[go: up one dir, main page]

CN109385404A - 一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用 - Google Patents

一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109385404A
CN109385404A CN201811222470.7A CN201811222470A CN109385404A CN 109385404 A CN109385404 A CN 109385404A CN 201811222470 A CN201811222470 A CN 201811222470A CN 109385404 A CN109385404 A CN 109385404A
Authority
CN
China
Prior art keywords
neuron
mrna
cell
stem cells
target gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811222470.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109385404B (zh
Inventor
张建民
王靓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guodian (beijing) Pharmaceutical Technology Co Ltd
Original Assignee
Guodian (beijing) Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guodian (beijing) Pharmaceutical Technology Co Ltd filed Critical Guodian (beijing) Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority to CN201811222470.7A priority Critical patent/CN109385404B/zh
Publication of CN109385404A publication Critical patent/CN109385404A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109385404B publication Critical patent/CN109385404B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用，利用目的基因mRNA转染干细胞后，诱导干细胞分化，得到神经元，称为mRNA诱导神经元。该方法利用了人诱导性多能干细胞iPSCs的生物学特性，通过脂质体转染mRNA表达促神经元分化的转录因子，从而实现干细胞体外定向分化为神经元。该方法为神经元损伤缺失后的补充来源提供了保障，也为用干细胞移植替代临床治疗神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默疾病和脑缺血损伤等疾病奠定了基础。本发明将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用
技术领域
本发明涉及干细胞分化技术领域，特别是涉及一种诱导干细胞分化为神经元的方法，尤其是，一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经元(dopaminergic neuron)，胆碱能神经元神经元(cholinergic neuron)，γ-氨基丁酸能神经元(GABAergic neuron)，谷氨酸能神经元(glutaminergic neuron)等多种类型神经元的快速高效的方法，及由该方法获得的神经元，目的基因mRNA在诱导干细胞分化为神经元的诱导剂中的应用。
背景技术
多能干细胞(PSCs)具有独特的自我更新能力和多系分化潜能，包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导性多能干细胞(iPSCs)。人类PSCs，特别是来源于疾病患者的iPSCs，在组织再生医学中的有着多种应用，包括疾病模型的建立，新型治疗药物的研发以及细胞替代疗法的开发，具有广阔的临床前景。iPSCs在再生医学中的应用很大程度上依赖于高效的分化技术，即建立快速有效的方法将其诱导分化成特殊种系和功能完整的后代(例如:各种神经元亚型)。
目前，高效分化iPSCs的方法包括基于化合物的iPSC分化、使用慢病毒产生基因整合等。然而，基于化合物的iPSC分化相对缓慢且稳定性差；使用慢病毒产生基因整合的方法目前在临床转化方面仍然存在安全隐患，实际操作性不理想。
因此，一种能够高效分化iPSCs的方法是本领域的研发方向。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种快速高效的诱导人干细胞分化为神经元的方法，利用目的基因mRNA转染干细胞后，诱导干细胞分化，得到神经元，称为mRNA诱导神经元；所述神经元为多巴胺能神经元(dopaminergicneuron)、胆碱能神经元神经元(cholinergic neuron)、γ-氨基丁酸能神经元(GABAergicneuron)或谷氨酸能神经元(glutaminergic neuron)。
所述干细胞选自人诱导性多能干细胞、胚胎干细胞或神经干细胞。
所述人诱导性多能干细胞可以是通过重编程的方式将来源于皮肤的成纤维细胞、人全血PBMC、或分离自尿液的肾上皮细胞等细胞制备得到的人诱导性多能干细胞。
所述目的基因mRNA可以选自编码NEUROD1、NEUROG1、NEUROG2、ASCL1、或ATOH1等蛋白质的mRNA。
包括以下步骤：
1)体外合成目的基因mRNA，目的基因mRNA可以选自编码NEUROD1、NEUROG1、NEUROG2、ASCL1、或ATOH1等蛋白质的mRNA；
2)将步骤1)获得的目的基因mRNA和干细胞置于培养基中转染，同时干细胞于培养基中培养进行分化(所述分化过程培养基优选用mTeSRTM1试剂盒或StemFlexTMMedium试剂盒)；
3)至干细胞出现神经元祖细胞形态且可检测出神经元标记物TUJ1时，进行神经元祖细胞传代，挑选贴壁附着的细胞，即得到mRNA诱导神经元(简称miN)；
优选的，步骤2)具体为：
第1天：将干细胞铺在GFR基质胶包被的培养板中，每孔加入DAPT至其终浓度为10μM，37℃，95％空气和5％CO2气氛下培养干细胞至其贴壁状况良好，加入步骤1)得到的目的基因mRNA转染干细胞，并诱导iPSCs分化，将此时标记为分化的第一天；
第2天：将第1天使用的培养基取出，换上mTeSRTM1培养基和N-2培养基按体积比1:1混合得到的培养基，然后加入DAPT至其终浓度为10μM，加入步骤1)得到的目的基因mRNA转染干细胞，并诱导iPSCs分化；
第3天：将第2天使用的培养基取出，换上N-2培养基，然后加入DAPT至其终浓度为10μM，加入步骤1)得到的目的基因mRNA转染干细胞，并诱导iPSCs分化，得到两端带有突触的梭形目的基因mRNA诱导神经元祖细胞；
更优选的，用目的基因mRNA转染干细胞的具体操作为：
在孔板中依次加入室温的PBS、目的基因mRNA、室温的Stem-In阳离子脂质体，混合后孵育后，加入干细胞中37℃培养。
所述传代具体包括以下步骤：
Ⅰ、将神经元培养基B27、消化液Accutase和DMEM/F-12分别加热至室温后，37℃保温，分别得到保温的神经元培养基B27、消化液Accutase和DMEM/F-12；
Ⅱ、分化完成后弃去培养板中的培养基，用保温的DMEM/F-12冲洗培养板，冲洗过后弃去孔中液体，加入保温的消化液Accutase/孔，37℃培养直至细胞脱落，再加入保温的DMEM/F-12彻底冲洗，最后转移至无菌的离心管中；
Ⅲ、用保温的DMEM/F-12再次冲洗培养板收集剩余的细胞，与步骤Ⅱ合并离心，弃去上清液，将沉淀在保温的神经元培养基B27中重悬，吹打至培养基变混浊并无明显的团块，得到重悬液；
Ⅳ、将步骤Ⅲ得到的重悬液铺在提前用Poly-D-Lysine和Laminin包被的含有盖玻片的培养板中，摇动细胞板，使盖玻片沉降到孔的底部，并被细胞覆盖，37℃培养72小时，然后更换含10ng/ml神经营养因子BDNF、10ng/ml GDNF、1ng/ml TGFβ-3、0.1mM cAMP、0.2mM抗坏血酸和10μM DAPT的神经元培养基B27以去除未附着在孔壁上的死细胞，贴壁附着的细胞即为mRNA诱导神经元(mRNA-induced neuron，简称：miN)，显微镜下观察其形态为两端带有细长轴突的细胞，说明传代完成。
诱导干细胞分化得到神经元的周期为4-7天。
第二方面，本发明提供一种mRNA诱导神经元，由上述方法得到的。
其纯度为80％以上，优选在90％以上。
第三方面，本发明提供目的基因mRNA在制备诱导干细胞分化为神经元的诱导剂中的应用，所述目的基因mRNA选自编码NEUROD1、NEUROG1、NEUROG2、ASCL1、或ATOH1等蛋白质的mRNA。
本发明提供了一种快速高效的诱导人干细胞分化为神经元的方法及由该方法获得的神经元，该方法利用了人诱导性多能干细胞iPSCs的生物学特性，通过脂质体转染mRNA表达促神经元分化的转录因子，从而在4-7天内实现干细胞体外定向分化为神经元，且神经元细胞的纯度可达90％以上。本发明提供的将人诱导性多能干细胞高效分化为神经元的方法为神经元损伤缺失后的补充来源提供了保障，也为用干细胞移植替代临床治疗神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默疾病和脑缺血损伤等疾病奠定了基础。本发明方法也可广泛用于建立来源于干细胞的人源神经元的药物筛选测试和疾病机理研究的高效平台，将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明
图1所示为mRNA转染效率图；
图2中A幅为iPSCs分化4天后的形态图；B幅为神经元祖细胞传代3天后的形态图；
图3中A幅为神经元标记物TUJ1的染色照片，B幅为神经元标记物MAP2的染色照片，C幅为神经元标记物TUJ1和MAP2的染色叠加照片；
图4所示为mRNA诱导神经元占总细胞数目百分比的柱状图；
图5所示为带有NEUROD1的mRNA合成载体的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用体外合成的mRNA将多种干细胞(包括：诱导性多能干细胞(iPSCs)，胚胎干细胞，神经干细胞等)高效分化为神经元的方法，由这一方法产生的神经元称为mRNA诱导神经元(mRNA-induced neuron，简称：miN)。
本发明提供的上述方法是一种将干细胞分化为神经元的无基因整合的方法，该方法利用mRNA转染的方式诱导干细胞分化，尤其是诱导人诱导性多能干细胞的分化，包括以下步骤：
1)体外合成目的基因mRNA，目的基因mRNA可以选自编码NEUROD1、NEUROG1、NEUROG2、ASCL1、ATOH1等蛋白质的mRNA；
2)将步骤1)获得的目的基因mRNA转染至干细胞中，于培养基中分化，至细胞形态变化出现神经元祖细胞形态，同时可检测出神经元标记物β-tubulin III(TUJ1)时，进行细胞传代得到贴壁附着的神经元，即为mRNA诱导神经元(简称miN)；
干细胞可选自人诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞，人诱导性多能干细胞的来源是广泛的，可以通过重编程的方式将来源于皮肤的成纤维细胞，人全血PBMC，分离自尿液的肾上皮细胞等细胞制备为人诱导性多能干细胞；
培养基可选用STEMCELL Technologies公司(加拿大干细胞技术有限公司)的mTeSRTM1试剂盒，货号85850；或者ThermoFisher SCIENTIFIC公司(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)的StemFlexTMMedium试剂盒，货号A3349401。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验或实施获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
实施例一、mRNA的合成及iPSCs的培养
1)干细胞的培养
本实施例中干细胞选择iPSCs(可以通过多种人类细胞采用重编程技术获得)，使用mTeSRTM1试剂盒，按照该试剂盒的技术手册(https://cdn.stemcell.com/media/files/manual/MA28315-Maintenance_of_Human_Pluripotent_Stem_Cells_mTeSR1_CN.pdf)中提供的方法培养iPSCs，得到的iPSCs形态特征包括致密的克隆、紧致的中心和光滑的边缘、细胞核大，核仁突出，核质比高。
2)目的基因mRNA的获得
2.1目的基因的克隆和载体质粒的线性化
2.1.1NEUROD1的克隆：本实施例中目的基因选择NEUROD1，克隆过程如图5所示。
将人NEUROD1(全称：neuronal differentiation 1，基因库中的检索号为NM_002500.4)基因的编码序列克隆到含有T7启动子的mRNA合成载体质粒上。该载体质粒是通过在Promega公司的pSP72载体质粒的BamHI酶切位点中加入带有AscI和MluI的多克隆位点而得到的含有T7启动子的载体。
克隆过程具体为：按照MluI和AscI(购自NEW ENGLAND BioLabs公司)两种限制性内切酶说明书中提供的方法利用这两种酶在表1所列的双酶切体系中进行酶切反应，以将mRNA合成载体质粒和NEUROD1酶切产生相同的粘性末端，分别得到mRNA合成载体双酶切产物和NEUROD1双酶切产物；然后通过T4DNA连接酶(购自NEW ENGLAND BioLabs公司)将mRNA合成载体双酶切产物和NEUROD1双酶切产物连接起来，以将NEUROD1连接入mRNA合成载体质粒，反应体系如表2所示，构建得到带有NEUROD1基因的mRNA合成载体，完成NEUROD1的克隆。
表1双酶切体系
酶切体系 20μl
NEB Buffer 4 2μl
NEUROD1 1μg
ASCI 0.2μl
MluI 0.2μl
H<sub>2</sub>O 加至总体积20μl
表2连接反应体系
酶切体系 20μl
T4 DNA连接buffer 2μl
T4 DNA连接酶 0.5μl
mRNA合成载体双酶切产物 20ng
NEUROD1双酶切产物 100ng
H<sub>2</sub>O 加至总体积20μl
2.1.2载体质粒的线性化
带有NEUROD1基因的mRNA合成载体构建完成后，按照限制性内切酶HindIII(购自NEW ENGLAND BioLabs公司，货号R0104S)的使用说明书中提供的方法通过限制性内切酶HindIII将带有NEUROD1基因的mRNA合成载体线性化，反应体系见表3，反应条件为37℃，反应3h，得到含有酶切产物的反应体系；再用PCR纯化试剂盒(购自Qiagen)纯化该反应体系，得到酶切产物，即线性化的NEUROD1载体(以下称NEUROD1DNA)，作为RNA合成的模板。
表3质粒线性化的反应体系
酶切体系 100μl
NEBuffer 2.1 10μl
带有NEUROD1基因的mRNA合成载体 5μg
HindIII 1μl
H<sub>2</sub>O 加至总体积100μl
其它目的基因的克隆也按照同样操作步骤和反应条件进行，得到多种线性化的目的基因载体。
2.2目的基因mRNA的合成和纯化
2.2.1目的基因mRNA的合成
目的基因mRNA的合成过程即是线性化的目的基因载体进行体外转录(In vitrotranscription，IVT)的过程。以NEUROD1 mRNA为例，具体为：
加帽反应：先使用HiScribeTMT7ARCA(anti-reverse cap analog，抗-反向帽类似物)mRNA试剂盒(购自New England Biolabs)，并按照其使用说明中所提供的试剂，以2.1中得到的NEUROD1DNA为原料37℃反应2h，以在体外合成NEUROD1 mRNA，并同时在mRNA的5′端加上一个7-甲基鸟苷帽结构(即进行ARCA加帽反应)，然后加入2μl DNase I(脱氧核糖核酸酶I，HiScribeTMT7ARCA mRNA试剂盒中附带的)37℃反应15min，降解模板DNA终止反应，得到5′末端加了一个7-甲基鸟苷帽结构的NEUROD1 mRNA，mRNA体外合成和ARCA加帽反应的反应体系见表4。
表4 ARCA加帽反应的反应体系
加尾反应：进而在加帽反应体系的基础上按表5所列形成加尾反应体系，37℃反应45min，以在加帽后的NEUROD1 mRNA 3′末端加上一个Poly(A)尾(即进行Poly(A)加尾反应)，得到5′末端加了一个7-甲基鸟苷帽结构、3′末端加了一个Poly(A)尾的NEUROD1 mRNA。
表5 Poly(A)加尾反应的反应体系
加尾反应体系 50μl 100μl
ARCA加帽反应后的反应体系 20μl 20μl
10倍Poly(A)聚合酶反应缓冲液 5μl 10μl
Poly(A)聚合酶 5μl 5μl
无核酸酶水 20μl 65μl
2.2.2目的基因mRNA的纯化
使用MEGAclear试剂盒(购自Thermo Fisher Scientific)纯化加尾反应完成后的反应体系(其中含有5′末端加了一个7-甲基鸟苷帽结构、3′末端加了一个Poly(A)尾的NEUROD1 mRNA)，得到NEUROD1 mRNA。
其它目的基因mRNA也用同样操作步骤和反应条件制备得到。
实施例二、mRNA的转染及iPSCs的分化
iPSCs的分化和mRNA的转染同时进行，即整个分化过程中分阶段对iPSCs进行三次mRNA转染，相邻转染之间间隔24h。以NEUROD1 mRNA的转染为例，具体过程如下：
第1天：将实施例一的1)iPSCs的培养中得到的iPSCs按照mTeSRTM1试剂盒的技术手册消化成单细胞，然后将其铺在GFR基质胶(购自Corning公司(康宁公司)的Growth Factor Reduced(GFR)Basement Membrane Matrix，*LDEV-Free，货号356230)包被的12孔培养板中，6×105细胞/孔，每孔中加入DAPT(N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯，购自Sigma-Aldrich(西格玛奥德里奇)公司，货号D5942)至DAPT的终浓度为10μM，37℃，95％空气和5％CO2气氛下培养iPSCs，使iPSCs开始传代，3-4小时后，如果iPSCs贴壁状况良好，加入0.25μg实施例一得到的NEUROD1 mRNA转染iPSCs，并诱导iPSCs分化，将此时标记为分化的第一天。
用NEUROD1 mRNA转染iPSC的具体过程如下：
①将Stem-In阳离子脂质体(Stem00015，购自Thermo Fisher Scientific)和PBS(购自MTI global stem，Stem-In 2140S，无RNase，转染专用，4℃保存)恢复至室温；
②在96孔板中依次加入50μl PBS、0.25μg NEUROD1 mRNA(实施例一得到的)、1.5μl室温的Stem-In阳离子脂质体，混匀得到混合液在通风橱下孵育15分钟；
③将步骤②孵育后的混合液均匀加入前面提到的12孔培养板中，培养板中盛有贴壁良好、传代完成的iPSCs，混匀后37℃培养。
mRNA转染iPSCs的效率图见图1。图1显示利用编码绿色荧光蛋白GFP的mRNA在与NEUROD1 mRNA转染iPSC相同的转染条件下进行iPSC转染，大于60％的细胞带有绿色荧光，说明本发明采用的mRNA转染条件能够让mRNA高效进入细胞并表达出对应的蛋白质。
第2天：将第1天使用的12孔培养板中的培养基取出，换上新的培养基，新的培养基为mTeSRTM1培养基和N-2培养基按体积比1:1混合得到的培养基，然后加入DAPT至其终浓度为10μM，按照第1天的转染步骤①-③用0.25μg实施例一得到的NEUROD1 mRNA转染iPSCs，并诱导iPSCs分化；N-2培养基为DMEM/F-12(购自ThermoFisher SCIENTIFIC公司，货号11320082)加1％N-2添加物(购自ThermoFisher SCIENTIFIC公司，货号17502001)得到。
第3天：将第2天使用的12孔培养板中的培养基取出，换上新的培养基，新的培养基为N-2培养基，然后加入DAPT至其终浓度为10μM，按照第1天的转染步骤①-③用0.25μg实施例一得到的NEUROD1 mRNA转染iPSCs，诱导iPSCs分化，得到NEUROD1 mRNA诱导神经元祖细胞，用于传代，即将用于传代的细胞见图2中的A幅，为两端带有突触的梭形细胞。
第4天：将第3天得到的NEUROD1 mRNA诱导神经元祖细胞进行神经元祖细胞(neuron progenitor cell，NPC)传代，具体包括以下步骤：
Ⅰ、将神经元培养基B27(配制方法为：Neurobasal培养基(购自ThermoFisherSCIENTIFIC公司，货号21103049)中加入体积比为2％的B-27添加物(购自ThermoFisherSCIENTIFIC公司，货号17504044)得到)、消化液Accutase(购自Sigma-Aldrich公司(西格玛奥德里奇公司)，货号A6964)和DMEM/F-12(购自ThermoFisher SCIENTIFIC公司，货号11320082)，使用前于37℃水浴中放置5分钟；
Ⅱ、吸出第3天使用的12孔培养板上孔中的培养基后，用1ml步骤Ⅰ得到的37℃的DMEM/F-12冲洗每个孔，冲洗过后弃去孔中液体，加入0.5ml步骤Ⅰ得到的37℃的消化液Accutase/孔，放置在37℃的培养箱中培养5-10分钟，直至细胞脱落，每孔再加入1ml步骤Ⅰ得到的37℃的DMEM/F-12彻底冲洗，将每孔的细胞连同DMEM/F-12一起转移至无菌的离心管中；
Ⅲ、在步骤Ⅱ冲洗后的12孔培养板中加入1ml步骤Ⅰ得到的37℃的DMEM/F-12再次冲洗培养板收集剩余的细胞，然后加入至步骤Ⅱ的离心管中，300g离心5分钟，弃去上清液，将沉淀在1ml步骤Ⅰ得到的37℃神经元培养基B27中重悬，用1ml移液枪吹打10次，至培养基变混浊并无明显的团块，得到重悬液；
Ⅳ、将步骤Ⅲ得到的重悬液铺在提前用Poly-D-Lysine和Laminin(Poly-D-Lysine自Sigma-Aldrich公司，货号P6407，Laminin购自Sigma-Aldrich公司，货号L2020)包被的含有盖玻片的24孔培养板中，细胞数目为2×105/孔，轻轻摇动细胞板，确保盖玻片沉降到孔的底部，并被细胞覆盖，37℃培养72小时，然后更换培养基(含神经营养因子BDNF(10ng/ml)、GDNF(10ng/ml)、TGFβ-3(1ng/ml)、cAMP(0.1mM)、抗坏血酸(0.2mM)和DAPT(10μM)的神经元培养基B27)以去除未附着在孔壁上的死细胞，贴壁附着的细胞即为mRNA诱导神经元(mRNA-induced neuron，简称：miN)，见图2中的B幅，其形态为两端带有细长轴突的细胞，轴突结构的长度显著长于图2中A幅显示的神经元祖细胞，说明传代完成。mRNA诱导神经元在37℃，95％空气和5％CO2气氛下继续培养，每3-4天更换30-50％的培养基(含神经营养因子BDNF(10ng/ml)、GDNF(10ng/ml)、TGFβ-3(1ng/ml)、cAMP(0.1mM)、抗坏血酸(0.2mM)和DAPT(10μM)的神经元培养基B27)。
其它目的基因mRNA转染iPSCs及NPC传代的过程类似，再此不一一赘述。
实施例三、miN的冷冻保存和复苏
实施例二得到的mRNA诱导神经元miN可在含有40wt％神经元培养基B27、50wt％胎牛血清和10％DMSO组成的冻存液中冷冻保存。使用时解冻复苏，即先在37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动冷冻管，直到管内还残余有冰块时，将管内液体转移到离心管中，加入液体体积3-5倍的神经元培养基B27，轻轻混匀，以300g的速度离心5分钟，弃去上清液，收集沉淀重悬于细胞神经元培养基(含神经营养因子BDNF(10ng/ml)、GDNF(10ng/ml)、TGFβ-3(1ng/ml)、cAMP(0.1mM)、抗坏血酸(0.2mM)和DAPT(10μM)的神经元培养基B27)中，然后铺在Poly-D-Lysine/Laminin包被的含有玻片的培养板中，细胞数目为2×105/孔，轻轻摇动培养板，确保盖玻片沉降到培养孔底部，并被细胞覆盖，37℃，95％空气和5％CO2气氛下培养72小时后更换培养基(含神经营养因子BDNF(10ng/ml)、GDNF(10ng/ml)、TGFβ-3(1ng/ml)、cAMP(0.1mM)、抗坏血酸(0.2mM)和DAPT(10μM)的神经元培养基B27以去除未附着在孔壁上的死细胞，贴壁附着的细胞即为复苏的mRNA诱导神经元。
实施例四、细胞免疫荧光(Confocal)
将实施例二得到的mRNA诱导神经元或实施例三复苏后的mRNA诱导神经元在含4wt％多聚甲醛的PBS(pH 7.4)中固定。固定后吸出固定液再用含0.2％(体积百分含量)Triton X-100和5％(体积百分含量)山羊血清的PBS(pH 7.4)作封闭液封闭。封闭后吸出封闭液加入用5％山羊血清稀释的一抗(按照一抗的使用说明书稀释)，混匀在4℃下孵育过夜。吸出一抗，再加入用Cy3-和Alexa Fluor 488-标记的二抗室温孵育2小时(一抗、用Cy3-和Alexa Fluor 488-标记的二抗均购自cell signaling technology公司)。吸出二抗，加入4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，购自Sigma-Aldrich公司，货号D8417)复染，复染后使用ProLong抗褪色试剂盒(购自Life Technologies)将细胞固定在载玻片上，结果见图3(标尺＝100μm)。
图3的A幅是神经元标志物TUJ1的免疫荧光染色结果图，其中绿色荧光的细胞表明TUJ1阳性，TUJ1阳性说明细胞是神经元细胞；B幅是成熟神经元标志物MAP2的免疫荧光染色结果图，其中红色荧光的细胞表明神经元为MAP2阳性，MAP2阳性说明细胞是成熟的神经元细胞；C幅是TUJ1和MAP2叠加图，其中TUJ1和MAP2双阳性细胞为成熟的mRNA诱导神经元，mRNA诱导神经元能同时表达神经元标志物TUJ1和成熟神经元标志物MAP2，因此双阳性表明所得到的细胞为成熟的mRNA诱导神经元。
对图3的C幅进行统计，结果见图4，可以看出本发明得到的miN中神经元标志物TUJ1和MAP2双阳性的成熟神经元占总细胞的比例超过80％，能够达到90％，说明由本发明方法得到的神经元纯度高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (10)

1.一种诱导干细胞分化为神经元的方法，其特征在于，利用目的基因mRNA转染干细胞后，诱导干细胞分化，得到神经元，称为mRNA诱导神经元；所述神经元为多巴胺能神经元(dopaminergic neuron)、胆碱能神经元神经元(cholinergic neuron)、γ-氨基丁酸能神经元(GABAergic neuron)或谷氨酸能神经元(glutaminergic neuron)。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述干细胞选自人诱导性多能干细胞、胚胎干细胞或神经干细胞。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述人诱导性多能干细胞可以是通过重编程的方式将来源于皮肤的成纤维细胞、人全血PBMC、或分离自尿液的肾上皮细胞等细胞制备得到的人诱导性多能干细胞。
4.根据权利要求1-3任一所述方法，其特征在于，所述目的基因mRNA可以选自编码NEUROD1、NEUROG1、NEUROG2、ASCL1、或ATOH1等蛋白质的mRNA。
5.根据权利要求1-4任一所述方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)体外合成目的基因mRNA，目的基因mRNA可以选自编码NEUROD1、NEUROG1、NEUROG2、ASCL1、或ATOH1等蛋白质的mRNA；
2)将步骤1)获得的目的基因mRNA和干细胞置于培养基中转染，同时干细胞于培养基中培养进行分化(所述分化过程培养基优选用mTeSRTM1试剂盒或StemFlexTMMedium试剂盒)；
3)至干细胞出现神经元祖细胞形态且可检测出神经元标记物TUJ1时，进行神经元祖细胞传代，挑选贴壁附着的细胞，即得到mRNA诱导神经元(简称miN)；
优选的，步骤2)具体为：
第1天：将干细胞铺在GFR基质胶包被的培养板中，每孔加入DAPT至其终浓度为10μM，37℃，95％空气和5％CO2气氛下培养干细胞至其贴壁状况良好，加入步骤1)得到的目的基因mRNA转染干细胞，并诱导iPSCs分化，将此时标记为分化的第一天；
第2天：将第1天使用的培养基取出，换上mTeSRTM1培养基和N-2培养基按体积比1:1混合得到的培养基，然后加入DAPT至其终浓度为10μM，加入步骤1)得到的目的基因mRNA转染干细胞，并诱导iPSCs分化；
第3天：将第2天使用的培养基取出，换上N-2培养基，然后加入DAPT至其终浓度为10μM，加入步骤1)得到的目的基因mRNA转染干细胞，并诱导iPSCs分化，得到两端带有突触的梭形目的基因mRNA诱导神经元祖细胞；
更优选的，用目的基因mRNA转染干细胞的具体操作为：
在孔板中依次加入室温的PBS、目的基因mRNA、室温的Stem-In阳离子脂质体，混合后孵育后，加入干细胞中37℃培养。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述传代具体包括以下步骤：
Ⅰ、将神经元培养基B27、消化液Accutase和DMEM/F-12分别加热至室温后，37℃保温，分别得到保温的神经元培养基B27、消化液Accutase和DMEM/F-12；
Ⅱ、分化完成后弃去培养板中的培养基，用保温的DMEM/F-12冲洗培养板，冲洗过后弃去孔中液体，加入保温的消化液Accutase/孔，37℃培养直至细胞脱落，再加入保温的DMEM/F-12彻底冲洗，最后转移至无菌的离心管中；
Ⅲ、用保温的DMEM/F-12再次冲洗培养板收集剩余的细胞，与步骤Ⅱ合并离心，弃去上清液，将沉淀在保温的神经元培养基B27中重悬，吹打至培养基变混浊并无明显的团块，得到重悬液；
Ⅳ、将步骤Ⅲ得到的重悬液铺在提前用Poly-D-Lysine和Laminin包被的含有盖玻片的培养板中，摇动细胞板，使盖玻片沉降到孔的底部，并被细胞覆盖，37℃培养72小时，然后更换含10ng/ml神经营养因子BDNF、10ng/ml GDNF、1ng/ml TGFβ-3、0.1mM cAMP、0.2mM抗坏血酸和10μM DAPT的神经元培养基B27以去除未附着在孔壁上的死细胞，贴壁附着的细胞即为mRNA诱导神经元(mRNA-induced neuron，简称：miN)，显微镜下观察其形态为两端带有细长轴突的细胞，说明传代完成。
7.根据权利要求1-6任一所述方法，其特征在于，诱导干细胞分化得到神经元的周期为4-7天。
8.一种mRNA诱导神经元，其特征在于，是由权利要求1-7任一所述方法得到的。
9.根据权利要求8所述mRNA诱导神经元，其特征在于，其纯度为80％以上，优选在90％以上。
10.目的基因mRNA在制备诱导干细胞分化为神经元的诱导剂中的应用，其特征在于，所述目的基因mRNA选自编码NEUROD1、NEUROG1、NEUROG2、ASCL1、或ATOH1等蛋白质的mRNA。
CN201811222470.7A 2018-10-19 2018-10-19 一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用 Active CN109385404B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811222470.7A CN109385404B (zh) 2018-10-19 2018-10-19 一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811222470.7A CN109385404B (zh) 2018-10-19 2018-10-19 一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109385404A true CN109385404A (zh) 2019-02-26
CN109385404B CN109385404B (zh) 2021-07-06

Family

ID=65427882

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811222470.7A Active CN109385404B (zh) 2018-10-19 2018-10-19 一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109385404B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110656089A (zh) * 2019-10-15 2020-01-07 上海捷易生物科技有限公司 一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法
CN110699321A (zh) * 2019-11-14 2020-01-17 信阳师范学院 一种体外诱导神经干细胞定向分化为神经元的方法
CN113278624A (zh) * 2021-05-24 2021-08-20 中山大学·深圳 合成修饰的Olig2 mRNA及其应用
WO2022052964A1 (zh) * 2020-09-08 2022-03-17 纽伦捷生物医药科技（苏州）有限公司 用于重编程的功能性片段、组合及其应用
CN114703196A (zh) * 2022-05-16 2022-07-05 中国科学技术大学 诱导神经元分化的rna组合物、分化方法及其应用
CN116836927A (zh) * 2023-09-04 2023-10-03 山东兴瑞生物科技有限公司 一种由iPSCs诱导为神经干细胞的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331583A (zh) * 2015-12-08 2016-02-17 广州医科大学附属第三医院 一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法
CN105950548A (zh) * 2016-05-26 2016-09-21 南京医科大学附属南京儿童医院 一种从间充质干细胞高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法
WO2018049382A1 (en) * 2016-09-12 2018-03-15 President And Fellows Of Harvard College Transcription factors controlling differentiation of stem cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331583A (zh) * 2015-12-08 2016-02-17 广州医科大学附属第三医院 一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法
CN105950548A (zh) * 2016-05-26 2016-09-21 南京医科大学附属南京儿童医院 一种从间充质干细胞高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法
WO2018049382A1 (en) * 2016-09-12 2018-03-15 President And Fellows Of Harvard College Transcription factors controlling differentiation of stem cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JONATHAN SAGAL, ET AL: "Proneural Transcription Factor Atoh1 Drives Highly Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Dopaminergic Neurons", 《STEM CELL TRANSLATIONAL MEDICINE》 *
潘传英 等: "利用诱导因子Oct4、Sox2和SV40T的mRNA介导体细胞重编程研究", 《畜牧兽医学报》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110656089A (zh) * 2019-10-15 2020-01-07 上海捷易生物科技有限公司 一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法
CN110656089B (zh) * 2019-10-15 2021-02-09 上海捷易生物科技有限公司 一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法
CN110699321A (zh) * 2019-11-14 2020-01-17 信阳师范学院 一种体外诱导神经干细胞定向分化为神经元的方法
CN110699321B (zh) * 2019-11-14 2021-04-09 信阳师范学院 一种体外诱导神经干细胞定向分化为神经元的方法
WO2022052964A1 (zh) * 2020-09-08 2022-03-17 纽伦捷生物医药科技（苏州）有限公司 用于重编程的功能性片段、组合及其应用
CN113278624A (zh) * 2021-05-24 2021-08-20 中山大学·深圳 合成修饰的Olig2 mRNA及其应用
CN114703196A (zh) * 2022-05-16 2022-07-05 中国科学技术大学 诱导神经元分化的rna组合物、分化方法及其应用
CN114703196B (zh) * 2022-05-16 2024-03-29 中国科学技术大学 诱导神经元分化的rna组合物、分化方法及其应用
CN116836927A (zh) * 2023-09-04 2023-10-03 山东兴瑞生物科技有限公司 一种由iPSCs诱导为神经干细胞的方法
CN116836927B (zh) * 2023-09-04 2023-12-01 山东兴瑞生物科技有限公司 一种由iPSCs诱导为神经干细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109385404B (zh) 2021-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109385404A (zh) 一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用
CN101792732A (zh) 人多能干细胞生长和分化的技术
US20200239842A1 (en) Preparation and Expansion Methods for Human Pluripotent Stem Cell-Derived Human Retinal Pigment Epithelial Cells
CN101948803B (zh) 人表皮源性间充质干细胞样多能细胞及其制备方法
CN113462639B (zh) 一种分离来源于人类诱导多能干细胞的成纤维细胞的方法及其应用
CN104774808B (zh) 将脐带间充质干细胞诱导分化成γ-氨基丁酸能神经元的方法
CN113151149A (zh) 一种经济简便诱导肺类器官的方法及实验模型的建立
CN111621475A (zh) 脐带间充质干细胞膜片及其制备方法
CN108865977A (zh) 一种新生大鼠皮肤终隔细胞大量扩增方法及应用
CN115369077B (zh) Meflc细胞株及其构建方法和应用
CN104789531B (zh) 一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法
CN111254108A (zh) 丝蛋白水凝胶及其制备方法、应用
CN119082007A (zh) 多肽dgea或其衍生物在促进多能干细胞分化为间充质干细胞中的应用
CN105441386A (zh) 一种猪极小胚胎样干细胞培养与鉴定方法
CN106222135A (zh) 一种快速获得和纯化人脐带间充质干细胞的方法
US8263406B2 (en) Enriched or purified population of motor neurons and its preparation from a population of embryonic stem cells
CN109666642B (zh) 一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法
CN103865875B (zh) 一种用成纤维细胞制备神经干细胞的方法
CN107012124B (zh) 钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B诱导iPSCs定向心肌分化的方法
CN114231567B (zh) 一种人肺特络细胞系构建方法
CN103333918B (zh) 一种提高猪克隆胚胎体外发育效率的方法
CN103173405B (zh) 一种人胎盘成肌纤维母细胞的简易分离及鉴定方法
CN101760450B (zh) 一种白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系及其建立方法
US20240124838A1 (en) Method for separating neural crest derived cell from peripheral blood
CN103695469B (zh) 一种制备cd44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant