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CN101792732A - 人多能干细胞生长和分化的技术 - Google Patents

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CN101792732A
CN101792732A CN200910129670A CN200910129670A CN101792732A CN 101792732 A CN101792732 A CN 101792732A CN 200910129670 A CN200910129670 A CN 200910129670A CN 200910129670 A CN200910129670 A CN 200910129670A CN 101792732 A CN101792732 A CN 101792732A
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hes
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CN200910129670A
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莫莉莎·K·卡本特
沃尔特·D·方克
约瑟·D·高德
猪熊·S·小百合
徐春辉
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Original Assignee
Geron Corp
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Abstract

本公开文本提供了在不存在饲养细胞的情况下培养人多能干细胞(pPS)的改进系统。可以通过在胞外基质上支持培养物，在条件培养基中培养，替代饲养细胞的作用。提供了能商品批量产生条件培养基的永久细胞系。还公开了通过在细胞中引入病毒载体或DNA/脂类复合物改变pPS细胞的方法。在该公开文本中描述的系统能够大量增殖pPS细胞，用于研究pPS细胞分化的生物学和产生重要的人治疗用产品。

Description

人多能干细胞生长和分化的技术
本申请是2001年1月10日申请的申请号为CN01806319.5，题为“人多能干细胞生长和分化的技术”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明主要涉及胚胎细胞的细胞生物学领域。更具体的它涉及人多能干细胞的繁殖，促进繁殖的培养条件，及其用于改变遗传、产生cDNA文库和产生分化的细胞用于组织再生的用途。
相关申请的引用
本申请要求下列正在申请中的美国专利申请的优先权：USSN 60/175,581，2000年1月11日提交；USSN 60/213,740，2000年6月22日提交；USSN 60/213,739，2000年6月22日提交；USSN 60/216,387，2000年6月7日提交；USSN 60/220,064，2000年7月21日提交；USSN 60/220,064，2000年7月21日提交；和09/688,031，2000年10月10日提交。
为了在美国的执行，在此完整地引入以供参考。
背景
近来的发现引起了希望，即干细胞可以是一种替换由疾病、感染或由于先天异常导致损伤的细胞和组织的来源。当分裂时，各种类型的多能的干细胞分化，成熟成为带有特定组织，例如心脏、肝脏或大脑的独特功能的细胞。特别重要的发现是多能干细胞的发育，并认为它具有分化成几乎任何细胞类型的能力。
在小鼠中进行了对于多能干细胞的早期工作(由Robertson，Meth.Cell.Biol.75：173，1997；和Pederson，Reprod.Fertil.Dev.6：543，1994综述)。可从早期胚胎细胞和胚胎组织中分离出小鼠干细胞。多能干细胞的理想特征是它们能在体外以不分化的状态无限增殖，维持正常核型，并维持分化成全部三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的衍生物。
人多能干细胞的制备物的开发涉及克服许多技术困难，比用小鼠细胞落后得多。
Thomson等(美国专利5,843,780；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995)是首次成功分离和繁殖的灵长类多能干细胞。他们随后从人胚囊衍生出人胚胎干细胞(hES)系(Science 262：114，1998)。Gearlla和同事从胚胎性腺组织衍生出人胚胎生殖细胞(hEG)细胞系(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998；和美国专利6,090,622)。
有报道hES和hEG细胞具有长期寻求的多能干细胞特征：它们能长期在体外繁殖而不分化，它们具有正常的核型，保持能产生许多不同的细胞类型。因此，它们具有用于人治疗的希望，作为再生几乎所有任何由于基因异常、创伤或疾病病况损伤的组织的储备。
多能干细胞用于治疗的重要挑战是它们常规在一层饲养细胞上培养，以防止分化(US 5,843,780；U.S.6,090,622)。如果在培养环境中没有饲养细胞，hPS细胞将很快死亡，或分化成不同的定型细胞群。白血病抑制因子(LIF)抑制小鼠PS细胞的分化，但不取代饲养细胞防止人PS细胞分化的作用。不幸的是，用饲养细胞提高了生产成本、不利于放大生产并产生混合的细胞群，需要将多能干细胞与饲养细胞成分分开。
另一种挑战是控制干细胞分化成各病人治疗的需要特定类型的组织。本发明假设通过观察多能干细胞生长和分化过程中的基因表达，可以获得对分化过程的更好理解。
国际专利出版物WO 99/20741(Geron Corp.)标题为灵长类衍生的原始干细胞的生长的方法和材料。提供了一种细胞培养基，用于在随后不分化的状态下生长灵长类衍生的原始干细胞，具有低渗透压和低内毒素水平。基础培养基混合有一种血清，它能有效地支持原始多能干细胞在饲养细胞基质或饲养细胞介质上生长。培养基还含有非必需氨基酸、抗氧化剂、作为生长因子核苷酸或丙酮酸盐。
基于序列的人类发育早期研究集中在胚胎器官和组织产生的文库，例如I.M.A.G.E.协会的胚胎文库；http:/image.llnl.gov/。国际专利出版物WO98/00540(Incvte)报道了从衍生自THP-1细胞和膀胱癌的cDNA文库中分离了干细胞抗原的部分序列。
促进不分化的多能干细胞生长和操纵的新技术将是实现全能胚细胞治疗的主要成就。
发明简述
在此公开了一种无饲养细胞的细胞培养物，其含有：
a)无饲养细胞的灵长类胚胎干细胞的建立的品系；
b)营养培养基；和
c)选自Engelbreth-Horm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂、层粘连蛋白、巢蛋白、硫酸肝素的胞外基质成分。优选胞外基质成分是Engelbreth-Horm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂。
在本发明的一个具体实施方式中，营养培养基是条件培养基。优选调理条件培养基的细胞是成纤维细胞；还优选调理条件培养基的细胞是小鼠细胞品系；还优选调理条件培养基的细胞是表皮细胞；还优选调理条件培养基的细胞是用端粒酶基因转染的细胞。
在本发明的另一个具体实施方式中，灵长类倍增速率是20-40小时。
该公开提供了一种在不存在饲养细胞下培养灵长类多能干细胞(pPS)的改进系统。可以通过在胞外基质上支持培养物，在条件培养基中培养，替代饲养细胞的作用。提供了能商品批量产生条件培养基的永久细胞系。还公开了通过在细胞中引入病毒载体或DNA/脂类复合物而遗传改变pPS细胞的方法。在该公开文本中描述的系统能够大量增殖pPS细胞，用于pPS细胞分化生物学的研究和产生重要的人治疗用产品。
本公开中描述的是含有基本不含饲养细胞的增殖性pPS细胞的组合物。该组合物还可以含有从饲养细胞的培养物收集的培养基产生的条件培养基，和用胞外基质成分包裹的底物。pPS细胞可以在该生长环境中以不分化状态传代和增殖。
本公开还提供了一种产生适于在基本无饲养细胞的生长环境中培养灵长类多能干细胞(pPS)的条件培养基的方法，包括通过在培养基中培养细胞调理培养基，并收集条件培养基。用于调理培养基的细胞具有一种或多种理想的特征，例如源自非恶性来源，具有正常核型，能广泛培养(例如60天或以上)，具有成纤维细胞特有的细胞标记的形态特征，是无限增殖化的(例如通过基因改变，表达端粒酶反转录酶)。描述了从人胚胎干细胞产生合适的人饲养细胞系。
该公开提供了一种产生分化的细胞群的方法，包括导致或允许pPS细胞在无饲养细胞的培养物中分化。
该公开还提供了一种从pPS细胞(和/或不和饲养细胞一起培养)通过直接分化产生分化细胞的方法。在过度生长、形成集落、胚状体或其它聚集物前从未分化的供体培养物制备细胞悬液，然后直接铺到固体表面。这表面可带有多聚正电荷(例如多聚赖氨酸或多聚鸟氨酸)还可以通过抽取血清或抑制分化的因子，和/或在无饲养细胞培养物或重新铺板后加入促进分化的因子，可促进沿一定细胞系分化。
该公开还提供了一种筛选细胞毒性或调节细胞的化合物的方法，包括使本发明的分化的细胞与化合物接触，确定细胞中任何由于与化合物接触导致的表型或代谢的改变，并将该改变和细胞毒性和细胞功能或生物化学中的任何其它改变进行。
可以比较从pPS细胞获得的不同细胞群之间的基因和蛋白质比较，来鉴定和确定上调或下调分化过程的因子，并产生受影响的基因的核苷酸拷贝。
本公开还提供了产生基因改变的灵长类多能干细胞(pPS)的方法。在一种变化中，在无饲养细胞培养物中转染pPS细胞。在另一种改变中，在含有具有药物抗性的饲养细胞的培养物中转染pPS细胞，能通过成功转染的pPS细胞的药物筛选。用于转染的载体通常含有与促进未分化的pPS细胞转录的启动子可操纵性连接的蛋白质编码区。还提供了一群灵长类多能干细胞(pPS)细胞或从其分化的细胞，其中细胞的大部分已被多核苷酸稳定转染，或者是继承了这些细胞的子代。
本公开还提供了一种在分化前或后从灵长类多能干细胞(pPS)产生mRNA制备物或cDNA文库的方法，包括提供基本无饲养细胞的未分化pPS细胞的培养物，可任选的允许pPS细胞分化，并从未分离或分离的细胞中分离mRNA。这些技术可用于制备cDNA表达和扣减文库。当从无饲养细胞的pPS培养物获得mRNA时，cDNA文库可包含未分化pPS细胞、或从pPS细胞分化的细胞和基本无其它脊椎动物的cDNA的至少1,000个mRNA水平表达的基因。在未分化的pPS细胞及其分化的子代中表达的基因的序列信息可用于制备表达的基因的cDNA和蛋白质衍生物，和针对基因产物的特异性抗体。
根据下文的描述可阐明本发明的这些和其它方面。
附图
图1是无饲养细胞培养物中显微照相的半色调复制。A栏(左侧)显示了在常规培养基(mEF/RM)或在mEF条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00051
、层粘连蛋白、纤连蛋白或胶原IV饲养细胞上培养的hES细胞的形态。B栏(右侧)显示了维持在mEF、NHG190、STO和BJ 5Ta细胞调理的培养基中，与未调理的常规培养基(RM)比较，Matrigel
Figure G2009101296702D00052
上维持的hES细胞的形态。常规培养基中的hES细胞在培养的第一周内分化。一些类型的条件培养基中hES细胞细胞含有未分化的细胞的合适形态的集落。栏C是柱状图，显示维持在常规培养基(mEF/RM)中的饲养细胞上，或mEF条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00053
或层粘连蛋白上的mES细胞中测定的整联蛋白表达。整联蛋白成分α6和β1可以起到将hES细胞附着于胞外基质的作用。
图2通过FACS分析显示了无饲养细胞的细胞中表面标记的表达。A栏是FACS扫描图案，显示SSEA-4，一种在常规培养基(mEF/RM)中的饲养细胞上，或在含有条件培养基的胞外基质上生长的hES细胞表达的糖蛋白的表达。B栏是柱状图，显示在不同基质上培养的hES细胞的表面标记的荧光强度。C栏是柱状图，显示不同细胞系的条件培养基中Matrigel
Figure G2009101296702D00054
上hES细胞的表面标记。
图3是显微照片的半色调复制，显示免疫细胞化学分析检测的与原始饲养细胞(mEF)或在胞外基质Matrigel
Figure G2009101296702D00055
，或在条件培养基中的层粘连蛋白上生长的细胞的标记表达。无饲养细胞的培养基中生长的hES细胞具有与在小鼠成纤维饲养细胞中生长的hES相似的表型标记。
图4提供了对与饲养细胞或含有常规培养基(RM)或条件培养基(CM)的胞外基质(Matrigel
Figure G2009101296702D00056
或层粘连蛋白)培养的hES细胞中OCT-4和hTERT表达的分析。下面一栏是柱状图，比较了在不同底物上生长的细胞的表达水平，表示成OCT-4或hTERT与18s标准之比。条件培养基中的层粘连蛋白和Matrigel
Figure G2009101296702D00057
上生长的hES细胞具有与在饲养细胞层上生长的细胞相似的表达模式。
图5是凝胶的半色调复制，显示在培养的hES细胞中用TRAP试验测量的端粒酶活性。所有培养条件显示在无饲养细胞培养物中40天后阳性的端粒酶活性。
图6是在培养的hES细胞上进行的免疫细胞化学的半色调复制，它们能通过形成胚状体分化。不论hES是在饲养细胞还是在胞外基质上培养，染色模式和分化成不同细胞类型的性能一致。染色模式显示神经元和心肌细胞品系的细胞(分别是β-微管蛋白III和心脏肌原蛋白I)。还有α-胎球蛋白，内胚层品系的标记的细胞。
图7是衍生自hES细胞的畸胎瘤，分化成不同细胞品系的能力的另一种指标的组织病理学半色调复制。A栏(上栏)显示来自在mEF饲养细胞上生长的hES的畸胎瘤的许多不同细胞。B栏(下栏)显示在无饲养细胞培养物中生长的hES的畸胎瘤中不同的细胞。
图8是转导的hES细胞GFP表达和SSEA-4，未分化细胞的标记的FACS模式。将hES细胞铺在饲养细胞层上，用腺病毒载体Ad5GFP或反转录病毒载体GRN354(两者都含有GFP表达盒)感染48小时。收集细胞，用针对SSEA-4的抗体染色，用流式细胞计数评估GFP表达。上栏显示模拟感染的培养物中背景荧光和SSEA-4阳性染色。下栏显示GFP表达得到的绿色荧光水平。
图9显示实验结果，其中在无饲养培养物中通过脂转染培养基因改变hES。A栏是光学显微照片的半色调，显示在GFP表达转染后，在层粘连蛋白上hES细胞的形态。B栏是荧光显微照片的半色调，显示同一集落的GFP表达。C栏是柱状图，显示在各种条件下表达GFP的细胞百分数。
图10是条状图，显示GFP-阳性细胞在SSEA-4阳性细胞群(未分化的ES细胞)中的百分数。A栏：在无饲养细胞的培养物中的未分化hES集落中观察到亮细胞。相反，在饲养细胞上生长的hES细胞集落中发现非常少的绿色荧光细胞。FACS分析显示，Matrigel
Figure G2009101296702D00061
上16％的细胞和层粘连细胞上的14％细胞在SSEA-4阳性(未分化)细胞群中的是GFP阳性，而饲养细胞中仅5％细胞是阳性的，提示用无饲养细胞条件显著提高了转染效力。B栏显示用不同条件的Lipofectamine 2000TM(L)或FuGENETM(F)转染GFP报道质粒的效率。
图11显示能产生在无饲养细胞培养物中支持hES细胞人细胞系的条件培养基。A栏是相差显微照片的拷贝，显示HEF1细胞系具有成纤维细胞的形态特征。B栏(下文)是TRAP试验结果的拷贝，显示用或端粒酶反转录酶(hTERT)的反转录病毒载体转染HEF1细胞获得端粒酶活性的HEF1细胞。
图12显示hTERT转导的HEF1细胞，和用载体对照转导的细胞的生长。两种品系最初每2天倍增。然而，对照细胞在38日停止增殖，而hTERT转染的细胞以稳定的生长速率继续增殖超过60天。
图13是hTERT转导的细胞和对照细胞在衰老关联的β-半乳糖苷酶，一种已知的细胞老化的生物标记，染色后的显微照片。用hTERT转染延长了细胞系的生命周期，阻止衰老。
图14显示传代入条件培养基后hES细胞的集落。A栏是光学显微照片的拷贝，显示维持在用原始小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)或人成纤维细胞样细胞系HEF1调理的培养基中维持的hES细胞培养物中未分化的集落。B栏(右侧)是TRAP的结果拷贝，显示用HEF1条件培养基维持的hES细胞显示未分化细胞的端粒酶活性。
发明详述
本公开提供了体外培养原始多能干细胞(pPS)，而不需要饲养细胞层来抑制分化的系统。
已发现饲养细胞的作用可以通过培养环境中支持细胞繁殖而不分化的特征替换。一个这样的特征是细胞表面的合适底物，例如胞外基质，例如Matrigel和层粘连蛋白。另一个特征是用含有在某些方面有效抑制分化的培养基，例如条件培养基。调理培养基，用于支持pPS细胞的细胞包括原代胚胎成纤维细胞和从培养的pPS细胞分化和选择的成纤维细胞样细胞。
在示范性制备物中，从饲养细胞上的hES培养物收集未分化的hES集落，然后以每个9.6cm2孔约15个集落接种在条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00072
底物上。接种后，见到未分化的hES细胞是约100-2,000个细胞的小集落，而在集落之间存在单细胞，似乎是正在分化或死亡的。随着hES细胞增殖，集落变得大而紧密，占了培养皿的大部分表面积。在接近汇合时，大多数细胞具有未分化细胞的形态特征，集落之间的分化细胞占培养物中细胞的10％。
倍增速率是20-40小时左右，与在饲养细胞上生长的hES相当。培养基每天改变，细胞每隔6或7天分裂和传代。最初接种后19天，用免疫荧光法测定细胞的细胞表面表型。90％以上的细胞为SSEA-4和Tra-1-60染色阳性；80％以上是Tra-1-81染色阳性，但只有15％以上是SSEA-1染色阳性。这表明制备物中至少约80％的细胞具有未分化的hES细胞预期的表型。
还发现了饲养细胞可以固定和维持在长期培养基中，而不会使其丧失产生高质量条件培养基的能力。例如，可通过基因改变原代小鼠胚胎成纤维细胞，使其表达端粒酶反转录酶，使其固定化(实施例8)。还发现了适合调理培养基的人细胞可以通过体外分化胚胎干细胞获得。hES细胞是通过在悬液中形成胚状体分化的，然后以这种方式培养，获得同源的成纤维细胞样细胞群(实施例12和13)。
未转导和端粒酶化的hEF细胞系在连续细胞培养中增殖，并被用于产生条件培养基。发现在培养基中生长的hES细胞形成具有未分化hES细胞形态特征的集落，与直接在一层原代mEF饲养细胞上生长的hES细胞不可区分(图14，A栏)。这是重要的，因为它排除了重复制备饲养细胞培养物，以持续培养的需要，使得pPS细胞可以稳定地高质量地以商品规模生产。
在无饲养细胞的环境中培养pPS细胞具有许多重要的优点。例如：
·产生pPS细胞及其衍生物更容易进行商业规模的生产。不需要持续产生饲养细胞来支持培养，可机械传代细胞。
·在无饲养细胞培养物中促进了细胞分化成定型前体或最终分化的细胞。无饲养细胞培养形成的胚状体产生更稳定的细胞群。另外，可通过将无饲养细胞的干细胞直接铺在合适的固相载体上，进行直接分化。视条件可获得相当均一的细胞群。
·不用饲养细胞和人细胞调理培养基就能产生pPS细胞从调节检查的观点出发是吸引人的-pPS细胞不含异源成分和培养物中其它细胞的癌症起源的成分。
·还促进了药物、毒素或可能的分化调节剂的筛选。可在培养基中加入物质，不而不对用于支持培养基的饲养细胞产生协同效应。
·可用无饲养细胞的pPS细胞培养物轻易的产生高质量mRNA和cDNA文库。每平方厘米培养物面积的mRNA产量更高。文库不被饲养细胞转录物(不同物种的cDNA或不同的人基因型)污染，表达模式将反映多达90％未分化pPS细胞的表型。还可以获得富含在发育中调节的基因的全长cDNA的扣减文库。
·无饲养细胞培养物的基因转染通过药物抗性标记促进转染细胞的筛选，并得到更高水平的瞬时表达。发现了基因改变pPS细胞，而不导致其在药物抗性饲养细胞或无饲养细胞培养物中分化的方法。无饲养细胞系统具有改进转染效率的额外优点。在模式实验中，无饲养细胞培养物中的约15％细胞被标记基因转染，而原代饲养细胞层上的转染效力通常仅是未分化hES细胞的5％，表明用无饲养细胞培养基条件显著增强了转染效率。
本发明中提供的技术代表用于研究和治疗用途的多能干细胞的重要进步。本发明的其它优点将在下文中被理解。
定义
原型“灵长类多能干细胞(pPS细胞)”是衍生自受精后的胚前期、胚胎或胎儿组织的多能细胞，并具有能在正确的条件下产生几种不同细胞类型的子代的特征。根据标准领域内接受的测试，例如在合适宿主中形成畸胎瘤的能力，pPS细胞能产生作为三种胚层的衍生物的子代：内胚层、中胚层和外胚层。
pPS细胞的定义中包括各种类型的胚胎细胞，例如胚胎干细胞(hES)细胞，如Thomson等(Science 282：1145，1998)所述；其它灵长类的胚胎干细胞，例如Rhesus或狨猴干细胞，如Thomson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995；发育生物学38：133，1998)所述；和人胚胎精细胞(hEG)细胞，如Shamblott等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)所述。其它类型的多能细胞也可以包括在该术语内。包括任何灵长类来源，能产生所有三种胚层的衍生物的子代的细胞，不论它们是否衍生自胚胎组织、胎儿组织或其它来源。对于本发明的许多实施例，有益地使用核型正常，不是衍生自恶性来源的pPS细胞。
pPS细胞培养物被描述成“未分化”或“基本未分化”的，当该群中大部分干细胞及其衍生物显示未分化的形态特征，将其与胚胎或成年来源的分化细胞清楚地分开。本领域技术人员不难辨认未分化的pPS细胞，通常在显微镜图的两维中以高核/胞浆比和明显的核点出现。可理解群中未分化细胞的集落通常被分化的邻近细胞包围。不论如何，当群在合适条件下培养或传代时，未分化的集落持续，各种未分化的细胞占细胞群的相当比例。基本是未分化的培养物含有至少20％未分化的pPS细胞，可含有至少40％、60％或80％，以提高表现(基于具有相同未分化的基因型的细胞百分数)。用公开文献中描述的方法，有时可以在基本未分化的培养物中产生或传代含有相对低的分化的pPS细胞比例(甚至低至5或10％)的培养物。
当本公开引用的培养物或细胞群被称为“未经分化”增殖时，指在增殖后，组合物主要是根据上面的定义的未分化的。增殖至少4代(约20次倍增)而不分化的群将基本含有未分化的相同比例(或可能更高比例的未分化细胞)，当以与起始培养物相同程度的汇合评估时。
“饲养细胞”或“饲养物”是与另一种类型细胞共同培养的一类细胞，来提供其中第二种细胞能生长的环境。饲养细胞可任选自与其支持的细胞不同的物种。例如，可用小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物、固定化的小鼠胚胎成纤维细胞或从hES细胞分化的人成纤维细胞样细胞，如本公开中所述支持一些类型的pPS细胞。在与pPS细胞的共培养中，通过辐射或用抗有丝分裂剂，例如丝裂霉素c处理，灭活饲养细胞，防止其生长超过其支持的细胞。为了用于产生条件培养基，灭活细胞是任选的，部分依赖于培养基生产的机械方面。
如果细胞在分裂后生长了至少一轮，其中未加入新鲜饲养细胞来支持pPS的生长，pPS细胞群被称为是“基本无饲养细胞”。认识到如果先前用含有饲养细胞的培养物作为不加入新鲜饲养细胞的pPS培养物的来源，将有一些饲养细胞在传代中活下来。例如，hES细胞通常在9.6cm2孔中，在接近汇合的约375,000个经辐照过的原胚胎成纤维细胞上培养。到培养终点，大约150,000个饲养细胞仍然存活，分裂并与hES一起传代，后者增殖到约1-1.5×106的数量。在1∶6分裂后，hES细胞通常停止增殖，但成纤维细胞不生长，仅一小部分在培养约6天结束时存活。该培养物基本无饲养细胞，组合物含有约5％以下的饲养细胞。更优选含有少于1％、0.2％、0.05％、或0.01％的饲养细胞的组合物(表达成培养物中总细胞的％)。
当在该公开中培养物或细胞群被称为“无饲养细胞”时，意味着组合物根据上述定义基本无饲养细胞，如果明显需要仅进一步限制。
“生长环境”是一种感兴趣的细胞将体外增殖的环境。环境特征包括细胞培养的培养基、温度、O2和O2的分压和如存在支持结构(例如固体表面的底物)。
“营养培养基”是用于培养细胞的含有促进增殖的营养物的培养基。营养培养基可含有任何下列合适的组合：等渗盐水、缓冲液、氨基酸、抗生素、血清或血清替换物、和外源加入的因子。“条件培养基”是通过在培养基中培养第一群细胞，然后收集培养基制备的。条件培养基(和任何细胞分泌到培养基中的东西)然后可以用于支持第二群细胞的生长。
“限制性发育品系细胞”是衍生自胚胎组织，通常是通过pPS细胞的分化或部分分化衍生的细胞。这些细胞能增殖和分化成几种不同的细胞类型，但是其储备的范围有限。例子是造血细胞，它是血细胞型的多能细胞，和干细胞祖细胞，它是窦状内皮细胞、干细胞和可能其它干细胞的多能细胞。另一个例子是神经限制细胞，它可以产生发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞的神经胶质细胞前体，和发展成神经元的神经元前体。
术语“多核苷酸”指任何长度的核苷酸的多聚形式。包括基因和基因片段、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、分离的DNA和RNA、核酸探针和引物。如本公开所用的，术语“多核盐酸”可互换的指双链和单链分子。除非另外说明或需要，本发明的任何作为多核盐酸的实施例包含双链形式，已知或预测的两种互补的单链形式组成双链形式。当在多核苷酸之间比较相同程度时，自然了解互补链容易产生，选择或预测根据相对部分比较的多核苷酸之间相同程度最大的有义或反义链，然后计算比较的序列之间共有的残基数，作为检测区域的百分数，而不补偿明显插入或缺失的存在。
“控制元件”或“控制序列”是与分子相互作用有关的核苷酸序列，它引起多核苷酸的功能调节，例如复制、重复、转录、剪接、翻译或降解多核苷酸。转录控制元件包括启动子和增强子。
如果基因元件的结构关系允许它们根据它们所预期的功能的方式起作用，则它们“可操纵性连接”。例如，启动子与编码区可操纵性连接，如果启动子帮助引发编码序列转录。在启动子和编码区之间可以有插入序列，只要维持这种功能性关系。
“克隆载体”是一种允许序列插入宿主细胞的载体的多核苷酸载体(例如质粒、噬菌体或植物或动物病毒)。在cDNA文库的情况下，复制的载体含有从多种基因转录的异源mRNA制备物拷贝的异源多核苷酸插入。如果插入物与允许插入物在宿主细胞中以蛋白质或mRNA水平表达的转录调控元件可操纵性连接，载体也可被称为“表达载体”。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本公开中互换使用，指任意长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以含有修饰的氨基酸，可以是线性或分枝的，可以被非氨基酸间断。通过首先排列要检测的多肽和参比对应部分或原型，然后计算要比较的序列之间共有的残基数作为检测区域的百分数，不补偿存在的插入或缺失，来计算序列相同性百分数。当进行取代时，通常更能接受保守取代(其中一个氨基酸被另一个具有类似电荷、大小、疏水性或芳族性的氨基酸取代)。所需的序列保持原型的功能：例如酶活性、特异性底物的结合和在标准竞争抑制免疫试验中作为可检测的特异性抗体的结合。
当多核苷酸被用任何人工操纵的合适方法转移到细胞中，或细胞是继承了多核苷酸的原始改变的细胞的子代，该细胞被称为是“基因改变的”、“转染的”或“基因转化的”。多核苷酸常常含有编码感兴趣的蛋白的可转录序列，使得细胞在提高水平表达蛋白质。还包括用任何方法基因改变的多核苷酸，导致内源基因功能改变或停止其活性。
如果被改变的细胞的子代具有相同改变，该基因改变被称为“可遗传的”。确定基因改变是否是可遗传的，可通过检测多核苷酸模板的存在(例如通过PCR扩增)，或通过检测依赖于要表现的基因改变的表型特征(例如表达基因产物或其效果)进行。
如果基因改变被至少4轮细胞复制继承，该基因改变被称为“稳定的”，可检测为第7代细胞中多核苷酸的存在。如果第7代细胞中的表型特征是亲本基因改变的细胞的至少10％(通常至少50％)，表型的表达(在mRNA、蛋白质或功能水平)被称为“稳定的”。如果不存在第7次细胞分裂的原始基因改变的细胞的子代不存在多核苷酸模板，基因改变被称为“瞬时的”。如果第7代细胞中的表型特征不大于原始基因改变的细胞中的5％，不论是由于模板丧失或由于一些机制抑制了模板的表达，表型的表达被称为“瞬时的”。
“细胞系”是一群可以在培养物中繁殖至少10代的细胞。该群可以是表型相同的，或可以是显著不同的表型的混合物。细胞系的特征是该群作为整体在10代后基本不改变的特征。
细胞被称为“端粒化的”，如果它被任何物种的编码端粒酶反转录酶(TERT)的核酸基因改变，其方式是TERT在细胞中转录和翻译。术语还用于原始改变的细胞的子代，这些细胞继承了以提高水平表达TERT编码区的能力。TERT编码序列通常是从哺乳动物TERT基因取得或适应的，例如如下文表明的人和小鼠TERT。
细胞系被描述成“永久的”或“无限增殖的”，如果它具有至少一个下列特征：1)它经基团改变以可检测地提高端粒酶反转录酶的表达，如在TRAP分析中端粒酶活性的提高；2)对于不能多于15次数量倍增的细胞系，它经基因改变，可以在合适的培养条件下至少20次数量倍增；或3)能15次以上数量倍增的细胞系，它可以经基因改变，在典型培养条件下延长细胞系的复制能力。理解符合该定义的细胞不仅包括原始的基因改变的细胞，还包括所有这些细胞的符合列出的关键的子代。
用于该公开的术语“抗体”指多克隆和单克隆抗体。术语的边界有意不仅包含完整的免疫球蛋白分子，还包括免疫球蛋白分子的片段和衍生物(例如单链Fv构建体)和免疫球蛋白等价物的片段和衍生物，例如T-细胞受体，如本领域已知的技术制备的，并维持所需的抗原结合特异性。
一般技术
为了进一步详细描述本发明实践中使用的一般技术，实施人可引用细胞生物学、组织培养和胚胎学中的标准教科书和综述。包括畸胎瘤和胚胎干细胞：实践方法(E.J.Robertson编，IRL Press Ltd，1987)；小鼠发育技术指南(P.M.Wasserman等编，Academic Press 1993)；胚胎干细胞体外分化(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900，1993)；胚胎干细胞的性质和用途：人类生物学和基因治疗应用的前景(P.D.Rathjen等，1993)。干细胞分化由Robertson，Meth.Cell Biol.75：173，1997；和Pederson，Reprod.Fetil.Dev.10：31，1998综述。
分子遗传学和基因工程中的方法一般在目前版本的Molecular Cloning：ALaboratory Mannual(Sambrook等)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编)；动物细胞培养(R.I.Freshney编)；哺乳动物细胞的基因转移载体(Miller & Calos编)；CurrentProtocols in Molecular Biology and Short protocols in Molecular Biology，第三版(F.M.Ausubel等编)；和重组DNA方法(R.Wu编，Academic Press)有所描述。本公开中引用的试剂、克隆载体和基因操纵的试剂盒购自供货商例如BioRad、Stratagene、Invitrogen和ClonTech。
对于制备mRNA和cDNA文库中涉及的一般技术及其分析，本领域技术人员可参考RNA Methologies：A Laboratory Guide for Isolation andCharacterization(R.E.Farrell，Academic Press，1998)；cDNA LibraryProtocols(Cowell & Austin编，Humana Press)；Functional Genomics(Hunt &Liversey编，2000)；和Annual Review of Genomics and Human Genetics(E Lander编，每年由Annual Review出版)。技术还可以参见其它表达文库的描述，例如发育性胚胎小鼠文库(U.S.5,789,158)；产生扣减cDNA文库的方法(U.S.5,643,761)；比较性基因转录分析(WO 95/20681，Incyte Pharmaceuticals)；小鼠胚胎干细胞的基因捕获方法(Skarnes等，Genes Dev 6：903，1992)；Sasaki等，Genomics 49：167，1998；Adjaye等，Genomics 46：337，1997；Nishiguchi等，J.BioChem.119：749，1996；和Phillips等，Science 288：1635，2000。
用于产生，纯化和修饰抗体的一般技术，和包括免疫细胞化学等的免疫试验的设计和执行，读者可参见Handbook of Experimental Immunology(Weir &Blackwell编)；Current Protocols in Immunology(Coligan等，编)；和Methodsof Immunological Analysis(Masseyeff等编，Weinheim：VCH Verlags GmbH)。
细胞培养和培养基选择中的一般技术概述于Large Scale Mammalian CellCulture(Hu等，Curr.Opin.Biotechnol.8：148，1997)；Serum-free Media(K.Kitano，Biotechnology 17：73，1991)；Large Scale Mammalian Cell Culture(Curr.Opin.Biotechnol.2：375，1991)；和Suspension Culture of Mamalian Cells(Birch等，Bioprocess TEchnol.19：251，1990)。其它感兴趣的读物包括UnderstandingMedia(M.McLuhan，Mentor NY，1964)和The Medium is the Massage(M.McLuhan& Q.Fiore，Bantam，NY，1967)。
多能干细胞来源
根据本发明合适的培养和分化的来源细胞包括在妊娠后形成组织衍生的多能细胞的建立的品系。示范性的原代组织来源是胚胎组织(例如胚泡)或在妊娠任何时间取得的胎儿组织，通常但不是必需的早于妊娠10周。非限制性例子是灵长类胚胎干细胞(ES)和胚胎精细胞(EG)的建立的品系。在最初建立或稳定这些细胞的过程中还考虑了使用本公开的技术，其中来源细胞可以是直接从列出的组织取得的原代多能细胞。
培养基和饲养细胞
分离和繁殖pPS细胞的培养基具有几种不同配方，只要获得的细胞具有所需的特征，可以进一步繁殖。合适的来源如下：Dulbecco的改良Eagles培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；敲除Dulbecco的改良Eagles培养基(KO DMEM)，Giboc#10829-018；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。示范性含血清的ES培养基是用80％DMEM(通常是KO DMEM)、未热灭活的20％限制性胎牛血清(FBS)、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇制备的。培养基并过滤储藏在4℃不长于2周。无血清的ES培养基是用80％KO DMEM、20％血清替代物、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇制备的。不是所有的血清替代物都可以用；一种有效的血清替代物是Gibco #10828-028(专利配方；从厂商获得)。过滤培养基，储藏在4℃不长于2周。在使用前，加入最终浓度为4ng/ml的人bFGF。
pPS细胞通常在一层以各种方式，例如产生促进pPS存活或增殖，或抑制分化的可溶性因子支持pPS细胞的饲养细胞上培养。饲养细胞通常是成纤维细胞类型的细胞，通常衍生自胚胎或胎儿组织。常用的来源是小鼠胚胎。通过获得胚胎成纤维细胞，转染使其表达端粒酶，然后传代或冷冻用于未来使用，获得了有用的饲养细胞系。细胞系铺板使其接近汇合，辐射防止增殖，用于支持pPS细胞培养。
在一个例子中，pPS首先衍生并支持在胚胎成纤维细胞上。可从远交的CF1小鼠(SASCO)或其它合适品系获得小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)。在妊娠第13天用70％乙醇擦拭小鼠腹部，将蜕膜移到磷酸缓冲盐(PBS)中。收集胚胎；除去胎盘、羊膜和软组织；用PBS洗涤尸体两次。然后将其转移到新鲜的含2ml胰蛋白酶/EDTA的10厘米细菌培养皿中，最终切碎。37℃培育5分钟后，用含有10％FBS的5ml DMEM灭活胰蛋白酶，将混合物转移到15ml的锥形管中。使碎片沉淀2分钟，上清液占终体积10ml，铺在10厘米组织培养板或T75烧瓶中。烧瓶静置培养24小时，然后替换培养基。当烧瓶汇合(约2-3天)，它们1∶2分到新烧瓶中。
饲养细胞在含有90％DMEM(Gibco #11965-092)、10％FBS(Hyclone #30071-03)和2mM谷氨酰胺的mEF培养基中繁殖。mEF在T150烧瓶(Corning #430825)中繁殖，用胰蛋白酶每隔1天将细胞一分为二，保持细胞不汇合。为了制备饲养细胞层，用一定剂量辐照细胞，来抑制增殖但允许合成重要的支持hES细胞的因子(约4000radsγ-辐射)。通过在37℃保温用1ml 0.5％的明胶包裹6孔培养板(例如Falcon#304)的每孔过夜，每孔铺375,000个辐射过的mEF。铺板后5小时-4天使用饲养细胞层。用新鲜hES培养基在接种pPS细胞前替换培养基。
人胚胎干细胞(hES)的制备
人胚胎干细胞(hES)可如Thompson等(美国专利5,843,780；Science282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995)所述制备。
简单地说，人成纤维细胞可以从人体内预植入胚胎获得。另外，可使用体外受精(IVF)的胚胎，或单细胞的人胚胎可以扩张到胚泡阶段(Bongso等，Hum Reprod4：706，1989)。人胚胎在G1.2和G2.2培养基中培养到胚泡阶段(Gardner等，Fertil.Steril.69：84，1998)。发育的胚泡可选择用于ES细胞的分离。从胚泡通过简单接触链霉蛋白酶(Sigma)除去透明带。用免疫手术分离内细胞团，其中胚泡接触1∶50稀释的家兔抗人脾细胞抗血清30分钟，然后用DMEM洗涤3次，每次5分钟，接触1∶5稀释的豚鼠补体(Gibco)3分钟(见Solter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72：5099，1975)。再用DMEM洗涤2次后，从完整的内细胞团通过温和吸取除去裂解的滋养外胚层细胞，将ICM铺在mEF饲养细胞层上。
9-15天后，内细胞团衍生的外生物通过接触无钙和镁的磷酸缓冲盐(PBS)和1mM EDTA，通过接触分散酶或胰蛋白酶。或通过用微量滴管机械分散分裂成团；然后重新铺在新鲜培养基中的mEF上。分散的细胞重新铺在新鲜ES培养基中的mEF饲养细胞层上，观察集落形成。显示未分化形态的集落分别是通过微量滴管、机械分离成团，和重新铺板选择的。ES-样形态的特征是密集的集落就明显高的核/胞浆比和明显的核。得到的ES细胞然后通过简单胰蛋白酶处理每1-2周常规分离，与Dulbecco的PBS(不含钙或镁，含2mM EDTA)接触或通过用微量滴管选择单个集落。最佳约50-100个细胞的团块大小。
人胚胎精细胞(hEG)的制备
人胚胎精细胞(hEG)可以从存在于在最后一次月经后8-11周的人胎儿材料原始精细胞。合适的制备方法如shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13726，1998和美国专利6,090,622中所述。
简单说，用等渗缓冲液漂洗生殖嵴，然后置于0.1mL 0.05％胰蛋白酶/0.53mMEDTA钠溶液(BRL)中，切成＜1mm3的块。然后用100微升tip吹洗组织，进一步解聚细胞。37℃保温约5分钟，然后加入约3.5mL EG生长培养基。EG生长培养基是DMEM、4500mg/L D-葡萄糖、2200mg/L mM碳酸氢钠；15％ES优质胎牛血清(BRL)；2mM谷氨酰胺(BRL)；1mM丙酮酸钠(BRL)；1000-2000U/ml人重组白血病抑制因子(LIF，Genzyme)；1-2ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Genzyme)；和10μM弗司扣林(在10％DMSO中)。在另一种方法中，用透明质酸酶/胶原酶/DNase分离EG细胞。从胎儿物质分解出性腺anlagen或具有系膜的生殖嵴，在PBS中漂洗生殖嵴，然后置于0.1ml HCD消化溶液(0.01％V型透明质酸酶，0.002％DNAse I、0.1％IV型胶原酶，都来自Sigma，制备在EG生长培养基中)。切碎组织，37℃保温1小时或过夜，重悬浮在1-3ml EG生长培养基中，铺在饲养细胞层上。
用在无LIF、bFGF或弗司扣林的改良EG生长培养基中培养3天未汇合的饲养细胞层制备96孔组织培养板，用5000radγ-辐射灭活。合适的饲养细胞是STO细胞(ATCC登录号CRL 1503)。在各孔中加入约0.2ml原代胚细胞(PGC)悬液。在EG生长培养基中7-10天后进行第一次传代，将各孔转移到24孔培养皿的一个孔中，该孔先前用辐射过的STO小鼠成纤维细胞制备。细胞每日更换培养基培养，直到观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常是在7-30天或1-4代后。
在不存在饲养细胞的情况下繁殖pPS细胞
使用支持增殖而不促进分化的培养条件组合，pPS细胞可以在培养物中连续繁殖。已确定hES细胞可以不分化而生长，甚至在没有饲养细胞的条件下。对于无饲养细胞培养物，有益的是提供可兼容的培养表面(底物)和提供饲养细胞所提供的一些影响的营养培养基。
特别适于作为无饲养细胞pPS培养基底物的是胞外基质成分(衍生自基底膜，或粘着分子受体-配体偶联物的形成部分)。商品制备物购自Becton Dickenson，商品名为Matrigel
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，并可在常规或生长因子还原型制剂获得。两种制剂都是有效的。Matrigel
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是在室温下胶凝形成重建的基底膜的Engelbreth-Horm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂。
其它胞外基质成分和成分混合物适合作为替代品。视增殖的细胞而定，这可以包括层粘连蛋白、纤溶酶、粘蛋白、巢蛋白。硫酸肝素等，单独或各种组合。层粘连蛋白是脊椎动物中所有基础片层的主要成分，它与整联蛋白异二聚物，例如α6β1和α6β4(层粘连蛋白特异性)和其它异二聚物(与其它基质交叉反应)相互作用。使用实施例中说明的培养条件，IV型胶原支持hES细胞生长，而I型不胶原支持。可以用本文上述的实验法测试的底物包括但不限于其它胞外基质成分和聚胺(例如聚鸟氨酸、聚-赖氨酸)和其它市售包衣。
多能细胞以合适的分布铺在底物上，在促进细胞生存、繁殖和维持所需特征的培养基上。这些特征是由于仔细留意接种分布获得的。分布的一个特征是铺板密度。发现至少约15,000个细胞cm-2的铺板密度促进生存和限制分化。通常使用约90,000-170,000cm-2之间的铺板密度。
另一种特征是细胞分散。小鼠干细胞的繁殖涉及细胞分散在单细胞悬液中(Robinson，Meth.Mol.Biol.75：173，1997，177页)。相反，传代的灵长类PS细胞先前被认为需要将细胞保持在小簇中，在细胞变得完全分散前停止酶消化(即用胶原酶IV约5分钟)。然后用滴管温和刮平板，用滴管研碎细胞，直到它们作为粘合的细胞簇悬浮，约10-2000个细胞。然后直接将簇铺到底物上，而不进一步分散。
现在发现灵长类PS细胞可以在无饲养细胞培养物之间作为更稀的细胞悬液传代，条件是选择合适的酶和培养基，铺板密度足够高。例如，在不存在饲养细胞的情况下，从平板上取下汇合的人胚胎干细胞，通过在0.05％(wt/体积)胰蛋白酶(Gibco)和0.053mM EDTA中37℃培养5-15分钟。使用滴管，除下平板中剩余的细胞，用滴管研磨细胞直到细胞分散到含单细胞和一些小簇的悬液中。然后以50,000-200,000细胞/cm2铺板，促进存活和限制分化。用该技术传代的ES细胞的表型与当通过胶原消化成簇收集的细胞观察到的相似。作为另一种选择，可以在板达到汇合前不用酶收集细胞。细胞在0.5mM EDTA的PBS溶液中培养5分钟，从培养容器中洗下，然后不经进一步分散铺在新的培养物中。
在不存在新鲜饲养细胞的情况下铺板的pPS细胞受到了在营养培养基中培养的益处。培养基通常含有增强细胞存活的一般成分，包括等渗缓冲液、必需矿物质和血清或血清替代品。特别有益的是经过调节，提供饲养细胞提供的一些要素的培养基。
可通过在无血清培养基，例如补充了20％血清替代品和4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的KO DMEM中以约5-6×104cm-2培养辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞(或其它合适的细胞制备物)制备条件培养基。在37℃约1天后培养上清液。培养必须锚定的细胞的装置包括T-烧瓶、摇瓶、气体渗透袋、中空纤维生物反应器、平床生物反应器，和平行板生物反应器。如果细胞固定在立体基质中，它们可以在连续搅拌罐生物反应器或空气升液生物反应器中培养。
如实施例下文说明的，调理1-2天的培养基通常用于支持pPS细胞培养物1-2天，然后更换可在调理后直接使用培养基，可作为纯净物或作为提取物储藏(例如4℃2、6或14天，或在-20℃冷冻)。应该在过滤培养基时注意：一些滤膜，例如醋酸纤维素20μ非蛋白结合膜(Corning #43079)可能是合适的，而其它除去了活性。在最初的研究中，通常不稀释使用培养基。可以通过将pPS细胞维持在培养基中7天或更长，并确定是否培养物维持了未分化的pPS细胞的特征，评估稀释和其它操作的作用。
如需要，可在使用其它有益于pPS细胞培养的生长因子前补充条件培养基。对于hES，常用bFGF或FGF-4等生长因子。对于hEG，可用bFGF等生长因子，gp130的诱导物例如LIF或Oncostain-M和可能提高cAMP水平的因子，例如弗司扣林补充培养基。其它类型的pPS细胞可获益于培养基中的其它因子，例如干细胞因子(Steel因子，c-kit配体)或IL-6。就在调理前，然后再在用培养基支持pPS细胞前加入生长因子，例如bFGF或FGF-4是有益的。
应认识到本文所述的各种条件可单独优化，某些条件的组合需进一步测试后证明是有效的。这种优化是常规实验的事实，不违背本公开提供的本发明的精神。
适合调理培养基的细胞系
作为原代小鼠成纤维细胞培养物的替代品，可从其它细胞类型制备条件培养基。例子是端粒化的胚胎成纤维细胞细胞系和分化的具有成纤维细胞的形态特征的pPS细胞。
调理培养基的示范性非人细胞系
饲养细胞通常含有成纤维细胞型细胞。原代胚胎或胎儿饲养细胞培养物是细胞的混合群，含有具有成纤维细胞、早期肌肉和神经元细胞形态的细胞。该群中不同的细胞可在支持pPS培养物中起到不同作用，培养物的分布和特征也会改变。
可用来自非人物种，例如小鼠的胚胎成纤维细胞(如前制备)产生更永久的饲养细胞系，来制备本发明的培养基。细胞可以用无限增殖化基因，例如表达端粒酶的基因基因改变。产生端粒化的细胞和测试端粒酶活性的方法可在本公开的下文中发现。
另外，用于条件培养基的细胞还可以基因改变，来提供一种或多种其它特征。例如为了筛选目的，可对细胞提供对于一种或多种抗生素，例如新霉素、潮霉素或嘌呤霉素的药物抗性基因(实施例8)。可对细胞提供标记基因，例如绿色荧光蛋白(实施例8)，β-半乳糖苷酶或提供免疫分离的标记的一些细胞表面抗原(例如截短的NGF受体)。还可对细胞提供生物合成的基因和提供支持pPS培养基的培养基性能的因子的分泌。例子是人碱性成纤维细胞因子(bFGF)和其它列在该公开内的营养补充物。
为了提高用于调理培养基的细胞系的复制能力，可如本公开所述对其端粒化(或无限增殖化)。
调理培养基的示范性人细胞系
发现了从人胚胎衍生的细胞分化的具有特定特征的细胞可用于支持未分化的pPS细胞的培养。一些衍生自人胚胎细胞的成纤维细胞样细胞(或间充质细胞)具有该性质，并可根据先前描述的试验鉴定。
获得合适的细胞的示范性方法涉及pPS细胞(例如hES细胞)培养物的分化。具有特定表型的分化的细胞选自混合的分化的细胞群，测试与所选细胞一起培养调理的培养基在基本无饲养细胞的培养环境下，支持pPS细胞生长的能力。
可首先通过供体pPS细胞培养物的过度生长形成聚集物，或在具有低粘性，能形成胚状体(EB)的底物的培养容器中培养pPS细胞，引发pPS细胞的分化。胚状体可以在悬浮培养中制备：通过简单胶原酶消化收集未分化的pPS细胞，分解成簇，并铺在非粘性的细胞培养板上。每隔数天喂养聚集物，然后在一段合适的时间，通常是4-8天后收集。然后在培养基和/或促进培养基调理性细胞富集的底物上培养细胞。另外，可通过制备未分化的pPS细胞的悬液，然后直接铺在促进常规分化成培养基调理性细胞的底物上，直接分化pPS细胞获得细胞。合适的底物包括用聚阳离子物质，例如聚鸟氨酸或胞外基质包裹的玻璃或塑料盖玻片。
一旦分化，根据表达的标记可富集群用于培养基调理性细胞(例如通过免疫标记和荧光分拣，通过在磁珠上分拣或通过污染性细胞的免疫特异性裂解)。
发现了从hES细胞分化的成纤维细胞样细胞尤其适合调理本发明的培养基。可通过形态条件，特别是具有代表结缔组织中发现的成纤维细胞的胞质过程的细胞的星状或杆状识别成纤维细胞样细胞。细胞成纤维细胞的性质的确定可以通过细胞的标记和分泌产物，例如胶原基质、胶原酶和各种成纤维细胞生长因子的同工型，特别是bFGF获得。这些标记可在转录或翻译水平上检测。
然后可根据上述试验测试分化的pPS细胞，来确定它们是否适合以培养基支持pPS细胞在无细胞培养物中生长的方式调理培养基。
用该方法从hES分化和筛选的细胞系能在细胞培养物中复制至少约30天(实施例12和13；图12)。在一些实施例中，细胞复制60天或120天(约10次倍增，25次倍增，或50次倍增)。高复制能力是一部分，因为这些细胞是从实际上无限增殖的干细胞分化的，具有与原代胚胎细胞相容的长度的端粒。如需要，细胞还可以基因改变，表达端粒酶反转录酶。或如前所述无限增殖化。这预先防止了老化，提高了复制能力超越未改变的细胞，促进培养基的商业生产和改进了批料之间的重复性。
可任选的，进一步适应适合于调理培养基的分化的人PS细胞-例如通过基因改变细胞表达bFGF等生长因子，或表达TERT，或固定化细胞，如先前部分所述。
测试条件培养基和产生它的细胞
可测试条件培养基支持pPS细胞的作用，通过将其刮到无饲养细胞培养系统中，代替用原代小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)调理的培养基，是一种已被证实的标准。如果pPS细胞以基本不分化的状态生长，那么可确定条件培养基支持无饲养细胞培养物中的pPS细胞。
确定pPS细胞是否在分化的常规方法是跟踪集落的形态特征(如下所述)。根据该试验方法，条件培养基可被视为能支持pPS细胞，如果亚汇合培养中的未分化pPS细胞的比例(通常传代约5天后)通过在条件培养基(可任选的补充有其它生长因子或其它合适加工的)中至少4次传代后不显著下降。
如需要，可获得该试验的定量读数，来估计培养基中pPS细胞支持因子的浓度的质量。在一个实施例中，调理基础培养基一段不同的时间(即6小时，12小时，24小时和48小时)，分别测试条件培养基支持无饲养细胞pPS细胞连续24小时的能力。通过更简单的调理时间使之有效的培养基可能是理想的，因为处理时间更短。在另一个例子中，通过稀释分析测试调理了24小时的基础培养基(在基础培养基中稀释，可任选的补充其它营养物)支持pPS培养的能力。在更大的稀释(例如1∶1、1∶2和1∶4条件培养基：稀释培养基)后有效的培养基对于储藏的方便是理想的。特定的特征的选择将由用途决定。
可通过在基础培养基中培养适当时间测试细胞系产生条件培养基的能力。如果条件培养基不支持无饲养细胞pPS培养，可调节调理方法的各种参数，例如培养时间、使用的基础培养基、细胞密度和可能的培养后处理培养基或补充额外的添加剂。这些和其它参数的调节可以凭经验进行，如常规实验。如果在调节过程中常规优化任何培养参数后，细胞系产生支持无饲养细胞的pPS培养物，该细胞系被视为通过了测试。
如需要，可进一步基于所支持的pPS细胞的其它特征评估条件培养基和产生它们的细胞。
条件培养基的批量生产
通过在培养基中培养细胞，然后从细胞培养物中收集条件培养基生产了本发明的条件培养基。
用于调理的细胞能调理培养基，使其能以无饲养细胞形式，如所述地支持pPS细胞。用于调理的基础培养基可以是几种不同配方中的任一，部分视所用的细胞类型而定。培养基必须能够支持用于调理培养基的至少一种细胞系的培养。方便的是培养基还在调理后支持pPS的培养。然而作为替代品，可用其它因子补充培养基或在调理后另外加工，使其适应培养pPS细胞。
为了在无饲养细胞的培养物中支持pPS细胞，可从下列成分制备合适的基础培养基：Dulbecco的改良Eagle’s培养基(DMEM)，Gibco #11965-092；敲除Dulbecco的改良Eagles培养基(KO DMEM)，Giboc #10829-018；Ham的F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco #15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巯基乙醇，Sigma #M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco #13256-029。示范性含血清的ES培养基是用80％DMEM(通常是KO DMEM)、20％末热灭活的限制性胎牛血清(FBS)、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇制备的。过滤培养基，储藏在4℃不长于2周。无血清ES培养基是用80％KO DMEM、20％血清替换物、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇制备的。不是所有的血清替代品都起作用；有效的血清替代品是Gibco#10828-028(专利配方；产品可从厂商获得)。过滤培养基并储藏在4℃不长于2周。就在与用于调理的细胞合并前，加入人bFGF至最终浓度为4ng/ml。
然后将所选的培养基与用于调理的细胞混合，其环境是使细胞在培养基中释放支持pPS细胞的成分。可任选的可以通过辐射(例如约4000rads)，用化学灭活剂，例如丝裂霉素c处理或其它任何有效方法灭活细胞(即使其不能充分复制)。细胞的灭活可能不是必须的，例如在培养基与调理的细胞在用于支持pPS细胞培养之前分开的情况。
细胞在培养基中培养足够时间，使得获得足够浓度的释放的支持pPS细胞培养24小时的因子。然而，培养期可以上调或下调，由经验确定(或通过分析必需因子的浓度)足够的时间。收集一批条件培养基后，可用细胞调理另一批培养基一段培养时间，如所需进行许多轮，只要细胞维持其以恰当的方式调理培养基的能力。例如，通过胚胎干细胞的分化衍生出的成纤维样细胞可用于在1-2周内以1-天以上的时间调理培养基(实施例12和13)。
可根据培养基收集的规模和目的选择条件培养基的培养装置。在最初研究和筛选目的中，通常在标准培养瓶和多孔板中产生培养基。最初的扩大可在具有多个表面的更大的容器，例如Nunc细胞厂中进行。大规模自动化或符合GMP的生产可能涉及使用更专门化的设备。
J.Furey(Genetic Eng.News 20：10，2000年5月15日)回顾了连续细胞培养系统。灌注培养涉及从培养室除去培养基，重新补充新鲜培养基。在旋转篮式系统中，篮状装置与驱动轴结合，被多孔屏障覆盖，通过它可交换培养基。在外部滤膜灌注系统中，培养物从容器通过中空纤维滤器模块循环，然后回到容器，在回路上连结有泵以提供循环。特定的灌注系统ATF系统(购自Refine Technology，EdisonNJ)包括在空心纤维外壳的一端的膜片泵，另一段与生物反应器连接。通过滤膜改变切向流动产生低剪切力层流，提供了高流速、可称量性和对不同生物反应器的适应性。
大规模培养系统还可购自Aastrom Sciences Inc.，Ann Harbor MI。AastromReplicellTM系统提供了从小的起始细胞群扩增(Koller等，Bone Marrow Transpl.21：653，1009；Koller等，Blood 86：1784，1995)。Cellastasis
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培养技术由Genespan Corp.，Bothell WA出售。细胞位于毛细管外空间，中空纤维将新鲜培养基和氧气带入培养环境(R.Lewis，Genetic Eng.News18(9)，1998年5月1日)。任何其它合适的装置可用于本发明。美国专利号4,501,815描述了一种培养分化的细胞的装置。美国专利号4,296,205描述了细胞培养和连续透析烧瓶及其用途。美国专利号5,994,129描述了用于维持生物细胞的便携盒。美国专利号5,362,642描述了储藏、重建、分散和收集细胞培养基的保护外壳系统。美国专利号6,022,742描述了培养装置和方法。
本发明的特定实施例是一种适用于制备条件培养基的装置，具有含有能调理培养基的本发明的细胞的培养室，和任选的可密封的出口，用于在细胞调理后从培养室排出培养基。该装置还可以具有形式为板、中空纤维或其它结构的大量转移微孔表面，分隔培养细胞和调理好的培养基，使得培养基能只有通过，提供通向出口。该装置还可具有一个或多个口，用于引入新鲜培养基，其它细胞或排出过期的细胞和细胞碎片。对于连续流动系统，可在培养基入口或出口上装泵，提供循环。
收集条件培养基后，如合适可用于直接支持pPS细胞生长。如果过滤、冷冻或用新的技术首次处理培养基，值得测试小批量来确定是否在重建的培养基中仍然存在活性。
在一些实施例中，在用有益于pPS细胞培养物的其它生长因子前补充条件培养基。对于hES，常用生长因子，例如bFGF。发现了在调理培养基前或后加入bFGF，可使得培养基能在无饲养细胞的培养基中支持hES细胞(实施例11)。对于hEG，可用bFGF等生长因子、gp130的活化剂，例如LIF、IL-6或Oncostatin-M，和可能提高cAMP水平的因子，例如弗司扣林或霍乱毒素补充培养基。其它类型的pPS细胞可以受益于培养基中的其它因子，例如干细胞因子(也称作Steel因子，c-kit配体)。
在一些实施例中，进一步处理条件培养基。例如，可以通过盐沉淀或选择性过滤浓缩，或可以提取来分离或储藏有效成分。然后可用新鲜培养基在用于支持pPS培养前重建或补充培养基提取物。
在制备后，可用此培养基在无饲养细胞的培养物中支持pPS细胞，如前所述。还适用于其它目的，并可不受这些目的使用。例如，可在饲养细胞存在下培养的pPS中加入培养基，进一步支持细胞增殖或限制分化。培养基还可用于维持或促进其它类型的培养的前体细胞的增殖或最终分化的细胞，可以凭经验确定。
在不存在饲养细胞的情况下生长的pPS细胞的特征
人ES细胞具有未分化干细胞的特征性形态特征。在标准显微影像的两个方向，hES细胞在图像平面内具有高核/胞质比、明显的核和具有难于辨别的细胞连接的紧密集落形成。可用标准G-条带技术(在许多提供核型分析服务的临床诊断实验室，例如Cytogenetics Lab，Oakland CA购得)对细胞系进行核型分析，与出版的人核型比较。理想的是获得具有“正常核型”的细胞，意味着细胞是整倍体，其中存在全部人染色体，没有明显改变。
还可通过表达的细胞标记确定hES和hEG细胞的特征。一般，可使用合适的免疫学技术检测在该公开中讨论的组织特异性标记-例如流式细胞计数用于膜结合标记，免疫细胞化学用于胞内标记，和酶联免疫分析用于分泌入培养基的标记。蛋白质标记的表达还可通过反转录酶-PCR，用标记特异性引物在mRNA水平检测。进一步的细节见美国专利号5,843,780。
阶段特异性胚胎抗原(SSEA)是一些胚胎细胞类型的特征。SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4的抗体购自Development Studies Hybridoma Bank of the NationalInstitute of Child Health and Human Development(Bethesda，MD)。其它有用的标记是用命名为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的(Andrews等，Cell Linesfrom Human Germ Cell Tumors in E.J.Robertson，1987，见上)。小鼠ES细胞可用作SSEA-1的阳性对照，和SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的阴性对照。SSEA-4一致存在于人胚胎癌细胞(hEC)上。体外分化pPS细胞使得SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达丧失，和SSEA-1的表达提高。SSEA-1还在hEG细胞中发现。pPS细胞还可以用碱性磷酸酶活性的存在确定特征，可以通过用4％聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显色，如厂商所述检测(Vector Laboratories，Burlingame CA)。hTERT和OCT-4(用RT-PCR检测)和端粒酶活性(用TRAP分析检测)的表达也是许多类型的未分化pPS细胞的特征(实施例3)。
增殖的pPS细胞的另一个理想特征是能分化成所有三个胚层的细胞：内胚层、中胚层和外胚层组织。hES细胞的多能性可以通过将约3.0×106个细胞注射到8-12周龄的雄性SCID小鼠的后腿肌肉中确定。得到的肿瘤可在8-16周发展时固定在4％聚甲醛中，石蜡包埋后组织学检测。显示所有三个胚层的组织，例如软骨、平滑肌或横纹肌(中胚层)；具有毛囊的复层扁平上皮、具有小室、中间物或套层的神经管(外胚层)；和纤毛柱状上皮和通过吸收性肠细胞排列的绒毛或分泌粘液性杯状细胞(内胚层)的畸胎瘤产生。可根据在本公开中随后所述的方法进一步测试pPS细胞分化成特定细胞系的多能性。
在不存在饲养细胞的情况下生长的示范性hES细胞制备物如下文实施例1所述。在培养第19天，＞80％的细胞用SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81染阳性，虽然＜15％的细胞染成SSEA-1阳性。
本公开中所述的一些细胞群基本未分化，可以在多种培养基之间传代，其中不加入新的饲养细胞。认识到在一些传代过程中，一些细胞可能分化(特别是当作为单细胞以低密度铺板，或可能形成大簇时)。然而培养物通常在培养期间重新建立较大比例的未分化细胞。特别感兴趣的是可以在无饲养细胞系统中繁殖至少约3个月的细胞。最佳繁殖的细胞具有不长于24-40小时的倍增时间。
理想的是提高pPS细胞的复制能力，或从其分化的细胞，可以用下文所述的方法无限增殖化或端粒化(在分化前或后)。
繁殖的pPS细胞的直接分化
本发明还提供了一种新的将pPS细胞分化成定型前体细胞或完全分化的细胞，而不形成胚状体作为中间步骤的方法。
O’Shea，Anat.Rec.(New Anat.257：323，1999)报道了培养胚状体中的一般原理。pPS细胞以允许聚集物形成的方式培养，其中允许许多选择：例如通过供体pPS细胞培养物的过度生长，或通过在具有能形成EB的低粘着性质的基质的培养容器中培养pPS细胞。胚状体还可以在悬浮培养中制备。简单胶原酶消化，分成簇，铺在非粘附的细胞培养板上收集pPS细胞。每隔数天喂养聚集物，然后在合适的时间段，通常是4-8天后收集。然后在培养基中和/或促进特定品系的细胞富集的底物上培养细胞。底物可以含有基质成分，例如Matrigel
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(Becton Dickenson)、层粘连蛋白、胶原、明胶或第一次培养产生基质的细胞系(例如成纤维细胞或内皮细胞系)，然后裂解和洗涤，使得基质维持与容器表面结合产生的基质。胚状体含有异源细胞群，可能具有内胚层外部和中胚层和外胚层内部。
现在已发现pPS细胞可以分化成定型的前体细胞或最终分化的细胞，而不形成作为中间步骤的胚状体或聚集物。简单说，制备未分化pPS细胞的悬液，然后铺在促进分化的固态表面。一般说，通常收集pPS细胞的培养物，当其分化到合适密度，但不到过度汇合，因为细胞可能以不受控制的方式分化，如果使其过度生长。可通过将培养皿与胶原酶IV一起保温约5-20分钟，然后将细胞从皿中刮下制备合适的悬液。可通过用滴管研磨分离细胞。对于许多形式的分化，推荐细胞不完全分离，从而使堆中的大部分pPS是10-200个细胞。
然后将悬液铺在促进常规分化成定型前体细胞的底物上。合适的底物包括粘附的玻璃或塑料表面。例如可用聚阳离子物质，例如聚胺，如聚赖氨酸、聚鸟氨酸或其它同源或混合的多肽或其它具有明显正电荷的聚合物包裹玻璃盖玻片。然后以适合促进分化成所需细胞品系的营养培养基培养细胞。
在一些情况下，分化是可通过从培养基取出血清或血清替代品而促进的。这可通过例如在重新铺板时用缺乏血清和血清替代品替换，通过取出促进未分化的细胞生长或抑制分化的培养基中的一种或多种成分来实现。例子包括一些生长因子、分裂原、淋巴细胞抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和调理培养基中的其它成分。
在一些情况下，分化是通过加入促进朝所需细胞品系的分化，或抑制具有不需要的特征的细胞的生长的培养基成分而促进的。例如为了产生定型为神经或神经胶质的细胞，培养基可含有有效组合的任何下列因子或培养基组分：大脑衍生的神经向性因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、表皮生长因子(EGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经生长因子(NGF)、视黄酸(RA)、超声刺猬(sonic hedgehog)、FGF-8、抗坏血酸、弗司扣林、胎牛血清(FBS)和骨骼形态发生蛋白(BMP)。
Pederson(Reprod.Fertil.Dev.6：543，1994)和U.S.6,090,622回顾了从多能干细胞获得组织细胞的一般原理。对于神经祖细胞，神经限制性细胞和神经胶质细胞前体，见Bain等，Biochem.Biophys.Res.Commun.200：1252，1994；Trojanowski等，Exp.Neurol.144：92，1997；Wojcik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1305-130；Mujtaba等，Dev.Biol.214：113，1999；和美国专利号5,851,832、5,928,947，5,766,948和5,849,553。对于心肌和心肌细胞，见Chen等，Dev.Dynamics 197：217，1993和Wobus等，Differention 48：173，1991。对于造血祖细胞，见Burkert等，New Biol.3：698，1991和Biesecker等，Exp.Hematol.21：774，1993。美国专利5,773,255涉及葡萄糖反应性胰岛素分泌性胰β细胞系。美国专利5,789,246涉及肝细胞前体细胞。其它感兴趣的祖细胞包括但不限于软骨细胞、成骨细胞、视网膜色素表皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞例如角化细胞、枝状细胞、毛囊细胞、肾小管表皮细胞、平滑和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞和血管内皮细胞。
Geron公司的科学家发现了在与生长因子受体结合的配体存在下培养pPS细胞或胚状体促进了神经前体细胞的富集。生长环境可以包括神经细胞支持性胞外基质，例如纤维结合素。合适的生长因子包括但不限于EGF、bFGF、PDGF、IGF-1和与这些配体的受体结合的抗体。还可包含辅助因子，例如维甲酸。培养的细胞然后可以任选的基于是否表达例如A2B5的标记分离。在合适的环境下，富集的表达A2B5标记的细胞群可能同时产生神经元细胞(包括成熟神经元)和神经胶质细胞(包括星状细胞和少突胶质细胞)。可任选的，细胞群进一步分化，例如通过在含有cAMP活化剂的培养基中培养。感兴趣的标记包括但不限于β-微管蛋白III或微管结合的蛋白质2(MAP-2)，神经元的特征；神经胶质纤维性酸性蛋白(GFAP)，存在于星状细胞中；半乳糖脑苷脂(GalC)或髓磷脂碱性蛋白(MBP)，少突胶质细胞的特征；OCT-4，未分化的hES细胞的特征；Nestin或Musashi，神经前体和其它细胞的特征；和A2B5和NCAM，出现在从pPS细胞分化的神经前体群上。
Geron公司的科学家还发现了在肝细胞分化剂的存在下培养pPS细胞或胚状体细胞促进肝细胞样细胞的富集。生长环境可含有肝细胞支持性胞外基质，例如胶原或Matrigel
Figure G2009101296702D00281
。合适的分化剂包括各种丁酸酯的异聚体及其类似物，例如正丁酸酯。培养的细胞可任选的同时与或随后与肝细胞成熟因子，例如有机溶剂如二甲亚砜(DMSO)等；维甲酸等成熟辅助因子；或细胞因子或激素等，例如糖皮质激素，表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转化生长因子(TGF-α和TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝素、肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素(IL-1和IL-6)、胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-II)和肝素结合生长因子(HBGF-1)一起培养。从pPS细胞分化的肝细胞品系细胞通常显示至少三种下列标记：α1-抗胰蛋白酶(AAT)合成、清蛋白合成、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGR)表达、无α-胎儿球蛋白、糖元储藏的证据、细胞色素p450活性的证据和葡萄糖-6-磷酸酶活性的证据。
存在于衍生自pPS细胞的混合的细胞群中的细胞类型可以通过特征性形态和表达的标记识别。对于骨骼肌：myoD、成肌素和myf-5。对于内皮细胞：PECAM(血小板内皮细胞粘着分子)、Flk-1、tie-1、tie-2、血管内皮(VE)钙粘着蛋白、MECA-32和MEC-14.7。对于平滑肌细胞：专一性肌动蛋白重链。对于心肌细胞：GATA-4、Nkx2.5、心脏肌钙蛋白I、α-肌动蛋白重链和ANF。对于胰细胞，pdx和胰岛素分泌。对于造血细胞及其祖细胞：GATA-1、CD34、β-主要球蛋白和β-主要球蛋白样基因βH1。
直接铺在合适的表面，或在饲养细胞培养物中提供pPS细胞，并合适改变培养基分化pPS细胞，可产生惊人的品系限制的细胞或最终分化的细胞的同源群。视所用的条件而定，可获得50％以上同源的细胞群(例如75％、90％或98％同源)-甚至不需要使用分拣技术。
对于治疗用途，通常理想的是分化的细胞群基本无未分化的pPS细胞。一种从群中耗竭未分化的干细胞的方法是用载体转染，该载体中具有在导致未分化细胞中优势表达的启动子控制下的效应基因。合适的启动子包括TERT启动子和OCT-4启动子。效应基因可以直接裂解细胞(编码，例如毒素或凋亡介导因子)。另外，效应基因可以使细胞易于受到外源因子，例如抗体或前药的毒性作用。例子是单纯疱疹胸腺嘧啶激酶(tk)基因，导致表达它的细胞对更昔洛韦敏感。WO98/14593(Morin等)提供了合适的TERT启动子tk构建物。
cDNA文库
与饲养细胞一起培养或来自无饲养细胞培养物的未分化的pPS细胞可用于制备反映这些细胞基因表达模式的mRNA或cDNA文库。mRNA和cDNA还可以从分化的细胞中制备，用于产生富含分化时上调或下调的转录物的扣减文库。
分离mRNA和制备扩增的拷贝
制备cDNA文库通常涉及从pPS细胞或其分化的子代分离mRNA；制备mRNA的多核苷酸拷贝，并产生含有可以补充的形式的多核苷酸拷贝的文库。通常，多核苷酸拷贝是来自mRNA模板的反转录酶反应的cDNA，但可使用维持原始mRNA群的序列的其它类型的拷贝。可任选的，扣减来自不同来源(例如pPS和分化的细胞)的聚核苷酸拷贝，产生富含在两个群体之间差异表达的拷贝的文库。所选的多核苷酸拷贝通常工程改造到一个克隆载体中，但理解任何在载体、宿主细胞或通过化学方法复制拷贝的方法都是等价的。
为了说明，从基质中用胶原酶释放在无饲养细胞培养物中的hES细胞，并通过离心收集，或直接用合适的溶剂在培养物中裂解。从细胞通过标准技术的适当组合(例如酸苯酚/氯仿抽提，通过CsCl离心，与oligo-dT基质结合等；见Sambrook等，见上)制备总RNA。如实施例14说明的，总RNA可以从收集的hES细胞中通过在异硫氰酸胍的溶液中裂解细胞，将悬液中的RNA与合适的基质，例如RNeasy
Figure G2009101296702D00291
旋转柱(Qiagen Inc.Valencia CA)结合(美国专利5,234,809)来分离。从基质洗脱总RNA，然后通过与dC10T30寡核苷酸结合的OligotexTM珠结合获得polyA+mRNA。在低盐缓冲液中收集粘着组分，可用于制备cDNA文库。
各种方法都能将mRNA转换成双链cDNA。产物包括初级文库，设计成代表起始mRNA群；扣减文库，其中两种或多种不同的mRNA群共有的mRNA在最终的cDNA制备物中被扣减，以富集在一个群体中优势表达的mRNA；标准化的文库，其中将各mRNA的相对丰度平衡到相等的表示；和全长偏向文库，其中cDNA的产生被优化为产生高频率的包含整个原mRNA编码序列的cDNA。
这些方法中的第一个反应通常是用oligo-dT或随机六聚物引物引发的模板依赖性反转录反应将mRNA转化成单链cDNA。该反应由反转录酶催化，它是一类能容易的从厂商购得的酶。例子是SuperScriptIITM(Life Technologies Inc.，Bethesda)，一种改良的反转录酶形式，其中天然酶中的RNAse H活性被除去，从而提高了产生全长的第一链cDNA的频率。Oligo-dT通常是在5’末端被修饰的，掺入限制性内切核酸酶识别序列，促进克隆。通常在第一链反应中包括一个核苷酸三磷酸的甲基化形式。因此，最终的cDNA受到保护，不会被通常用于限制最终产物的限制性内切核酸酶消化。
可用几种方法实现反转录酶反应的单链cDNA产物向双链cDNA的转化。通常第一链cDNA进行合适的DNA聚合酶引发的互补链合成。SMARTTM技术(ClonTEch，Palo Alto，CA)利用标准开关寡核苷酸，其引发第一链产物末端处末端胞嘧啶残基开始的第二链合成。其它适应第一链cDNA产物的技术包括用末端脱氧核苷酸转移酶引入同聚尾部，然后用互补的同聚物引导第二链，或连接合适的寡核苷酸，然后用与连接的寡核苷酸互补的引物引导第二链。用后一种方法，连接的寡核苷酸及其互补物可以设计成含有促进克隆的限制性内切核酸酶识别序列。
在一个例子中，RNase H的作用是用于在RNA/DNA二倍体中引入缺口，然后变得适于作为DNA聚合酶例如大肠杆菌的Pol1的引发位点。该方法是有效的，但是从cDNA5’末端开始的序列信息可能丧失，因为超过了5’末端(原mRNA中相对于polyA+位点的末端)的引导的RNA将在随后的双链cDNA加工中丧失。另外，保存了5’序列信息的双链DNA涉及在第一链cDNA的3’末端连接寡核苷酸引物。该连接反应由T4RNA连接酶进行，它是一种能连接单链寡核苷酸的末端5’磷酸与第一链cDNA产物的3’-羟基的酶。所用的寡核苷酸是合成的，从而提供了5’-末端磷酸，使得与cDNA连接，还提供了3’-封闭基团，例如氨基或双脱氧衍生物，来防止自身形成多联体。该寡核苷酸还编码限制性内切核酸酶识别序列，它适应适合随后克隆入载体的位点。在寡核苷酸与第一链cDNA产物连接后，用合适的DNA聚合酶作用，例如热稳定性聚合酶，用与连接的寡聚物互补的寡核苷酸引导第二链cDNA合成。序列例子：第一链cDNA连接寡聚物：5’P-AGGTCGACGAGAG-3’NH-X(SEQ ID NO：1)，其中P＝磷酸，NH-X＝胺封闭基团；互补寡聚物5’-OH-CTCTC TCGTCGACCT-OH-3’(SEQ ID NO：2)，其中-OH＝羟基。
可用一些方法提高全长cDNA在样品中的比例。对于该目的合适的是在RIKENInstitute，Japan(Carninci等，Methods Enzymol.303：19，1999；Iton等，GenomeRes.9：463，1999；另见国际专利申请WO 98/20122)开发的技术。通过在mRNA5’末端的7-甲基G帽结构加上生物素，对mRNA加上衔接头。如前所述获得第一链cDNA的产物，用RNAse I处理cDNA/mRNA杂交子，降解单链的mRNA。不受与全长cDNA杂交保护的mRNA被水解，而全长的cDNA/mRNA杂交子留下。用链霉亲和素包裹的珠(与5’帽结合)纯化杂交子，并用标准技术转换成双链cDNA。样品中得到的全长cDNA的比例通常比存在于用传统方法制备的文库中存在的更高。几个厂商提供产生全长偏向cDNA的服务，包括Life Technologies Inc.(Bethesda，MD)和SeqwrightInc.(Houston，TX)。
扣减文库提供了一种表达两群mRNA之间不同的表达水平的基因的丰富来源。产生扣减文库的方法通常涉及扩增从pPS细胞获得的mRNA(例如通过如前所述形成cDNA群)；扩增从分化的细胞获得的mRNA；在允许从在pPS细胞和分化的细胞中表达的mRNA扩增的多核苷酸的条件下培养两个库，使其杂交；然后回收未杂交的扩增的多核苷酸。
以相似方式，可以从其它mRNA分离物的组合产生扣减文库-例如，饲养细胞培养物中的pPS细胞对无饲养细胞培养物中的pPS细胞；部分分化的细胞对最终分化的细胞；或两种或多种不同品系的分化的细胞群。在另一个例子中，从在无饲养细胞培养物中生长的pPS细胞的cDNA中扣减在单层培养物(通过铺在基质或其它促进分化的底物上，或通过用DMSO或视黄酸等药物处理)中分化的pPS细胞的cDNA，来纠正在各集落周围的边缘上形成的分化细胞的比例。还可制备扣减文库，来确定化合物或培养条件的改变对未分化pPS细胞或其分化的子代的表达模式的作用。从接触化合物或条件的细胞制备扩增的mRNA，用对照细胞的扩增的mRNA扣减。从而文库富集作为改变的结果上调或下调的转录物。
扣减文库的制备可如下说明：制备了两种独立的mRNA库，一种称为测试物，另一种称为驱动物。在该例子中，它们被转化成合适的形式，通常是单链cDNA(一条是有义朝向的库，另一条是反义朝向)，然后混合杂交。两个mRNA群中共有的转录物将形成杂交子，而仅在一个库中发现的，或在一个库中以显著高的水平表达的其它转录物保持未杂交。然后回收杂交子，通常通过在层析柱上分离或通过用特定生物化学系统，例如链霉亲和素/生物素恢复。剩余的单链序列现在富含在测试mRNA库中更高表达的基因，克隆入合适的载体。已开发了许多扣减文库产物的变体。混合了扣减文库杂交掺入标准化的方法是市售的(抑制性扣减杂交(SSH)，ClonTech，Palo Alto，CA)。
制备重组表达文库
这些技术制备的双链cDNA可以工程改造成各种克隆载体。合适的载体系统包括细菌质粒和λ噬菌体，用于克隆入细菌宿主。当用内切核酸酶限制性末端制备cDNA时，克隆通常是由与相应限制的载体DNA连接实现的。质粒文库有利于序列分析，因为各克隆不难进行高通量纯化和PCR扩增。
在本发明的一些实施例中，克隆载体还是表达载体，设计成分离的蚀斑可以转染到细胞中，获得基因产物。因此扩增的转录物置于载体中，在转录和翻译控制元件的控制下。例如，质粒pCMVSportTM6.0(Life Technologies Inc.，BethesdaMD)在多克隆位点的对侧含有SP6和T7病毒RNA聚合酶启动子，能够转录克隆的cDNA的有义或反义链。同样，当引入哺乳动物细胞时，CMV启动子盒赋予体内转录。因此，插入该载体的cDNA能够测试其在各种宿主细胞，包括pPS细胞中的表达。该载体的特征还包括侧接多克隆位点的λ噬菌体结合序列，使其与LifeTechnologies GatewayTM载体兼容。GatewayTM系统包括用序列特别修饰的载体，这些序列能够将克隆的序列在载体之间转移，通过使用λ噬菌体和大肠杆菌重组酶活性的酶混合物。这在载体间转移序列时避免了用限制性酶消化的需要。
特别感兴趣的是优化在多能干细胞中表达cDNA的文库。胚胎细胞中的甲基化模式和其它调控机制可以抑制基因在启动子，例如CMV的控制下转录，它在许多其它真核细胞类型中是活性的。已发现在pPS细胞中有活性的持家基因的启动子可以有效控制人工引入的编码区域的转录。如实施例14所述，合适的启动子可用含有试验启动子序列、报道基因例如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶和药物抗性基因的报道构建体通过实验选择。合适的启动子具有导致报道基因表达的特征，而基本上不增加细胞分化丧失的比例。用该选择策略，PGK，EF1α和UbiC的启动子被确定为对于构建在pPS细胞中可表达的文库是有效的。
确定重组表达文库的特征
可用几种条件确定cDNA文库的特征。可通过用限制性酶消化单个克隆的质粒制备物，释放cDNA插入物，来进行cDNA长度的简单和直接的估计。消化产物可以用琼脂糖凝胶电泳确定大小，可计算平均cDNA插入物大小。表达文库的一些特征可以通过比较各cDNA克隆5’末端产生的序列和在公众数据库中发现的序列实现。本发明的多核苷酸分离物和克隆的插入物可以用任何本领域合适的方法测序。例子是基于PCR的测序法，形成用自动化DNA测序仪分辨的荧光产物。质粒DNA和测序引物在PCR反应条件(包括荧光标记的双脱氧核苷酸三磷酸)下反应。得到的反应产物在合适的DNA测序仪，例如ABI377(Perkin Elmer Biosystems，Foster City，CA)上分辨。检测荧光型号，转化成原序列信息并处理。基本基于这些方法的DNA测序服务是市售的，例如从Lark Technologies，Houston，TX；和Incyte Genomics，PaloAlto，CA等公司获得。获得了mRNA编码序列的开发阅读框，可正常确定蛋白质基因的氨基酸序列，而不需要进一步通过根据基因编码翻译编码序列来确定。
序列数据提供了对cDNA文库多样性的一般估计，基于代表的单个基因的数量。例如，将cDNA序列与UNIGENE集合(National Center for BiotechnologyInformation；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/index.html)比较，排列大多数序列的独特簇鉴定子。通过比较对齐的簇的数目与评估的cDNA的总数，可实现对克降多样性的估计。
代表较不复杂的mRNA来源的文库具有相对较少的独立基因序列，这些序列代表与更复杂的mRNA来源制备的文库比较，给定数目的cDNA。在本发明的一些实施例中，克隆载体中的mRNA制备物、cDNA制备物和文库含有代表至少100，1,000，10,000或甚至50,000个在mRNA水平在pPS细胞或其分化的子代中表达的基因。
文库还可用它们是否含有来自单个基因型的细胞的转录物确定特征。将来自不同蚀斑的粗序列数据与人序列和其它也怀疑存在的物种的序列数据库匹配。如果文库中1％以下的转录物拷贝具有确定不是来自cDNA文库需要的基因型的序列，该文库称为“基本”无其它物种、脊椎动物、哺乳动物和同一物种的不同基因型的cDNA。用本公开所述的无饲养细胞培养系统，pPS细胞文库被外源转录物污染的程度将小于0.2％，0.5％，0.01％或0.001％，视pPS细胞在饲养细胞层上的最后一次培养的传代数量而定。
cDNA的5’序列还可以与附有说明的全长mRNA序列的集合比较，来确定代表全长序列的cDNA的比例。就此，全长序列可定义为包括编码蛋白的起始甲硫氨酸密码子的序列。例如5’序列读数可以用合适的检索程序，例如Blast与REFSEQ集合(GenBank)比较。对于与REFSEQ输入匹配的cDNA序列，对序列排列的评估将表明是否cDNA序列包括REFSEQ输入编码的蛋白质的起始甲硫氨酸，因而可估计全长cDNA的比例。由于REFSEQ集合是附有说明的，来表明全长mRNA的估计大小，该分析可以进一步评估确定对应于特定大小的mRNA的全长cDNA的比例。例如，可以比较对应于长度小于1kb的mRNA的全长cDNA的百分数，对对应于长度大于1kb的mRNA的全长cDNA的百分数。
由衍生出这些产物的方法而定，含有相应的mRNA的完整编码区的cDNA的比例可以是至少15％、30％和有时是50％的制备物中的多核苷酸或载体。插入物的平均长度可以是至少约0.5kb、1kb、2kb或4kb，视用于获得和选择双链cDNA制备物的方法而定。
来自表达文库的信息的用途
一旦确定了来自pPS细胞或其分化的子代的mRNA或cDNA的序列，可用于制备含有这些序列的多核苷酸，其编码的多肽和对多肽特异性的抗体。
根据核酸化学技术制备用于研究、诊断或治疗应用的任何合适目的的多核苷酸。可以修饰核苷酸序列，为了任何所需目的来除去天然编码序列的区段，加入额外的编码序列，或引入突变和其它改变。基本相同的多核苷酸或多核苷酸片段在严谨条件下与来自pPS细胞及其分化的子代的表达文库中的cDNA杂交，优于与人基因组或其它细胞类型表达的其它核苷酸序列杂交。与约100个碱基对和以上的探针杂交的高严谨性的典型条件是65℃，2×SSC的杂交反应，然后用0.1×SSC重复洗涤。在一些实施例中，制备的多核苷酸的区段是与如本公开所述获得的cDNA确定的序列或序列的部分至少约80％、90％、95％或100％相同。与示范性序列比较相同或同源的连续残基长度可以是至少约15、30、50、75、100、200或500个残基，以提高优势。
基于所需的核酸序列，可以根据任何合适的技术制备多核苷酸。用化学合成方便的制备小于50个碱基对的寡核苷酸，通过市售服务或用已知的合成方法，例如三酯法或磷酸法。合适的方法是用一核苷亚磷酰胺偶联单元固相合成(Hirose等，Tetra.Lett.19：2449-2452，1978；美国专利号4,415,732)。可制备具有修饰的骨架的多核苷酸，例如美国专利5,578,718；5,541,307；5,378,825所述的。肽核酸的制备如美国专利5,539,082、5,766,855、5,786,461和EP申请97918549.2所述。
另外，可以通过PCR扩增，用所需序列的模板制备多核苷酸。跨越所需序列的寡核苷酸引物与模板一起退火，然后用DNA聚合酶延伸，然后在更高温度下解链，从而使模板和延伸的寡核苷酸分离。重复循环，直到获得所需量的扩增的多核苷酸(美国专利4,683,195和4,683,202)。合适的模板包括从pPS细胞或其子代制备的表达文库，或来自任何组织的文库，其中对应的基因在人中表达。通过将所需的序列插入合适的克隆载体，复制克隆或将序列转染到合适的宿主细胞中，方便的获得批量的大多核苷酸的生产。核苷酸克隆的技术在Sambrook，Fritch & Maniatis(见上)和美国专利号5,552,524中提供。多核苷酸可通过核酸化学中的标准技术，例如苯酚-氯仿抽提、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域已知的技术纯化，视来源调节。
来自pPS细胞的mRNA或cDNA的序列数据还可用于制备含有编码区中所含的序列的肽。可以修饰氨基酸序列，除去或加上区段，或为了任何需要的目的引入突变和其它改变。基本相同的多肽或多肽片段共有一个表位，该表位由对来自pPS细胞或其分化的子代得到的表达文库的cDNA中编码的蛋白质特异性的抗体识别，优于人基因组或其它细胞类型中表达的其它核苷酸序列。在一些实施例中，肽与mRNA或cDNA编码的肽或肽片段60％、80％、90％、95％或100％相同，以提高的优势的顺序。与原型多肽比较，相同或同源的序列的长度可以有约7、10、15、25、50或100个残基，顺序为增加的优势，直到整个蛋白质的长度。
多肽及其变体可以根据任何合适的技术制备。短多肽可以通过固相化学合成制备。固相化学合成的原理可以在Dugas & Penney，Bioorganic Chemistry，Springer-Verlag NY pp54-92(1981)和美国专利4,493,795中找到。自动化固相肽合成可以用PE-Applied Biosystems 430A肽合成仪(从Applied Biosystems，Foster city CA购得)进行。
较长的多肽可以方便的通过在体外翻译系统中翻译，或通过在合适的宿主细胞中表达制备。为了产生表达载体，编码所需多肽的多核苷酸与转录和翻译的控制元件可操纵性连接，然后转染入合适的宿主细胞，包括原核细胞例如大肠杆菌，真核微生物例如酵母、酿酒酵母，或更高等的真核细胞，例如昆虫或哺乳动物细胞。许多适合产生本发明的肽的表达系统如美国专利5,552,524中所述。表达载体可购自厂商如Lark Technologies，Houston，TX。产生后，通常用蛋白质化学中合适组合的标准方法纯化蛋白质，可以包括离子交换层析、亲和层析或HPLC。
本发明的mRNA和cDNA编码的多肽特异性的多克隆和单克隆抗体可以通过确定表达文库中，蛋白质编码区域的氨基酸序列，并免疫接种动物或接触免疫感受态细胞，或具有含有确定的序列的蛋白质的颗粒获得。单克隆抗体的产生如Harrow &Lane(1988)、美国专利号4,491,632、4,472,500和4,444,887和酶学方法73B：3(1981)等参考文献中描述了产生的单克隆抗体。其它获得特异性抗体分子(最佳以单链可变区的形式)的方法涉及将免疫感受态细胞或病毒颗粒的文库与靶抗原接触，和长出阳性筛选的克隆。见Marks等，New Eng.J.Med 335：730，1996，国际专利出版物WO 94/13804，WO 92/01047，WO 90/02809和McGuiness等，NatureBiotechnol.14：1449，1996。通过用本公开的pPS阳性筛选和用携带更广泛分布的抗原的细胞(例如分化的胚胎细胞)或成年人衍生的干细胞阴性筛选，获得所需的特异性。
衍生自从本发明的mRNA或cDNA获得的序列数据的多核苷酸、多肽和抗体具有许多重要的商业用途。例如，在pPS细胞中表达，但在分化过程中消失的基因或蛋白质可用作未分化状态的分子标记。对应于这些标记的因子，例如抗体，可用于从一群分化的细胞中通过免疫亲和分离或补体介导的裂解除去未分化的pPS细胞。在分化过程中提高表达水平的基因或蛋白质可以相似方式用于纯化、富集、除去或消除衍生自pPS细胞的特定细胞类型。这些标记可以作为广泛类型的细胞分化的指标，例如在中胚层、内胚层或外胚层品系中表达的基因或蛋白质，或可作为高度分化的细胞类型的定型谱系的特定标记。
在表达过程中上调的基因还可用于影响pPS细胞分化成特定品系。例如，可测试表达转录因子、生长因子、受体和信号传递分子的pPS细胞中强制表达的影响特定细胞品系分化的能力。
多能干细胞的基因改变
本公开还提供了一种获得以瞬时或稳定形式经过基因改变的pPS细胞的系统。这是许多目的所需的。pPS细胞的希望之一是能获得不同组织细胞的储备，用于研究、诊断和治疗目的。为了促进不同分化细胞群的富集，可能引入影响分化或帮助消除未分化细胞的基因。基因选择的方法如所述，例如在美国专利号5,602,301、5,733,727和6,015,671；和国际专利出版物WO 98/32868、WO 99/53022和WO99/55841。
在特定实施例中，本发明提供了获得基因改变的pPS细胞的方法，通过提供在一层药物抗性的饲养细胞上的pPS细胞的组合物，将多核苷酸转移到组合物中的pPS细胞中；用饲养细胞抗性的药物筛选组合物中的基因改造的细胞。在具体实施例中，多核苷酸含有与促进未分化的pPS细胞中的编码区的转录的启动子可操纵性连接的蛋白质编码区。在另一个实施例中，多核苷酸含有蛋白质编码区，它与促进分化的pPS细胞产生的一种或多种细胞类型中编码区域转录的启动子可操纵性连接。
其它基因改变干细胞的理由是通过提供端粒酶(TERT)的催化性成分的表达系统使其无限增殖化，或调节其基因适合体外用途，例如药物筛选。对于治疗应用，可有益于修饰具有治疗性基因的细胞，或赋予细胞组织与指定的受体的相容性。还可用基因改变来制备细胞，用于在分化后分拣。例如，用药物易感性基因，例如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(赋予细胞对更昔洛韦的易感性)在对未分化细胞特异性的启动子，例如hTERT启动子的OCT-4启动子(WO 98/14593)转染hES细胞。在培养物分化后，可从群体中用更昔洛韦除去未分化的细胞。
已发现pPS细胞可以允许基因改变以瞬时、稳定或可随着细胞分裂遗传的方式基因改变。基因改变的细胞可在培养物中保持未分化的多能形式，或可以分化成其它类型的细胞，仍然保留基因改变。发现了当在原代饲养细胞上生长时，使hES细胞基因改变的有效方法。还提供了方法，其中hES细胞在转染前是铺在无饲养细胞环境中，其中提供了许多重要的优点。
在细胞中要转移的多核苷酸通常提供了一种功能，该功能将以所需方式改变细胞或其子代的表型。例如，它可含有编码区，该编码区在促进未分化hES细胞中，或特定品系的分化细胞中的转录的启动子的控制下。它还可以合适的机制，例如反义反应性、三股螺旋形成或核酶作用影响内源基因表达。
合适的转移载体质粒进入hES细胞的方法包括脂类/DNA复合物，例如美国专利号5,578,475、5,627,175、5,705,308、5,744,335、5,976,567、6,020,202和6,051,429中所述的。合适的试剂包括lipofectamine，一种阳离子脂类2，3-二油酰氧-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸(DOSPA)(化学文摘登录名：N-{2-(2，5-二[(3-氨基丙基)氨基]-1-氧戊基}氨基)乙基]-N，N-二甲基-2，3-二(9-十八烯基氧基)-1-丙铵三氟乙酸)和中性脂类二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)在膜过滤水中的3∶1(w/w)的脂质体制剂。例子是制剂Lipofectamine 2000TM(购自Gibco/Life Technologies #11668019)。其它试剂包括：FuGENETM 6转染试剂(非脂质体形式的脂类和其它化合物在80％乙醇中的混合物，可从Roche DiagnosticsCorp.# 1814443)；和LipoTAXITM转染试剂(来自InVitrogen Corp，#204110的脂类制剂)。
产生具有稳定基因改变的hES细胞合适的病毒载体系统基于腺病毒和反转录病毒，可用市售病毒成分制备。
对于许多用途，hES细胞的基因改变需要注意两种不同的事项：实现足够高效力的基因改变，和以不促进hES细胞沿着不良途径分化的方式改变。筛选各种转染和转导系统，优化反应时间和条件，可以在用具有可检测标记的编码区的表达载体的实验中方便的进行。特别方便的标记是强荧光，例如荧光酶或绿色荧光蛋白(GFP)。标记还可以是在组织病理学中检测的或用酶反应定量的酶。例子包括碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。标记还可以是细胞表面蛋白，可以用标记的抗体染色和例如在荧光活化细胞计数装置中定量。一旦鉴定和优化了有效系统，可用感兴趣的基因取代标记的编码区。
为了监测基因改变的细胞的分化，可以测试细胞对于pPS细胞特征性标记，例如SSEA-4、OCT-4和TERT的表达。转染效力因此可以计算成携带未分化表型的细胞的百分数。基因改变的细胞的多能性还可通过在体外(例如通过胚状体形成)或在体内(通过畸胎瘤形成)诱导分化确定，和与未基因改变的hES细胞产生的细胞类型比较。
用这些条件和跟踪含GFP的质粒载体的转染和SSEA-4的表面表达，测定了基因改变的效力一般可以改进，如果重新将pPS细胞铺板，使其在加入载体前稳定48小时。标记例如GFP的峰表达发生在约24小时后。
基因改变的效力很少会是100％，通常需要富集已成功改变的细胞群。当使用在成纤维细胞饲养细胞上的hES培养物时，效率可以是未分化细胞的5-20％。可通过利用新表型的功能特征富集基因改变的细胞。例如，当pPS细胞被GFP等标记，或用可免疫染色的表面标记，例如NCAM转染，可以悬浮pPS细胞，用荧光激活的细胞分拣分离，然后重新铺板。注意读数，因为完全分离的pPS细胞通常促进分化。
特别有效的富集基因改变的细胞的方法是用对药物，例如新霉素或嘌呤霉素的抗性阳性筛选。为了实现这个，可以通过与标记基因或感兴趣基因的载体细胞和提供药物抗性基因的载体系统同时接触，基因改变细胞。如果药物抗性基因的比例在混合物中低(即3∶1)，那么大部分药物抗性细胞应也还有感兴趣的基因。另外，药物抗性基因可以构建在感兴趣的基因的同一载体中。转染发生后，用相应的药物处理培养物，并除去未转染的细胞。不幸的是，hES培养物中的饲养细胞通常也对药物敏感。
为了克服这个问题，本公开还提供了药物抗性的饲养细胞。已知提供适合繁殖pPS细胞，而不分化的环境的细胞可以引入药物抗性基因，然后重新评估其作为饲养细胞的活力。另外，饲养细胞(例如原代小鼠成纤维细胞)可以从被赋予药物抗性基因的非人哺乳动物制备。这些小鼠是可购得的，例如从Jackson Laboratories。饲养细胞可以通过用端粒酶反转录酶(TERT)或SV40大T抗原的表达系统基因改造，从而无限增殖化。
实施例8说明了称为NHG190的具有潮霉素、新霉素、嘌呤霉素和经过端粒化的永久饲养细胞系。令人惊讶的是，尽管所有操纵和基因微扰，细胞仍然是非常有效的饲养细胞，提供支持hES细胞增殖而不分化的基质底物和辅助因子。NHG190细胞还适合产生在无饲养细胞培养物中支持hES细胞的条件培养基。实施例9说明了药物抗性的饲养细胞如何用于长期筛选用药物抗性基因改变的hES细胞。
发现了pPS细胞尤其适合基因改变，当其在无细胞培养物中生长时(在实施例10中说明)。用DNA/脂类复合物瞬时转染可以高达60％。细胞易于操纵，并且在周围没有饲养细胞起到载体槽的作用，药物筛选不需要存在药物抗性饲养细胞。在转染后长出的未分化的pPS集落的数量还可以提高。
基因改变和药物筛选(在药物抗性饲养细胞或无饲养细胞培养物上)后，可能分拣出显示改变的表型的集落，并分开培养。挑拣出的集落分散成25-100个细胞的小堆，重新铺在合适的环境中。用一些或全部该部分和本公开中描述的策略，可以得到pPS细胞的培养物，其中至少约25％、50％、75％或甚至90％未分化的细胞已被基因改造。
端粒化多能干细胞及其衍生物
当需要提高pPS细胞、成纤维细胞或其它细胞类型的复制能力时，可以通过用合适的载体(如上所述)基因改变它们使其端粒化，从而它们能表达端粒酶催化成分(TERT)。特别合适的是人端粒酶(hTERT)的催化成分，在国际专利出版物WO98/14592中提供。对于一些申请，可使用其它TERT序列(小鼠TERT提供于WO99/27113)。
通常，载体将含有在异源启动子控制下的TERT编码区，促进指定的未分化或分化的细胞系转录。可驱动TERT编码区表达的序列包括病毒LTR、增强子和启动子(例如MPSV、SV40、MolV、CMV、MSCV、HSV TK)，真核启动子(例如β-肌动蛋白、遍在蛋白、EF1α和PGK)或其组合(例如与β-肌动蛋白启动子联合的CMV增强子)。标记基因的表达可以由TERT基因的相同启动子驱动，或作为独立的表达盒，作为多顺反子转录物的一部分(其中TERT的编码区和标记基因由IRES序列分开，使得两种独立的蛋白质从由一个启动子驱动的一个转录物产生)。人细胞中端粒酶的转染和表达如Bodnar等，Science 279：349，1998和Jiang等，Nat.Genet.21：111，1999。
在端粒化前后，端粒酶活性和hTERT表达可以用标准试剂和方法确定。例如，用TRAP试验评估pPS细胞的端粒酶(Kim等，Science 266：2011，1997；Weinrich等，Nature Genetics 17：498，1997)。为了研究目的购得下列试验试剂盒：TRAPeze
Figure G2009101296702D00401
XK端粒酶检测试剂盒(目录s7707；Intergen Co.，Purchase NY)；和TeloTAGGG端粒酶PCR ELISAplus(目录2,013,89；Roche Diagnostics，Indianapolis IN)。hTERT表达还可以在mRNA水平通过RT-PCR评估。为了研究目的购得下列试验试剂盒：LightCycler TeloTAGGG hTERT定量试剂盒(目录3,012,344；Roche Diagnostics)。
还考虑其它无限增殖化细胞的方法，例如用编码SV40大T抗原的DNA基因改变细胞(美国专利5,869,243，国际专利出版物WO 97/32972)，用EB病毒感染，引入癌基因例如myc和ras，引入病毒复制基因例如腺病毒E1a，和将具有所需表型的细胞与无限增殖化的细胞系融合。当细胞用于治疗目的时，用癌基因或癌病毒产物转染通常不是很适合。
繁殖的pPS细胞及其衍生物的其它用途
该描述提供了一种方法，通过它可以商业化产生大量多能细胞，而不需要饲养细胞，然后分化成定型的前体细胞或最终分化的细胞。这些细胞群可用于许多重要的目的。
特异性抗体的制备
可用不需要饲养细胞维持的pPS细胞制备对胚胎标记、干细胞标记和其它细胞上表达的抗原特异性的抗体。在本公开中描述的细胞提供了一种产生这些抗体的改良途径，因为它们基本无来自饲养细胞的污染的抗原。可通过用本公开的免疫原性形式的细胞注射脊椎动物，制备多克隆抗体。产生多克隆和单克隆抗体的方法如上所述。通过用本公开的pPS阳性筛选和用携带更广泛分布的抗原的细胞(例如分化的胚胎细胞)或成年人衍生的干细胞阴性筛选，可获得所需的特异性。
筛选增殖因子、分化因子和药物
可用pPS细胞筛选因子(例如小分子药物、肽、多核苷酸等)或影响培养物中pPS细胞的特征的条件(例如培养条件或操作)。该系统的优点是不被二级作用复杂化，该二级作用是由用测试化合物微扰饲养细胞导致的。在一个应用中，测试了生长影响物质。从培养物中抽出条件培养基，用更简单的培养基(例如KO DMEM)代替。然后用作为取代条件培养基的成分的候选物的不同可溶性因子的混合物处理不同的孔。如果维持处理的细胞并以令人满意的方式增殖，与在条件培养基中一样最好，确定各混合物的效力。可以通过根据测试方案处理细胞，然后确定是否处理的细胞产生特定品系的分化细胞的功能性或表型性特征，可测试可能的不同因子或条件。
还可用无饲养细胞pPS培养物在药物研究中测试药物化合物。候选药物化合物的活性评估通常涉及将本发明的分化的细胞与候选化合物混合，确定任何得到的变化，然后将化合物的作用与观察到的变化联系起来。用例如，由于化合物设计成对一些细胞类型具有药物学作用，或由于设计成具有其它作用的化合物可能具有不确定的副作用，来进行筛选。可以联合测试两种或多种药物(通过将细胞同时或依次混合)，来检测可能的药物-药物相互作用。在一些应用中，最初筛选化合物可能的毒性(Castell等，pp375-410，于“药物研究中的体外方法”，Academic Press，1997)。可以通过细胞存活率、存活、形态、一些标记、受体或酶的表达或释放，DNA合成或修复，[3H]-胸腺嘧啶或BrdU掺入，或姐妹染色体交换，分裂中期扩散确定细胞毒性。读者可以参见标准教科书“药物学研究的体外方法”，AcademicPress，1997和美国专利5,030,015。
基因组学
本公开描述的细胞可用于鉴定转录物的表达模式和前体细胞特征性的新合成的蛋白质，并可辅助指导分化途径和促进细胞之间的相互作用。感兴趣的细胞群的表达模式(例如直接或通过胚状体分化的人PS细胞，或特定品系的细胞)与对照细胞系(例如未分化的pPS细胞，其它类型的定型前体细胞、最终分化的细胞或其它物种的分化的细胞例如恒河猴PS细胞)比较。
比较蛋白质水平的表达的合适方法包括如上所述的免疫试验或免疫细胞化学技术。比较转录水平的表达的合适方法包括mRNA的分化显示的方法(Liang等，Cancer Res.52：6966，1992)和矩阵阵列表达系统(Schena等，Science 270：467，1995；Eisen等，Methods Enzymol.303：179，1999；Brown等，Nat.Genet.21 Suppl1：33，1999)。
在分析基因表达中使用微阵列一般由Fritz等Science 288：316，2000；“微阵列生物芯片技术”，M.Schena编，Eaton Publishing Company；“微阵列分析”Gwynne & Page，Science(1999年8月6日增刊)；Pollack等，Nat.Genet 23：41，1999；Gerhold等，Trends Biochem.Sci.24：168，1999；“基因芯片(DNA微阵列)”L.Shi于因特网网址www.Gene-chips.com综述。进行微阵列分析的系统和试剂可购自公司，例如Affymerix，Inc.，Santa Clara CA；Gene logic Inc.Columbia MD；HySeq Inc.，Sunnyvale CA；Molecular dynamics Inc.，Sunnyvale CA；Nanogen，SanDiego CA；和Synteni Inc.Fremont CA(由Incyte Genomics，Palo Alto CA获得)。
固相阵列是通过在所需位置合成探针，或预先合成探针片段，然后将其附着于固相载体，将探针附着在特定位点制备的。可使用各种固相载体，包括玻璃、塑料、陶瓷、金属、凝胶、膜、纸和各种成分的珠。美国专利号5,445,934公开了一种芯片上合成的方法，其中用含有光可切割的保护基团的化学物质衍生载玻片。通过掩模辐射去除各位点的保护，然后与含有光保护性基团的DNA单聚物反应。将预先合成的探针附着于固相载体表面的方法包括吸附、紫外光连接和共价结合。在一个例子中，修饰固相载体携带一个活性基团，例如羟基、羧基、胺、醛、肼、环氧化物、溴乙酰基、马来酰亚胺或硫醇基团，通过该基团可结合探针(美国专利号5,474,895和5,514,785)。
探针试验通常通过使阵列在合适的杂交条件下接触可能含有感兴趣的核苷酸序列的液体，然后确定任何形成的杂交。例如，样品中的mRNA或DNA可以在与合适的标记，例如荧光标记Cys3或Cys5结合的核苷酸存在的情况下扩增。调节条件，使杂交是精确互补匹配或以不同程度的同源性合适地发生。然后洗涤阵列，通过测定与固相关联的标记的存在和数量确定结合的核酸。可以比较阵列之间不同样品的相对表达水平，可任选的用在感兴趣的细胞中表达的基因，例如核糖体或家务基因，或作为样品中总多核苷酸的比例标准化。另外，通过从各来源制备以不同水平扩增的多核苷酸，可同时在相同阵列上测试两种或多种不同来源的样品。
用Genetic Microsystems阵列发生器和Axon GenePixTM扫描仪进行一种示范性方法。通过首先以96或384孔形式扩增编码要分析的标记序列的cDNA片段制备微阵列。然后直接将cDNA点样于载玻片上，密度高达＞5000/片。为了比较感兴趣的两种细胞的mRNA制备物，将一种制备物转化成Cy3-标记的cDNA，而另一种转化成Cy5-标记的cDNA。同时将两种cDNA与微阵列载玻片杂交，然后洗涤消除非特异性结合。阵列上任何给定的点将以两种原始mRNA制备物中的转录物的丰度成正比，与各cDNA产物结合。然后在各标记合适的波长扫描载玻片，定量得到的荧光，格式化结果得到阵列上各标记的mRNA相对丰度的指标。
鉴定表达产物，用于确定特征和影响本发明分化的细胞，涉及分析第一细胞类型，例如多能前体细胞，或能沿特定途径分化的细胞的RNA、蛋白质或其它基因产物的表达水平；然后分析相同产物在对照细胞类型中的表达水平；比较两种细胞类型之间的相对表达水平(通常由样品中的总蛋白质或RNA标准化，或与希望在两种细胞类型中以相似水平表达的另一种基因产物，例如持家基因)；然后基于比较的表达水平鉴定感兴趣的产物。
如果产物在本发明的分化的pPS细胞中与对照比较，相对表达水平是至少约2倍、10倍或100倍提高(或抑制)，通常对它们是感兴趣的。该分析可任选的是计算机辅助的，通过在独立的轴上标记各细胞类型中的表达水平，其中相对于各轴的标记的位置是根据各细胞中的表达水平，然后基于标记位置选择感兴趣的产物。另外，第一种细胞与对照细胞之间的表达差异可以在色谱上表示(例如黄色代表相当的水平，红色代表增加的表达，蓝色代表抑制的水平)。然后可基于代表一种感兴趣的标记的表达的衍射，或基于代表多种标记的图案选择感兴趣的产物。
表达水平在分化过程中经过改变的基因和蛋白质对于许多目的是感兴趣的。例如，可用在pPS细胞中高而在分化过程中下降的表达作为未分化状态的分子标记。可使用对应于这些标记的试剂，例如抗体来从一群分化的细胞群中通过免疫亲和分离或补体介导的裂解除去未分化的pPS细胞。当表达在分化过程中提高时，可以相似方式使用标记，来纯化、富集、除去或消除衍生自pPS细胞的特定细胞类型。这些标记可以作为细胞分化的广泛家族的指标，例如中胚层、内胚层或外胚层品系中表达的基因或蛋白质，或可以作为高度分化的细胞类型的标记。
在表达过程中上调的基因还可用于影响pPS分化成特定品系。例如，可测试编码转录因子、生长因子、受体和信号传递分子的转基因的未分化pPS细胞中的强迫表达影响分化成特定细胞品系的能力。
治疗组合物
本发明的分化的细胞还可用于在有需要的人类病人中组织重建或再生。细胞以允许其移植到指定的组织位点并重建或再生功能性缺陷的区域的方式施用。
在一个例子中，神经干细胞被根据要治疗的疾病直接移植到中枢神经系统的薄壁或鞘内位点。用单细胞悬液或小聚集物，以25,000-500,000细胞/微升的密度进行移植(美国专利5,968,829)。可在大鼠模型中评估神经细胞移植物对于急性受伤的脊索的效应，如McDonald等(Nat.Med.5：1410，1999)所述。成功的移植将显示出移植物衍生的细胞在2-5周后存在于病变区，分化成星状细胞、少突胶质细胞和/或神经元，并沿脊索从受损的一端迁移，以及离子通道闸门、协调和重量支撑的改进。
心肌细胞的效用可以在心脏冻伤动物模型中评估，它是导致55％左心室壁组织变成疤痕组织，而没有治疗(Li等，Ann.Thorac.Surg.62：654，1996；Sakai等，Ann.Thorac.Surg.8：2074，1999；Sakai等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.118：715，1999)。成功的治疗将减少疤痕面积，限制疤痕膨胀，并改善心脏功能，由收缩、舒张和改进的压力确定。心脏损伤还可以用左前降动脉的远侧部中的栓塞形成卷曲作为模型(Watanabe等，Cell Transplant.7：239，1998)，和可用病史和心脏功能评估疗效。本发明描述的心肌细胞制备物可用于治疗，来再生心肌，和治疗心脏功能不全(美国专利5,919,449和WO 99/03973)。
可在动物模型中评估肝细胞和肝细胞前体修复肝脏损伤的能力。一个这样的例子是腹膜内注射D-半乳糖胺导致的损伤(Dabeva等，Am.J.Pathol.143：1606，1993)。疗效可以通过免疫细胞化学染色肝细胞标记，显微镜确定是否在生长组织中形成小管结构，和治疗恢复合成肝脏特异性蛋白质的能力确定。肝脏细胞可通过直接给药，或当病人的肝脏组织在暴发性肝脏衰竭后再生时，作为提供临时肝脏功能的生物辅助装置的一部分用于治疗。
根据本发明制备的，用于人或兽医治疗的细胞最佳在药物组合物中提供，含有在人给药的充分无菌条件下制备的等渗赋形剂。对于医药制剂中的一般原理，读者可参见细胞治疗：干细胞移植，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy，G.Morstyn和W.Sheridan编，Cambridge university Press，1996；和造血干细胞治疗，E.D.Ball，J.Lister & P.Law，Churchill Livingstone，2000。组合物可以和对细胞在组织再生、或恢复治疗上重要的代谢功能的用途的书面说明一起包装。
下面的实施例是通过进一步说明提供的，不意味着指要求的本发明的实践中的任何限制。
实施例
实施例1：hES细胞的无饲养细胞的传代
在该实验中，收集维持在原代小鼠胚胎饲养细胞上的未分化的hES细胞，然后在无饲养细胞的条件下维持。用Matrigel
Figure G2009101296702D00451
包裹培养物孔，将细胞在通过培养辐照过的原代成纤维细胞获得的条件营养培养基的存在下培养。
从原代小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)制备条件培养基(CM)
从T150烧瓶通过用无CA++/Mg++PBS洗涤一次，在1.5-2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco)中保温约5分钟收集成纤维细胞。在成纤维细胞与烧瓶分离后，将它们收集在mEF培养基(DMEM+10％FBS)中。以4000rad辐射细胞(508sec于140kV：在Torrex发生器中搁板设定6)。在至少4小时后，用含有ES培养基的SR交换培养基，在6孔板上使用3-4毫升/9.6厘米孔。每日收集条件培养基，喂养hES培养物。另外，用铺在培养瓶中的mEF制备培养基，每日以0.3-0.4ml/cm2交换培养基。在加到hES培养物之前，用4ng/ml人bFGF(Gibco)补充条件培养基。在该系统中使用成纤维细胞培养物约1周，然后用新制备的细胞替换。
Matrigel
Figure G2009101296702D00452
包裹：
去除生长因子的Matrigel
Figure G2009101296702D00461
或常规Matrigel
Figure G2009101296702D00462
(Becton-Dickinson，BedfordMA)在4℃融化。Matrigel
Figure G2009101296702D00463
在冷的KO DMEM中1∶10-1∶500稀释。在每9.6平方厘米孔中各加入0.75-1.0毫升，并在室温下培养1小时，或在4℃过夜。包裹的孔在加入细胞前用冷KO DMEM洗涤一次。包裹后2小时内使用平板，或4℃储藏在DMEM中，在约1周内使用。
人ES培养物：
从饲养细胞上的hES收集未分化的hES集落如下：培养物在约200U/ml胶原酶IV中37℃保温约5分钟。通过用20微升滴管尖在显微镜下挑起单个集落，或将其刮落，在条件培养基(CM)中分解成小簇收集集落。然后将这些细胞接种在条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00464
中，每个9.6cm2孔15个集落(如果1个集落是约10,000个细胞，那么铺板密度是约15,000细胞/cm2)。
在Matrigel上接种后一天，可见hES为小集落(约100-2,000个细胞)，在集落之间有细胞正在分化或死亡。随着hES细胞繁殖，集落变得十分大和非常紧密，占了培养皿的大部分表面积。集落中的hES细胞具有高核/质比，并具有明显的核，与维持在饲养细胞上的hES细胞类似。在汇合时，集落之间分化的细胞占培养物中细胞的10％以下。
接种后6天，培养物变得几乎汇合。通过与1ml-200U/ml胶原酶IV的KO DMEM溶液37℃保温约5分钟分裂培养物。吸去胶原酶溶液，在每孔中加入2ml hES培养物，从皿中用滴管刮取hES细胞。细胞悬液转移到15ml锥形管中，达到6ml体积，并温和研磨，使细胞分解成10-2000个细胞的小簇。然后将细胞重新接种在Matrigel
Figure G2009101296702D00466
包裹的CM板上，如上所述。细胞以1∶3或1∶6的比例接种，约90,000-170,000个细胞/cm2，在各孔中达到3ml体积。每天更换培养基，在最初接种后的第13天和第19天分开并再次传代。
在最初接种后的第19天，收集细胞并通过免疫荧光细胞流式计数，用对细胞表面标记特异性的标记的抗体评估表面标记表达。该实验的结果如下：
表1：在无饲养细胞下生长的hES细胞的表型
  标记   特异性   细胞染色百分数
  SSEA-4   未分化的细胞   92％
  Tra-1-80   未分化的细胞   92％
  Tra-1-81   未分化的细胞   83％
  SSEA-1   分化的细胞   12％
对于在不存在饲养细胞的情况下维持的hES细胞，以高百分数表达SSEA-4、Tra-1-60或Tra-1-81。这3个标记在维持在饲养细胞上的未分化的人hES细胞中表达(Thomson等，1998)。另外，SSEA-1，一种在未分化的ES细胞上不表达(或以低水平表达)的糖脂表达非常少。SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的免疫细胞化学评估表明这些标记的表达位于ES集落，而不是集落之间的分化细胞。
在不存在饲养细胞的情况下生长的hES细胞还可以用核型(用G显带法评估)、OCT-4(与未分化ES细胞有关的POU转录因子家族的成员，由PCR评估)的表达、形成端粒的能力(用约5×106细胞注射SCID/beige小鼠后1-4个月)和对低温保存的适应性(在补充了10％DMSO和20-30％SR的标准培养基中，在控制速度的冷藏室中)确定特征。
hES细胞的培养物在最初接种后在无饲养细胞的情况下生长了超过147天，而且在增殖能力或表型中没有明显变化。维持在mEF条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00471
上的人ES细胞具有约31-33小时的倍增时间，与mEF饲养细胞上生长的hES细胞的增殖速率类似。无饲养细胞培养64天后的H1细胞显示正常核型。
实施例2：Matrigel
Figure G2009101296702D00472
和层粘连蛋白支持hES细胞的无饲养细胞生长
在不同的基质成分，在用原代小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)调理的培养基中跟踪hES细胞的生长。
最初从维持在ES培养基(80％敲除DMEM(Gibco BRL，Rockville，MD)，20％敲除血清替代品(Gibco BRL，Rockville，MD)，1％非必需氨基酸(Gibco BRL，Rockville，MD)，1mM L-谷氨酰胺(Gibco)，0.1mM β-巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)，补充了4ng/ml的重组人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF；Gibco))中的饲养细胞培养物中收集hES培养物。通过在约200U/ml胶原酶IV中37℃培养约5-10分钟，然后在条件培养基中温和分离成小簇，然后接种到基质包裹的平板上传代培养物。
将收集到的hES细胞接种到mEF条件培养基中的Matrigel或明胶中。接种后一天，将细胞铺到Matrigel
Figure G2009101296702D00481
结合的平板上，形成比饲养细胞层上的hES集落较稀疏的小集落。在后两天，集落变大，细胞变得紧密。得到的培养物具有被分化的细胞包围的非常密的未分化集落。
在接种后约1周，培养物变得汇合，可以传代。相反，接种在明胶上的细胞显示非常少的存活，存活的细胞看来分化。三种hES细胞系H1、H7和H9在mEF条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00482
上培养。在这些条件下维持超过100天的培养物继续显示ES样形态。
Matrigel
Figure G2009101296702D00483
的主要成分是层粘连蛋白、胶原酶IV和硫酸肝素蛋白聚糖。这些成分支持hES细胞培养物的能力分别测试。层粘连蛋白、胶原酶IV或纤连蛋白(都来自Sigma)分别稀释到最终浓度为20微克/毫升、10微克/毫升和5微克/毫升的PBS溶液。
接种在层粘连蛋白、纤连蛋白或胶原酶IV上的hES细胞具有未分化的hES细胞的集落，虽然纤连蛋白或胶原酶IV上的培养物所含的未分化集落不如Matrigel或层粘连蛋白上的培养物那样多。当Matrigel
Figure G2009101296702D00485
或层粘连蛋白上的细胞达到汇合时，集落内的细胞变得非常紧密，形态与维持在饲养细胞上的细胞非常相似，可连续传代。40天(6次传代)后，Matrigel
Figure G2009101296702D00486
和层粘连蛋白上的细胞含有高比例的集落，它们在长期培养中继续显示ES样的形态。然而，维持在纤连蛋白或胶原酶IV中的细胞具有所显示出合适的ES-形态的集落少。作为对照，在未调理的培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00487
或层粘连蛋白上培养的细胞增殖更慢，并在几次传代后出现分化的形态。
图1显示了hES细胞在无细胞培养物中的形态。A栏(左侧)显示了在未调理的培养基(mEF/RM)中饲养细胞上，在mEF条件培养基中的Matrigel、层粘连蛋白、纤连蛋白或胶原酶IV上培养的H1品系的hES细胞的形态。B栏显示维持在各种类型的条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00489
上的H9品系的hES细胞的形态，如实施例11所述。
层粘连蛋白是脊椎动物中所有基础片层的主要成分，它与整联蛋白异二聚体，例如α1β1、α2β1、α3β1、α6β1和α6β4，在细胞表面相互作用，并介导细胞生长和发育中的迁移。在这些整联蛋白中，α6β1和α6β4是层粘连蛋白专一性的；其它整联蛋白还和其它基质相互作用。另一个实验测试了层粘连蛋白受体是否在hES细胞上表达，和在层粘连蛋白或Matrigel
Figure G2009101296702D004810
上培养hES细胞是否改变层粘连蛋白受体的表达。用FACS分析对维持在饲养细胞上，条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00491
或层粘连蛋白上的细胞检测包括α1、α2、α3、α6、β1和β4的整联蛋白表达。为了分析整联蛋白表达，用一组整联蛋白特异性抗体通过层粘连蛋白特异性整联蛋白调查试剂盒(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)和FACS分析如下所述染色细胞。
图1C栏显示在维持在未调理培养基(mEF/RM)中的饲养细胞，或在mEF条件培养基(CM)上的Matrigel或层粘连蛋白上的H1 hES细胞中测定整联蛋白表达。
维持在Matrigel
Figure G2009101296702D00493
/条件培养基和层粘连蛋白/条件培养基中的细胞如下冷冻保藏：在标准hES培养基(而不是条件培养基)中冷冻细胞，用10％DMSO和另外10％SR(总的30％)补充。在条件培养基的Matrigel
Figure G2009101296702D00494
或层粘连蛋白上融化细胞。细胞在融化后维持正常核型。
维持在mEF条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00495
上的人ES细胞显示出约31-33个小时的倍增时间，与在mEF饲养细胞上生长的hES细胞的增殖速率类似。64天的无饲养细胞培养后H1细胞显示正常核型。
实施例3：无细胞培养物中hES细胞的表型标记
未分化的hES细胞表达SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、OCT-4和hTERT。为了评估维持在无饲养细胞的条件下的细胞是否保留这些标记，用免疫染色、反转录酶PCR扩增和端粒酶活性试验评估细胞。
图2显示FACS分析无饲养细胞的细胞中表达的表面标记。A栏：在未调理培养基(mEF/RM)中的饲养细胞上，在mEF条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00496
、层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原酶IV上的H1细胞中，SSEA-4的表达。虚线表明了同工型对照。B栏是在不同基质上培养的H1细胞中的SSEA-1、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的平均荧光强度。C栏：SSEA-1、Tra-1-60和Tra-1-81在来自不同细胞系的条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00497
上培养的H9细胞中的平均荧光强度。
为了用荧光活化的细胞分拣(FACS)分析，将hES细胞分散在0.5mM的EDTA的PBS溶液中，在含有0.1％BSA的PBS溶液中重新悬浮到约5×105个细胞/50微升稀释液。为了分析表面标记表达，细胞在一抗中4℃保温30分钟，包括稀释在稀释液中的IgG同工型对照(0.5微克/测试)、IgM同工型对照(1∶10)、SSEA-1(1∶10)、SSEA-4(1∶20)、Tra-1-60(1∶40)和Tra-1-81(1∶80)。用稀释液洗涤后，用与PE偶联的大鼠抗小鼠κ链抗体(Becton Dickinson，san Jose，CA)在4℃与细胞保温30分钟。洗涤细胞，在FACSCaliburTM流式细胞计数仪(Becton Dickinson，SanJose，CA)上用CellQuestTM软件分析细胞。
与饲养细胞上的hES细胞类似，在Matrigel
Figure G2009101296702D00501
、层粘连蛋白、纤连蛋白或胶原酶IV上的细胞表达SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81。对于SSEA-1，一种未分化的hES细胞不表达的糖脂几乎没有表达。
图3显示用组织化学检测的标记表达。为了用免疫细胞化学分析，用稀释在敲除DMEM中的一抗，包括SSEA-4(1∶20)、Tra-1-60(1∶40)和Tra-1-81(1∶80)37℃保温细胞30分钟。然后用温热的敲除DMEM洗涤细胞，在2％聚甲醛中固定15分钟。在用PBS洗涤细胞后，在室温下用5％山羊血清的PBS溶液培养细胞30分钟，然后在室温下与FITC-偶联的山羊抗小鼠抗体(1∶125)(Sigma)保温30分钟。洗涤细胞，用DAPI染色并计数。还测定了细胞的碱性磷酸酶，一种未分化ES细胞的标记的表达。这是通过将细胞在槽切片上培养，用4％聚甲醛固定15分钟，然后用PBS洗涤进行的。然后细胞与碱性磷酸酶底物(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)在室温下避光保温1小时。在计数前在100％乙醇中漂洗切片2-5分钟。
结果显示Matrigel
Figure G2009101296702D00502
或层粘连蛋白上的hES集落表达SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81和碱性磷酸酶，如饲养细胞上的细胞所见-但集落之间的分化细胞不表达。
图4显示饲养细胞上和无饲养细胞的H1细胞OCT-4和hTERT表达，如反转录酶PCR扩增测定的。为了放射性相对定量各基因产物，根据厂商说明书使用QuantunRNATM交替18S内标引物(Ambion，Austin TX，USA)。简单说，测定特定引物对扩增的品系范围，然后与合适的交替18S引物：竞争物的合适混合物共同扩增，得到具有相符的品系范围的PCR产物。在加入AmpliTaqTM(Roche)进行PCR反应前，酶与TaqStartTM抗体(ProMega)根据厂商说明书预先保温。在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析放射性PCR反应，干燥并接触磷光屏(Molecular Dynamics)一小时。用Molecular Dynamics Storm 860扫描屏幕，并用ImageQuantTM软件定量条带强度。结果表达成掺入hTERT或OCT-4条带中的放射性标定为掺入18s条带的放射性之比。
特定标记的引物和扩增条件如下。OCT-4：有义(SEQ ID NO：3)5’-CTTGCTGCAGAAGTGGGTGG AGGAA-3’；反义(SEQ ID NO：4)5’-CTGCAGTGTG GGTTTCGGGC A-3’；交替18：竞争物1∶4；19轮(94℃30秒；60℃30秒；72℃30秒)。hTERT：有义(SEQ IDNO：5)5’-CGGAAGAGTG TCTGGAGCAA-3’；反义(SEQ ID NO：6)5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3’；交替18：竞争物1∶12；34轮(94℃30秒；60℃30秒；72℃30秒)。
转录因子OCT-4通常在未分化的hES细胞中表达，并在分化时下调。在该实验中，发现维持在条件培养基(CM)中的Matrigel或层粘连蛋白上21天的细胞表达OCT-4，而在未调理的常规培养基(RM)中的Matrigel
Figure G2009101296702D00512
上的细胞没有。维持在纤连蛋白或胶原酶IV上的细胞，其显示大程度的分化，与饲养细胞、Matrigel
Figure G2009101296702D00513
或层粘连蛋白上的细胞相比较低的OCT-4的表达水平。
hTERT和OCT-4表达在全部培养条件，除了Matrigel
Figure G2009101296702D00514
和常规培养基中可见。另外，在细胞接触视黄酸(RA)或二甲亚砜(DMSO)后，促进细胞分化的因子，hTERT的表达显著下降。
图5显示了TRAP试验测定的端粒酶活性(Kim等，Science 266：2011，1997；Weinrich等，Nature Genetics 17：498，1997)。全部培养条件显示在mEF条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00515
、层粘连蛋白、纤连蛋白或胶原酶IV上40天后的阳性端粒酶活性。
实施例4：体外和体内分化
在维持在条件培养基中的Matrigel、层粘连蛋白、纤连蛋白或胶原酶IV上26天的H1 hES细胞中诱导体内分化。通过在约200U/ml胶原酶IV中37℃保温10分钟，将hES细胞分解成小簇，并在含有DMEM、20％FBS(hyclone)、1mM谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇和0.1mM非必需氨基酸(Gibco)的培养基中，悬浮培养形成胚状体(EB)。悬液中4天后，将聚集物转移到聚鸟氨酸包裹的平板上，再培养7天。然后检测培养物中搏动细胞的存在，处理进行免疫细胞计数。
图6显示这些细胞的免疫细胞化学分析的结果。染色模式与神经元和心肌细胞品系的细胞一致(分别为β-微管蛋白III和心脏肌钙蛋白I)。约分化后8天，在所有培养物中出现搏动区。还有α-胎儿球蛋白，一种内胚层品系的细胞染色。
通过肌肉内注射到SCID小鼠中，还测试了hES细胞形成畸胎瘤的能力。收集维持在饲养细胞或无饲养细胞条件下的细胞，重新悬浮在PBS中，并肌肉内注射到SCID/beige小鼠(5×105个细胞/位点)体内。切下肿瘤并进行组织学分析。来自无饲养细胞培养物的hES细胞产生肿瘤，在78-84天后切下并进行组织学分析。
图7显示了用mEF饲养细胞(A)或无饲养细胞的培养物(B)维持的畸胎瘤的组织病理学。在饲养细胞上培养的畸胎瘤衍生形式的hES细胞中观察到粘液性表皮成分、软骨和神经组织。囊性表皮结构，可能的牙齿成分、软骨和腺上皮或神经成分在衍生自无饲养细胞的hES培养物的畸胎瘤中找到。
实施例5：直接分化hES细胞
将用聚集物形成的标准方法的分化与本发明的技术比较，其中细胞是通过直接在一些条件下在固相表面上铺板分化的。
对于该聚集分化技术，通过在胶原酶IV中保温5-20分钟，从平板上刮下细胞，收集猿猴和人ES品系的单层培养物。然后分散细胞，铺在无粘连的细胞培养平板上的含FBS的培养基中(20％未热灭活的FBS(Hyclone)，补充有0.1mM非必需氨基酸，1mM谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇)。当培养基的体积超过4ml/孔，收集EB重新悬浮在新鲜培养基中。将平板置于37℃的温箱中，在一些情况下使用摇床来促进在悬液中维持聚集。悬浮4-8天后，形成聚集体，铺在底物上使得进一步分化。
对于直接分化技术，以相似方式制备猿猴和人ES细胞的悬液。然后将细胞研磨成约50-100个细胞的簇，置于用聚鸟氨酸处理的玻璃盖玻片上。在含有血清的培养基或有限的培养基中维持细胞7-10天，然后分析。用β-微管蛋白III和MAP-2的免疫反应性测试细胞，它们是神经元和星状细胞的特征性胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的特征。
用聚集物或直接分化技术将6种不同的ES品系分化成携带神经元和星状细胞标记的细胞。在衍生自猿猴ES细胞的培养物中，含有神经元的聚集物的百分数为49％-93％之间。在人ES细胞衍生的培养物中，含有神经元的聚集物的百分数范围是60％-80％。双重标记GABA和β-微管蛋白表明神经细胞的一个亚群表达抑制性神经递质GABA。星状细胞和少突胶质细胞分别用GFAP免疫反应性和GalC免疫反应性鉴定。因此人和猿猴ES细胞能形成中枢神经系统中的全部三种主要细胞表型。
检测了神经营养蛋白生长因子家族的几个成员的作用。用胶原酶收集，分解和重新铺在聚鸟氨酸包裹的盖玻片上，分化hES细胞。细胞铺在DMEM/F12+N2+10％FBS中过夜。翌日，从培养基除去血清，用10ng/ml人bFGF和要测试的生长因子替换。在24小时后，从培养基除去bFGF。每隔一日喂养这些培养基。分化7天后固定，并免疫染色分析。通过计算β-微管蛋白阳性的细胞数量，评估神经元数量。在10ng/ml大脑衍生的神经营养因子(BDNF)存在下维持的培养物形成比对照培养物多约3倍的神经元。维持在神经营养蛋白-3(1ng/ml)中的培养物形成的神经元比对照培养物多约2倍。
为了评估心肌细胞形成，在悬浮培养4天后将EB转移到明胶包裹的平板或槽切片中。接种后EB与表面结合，增殖并分化成不同类型的细胞。在分化的第8天，在培养物的不同区域观察到自发收缩的细胞，搏动区域数目增加，直到第10天。在一些情况下，75％以上的EB具有收缩区。搏动细胞的形态与小鼠ES细胞衍生的搏动心肌细胞相似。在这些培养物中，100％的搏动区域与心脏肌钙蛋白I(cTnI)具有免疫反应性，而在非搏动细胞中观察到很小的免疫反应性。
用针对cTnI的单克隆抗体对分化的EB的培养物进行Western印迹分析。该试验得到强31kDa蛋白质信号，对应于纯化的天然人cTnI的大小。在含有收缩细胞的分化的人ES细胞中检测到，但在未分化ES细胞和没有收缩细胞迹象的分化的培养物中检测不到。作为对照，重新用β-肌动蛋白特异性抗体探测印迹，确定在所有样品中存在相似量的蛋白质。
在其它实验中，培养EB8或16天，并作为粘附培养物再维持10天。从分化的人ES细胞制备RNA，进行半定量RT-PCR，检测内胚层特异性产物α1-抗-胰蛋白酶、AFP和清蛋白的相对表达。在未分化的细胞中检测到低水平的α1-抗-胰蛋白酶和AFP；在相同的培养物中检测不到或几乎检测不到清蛋白。在分化后检测到相当高水平的全部3个标记。全部3个内胚层标记的表达在从8天的胚状体衍生的培养物中比16天的胚状体衍生的高。
实施例6：未分化和分化的细胞的表达的微阵列分析
通过将未分化的H9培养物的mRNA与相应EB的mRNA比较，进行分化基因表达的分析。将EB在生长培养基中维持8天，或维持在生长培养基中4天，然后用0.5μM视黄酸处理4天。2天、4天或8天后收集EB，直接将得到的mRNA与未分化的培养物的mRNA比较。该分析跟踪相对同源的细胞群转化成复杂的分化的细胞类型的混合物，从而读数同时受到基因表达变化的程度和在表达的变化是特定的一种分化细胞类型，受到培养物中该细胞类型的表现的影响。在这些实验中使用的阵列从选自代表特征性人基因的大部分的约10,000cDNA中采样。
从人ES培养物或其衍生的衍生物中，用Qiagen RNAeasyTM Miniprep试剂盒根据厂商说明书收集总RNA。通过测定260nm处的紫外吸光度定量RNA。从总RNA制备物用Qiagen OligotexTM Minipreps根据厂商说明书制备Poly A+mRNA。最终的mRNA制备物用A260测量值定量，然后在天然的琼脂糖凝胶上电泳后目测。样品RNA被送到承包实验室(Incyte Pharmaceuticals，Palo Alto，CA)转化成Cy3-或Cy5标记的cDNA探针，它最后与UNIGEM 1.0阵列杂交。
处理杂交的阵列后，定量荧光测量值，值返回用于分析。用Cy3通道中未分化ES细胞得到的样品，和Cy5通道中返回的ES细胞样品进行探针配对。表达中的变化(如比较Cy3和Cy5通道测量的)通常认为是重要的，如果差异至少是2.5倍。
hES细胞的分化涉及许多基因的活化和抑制，包括未知功能的EST。有趣的是，在分化最后4天的悬浮培养物中加入视黄酸对基因表达模式具有非常小的作用(比较4d-/4d+和8d)。
在分化过程中表达减少的基因代表各种各样的功能，包括金属硫蛋白、生长因子(例如FGF9)、分泌的富含半胱氨酸的蛋白质(例如骨桥蛋白、AGF-BP5、Cyr61、结缔组织生长因子)、铯供体代表selD和许多其它功能。一般说，表达中最显著的改变发生在悬浮培养4天后，相应在细胞形态中发生变化。感兴趣的是与α-D-葡萄糖磷酸酯、UDP-葡萄糖磷酸化酶和磷酸葡糖变位酶的分解代谢中有关的两种基因的表达在分化后剧烈下降，提示葡糖代谢的可能改变。
用于这些实验的阵列不含对应于hTERT的cDNA特征；然而观察到对于TRF1的mRNA的表达中显著的下降。TRF1是一种主要的端粒结合因子，其表达与缩短的端粒长度关联。因此端粒长度的阳性(hTERT)和阴性(TRF1)调节因子在ES细胞分化中减少。
在该分析中几种与内脏内胚层和早期肝脏分化有关的基因占优势，包括α-胎儿球蛋白、载脂蛋白A-II、载脂蛋白A1调节蛋白-1、α1-抗胰蛋白酶、和纤维蛋白原的α、β和γ链。该诱导在分化两天内是明显的，但几乎不受视黄醛处理的影响。在视黄醛处理的培养物中观察不到细胞视黄酸结合蛋白1和2(CRABP I、II)的诱导表达，与预测的负反馈回路一致，其中视黄醛特异性抑制CRAB I基因启动子的转录。
IL-6受体gp130的表达在hES培养物中低，在分化后被诱导。这些结果提供了hES培养物中缺乏LIF反应性的分子基础(Thompson等，1999；Reubinoff等，2000)，并表明gp130在人类中与小鼠ES细胞中完全不同的作用，在小鼠ES细胞中LIF信号传递是直接在未分化状态的维持中暗示的。
其它分化诱导的基因包括蛋白质同类物多效蛋白和midkine。这些分泌的细胞因子具有作为神经元和肝细胞型有丝分裂原或作为泛化血管生成因子的推测作用(Owada等，1999；Sato等，1999)，并可以在ES细胞分化中起到类似作用。DNA结合蛋白的诱导，例如同源异型框b5蛋白和meisl，类似反映了转录调节因子在分化过程中的中心作用。
实施例7：维持在原代mEF饲养细胞层上的hES细胞的基因改变
该实施例提供了在如上所述原代mEF上生长的hES细胞中引入基因改变的条件。在转染前，用胶原酶(约200U/ml)从饲养细胞层上除下hES细胞，悬浮在18毫升的最终体积中，以3ml/孔铺在预先用明胶和原代mEF饲养细胞包裹的6孔板中。
然后用不同的转染系统测试重新铺板的细胞：哺乳动物转染试剂盒(CaPO4和DEAE试剂)、Stratagene目录号200285；TransIT-LT1 Mirus(Panvera)，目录号MIR 2310；Polybrene(Sigma)；SuperfectTM(Qiagen)；EffecteneTM(Qiagen)；LipofectinTM(Life Technologies)；Lipofectamine(与Lipofectamine 2000TM不同)(Life Technologies)；CellfectinTM(Life Technologies)；DMRIE-C(LifeTechnologies)；Lipofectamine 2000(Life Technologies)；和用BioRadTM Gene脉冲仪电穿孔。
在所用的条件下，Lipofectamine 2000(Gibco Life Technologies目录号11668019，申请专利中)和FuGENETM(Fugent L.L.C.的商标；脂类和其它成分的专利混合物，购自Roche Diagnostic Corporation目录号1814443)，都得到良好的转染效力。如果这些试剂与重新铺板的hES细胞在铺板后接触约48小时，效率通常是最佳的。
用Lipofectamine 2000TM转染如下进行：质粒DNA(3-5微克pEGFP-C1，ClonTech目录号6084-1)稀释在水中达到最终体积为100微升。在引导实验中，将5-30微升Lipofectamine 2000TM(Gibco，目录号11668-019)稀释在OptiMEMTM(Gibco，目录号11-58-021)中，达最终体积100微升。然后将DNA溶液缓慢加到Lipofectamine 2000TM溶液中，并温和混合。混合物在室温下保温20-30分钟，然后补充800微升OptiMEMTM。用2毫升预温的OptiMEMTM洗涤细胞，各孔(9.6cm2)在0.5-1毫升DNA/脂类混合物溶液中37℃保温4小时。在一些实验中，在4小时，除去混合物，然后加入4毫升mEF条件培养基；在其它实验中，在孔中加入足量的mEF条件培养基，达到最终体积为3.5毫升，将混合物留在细胞上过夜。在其它实验中，DNA：脂类混合物加到含有足量mEF条件培养基的孔中，从而使最终体积为3.5毫升，细胞在该混合物中培养过夜。
如下进行FuGENETM的转染。用FuGENETM 6(Roche diagnostics Corp.)以3∶2FuGeneTM试剂对DNA的比例，用10微克DNA转染各孔，如厂商说明书所述。在该转染中使用OptiMEMTM无血清培养液。在“旧方案”中，加入FuGENETM-DNA复合物4小时后，在各转染孔中加入2.5毫升标准hES培养物。在修订的方法中(“3:2L”)，不用标准hES培养基重新喂养转染的孔。转染后24小时，用流式细胞计数计估GFP-表达。
转染前48小时，将hES细胞接种到如上所述包裹了明胶和mEF饲养细胞层的6孔板上。用FuGENETM 6(Roche)或Lipofectamine 2000TM(Gibco)根据厂商说明书转染hES细胞。转染后24小时，在荧光显微镜或流式细胞计数的观察下评估细胞的GFP表达。在图1所示的实验中，比较了这些方法：标准的Lipofectamine2000TM、标准FuGENETM方案和改变的FuGENETM方案，其中DNA/脂类混合物留在细胞中过夜。结果提示虽然LipofectamineTM一致的得到更高百分数的表达GFP的细胞，但是改变的FuGENETM方案得到具有更高平均荧光强度的表达GFP的细胞。
用腺病毒载体瞬时转染如下进行。载体Ad5CMV5-CFP(本文称为Ad5GFP)含有CMV启动子孔中下的绿色荧光蛋白编码区，购自Quantum Biotechnologies目录号ADV0030。转导72小时前，将hES细胞接种在如前所述用明胶和mEF饲养细胞层包裹的24孔板上。转导前，用0.05％胰蛋白酶/5mM EDTA(Sigma)溶液在37℃分离3个孔的hES细胞，重悬浮在500微升标准mEF生长培养基中，用血细胞计数器(75,000mEF饲养细胞从各孔中减去)计数，在转染前确定细胞数。在使用前立即在冰上融化腺病毒储液。
对于用Ad5GFP感染，从孔中吸去含有hES细胞的生长培养基，用1ml hES培养基加上9微升Ad5 GFP储液替换(MOI 40)。两小时后，各孔用1ml hES培养基替换含病毒培养基。重新用1毫升新鲜hES培养基每隔24小时重新喂养各转导的孔。用流式细胞计数评估GFP表达。典型实验的结果表明表达在转导24小时后最高，但持续8天低水平(在最后的时间点，由于hES细胞的过度生长发生广泛的分化)。
图8显示了铺在饲养细胞层上，用腺病毒载体Ad5GFP(MOI 30)或反转录病毒载体GRN354(MOI 40，实施例9)感染48小时后的hES细胞的FACS分析。分别在24小时或48小时后，收集细胞，用针对干细胞标记的SSEA-4的抗体，和用流式细胞计数评估GFP表达。上栏显示背景荧光和模拟感染的培养物中SSEA-4阳性染色。下栏显示GFP表达得到的绿色荧光水平。
实施例8：无限增殖化饲养细胞的制备
原代小鼠胚胎成纤维细胞(Robertson，见上)可以通过基因改造使其无限增殖化，表达人端粒酶反转录酶(hTERT)。用反转录病毒构建物pBABE puro hTERT(含有由MolV LTR驱动的hTERT编码序列和SV40早期启动子驱动的嘌呤霉素抗性)转染成纤维细胞(mEF)。在含有10％胎牛血清(HyClone)、2mM谷氨酰胺(Gibco/BRL)90％高葡萄糖DMEM(Gibco/BRL)的生长培养基中培养原代mEF的分离物。每隔3天以1∶2的比例分开mEF。
4次分开后，将5×105mEF铺在100mM培养皿上。翌日，用含有5毫升反转录病毒储液(1×106pfu/ml)和4微克/毫升聚凝胺的混合物替换生长培养基感染细胞，在37℃培养。8小时后，加入另外5毫升反转录病毒/聚凝胺混合物，37℃培养细胞。
翌日，除去反转录病毒/聚凝胺混合物，用新鲜生长培养基替换。4小时后，从平板用0.5％胰蛋白酶/500mM EDTA(Gibco/BRL)除去mEF，重新铺在2T150瓶中的25毫升生长培养基/瓶中。翌日，用补充了0.5微克/毫升嘌呤霉素的生长培养基替换培养基。
每周以1∶4分开细胞8周，维持在含嘌呤霉素的培养基中，8周后，胰蛋白酶消化细胞，重新以2,000细胞/150mm平板铺板。用克隆量筒在26天后分离各集落，扩增并筛选端粒酶活性。
小鼠饲养细胞系NH190
建立了适于调理用于原代多能干细胞(pPS)培养的培养基的永久小鼠细胞系。NHG190品系是小鼠胚胎成纤维细胞系，有三重药物抗性的端粒酶无限增殖化，并表达绿色荧光蛋白(GFP)。
从Jackson laboratory(Bar Harbor，Maine)获得两个小鼠品系，具有对抗生素新霉素或潮霉素的抗性。杂交来自Jackson Labs的C57BL/6JTgN(pPGKneobpA)3Ems小鼠和C57BL/6J-TgN(pPWL512hyg)1Ems小鼠。根据标准方案，在怀孕后第13.5天分离同时具有新霉素和潮霉素抗性的胚胎，制备小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)作为饲养细胞层(E.J.Robertson，pp.71-112，于畸胎癌和胚胎干细胞系，E.J.Robertson编，Oxford：IRL Press，1987)。冷冻储藏衍生的mEF细胞。
在含有20％胎牛血清(HyClone)、2mM L-谷氨酰胺、80％DMEM(Gibco/BRL)的生长培养基融化mEF。用1∶2的分离比扩增细胞4代。用新鲜培养基喂养两个达到约75％汇合的培养瓶4小时，然后电穿孔。用0.5％胰蛋白酶/500mM EDTA(Gibco/BRL)从瓶中取出细胞，室温400xg5分钟沉淀，以4×106细胞/毫升重悬浮在生长培养基中。
细胞悬液分成两个500微升等份，转移到两个0.4cm间隙的电穿孔样品池(BioRad)中。一个样品池接受5微克对照质粒(pBS212；SV40早期增强子/启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因)；另一个接受5微克pGRN190，含有MPSV启动子驱动的小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)编码区+SV40早增强子/启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因。手工混合细胞和DNA，用装有BioRad电容放大器的BioRad基因脉冲仪在设定的300V，960μF电穿孔。
将各等份的细胞转移到含有25毫升生长培养基的150mm平板上。翌日交换平板上的培养基，在后一天用加有0.5微克/毫升的嘌呤霉素的生长培养基替换生长培养基。用含嘌呤霉素的新鲜培养基每48小时更换平板上的培养基，直到电穿孔后29天。在此时，嘌呤霉素抗性细胞的各大集落在pBS212和pGRN190电穿孔平板中是明显的。用克隆量筒分离10个对照平板的集落和12个pGRN190电穿孔平板的集落，将各集落转移到48孔平板的1个孔中(1孔/集落)。
一周后，将所有在48孔板中长到汇合的所有存活集落(三个对照集落，1个pGRN-电穿孔的集落)转移到24孔板的各孔中。6天后，从pGRN190电穿孔的平板衍生出继续膨胀的唯一一个集落，随后命名为NH190。细胞维持在加有0.5微克/毫升嘌呤霉素的生长培养基中。用TRAP试验分析端粒酶活性(Kim等，NucleicAcids Res.25：2595，1997)证明NH190细胞功能性表达端粒酶活性。
为了便于检测细胞在混合培养物群和体内的监测，还用赋予绿色荧光蛋白(GFP)表达的反转录病毒构建物感染NH190细胞。来自质粒pEGP-1的增强的GFP序列是Living ColorsTM荧光蛋白载体之一，购自ClonTech。它含有增强的GFP编码区，具有改变限制性酶切位点的变化，并且使得编码蛋白的刺激和发射波长发生漂移。EGFP-1序列克隆入载体pMSCV.neo，ClonTech目录号K1062-1。用工程改造的载体转导NH190细胞，用FACS分拣分离GFP阳性细胞。GFP表达的细胞系称为NHG190。培养物携带这些细胞3个月。
实施例9：维持在药物抗性NHG190饲养细胞系上的hES细胞的基因改变
在DMEM(Gibco)+20％胎牛血清(HyClone)和5mM谷氨酰胺中培养实施例8所述的NHG190细胞。细胞每隔3天一分为十。用胰蛋白酶分离亚汇合的培养物，悬浮在10ml培养物中，用Torrex 150D X-光发生器以3500rads的累积剂量辐射。辐射的细胞以400xg沉淀5分钟，重新悬浮在1.25×105细胞/ml的NHG190培养基或标准hES培养基中。
重新在用Matrigel
Figure G2009101296702D00591
和NHG190饲养细胞预先包裹的6孔板铺板，转染hES细胞。接种后48小时，用10微克DNA/孔用FuGENETM6(roche)根据厂商说明书在OptiMEMTM无血清培养基中转染hES细胞。DNA是含有PGK启动子驱动的neor的质粒。4小时后，在各转染孔中加入3毫升NHG190-调理的培养基。用3毫升条件培养基每日重新喂养细胞。转染48小时后将细胞与含有200微克/毫升加入的遗传霉素(Sigma)的NHG190条件培养基一起铺板，此后每天重复。筛选3天后，加入额外的辐射过的NHG190饲养细胞(1.25×105细胞/孔的hES培养基)。24小时后，再次用含有200微克/毫升遗传霉素的NHG190条件培养基替换培养基，每天重复。
通过另一轮筛选分离和扩增各集落。5天后，用显微镜鉴定各集落，并在皿外侧标记。除去培养基，用胶原酶(约200U/ml)替换。用p20滴管尖挑出各集落，转移到含有2ml NHG190(不含遗传霉素)的条件培养基的各试管中。悬液研磨5次，分离集落，将各试管的内容物转移到用明胶和辐射的NHG190细胞(1.875×105细胞/孔)包裹的12孔板的各孔中。24小时后用2毫升新鲜的条件培养基喂养细胞。接种后2天，将细胞与含有200微克/毫升遗传霉素的条件培养基一起铺板，此后每天重复5天。当各孔达到50-75％汇合时，用胶原酶分离细胞，转移到6毫升条件培养基中，并研磨10-12次。在包裹了明胶和辐射的NHG190细胞(3.75×105细胞/孔)的6孔板的2个孔中各加入3毫升细胞悬液；重新用3毫升条件培养基喂养细胞24小时。然后用含有遗传霉素的3毫升条件培养基筛选细胞5天，如前一分为六。
用反转录病毒如下进行稳定转导。Geron Corp.用购自ClonTech(目录号K1062-1)的PMSCVneo载体构建了命名为GRN354的反转录病毒载体。在MSCV LTR下游插入eGFP编码区。LTR驱动GFP表达，载体还含有小鼠PGK启动子驱动的neor基因。用0.5％明胶和NHG190饲养细胞(7.5×104在1毫升NHG190培养基中，24孔板；3.75×105在3毫升培养基中，6孔板)包裹平板。将hES品系H7接种在24孔制备好的平板上的hES培养基中(1ml/孔)。48小时后，在37℃用0.05％胰蛋白酶/5mM EDTA(Sigma)分离3个孔的hES细胞，重悬浮在500微升NHG190培养基中，并计数。反转录病毒构建物pGRN354的储液在使用前在冰上立即融化。从孔中吸出生长培养基，用400微升hES培养基+8微升反转录病毒(MOI 10)和4微升8mg/ml的聚凝胺溶液(Sigma)替换。2小时后，每孔加入800微升hES培养基。重新用1ml新鲜hES培养基每24小时喂养各转导孔。
转导4天后，用含有200微克/毫升遗传霉素的1毫升hES培养基替换培养基。遗传霉素筛选3天后，用胶原酶分离细胞，研磨，重新悬浮在3ml hES培养基中，重新接种在用明胶和NHG190饲养细胞包裹的6孔板的1个孔中，用hES培养基重新喂养24小时。然后再次用含遗传霉素的hES培养基替换培养基，每24个小时重新喂养。未分化的集落在筛选中存活，并维持了超过3个月。FACS分析显示50-60％所选的细胞表达GFP，虽然是以低水平。细胞核型是正常的。
然后将细胞转移到悬浮培养中形成胚状体，使其分化4天，然后在20％FBS培养液中铺板1周。发生广泛分化后，用4％聚甲醛固定培养物，并制备用于荧光显微镜镜检。许多分化的细胞表达的GFP水平比未分化转染的hES细胞系更高，与不同细胞类型中MESV-LTR的分化活化一致。
实施例10：无细胞培养物中hES细胞的转染
通过用携带由CMV启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)的质粒，将在条件培养基中的层粘连蛋白上无细胞培养物中维持的hES细胞进行基因改变。
如上所述制备mEF条件培养基。辐射mEF并以约5.7×104细胞cm-2接种。至少16小时后，用含有4ng/mlhbFGF的hES培养基替换培养基。每天收集条件培养基用于喂养hES培养物。在加到hES培养物之前，在培养基中补充另4ng/ml hbFGF。当需要选择稳定的转染子时，在mEF条件培养基中补充200微克/ml遗传霉素(Sigma目录号G5013)。
通过与约200U/ml胶原酶IV在37℃保温10分钟，从培养物收集维持在mEF饲养细胞层上的H9 hES细胞。分离细胞并将其重新悬浮在常规hES培养基或mEF条件培养基中。然后将常规培养基中的细胞重新接种到mEF饲养细胞层上，将mEF条件培养基中的细胞铺到Matrigel或层粘连蛋白上。所有培养物中的接种密度是约4×104细胞/cm2。细胞或饲养细胞层维持在常规培养基中，而基质上的细胞维持在mEF条件培养基中1或2天，然后转染。每24小时更换条件培养基。
用Lipofectamine 2000TM如上所述转染hES细胞培养物。如下进行GFP表达的FACS分析。用0.5mM EDTA的PBS收集hES细胞，并以约1×106细胞/测试重新悬浮。在含有PBS+2％FBS、0.1％叠氮化钠和2mM EDTA的溶液中洗涤细胞。在相同的缓冲液中用从Development Studies Hybridoma Bank(University of Iowa，IowaCity)以1∶15的稀释度进行SSEA-4染色。从Sigma(St.Louis，MO，USA)获得同工型匹配的对照。细胞与抗体一起以100微升的最终体积4℃保温30分钟，洗涤并与PE偶联的大鼠抗小鼠κ链抗体(Becton Dickinson，San Jose，CA)4℃保温30分钟。如前洗涤样品，在在FACSCaliburTM流式细胞计数仪(Becton Dickinson，SanJose，CA)上用CellQuestTM软件分析GFP和SSEA-4表达。
在铺板后24或48小时，用携带由CMV启动子驱动的GFP质粒转染维持在mEF条件培养基中的层粘连蛋白上的H9品系的hES细胞。原始实验使用5微克质粒和12微升Lipofectamine 2000TM的混合物。细胞接受1毫升DNA/脂类复合物，37℃孵育4小时，然后加入3毫升mEF条件培养基，然后监测转染后24小时的GFP表达。
图9显示了该实验的结果。A栏：维持在层粘连蛋白上的H9细胞的形态。B栏：在A所示的相同集落中观察到的GFP阳性细胞。C栏：高SSEA-4群(未分化细胞)中％GFP阳性细胞的FACS分析。在接种后24小时(条1和2)或48小时(条3和4)转染细胞，并在转染后24小时(条1和2)或48小时(条3和4)分析。转染后24小时(栏A和B)在层粘连蛋白上的未分化ES集落的致密区观察到明亮的绿色细胞。最初接种后48小时的转染提供了最高效率：38％的细胞用FACS分析在转染后24小时测定是GFP阳性(C栏)。
下一个实验比较了mEF条件培养基中维持在Matrigel
Figure G2009101296702D00621
或层粘连蛋白包被偶氮平板上的与维持在mEF饲养细胞上的H9细胞的转染效率。维持在常规培养基中的饲养细胞层上的细胞被用作对照。在接种后1或2天观察到饲养细胞层上的细胞和不在饲养细胞层上的细胞之间的形态差异。饲养细胞上的集落比不在饲养细胞层上的细胞更紧密。在层粘连蛋白上的细胞和Matrigel上的细胞之间细胞或集落形态没有明显的差异。转染后24小时，在荧光显微镜下检测细胞的GFP表达。
细胞维持在常规培养基中的mEF饲养细胞(mEF/RM)上，在mEF调理的培养基中的层粘连蛋白上(层粘连蛋白/CM)或在条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00622
上(Matrigel/CM)。如图10(A)所示，在无饲养细胞培养物的未分化hES集落中观察到亮绿色细胞。相反，在饲养细胞的集落中发现了非常少的绿色细胞。FACS分析显示，Matrigel
Figure G2009101296702D00623
上16％的细胞和层粘连蛋白上14％的细胞是高SSEA-4群中的GFP阳性，而在饲养细胞中仅5％细胞是阳性。这些结果表明用无饲养细胞条件显著提高了转染效率。
接下来的实验评估了以下作用：1)DNA：脂类的比例；2)在加入mEF条件培养基4小时前在细胞中加入DNA/脂类复合物对在mEF条件培养基存在下加入复合物；和3)使用Lipofectamine 2000TM对FuGENETM。
如上所述用Lipofectamine 2000TM转染。用FuGENETM如下转染。将质粒DNA(5-10微克pEGFP-C1，ClonTech目录号6084-1)稀释在水中，达到最终体积为100微升。然后将DNA溶液缓慢加到FuGENETM溶液中，温和混合。在用800微升OptiMEMTM补充前在室温下保温混合物30分钟。细胞用3毫升预温的OptiMEMTM洗涤，并在1毫升DNA/脂类混合物溶液中37℃保温4小时。在一些实验中，在4小时时孔接受另2毫升mEF条件培养基；在其它中DNA/脂类混合物加到含有2毫升mEF条件培养基的孔中，然后细胞在该混合物中孵育过夜。
结果如图10(B)所示。在下列条件下获得最高效率。条1＝5微克质粒+12微升Lipofectamine 2000TM的混合物，在含有2.5ml mEF条件培养基的孔中加上1毫升DNA/脂类混合物，将细胞在该混合物中孵育过夜。条2&3＝10微克质粒+15微升FuGENETM的混合物，将细胞在1毫升DNA/脂类混合物中孵育4小时，然后加入2.5毫升mEF条件培养基。L＝Lipofectamine 2000TM，F＝FuGENETM。
在另一系列实验中，用0.5mM EDTA的系列稀释的PBS溶液(代替胶原酶)从无饲养细胞培养物的基质中分离后，转染hES细胞。细胞37℃孵育5分钟，直到各细胞变成圆形。然后除去EDTA溶液，将约1毫升条件培养基用滴管滴到孔中，分离细胞。将得到的簇一分为3或一分为六重新铺在新的无饲养细胞培养物中。在这些条件下，当细胞在接种后脂转染24小时后实现最高瞬时转染效率。
为了调查是否无饲养细胞hES细胞经历了稳定的基因修饰，用7.5微克携带EF1α启动子驱动的β-半乳糖苷酶的质粒和2.5微克携带PGK启动子驱动的新磷酸转移酶基因的质粒的混合物，共转染维持在Matrigel
Figure G2009101296702D00631
上的H1 hES细胞。将其铺在mEF条件培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00632
上后转染细胞48小时。将10微克质粒+15微升FuGENETM与1毫升细胞孵育4小时，然后加入2.5ml mEF条件培养基。48小时后，用补充有200微克/ml遗传霉素的mEF条件培养基替换培养基。所有模拟转染的培养物(即那些接受FuGENETM与水而不是质粒混合的培养物)在48-72小时内死亡。孔中产生的药物抗性集落用FuGENETM和质粒以约105的原始转染细胞中1个的频率转染。集落维持在含遗传霉素的mEF条件培养基中，并扩大。
实施例11：无饲养细胞培养物中条件培养基的其它来源
测试了几种细胞系的条件培养基支持hES细胞在无饲养细胞培养物中生长的能力。已描述了原代小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)和NHG190端粒化mEF品系的分离。STO是一种购自ATCC的转化的小鼠成纤维细胞。BJ 5ta是一种端粒化的人包皮成纤维细胞细胞系。hTERT-RPE是端粒化的人视网膜表皮细胞系。
用于培养细胞的培养基如下。1.mEF培养基：90％DMEM(Gibco BRL，Rockville，MD)、10％胎牛血清(FBS)(热灭活)(Hyclone)、和2mM L-谷氨酰胺。2.STO培养基：用0.1mM非必需氨基酸补充的mEF培养基。3.BJ 5ta培养基：90％DMEM和10％Cosmic胎牛血清(未热灭活)。4.NHG190培养基：用另外10％FBS补充的mEF培养基。5.RPE培养基：90％DMEM/F12，10％FBS(未热灭活)、10ml L-谷氨酰胺和3.48g/l碳酸氢钠。6.分化的培养基：80％敲除Dulbecco的改良Eagles培养基(KO DMEM)、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇和1％非必需氨基酸，补充有20％FBS。
为了制备条件培养基，用无Ca++/Mg++PBS洗涤一次，在胰蛋白酶/EDTA(Gibco)中孵育约5分钟，并悬浮于mEF培养基中，收集各细胞系。用约4000rad(约508秒，140kV：在Torrex发生器，EG&G Astrophysics Reseach Corp.，Long Beach CA中搁板设定6)辐射细胞。然后对其进行计数，以约55,000细胞/cm2的mEF、约38,000细胞/cm2的NHG190细胞、约95,000细胞/cm2的STO细胞、约80,000细胞/cm2的BJ 5ta细胞、约90,000细胞/cm2的RPE细胞接种。在至少4小时后，用含有4ng/ml的bFGF的ES培养基替换培养基。此后每天收集条件培养基，用于喂养hES培养物。在加到hES培养物前，各条件培养基补充4ng/ml的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF，Gibco)。
图1，栏B(右侧)显示维持在用mEF、NHG190、STO和BJ 5ta细胞调理的培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00641
上，与未调理的常规培养基(RM)比较的H9品系的hES细胞的形态。RPE条件培养基中的细胞在培养第一周内分化。其它条件培养基中的细胞都具有合适的ES形态的hES集落。基于形态、培养物的汇合，和分化对未分化细胞的比例，条件培养基可按降序如下评级：原代mEF、NHG190、STO和BJ 5ta。
与维持在来自原代mEF的条件培养基中的细胞类似，由其它细胞系(包括NHG190、STO和BJ 5ta)调理的培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00642
或层粘连蛋白上的细胞表达高水平的SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81，但表达低水平的SSEA-1，如FACS分析的结果(图2C)。在mEF条件培养基或NHG190条件培养基中的Matrigel或层粘连蛋白上的细胞能分化成三个胚层的细胞类型。分化培养物中的免疫细胞化学分析显示β-微管蛋白III的阳性染色与神经元(外胚层品系)一致，心脏肌钙蛋白I与心肌细胞(中胚层品系)一致，α-胎儿球蛋白与内胚层品系的细胞一致。
在实施例1-3中，在培养基中加入4ng/ml hbFGF，然后用mEF调理，然后当收集条件培养基并用于喂养hES细胞时再加入，制备培养基。为了确定hbFGF在培养基中的两次加入都是维持ES细胞的未分化状态必需的，进行了实验，其中消除了一次或两次hbFGF加入。
维持在条件培养基中，而第二次不加入hbFGF的培养物在早期传代看来不健康，并在培养物中29天后出现分化。维持在没有第一次加入hbFGF的条件培养基中的细胞显示最分化的形态，但仍然在培养物中27天后出现更小的未分化集落。维持在两次都未加入hbFGF的条件培养基中的细胞在18天后出现分化。相反，在两次都加入bFGF的条件培养基中培养的细胞看来是健康的，并且在长期培养中不分化。因此，通过在用饲养细胞培养前后加入bFGF制备条件培养基帮助防止hES细胞在随后的无饲养细胞培养中分化。
如下测试了条件培养基的储藏：通过在如所述的mEF细胞培养物中调理1-2天，制备批量培养基，4℃储藏在密封培养瓶中。每天更换储藏的培养基维持无饲养细胞hES细胞培养。未分化的干细胞的特征性形态特征在至少7天后仍然存在，与维持在新鲜调理的培养基中的hES细胞比较。
为了确定是否白血病抑制因子(LIF)能取代条件培养基不用饲养细胞维持hES细胞，将H1和H9品系的细胞在含有最终浓度为1500、1,000或500U/ml的LIF(重组LIF来自R&D；目录号250-L)的ES培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00651
上培养。细胞同时作为阳性对照在mEF条件培养基中培养，将未调理的ES培养基作为阴性对照。1周后，含或不含LIF的培养基中的培养物显示很大程度的分化，而维持在mEF条件培养基中的培养物含占优势的未分化集落。这些数据表明LIF不能在不存在饲养细胞的条件下将hES细胞维持在未分化状态。
实施例12：来自H9干细胞系的人胚胎成纤维细胞样细胞调理的培养基
细胞衍生自具有成纤维细胞和间充质细胞的形态特征的hES细胞。它们能支持无饲养细胞培养物中的hES细胞。
如本公开所述获得H9hES细胞系。为了形成胚状体，在与约200U/ml胶原酶IV一起37℃保温10分钟后收集hES细胞，并在分化培养基中分离成小簇，并在非粘附细胞培养平板(Costar)中培养，形成悬浮的聚集物。将约2×106个细胞接种到各孔中(9.6cm2)。悬浮2天后，将聚集物转移到明胶包裹的平板中。它们粘附在平板上，并继续分化成不同形态的细胞。在另外11天后的分化细胞的混合群中，观察到以100-1000个细胞的簇存在的成纤维细胞样细胞。
为了分离成纤维细胞样细胞，培养物在37℃在约200U/ml胶原酶IV中孵育3分钟。用PipetmanTM在显微镜后取出成纤维细胞样细胞的簇，并直接转移到含有分化培养基的试管或释放到胶原酶溶液中，随后收集。旋转细胞，重新悬浮在分化培养基中，并铺在6孔板中的1个孔中。增殖细胞，并系列传代。将第三次传代的细胞转移到mEF培养基中。在全部过程中，每隔2-3天喂养细胞。
为了将端粒酶引入成纤维细胞样细胞，用表达hTERT的反转录病毒如下感染。将细胞以8.6×104细胞/孔(9.6cm2)在感染前一天接种到6孔板中，用补充了4微克/ml的聚凝胺的含病毒培养基孵育8小时，然后转移到mEF培养基中。用pBABE-hTERT或pBABE载体对照感染不同孔。将hTERT编码的序列(除去5’UTR和3’UTR和从ATG起始密码子-1到-5的Kozak共有翻译起始位点)克隆入市售pBABE.puro的EcoRI位点，将hTERT编码区置于与5；UTR相同方向，构建pBABE-hTERT(Ouellette等，Hu.Mol.Gen.9：403，2000)。培养细胞另6天，并在嘌呤霉素中以最终1.6微克/毫升的浓度筛选8天。然后收集细胞并重新接种在mEF培养基中。
细胞增殖并继续显示成纤维细胞样形态50天。感染后20天，用TRAP试验收集细胞。从0-27天将细胞维持在mEF培养基中，并从第28天到43天更换到分化培养基中。在选择后的每次传代计数细胞，计算群倍增。
端粒化和对照细胞系(未转导或用对照反转录病毒转导)在50天的培养中在培养物中增殖，约倍增7-8次。用hTERT表达盒转导的细胞在TRAP试验中显示阳性端粒酶活性，而对照细胞不显示任何活性。hTERT-hEF细胞以对照细胞类似的增殖速率系列传代。
为了制备条件培养基，用无Ca++/Mg++PBS洗涤一次，在胰蛋白酶/EDTA(Gibco)中孵育约2分钟收集转染的hTERT细胞。细胞从板分离后，将其收集在mEF培养基中。用4000rad辐射细胞，计数，以约3.7-5×105细胞/孔接种。至少16小时后，用含有4ng/ml的bFGF的hES培养基(如上所述的血清替代品培养基，含有4ng/ml的外源加入的人碱性成纤维细胞生长因子)替换培养基。在6孔板中每孔用3-4ml。
每天收集条件培养基用于喂养hES培养物。在加到hES培养物之间，用4ng/mlhbFGF(Gibco)补充条件培养基。在该系统中用hTERT-hEF培养物1-2周。
在H1 hES细胞系上测试培养基支持hES细胞生长的能力。hES细胞的培养物重新铺在hEF条件培养基支持的Matrigel
Figure G2009101296702D00671
上的无细胞培养物中(C&F栏)，形成的集落具有未分化hES细胞的形态特征。培养物不能与直接在原代mEF饲养细胞层上，或在原代mEF调理的培养基中的Matrigel
Figure G2009101296702D00672
上生长的hES细胞分辨开来。hES细胞的健康集落大小增加，并具有未分化的胚胎干细胞的特征。几个集落显示一定程度的分化，但分化程度在各培养条件下是相似的。
接种后7天，培养物变得几乎汇合，以1∶3或1∶4的比例分裂，约130,000-170,000个细胞/平方厘米。细胞在该条件下维持超过30天，同时显示hES细胞的形态特征。
实施例13：用hEF从H1品系调理的培养基
从不同的hES细胞系，称为H1，产生了第二种人胚胎成纤维细胞(hEF)样细胞系。如前形成胚状体，在悬浮培养物中培养4天后，另外铺在明胶包裹的平板上9天。
在该例子中，从大量培养而不是用滴管筛选产生成纤维细胞。培养物在37℃在2mg/ml II型胶原酶的PBS溶液中孵育30分钟。收集细胞，分散，离心，重悬浮在分化培养基中，铺在6孔板中。增殖的细胞在hEF培养基(90％DMEM、10％热灭活的FBS、0.1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺)中传代，每隔2-3天喂养。2次传代后，细胞群变得均一的具有成纤维细胞的形态特征。该hEF细胞系称为HEF1。
用反转录病毒端粒酶表达载体(pBABE-hTERT)或对照载体如实施例12中转导亚群。
图11(栏A)显示HEF1细胞系的形态。B栏(下文)显示端粒酶活性，如TRAP试验中测得的。用hTERT表达盒转导的细胞显示在转导后20或65天阳性的端粒酶活性。未转导的细胞系或用对照载体转导的细胞显示无端粒酶活性。
图12显示hTERT-转导的HEF1细胞、用载体对照转导的细胞的生长曲线。两种品系都每隔2天倍增，直到38天时对照细胞停止分裂(可能是由于它们达到了Hayflick极限)。hTERT转染的细胞继续以恒定的生长速率增殖超过60天(倍增30次)。
图13是hTERT诱导的细胞和对照细胞在用衰老相关β-半乳糖苷酶，一种细胞老化的已知生物标记(Dimitri等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：9363，65)的显微照片。在槽切片上生长的细胞用0.2％戊二醛的PBS溶液固定2分钟，用PBS洗涤，并在1mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-半乳糖苷酶(X-gal)、5mM K4Fe(CN)6、150mM NaCl、2mL MgCl2的40mM柠檬酸磷酸缓冲液pH6.0中过夜孵育。HEF1对照细胞的β-半乳糖苷酶染色明显，而hTERT转导的细胞不是。综合结果表明hTERT的表达延长了HEF1细胞的生命周期。
如实施例12中用在6000rad辐射过的HEF1细胞调理培养基，并以约4.1-5.5×104细胞/平方厘米接种。测试培养基支持H9 hES细胞系在Matrigel
Figure G2009101296702D00681
底物上生长的能力。
图14显示传代到用小鼠胚胎成纤维细胞或HEF1细胞系调理的培养基中后的hES细胞的集落。用HEF1调理培养基维持hES细胞4代，继续显示未分化ES细胞的形态。发现hES细胞维持hTERT和OCT-4的表达。如B栏所示，它们还能继续显示端粒酶活性，如TRAP试验所测量的，它是未分化hES细胞的特征。
实施例14：cDNA文库
从未分化和分化的pPS细胞如下分离polyA+mRNA。
从在饲养细胞上，或在无饲养细胞环境中如本公开所述的生长的培养物获得人胚胎干细胞。从两者获得cDNA文库，用无饲养细胞培养物的优点是产生的文库没有污染的小鼠RNA，可以更容易的批量产生大量细胞，用于mRNA分离。
从hES细胞用RNeasyTM方案和试剂(Qiagen，Germany)根据厂商说明书分离总RNA。简单说，直接在培养皿中用异硫氰酸胍(GITC)裂解细胞，并在RNA结合条件下使得到的提取物与RNeasyTM基质结合，但污染物和基因组DNA不结合。在用厂商提供的所述缓冲液洗涤基质后，用水洗脱总RNA并用260nm的吸光度定量。
然后用OligotexTM方案和试剂(Qiagen，Germany)从总RNA制备物纯化polyA+mRNA。简单说，将含有共价结合的dC10T30寡核苷酸的珠基质与总RNA混合，使得mRNA的polyA+尾与dC10T30结合的珠相互作用。在用特定的洗液洗涤后，结合的mRNA释放到低盐缓冲液中，用260nm的吸光度定量产率。凝胶电泳确定了polyA+mRNA的总纯度。
用标准方案(SuperScriptTMλ系统，Life Technologies，Rockville，MD)实现cDNA合成。将1微克polyA+mRNA用oligo dT-NotI引物/衔接头和SuperScriptTM II反转录酶转化成单链cDNA。[32P]dCTP包含在反应物中，实现对第一链转化效率的计算。然后用DNA聚合酶在DNA连接酶和RNaseH(所有酶来自大肠杆菌)的存在下将单链cDNA转化成双链cDNA。将双链cDNA与SalI衔接头连接，然后用凝胶排阻层析分辨。用凝胶电泳分析每个柱组分的一部分，合并含有具有预测的2kbp或以上的平均大小的cDNA的组分。然后用NotI内切核酸酶限制性消化大小确定的cDNA的合并物，与NotI-SalI限制消化的pSport1质粒(LifeTechnologies)连接。用连接产物转化UltraMaxTM感受态大肠杆菌(LifeTechnologies)，随后铺在含有青霉素的培养基平板上。用这些方法产生的文库通常含有5×106或以上的单独克隆，具有约1.2kbp的平均cDNA插入大小，如用各集落的质粒制备物的PCR判断的。
还从胚状体细胞(EB)制备cDNA文库，它含有分化自hES细胞的混合细胞群。为了制备EB，通过与约200U/ml胶原酶IV一起37℃保温5-20分钟，收集hES细胞的单层培养物。将hES细胞分解成小簇，并置于含有80％KO DMEM、20％非热灭活的FBS(Hyclone)、0.1mM非必需氨基酸、1mM谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇的分化培养基中的非粘附的细胞培养物平板(costar)中。
然后以1∶2的比例将EB接种在每个9.6cm2孔的2毫升培养基中。每隔一天通过在每孔中加入2ml培养基达到4ml/孔喂养EB，然后收集并重悬浮在2ml新鲜培养基中。在悬浮培养约2-8天后制备总RNA。另外，EB维持在悬浮培养中约4天，然后铺到明胶包裹的平板上，再培养7天。这导致形成多样的细胞群，并促进RNA的产率，可能是由于更高的细胞密度。约20-500×106个细胞的总RNA的产率是约25-2500微克。
hES细胞表达的启动子选择
测试了各种启动子驱动未分化hES细胞中稳定长期基因表达的能力。通过反转录病毒转导或通过FuGENETM介导的脂转染引入构建物。
从饲养细胞层中用胶原酶(约200U/ml)37℃7-10分钟，取出6孔板中铺板的hES细胞。当集落开始分离时，吸出各孔中的胶原酶，并用2毫升标准hES培养基/孔替换。通过用5毫升滴管刮各孔表面除下hES细胞，将其转移到50毫升锥形瓶中。另外加入ES培养基达到最终体积10毫升。用10毫升吸量管捣碎细胞悬液10-12次，加入另外8毫升标准hES培养基。在6孔板的如上所述预包裹明胶和mEF饲养细胞层的各孔中加入3毫升细胞悬液(即6孔板的1个孔足够接种新平板的6个孔)。
如下用反转录病毒进行转导。Geron Corp.用购自ClonTech(目录号K1062-1)的PMSCVneo载体构建了命名为GRN354的反转录病毒载体。在MSCV LTR下游插入eGFP编码区。LTR驱动GFP表达，载体还含有小鼠PGK启动子驱动的neor基因。
用0.5％明胶和NHG190饲养细胞(7.5×104在1毫升NHG190培养基中，24孔板；3.75×105在3毫升培养基中，6孔板)包裹平板。将hES品系H7接种在24孔制备好的平板上的hES培养基中(1ml/孔)。48小时后，在37℃用0.05％胰蛋白酶/5mM EDTA(Sigma)分离3个孔的hES细胞，重悬浮在500微升NHG190培养基中，并计数。反转录病毒构建物pGRN354的储液在使用前在冰上立即融化。从孔中吸出生长培养基，用400微升hES培养基+8微升反转录病毒(MOI 10)和4微升8mg/ml的聚凝胺溶液(Sigma)替换。2小时后，每孔加入800微升hES培养基。重新用1ml新鲜hES培养基每24小时喂养各转导孔。
转导4天后，用含有200微克/毫升遗传霉素的1毫升hES培养基替换培养基。遗传霉素筛选3天后，用胶原酶分离细胞，研磨，重新悬浮在3ml hES培养基中，重新接种在用明胶和NHG190饲养细胞包裹的6孔板的1个孔中，用hES培养基重新喂养24小时。然后再次用含遗传霉素的hES培养基替换培养基，每24个小时重新喂养。
根据厂商说明书用FuGENETM 6(Roche)进行脂转染。将质粒DNA(5-10微克pEGFP-C1，ClonTech目录号6084-1)稀释在水中，达到最终体积为100微升。在引导实验中，在足量OptiMEMTM溶液(Gibco，目录号11-58-021)中加入5-30微升FuGENETM，达到最终体积为100微升。然后缓慢在FuGENETM溶液中缓慢加入DNA溶液，温和混合。在室温下孵育混合物30分钟，然后补充800微升OptiMEMTM。
转染前48小时，将hES细胞接种到用明胶和mEF饲养细胞层包裹的6孔板中。用3毫升预温的OptiMEMTM洗涤细胞，并在37℃的DNA/脂类混合物溶液中孵育4小时。在一些实验中，4小时后各孔接受另外2毫升mEF条件培养基；在其它中DNA/脂类混合物加到含有2毫升mEF条件培养基的孔中，在该混合物中孵育细胞过夜。
在随后的实验中，用FuGENETM转染hES细胞的无饲养细胞培养物。在这些实验中，将未分化的hES细胞接种到mEF条件培养基+另外4ng/ml的hbFGF的Matrigel包裹的6孔板上(以通常约1.5×104细胞/平方厘米的密度)。铺板48小时后，用FuGENETM如所述转染细胞。转染后48小时，用mEF条件培养液+4ng/mlhbFGF和200微克/ml遗传霉素重新喂养细胞。随后，用含有200微克/毫升的遗传霉素的培养基每天喂养细胞。
表2总结了代表性实验的结果。
表2：启动子对人胚胎干细胞表达的测试
  方法   构建物(启动子/ORF组合)   衍生的未分化品系数   结果
  反转录病毒转导   MSCV-LTR/GFP；PGK/neo(单个载体)   混合的培养物   100％G418抗性50-65％GFP阳性
  脂转染   CMV/β-半乳糖苷酶SV/neo(单个载体)   3   100％G418抗性β-半乳糖苷酶阴性
  脂转染   CMV/GFPPGK/neo(2个载体共转染)   5-6个合并的集落   100％G418抗性GFP阴性
  脂转染   UbiC*/β-半乳糖苷酶PGK/neo(2个载体共转染)   1   100％G418抗性β-半乳糖苷酶阴性
  脂转染   EF1α/β-半乳糖苷酶PGK/neo(2个载体共转染)   13个单独品系4-5个合并集落   100％G418抗性GFP阴性
  脂转染   MSCV LTR/neoPGK/hTERT(单个载体)   0   100％G418抗性仅分化的细胞
  脂转染   EF1α/neo   16   100％G418抗性
  脂转染   UbiC*/neo   3   100％G418抗性
通过这些条件，PGK、EF1α和UbiC启动子适合在未分化的hES细胞中稳定长期表达cDNA克隆。
应认识到本描述中提供的组合物和方法能被本领域熟练技术人员有效修改，而不违背本发明在权利要求中所表达的精神。
序列表
<110>杰龙公司(Geron Corporation)
<120>人多能干细胞生长和分化的技术
<130>024084F1
<150>US 60/175,581
<151>2000-01-11
<150>US 60/213,740
<151>2001-06-22
<150>US 60/213,739
<151>2001-06-22
<150>US 60/216,387
<151>2001-07-07
<150>US 60/220,064
<151>2001-07-21
<150>US 09/688,031
<151>2001-10-10
<160>6
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>1
aggtcgacga gagag                                                               15
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>2
ctctctcgtc gacct                                                               15
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>3
cttgctgcag aagtgggtgg aggaa                                                    25
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>4
ctgcagtgtg ggtttcgggc a                                                        21
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>5
cggaagagtg tctggagcaa                                                          20
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>6
ggatgaagcg gagtctgga                                                           19

Claims (8)

1.一种无饲养细胞的细胞培养物，其含有：
a)无饲养细胞的灵长类胚胎干细胞的建立的品系；
b)营养培养基；和
c)选自Engelbreth-Horm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂、层粘连蛋白、巢蛋白、硫酸肝素的胞外基质成分。
2.如权利要求1所述的细胞培养物，其特征在于，所述胞外基质成分是Engelbreth-Horm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂。
3.如权利要求1所述的细胞培养物，其特征在于，所述营养培养基是条件培养基。
4.如权利要求3所述的细胞培养物，其特征在于，调理所述条件培养基的细胞是成纤维细胞。
5.如权利要求3所述的细胞培养物，其特征在于，调理所述条件培养基的细胞是小鼠细胞品系。
6.如权利要求3所述的细胞培养物，其特征在于，调理所述条件培养基的细胞是表皮细胞。
7.如权利要求3所述的细胞培养物，其特征在于，调理所述条件培养基的细胞是用端粒酶基因转染的细胞。
8.如权利要求1所述的细胞培养物，其特征在于，灵长类胚胎干细胞的建立的品系的倍增速率是20-40小时。
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