CN111808721B - 一种核酸提取芯片及采用其快速提取血液dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种核酸提取芯片，主要由圆盘形本体以及围绕其中心环形排列的若干个离心通道组成，每个离心通道靠近所述圆盘形本体中心的一端设有包埋有核酸提取液的加样区A，另一端设有取样区B；所述离心通道的中部设有过滤膜，位于所述过滤膜与加样区A之间还设有仅允许液体从加样区A流向取样区B的单向阀；本发明还提供一种采用其快速提取血液DNA的方法，采用的核酸提取芯片，事先在芯片中预埋有核酸提取液，可快速得到纯度较高的核酸。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，具体讲是一种核酸提取芯片及采用其快速提取血液DNA的方法。
背景技术
核酸检测由于其灵敏度高、特异性强、操作简便、所需时间短等特点，已广泛应用于临床医学、检验检疫等多个领域，尤其是PCR、等温扩增等核酸扩增技术。然而，核酸扩增技术对于临床或直接获得的标本中的干扰物质较为敏感，会造成检测结果的假阴性，故在核酸扩增前需进行样品核酸提取与纯化。但一直以来，样本中核酸的提取和纯化是整个实验中最耗时，最繁琐的过程，严重影响样本检测的速度以及现场应用。
样本中核酸的提取主要包括两个步骤：裂解细胞和提取核酸。裂解细胞使核酸从细胞中释放，蛋白解离的常用方法包括物理法(煮沸、冻融、微波、超声、研磨等)、化学方法(高盐、表面活性剂、苯酚等)和酶消化法(溶菌酶、蛋白酶K等)。
现有的核酸的提取方法中，苯酚-氯仿抽提法、异丙醇沉淀法及甲酰胺裂解法是提取DNA最为经典的方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均是利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化裂解细胞。在前两种方法中，裂解液先用苯酚-氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇双醇沉淀DNA。甲酰胺法是利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。这些经典方法在不计样本量情况下获得的DNA纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。
碱裂解法是在NaOH提供的高pH(12.0-12.6)条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使细胞的蛋白质发生变性，释放出DNA。裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和其他杂质形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下，可有效沉淀，而DNA保留于上清液中，再通过无水乙醇沉淀、乙醇洗涤等步骤纯化DNA。碱裂解法虽然快速简便，但去蛋白效果欠佳，明显影响了后续PCR效果。
磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脱液洗脱，得到纯净的DNA。由于其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，提取步骤更简单，对核酸样本的回收率高和纯度好等优势而倍受研究者青睐。不过产品基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，成本较高，从而限制了其在我国的广泛应用。
综上所述，传统的提取方式存在过程耗时长，成本高，步骤繁多，增加了污染的风险，对基层的操作人员来讲，难度较大，可能无法非常准确的完成提取，因此，需要一种快速提取DNA的试剂，简单处理一下就可以作为模板进行上机检测，满足科研和检验领域快速检测的需求。
发明内容
本发明提供一种核酸提取芯片及采用其快速提取血液DNA的方法，采用的核酸提取芯片，事先在芯片中预埋有核酸提取液，可快速得到纯度较高的核酸。
本发明的技术解决方案如下：一种核酸提取芯片，主要由圆盘形本体以及围绕其中心环形排列的若干个离心通道组成，每个离心通道靠近所述圆盘形本体中心的一端设有包埋有核酸提取液的加样区A，另一端设有取样区B；所述离心通道的中部设有过滤膜，位于所述过滤膜与加样区A之间还设有仅允许液体从加样区A流向取样区B的单向阀。
所述单向阀由2个端部相互紧贴的楔形瓣膜组成。
所述加样区A和取样区B上还设有端盖。
所述过滤膜为孔径为0.1-1μm的微孔滤膜。
作为优选，所述过滤膜为孔径为0.22μm的尼龙或丙烯酸微孔滤膜。
作为优选，所述瓣膜材料为硅胶。
本发明还提供一种采用所述核酸提取芯片快速提取血液DNA的方法，包括以下步骤：
将血液颠倒混匀后，吸取一定量的血液置于所述核酸提取芯片中的加样区A中与包埋在所述加样区A中的核酸提取液混合，盖上端盖，将所述核酸提取芯片采用仪器驱动其以中心轴为转轴常温离心一段时间后，打开取样区B的端盖，吸取液体，就得所提取的核酸溶液。
所述核酸提取液组成为：10mM-100mM的氢氧化钠溶液，10mM-100mM的异硫氰酸胍，1-8wt%的吐温20，0.1-5wt%的十二烷基硫酸锂，终浓度为0.5-8wt%的二甲基亚砜，终浓度为1-50mg/mL的蛋白酶K，0.5-5wt%的牛血清蛋白，0.1-6wt%的明胶。
作为优选，所述核酸提取液组成还包括5mM-50mM的氯化钾。
本发明的有益效果是：本发明核酸提取芯片解决了常规核酸提取方法的回收率低，操作步骤繁琐，成本高等问题。采用本发明的核酸提芯片，只需要将样本加入到核酸提取芯片中，放入仪器中，即可达到核酸的提取，无需以往的裂解，离心，过柱，洗涤，洗脱等步骤，在很大程度上减少了操作步骤，减少了核酸的丢失，增加了检测的灵敏度并且大大降低了成本，并且不会影响检测结果的灵敏度和稳定性。
本发明的核酸提取芯片中的核酸提取液采用蛋白变性剂，表面活性剂，能够快速裂解组织，细胞以及病毒的蛋白质外壳结构，并通过高温加热的方式，充分的释放出核酸，蛋白酶K又可以很好的使核酸和蛋白质分离，高温后蛋白酶K失活，不会对下游实验造成影响；通过BSA和明胶，在保护核酸的同时，可以有效的将蛋白质，糖类，脂质等抑制物沉淀下来，核酸提取液中的异硫氰酸胍更是有抑制核酸酶的作用，防止了核酸的降解，对后续的下游实验不造成影响。
附图说明
图1为本发明核酸提取芯片的局部剖视结构示意图。
图2为图1中C区局部放大结构示意图。
图3为实施例中CPV平行测试扩增曲线图。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
实施例
如图1-2所示，本实施例核酸提取芯片由圆盘形本体以及围绕其中心环形排列的8个离心通道组成，每个离心通道靠近所述圆盘形本体中心的一端设有包埋有核酸提取液的加样区A，另一端设有取样区B；所述离心通道的中部设有孔径为0.22μm的尼龙微孔滤膜，位于所述微孔滤膜与加样区A之间靠近微孔滤膜还设有仅允许液体从加样区A流向取样区B的由2个端部相互紧贴的楔形瓣膜组成的硅胶膜单向阀，所述加样区A和取样区B上还设有端盖。
所述核酸提取芯片具有8个加样孔，一次可以提取8个样品，所述A区域为试剂包埋区，B区域为吸取核酸溶液区域， A区域包埋的核酸提取液，也可以进行烘干来方便运输，用户在使用时，只要加入样本，加入水就可以，快速安全，操作非常简单。A、B中间有单向阀和过滤膜，当离心力达到4000g时，液体将通过微孔滤膜，大颗粒物质会被阻挡在A区域，同时防止反流，样本的核酸溶解在溶液中，通过微孔滤膜，到达B区域。
以氢氧化钠、异硫氰酸胍、吐温20、十二烷基硫酸锂、二甲基亚砜、蛋白酶K、牛血清蛋白、明胶、水为原料配置成以下组分含量的核酸提取液：10mM-100mM的氢氧化钠溶液，10mM-100mM的异硫氰酸胍，1-8wt%的吐温20，0.1-5wt%的十二烷基硫酸锂，终浓度为0.5-8wt%的二甲基亚砜，终浓度为1-50mg/mL的蛋白酶K，0.5-5wt%的牛血清蛋白，0.1-6wt%的明胶，取上述核酸提取液40uL，加入到核酸提取芯片的A区域，将芯片放置于干燥箱中65℃，10min进行烘干，盖上盖子。
用本发明对CPV（犬细小）病毒进行提取并扩增；
1)取阳性CPV血液样本10μL，加入到核酸提取芯片的A区域，再加入40μL 纯水；
2)将核酸提取芯片放入宁波爱基因科技有限公司的MA2000仪器中，点击“核酸提取”按钮；
3)提取结束后，从芯片的B区域吸取2μL作为模板，进行试验；
4)实验采用的是微流控芯片法，将2μL模板，13μL水和10μL的反应液进行充分混合后，加入到CPV检测芯片中，放入微流控芯片检测仪中，设置好扩增程序63.5℃，30min；CPV平行测试扩增结果如图3所示。
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (8)
1.一种核酸提取芯片，其特征在于，主要由圆盘形本体以及围绕其中心环形排列的若干个离心通道组成，每个离心通道靠近所述圆盘形本体中心的一端设有包埋有核酸提取液的加样区A，另一端设有取样区B；所述离心通道的中部设有过滤膜，位于所述过滤膜与加样区A之间还设有仅允许液体从加样区A流向取样区B的单向阀，所述单向阀由2个端部相互紧贴的楔形瓣膜组成。
2.根据权利要求1所述的核酸提取芯片，其特征在于，所述加样区A和取样区B上还设有端盖。
3.根据权利要求1所述的核酸提取芯片，其特征在于，所述过滤膜为孔径为0.1-1μm的微孔滤膜。
4.根据权利要求1所述的核酸提取芯片，其特征在于，所述过滤膜为孔径为0.22μm的尼龙或丙烯酸微孔滤膜。
5.根据权利要求1所述的核酸提取芯片，其特征在于，所述瓣膜材料为硅胶。
6.一种采用权利要求1~5任意一项所述的核酸提取芯片快速提取血液DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将血液颠倒混匀后，吸取一定量的血液置于所述核酸提取芯片中的加样区A中与包埋在所述加样区A中的核酸提取液混合，盖上端盖，将所述核酸提取芯片采用仪器驱动其以中心轴为转轴常温离心一段时间后，打开取样区B的端盖，吸取液体，就得到所提取的核酸溶液。
7.根据权利要求6所述的快速提取血液DNA的方法，其特征在于，所述核酸提取液组成为：10mM-100mM的氢氧化钠溶液，10mM-100mM的异硫氰酸胍，1-8wt%的吐温20，0.1-5wt%的十二烷基硫酸锂，终浓度为0.5-8wt%的二甲基亚砜，终浓度为1-50mg/mL的蛋白酶K，0.5-5wt%的牛血清蛋白，0.1-6wt%的明胶。
8.根据权利要求7所述的快速提取血液DNA的方法，其特征在于，所述核酸提取液组成还包括5mM-50mM的氯化钾。
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