CN109385418B

CN109385418B - 一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法及试剂

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Publication number: CN109385418B
Application number: CN201711138666.3A
Authority: CN
Inventors: 尤其敏; 朱勤锋; 朱罗罗; 袁旦一; 李玲; 饶焕新; 刘莹; 孙刚; 胡江文; 赵博熹; 胡林; 何谦
Original assignee: Ustar Biotechnologies Hangzhou Ltd
Current assignee: Hangzhou Yousida Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2037-11-16
Also published as: CN109385418A

Abstract

本发明公开了一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法及试剂，取动物样本，加入裂解液进行室温裂解，得到裂解反应液；再向裂解反应液中加入乙醇溶液，移至含硅胶吸附膜离心柱，然后采用低速离心的方式进行吸附、清洗和洗脱。本发明提取的病毒核酸纯度高，在提取过程中不需要使用蛋白酶K消化样本，简化了试剂组分和操作流程；且过程中采用低速离心的方式，可以降低硬件设备的成本，可以采用低速掌上离心机，也便于携带，适合现场操作。本发明还优化了裂解液组分，增强了核酸分子与硅胶吸附膜的结合能力，确保了良好的核酸提取效率。

Description

一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法及试剂

技术领域

本发明属于核酸提取领域，具体地说，涉及一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法及试剂。

背景技术

从动物血清中提取核酸是分子生物学研究中经常使用的重要的实验技术。提取获得DNA和RNA模板，可用于相关细菌或病毒的分子检测。

离心柱法是最常用的核酸提取方法之一。该方法利用核酸分子在高盐低pH环境下与硅胶吸附膜结合，低盐高pH环境下与硅胶吸附膜分离的特性，可从痰液、血液、尿液等多种类型的样本中特异性地富集和纯化核酸模板。配合高速离心机或自动化的核酸提取仪，离心柱法具有通量大、速度快、提取效率高、模板纯度好等优点，能满足大多数临床实验室的检验要求。

近年来，利用离心柱法提取血液病毒核酸的试剂盒种类日益丰富。这些产品大多需要蛋白酶K消化样本，并且依赖高速离心机才能将实现核酸的吸附、清洗和洗脱过程。这些产品对蛋白酶K和高速离心机的依赖，极大地限制了产品的便携性和时效性，导致核酸提取以及后续的分子检测过程往往局限在分子实验室中，而不能在第一时间、在采样现场当场进行。因此，开发一种不依赖蛋白酶K、高速离心机以及其他昂贵设备的核酸提取方法及试剂，对核酸提取乃至分子检测技术的推广普及，具有重要意义。

专利申请201110177638.9公开了一种从生物样品中提取游离RNA的方法，其具体步骤包括：用化学试剂将生物样品中的核酸释放出来；酚氯仿抽提出游离RNA；抽提出的游离RNA在高盐条件下与硅胶吸附膜结合；洗涤去除杂质；低盐条件下洗脱，得到高纯度的游离RNA。该专利的不足之处在于，使用了具有毒性的酚氯仿试剂，以及转速10,000g以上的高速离心机。

专利申请201010281633.6公开了一种同时高效提取DNA和RNA的方法和试剂。该专利不使用酚氯仿等有毒试剂，采用含有玻璃纤维膜的离心柱吸附核酸分子，同时结合去除多糖多酚类杂质的助提剂，显著提高了对植物类核酸的提取效率。尽管如此，该专利在操作过程中依然需要使用转速8,000g以上的高速离心机。

专利申请201210058721.9，公开了一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，通过向抗凝血中加入蛋白酶K和其他试剂，实现了核酸的结合、洗涤和洗脱过程。尽管该专利使用了2,000g的低转速离心机，但是提取得到的大核酸片段主要是来自白细胞的真核基因组核酸，并不适合纯化小片段的病毒基因组核酸。

本发明针对现有技术对高速离心机和蛋白酶K的依赖，提出了一种更为简洁的核酸提取方法及试剂。该方法操作简单便捷，不使用蛋白酶K、高速离心机或其他昂贵设备，仅用廉价便携的低转速掌上离心机就可以完成血液样本中病毒核酸的纯化，因而具有更加广泛的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取方法及试剂。本发明的提取方法适用于提取动物(包括人)的组织、血清/血浆、分泌液游离核酸，更适用于提取血液病毒核酸，提取的病毒核酸纯度高，在提取过程中不需要使用蛋白酶K消化样本，简化了试剂组分和操作流程；且采用低速离心的方式，可以降低硬件设备的成本，也便于携带，适合现场操作。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法，取动物血清或者血浆为样本，加入裂解液进行室温裂解，得到裂解反应液；再向裂解反应液中加入乙醇溶液，移至含硅胶吸附膜离心柱，然后采用低速离心的方式进行吸附、清洗和洗脱。

本发明针对现有技术中提取病毒/细菌核酸过程中对高速离心机和蛋白酶K的依赖，提出了一种更为简洁的核酸提取方法及试剂。不使用蛋白酶K、采用本发明的裂解液使动物样本在室温下可以实现完全裂解，并将绝大部分蛋白溶解，避免堵塞离心柱，因此可以采用低速离心的方式进行吸附、清洗和洗脱。该方法操作简单便捷，不需要高速离心机或其他昂贵设备，仅用廉价便携的低转速掌上离心机就可以完成血液样本中病毒核酸的纯化，也更适合现场操作，因而具有更加广泛的应用前景。

进一步的方案，所述的裂解液包括尿素和硫氰酸胍，所述尿素的含量为5～8mol/L，所述硫氰酸胍的含量为3～5mol/L；

优选的，所述的尿素的含量为7～8mol/L，硫氰酸胍的含量为3～4mol/L。

硫氰酸胍破坏蛋白质三维结构，导致蛋白溶解，变性，尿素优先与变性蛋白结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起N-D反应平衡向右移动，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性。单独采用硫氰酸胍或尿素，虽然可以起到使蛋白变性、溶解的作用，但单独使用胍盐或尿素的常规裂解液中，水分含量一般高达50％～60％，由于核酸分子具有溶解于水，不溶于乙醇的特性，因此，常规的裂解液中会溶解较多的核酸，不利于核酸的沉淀析出。

本发明经过多次实验惊喜的发现，将硫氰酸胍和尿素联用起到了意想不到的有益的效果，主要体现在三个方面：第一，硫氰酸胍和尿素都具有溶解蛋白质的能力，两者联用使血清样本中蛋白组分的溶解更加充分，即使加入乙醇，样本中也不会出现变性的蛋白颗粒，堵塞核酸吸附膜，因而使本发明可以在低转速条件下离心过滤样本；第二，硫氰酸胍和尿素联用，不仅可以在室温条件下溶解病毒颗粒的蛋白外壳，释放病毒核酸分子，而且可以抑制血清样本中的核酸酶活性，保护核酸分子不被降解，因而使血清样本的处理摆脱了对蛋白酶K的依赖；第三，可以使本发明中裂解液的水分含量减少为10％，因此在相同的实验条件下，本发明中的裂解液比常规裂解液更能促进核酸分子从样本中沉淀析出。

进一步的方案，裂解液中包括水分，水分的含量不大于10wt％；优选的，水分的含量不大于8wt％。

本申请采用高浓度的硫氰酸胍和尿素，裂解液中水分的含量很低，最高不大于10wt％；如此低含量的水分也为核酸的沉淀析出提供了前提条件。硫氰酸胍和尿素协同作用，能够在短时间内快速溶解蛋白，溶解病毒外壳，释放核酸分子，抑制核酸酶活性，保护核酸分子。

进一步的方案，所述的裂解液还包括乙二胺四乙酸二钠、表面活性剂和缓冲剂；表面活性剂选自吐温-20和月桂酰肌氨酸钠；缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷；

优选的，所述裂解液中含有硫氰酸胍3～5mol/L、尿素5～8mol/L、氯化钠0.05～0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠10～30mmol/L、三羟甲基氨基甲烷10～30mmol/L、吐温-20 3～6wt％、月桂酰肌氨酸钠0.3～0.8wt％；

更优选的，裂解液中含有硫氰酸胍3～4mol/L、尿素7～8mol/L、氯化钠0.05～0.1mol/L、乙二胺四乙酸二钠20～30mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20～30mmol/L、吐温-20 4～5wt％、月桂酰肌氨酸钠0.4～0.5wt％。

本发明的裂解液中含有硫氰酸胍、尿素、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、表面活性剂和缓冲剂。其中硫氰酸胍和尿素的主要作用是在常温条件下溶解样本中的蛋白质组分：一方面，抑制核酸酶活性，保护核酸分子；另一方面，溶解病毒外壳，释放核酸分子。此外，硫氰酸胍还可以提供高盐环境，增强硅胶吸附膜对核酸分子的吸附能力；乙二胺四乙酸二钠的作用为螯合二价金属离子，抑制核酸酶的活性；表面活性剂的作用为促进病毒外壳的溶解，辅助核酸分子的释放。

进一步的方案，所述的样本与裂解液的体积比为5：3～6，优选5：4～6。

进一步的方案，样本的裂解的条件为：常温下静置10-15分钟；优选15分钟。

进一步的方案，所述的低速离心的相对离心力不大于2000×g，离心1-3min，优选离心1min。

进一步的方案，乙醇溶液的浓度为90～98v/v％，优选95～98v/v％；乙醇溶液所加入的体积为裂解反应液体积的0.3～0.7倍，优选0.4～0.6倍。

本发明在样本裂解后加入乙醇溶液。乙醇不仅可以竞争核酸分子周围的水分子，而且其介电常数比裂解液更低，可以促进溶液中带正电荷的钠离子中和核酸分子的磷酸根基团，从而降低核酸分子的溶解度，使其以中性微粒的形式从溶液中沉淀析出。

进一步的方案，清洗时采用清洗液，洗脱时采用洗脱液；

优选的，所述的清洗液为浓度为0.1～0.4mol/L的醋酸钠溶液；浓度优选0.2～0.3mol/L；

优选的，所述洗脱液为浓度为2～5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，优选2.5～3mmol/L。

本发明还优化了清洗液和洗脱液组分，以保障良好的核酸提取效率。清洗液含有醋酸钠，可以中和核酸分子负电荷，减少清洗过程中的核酸损失。洗脱液中含微量三羟甲基氨基甲烷，使洗脱体系维持在pH值8.0的弱碱性环境。与中性和酸性条件相比，弱碱性溶液更好地帮助核酸从吸附膜上洗脱。

进一步的方案，动物样本选自动物组织、体液、分泌液；所述动物组织选自肝脏组织，体液选自血清、血浆，分泌液选自精液；

优选的，动物样本选自动物血清、血浆。

作为一种具体的实施方案，提取方法为：

1.裂解样本：取动物血清或者血浆，加入裂解液得到裂解反应液，吹打混匀，常温静置处理；前处理样本与裂解液的体积比为5：3～6，优选5：4～6；

2.吸附：待静置完毕后，加入95％～98％乙醇混匀，转移至离心柱中，低速离心1min，将待测样本中的核酸分子吸附在滤膜上，弃去滤液；乙醇溶液所加入的体积为裂解反应液体积的0.3～0.7倍，优选0.4～0.6倍；

3.清洗：加入适量清洗液，清洗滤膜，低速离心1min，弃去滤液；并可重复1～2次；

4.洗脱：加入适量洗脱液，静置1分钟，低速离心1min，洗脱液流经滤膜将吸附在膜上的核酸成分洗脱，得到核酸水溶液。

本发明的第二目的是提供一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的试剂，所述试剂包括：裂解液、裂解后处理液、清洗液、洗脱液；

所述的裂解液包括：所述裂解液中含有硫氰酸胍3～5mol/L、尿素5～8mol/L、氯化钠0.05～0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠10～30mmol/L、三羟甲基氨基甲烷10～30mmol/L、吐温-20 3～6wt％、月桂酰肌氨酸钠0.3～0.8wt％；

优选的，裂解液包括：硫氰酸胍3～4mol/L、尿素7～8mol/L、氯化钠0.05～0.1mol/L、乙二胺四乙酸二钠20～30mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20～30mmol/L、吐温-20 4～5wt％、月桂酰肌氨酸钠0.4～0.5wt％；

裂解后处理液为90～98v/v％的乙醇溶液，优选95～98v/v％的乙醇溶液；

所述清洗液为0.1～0.4mol/L的醋酸钠溶液，优选0.2～0.3mol/L；

所述洗脱液为2～5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，优选2.5～3mmol/L。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明的裂解液裂解病毒的效率高、效果好，无需使用蛋白酶K消化样本，加入裂解液后只需室温静置(优选15分钟)就能够充分溶解动物血液/血浆样本，不仅简化了试剂组份，而且无需加热设备，简化了操作流程。不需要使用蛋白酶K也就不需要准备用于存贮蛋白酶K所需的冰箱，为用户减少消耗成本。

2、本发明在裂解的同时，能够将绝大部分甚至全部的蛋白溶解，不会形成蛋白颗粒堵塞离心柱，因此低速离心(相对离心力不大于2000×g)就可以达到分离的目的，不需要昂贵的高速离心机，只需要廉价的掌上离心机就可操作，如此，不仅降低了硬件设备的成本，而且低速离心机更容易携带，适合现场操作；

3.本发明中提取的核酸为病毒或细菌的总核酸，包括DNA和RNA。一份样本提取得到的核酸可分别进行RNA类病毒和DNA类病毒的检测，大大节省了用户的时间成本和经济成本。同时，提取得到的核酸模板纯度高，可满足多种检测需求。本发明的裂解液还增强了核酸分子与硅胶吸附膜的结合能力，确保了良好的核酸提取效率。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是对比例1中的猪蓝耳病毒阳性血清样本的核酸提取效果验证电泳图；

图2是对比例2中的猪圆环病毒阳性血浆样本的核酸提取效果验证电泳图；

图3是对比例3中的猪蓝耳病毒阳性肝脏研磨液的核酸提取效果验证电泳图；

图4是对比例4中的猪蓝耳病毒阳性精液样本的核酸提取效果验证电泳图。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

1.裂解样本：取0.2ml牛血清样本至1.5ml离心管，加入0.2ml裂解液，震荡混匀，室温静置15分钟，得到裂解反应液；

裂解液中含有硫氰酸胍4mol/L、尿素7mol/L、氯化钠0.1mol/L、乙二胺四乙酸二钠20mmol/L、三羟甲基氨基甲烷20mmol/L、吐温-20 5wt％、月桂酰肌氨酸钠0.5％；

2.吸附核酸：向裂解反应液中加入0.24ml乙醇，乙醇的体积浓度为95％，充分混匀后，将液体转移至离心柱中，将离心柱至于掌上离心机中。1000×g离心1分钟，弃去收集管中的液体，并将离心柱放回收集管；

3.清洗：向离心柱中加入0.5ml清洗液，将离心柱至于掌上离心机中。2000×g离心1分钟，弃去收集管中的液体；并重复清洗一次；清洗液为0.3mol/L的醋酸钠溶液。

4.空甩：将空离心柱置于掌上离心机中，2000×g离心3分钟，以充分去除残余液体，丢弃收集管，将离心柱至于洁净的新收集管中；

5.洗脱：向离心柱的滤膜中央中滴加50μl洗脱液，室温静置1分钟。将离心柱置于掌上离心机中，2000×g离心1分钟，收集管中的滤液可直接用于核酸扩增或检测；洗脱液为3mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液。

实施例二

1.裂解样本：取0.2ml猪血浆样本至1.5ml离心管，加入0.2ml裂解液，震荡混匀，室温静置15分钟，得到裂解反应液；

裂解液中含有硫氰酸胍3mol/L、尿素5mol/L、氯化钠0.05mol/L、乙二胺四乙酸二钠10mmol/L、三羟甲基氨基甲烷10mmol/L、吐温-20 3wt％、月桂酰肌氨酸钠0.3％；

2.吸附核酸：向裂解反应液中加入0.12ml乙醇，乙醇的体积浓度为98％，充分混匀后，将液体转移至离心柱中，将离心柱至于掌上离心机中。500×g离心1分钟，弃去收集管中的液体，并将离心柱放回收集管；

3.清洗：向离心柱中加入0.5ml清洗液，将离心柱至于掌上离心机中。2000×g离心1分钟，弃去收集管中的液体；并重复清洗一次；清洗液为0.1mol/L的醋酸钠溶液。

5.洗脱：向离心柱的滤膜中央中滴加50μl洗脱液，室温静置1分钟。将离心柱置于掌上离心机中，2000×g离心1分钟，收集管中的滤液可直接用于核酸扩增或检测；洗脱液为2.5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液。

实施例三

1.裂解样本：取0.3ml牛血浆样本至1.5ml离心管，加入0.3ml裂解液，震荡混匀，室温静置10分钟，得到裂解反应液；

裂解液中含有硫氰酸胍5mol/L、尿素8mol/L、氯化钠0.2mol/L、乙二胺四乙酸二钠30mmol/L、三羟甲基氨基甲烷30mmol/L、吐温-20 6wt％、月桂酰肌氨酸钠0.8wt％；

2.吸附核酸：向裂解反应液中加入0.42ml乙醇，乙醇的体积浓度为95％，充分混匀后，将液体转移至离心柱中，将离心柱至于掌上离心机中。2000×g离心1分钟，弃去收集管中的液体，并将离心柱放回收集管；

3.清洗：向离心柱中加入0.5ml清洗液，将离心柱至于掌上离心机中。2000×g离心1分钟，弃去收集管中的液体；并重复清洗一次；清洗液为0.4mol/L的醋酸钠溶液。

5.洗脱：向离心柱的滤膜中央中滴加50μl洗脱液，室温静置1分钟。将离心柱置于掌上离心机中，2000×g离心1分钟，收集管中的滤液可直接用于核酸扩增或检测；洗脱液为5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液。

实施例四

裂解液中含有硫氰酸胍4mol/L、尿素7mol/L、氯化钠0.1mol/L、乙二胺四乙酸二钠25mmol/L、三羟甲基氨基甲烷25mmol/L、吐温-20 4wt％、月桂酰肌氨酸钠0.4wt％；

2.吸附核酸：向裂解反应液中加入0.16ml乙醇，乙醇的体积浓度为90％，充分混匀后，将液体转移至离心柱中，将离心柱至于掌上离心机中。1500×g离心1分钟，弃去收集管中的液体，并将离心柱放回收集管；

3.清洗：向离心柱中加入0.5ml清洗液，将离心柱至于掌上离心机中。1500×g离心1分钟，弃去收集管中的液体；并重复清洗一次；清洗液为0.2mol/L的醋酸钠溶液。

5.洗脱：向离心柱的滤膜中央中滴加50μl洗脱液，室温静置1分钟。将离心柱置于掌上离心机中，2000×g离心1分钟，收集管中的滤液可直接用于核酸扩增或检测；洗脱液为2mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液。

实施例五

一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的试剂，包括：裂解液、裂解后处理液、清洗液、洗脱液；其组成成分如表1所示：

表1用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的试剂(一份)

实施例六

一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的试剂，包括：裂解液、裂解后处理液、清洗液、洗脱液；其组成成分如表2所示：

表2用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的试剂(十份)

实施例七

一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的试剂，包括：裂解液、裂解后处理液、清洗液、洗脱液；其组成成分如表3所示：

表3用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的试剂(五十份)

实施例八

一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的试剂，包括：裂解液、裂解后处理液、清洗液、洗脱液；其组成成分如表4所示：

表4用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的试剂(一百份)

实验例1

向4组0.2ml牛血清样本中加入10μl的猪蓝耳病毒RNA，浓度分别为4×10³copy/μl，4×10⁴copy/μl，4×10⁵copy/μl，4×10⁶copy/μl，每组6个平行。按照实施例一的方法提取猪蓝耳病毒RNA，对提取后的模板进行RT-PCR定量核酸扩增，来检测并计算核酸提取效率，结果如表5所示。

其中，RT-PCR定量核酸扩增采用猪蓝耳病毒核酸检测试剂，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。核酸扩增操作依据产品说明书进行。

表5牛血清样本核酸提取效率

	提取效率	平均提取效率
			4×10<sup>4</sup>copies	39.0％～49.6％	40.6％
4×10<sup>5</sup>copies	37.0％～50.6％	43.2％
			4×10<sup>6</sup>copies	20.6％～49.2％	41.4％
4×10<sup>7</sup>copies	37.6％～51.4％	44.6％

如表5所示，采用实施例一的试剂和方法，从牛血清中提取的猪蓝耳病毒核酸的提取效率均在40％以上，提取效率高且稳定。

实验例2

本实验例采用实施例一的试剂为实验组1，采用市售的需要蛋白酶K和高速离心机的血清游离核酸提取试剂盒为对照组1，分别检测在低转速条件下的试剂残留量。由于裂解液和清洗液含有酶抑制剂，若液体残留量过多将导致后续分子检测的失败，不利于后期实验。

向0.2ml猪血浆样本中加入0.2ml裂解液，室温静置15min，按照实施例一的方法操作，分别用500g，1000g，1500g，2000g的转速进行离心，称重离心柱的液体残留量。每组10只离心柱同时称重，结果如表6所示。

表6实验组1和对照组1在低转速条件下的试剂残留量

如表6所示，吸附核酸时，对照组1在转速低于2000g的低速条件下均无法滤过，而实验组1的均可以滤过，同时在2000g时残留量也较小。清洗和空甩时，采用低速离心后，实验组1的离心柱的液体残留量明显小于对照组1，液体残留量仅为对照组1的三分之一，说明本发明的试剂和提取方法能够采用低速离心(小于2000g)的方式，可以降低硬件设备的成本，可以采用低速掌上离心机，也便于携带，适合现场操作。

实验例3

本实验例的实验组1采用实施例一的方法和试剂，对照组1与实验组1的区别在于裂解液中不加尿素，其它的试剂和方法相同；对照组2与实验组1的区别在于裂解液中不加硫氰酸胍，其它的试剂和方法相同，

向3组0.2ml牛血清样本中加入10μl的猪蓝耳病毒RNA，浓度均为4×10⁶copy/μl，每组6个平行。采用实验组1、对照组1和对照组2的试剂和方法分别提取3组牛血清样本中的猪蓝耳病毒RNA，并对提取后的3组模板分别进行RT-PCR定量核酸扩增，来检测并计算核酸提取效率，结果如表7所示。

表7不同提取试剂提取牛血清样本核酸提取效率

	裂解液中水分含量wt％	提取效率	平均提取效率
				对照组1	53wt％	15.0％～22.7％	17.3％
对照组2	55wt％	11.2％～15.9％	13.1％
				实验组1	9wt％	43.3％～45.8％	44.2％

如表7中所示，裂解液中不添加尿素的对照组1和不添加硫氰酸胍的对照组2，裂解液中的水分含量均很高，而平均核酸提取效率在11.2-22.7％。实验组的裂解液的水分含量为9wt％，远低于对照组，而平均核酸提取效率为44.2％，比对照组1高26.9％，比对照组2高31.1％，说明本发明中添加的尿素和硫氰酸胍起到了协同作用，在增强蛋白溶解性能的同时，有利于核酸的沉淀析出，大大提高了核酸提取效率。

对比例1

采用实施例一的试剂和方法提取猪血清样本中的猪蓝耳病毒RNA，为实验组，采用市售的需要蛋白酶K和高速离心机的血清游离核酸提取试剂盒为对照试剂，即为对照组。

取同一份猪蓝耳病毒阳性的血清样本，分别取10μl，50μl，100μl血清，用生理盐水补足体积至0.2ml。按照实施例一的方法，或按照对照试剂的操作说明书，提取猪蓝耳病毒RNA。实验组和对照组分别提取得到的模板，利用进行RT-PCR扩增，并作2％琼脂糖电泳，电泳结果如图1所示。

其中，核酸扩增采用猪蓝耳病毒核酸检测试剂，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。核酸扩增操作依据产品说明书进行。

由图1可以看出，实验组中利用实施例一的试剂和方法提取的模板，RT-PCR扩增出的条带明显比对照组获得的条带亮度高，清晰度好。在体系、条件均相同的情况下，说明本发明实施例一的试剂盒方法提取的病毒核酸的浓度高、效果更好。

对比例2

采用实施例一的试剂和方法提取猪血浆样本中猪圆环病毒DNA，为实验组。采用市售的需要蛋白酶K和高速离心机的血清游离核酸提取试剂盒为对照试剂1，即为对照组1。采用市售的不需要离心机的无仪器核酸提取试剂盒为对照试剂2，即为对照组2。核酸提取操作依照产品说明书进行。

取同一份猪圆环病毒阳性的血浆样本，分别取10μl，50μl，100μl血浆，用生理盐水补足体积至0.2ml。按照实施例一的方法，或对照试剂的操作说明书，提取猪圆环病毒DNA。实验组和对照组分别提取得到的模板，分别进行常规PCR扩增，并作2％琼脂糖电泳，电泳结果如图2所示。

其中，核酸扩增采用猪圆环病毒核酸检测试剂，采购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。核酸扩增操作依据产品说明书进行。

由图2可以看出，实验组利用实施例一的试剂提取的模板，RT-PCR扩增出的条带明显比对照组1和对照组2获得的条带亮度高，清晰度好。在体系、条件均相同的情况下，说明本发明实施例一的试剂盒方法提取的病毒核酸的浓度高、效果更好。

对比例3

采用实施例一的试剂和方法提取猪组织样本中猪蓝耳病毒RNA，为实验组，采用市售的需要蛋白酶K和高速离心机的血清游离核酸提取试剂盒为对照试剂，即为对照组。

取猪蓝耳病毒阳性的猪肝脏组织研磨液，分别取10μl，50μl，100μl组织悬液，用生理盐水补足体积至0.2ml。按照实施例一的方法，或对照试剂的操作说明书，提取猪蓝耳病毒RNA。实验组和对照组分别提取得到的模板，同时进行RT-PCR扩增，并作2％琼脂糖电泳，结果如图3所示。

由图3可以看出，实验组利用实施例一的试剂提取的模板，RT-PCR扩增出的条带明显比对照组获得的条带亮度高，清晰度好。在体系、条件均相同的情况下，说明本发明实施例一的试剂盒方法提取的病毒核酸的浓度高、效果更好。

对比例4

采用实施例一的试剂和方法提取猪精液样本中提取猪蓝耳病毒RNA，为实验组，采用市售的需要蛋白酶K和高速离心机的血清游离核酸提取试剂盒为对照试剂，即为对照组。

取患有猪蓝耳病的猪精液样本，分别取10μl，50μl，100μl精液样本，用生理盐水补足体积至0.2ml。按照实施例一的方法，或对照试剂的操作说明书，提取猪蓝耳病毒RNA。实验组和对照组分别提取得到的模板，同时进行RT-PCR扩增，并作2％琼脂糖电泳，结果如图4所示。

对照组中，除了100μl样本组的有较浅的条带，对照组其它样本没有扩增出，说明模板提取效果不好，浓度很低。本发明的试剂提取的50μl，100μl样本的均有条带，说明可以提取出精液中的病毒核酸，但相比血浆、血清的样本效果稍差。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims

1.一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法，其特征在于，取动物样本，加入裂解液进行室温裂解，得到裂解反应液；再向裂解反应液中加入体积浓度为95%的乙醇溶液，移至含硅胶吸附膜离心柱，然后采用低速离心的方式进行吸附、清洗和洗脱；

所述裂解液中含有硫氰酸胍 4mol/L、尿素 7 mol/L、氯化钠 0.1 mol/L、乙二胺四乙酸二钠 20 mmol/L、三羟甲基氨基甲烷 20 mmol/L、吐温-20 5 wt %、月桂酰肌氨酸钠 0.5wt %；

清洗时采用清洗液，洗脱时采用洗脱液；所述清洗液为0.3mol/L的醋酸钠溶液；所述洗脱液为3 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液；所述动物样本为血清或血浆。

2.根据权利要求1所述的一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法，其特征在于，所述动物样本与裂解液的体积比为5：3～6，动物样本的裂解的条件为：室温下静置10-15分钟。

3.根据权利要求2所述的一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法，其特征在于，所述动物样本与裂解液的体积比为5：4～6。

4.根据权利要求2所述的一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法，其特征在于，动物样本的裂解的条件为：室温下静置15分钟。

5.根据权利要求1-4任一所述的一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法，其特征在于，所述的低速离心的相对离心力不大于2000×g，离心1-3min。

6.根据权利要求5所述的一种用于动物样本中病毒/细菌核酸提取的方法，其特征在于，离心1min。