CN110656089B - 一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法 - Google Patents
一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110656089B CN110656089B CN201910975720.2A CN201910975720A CN110656089B CN 110656089 B CN110656089 B CN 110656089B CN 201910975720 A CN201910975720 A CN 201910975720A CN 110656089 B CN110656089 B CN 110656089B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- culture solution
- additive
- ips cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 148
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 66
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 35
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 25
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- -1 small molecule compound Chemical class 0.000 claims description 12
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 10
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 8
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 claims description 4
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 2
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 2
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 2
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 2
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 5
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 6
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 3
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 3
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 3
- 102100034026 RNA-binding protein Musashi homolog 1 Human genes 0.000 description 3
- 101710129077 RNA-binding protein Musashi homolog 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 3
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 2
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 2
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101150009249 MAP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021118 Microtubule-associated protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039203 Road traffic accident Diseases 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009668 clonal growth Effects 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001020 neural plate Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000017511 neuron migration Effects 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 230000009207 neuronal maturation Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000005368 silicate glass Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0619—Neurons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法，包括如下步骤：人iPS细胞的无异源成份培养方式培养；iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元。本发明提供的将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法，安全、无病毒处理、无外源血清成分干扰，并且可以从iPS细胞起始，在体外培养中简便、快速、高效的诱导分化到成熟神经元；而且在形成神经球之前有一次6倍的细胞扩增，最终可以获取大量的成熟神经元，为进一步研究和治疗神经系统疾病提供了一种有效的细胞模型。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及神经元的快速、大量获取方法，尤其是涉及一种安全可靠的将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法。
背景技术
人诱导多能干细胞(hiPSCs)是人的体细胞被转入“Yamanaka因子”(Sox2,Oct4,Klf4和c-myc)后，表达特异基因，逆转回到胚胎干细胞样状态的去分化细胞。hiPSCs与人胚胎干细胞(hESCs)非常类似，有类似的基因和蛋白表达、DNA甲基化模式，自我更新能力和多向分化潜能，理论上可以分化成为人体各种细胞类型。hiPSCs由于克服了hESCs临床应用中会存在的免疫排斥及伦理问题而具有更重要的临床应用价值。如果hiPSCs来源于基因突变病人的体细胞，hiPSCs会携带相应的突变。因此，hiPSCs在疾病建模、机制研究、药物筛选和再生医学等方面展现出巨大优势。
人类的各种类型神经系统疾病，其本质是神经元损伤。运动和交通意外容易导致脑和脊髓损伤；随着人类寿命的延长，各种神经退行性病(阿尔茨海默病、帕金森病等)和脑血管意外导致的神经元受累发病率增加。人类神经元损伤后不可再生，现阶段的神经系统疾病的治疗基本是对症和保守治疗。多能干细胞(hiPSCs/hESCs)诱导分化来的神经元是人神经再生的关键。找到一系列体外诱导多能干细胞定向分化的模式，诱导其分化为神经细胞，达到神经修复和细胞治疗的目的是当今神经科学界的研究热点之一。
目前已经可以将iPS细胞诱导分化到神经元，如EB分化的方法和小分子化合物的方法等(Chambers SM,Fasano CA,Papapetrou EP,Tomishima M,Sadelain M,StuderL.Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dualinhibition of SMAD signaling[J].Nature biotechnology.2009；27(3):275-80.Hu BY,Weick JP,Yu J,Ma LX,Zhang XQ,Thomson JA,et al.Neural differentiation of humaninduced pluripotent stem cells follows developmental principles but withvariable potency[J].Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of theUnited States of America.2010；107(9):4335-40.)。这些方法逐渐在向更确定的成分和更便捷的方法发展。但是总的来说神经元诱导分化的过程长，操作繁琐，不能得到大量神经元。这些缺点限制了诱导分化的神经元在疾病模拟、机制研究以及药物筛选等方面的应用。
神经元诱导分化过程中，通过抑制TGF-β/Activin/Nodal通路、BMP通路和Wnt通路，抑制iPS细胞向中、内胚层分化，得到神经外胚层细胞。加入这些通路的小分子抑制剂，可以得到的这些神经外胚层细胞具有神经干细胞特征，可以在分化过程中实现细胞扩增，实现一次分化收获大量神经元。
发明内容
针对目前现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种将人源诱导多能干细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法。该方法在分化过程中可以实现细胞扩增，实现一次分化收获大量成熟神经元，且分化的神经元具体电生理功能。
为了达成上述的目的，具体技术方案如下：
一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法，包括如下步骤：
S0，使用mTeSR1细胞培养液培养iPS细胞至60％～80％的密度后进行细胞传代，此时仍用mTeSR1细胞培养液培养；
S1，iPS细胞传代第二天将mTeSR1细胞培养液更换为含有小分子化合物组合1的神经分化培养液，培养6-7天；
S2，分散酶将细胞消化并按1孔传代6孔的比例转至基质胶包被处理过的孔板内，更换培养液为含有小分子化合物组合2的神经分化培养液，培养6天；
S3，分散酶将细胞消化并悬浮培养于神经分化培养液中10-12天；
S4，Accutase细胞消化液将细胞消化3～8分钟后贴壁，神经元贴壁培养液中培养7-8天可以得到成熟的神经元。
进一步地，其中步骤S1中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有1:1(v/v)的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂及小分子化合物组合1。
进一步地，其中步骤S1中，所述小分子化合物组合1的组成及浓度分别为：CHIR99021 3μM，SB 431542 2μM，LDN 193189 200nM。
进一步地，其中步骤S2中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有1:1(v/v)的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂及小分子化合物组合2。
进一步地，其中步骤S2中，所述小分子化合物组合2的组成及浓度分别为：CHIR99021 1μM，SB 431542 2μM，LDN 193189200nM。
进一步地，其中步骤S3中，步骤S1中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有1:1(v/v)的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂。
进一步地，其中步骤S4中，所述细胞球用Accutase细胞消化液消化5分钟后，再将神经球贴到经基质胶包被处理过的孔板或玻片上，用神经元贴壁培养液培养。
进一步地，其中步骤S4中，所述神经元贴壁培养液为混合成分，分别含有Neurobasal培养基、1×N2细胞添加剂、1×B27细胞添加剂、脑源性神经营养因子10ng/ml、神经胶质细胞源性神经营养因子10ng/ml、环磷酸腺苷1μM、L-抗坏血酸200μM。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法，安全、无病毒处理、无外源血清成分干扰，并且可以从iPS细胞起始，在体外培养中简便、快速、高效的诱导分化到成熟神经元；而且在形成神经球之前有一次6倍的细胞扩增，最终可以获取大量的成熟神经元，为进一步研究和治疗神经系统疾病提供了一种有效的细胞模型。
附图说明
图1为人iPS细胞在无异源成份培养方式中培养的形态。标尺：100微米。
图2为人iPS细胞向神经元定向诱导分化的流程示意图。
图3为人iPS细胞向神经元定向诱导分化的各时期的形态照片。其中A为分化第1天的细胞形态；B为分化第6天的细胞形态；C为分化第12天的细胞形态；D为分化第20天的细胞形态；E为分化第28天的细胞形态。
图4为人iPS细胞向神经元定向诱导分化第12天神经干细胞标志蛋白免疫荧光染色；其中A为神经干细胞标志蛋白Musashi1染色；B为DAPI细胞核染色；C为Musashi1和DAPI共定位；D为神经干细胞标志蛋白Nestin染色；E为DAPI细胞核染色；F为Nestin和DAPI共定位。
图5为iPS细胞向神经元定向诱导分化第28天的细胞神经元标志蛋白的免疫荧光染色；其中A为神经元标志蛋白TUJ1和DAPI的共染色；B为成熟神经元标志物MAP2和DAPI的共染色。神经元突起交织成网状结构；C为神经元标志蛋白NeuN和DAPI的共染色。
图6为iPS细胞向神经元定向诱导分化第28天的神经元突触标志蛋白Synaptophysin的免疫荧光染色。
图7为iPS细胞向神经元定向诱导分化第28天的神经元在全细胞膜片钳记录模式下的细胞电生理特性；其中A为被玻璃电极钳夹胞体记录电生理特性的分化神经元；B为施加电流刺激后神经元发放动作电位；C为在施加35pA的电流刺激下神经元发放4个动作电位；D为电压钳记录到内向的钠离子通道电流和外向钾离子通道电流。
具体实施方式
为了对本发明有更进一步的了解，以下列举说明书附图和实施例进行说明。
以下材料或试剂，若非特别说明，均为市购。
实施例1人iPS细胞培养(S0)
人iPS细胞(购自中国科学院干细胞库)被贴壁培养在基质胶(BD公司)包被过的6孔板上(如图1)，所用培养液为mTeSR1培养液。细胞传代时，需要用0.5mM EDTA对细胞进行消化。当培养皿中的细胞克隆变大且融合度达到60％～80％时，就可以对细胞进行传代。
细胞传代具体步骤如下：
1)六孔板包被：向六孔板中每孔加入1.5mL基质胶工作液(基质胶用DMEM/F12(赛默飞世尔科技有限公司)稀释60倍，体积比)，然后置于37℃恒温箱中孵育至少1小时，使用前吸弃基质胶工作液；
2)人iPS细胞在六孔板中达到60％～80％密度后，吸弃mTeSR1培养液，每孔中加入1mL0.5 mM EDTA，在37℃孵育3～8分钟进行消化；
3)消化完成后吸弃EDTA，并在每孔中加入2DMEM/F12重悬细胞，并转移至15mL离心管，300g常温离心5分钟；
4)离心后，吸弃上清，细胞沉淀用mTeSR1培养液重悬，细胞计数，按照1x106每板的细胞数量接种于事前包被好基质胶的六孔板中培养，每天更换mTeSR1培养液并观察细胞状态。
实施例2人iPS细胞快速高效诱导分化成为神经元
人iPS细胞诱导分化成为成熟神经元共需要三大步骤，流程见图2，具体步骤分别如下：
1)人iPS细胞向神经干细胞样细胞分化(S1与S2)：mTeSR1培养液中培养的人iPS细胞正常传代，传代第二天，细胞融合度达到10-20％时，将mTeSR1细胞培养液(STEMCELL公司)更换为含有小分子化合物组合1的神经分化培液，此时记为神经元分化第0天(day 0)，继续培养6天(S1)；分散酶(赛默飞世尔科技有限公司)将细胞消化并按1孔传代6孔的比例转至基质胶包被处理过的孔板内(包被方法同人iPS细胞培养)，再更换为含有小分子化合物组合2的神经分化培液，培养6天(S2)，得到神经干细胞样细胞。
其中，神经分化培养液为混合成分，含有1:1(体积：体积)的DMEM/F12和Neurobasal培养基(赛默飞世尔科技有限公司)、0.5×N2细胞添加剂(赛默飞世尔科技有限公司)、0.5×B27细胞添加剂(赛默飞世尔科技有限公司)、1×GlutaMax细胞添加剂(赛默飞世尔科技有限公司)；所述神经分化培养液中的小分子化合物组合1的组分(浓度)为：CHIR99021(3μM)，SB431542(2μM)，LDN193189(200nM)；所述神经分化培养液中的小分子化合物组合2组分(浓度)分别为：CHIR99021(1μM)，SB431542(2μM)，LDN193189(200nM)。
2)神经干细胞样细胞扩增、分化成神经前体细胞(S3)：得到神经干细胞样细胞后，吸弃六孔板中的培养液，每孔中加入1.5mL分散酶，放置37℃孵育5～10分钟，进行消化，消化后吸弃分散酶，每孔添加2mL神经分化培液重悬，并转换至非贴壁六孔板中继续培液10天，形成神经球，成为神经前体细胞状态。
3)神经元迁移和成熟(S4)：收集培养好的神经球于15mL离心管，吸弃培养液，加入2mL Accutase消化液静置37℃孵育5分钟后，吸弃Accutase消化液，并加入2mL神经元贴壁培液重悬神经球，并转移至基质胶包被好的六孔板(包被方法同前)中进行贴壁培养，每2天更换2mL新鲜的神经元贴壁培液，神经元会在贴壁后逐渐迁出神经球并产生突起形成网络状，在神经元贴壁培液中培养7天后可以得到成熟的神经元。
分化结果如图3所示，其中A为分化第1天的细胞形态，细胞仍然和iPS细胞克隆类似；B为分化第6天的细胞形态，细胞不再保持克隆状生长，出现生长差异，细胞急速增长形成小片突起，细胞折光性更强；C为分化第12天的细胞形态，后续的免疫荧光鉴定证实此时的细胞具有神经干细胞样特性；D为分化第20天的细胞形态，此时分化细胞形成神经球，在分化培养液中悬浮培养；E为分化第28天的细胞形态，此时神经球贴壁后有神经元样形态的细胞爬出，突起向外辐射状生长，同时胞体向外迁移。
实施例3免疫荧光实验鉴定人iPS细胞诱导分化成为神经元过程中的蛋白标记(神经干细胞与成熟神经元细胞标志蛋白的免疫荧光染色)
分别取人iPS细胞诱导分化成为神经元过程中第12天的神经干细胞和第28天的成熟神经元细胞，作为两种材料进行如下免疫荧光染色鉴定：
1)培养细胞吸弃培养液，加入2mL PBS，孵育10分钟；
2)吸弃PBS，加入2mL，4℃的多聚甲醛，室温放置固定20分钟；
3)吸弃多聚甲醛，加入2mL PBS；
4)加入含有10％(v/v)驴血清，0.2％(v/v)Triton X-100的孵育液2mL，室温孵育1小时；
5)一抗用含有5％(v/v)驴血清的PBS按相应体积比进行稀释，具体数见表1；
6)加入稀释后的一抗；
7)4℃孵育过夜；
8)吸弃一抗，加入2mL PBS洗涤5遍，每次10分钟；
9)二抗用含有5％(v/v)驴血清的PBS稀释；
10)加入稀释后的二抗和1μL DAPI；
11)避光，室温孵育2小时；
12)吸弃二抗，加入2mL PBS洗5遍，每次10分钟，注意避光；
13)封片；
14)荧光显微镜观察，拍照。
免疫荧光鉴定结果见图4，图5和图6。图4为分化至第12天的细胞，其表达神经干细胞标志蛋白Nestin和Musashi1，提示在分化至12天时，得到了神经干细胞样细胞。图5与图6为分化至第28天的细胞，表达神经元标志蛋白TUJ1、NeuN和成熟神经元标志蛋白Map2(图5)，提示分化第28天时已经分化到了成熟的神经元。并且图6中突触标志蛋白Synaptophysin表达阳性，提示此时分化得到的成熟神经元已经彼此形成功能突触。
表1免疫荧光染色所使用的抗体
实施例4全细胞膜片钳实验检测人iPS细胞诱导分化的神经元的电生理功能
取人iPS细胞诱导分化第28天的成熟神经元进行全细胞膜片钳技术检测，具体步骤如下：
1)玻璃微电极的制备
取外径1.50mm、内径0.89mm的普通硬质硅酸盐玻璃微电极(VitalSenseScientific Instruments,China)经P-97(Sutter，USA)拉制仪四步拉制而成，充灌电极内液后，电极阻抗为4-6ΜΩ。
2)全细胞记录
在室温(20-25℃)下，用Axon 700B(MD，USA)膜片钳放大器进行全细胞膜片钳记录。实验参数设置、数据采集和刺激方案施加均通过采样软件pClamp10.7(MD,USA)来控制。并记录全细胞电压依赖电流(钠/钾电流)和动作电位。
(1)全细胞电压依赖电流的记录(钠/钾电流记录)
电压钳下，钳制电压-70mV,给予-90～+50mV，时程100ms，步幅10mV的去极化步阶电压刺激记录不同电压下的全细胞电流。
(2)动作电位的记录
电流钳下，钳制电流0pA，给予-10pA～+40pA，时程500ms，步幅5pA的去极化步阶电流刺激记录不同刺激强度下的动作电位。
人iPS细胞诱导分化的神经元电生理检测结果如图7所示，其中A图为被玻璃电极钳夹胞体记录电生理特性的分化神经元；B与C图显示诱导分化的神经元可以记录到动作电位，提示诱导分化的神经元具体正常神经元的动作电位发放电生理特性；D图显示诱导分化的神经元可以记录到内向的钠离子通道电流和外向钾离子通道电流，提示诱导分化的神经元已经具有成熟的钠离子通道与钾离子通道。这些结果提示人iPS细胞诱导分化的神经元在第28天时已经成熟，且具有神经元所特有的电生理特性。
综上结果显示，本发明建立了一种安全、高效并且能得到大量神经元的诱导分化方案。整个诱导分化过程中都是在无血清的培养条件下完成，不会存在其它异源性物质的影响；在形成神经球之前有一次6倍的细胞扩增，为后续获取大量的成熟神经元奠定了基础；并且免疫荧光和全细胞膜片钳检测都显示诱导分化的神经元已经成熟且具有正常功能。可以为遗传性疾病的疾病模拟、机制研究以及将来的细胞治疗临床应用提供一种完美的细胞模型。
上述内容已经描述了许多本发明的具体实施方式，但本发明不应该被认为局限于这些具体实施方式。除非另有说明，这里所提供的任何或所有的实例、或典型的术语都仅仅是出于更好地说明本发明的目的，而并不限制本发明的范围。不过，应该理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下，可以作出很多不同的修改。因此，应该明了，本发明不限于具体描述的实施方式，而仅由权利要求的范围所限定。
Claims (1)
1.一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S0，使用mTeSR1细胞培养液培养iPS细胞至60％～80％的密度后进行细胞传代，此时仍用mTeSR1细胞培养液培养；
S1，iPS细胞传代第二天将mTeSR1细胞培养液更换为含有小分子化合物组合1的神经分化培养液，培养6-7天；
S2，分散酶将细胞消化并按1孔传代6孔的比例转至基质胶包被处理过的孔板内，更换培养液为含有小分子化合物组合2的神经分化培养液，培养6天；
S3，分散酶将细胞消化并悬浮培养于神经分化培养液中10-12天；
S4，Accutase细胞消化液将细胞消化3～8分钟后贴壁，神经元贴壁培养液中培养7-8天可以得到成熟的神经元；
所述步骤S1中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有体积比1:1的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂及小分子化合物组合1；所述小分子化合物组合1的组成及浓度分别为：CHIR 99021 3μM，SB431542 2μM，LDN 193189 200nM；
所述步骤S2中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有笔记比1:1的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂及小分子化合物组合2；所述小分子化合物组合2的组成及浓度分别为：CHIR 99021 1μM，SB431542 2μM，LDN 193189 200nM；
所述步骤S3中，所述神经分化培养液为混合成分，其含有体积比1:1的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂、1×GlutaMax细胞添加剂；
所述步骤S4中，所述细胞球用Accutase细胞消化液消化5分钟后，再将神经球贴到经基质胶包被处理过的孔板或玻片上，用神经元贴壁培养液培养；所述神经元贴壁培养液为混合成分，分别含有Neurobasal培养基、1×N2细胞添加剂、1×B27细胞添加剂、脑源性神经营养因子10ng/ml、神经胶质细胞源性神经营养因子10ng/ml、环磷酸腺苷1μM、L-抗坏血酸200μM。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910975720.2A CN110656089B (zh) | 2019-10-15 | 2019-10-15 | 一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910975720.2A CN110656089B (zh) | 2019-10-15 | 2019-10-15 | 一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110656089A CN110656089A (zh) | 2020-01-07 |
| CN110656089B true CN110656089B (zh) | 2021-02-09 |
Family
ID=69040848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910975720.2A Active CN110656089B (zh) | 2019-10-15 | 2019-10-15 | 一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110656089B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113774022A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-12-10 | 上海益诺思生物技术股份有限公司 | 外周神经毒性的评价方法、细胞模型及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012011610A1 (en) * | 2010-07-21 | 2012-01-26 | Kyoto University | Method for inducing differentiation of human pluripotent stem cell into intermediate mesoderm cell |
| CN104031882A (zh) * | 2014-06-20 | 2014-09-10 | 上海安集协康生物技术有限公司 | 人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法 |
| CN106459904A (zh) * | 2014-03-11 | 2017-02-22 | 印第安纳大学研究和科技公司 | 用于生成内皮集落形成细胞状细胞的方法 |
| CN106701824A (zh) * | 2017-01-05 | 2017-05-24 | 福建医科大学附属第医院 | 基于人iPS细胞获取脊髓运动神经元及其功能性细胞的方法 |
| CN109385404A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-02-26 | 国典(北京)医药科技有限公司 | 一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用 |
-
2019
- 2019-10-15 CN CN201910975720.2A patent/CN110656089B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012011610A1 (en) * | 2010-07-21 | 2012-01-26 | Kyoto University | Method for inducing differentiation of human pluripotent stem cell into intermediate mesoderm cell |
| CN106459904A (zh) * | 2014-03-11 | 2017-02-22 | 印第安纳大学研究和科技公司 | 用于生成内皮集落形成细胞状细胞的方法 |
| CN104031882A (zh) * | 2014-06-20 | 2014-09-10 | 上海安集协康生物技术有限公司 | 人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法 |
| CN106701824A (zh) * | 2017-01-05 | 2017-05-24 | 福建医科大学附属第医院 | 基于人iPS细胞获取脊髓运动神经元及其功能性细胞的方法 |
| CN109385404A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-02-26 | 国典(北京)医药科技有限公司 | 一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Combined Small-Molecule Inhibition Accelerates Developmental Timing and Converts Human Pluripotent Stem Cells Into Nociceptors;Stuart M Chambers等;《Nat Biotechnol》;20120701;第30卷(第7期);第715-720页 * |
| Hox Networks and the Origins of Motor Neuron Diversity;Jeremy S. Dasen等;《Current Topics in Developmental Biology》;20090228;第88卷;第169-200页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110656089A (zh) | 2020-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6835335B2 (ja) | 終脳又はその前駆組織の製造方法 | |
| CN102604894B (zh) | 用于制备神经干细胞的培养基及其用途 | |
| CN110396499B (zh) | 一种诱导神经干细胞的方法及其应用 | |
| JP6824267B2 (ja) | ヒト誘導多能性幹細胞からライディッヒ細胞への分化誘導方法及びその用途 | |
| CN109385404B (zh) | 一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用 | |
| CN114149971A (zh) | 用hPSCs诱导分化得到中脑类器官的方法及中脑类器官 | |
| CN105219729B (zh) | 一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法及其用途 | |
| CN103160466A (zh) | 由万能干细胞所分化的神经上皮细胞的培养方法及培养基 | |
| JP2015047140A (ja) | 移植後の生着能を有する神経細胞と固体３次元マトリックスとの複合体 | |
| Chuye et al. | Brain organoids: expanding our understanding of human development and disease | |
| CN110656089B (zh) | 一种将iPS细胞定向诱导分化到成熟神经元的方法 | |
| Poulin et al. | Differentiation of lymphoblastoid-derived iPSCs into functional cardiomyocytes, neurons and myoblasts | |
| CN113136367A (zh) | 一种纹状体类器官的制备方法和应用 | |
| US10472607B2 (en) | Culture medium and method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neuroepithelial cells | |
| JP2020195349A (ja) | 脳幹オルガノイドの作製方法 | |
| JP2013017434A (ja) | 神経細胞とグリア細胞を共培養する方法 | |
| CN104862279A (zh) | 无外源诱导人多能干细胞为gaba神经元的方法和应用 | |
| CN102827812A (zh) | 诱导型神经干细胞的制备方法及应用 | |
| KR101793722B1 (ko) | 성상세포의 생산방법 | |
| KR101613677B1 (ko) | 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법 | |
| WO2011052281A1 (ja) | 神経スフェロイドネットワークの構築方法 | |
| CN116286646A (zh) | 将精原干细胞直接转分化为神经干细胞样细胞的方法 | |
| CN104130975B (zh) | 人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞及其制备方法和应用 | |
| Pierret et al. | Elements of a neural stem cell niche derived from embryonic stem cells | |
| CN112553160B (zh) | 一种化学诱导皮质神经元的方法及培养基 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211122 Address after: 410117 building 11, kangtingyuan phase I, No. 579, Zhenhua Road, Yuhua District, Changsha City, Hunan Province Patentee after: Hunan Jieyi medical laboratory Co.,Ltd. Address before: 201203 2nd floor, building 3, Hengyue international building, Lane 1238, Zhangjiang Road, Pudong New Area, Shanghai Patentee before: SHANGHAI GEMPLE BIOTECH Co.,Ltd. |