除草剂”。

一种实施方式提供了用于赋予或增强植物或藻类的除草剂耐受性的组合物，其包含上述除草剂耐受性PPO蛋白、其变体或其编码基因；和第二除草剂耐受性多肽或其编码基因。

另一种实施方式提供了植物或藻类的具有除草剂耐受性的转化体、其克隆或后代，所述转化体、其克隆或后代包含上述的除草剂耐受性PPO蛋白、其变体或其编码基因；和第二除草剂耐受性多肽或其编码基因。

其他实施方式提供了制备具有除草剂耐受性的植物或藻类的方法，所述方法包括用以下转化藻类，或植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、枝条或整株植物的步骤：上述除草剂耐受性PPO蛋白、其变体或其编码基因；和第二除草剂耐受性多肽或其编码基因。

其它实施方式提供了一种控制农田中杂草的方法，包括：向农田提供植物的步骤，所述植物包含上述除草剂耐受性PPO蛋白、其变体或其编码基因；第二除草剂耐受性多肽或其编码基因；以及将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于农田的步骤。

其他实施方式提供了从培养基中除去不希望的水生生物的方法，包括：向培养基提供藻类的步骤，所述藻类包含除草剂耐受性PPO蛋白、其变体或其编码基因；第二除草剂耐受性多肽或其编码基因；以及将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于培养基的步骤。

例如，植物或藻类还包括第二除草剂耐受性多肽或其编码基因，从而对第二除草剂具有新的和/或增强的耐受性。

例如，第二除草剂可包括细胞分裂抑制性除草剂、光合作用抑制性除草剂、氨基酸合成抑制性除草剂、质体抑制性除草剂、细胞膜抑制性除草剂和/或其任何组合，但不限于此。第二除草剂可以例示为草甘膦、草铵膦、麦草畏、2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)、ALS(乙酰乳酸合酶)抑制性除草剂(例如，咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶、磺苯胺、嘧啶硫代苯甲酸等)，光系统II抑制性除草剂、苯脲基除草剂、质体抑制性除草剂，溴苯腈基除草剂，和/或其任意组合，但不限于此。

例如，第二除草剂耐受性多肽可以例示为选自由以下组成的组中的一种或多种：草甘膦除草剂耐受性EPSPS(草甘膦耐受性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)、GOX(草甘膦氧化酶)、GAT(草甘膦-N-乙酰转移酶)或草甘膦脱羧酶；草铵膦除草剂耐受性PAT(草丁膦-N-乙酰转移酶)；麦草畏除草剂耐受性DMO(麦草畏单加氧酶)；2，4-D除草剂耐受性2，4-D单加氧酶或AAD(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)；ALS抑制性磺酰脲基除草剂耐受性ALS(乙酰乳酸合酶)、AHAS(乙酰羟酸合酶)或AtAHASL(乙酰羟酸合酶大亚基)；光系统II抑制性除草剂耐受性光系统II蛋白D1；苯脲基除草剂耐受性细胞色素P450；质体抑制性除草剂耐受性HPPD(羟基苯丙酮酸双加氧酶)；溴苯腈除草剂耐受性腈水解酶；及其组合，但不限于此。

进一步地，第二除草剂耐受性多肽的编码基因可以例示为选自由以下组成的组中的一种或多种：草甘膦除草剂耐受性cp4epsps、epsps(AG)、mepsps、2mepsps、goxv247、gat4601或gat4621基因；草铵膦除草剂耐受性bar、pat或pat(SYN)基因；麦草畏除草剂耐受性dmo基因；2，4-D除草剂耐受性AAD-1或AAD-12基因；ALS抑制性磺酰脲基除草剂耐受性ALS、GM-HRA、S4-HRA、ZM-HRA、Csr1、Csr1-1、Csr1-2、SurA或SurB；光系统II抑制性除草剂耐受性psbA基因；苯脲除草剂耐受性CYP76B1基因；异

唑草酮除草剂耐受性HPPDPF W336基因；溴苯腈除草剂耐受性bxn基因；及其组合，但不限于此。

有益效果

将本文提供的除草剂耐受性PPO蛋白的变体或其编码基因施用于植物或藻类，从而赋予和/或增强更优异的除草剂耐受性性状，并且使用除草剂进行选择性控制，从而经济地控制杂草或去除水生生物。

附图说明

图1是示出了用pACBB空载体(由V表示)、拟南芥PPO1基因(由WT表示)、CyPPO2野生型基因(由Cy2表示)、CyPPO4野生型基因(由Cy4表示)或CyPPO8野生型基因(由Cy8表示)转化PPO缺陷型BT3大肠杆菌(BT3(ΔPPO))之后，用浓度为0μM(微摩尔)、25μM、50μM、100μM或400μM的汰芬那处理后的细胞生长水平的照片。

图2是pET29b载体的图谱。

图3是pACBB-eGFP载体的图谱。

图4是pET303-CT-His载体的图谱。

图5是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的汰芬那处理时，用CyPPO2野生型基因(由Cy2表示)或各种CyPPO2突变基因转化的PPO缺陷型BT3大肠杆菌(BT3(ΔPPO))转化体的细胞生长水平的照片。

图6是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的苯嘧磺草胺处理时，用Cy2 WT或各种CyPPO2突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图7是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的丙炔氟草胺处理时，用Cy2 WT或各种CyPPO2突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图8是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的氟磺胺草醚处理时，用Cy2 WT或各种CyPPO2突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图9是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的三氟羧草醚处理时，用Cy2 WT或各种CyPPO2突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图10是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的双唑草腈处理时，用Cy2 WT或各种CyPPO2突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图11是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的甲磺草胺处理时，用Cy2 WT或各种CyPPO2突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图12是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的环戊

草酮处理时，用Cy2 WT或各种CyPPO2突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图13是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的氟唑草酯处理时，用Cy2 WT或各种CyPPO2突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图14是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的汰芬那处理时，用CyPPO4野生型基因(由Cy4 WT表示)或各种CyPPO4突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图15是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、100μM和200μM的苯嘧磺草胺处理时，用Cy4 WT或各种CyPPO4突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图16是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、100μM和200μM的丙炔氟草胺处理时，用Cy4 WT或各种CyPPO4突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图17是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM、200μM和400μM的汰芬那处理时，用CyPPO8野生型基因(由Cy8 WT表示)或各种CyPPO8突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片，其中上图是通过使用pET303-CT-His载体获得的结果，下图是通过使用pACBB载体获得的结果。

图18是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的苯嘧磺草胺处理时，用Cy8 WT或各种CyPPO8突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图19是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的氟磺胺草醚处理时，用Cy8 WT或各种CyPPO8突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图20是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的三氟羧草醚处理时，用Cy8 WT或各种CyPPO8突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图21是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的丙炔氟草胺处理时，用Cy8 WT或各种CyPPO8突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图22是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的甲磺草胺处理时，用Cy8 WT或各种CyPPO8突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图23是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的环戊

草酮处理时，用Cy8 WT或各种CyPPO8突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图24是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的氟唑草酯处理时，用Cy8 WT或各种CyPPO8突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图25是示出了在用浓度分别为0μM、5μM、25μM、50μM、100μM和200μM的双唑草腈处理时，用Cy8 WT或各种CyPPO8突变基因转化的BT3(ΔPPO)转化体的细胞生长水平的照片。

图26是示出了用于制备融合蛋白的重组载体的示意图，其中融合了MBP(麦芽糖结合蛋白)和PPO蛋白。

图27是pMAL-c2X载体的图谱。

图28示出了分离和纯化CyPPO2野生型蛋白和CyPPO2-Y373M变体蛋白的SDS-PAGE的结果。

图29示出了分离和纯化CyPPO4野生型蛋白和CyPPO4-Y375M变体蛋白的SDS-PAGE的结果。

图30示出了分离和纯化CyPPO8野生型蛋白和CyPPO8-F363M变体蛋白的SDS-PAGE的结果。

图31是示例性示出了用于CyPPO基因的植物转化的二元载体的结构的示意图。

图32示出了当在包含各种浓度的汰芬那的培养基中使种子萌发时，导入CyPPO2、CyPPO4或CyPPO8的突变基因的拟南芥(T₂)转化体的种子萌发水平。Col-O表示非转基因拟南芥。

图33示出了蛋白印迹结果，该结果示出了用CyPPO2、CyPPO4或CyPPO8的突变基因转染的拟南芥(T₂)中的CyPPO变体蛋白的表达水平。Col-0表示非转基因拟南芥。

图34示出了在向转化的拟南芥(T₃)喷洒5μM汰芬那后7天观察到的结果，在所述转化的拟南芥中导入了编码CyPPO2 Y373M变体或CyPPO8 F363M变体的基因。Col-O表示非转基因拟南芥。

图35示出了在向转化的拟南芥(T₃)喷洒5μM苯嘧磺草胺后7天观察到的结果，在所述转化的拟南芥中导入了编码CyPPO2 Y373M变体、CyPPO4Y375M变体或CyPPO8 F363M变体的基因。Col-O表示非转基因拟南芥。

图36示出了在向转化的拟南芥(T₃)喷洒5μM氟磺胺草醚后7天观察到的结果，在所述转化的拟南芥中导入编码CyPPO2 Y373M变体或CyPPO8F363M变体的基因。Col-O表示非转基因拟南芥。

图37示出了向转化的拟南芥(T₃或T₂)喷洒25μM或5μM的汰芬那或75μM的苯嘧磺草胺后7天观察到的结果，在所述转化的拟南芥中分别导入了编码CyPPO2的Y373I、Y373L、Y373V、Y373C、Y373M、V318M+YBL3I、V173S+A175C+Y373M或A175C+V318M+Y373M变体的基因。

图38示出了在向转化的拟南芥(T₃或T₂)喷洒25μM或10μM的汰芬那或100μM浓度的苯嘧磺草胺后7天观察到的结果，在所述转化的拟南芥中导入了编码CyPPO8的F363V、F363L、A162L或A162C+V308M+F363M变体的基因。

图39是pCAMBIA3301载体的图谱。

图40示出了在向野生型东津(Dongjin)水稻和用CyPPO2 Y373M突变基因或CyPP08F363M突变基因转化的东津水稻转化体T₀代喷洒PPO抑制性除草剂后7天观察到的结果，其中A是853g ai/ha汰芬那处理后的图像，B是2,087g ai/ha苯嘧磺草胺处理后的图像。

图41示出了在向东津水稻的CyPPO2 Y373M T₂转化体品系3号和CyPPO8 F363M T₂转化体品系3号喷洒PPO抑制性除草剂后7天观察到的结果，其中A是420g ai/ha汰芬那处理后的图像，B是840g ai/ha苯嘧磺草胺处理后的图像(1：嫩叶→4：老叶)。东津是指非转基因水稻(栽培品种)。

图42是示出了东津水稻的CyPPO2 Y373M转化体的叶片中CyPPO2 Y373M变体蛋白的表达的蛋白印迹结果。

图43是示出了东津水稻的CyPPO8 F363M转化体的叶片中CyPPO8 F363M变体蛋白的表达的蛋白印迹结果。

图44是检测东京水稻的CyPPO8 F363M转化体中是否存在CyPPO8 F363M的DNA印迹结果。

图45是示出了分别导入CyPPO2的Y373I和CyPPO8突变基因的F363V的拟南芥转化体(T₃)对各种除草剂的耐受水平的照片。

图46是示出了分别导入CyPPO2的Y373I和CyPPO8突变基因的F363V的拟南芥转化体T₄代的除草剂耐受水平的照片。

图47是示出了拟南芥的导入CyPPO2 Y373I的转化体和导入CyPPO8 F363V的转化体的T₅代的除草剂耐受水平的照片。

图48是示出了拟南芥的导入CyPPO2 Y373I的转化体和导入CyPPO8F363V的转化体的T₄代的PPO蛋白表达的蛋白印迹结果。

图49是示出了拟南芥的导入CyPPO2 Y373I的转化体和导入CyPPO8F363V的转化体的T₅代的PPO蛋白表达的蛋白印迹结果。

图50是示例性地示出了用于大豆转化的载体的结构的结构图。

图51是检测突变基因是否存在于大豆的CyPP02 Y373M转化体和CyPPO8 F363M转化体中的DNA印迹结果。

图52是示出了大豆的CyPP02 Y373M转化体和CyPPO8 F363M转化体的T₂代的除草剂耐受水平的照片。广安是指非转基因大豆(栽培品种)

图53是检测CyPPO2 Y373M蛋白和CyPPO8 F363M蛋白是否分别在大豆的CyPPO2Y373M转化体和CyPPO8 F363M转化体的叶中表达的蛋白印迹结果。

图54是示出了用汰芬那处理油菜籽的CyPPO8F363M转化体之前(上图)和之后(下图)的生长图像的照片。灵山(Youngsan)是指非转基因油菜籽(栽培品种)。

图55是示出了用苯嘧磺草胺处理油菜籽的CyPPO8F363M转化体之前(上图)和之后(下图)的生长图像的照片。野生型是指非转基因油菜籽(栽培品种)。

图56示出了检测CyPPO8 F363M蛋白是否在油菜籽的CyPPO8 F363M转化体的叶中表达的蛋白印迹结果(上图)并示出了考马斯染色结果(下图)。

具体实施方式

在下文中，将参考实施例详细描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明不受这些实施例的限制。

实施例1.从原核生物中分离PPO基因

黑绿颤藻PCC 7112、鞘丝藻属PCC 8106株和盐杆藻属PCC 7418株由巴斯德研究所(法国)提供，PPO基因分离自每株。每种PPO基因用针对在BT3大肠杆菌中进行有效的除草剂抗性筛选的密码子优化序列信息合成。使用表1的引物扩增合成的PPO基因。

将1微升(1μl)每种模板(每株的基因组DNA)、5μl 10X缓冲液、1μl dNTP混合物(各10mM)、1μl正向引物(参见表1；10μM)、1μl反向引物(参见表1；10μM)、40μl DDW和1μl Pfu-X(Solgent，2.5单位/μl)混合来制备50μl PCR反应混合物，并在以下条件下进行扩增：94℃下4分钟；94℃下30秒，56℃下30秒和72℃下1.5分钟，25个循环；72℃下5分钟。

分别地，从黑绿颤藻PCC 7112分离的PPO被命名为CyPPO2，从鞘丝藻属PCC 8106株分离的PPO被命名为CyPPO4，从盐杆藻属PCC 7418株分离的PPO被命名为CyPPO8。

此外，检测CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8各自的核苷酸序列及由相应的序列编码的氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO：1至6。

表1

使用PPO缺陷型大肠杆菌(BT3(ΔPPO))测试以上制备的CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8对除草剂的耐受性。BT3(ΔPPO)菌株由北海道大学(日本)提供，其是缺乏hemG型PPO并具有卡那霉素耐受性的大肠杆菌菌株(参见Watanabe等人，通过替代使用两种框内抑制密码子菠菜原卟啉原氧化酶II对线粒体和叶绿体双重靶向(Dual targeting of spinachprotoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternativeuse of two in-frame inhibition codons)，JBC 2001276(23)：20474-20481；Che等人，在菠菜叶绿体中原生卟啉原氧化酶的分子特征和亚细胞定位(Molecular Characterizationand Subcellular Localization of Protoporphyrinogen Oxidase in SpinachChloroplasts)，Plant Physiol.2000Sep；124(1)：59-70″)。

用每种CyPPO基因转化BT3(ΔPPO)，并将其在含有PPO抑制性除草剂的LB(Luria-Bertani)琼脂培养基上培养，从而检测是否抑制转化的大肠杆菌的生长。

具体测试过程如下：

将以上制备的CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因克隆到pACBB载体(质粒#32551；Addgene；参见图3)中。将克隆的质粒分别添加到BT3感受态细胞中，从而通过热激法转化。将用每种CyPPO基因转化的大肠杆菌在含有氯霉素(34μg/ml，Duchefa)的LB琼脂培养基中培养。

将用每种CyPPO基因转化的单个大肠杆菌菌落在含有氯霉素的3ml LB肉汤中培养过夜(220rpm，37℃)，然后用新鲜培养基再培养各培养物直至吸光度(OD₆₀₀)变成0.5至1。将其用LB肉汤稀释至吸光度(OD₆₀₀)为0.5。再次，以十分之一的系数将稀释的溶液连续稀释5次。接下来，将10μl每种稀释溶液滴加到含有氯霉素(34μg/ml)和浓度为0至400μM的汰芬那的LB琼脂培养基上。将LB琼脂培养基在光照条件下于37℃培养，并在16至20小时后评估生长抑制水平。

为了比较，使用用pACBB-eGFP载体(质粒#32551；Addgene；参见图3)转化的BT3大肠杆菌转化体和导入拟南芥来源的野生型PPO基因(野生型AtPPO1)(SEQ ID NO：8)的BT3大肠杆菌转化体进行相同的试验。

如图1所示，CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因的BT3大肠杆菌转化体在测试的除草剂的所有浓度下表现出与AtPPO1基因的大肠杆菌转化体相比更高的除草剂耐受性。

实施例2.从PPO和PPO抑制性除草剂复合物中确定与PPO抑制性除草剂相互作用的 PPO氨基酸残基

为了确认PPO蛋白与除草剂的结合结构信息，使用汰芬那作为PPO抑制性除草剂的代表性实例。

为了获得水溶性CyPPO2蛋白，用亲水残基替换位于CyPPO2(SEQ ID NO：1)氨基酸中的类囊体膜结合域中的7个疏水氨基酸残基。将编码CyPPO2的氨基酸残基替换的变体蛋白的基因克隆到pET29b载体(目录号：69872-3；EMD Biosciences；参见图2)，并使用大肠杆菌系统表达CyPPO2蛋白。通过镍亲和层析纯化表达的CyPPO2蛋白并使其结晶。通过浸泡3mM的汰芬那获得CyPPO2和汰芬那复合物，并通过同步辐射加速器将该复合物用于X射线衍射。获得CyPPO2-汰芬那复合物晶体的

分辨率下的X射线衍射数据，确定三维结构，并分析汰芬那在CyPPO2蛋白中的结合位置。CyPPO2和汰芬那复合物的结构分析结果是，CyPPO2蛋白(SEQ ID NO：1)的S63、P91、R92、F169、V173、A175、E228、L229、P316、V318、F337、L340、G351、T352、I353和Y373位置的氨基酸与汰芬那相互作用。

并且，使用来自CyPPO2-汰芬那复合物结构的信息，通过如下序列同源性分析确定CyPPO4(SEQ ID NO：3)和CyPPO8(SEQ ID NO：5)蛋白(NCBI BLAST，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSe arch&LINK_LOC＝blasthome确定与中与汰芬那相互作用的氨基酸残基。

与汰芬那相互作用的CyPPO4蛋白(SEQ ID NO：3)的氨基酸是N63、S64、S66、P67、P92、R93、F170、S172、G173、V174、Y175、A176、R190、E230、L231、P318、V320、F339、G340、N341、L342、L352、G353、T354、I355、Y375、I424、V458和R465。与汰芬那相互作用的CyPPO8蛋白(SEQ ID NO：5)的氨基酸是P84、R85、F156、V160、A162、Q179、P306、V308、F327、L330、I343、N362和F363。

实施例3.通过PPO变体验证PPO抑制性除草剂的耐受性(在大肠杆菌中测试)

为了增强CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8的PPO抑制性除草剂耐受性，分别引入在与实施例2中获得的除草剂相互作用的位置处的突变。用突变的CyPPO基因转化BT3(ΔPPO)，并在用PPO抑制性除草剂处理的条件下培养，从而检测转化的BT3的生长是否被抑制。用每种基因的野生型作为对照。

实验方法如下：

使用表2至3的引物使克隆在pACBB载体(质粒#32551；Addgene；参见图3)中的CyPPO2和CyPPO4突变，并且使用表4的引物使克隆在pACBB载体或pET303-CT-His载体(VT0163；Novagen；参见图4)中的CyPPO8突变。

通过混合1μl模板、5μl 10X缓冲液、1μl dNTP混合物(各10mM)、1μl正向引物(10μM)、1μl反向引物(10μM)、40μl DDW和1μl Pfu-X(Solgent，2.5单位/μl)来制备50μl PCR反应混合物，并在以下条件下进行扩增：94℃下4分钟；94℃下30秒，56至65℃下30秒和72℃下3分钟，17至25个循环；72℃下5分钟。用0.5μl DpnI(New England Biolabs)处理每5μl PCR产物，并在37℃下温育30分钟。通过热冲击法用大肠杆菌转化反应溶液。每种转化体在含有氯霉素或氨苄青霉素的LB琼脂培养基中培养。通过质粒DNA测序确认每个突变，并将每个质粒转化至BT3(ΔPPO)。

表2

用于CyPPO2突变的引物

表3

用于CyPPO4突变的引物

表4

用于CyPPO8突变的引物

将用每种CyPPO基因转化的单个大肠杆菌菌落在含有氯霉素的3ml LB肉汤中培养过夜(220rpm，37℃)，然后用新鲜培养基再培养各培养物直至吸光度(OD₆₀₀)变成0.5至1。将其用LB肉汤稀释至吸光度(OD₆₀₀)为0.5。再次，以十分之一的系数将稀释的溶液连续稀释5次。接下来，将10μl每种稀释溶液滴加到含有氯霉素(34μg/ml)和浓度为0至400μM的汰芬那的LB琼脂培养基上。将LB琼脂培养基在光照条件下于37℃培养，并在16至20小时后评估生长抑制水平。

试验中使用的除草剂列于下表5中：

表5

结果示于下表6至8和图5到25中。

表6

CyPPO2突变赋予的除草剂耐受水平

CyPPO2	汰芬那	苯嘧磺草胺	丙炔氟草胺
				CyPPO2(野生型)	-	-	-
Y373M+G351A	+++++	+++++	+++++
				Y373C	++++	+++++	+++++
Y373I	++++	+++++	+++++
				Y373L	++++	+++++	+++++
Y373M	++++	+++++	+++++
				Y373T	++++	+++++	+++++
Y373V	+++	+++++	+++++
				A175C	+++	++++	+++++
A175L	++	+++++	++++
				V318M	++	++++	+++++
P316A+V318L	+	NT	NT
				P316L+V318L	+	NT	NT
F337V+Y373M	++	NT	NT
				T352V+Y373M	++++	NT	NT
G351A+T352V+Y373M	+++	NT	NT
				P91L+Y373M	++	NT	NT

(NT：未测试)

表7

CyPPO4突变赋予的除草剂耐受水平

CyPPO4	汰芬那	苯嘧磺草胺	丙炔氟草胺
				CyPPO4	-	-	-
Y375M	+++++	+++++	+++++
				Y375V	+++++	+++++	+++++
Y375I	+++++	+++++	+++++
				Y375T	+++++	+++	+++++
Y375C	+++++	+++	NT
				A176C	+++++	+++++	+++++
A176L	+++++	++++	+++++
				P318L+V320L	+++++	++++	NT
V320M	+++++	++++	NT
				P318A+V320L	+++++	++++	NT

(NT：未测试)

表8

CyPPO8突变赋予的除草剂耐受水平

(NT：未测试)

表6至表8示出了评价野生型和PPO变体的除草剂耐受性的结果，野生型的除草剂耐受性水平用“-”表示，除草剂耐受性水平通过用“-”表示相同的耐受水平，若更高则添加“+”直到最大大“+++++”来渐变表示。

图5至25示出了用CyPPO基因(野生型和变体)转化的大肠杆菌的结果，并且在上图描述了除草剂处理的浓度。最左侧的柱是大肠杆菌培养液OD₆₀₀＝0.5的结果，接下来的5个柱是以十分之一的系数稀释5次。

如表6和图5至13所示，CyPPO2野生型转化体(下文称为′Cy2 WT′；对照)示出了从25μM或50μM嘧啶二酮基除草剂汰芬那处理的快速生长抑制，但是分别导入了Y373C、Y373I、Y373L、Y373M、Y373T、Y373V、A175C、A175L、V318M、G351A+Y373M、P316A+V318L、P316L+V318L、Y373M+F337V、Y373M+T352V、Y373M+G351A+T352V和Y373M+P91L的突变基因的转化体甚至在最大浓度(200μM)下也未观察到生长抑制(图5)。当用另一种嘧啶二酮基除草剂苯嘧磺草胺处理时，Cy2 WT在100μM或更高浓度下也显示出生长抑制，但是分别导入了Y373C、Y373I、Y373L、Y373M、Y373T、Y373V、A175C、A175L、V318M和G351A+Y373M的突变基因的转化体即使在最大浓度(200μM)下也未观察到生长抑制(图6)。当用N-苯基邻苯二甲酰亚胺类除草剂丙炔氟草胺处理时，Cy2 WT的生长抑制从25μM浓度的除草剂处理开始，但是分别导入了Y373C、Y373I、Y373L、Y373M、Y373T、Y373V、A175C、A175L、V318M和G351A+Y373M的突变基因的转化体在最大浓度(200μM)下未观察到生长抑制(图7)。

如表7和图14至16所示，当用汰芬那处理时，导入CyPPO4野生型基因(在下文中，由′Cy4 WT′表示；对照)显示从100μM除草剂处理开始的生长抑制，但是分别导入了A176L、A176C、P318L+V320L、P318A+V320L、V320M、Y375I、Y375T、Y375V、Y375M和Y375C的突变基因的转化体在最大浓度(200μM)下未观察到生长抑制(图14)。当用苯嘧磺草胺处理时，Cy4 WT显示出从100μM除草剂处理开始的生长抑制，但是分别导入了Y375C、Y375I、Y375M、Y375T、Y373V、A176C、A176L、P318L+V320L、P318A+V320L和V320M的突变基因的转化体在最大浓度(200μM)下未观察到生长抑制(图15)。当用丙炔氟草胺处理时，Cy4 WT显示出从200μM浓度的除草剂处理开始的生长抑制，但是分别导入了Y375I、Y375M、Y375T、Y373V、A176C和A176L的突变基因的转化体未观察到生长抑制(图16)。

如表8和图17至25所示，当用汰芬那或苯嘧磺草胺处理时，导入CyPPO8野生型基因(下文中，由′Cy8 WT′代表；对照)显示从5μM除草剂处理浓度开始不生长，分别导入F363C、F363L、F363M、F363V、A162L、V308M、P306A+V308L、P306L+V308L、F363M+P84L和F363M+N362S的突变基因的转化体甚至在最小浓度25μM或更高下观察到生长(图17和图18)。当用二苯基醚基除草剂氟磺胺草醚处理时，Cy8 WT显示从25μM除草剂处理浓度开始不生长，但是分别导入F363C、F363L、F363M、A162L、V308M、P306A+V308L和P306L+V308L的突变基因的转化体在25μM或更高浓度下观察到生长(图19)。当用二苯基醚类除草剂三氟羧草醚处理时，Cy8WT显示从50μM除草剂处理浓度开始不生长，但是分别导入F363C、F363L、F363M、F363V、A162C、A162L、V308M、P306A+V308L和P306L+V308L的突变基因的转化体在50μM或更高浓度下观察到生长(图20)。当用丙炔氟草胺处理时，Cy8 WT显示从5μM除草剂处理浓度开始不生长，但是分别导入F363C、F363L、F363M、F363V、A162L和V308M的突变基因的转化体在25μM或更高浓度下观察到生长(图21)。当用三唑啉酮基除草剂甲磺草胺处理时，Cy8 WT显示仅通过25μM除草剂处理浓度而生长，但是分别导入F363C、F363L、F363M、F363V、A162C、A162L、V308M、P306A+V308L和P306L+V308L的突变基因的转化体在50μM或更高浓度下观察到生长(图22)。当用环戊

草酮或氟唑草酯处理时，Cy8 WT显示从5μM除草剂处理浓度开始不生长，但是分别导入F363C、F363L、F363M、F363V、A162C、A162L、V308M、P306A+V308L和P306L+V308L的突变基因的转化体在最大浓度((200μM)下观察到生长(图23和图24)。当用双唑草腈处理时，Cy8 WT显示从25μM除草剂处理浓度开始不生长，但是分别导入F363C、F363L、F363M、F363V、A162C、A162L、V308M、P306A+V308L和P306L+V308L的突变基因的转化体在最大浓度(200μM)下观察到生长(图25)。

实施例4：通过PPO野生型和变体的除草剂测量酶活性和IC₅₀值

检测其中使PPO蛋白的某些位置的氨基酸突变以增加除草剂耐受性的变体的酶活性，并进行PPO抑制性除草剂的抑制试验。已证实PPO蛋白具有低水溶性，但当PPO与MBP(麦芽糖结合蛋白)融合时(MBP-PPO)，其是水溶的并且稳定表达。因此，在本实验中使用以与MBP的融合蛋白形式表达的野生型和变体蛋白(参见图26)。

为了克隆CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8的野生型基因和变体基因(参见实施例1和实施例2)，将这些基因分别导入pMAL-c2X载体(参见图27)，然后在BL21-CondonPlus(DE3)大肠杆菌(CodonPlus)中表达。

在以下条件下培养转化的大肠杆菌以表达导入的PPO基因：

诱导：OD₆₀₀＝0.2，添加IPTG至0.3mM终浓度；

表达温度：23℃，200rpm振荡培养；

表达时间：16小时；

培养规模：200ml/1000ml烧瓶。

通过以下方法对培养的细胞进行细胞裂解和蛋白提取：

提取缓冲液：柱缓冲液(50mM Tris-Cl，pH8.0，200mM NaCl)5ml缓冲液/g细胞；

超声处理：SONICS&MATERIALS VCX130(130瓦)；

15秒开(ON)，10秒关闭(OFF)，冰上进行5分钟；

在4℃的条件下离心20分钟(20,000×g)；用柱缓冲液以1：6的比例稀释离心得到的上清。

以下纯化PPO蛋白的方法在4℃冷室中进行。将直链淀粉树脂(New EnglandBiolabs)填充到1.5×15cm柱(Bio-Rad Econo柱1.5×10cm，玻璃色谱柱，最大体积)中，并将获得的蛋白提取物以0.2ml/分钟的流速加载到柱中。用3倍柱体积的缓冲液洗涤柱，检测洗涤溶液中蛋白的量。当不再检测到蛋白时，终止洗涤。然后，用约2倍柱体积的含有20mM麦芽糖的缓冲液洗脱MBP-PPO蛋白。测定每个洗脱液的蛋白浓度，并在不再检测到蛋白时停止洗脱。研究10微升每种级分进行蛋白定量和SDS-PAGE分析。将PPO蛋白变体(例如CyPPO2-Y373M、CyPPO4-Y375M、CyPPO8-F363M)的高纯度级分用于酶活性测定。

每种PPO的SDS-PAGE分析在图28至图30中示出。参考图28中示出的结果，取CyPPO2野生型蛋白(洗脱7，泳道2)和CyPPO2-Y373M(洗脱5，泳道7)并用于酶活性分析。

参考图29中示出的结果，取CyPPO4野生型蛋白(洗脱3，泳道2)和CyPPO4-Y375M(洗脱3，泳道6)并用于酶活性分析。

参考图30中示出的结果，取CyPPO8野生型蛋白(洗脱9，泳道3)和CyPPO8-F363M(洗脱4，泳道6)并用于酶活性分析。

通过以下方法测量纯化的野生型蛋白和CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8的变体蛋白的酶活性。

整个过程在氮气流下在黑暗中进行。由于原卟啉原IX，即PPO蛋白的底物是不能商业上获得的，所以其在实验室中化学合成。将6μg原卟啉IX溶于20ml 20％(v/v)EtOH中，并在黑暗条件下搅拌30分钟。将得到的原卟啉IX溶液以800μl的量置于15ml螺旋管中，用氮气冲洗5分钟。向其中添加1g钠汞齐，并剧烈振荡2分钟。打开盖子以排出管中的氢气。此后，关闭盖子并温育3分钟。使用注射器和纤维素膜过滤器过滤原卟啉原IX溶液。向600μl所获得的原卟啉原IX溶液中添加约300μl的2M MOPS[3-(N-吗啉代)丙磺酸]，以便将pH调节至8.0。为了确定PPO蛋白的酶活性，用以下组成(基于10ml)制备反应混合物：50mM Tris-Cl(pH8.0)；50mM NaCl；0.04％(v/v)吐温20；40mM葡萄糖(0.072g)；5单位葡萄糖氧化酶(16.6mg)；和10单位过氧化氢酶(1μl)。

将含有纯化的PPO蛋白的200μl反应混合物置于96孔板中，并在室温下预温育30分钟以通过葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶的偶联反应降低氧浓度。将矿物油分层，然后通过添加底物原卟啉原IX溶液至终浓度为50μM使反应开始。反应在室温下进行30分钟，并使用酶标仪(Sense，Hidex)测量原卟啉IX的荧光(激发：405nm；发射：633nm)。为了计算PPO酶活性，将原卟啉原IX溶液在空气中保持开放以氧化溶液(过夜)。向其中添加2.7N HCl，测量408nm处的吸光度。使用标准原卟啉IX产生标准曲线，通过使用原卟啉IX的标准曲线校准原卟啉IX来测量PPO活性。

获得的PPO野生型和变体的酶活性显示在表10和11中。

计算每种酶的米氏常数(Km)和最大速度(Vmax)值，以评估CyPPO2和CyPPO8的动力学研究。测量初始反应速度，其中通过使底物浓度变化，反应速度与浓度成比例。作为酶促反应产物的产生的原卟啉IX的量在室温下根据时程测量20分钟。用酶动力学分析程序通过米氏方程计算Km和Vmax值。用野生型AtPPO1作为对照。结果如表9所示：

表9

CyPPO2和CyPPO8的Km和Vmax的确定

结果表明，CyPPO2和CyPPO8的Km值低于AtPPO1的Km值，确认酶与底物间的亲和力较好，而CyPPO2和CyPPO8的Vmax值是AtPPO1的2倍以上。总之，CyPPO2和CyPPO8的PPO蛋白显示出比植物来源的AtPPO1更好的作为PPO酶的能力。

另外，测量每种除草剂的抑制每种PPO野生型和变体的PPO酶活性至50％时的PPO抑制性除草剂的浓度(IC₅₀)。每种除草剂的最终浓度如下：

-汰芬那、苯嘧磺草胺、氟磺胺草醚、氟丙嘧草酯、丙炔氟草胺和甲磺草胺：0、10、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000nM

将IC₅₀值计算为在添加上述浓度的除草剂之前抑制PPO酶活性到50％的除草剂浓度。

不同除草剂的IC₅₀值示于下表10和11中。

表10

(NT：未测试)

表11

(NT：未测试)

如表10和表11所示，说明了与野生型相比，在CyPPO蛋白变体的情况下，每种除草剂的IC₅₀值显著增加。这些结果显示，除草剂耐受性通过PPO蛋白某些位置的氨基酸突变而增加。尽管本数据显示CyPPO蛋白变体与野生型相比具有降低的酶活性，但这可能由蛋白折叠的不同条件和/或重组体PPO与天然PPO相比的疏水性引起。虽然天然PPO是疏水性的并且定位于植物中叶绿体的膜，但是在大肠杆菌中产生的含有MBP作为融合配偶体的重组PPO是亲水性的。因此，当PPO变体适当组装并表达到植物中的叶绿体时，酶活性不会受到显著影响。

实施例5.使用CyPPO变体产生拟南芥转化体和PPO抑制性除草剂耐受性测试

5-1.构建拟南芥转化体载体和拟南芥转化体的产生

用二元载体转化拟南芥，该二元载体具有选择性标记的ORF、Bar基因(草铵膦耐受基因)和CyPPO2、CyPPO4或CyPPO8的每种氨基酸突变基因的ORF。检查转基因植物对草铵膦和PPO抑制性除草剂的交叉耐受性。bar基因也用于检查转基因是否在世代中稳定遗传。NOS启动子和E9终止子用于bar基因表达。

为了分别在植物中表达CyPPO2变体、CyPPO4变体和CyPPO8变体，使用CaMV35S启动子和NOS终止子。另外，为了将蛋白转运至叶绿体，使用XbaI和XhoI限制酶将AtPPO1基因的转运肽(TP)(SEQ ID NO：8)插入到插入基因的5′前方。进一步地，为了鉴定表达的蛋白，使用BamHI和SacI限制酶将血凝素(HA)标签与3′末端区融合。插入载体的转运肽区由SEQ IDNO：10表示，插入的HA标签序列由SEQ ID NO：11表示。使用XhoI和BamHI限制酶将CyPPO2变体、CyPPO4变体或CyPPO8变体的编码基因插入转运肽和HA标签之间。在HA标签后方插入NOS终止子，从而终止PPO基因的转录。植物转化二元载体的示意图在图31中示出。

通过冻融法将每种构建的载体转化到根癌农杆菌GV3101感受态细胞中。为了制备农杆菌GV3101感受态细胞，在30℃，200rpm的条件下在5ml LB培养基中对农杆菌GV3101株培养12小时。将培养物溶液倒入200ml LB培养基中，然后在30℃的条件下以200rpm培养3至4小时，并在4℃下离心20分钟。用无菌蒸馏水洗涤细胞沉淀，并重悬于20ml LB培养基中。将用液氮冷冻的200μl等分试样储存在深冻冰箱中。

将每种转化的农杆菌在抗生素培养基(含有壮观霉素的LB琼脂)中培养并筛选。筛选的菌落在LB肉汤中液体培养。从培养物溶液中收获农杆菌细胞后，将其以0.8的吸光度(OD₆₀₀)重悬于5％(w/v)蔗糖、0.05％(v/v)Silwet L-77溶液(迈图性能材料公司)中。通过花序转染(Floral dipping)，转化野生型拟南芥(Col-0生态型)，然后在1至2个月后收获种子(T₀)。

二元载体中的Bar基因用于筛选单个转化体。将获得的T₀种子播种在补充有25μM草铵膦的1/2MS培养基(2.25g/L MS盐，10g/L蔗糖，7g/L琼脂)中，并在播种7天后选择存活的植物，并移植到土壤中并生长，以获得T₁植物。

为了检测转基因植物对PPO抑制性除草剂的耐受性，对每个40×60cm的区域(0.24m²)的4周龄植物均匀喷洒100ml 1μM的汰芬那溶液(0.05％Silwet L-77)。虽然野生型拟南芥(Col-0生态型)在处理后7天内完全死亡，但每个转化体均未显示对PPO抑制性除草剂处理的损害。

将T₂种子播种到补充有25μM草铵膦的1/2MS培养基(2.25g/L MS盐，10g/L蔗糖，7g/L琼脂)中，并且在1周后，将存活的植物移植到土壤中。

用拟南芥野生型PPO1(野生型AtPPO1)作为具有PPO抑制性除草剂的敏感性的阴性对照(GenBank登录号AX084732(该基因的核苷酸序列由SEQ ID NO：8表示，氨基酸序列由SEQ ID NO：7表示))。在野生型AtPPO1的氨基酸序列中，具有Y426M(第426位氨基酸，酪氨酸被甲硫氨酸取代)和S305L(第305位氨基酸，丝氨酸被亮氨酸取代)的氨基酸替换的突变体AtPPO1用作阳性对照(氨基酸序列由SEQ ID NO：9表示)(Li等人.原卟啉原氧化酶作为根癌农杆菌介导的玉米转化的有效选择标记的开发(Development of protoporphyrinogenoxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize).Plant physiol.2003 133：736-747)。

用于产生拟南芥转化体的CyPPO变体列于表12中：

表12

5-2.种子萌发

使用在1μM的汰芬那喷雾下存活的T₂种子确认拟南芥的汰芬那耐受性。向转化体导入CyPPO2的Y373M突变体，CyPPO4的Y375M突变体或CyPPO8的F363M突变体(分别为CyPPO2Y373M转化体，CyPPO4 Y375M转化体和CyPPO8 F363M转化体)。通过在补充有草铵膦(50μMPPT)的培养基中播种拟南芥种子来确认转化体的草铵膦耐受性。

结果在图32中示出。

萌发的CyPPO2 Y373M转化体的第32号、第34号和第28号，CyPPO4Y375M转化体的第14号和第31号，以及CyPPO8 F363M转化体的第22号、第51号和第52号均在含有1μM或更高浓度的汰芬那的1/2MS培养基中萌发。此外，用作阴性对照的野生型拟南芥(Col-0)种子在含有70nM汰芬那的1/2MS培养基中不萌发，并且用作阳性对照的突变AtPPO1转化体(AtPPO1SLYM)甚至在含有1μM汰芬那的1/2MS培养基中萌发。

5-3.确定T₂代种子耐性性状的分离比例

为了确定遗传，用T₂种子研究了分离比例。结果在表13至表15中示出。

表13

表14

表15

如表13所示，在CyPPO2突变基因插入的转化体的情况下，Y373M变体的32号、34号、38号和39号品系，Y373V变体的34号品系，Y373I变体的23号和34号品系，Y373L变体的23号和43号品系，Y373C变体的40号品系，V318M+Y373I变体的1号和3号品系，V173S+A175C+Y373M变体的3号、4号、72号、84号和51号品系，A175C+V318M+Y373M变体的4号和8号品系显示出约3∶1的耐受个体比易感个体，从而根据孟德尔定律说明了单拷贝的转基因被整合到拟南芥基因组中。

如表14所示，在CyPPO4突变基因插入的转化体的情况下，Y375M变体的14号和31号品系显示出约3∶1的耐受个体比易感个体，从而说明了单拷贝的转基因被整合到拟南芥基因组中。

如表15所示，在CyPPO8突变基因插入转化体的情况下，F363M变体的22号、51号和52号品系，F363V变体的1号和18号品系，F363L变体的1号和33号品系，A162L变体的1号和5号品系，A162C+V308M+F363M的46号和48号品系显示出约3∶1的耐受个体比易感个体，从而说明了单拷贝的转基因被整合到拟南芥基因组中。

5-4.耐除草剂拟南芥(T₂)中CyPPO蛋白表达的研究

在蛋白水平上检测CyPPO2 Y373M，CyPPO4 Y375M或CyPPO8 F363M的导入基因的表达。将约100mg拟南芥T₂转化体叶片与液氮粉碎后，通过加入蛋白提取缓冲液(0.05M Tris-Cl pH 7.5，0.1M NaCl，0.01M EDTA，1％Triton X-100，1mM DTT)提取蛋白。使用提取的蛋白进行蛋白印迹。电泳后，将蛋白转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，然后使用抗HA抗体(Santacruz)和抗肌动蛋白抗体(上样对照，比较实验蛋白的量；Abcam)进行蛋白印迹。

结果如图33所示。

突变PPO蛋白表达水平在CyPPO2 Y373M转化体和CyPPO8 F363M转化体中相似，而CyPPO4 Y375M表现出低水平的PPO变体表达。

将转化体品系进一步培养一个世代(T₃代)，确认转化体的每个品系对除草剂具有耐受性(参见实施例5-5)。这表明导入的基因的表达在传代过程中得以维持，并且它们赋予除草剂耐受性。

5-5.转化拟南芥的除草剂耐受性的验证

为了说明植物中编码CyPPO2、CyPPO4和CyPPO8基因的氨基酸变体的除草剂耐受性，对T₂代或T₃代测试除草剂耐受性。所有喷雾试验均在抽苔前，大约移栽后4周进行。每40×60cm的区域(0.24m²)喷洒100ml含有溶液(0.05％SilweTL-77)的除草剂。

喷洒至CyPPO2 Y373M变体、CyPPO4 Y375M变体和CyPPO8 F363M变体后第7天所观察到的结果在图34(汰芬那处理的结果)、图35(苯嘧磺草胺处理的结果)和图36(氟磺胺草醚处理的结果)中示出。野生型Col-0(阴性对照)死亡，而AtPPO1 SLYM(阳性对照)和实验组，CyPPO2 Y373M转化体的38号、39号和34号品系以及CyPPO8 F363M转化体的22号、51号和52号品系在5μM汰芬那、5μM苯嘧磺草胺和5μM氟磺胺草醚下均显示出持续生长。CyPPO4Y375M转化体14号品系在5μM苯嘧磺草胺和5μM氟磺胺草醚下显示出持续生长。

用25μM汰芬那或75μM苯嘧磺草胺处理CyPPO2的Y373C、Y373I、Y373L、Y373M和Y373V突变基因的T₃转化体。将25μM汰芬那或100μM苯嘧磺草胺喷洒到CyPPO8的F360L、F360V和A162L突变基因的T₃转化体上。

将5μM汰芬那喷洒到CyPPO2的V318M+Y373I、V173S+A175C+Y373M和A175C+V318M+Y373M突变基因的T₂转化体上。将10μM汰芬那喷洒到CyPPO8的A162C+V308M+F363M突变基因的T₂代转化体上。

喷洒后第7天观察到的结果在表16(损伤指数)和图37(CyPPO2变体；T₃代(上图，下图)/T₂代(中图))和图38CyPPO8变体；T₃代(上图，中图)/T₂代(下图))中示出。

表16

损伤指数

NT：未测试

表16的损伤指数通过下表17的标准评估(这同样适用于上下文中提供的损伤指数)：

表17

如表16和图37所示，CyPPO2变体的所有转化体分别不仅在5μM而且在25μM的汰芬那中持续生长。

如表16和图38所示，每种CyPPO8变体的转化体不仅在10μM汰芬那中而且在25μM汰芬那中持续生长，并且在100μM苯嘧磺草胺中连续生长。

此外，在每种50μM除草剂(丙炔氟草胺、甲磺草胺、汰芬那或苯嘧磺草胺)中确认分别导入CyPPO2 Y373I和CyPPO8 F363V的转化体(T₃)的耐受水平。用AtPPO1 SLYM作为耐受性对照组(阳性对照)。分别以50μM的浓度用汰芬那、苯嘧磺草胺、丙炔氟草胺或甲磺草胺处理，并且在7天后评估损伤指数。结果在图45和表18中示出。作为参考，汰芬那的分子量(MW)为511.87，苯嘧磺草胺的分子量为500.85，丙炔氟草胺的分子量为354.34，甲磺草胺的分子量为是387.18。将浓度为50μM的每种除草剂在40×60cm的区域(0.24m²)上均匀喷洒100ml。转化的处理剂量分别对应于106.7g ai/ha的汰芬那、104.4g ai/ha的苯嘧磺草胺、73.8gai/ha的丙炔氟草胺和80.7g ai/ha的甲磺草胺。

表18

损伤指数

如图45和表18所示，与已知具有除草剂耐受性的AtPPO1 SLYM相比，突变基因转化体的耐受性相似或更高。

野生型拟南芥在0.8μM的汰芬那处理后死亡，然而PPO突变体转化体在5μM、10μM或25μM的汰芬那处理下表现出持续生长。

根据该结果，预期CyPPO变体对其他植物与拟南芥一样地提供各种PPO抑制性除草剂的耐受性。

5-6.在发生传代期间确认转基因稳定性

该试验是为了确认在拟南芥中导入的基因即使世代培育也能稳定遗传和表达。

如下将CyPPO2 Y373I突变体和CyPPO8 F363V突变体转化体发展到T₄或T₅代；CyPPO2 Y373I的T₃品系23-2、23-7、34-2和CyPPO8 F363V的1-7、18-1、18-7。通过每个品系的T₃至T₅代维持除草剂耐受性，表明转基因在世代中的稳定性。

具体地，用15μM的汰芬那或150μM的苯嘧磺草胺处理T₄或T₅品系，并且在除草剂处理后7天，评估损伤水平。结果在图46(T₄品系)和图47(T₅品系)中示出。

此外，进行蛋白印迹以确认蛋白表达。从转化体中提取蛋白。在使用液氮研磨幼苗后，添加蛋白提取缓冲液(0.05M Tris-Cl pH 7.5，0.1M NaCl，0.01M EDTA，1％Triton X-100，1mM DTT)并提取总蛋白。电泳后将提取的蛋白转移到PVDF膜上，使用抗HA抗体(Santacruz)进行蛋白印迹。检测转化体中表达的蛋白。结果在图48(T₄品系)和图49(T₅品系)中示出。

如图46至图49所示，维持了T₄和T₅的所有代的除草剂耐受性，并且还确认了PPO蛋白的表达。具体而言，在Col-0中(阴性对照)当15μM汰芬那或150μM苯嘧磺草胺进行处理时完全死亡，然而T₄和T₅的转化体维持且没有损伤(损伤指数0)。作为参考，当在T₃代中用25μM的汰芬那或75μM的苯嘧磺草胺处理时，损伤指数水平为0至1。

实施例6.使用CyPPO变体和PPO抑制除草剂耐受性试验产生水稻转化体

6-1.水稻转化载体的构建及水稻转化体的产生

构建了具有Bar基因(草铵膦耐受基因)的ORF和CyPPO2或CyPPO8的每种氨基酸突变基因的ORF的二元载体，并将其用于水稻转化。将每种基因克隆到pCAMBIA3301载体中(参见图39)。使用用于表达Bar基因的CaMV35S启动子和用于转录终止的35S终止子。

为了在植物中表达CyPPO2或CyPPO8的突变基因，使用玉米的泛素启动子和NOS终止子。此外，AtPPO1的转运肽(TP)融合在CyPPO2或CyPPO8突变体的N-末端区。通过电击法将构建的每种载体转化到根癌农杆菌LBA4404感受态细胞(Takara)中。

转化的农杆菌用于转化东津水稻(野生型栽培品种)。去除东津水稻种皮，消毒，并在32℃下在N6D培养基中在黑暗中培养5天之后，将水稻种子与转化的农杆菌溶液混合，然后移植到2N6-AS100培养基上。将其在黑暗中在28℃下温育1天，然后在黑暗中在23.5℃下温育4天。将种子在补充有适当浓度的草丁膦(Duchefa)的N6D cf500ppt4培养基上于28℃在光照下温育10天，在感染的种子中选择转化的愈伤组织。将选择的愈伤组织移至补充有适当浓度的草丁膦(Duchefa)的REIII cf500ppt4培养基上，从而诱导植物。

所用培养基的组成列于表19中：

表19

6-2.转化的水稻的PPO抑制性除草剂耐受性的验证

为了检验在单子叶植物作物中CyPPO2和CyPPO8突变基因的转化体的除草剂耐受性水平，在转化了每种基因的东津水稻T₀代植物中测试了除草剂耐受性。

在CyPPO2 Y373M转化体和CyPPO8 F363M转化体的T₀代的5周龄水稻分蘖后，使它们生长，然后各自用汰芬那或苯嘧磺草胺处理。在40×60cm的区域中用200ml的200μM汰芬那(相当于853g ai/ha)或500μM苯嘧磺草胺(相当于2,085g ai/ha)处理。作为参考，用于控制杂草的汰芬那的推荐处理剂量为约150g ai/ha，用于控制杂草的苯嘧磺草胺的推荐处理剂量为低于145g ai/ha。

在播种后第47天，用除草剂处理CyPPO2 Y373M和CyPPO8 F363M的T₂转化体。分别在40×60cm的区域喷洒100ml的200μM汰芬那(相当于420g ai/ha)和400μM苯嘧磺草胺(相当于840g ai/ha)。喷洒后第7天所观察到的结果分别在图40(显示了汰芬那和苯嘧磺草胺处理后CyPPO2 Y373M转化体1号和3号品系以及CyPPO8 F363M转化体2号和3号品系的T₀代植物的结果)和图41(显示汰芬那和苯嘧磺草胺处理后CyPPO2 Y373M转化体3号品系和CyPPO8 F363M转化体3号品系的T₂代植物)中示出。图40中的“非GM”表示未转化的野生型东津水稻，并用作阴性对照。

如图40和图41所示，在汰芬那或苯嘧磺草胺处理后，阴性对照野生型东津水稻严重受损，但在CyPPO2 Y373M转化体(由“CyPPO2YM”表示)1号和3号品系T₀代植物和CyPPO2Y373M转化体3-1号的T₂代植物中未观察到或有微弱的损伤。与汰芬那或苯嘧磺草胺处理后的野生型东津水稻相比，在CyPPO8 F363M转化体(由“CyPPO8FM”表示)1号和3号品系的T₀代植物和CyPPO8 F363M转化体3-1号的T₂代植物中未观察到损伤。

所有CyPPO2 Y373M转化体和CyPPO8 F363M转化体水稻植物在用高于杂草控制的推荐浓度的汰芬那或苯嘧磺草胺处理后都表现出耐受性。这表明导入水稻植物的基因是遗传并稳定表达的，从而显示出PPO抑制的除草剂耐受性。

6-3.水稻转化体中蛋白表达的验证

为了证实突变蛋白(CyPPO2 Y373M或CyPPO8 F363M)在CyPPO2 Y373M转化体和CyPPO8 F363M转化体中表达，从每个转化体品系的叶片中提取蛋白，并进行蛋白印迹。

为此，将每克组织添加5ml提取缓冲液(50mM Tris-Cl，pH 7.5，150mM NaCl，1mMEDTA，0.5％NP-40)和蛋白酶抑制剂(Xpert蛋白酶抑制剂混合溶液，GenDepot)添加到每种转化体的研磨的叶片组织中。将提取的蛋白加载到SDS-PAGE凝胶上，并转移到PVDF膜上。将膜与比例为1∶1000的CyPPO2或CyPPO8肽特异性一抗(GenScript)温育。使用ECL试剂和发光显影(Atto)通过HRP缀合的二抗检测蛋白。

获得的图像在图42(CyPPO2 Y373M表达)和图43(CyPPO8 F363M)中示出。在CyPPO2Y373M转化体1号和3号品系以及CyPPO8 F363M转化体2号和3号品系中检测到CyPPO蛋白。

6-4.转化水稻中导入基因的拷贝数分析

从CyPPO8 F363M转化体的叶片组织中提取基因组DNA以分析转基因的拷贝数。

如下提取基因组DNA。用研杵和研钵在液氮中研磨转化水稻的叶片组织后，添加每克组织5ml的DNA分离缓冲液(2％(w/v)CTAB，1.5M NaCl，25mM EDTA，0.2％(v/v)β-巯基乙醇，100mM Tris-Cl(pH8.0))并涡旋。在60℃下加热1小时后，添加1体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)并颠倒混合。在4℃下在7000×g的条件下离心10分钟后，将上清液移至新管中，并混合2.5体积的乙醇。在4℃下以5000×g离心5分钟后，弃去上清液，将沉淀溶解在TE缓冲液(LPSS)中。添加20μg/ml RNA酶(Bioneer)后，将其在37℃下温育30分钟。添加1体积的苯酚∶氯仿(1∶1)后，将其混合并在4℃下以10,000×g离心10分钟。将上清液移至新管中，然后添加1体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)并混合。在4℃下在10,000xg下离心10分钟后，将上清液移至新管中，添加0.1体积NaOAc(pH 5.2)和2体积乙醇并混合。然后，在4℃下以5,000×g离心5分钟，用70％乙醇洗涤沉淀。空气干燥后，将基因组DNA溶解在适量的TE缓冲液中。

使用EcoRI(Enzynomics)将10至40μg提取的DNA消化过夜。

然后，在0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳(50V)后，如下处理凝胶：

1)脱嘌呤：0.25N HCl，摇动15分钟

2)变性：0.5M NaOH，1.5M NaCl，摇动30分钟

3)中和：0.5M Tris(pH7.5)，1.5M NaCl，摇动20分钟

此后，使用毛细管转移法将DNA片段移至硝酸纤维素膜(GE healthcare)上，使用UV交联剂(UVC-508；ULTRA LUM Inc.)进行交联。

通过以下方法进行杂交：将硝酸纤维素膜浸入Easy杂交溶液(Roche)中，并在42℃下温育3小时。然后，弃去溶液，替换为新DIG Easy杂交溶液，并在42℃温育过夜。

探针(DIG标记的CyPPO8-M探针)通过PCR反应标记如下：

材料

表20

PCR反应的条件

引物序列

CyPPO8 F363M探针的正向引物：GCGTTAACGGGTGCATTAGGC(SEQ ID NO：158)

CyPPO8 F363M探针的反向引物：TGGAAAGAGTGTTGAACTCC(SEQ ID NO：159)

用标记的探针杂交后，在低严格度的洗涤缓冲液(2×SSC，0.1％SDS)中洗涤膜，然后用高严格度的洗涤缓冲液(0.5×SSC，0.1％SDS)洗涤。DNA印迹信号检测如下：

1)在膜上添加封闭缓冲液(Roche)后振荡30分钟

2)添加DIG抗体(抗地高辛-AP Fab片段，Roche)后振荡30分钟

3)在洗涤缓冲液中振荡15分钟(Roche)

4)添加检测缓冲液(Roche)后振荡3分钟

5)在膜上施加CDP-Star即用型(Roche)后，在X射线胶片上使印迹显影。

结果在图44中示出。CyPPO8 F363M 3号品系示出一个条带，这表明在水稻基因组中插入了单拷贝的基因。

实施例7.使用CyPPO变体产生大豆转化体和PPO抑制性除草剂耐受性试验

7-1.大豆转化体的产生

构建了用于用CyPPO2 Y373M或CyPPO8 F363M基因转化大豆植物的载体。

将拟南芥PPO1的转运肽序列与CyPPO2 Y373M或CyPPO8 F363M的5′区融合(参见图31)，并将融合基因扩增并分离以用于载体构建。

通过将1μl模板(用于拟南芥转化的载体)、5μl 10X缓冲液、1μl dNTP混合物(各10mM)、1μl TOPO-cTP_F引物(10μM)、1μlTOPO-CyPPO2_R或TOPO-CyPPO8_R引物(10μM)、40μlDDW和1μl Pfu-X(Solgent，2.5单位/μl)混合，制备PCR反应混合物(总共50μl)，并在如下的条件下进行扩增：94℃下4分钟，1个循环；94℃下30秒，56℃下30秒和72℃下1.5分钟，25个循环；72℃下5分钟，1个循环。

使用的引物总结在表21中：

表21

引物	序列
		topO-cTP_F	CAC CATGGA GTTATC TCTTC(SEQ ID NO：160)
topO-CyPPO2_R	TCA GATCGA TCG AGTATC TG(SEQ ID NO：161)
		topO-CyPPO8_R	TTA ACC CAAATA ATC TAA CA(SEQ ID NO：162)

使用pENTR Directional TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将每种扩增产物连接到pENTR-TOPO载体(Invitrogen，参见图50)，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞(Invitrogen)。

将pENTR-TOPO载体中的克隆基因转移至pB2GW7.0二元载体以转化植物。用Gateway LR Clonase II酶混合物试剂盒(Invitrogen)进行pB2GW7.0载体构建。在将插入了CyPPO2YM或CyPPO8FM基因的pENTR/D-TOPO载体、TE缓冲液和LR Clonase II酶混合物混合后，将混合物在25℃下温育1小时。将蛋白酶K溶液(Invitrogen)添加到反应混合物中后，将其在37℃下温育10分钟，并将其转化到DH5α感受态细胞中。

用上述二元载体构建体电转化根癌农杆菌EHA105(Hood等人，用于基因转移至植物的新的农杆菌辅助质粒(EHA105)(New Agrobacterium helper plasmids for genetransfer to plants(EHA105)).Trans Res.19932：208-218)。用广安(Kwangan)大豆植物进行转化。从大豆种子去除种皮后，通过外科手术刀(#11刀)切割下胚轴并使其损伤7-8次。将大约50个外植体与转化的农杆菌EHA105混合，将混合物超声处理20秒，然后温育30分钟进行接种。将其置于CCM(共培养基；0.32g/L Gamborg B5，4.26g/L MES，30g/L蔗糖，0.7％琼脂)培养基上。然后，将其在生长室(25℃，18小时光照/6小时黑暗)中共培养5天。

之后，将其在液体1/2SIM(枝条诱导培养基；3.2g/L B5盐，1.67mg/L BA，3mM MES，0.8％(w/v)琼脂，3％(w/v)蔗糖，250mg/L头孢噻肟，50mg/L万古霉素，100mg/L替卡西林，pH5.6)中洗涤10分钟并置于不含抗生素的SIM上并在生长室(25℃，18小时光照/6小时黑暗)中培养2周。

将枝条诱导的外植体移植到SIM-1(补充有10mg/L DL-草丁膦，pH 5.6的SIM培养基)上。将褐色的枝条移植到SEM上(枝条伸长培养基；4.4g/L MS盐，3mM MES，0.5mg/L GA3，50mg/L天冬酰胺，100mg/L焦谷氨酸，0.1mg/L IAA，1mg/L玉米素，3％(w/v)蔗糖，0.8％(w/v)琼脂，250mg/L头孢噻肟，50mg/L万古霉素，100mg/L替卡西林，5mg/L DL-草丁膦，pH5.6)。将高度为4cm的伸长的枝条转移到RIM(根诱导培养基；4.4g/L MS盐，3mM MES，3％蔗糖，0.8％琼脂，50mg/L头孢噻肟，50mg/L万古霉素，50mg/L替卡西林，25mg/L天冬酰胺，25mg/L焦谷氨酸，pH 5.6)。

当根充分生长时，将植物移至与蛭石混合的床土(Bioplug编号2，Farmhannong)，床土与蛭石以2∶1(v/v)混合。10天后，用100mg/L DL-膦丝菌素涂上叶片。

7-2.大豆转化体中导入基因的分析

为了分析CyPPO2 Y373M转化的大豆T₀植物(12、14、16、24、25、27、28、34和41号品系)和CyPPO8 F363M转化大豆T₁植物(3、5、7、9、11、14、17、36和44号品系)中导入基因的拷贝数中，参照实施例6-4，用每种转化植物的250mg叶片组织提取基因组DNA。

用EcoRI(Enzynomics)消化10-40μg基因组DNA过夜，按照实施例6-4中的方法进行DNA印迹。

通过PCR反应标记DIG(地高辛)-dNTP来制备用于杂交的Bar DNA探针。通过混合0.5μl模板(用于大豆转化的载体)、5μl 10X缓冲液、10μl DIG-dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP各自为0.5mM，dTTP为0.32mM，DIG-11-dUTP为0.18mM)、0.5μl正向引物(100μM)、0.5μl反向引物(100μM)、33μlDDW和0.5μl e-Taq(Solgent，2.5单位/μl)来制备PCR反应混合物(总共50μl)。在如下的条件下进行扩增：94℃下4分钟，1个循环；94℃下30秒，56℃下30秒和72℃下30秒钟，35个循环；72℃下5分钟，1个循环。

Bar探针引物：

Bar探针的正向引物：5′-TTC CGTACC GAG CCG CAG GA-3′(SEQ ID NO：163)

Bar探针的反向引物：5′-CGTTGG GCA GCC CGA TGA CA-3′(SEQ ID NO：164)

为了比较，将未转化的广安大豆(WT)的基因组DNA用作阴性对照。

结果在图51中示出。图51中胶片上显示的条带数量表示插入基因的数量。在未转化的广安大豆(WT)的情况下没有检测到条带，并且证明了单拷贝的CyPPO基因整合到CyPPO2 Y373M转化体14、25、34和41号品系中以及CyPPO8 F363M转化体3、5、7、11、14和17号品系中的广安大豆的基因组中。

在下文中，使用插入单拷贝的转化体品系，评估除草剂耐受性并测试CyPPO蛋白表达。

7-3.验证转化大豆的除草剂耐受性

为了检测CyPPO2 Y373M或CyPPO8 F363M转化的大豆植物的除草剂耐受性水平，将除草剂施用于大豆转化体(T₂代)。

将20μM的汰芬那(相当于42g ai/ha)或150μM(相当于315g ai/ha)或300μM(相当于630g ai/ha)的苯嘧磺草胺分别喷洒到V2～3阶段的大豆中。将上述浓度的100ml除草剂均匀喷洒在40×60cm的区域，5天后评价除草剂耐受性。用未转化的大豆(由广安大豆表示)作为对照。

图52示出了结果。当用20μM汰芬那处理时，未转化的广安大豆在各种除草剂处理下均以损伤指数9而死亡，然而CyPPO2 Y373M或CyPPO8 F363M转化体的损伤指数为1至3。当用150μM苯嘧磺草胺处理时，CyPPO2 Y373M转化体的损伤指数为0，当用300μM苯嘧磺草胺处理时，CyPPO8 F363M转化体的损伤指数为0。损伤指数由以下标准确定：

表22

结果表明，虽然野生型广安大豆经各浓度的除草剂处理均死亡，但用苯嘧磺草处理的转化体损伤较小，用苯嘧磺草胺处理的转化体几乎没有损伤。作为参考，CyPPO2 Y373M的汰芬那或苯嘧磺草胺的IC₅₀值分别为250nM或5,000nM，并且CyPPO8 F363M的汰芬那或苯嘧磺草胺的IC₅₀值分别为183nM或5,000nM(表10至11)。

7-4.转化大豆中蛋白表达的验证

检测了CyPPO2 Y373M蛋白或CyPPO8 F363M蛋白在转化植物中的表达。

为了检验蛋白表达，在每种转化体(T₁)中提取总蛋白并进行蛋白印迹分析。在用液氮研磨每种转化体的叶片组织后，添加蛋白提取缓冲液(0.8％SDS，4％甘油，2％β-巯基乙醇，0.0008％溴酚蓝，0.125M Tris-Cl，pH7.4)并提取总蛋白。

将提取的蛋白在SDS-PAGE凝胶中电泳并转移至PVDF膜。用对每种插入蛋白特异的抗体(用于CyPPO2 Y373M转化体的CyPPO2特异性抗体，用于CyPPO8F363M转化体的CyPPO8特异性抗体；GenScript)标记膜。

结果证明CyPPO2 Y373M蛋白或CyPPO8 F363M蛋白在所有转化体个体中表达(图53)。这表明转化体的除草剂耐受性是由CyPPO2 Y373M蛋白或CyPPO8 F363M蛋白的表达所赋予的。

实施例8.使用CyPPO变体产生油菜籽转化体和PPO抑制性除草剂耐受性试验

8-1.油菜籽转化体的产生

用在实施例5-1中构建的插入CyPPO8 F363M基因的载体产生油菜籽转化体。

将油菜籽的种子用70％(v/v)乙醇灭菌4分钟，然后用1.3％(v/v)次氯酸钠灭菌30分钟。用无菌水洗涤5次后，在无菌滤纸上除去水分，将种子移植到MSO培养基(4.43g/L MS盐，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，pH5.8)中，并且在光照条件下(16小时光照/8小时黑暗，25,000Lux)在25±1℃的培养室中培养5天。

用插入CyPPO8 F363M基因的载体转化农杆菌后，将其接种于补充有壮观霉素(100mg/L)和利福平(50mg/L)的LB培养基中，在振荡培养箱中于28℃下培养16小时。切下油菜籽植物的子叶和下胚轴并将其与农杆菌共培养3天(黑暗条件，25±1℃)。将接种的植物组织转移至选择培养基(4.43g/L MS盐，20g/L蔗糖，0.2mg/L NAA，8μM TDZ，0.01mg/L GA3，50μM硫代硫酸银，10mg/L PPT，500mg/L羧苄青霉素，4g/L植物凝胶，pH 5.8)中并在生长室(25±1℃，16小时光照/8小时黑暗)中培养。

每两周对接种的植物组织进行传代培养，然后将来自愈伤组织的再分化枝条转移至根诱导培养基(4.43g/L MS盐，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，3g/L活性炭，pH 5.8)，从而诱导根。将根诱导的小植物转移到盆中，然后使用切下的叶确认转化体。

8-2.转化体的除草剂耐受性的验证

将油菜籽转化体(T₁)和灵山油菜籽(野生型油菜籽，对照)的种子用50％(v/v)次氯酸钠灭菌30分钟后，用无菌水洗涤5次。将转化体播种在选择培养基(1/2MS，50nM汰芬那，pH 5.8)中，并将野生型油菜籽播种在1/2MS培养基中。将7天后存活的个体移植到盆中并在生长室(25±1℃，16小时光照/8小时黑暗)中培养。移植35天后，在放置了盆的每个托盘(40×60cm，0.24m²)分别用100mL(0.05％Silwet L-77)10μM的汰芬那和10μM的苯嘧磺草胺处理。

用除草剂处理后7天的结果在图54(汰芬那处理)和图55(苯嘧磺草胺处理)中示出。在图54和图55中，“灵山”代表野生型灵山油菜籽。通过评估伤害指数0至5(没有损伤到死亡；参见表17)，在表23中示出损伤水平：

表23

(NT：未测试)

对于10μM的汰芬那处理，虽然灵山(野生型油菜籽，对照)表现出损伤水平4，然而CyPPO8 F363M-2号品系表现出耐受性损伤水平1至2(图54)。此外，在10μM苯嘧磺草胺处理后，CyPPO8 F363M-2号品系没有表现出损伤(图55)。

8-3.转化油菜蛋白表达的验证

确认了CyPPO8 F363M油菜籽转化体中插入基因的表达。在CyPPO8F363M品系中，选择5个具有除草剂耐受性的个体(2-1、2-2、2-6、2-9和2-10)进行蛋白印迹。

在使用液氮和研杵研磨每种油菜籽转化体的约200mg叶片后，使用0.8mL苯酚(Tris缓冲液，pH8.0)和0.8mL浓SDS缓冲液(30％(w/v)蔗糖，2％(w/v)添加SDS，0.1M Tris-Cl，pH8.0，5％(v/v)β-巯基乙醇)并通过涡旋混合30秒，并以10,000×g离心3分钟。将上清液转移到新管中，添加5体积甲醇(4℃，0.1M乙酸铵)并混合，然后在-20℃下放置30分钟。通过以10,000×g离心5分钟沉淀蛋白，并用1mL甲醇(4℃，0.1M乙酸铵)洗涤两次和用80％丙酮(4℃)洗涤两次，以及干燥。将干燥的蛋白用2％(w/v)SDS缓冲液(50mMTris-Cl，pH 6.8，1mM DTT)溶解。

由于用HA标签构建CyPPO8 F363M载体(参见实施例5-1)，所以用HA抗体(SantaCruz)进行蛋白印迹以证实CyPPO8 F363M蛋白表达。

蛋白印迹结果在图56的上图中示出。已证实CyPPO8蛋白在除灵山(野生型油菜籽，对照)之外的所有个体中表达。这样的结果表明除草剂耐受性是由导入基因的蛋白表达所赋予的。

另外，PVDF膜的考马斯蓝染色结果在图56的下图中示出。结果表明，每个样品的蛋白含量几乎相等。

Claims (21)

1.一种多肽，选自以下：

(1)由以下氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的Y373V、Y373I、Y373T、Y373L、Y373C、Y373M、A175C、A175L、V318M、R92A、V173C、F337V、L340T或I353T的氨基酸突变中的一种；和

(2)由以下氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列包含：

(i)SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的Y373V、Y373I、Y373L或Y373M，以及

(ii)选自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的A175C、A175L或A175I，

V318M或V318T，

R92A，和

V173S、V173C、V173T或V173L组成的组中的一种或两种。

2.权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的Y373M、Y373V、Y373I、Y373T、Y373L、Y373C、A175C、A175L、V318M、R92A、V173C、F337V、L340T、I353T、R92A+Y373M、V173S+Y373M、V173S+Y373I、V173S+Y373L、V173S+Y373V、V173C+Y373M、V173C+Y373I、V173T+Y373M、V173T+Y373I、V173L+Y373M、A175L+Y373M、A175L+Y373I、A175C+Y373M、A175C+Y373I、A175I+Y373M、V318M+Y373M、V318M+Y373I、V318M+Y373V、V318T+Y373I、V173S+V318M+Y373M、V173S+A175C+Y373M、A175C+V318M+Y373M或A175L+V318M+Y373M的氨基酸突变中的一种。

3.一种多肽，选自以下：

(1)由以下氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的R85A、F363M、F363V、F363L、F363C、F363I、F363T、A162C、A162L、V308M、V160C、I343T、F156A、F327V或L330T的氨基酸突变中的一种；以及

(2)由以下氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列包含：

(i)SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的F363M、F363V、F363L或F363I，以及

(ii)选自由SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的R85A，

A162C或A162L，

V308M，以及

V160S或V160C组成的组中的一种或两种氨基酸突变。

4.权利要求3所述的多肽，其中，所述多肽由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的R85A、F363M、F363V、F363L、F363C、F363I、F363T、A162C、A162L、V308M、V160C、I343T、F156A、F327V、L330T、R85A+F363M、R85A+F363I、R85A+A162L+F363M、R85A+A162L+F363I、R85A+A162C+F363M、R85A+A162C+F363I、R85A+V308M+F363M、V160S+F363M、V160S+F363I、V160S+V308M+F363I、A162L+F363M、A162C+F363M、A162C+F363I、A162C+F363L、A162C+V308M+F363M、A162C+V308L+F363M、V308M+F363M或V308M+F363I的氨基酸突变中的一种。

5.一种编码权利要求1至4中任一项所述的多肽的多核苷酸。

6.一种包含权利要求5所述的多核苷酸的重组载体。

7.一种包含权利要求6所述的重组载体的转化细胞。

8.一种用于赋予或增强植物的除草剂耐受性的组合物，其包含选自由以下组成的组中的一种或多种：权利要求1至4中任一项所述的多肽；编码所述多肽的多核苷酸；包含所述多核苷酸的重组载体；和包含所述重组载体的转化细胞。

9.权利要求8所述的组合物，其中，所述除草剂是原卟啉原氧化酶抑制性除草剂。

10.权利要求9所述的组合物，其中，所述除草剂是选自由嘧啶二酮、二苯基醚、苯基吡唑、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、苯基酯、噻二唑、

二唑、三唑啉酮、

唑烷二酮、双唑草腈、氟哒嗪草酯和氟唑草胺组成的组中的一种或多种。

11.权利要求10所述的组合物，其中，所述除草剂是选自由以下组成的组中的一种或多种：氟丙嘧草酯、苯嘧磺草胺、双苯嘧草酮、汰芬那、氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、苯草醚、三氟羧草醚、治草醚、氯乳醚、乳氟禾草灵、甲氧除草醚、氯除草醚、乙羧氟草醚、氟硝磺酰胺、氟唑草酯、异丙吡草酯、丙炔氟草胺、吲哚酮草酯、氟烯草酸、嗪草酸、噻二唑草胺、丙炔

草酮、

草酮、唑酮草酯、甲磺草胺、唑啶草酮、环戊

草酮、双唑草腈、氟哒嗪草酯、氟唑草胺、吡落草、吡落草的氨基甲酸酯类似物及其农业上可接受的盐。

12.权利要求8所述的组合物，其中，所述植物还包含第二除草剂耐受性多肽或其编码基因，并且赋予或增强对所述第二除草剂的耐受性。

13.权利要求12所述的组合物，其中，所述第二除草剂选自由草甘膦、草铵膦、麦草畏、2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)、异

唑草酮、ALS(乙酰乳酸合酶)抑制性除草剂、光系统II抑制性除草剂、苯脲基除草剂、溴苯腈基除草剂及其组合组成的组。

14.权利要求12所述的组合物，其中，所述第二除草剂耐受性多肽是选自由以下组成的组中的一种或多种：

草甘膦除草剂耐受性EPSPS(草甘膦抗性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)、GOX(草甘膦氧化酶)、GAT(草甘膦-N-乙酰转移酶)或草甘膦脱羧酶；

草铵膦除草剂耐受性PAT(草丁膦-N-乙酰转移酶)；

麦草畏除草剂耐受性DMO(麦草畏单加氧酶)；

2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)除草剂耐受性2,4-D单加氧酶或AAD(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)；

ALS(乙酰乳酸合酶)抑制性磺酰脲基除草剂耐受性AHAS(乙酰羟酸合酶)、AHAS(乙酰羟酸合酶)或AtAHASL(乙酰羟酸合酶大亚基)；

光系统II抑制性除草剂耐受性光系统II蛋白D1；

苯脲除草剂耐受性细胞色素P450；

质体抑制性除草剂耐受性HPPD(羟基苯丙酮酸双加氧酶)；

溴苯腈除草剂耐受性腈水解酶；

及其组合。

15.权利要求12所述的组合物，其中，所述第二除草剂耐受性多肽的编码基因是选自由以下组成的组中的一种或多种：

草甘膦除草剂耐受性cp4 epsps、mepsps、2mepsps、goxv247、gat4601或gat4621基因；

草铵膦除草剂耐受性BAR或PAT基因；

麦草畏除草剂耐受性dmo基因；

2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)除草剂耐受性AAD-1或AAD-12基因；

异

唑草酮除草剂耐受性HPPDPF W336基因；

磺酰脲除草剂耐受性ALS、Csr1、Csr1-1、Csr1-2、GM-HRA、S4-HRA、Zm-HRA、SurA或SurB基因；

光系统II抑制性除草剂耐受性psbA基因；

苯脲除草剂耐受性CYP76B1基因；

溴苯腈除草剂耐受性bxn基因；

及其组合。

16.一种制备具有除草剂耐受性的转基因植物的方法，所述方法包括用权利要求1至4中任一项所述的多肽、或编码所述多肽的多核苷酸转化植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、枝条或整株植物。

17.一种赋予或增强植物的除草剂耐受性的方法，所述方法包括用权利要求1至4中任一项所述的多肽、或编码所述多肽的多核苷酸转化植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、枝条或整株植物。

18.一种控制农田中杂草的方法，所述方法包括：

向所述农田提供植物，所述植物包含权利要求1至4中任一项所述的多肽、或编码所述多肽的多核苷酸；和

将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于所述农田。

19.权利要求18所述的方法，其中，所述将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于所述农田的步骤通过依次或同时施用有效剂量的两种或更多种原卟啉原氧化酶抑制性除草剂来进行。

20.权利要求18所述的方法，其中，所述植物还包含第二除草剂耐受性多肽或其编码基因，并且

所述将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于所述农田的步骤通过依次或同时施用有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂和第二除草剂来进行。

21.一种从培养基中除去不希望的水生生物的方法，所述方法包括：

向培养基提供藻类，所述藻类包含权利要求1至4中任一项所述的多肽、或编码所述多肽的多核苷酸；以及

将有效剂量的原卟啉原氧化酶抑制性除草剂施用于培养基。

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