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JP6756610B2 - 多分化能細胞および多能性細胞の分化を方向付けることによって発生させる皮質介在ニューロンおよびその他のニューロン細胞 - Google Patents

多分化能細胞および多能性細胞の分化を方向付けることによって発生させる皮質介在ニューロンおよびその他のニューロン細胞 Download PDF

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Description

政府の資金提供を受けた研究および開発
本開示に記載される研究は、一部において、アメリカ国立衛生研究所からの補助金交付番号２ＲＯ１ＭＨ０６６９１および１ＲＣ１ＭＨ０８９６９０によって資金提供を受けた。米国政府は、本開示について特定の権利を有する。
関連出願との相互参照
ＰＣＴ国際特許出願として２０１４年４月２８日に出願された本出願は、その全体が参考として援用される２０１３年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／８１６，６２４号に対する利益を主張する。
発明の背景
技術分野
本開示は一般に、幹細胞および神経前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化、障害および疾患を研究するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞ベースのモデル系の開発、ならびにニューロン細胞の方向付けられた分化を介してｉｎ ｖｉｔｒｏで発生させた細胞の投与による障害および疾患の処置に関する。より具体的に、本開示は、例えば、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロン、ならびにこれらの前駆体細胞を含む、ニューロン細胞およびニューロン細胞の前駆体細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法、およびこれらを含む組成物を提供する。このようなニューロン細胞は、ニューロン細胞を発生させるために幹細胞を含む多分化能、多能性、および／または全能性細胞を、ＳＭＡＤおよびＷｎｔシグナル伝達阻害剤および／またはアンタゴニストと接触させ、かつ、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達経路の活性化因子と、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および／または視索前野コリン作動性ニューロンのマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるのに要求される時点において、これに要求される持続期間にわたり接触させることにより発生させる。本明細書で開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法により発生させた、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロンは、神経変性障害および神経精神障害ならびに神経変性疾患および神経精神疾患を処置するのに治療的に使用することができ、このような神経変性障害および神経精神障害ならびに神経変性疾患および神経精神疾患を研究するためモデル系として使用することができ、かつ、このような障害および疾患を処置するための治療用候補化合物をスクリーニングおよび同定するために使用することができる。
関連技術の記載
神経学的障害の処置は従来、１つまたは複数の低分子のｉｎ ｖｉｖｏにおける投与を含んだ。これらの治療アプローチがｉｎ ｖｉｖｏにおいて神経学的障害に罹患した患者にもたらす有効性は、残念ながら、極めて微弱なものであった。
ニューロン組織、最も具体的には、脳内のニューロン組織は、シナプス可塑性およびリモデリング能を呈示する。しかし、これらの特性は、神経学的障害のための治療レジメンの開発のために満足に利用されていない。初代ヒトニューロンは、存命中のドナーから得るのが困難であり、成熟ニューロンは、有糸分裂後のものであるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて治療的利益を達成するために要求される細胞数をもたらすのに要求される時間枠で培養することができない。
幹細胞を含む、全能性、多能性、および多分化能細胞は、神経学的障害および疾患を含む、障害および疾患を研究し、障害および疾患の処置のための細胞ベースの療法を開発するための強力なツールである。胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む多能性細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞系統に分化させることができる。
したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、ＥＳＣおよび／またはｉＰＳＣから発生させたＣＮＳ細胞は、神経変性障害および神経精神障害ならびに神経変性疾患および神経精神疾患を含む障害および疾患の処置のための治療レジメンにおいて使用しうることが示唆されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるある特定の態様のニューロン特化を方向付けるためのプロトコールが記載されている。例えば、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）のニューロン変換は、接着性のｈＥＳＣを２つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤（ノギンおよびＳＢ４３１５４２（アクチビン／ノーダルシグナル伝達の阻害剤））と接触させることにより達成されている（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年））。
ｈＰＳＣを使用する初期研究は、パーキンソン病における中脳ドーパミンニューロン（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年）；Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１３６巻：９６４〜９７７頁（２００９年）；およびＳｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４６巻：３１８〜３３１頁（２０１１年））または筋萎縮性側索硬化症（Ｄｉｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１巻：１２１８〜１２２１頁（２００８年））および脊髄筋萎縮症（Ｅｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、４５７巻：２７７〜２８０頁（２００９年））における運動ニューロンなど、ニューロン細胞の特定のサブセットと関連する神経変性障害に焦点を当てていた。
統合失調症（Ｂｒｅｎｎａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４７３巻：２２１〜２２５頁（２０１１年））および多様な自閉症関連症候群（Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、Ｃｅｌｌ、１４３巻：５２７〜５３９頁（２０１０年）；およびＰａｓｃａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１７巻：１６５７〜１６６２頁（２０１１年））など、他の複合的な神経障害についても、同様のアプローチが示唆されている。パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、または脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）と異なり、統合失調症および自閉症関連症候群と関連するニューロンの特定のサブセットは、よく規定されていないままであり、これらの神経障害を処置するための治療レジメンおよびこれらの神経障害を研究するためのモデル系の開発を妨げている。
皮質介在ニューロンなどの抑制性ニューロンは、統合失調症および自閉症において、特に重要な役割を果たしうる（Ｉｎｓｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ、４６８巻：１８７〜１９３頁（２０１０年）；およびＬｅｗｉｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６巻：３１２〜３２４頁（２００５年））。ヒト皮質投射ニューロンをＥＳＣから産生するためのプロトコールは、最近記載されている（Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、７７巻：４４０〜４５６頁（２０１３年）；ならびにＳｈｉら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１５巻：４７７〜４８６頁およびＳ４７１頁（２０１２年））。
皮質介在ニューロンおよびそれらの前駆体細胞は、成体大脳皮質への移植後において、遊走し、成熟し、機能する驚嘆すべき能力を有する。これらの細胞は、皮質活性を正常に制御するので、病巣起源の慢性発作のための細胞ベースの療法においてそれらを使用することが提起されている。特に、難治性の発作障害の場合、細胞ベースの療法は、手術による介入に対する代替法として提起されている。このような細胞はまた、投薬で難治性の発作およびパーキンソン病などの前脳障害のための細胞ベースの療法においても使用され得ると予期されている。このような療法は、活性を抑制するこれらの細胞の本来的な能力を活用するように使用することもでき、治療剤（すなわち、ＧＡＢＡ、神経ペプチドＹ、アデノシンを含む発作を抑制する薬剤）を発現させる遺伝子操作後における薬物送達系として使用することもできるで。
皮質介在ニューロンならびに視床下部ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロンおよびこれらの前駆体細胞など前脳系統の他のニューロンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生するのが困難であるが、治療的にも、疾患モデルとしても大きな潜在的可能性を有する。視床下部ニューロンは、内分泌関連障害、睡眠障害（例えば、ナルコレプシー）、および摂食異常と関連する障害に主に関与する。視索前野コリン作動性ニューロンは、アルツハイマー病（ＡＤ）で失われる記憶機能を果たす。皮質介在ニューロン、ならびに視床下部ニューロンおよび視索前野コリン作動性ニューロンなど、前脳系統の他のニューロンの移植は、それぞれ、内分泌、睡眠、および摂食障害を処置するための、ならびにＡＤを処置するための著明な潜在的治療可能性を有する。
マウス皮質介在ニューロンは、Ｌｈｘ６：：ＧＦＰレポーターマウスＥＳＣ系を使用して導出されているが、皮質介在ニューロン発生の効率は低かった（Ｍａｒｏｏｆら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３０巻：４６６７〜４６７５頁（２０１０年））。ヒト皮質介在ニューロンの発生上の起源は、いまだ確立されておらず、介在ニューロン特化は、哺乳動物の種間で異なりうることが報告されている（Ｌｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年）；ならびにＹｕおよびＺｅｃｅｖｉｃ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：２４１３〜２４２０頁（２０１１年））。さらに、長期間を要するｉｎ ｖｉｖｏにおける皮質介在ニューロンの発生は、ヒト細胞による、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化の達成に対して、難題を提示してきた。したがって、Ｍａｒｏｏｆらにより記載された条件を、ヒトＥＳＣおよび／または他の多能性幹細胞からのヒト皮質介在ニューロンの発生に適用しうるのかどうかは、依然として不確定である。
Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年） Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年） Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４６巻：３１８〜３３１頁（２０１１年） Ｄｉｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１巻：１２１８〜１２２１頁（２００８年） Ｅｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、４５７巻：２７７〜２８０頁（２００９年） Ｂｒｅｎｎａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４７３巻：２２１〜２２５頁（２０１１年） Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、Ｃｅｌｌ、１４３巻：５２７〜５３９頁（２０１０年） Ｐａｓｃａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１７巻：１６５７〜１６６２頁（２０１１年） Ｉｎｓｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ、４６８巻：１８７〜１９３頁（２０１０年） Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６巻：３１２〜３２４頁（２００５年） Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、７７巻：４４０〜４５６頁（２０１３年） Ｓｈｉら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１５巻：４７７〜４８６頁およびＳ４７１頁（２０１２年） Ｍａｒｏｏｆら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３０巻：４６６７〜４６７５頁（２０１０年） Ｌｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年） ＹｕおよびＺｅｃｅｖｉｃ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：２４１３〜２４２０頁（２０１１年）
本開示は、前脳分化は、増強することができ、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロン、ならびにこれらの前駆体細胞を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）のある特定のニューロンは、ある特定の全能性、多能性、および／または多分化能細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および／またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ））を、１つまたは複数のＷｎｔアンタゴニストと組み合わせた、１つ、２つ、またはそれより多くのＳＭＡＤ転写因子阻害剤と、ニューロン前駆体細胞を発生させるのに適切な濃度で、これに適切な持続期間にわたり接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に誘導することができ、これらのニューロン前駆体細胞を、適切な濃度の１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と、幹細胞の分化および／またはニューロン細胞の発生の開始の後の適切な時点において、適切な持続期間にわたり接触させ、これにより、ニューロン細胞内で、皮質介在ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー１つもしくは複数、視床下部ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー１つもしくは複数、および／または視索前野コリン作動性ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー１つもしくは複数の産生を誘導しうるという発見に基づく。加えて、皮質投射ニューロンおよびその前駆体細胞は、ＳＨＨ活性化因子と接触させるステップを欠く同様の方法により発生させることができる。
本明細書で詳細に記載されるこれらの発見および他の発見に基づき、ある特定の実施形態では、本開示は、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および／または視索前野コリン作動性ニューロンのマーカー１つまたは複数を含むニューロン細胞を含むニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法を提供する。また、本明細書で開示される方法により発生させた、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および／または視索前野コリン作動性ニューロンのほか、皮質投射ニューロンを含むニューロン細胞、ならびに前出のうちのいずれかの前駆体細胞のほか、このようなニューロン細胞のうちの１つまたは複数を含む組成物も提供される。さらに、１つ、好ましくは２つまたはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤、および１つまたは複数のＷｎｔアンタゴニストを含む組成物、ならびに１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子を含む、薬学的に適切な組成物および処方物を含む、組成物および処方物のほか、１つ、２つ、またはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔアンタゴニスト、および１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と、任意選択で、前出の種類の１つもしくは複数のニューロンまたはこれらの前駆体細胞を調製するための使用のための指示書とを含むキットが提供される。
ある特定の実施形態では、本開示は、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を含むニューロンを含む、ニューロンを発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、（ａ）全能性細胞、多能性細胞、および／または多分化能細胞を、１つ、２つ、またはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、全能性、多能性、および／または多分化能細胞からのニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、（ｂ）ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、皮質介在ニューロンおよび／または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップとによる、全能性細胞、多能性細胞、または多分化能細胞の分化を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法を提供する。
これらの方法のある特定の態様では、皮質介在ニューロンおよび／または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン前駆体細胞を、ニューロン前駆体細胞の成熟に助力する条件に晒す。他の態様では、ニューロン前駆体細胞を、ニューロン前駆体細胞を発生させた後、ならびに／または全能性、多能性、および／もしくは多分化能細胞を、１つ、２つ、もしくはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤および／または１つもしくは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させた後における、所定の期間にわたる継代培養の後で、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させる。
これらの方法の関連する態様では、ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップを、全能性細胞、多能性細胞、および／または多分化能細胞を、１つ、２つ、またはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を作製するステップの、約４日後〜約２０日後、または約６日後〜約２０日後、または約８日後〜約２０日後、または約８日後〜約１８日後に開始する。
ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、約５日間〜約３０日間、または約８日間〜約１６日間の期間にわたりうる。ニューロン細胞をＳＨＨの活性化因子と接触させる時間は、１つまたは複数のＳＨＨ活性化因子と接触させるステップが実行される培養培地により決定することができる。培養培地は、例えば、上記で開示した通り、とりわけ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地およびＫＳＲベースの培地を含みうる。実際には、ＳＨＨ活性化因子は、除去する（例えば、培地の交換により）必要がなく、細胞は、培養物中で、数週間または数カ月間にわたり増殖させることができる。
特に、皮質介在ニューロンおよび／またはその前駆体細胞を、培養物中で、数週間〜数カ月間にわたり維持することができる。皮質介在ニューロンおよび／またはその前駆体細胞を、培養物中またはｉｎ ｖｉｖｏで、何カ月間にもわたり維持することができる。
これらの方法のさらなる態様では、皮質介在ニューロンおよび／または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の各々は、ＳＳＴ、ＰＶ、ＧＡＢＡ、カルビンディン、ＬＨＸ６、ＲＡＸ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＧ１、ＯＬＩＧ２、ＭＡＳＨ１、ＮＫＸ６．２、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１、ＤＬＸ２、ＡＳＣＬ１、およびＣｈＡＴ、ならびにこれらの組合せからなる群から選択することができる。
他の実施形態では、本開示は、視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ニューロン細胞を、全能性細胞、多能性細胞、および／または多分化能細胞の分化により発生させ、（ａ）１つもしくは複数の全能性細胞、１つもしくは複数の多能性細胞、および／または１つもしくは複数の多分化能細胞を、（ｉ）１つ、２つ、またはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤、および（ｉｉ）１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、（ｂ）ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップとを含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法を提供する。
これらの方法のある特定の態様では、視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン前駆体細胞を、ニューロン前駆体細胞の成熟に助力する条件に晒す。他の態様では、ニューロン前駆体細胞を、ニューロン前駆体細胞を発生させた後、ならびに／または全能性、多能性、および／もしくは多分化能細胞を、１つ、２つ、もしくはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤および／または１つもしくは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させた後における、所定の期間にわたる継代培養の後で、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させる。他の一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるニューロン細胞の成熟を加速するように胚性マウス皮質細胞を使用して、皮質フィーダー環境を創出した。
これらの方法の他の態様では、ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップを、全能性細胞、多能性細胞、および／または多分化能細胞を、１つ、２つ、またはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させるステップの、約１日後〜約４日後に開始して、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を産生する。ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、約５日間〜約３０日間、または約８日間〜約２０日間の期間にわたりうる。ＳＨＨ活性化因子との接触はより長期でも、有害ではない。
これらの方法のさらなる態様では、視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の各々は、ＮＧＦＩ−Ｂ、ｃ−ｆｏｓ、ＣＲＦ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＲＡＸ、ＰＯＭＣ、ヒポクレチン、バソプレッシン、オキシトシン、ｎＮＯＳ、およびＮＡＤＰＨ、ならびにこれらの組合せからなる群から選択することができる。
さらに他の実施形態では、本開示は、視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ニューロン細胞を、全能性細胞、多能性細胞、および／または多分化能細胞の分化により発生させ、（ａ）１つもしくは複数の全能性細胞、１つもしくは複数の多能性細胞、および／または１つもしくは複数の多分化能細胞を、（ｉ）１つ、２つ、またはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤、および（ｉｉ）１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、（ｂ）ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップとを含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法を提供する。
これらの方法のある特定の態様では、視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン前駆体細胞を、ニューロン前駆体細胞の成熟に助力する条件に晒す。他の態様では、ニューロン前駆体細胞を、ニューロン前駆体細胞を発生させた後、ならびに／または全能性、多能性、および／もしくは多分化能細胞を、１つ、２つ、もしくはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤および／または１つもしくは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させた後における、所定の期間にわたる継代培養の後で、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させる。
これらの方法の他の態様では、ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップを、全能性細胞、多能性細胞、および／または多分化能細胞を、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させるステップの、約４日後〜約８日後に開始して、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を産生する。ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、約５日間〜約３０日間、または約８日間〜約２４日間の期間にわたりうる。
これらの方法のさらなる態様では、視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の各々は、ＣｈＡＴ、ＮＧＦ、Ａｃｈ、ＶＡＣｈＴ、ＬＨＸ８、ＩＳＬ１、およびｐ７５、ならびにこれらの組合せからなる群から選択することができる。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法の他の態様では、１つまたは複数の全能性細胞、多能性細胞、および／または多分化能細胞は、ヒト細胞であるかまたはマウス細胞である。これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のさらに他の態様では、１つまたは複数の全能性細胞、多能性細胞、および／または多分化能細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、神経幹細胞、人工多能性細胞、操作多能性細胞、初代前駆細胞、誘導前駆細胞、および操作前駆細胞からなる群から選択することができる。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のさらなる態様では、ＳＭＡＤ阻害剤と接触させるステップおよび／またはＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させるステップは、同時に実行することもでき、逐次的に実行することもできる。接触させるステップは、約５日間〜約３０日間の持続期間にわたりうる。これらの方法の関連する態様では、１つまたは複数のＷｎｔアンタゴニストと接触させるステップを、全能性、多能性、および／または多分化能細胞を、１つ、２つ、またはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤および／またはＷｎｔシグナル伝達経路の１つもしくは複数のアンタゴニストと接触させるステップの、０日後〜約５日後または０日後〜約１日後に開始することができる。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のなおさらなる態様では、ＳＭＡＤ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ３６４９４７、Ａ７７−０１、Ａ−８３−０１、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＧＷ６６０４、ＳＢ−５０５１２４、レルデリムマブ、メテリムマブ、ＧＣ−Ｉ００８、ＡＰ−１２００９、ＡＰ−１１０Ｉ４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ−５０５１２４、Ｅ−６１６４５２（ＡＬＫ阻害剤であるＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ−２０８、ＳＭＩ６、ＮＰＣ−３０３４５、Ｋｉ２６８９４、ＳＢ−２０３５８０、ＳＤ−０９３、アクチビン−Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン二塩酸塩、ならびにこれらの誘導体および／または改変体であって、これらの各誘導体および／または改変体が、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害活性を保有する誘導体および／または改変体からなる群から選択することができる。例えば、２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤は、二重ＳＭＡＤ阻害剤であるＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ−１９３１８９、またはこれらの機能的な誘導体および／もしくは改変体を含みうる。ＳＢ４３１５４２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中で、約０．１μＭ〜約１ｍＭまたは約０．１μＭ〜約１００の最終濃度で、全能性、多能性、および／または多分化能細胞と接触させることができる。ＬＤＮ−１９３１８９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中で、約１ｎＭ〜約１０μＭまたは約１ｎＭ〜約１μＭの最終濃度で、全能性、多能性、および／または多分化能細胞と接触させることができる。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のまたさらなる態様では、Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストは、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ＳＦＲＰ−１、ＳＦＲＰ−２、ＳＦＲＰ−５、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４、ＷＩＦ−１、Ｓｏｇｇｙ、ＩＷＰ−２、ＩＷＲ１、ＩＣＧ−００１、ＫＹ０２１１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＬＧＫ９７４、ＩＷＰ−Ｌ６、ならびにこれらの誘導体および／または改変体であって、これらの各誘導体および／または改変体が、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニスト活性を保有する誘導体および／または改変体からなる群から選択される少なくとも１つでありうる。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストは、ＸＡＶ９３９またはその機能的な誘導体および／もしくは改変体を含みうる。ＸＡＶ９３９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中に、約１０ｎＭ〜約５００μＭまたは約０．２μＭ〜約２００μＭの最終濃度の、多能性および／または多分化能細胞と接触させることができる。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のなおさらなる態様では、ＳＨＨシグナル伝達活性化因子は、スムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）アゴニスト（ＳＡＧ）、ＳＡＧ類似体、ＳＨＨ、Ｃ２５−ＳＨＨ、Ｃ２４−ＳＨＨ、プルモルファミン、Ｈｇ−Ａｇ、ならびにこれらの誘導体および／または改変体であって、これらの各誘導体および／または改変体が、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子活性を保有する誘導体および／または改変体からなる群から選択することができる。例えば、ＳＨＨシグナル伝達活性化因子は、組換えＳＨＨおよび／もしくはプルモルファミン、またはこれらの機能的な誘導体および／もしくは改変体を含みうる。組換えＳＨＨを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中で、約５ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの最終濃度で、全能性、多能性、および／または多分化能細胞と接触させることができる。プルモルファミンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中に、約０．１μＭ〜約２０μＭの最終濃度の、多能性および／または多分化能細胞と接触させることができる。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のなおさらなる態様では、ニューロン前駆体細胞は、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＬＨＸ６、ＬＨＸ８、ＦＯＸＡ２、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ５、ＤＬＸ６、ＳＩＸ６、ＳＩＸ３、ＳＯＸ６、ＭＡＦＢ、ＮＰＡＳ１、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、およびＮＫＸ６．２からなる群から選択される、１つまたは複数のマーカーを含む。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のなおさらなる態様では、１つ、２つ、またはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤；１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニスト；および／あるいは１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、マウス皮質錐体ニューロン、例えば、マウスＥＳＣから導出されるマウス皮質錐体ニューロンなどのフィーダー細胞の存在下で実行することができる。
さらなる実施形態では、本開示は、皮質介在ニューロン細胞および／または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生する１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞が、（ａ）多分化能細胞、多能性細胞、および／または全能性細胞を、１つ、２つ、またはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｂ）多分化能細胞、多能性細胞、および／または全能性細胞を、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｃ）多分化能細胞、多能性細胞、および／または全能性細胞から発生させた神経前駆細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップにより産生されている、組成物を提供する。
これらの実施形態のある特定の態様では、組成物は、２つまたはそれより多くの細胞の混合物であって、皮質介在ニューロンが、細胞総数のうちの少なくとも約３０％、または細胞総数のうちの少なくとも約４０％、または細胞総数のうちの少なくとも約５０％、または細胞総数のうちの少なくとも約６０％、または細胞総数のうちの少なくとも約７０％、または細胞総数のうちの少なくとも約８０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９５％を占める混合物を含む。
これらの実施形態の関連する態様では、組成物は、２つまたはそれより多くの細胞の混合物であって、ＮＫＸ２．１＋／ＰＶ＋皮質介在ニューロンが、組成物中の細胞総数のうちの少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％を占める混合物を含む。
これらの実施形態の他の関連する態様では、組成物は、２つまたはそれより多くの細胞の混合物であって、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）作動性抑制性介在ニューロンが、組成物中の皮質介在ニューロンの総数のうちの少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％を占める混合物を含む。
これらの組成物のある特定の態様では、皮質介在ニューロンおよび／または介在ニューロン前駆体細胞は、例えば、ＣＴ−２または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの検出マーカーを発現するトランス遺伝子を含みうる。
なおさらなる実施形態では、本開示は、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生する１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞が、（ａ）多分化能細胞、多能性細胞、および／または全能性細胞を、２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｂ）多分化能細胞、多能性細胞、および／または全能性細胞を、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｃ）多分化能細胞、多能性細胞、および／または全能性細胞から発生させたニューロン前駆細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップにより産生されている、組成物を提供する。
これらの実施形態のある特定の態様では、組成物は、２つまたはそれより多くの細胞の混合物であって、視床下部ニューロンが、細胞総数のうちの少なくとも約３０％、または細胞総数のうちの少なくとも約４０％、または細胞総数のうちの少なくとも約５０％、または細胞総数のうちの少なくとも約６０％、または細胞総数のうちの少なくとも約７０％、または細胞総数のうちの少なくとも約８０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９５％を占める混合物を含む。
さらに他の実施形態では、本開示は、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生する１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞が（ａ）多分化能細胞または多能性細胞を、２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｂ）多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｃ）多分化能細胞、多能性細胞、および／または全能性細胞から発生させたニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップにより産生されている、組成物を提供する。
これらの実施形態のある特定の態様では、組成物は、２つまたはそれより多くの細胞の混合物であって、視索前野コリン作動性ニューロンが、細胞総数のうちの少なくとも約３０％、または細胞総数のうちの少なくとも約４０％、または細胞総数のうちの少なくとも約５０％、または細胞総数のうちの少なくとも約６０％、または細胞総数のうちの少なくとも約７０％、または細胞総数のうちの少なくとも約８０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９５％を占める混合物を含む。
３つの実施形態の組成物の他の態様では、細胞は、ヒトまたはマウスのものであり得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンは、前脳前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される、１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該前脳前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．任意選択で、発生させた該前脳前駆体細胞を、それらのさらなる分化に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法を提供する。
ＳＭＡＤ阻害剤およびＷｎｔアンタゴニストは、上記で記載した通りである。
他の実施形態では、本開示は、（１）ＳＭＡＤおよび／もしくはＷｎｔシグナル伝達阻害剤および／もしくはアンタゴニストならびに／またはＳＨＨシグナル伝達活性化因子を同定し、特徴付けるための細胞ベースの方法と、（２）ＳＭＡＤおよび／もしくはＷｎｔシグナル伝達阻害剤および／もしくはアンタゴニストならびに／またはＳＨＨシグナル伝達活性化因子の組合せを含む組成物と、（３）パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、多系統萎縮症などの神経変性障害および疾患、ならびに統合失調症および自閉症関連障害などの神経精神障害および疾患を含む、神経学的障害および疾患を処置するための方法であって、本明細書で開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法により発生させた、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および／または視索前野コリン作動性ニューロンをｉｎ ｖｉｖｏにおいて患者へ投与する工程を含む方法とを提供する。
本開示のこれらの態様および他の態様は、多様な実施形態のある特定の態様を例示する、以下の図面と併せると最もよく理解される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンは、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも１つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
ｃ．任意選択で、発生させた該介在ニューロンまたは介在ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目２）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンは、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも１つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
ｃ．任意選択で、発生させた該視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目３）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンは、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも１つ、好ましくは２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からのニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．所定の期間にわたる継代培養の後で、該ニューロン前駆体細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させて、該前駆体細胞からの、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す少なくとも１つのマーカーを有するニューロンの発生に助力するステップと、
ｃ．任意選択で、発生させた該視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を、それらの成熟に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目４）
該１つまたは複数の出発細胞が、ヒトのものである、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目５）
前記１つまたは複数の出発細胞が、マウスのものである、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目６）
前記１つまたは複数の出発細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、神経幹細胞、人工多能性細胞、操作多能性細胞、初代前駆細胞、誘導前駆細胞、および操作前駆細胞からなる群から選択される、少なくとも１つの細胞のクラスを含む、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目７）
ＳＭＡＤ阻害剤と接触させる前記ステップおよびＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させる前記ステップを同時または逐次的に実行し、各ステップの持続期間が、約５日間〜約３０日間の間である、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目８）
前記ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ３６４９４７、Ａ７７−０１、Ａ−８３−０１、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＧＷ６６０４、ＳＢ−５０５１２４、レルデリムマブ、メテリムマブ、ＧＣ−Ｉ００８、ＡＰ−１２００９、ＡＰ−１１０Ｉ４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ−５０５１２４、Ｅ−６１６４５２（ＡＬＫ阻害剤であるＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ−２０８、ＳＭＩ６、ＮＰＣ−３０３４５、Ｋｉ２６８９４、ＳＢ−２０３５８０、ＳＤ−０９３、アクチビン−Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン二塩酸塩、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目９）
前記ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ−１９３１８９を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ＳＢ４３１５４２が、前記細胞を含有する培養培地中に約０．１μＭ〜約１ｍＭの間の範囲内の濃度で提供される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
ＬＤＮ−１９３１８９が、前記細胞を含有する培養培地中に約１ｎＭ〜約１０μＭの間の範囲内の濃度で提供される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストが、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３、Ｄｋｋ−４、ＳＦＲＰ−１、ＳＦＲＰ−２、ＳＦＲＰ−５、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４、ＷＩＦ−１、Ｓｏｇｇｙ、ＩＷＰ−２、ＩＷＲ１、ＩＣＧ−００１、ＫＹ０２１１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＬＧＫ９７４、ＩＷＰ−Ｌ６、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１３）
前記Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストが、ＸＡＶ９３９を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ＸＡＶ９３９が、前記細胞を含有する培養培地中に約１０ｎＭ〜約５００μＭの間の範囲内の濃度で提供される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子が、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）、ＳＡＧ類似体、ＳＨＨ、Ｃ２５−ＳＨＨ、Ｃ２４−ＳＨＨ、プルモルファミン、Ｈｇ−Ａｇ、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１６）
前記１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子が、組換えＳＨＨおよびプルモルファミンの両方を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
組換えＳＨＨが、前記細胞を含有する培養培地中に約５ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの間の範囲内の濃度で提供される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
プルモルファミンが、前記細胞を含有する培養培地中に約０．１μＭ〜約２０μＭの間の範囲内の濃度で提供される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも４日後かつ最大で２０日後に開始する、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記ステップ（ｂ）を、その開始の約５〜約３０日後に終了する、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の約８〜約１８日後の間に開始し、該ステップ（ｂ）の開始の約８〜約１６日後の間に終了する、項目１に記載の方法。
（項目２２）
皮質介在ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＳＳＴ、ＰＶ、ＧＡＢＡ、カルビンディン、ＬＨＸ６、ＲＡＸ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＧ１、ＯＬＩＧ２、ＮＫＸ６．２、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１、ＤＬＸ２、ＡＳＣＬ１、ＣｈＡＴ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも１日後かつ最大で４日後に開始する、項目２に記載の方法。
（項目２４）
前記ステップ（ｂ）を、その開始の約５〜約３０日後に終了する、項目２に記載の方法。
（項目２５）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の約１〜約４日後の間に開始し、該ステップ（ｂ）の開始の約８〜約２０日後の間に終了する、項目２に記載の方法。
（項目２６）
視床下部ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＮＧＦＩ−Ｂ、ｃ−ｆｏｓ、ＣＲＦ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＲＡＸ、ＰＯＭＣ、ヒポクレチン、ＮＡＤＰＨ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目２７）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも４日後かつ最大で１０日後に開始する、項目３に記載の方法。
（項目２８）
前記ステップ（ｂ）を、その開始の約５〜約３０日後に終了する、項目３に記載の方法。
（項目２９）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の約４〜約８日後の間に開始し、該ステップ（ｂ）の開始の約８〜約２４日後の間に終了する、項目３に記載の方法。
（項目３０）
視索前野コリン作動性ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＣｈＡＴ、ＮＧＦ、Ａｃｈ、ＶＡＣｈＴ、ＬＨＸ８、Ｉｓｌ１、ｐ７５、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目３１）
前記ニューロン前駆体細胞が、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＬＨＸ６、ＬＨＸ８、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ５、ＤＬＸ６、ＳＯＸ６、ＭＡＦＢ、ＮＰＡＳ１、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、およびＮＫＸ６．２からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを含む、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目３２）
前記ステップ（ａ）および（ｂ）のうちの１つまたは複数と、存在する場合、任意選択の前記ステップ（ｃ）とを、フィーダー細胞の存在下で実行する、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目３３）
前記フィーダー細胞が、マウス皮質錐体ニューロンである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記マウス皮質錐体ニューロンが、マウスＥＳＣから導出される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
（項目３６）
前記細胞のうちの少なくとも３０％、または該細胞のうちの少なくとも４０％、または該細胞のうちの少なくとも５０％、または該細胞のうちの少なくとも６０％、または該細胞のうちの少なくとも７０％、または該細胞のうちの少なくとも８０％、または該細胞のうちの少なくとも９０％、または該細胞のうちの少なくとも９５％が、皮質介在ニューロンである、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
前記細胞のうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％が、ＮＫＸ２．１＋／ＰＶ＋皮質介在ニューロンである、項目３５に記載の組成物。
（項目３８）
前記皮質介在ニューロンのうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％が、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）作動性抑制性介在ニューロンである、項目３５に記載の組成物。
（項目３９）
視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
（項目４０）
前記細胞のうちの少なくとも３０％、または該細胞のうちの少なくとも４０％、または該細胞のうちの少なくとも５０％、または該細胞のうちの少なくとも６０％、または該細胞のうちの少なくとも７０％、または該細胞のうちの少なくとも８０％、または該細胞のうちの少なくとも９０％、または該細胞のうちの少なくとも９５％が、視床下部ニューロンである、項目３９に記載の組成物。
（項目４１）
視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、多分化能細胞または多能性細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤、および１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることにより産生されるｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物。
（項目４２）
前記細胞のうちの少なくとも３０％、または該細胞のうちの少なくとも４０％、または該細胞のうちの少なくとも５０％、または該細胞のうちの少なくとも６０％、または該細胞のうちの少なくとも７０％、または該細胞のうちの少なくとも８０％、または該細胞のうちの少なくとも９０％、または該細胞のうちの少なくとも９５％が、視索前野コリン作動性ニューロンである、項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記細胞が、ヒトのものである、項目３５、３９、４１に記載の組成物。
（項目４４）
前記細胞が、マウスのものである、項目３５、３９、４１に記載の組成物。
（項目４５）
前記Ｗｎｔアンタゴニストと接触させる前記ステップを、ステップ（ａ）の開始後５日以内に、好ましくは、ステップ（ａ）の開始の０〜１日後に開始する、項目７に記載の方法。
（項目４６）
ＳＢ４３１５４２を、前記細胞を含有する培養培地中に約０．１μＭ〜約１００μＭの間の範囲内の濃度で提供する、項目１０に記載の方法。
（項目４７）
ＬＤＮ−１９３１８９を、前記細胞を含有する培養培地中に約１ｎＭ〜約１μＭの間の範囲内の濃度で提供する、項目１１に記載の方法。
（項目４８）
ＸＡＶ９３９を、前記細胞を含有する培養培地中に約０．２μＭ〜約２００μＭの間の範囲内の濃度で提供する、項目１４に記載の方法。
（項目４９）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも６日後かつ最大で２０日後に開始する、項目１９に記載の方法。
（項目５０）
前記ステップ（ｂ）を、前記ステップ（ａ）の開始の少なくとも８日後かつ最大で１８日後に開始する、項目１９に記載の方法。
（項目５１）
前記培養培地が、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地およびＫＳＲベースの培地からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目５２）
前記皮質介在ニューロンまたは介在ニューロン前駆体細胞が、検出マーカーを発現するトランス遺伝子で改変されている、項目３５に記載の組成物。
（項目５３）
前記検出マーカーが、ＣＴ−２およびＧＦＰからなる群から選択される、項目５３に記載の組成物。
（項目５４）
前記皮質介在ニューロン前駆体細胞が、培養物中で、数週間〜数カ月間にわたり維持されうる、項目２０に記載の方法。
（項目５５）
前記皮質介在ニューロンが、培養物中またはｉｎ ｖｉｖｏで、何カ月間にもわたり維持されうる、項目２０に記載の方法。
（項目５６）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンが、前脳前駆細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、血清を補充した培養培地中で、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該前脳前駆細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．任意選択で、発生させた該前脳前駆細胞を、ニューロンへのそれらのさらなる分化に助力する条件に晒すステップと
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目５７）
前脳前駆細胞視索前野コリン作動性ニューロンを示す前記１つまたは複数のマーカーが、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
ステップ（ａ）において、前記細胞を、ＸＡＶ９３９、ＬＤＮ−１９３１８９およびＳＢ４３１５４２と接触させる、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンが、皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、ＳＨＨ活性化因子の非存在下における該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．任意選択で、発生させた該皮質投射ニューロンまたは皮質投射ニューロン前駆体細胞を、ＳＨＨ活性化因子の非存在下においてそれらのさらなる成熟に助力させるステップと
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目６０）
ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を介してニューロンを発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該ニューロンが、皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を示す１つまたは複数のマーカーを含み、該方法は、
ａ．多能性細胞、多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤および少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させて、ＳＨＨ活性化因子の非存在下における該多能性細胞もしくは多分化能細胞またはこれらの混合物からの該皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞の発生に助力するステップと、
ｂ．任意選択で、発生させた該皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞を、ＳＨＨ活性化因子の非存在下においてそれらのさらなる成熟に助力させるステップと
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法。
（項目６１）
前脳前駆体細胞の皮質への遊走をモジュレートするための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ．１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させた前脳前駆体細胞を動物の腹側終脳に注射するステップと、
ｂ．薬剤を該動物に投与するステップと、
ｃ．該薬剤が、前脳前駆体細胞の皮質への遊走をモジュレートするのかどうかを決定するステップと
を含む方法。
（項目６２）
ポリヌクレオチドを動物の皮質に送達する方法であって、該方法は、
ａ．該ポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つの分化させた前脳前駆体細胞を哺乳動物の腹側終脳に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで注射するステップと、
ｂ．該少なくとも１つの細胞が、該哺乳動物の皮質に遊走するのかどうかを検出するステップと、
ｃ．遊走した該少なくとも１つの細胞が、該ポリヌクレオチドを含有するのかどうかを決定するステップと
を含む方法。
図１Ａは、二重ＳＭＡＤ阻害パラダイムを使用して、前方神経前駆細胞を発生させる、分化プロトコールの概略表示を提示する図である。ＮＳＢ：ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）＋ＳＢ４３１５４２である。ＬＳＢ：ＬＤＮ１９３１８９＋ＳＢ３１５４２である。図１Ｂ、１Ｃ、１Ｆ、１Ｇ、および１Ｈは、ｈＥＳＣ細胞系であるＨＥＳ−３（ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ）から導出されたデータを提示する図であり、図１Ｄは、ｈＥＳＣ細胞系であるＷＡ−０９／Ｈ９に由来するデータを提示する図であり、図１Ｅは、ｈＥＳＣ細胞系であるＷＡ−０９／Ｈ９ならびにｈｉＰＳＣ細胞系であるＳｅＶ６およびＣ７２に由来するデータを提示する図である。まとめると、これらのデータは、Ｗｎｔの阻害およびＳＨＨシグナル伝達の活性化により、前脳運命の効率の高い導出およびＮＫＸ２．１の誘導がもたらされることを実証する。Ｐ：プルモルファミンであり、Ｓ：ソニックヘッジホッグである。図１Ｂおよび１Ｃは、ＤＫＫ１つまたはＸＡＶ９３９（Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニスト）を二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールへと追加することにより、ＦＯＸＧ１＋細胞の百分率の有意な増大がもたらされた（図１Ｂ）が、ＰＡＸ６発現の喪失はもたらされなかった（図１Ｃ）ことを示す棒グラフである。ＡＮＯＶＡの後で、シェッフェ検定を使用、＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。図１Ｄは、分化１０日目（ＸＬＳＢ誘導）における、ＦＯＸＧ１およびＰＡＸ６の発現についての免疫蛍光画像である。図１Ｅは、ＸＬＳＢが、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ細胞系であるＳｅＶ６、Ｃ７２；ｎ＝４）内で、頑健な終脳特化を、同等な効率で誘導することを示す棒グラフである。（Ｂ）のスケールバーは、当たり１２５／ｌｍを表す。図１Ｆは、ＳＨＨをＸＬＳＢと組み合わせることにより、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰを発現する前駆細胞の産生が有意に増強されたことを示す棒グラフである。図１Ｇは、分化４日目から始めて、１μＭのプルモルファミンを、５ｎＭのＳＨＨ（Ｓｏｎｉｃ Ｃ２４ＩＩ）へと添加したところ、分化１０日目においてＳＨＨと比較した場合に、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ発現の相乗的増大（＊＊＊Ｐ＜０．００１）が呈示されたことを示す棒グラフである。ＳＨＨおよびプルモルファミンの濃度範囲を、分化１８日目に比較した。ＡＮＯＶＡの後でシェッフェ検定を使用して、ＳＨＨを用いないものと比較した場合に、共処理は、極めて高い濃度のＳＨＨ単独またはプルモルファミン単独に対して大きく優位であった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１Ｈは、ＡＮＯＶＡの後でシェッフェ検定を使用して、ＳＨＨまたはプルモルファミンを用いない分化０〜１８日目の細胞と比較した場合に、最初のＳＨＨ誘導のタイミングを、分化２〜１０日目の間に始めるように遅延させても、分化１８日目に測定したＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの誘導に対するプルモルファミンの効能の相乗作用に劇的な影響を及ばさなかった（＊＊＊Ｐ＜０．００１）ことを示す棒グラフである。
図２は、ＳＨＨ曝露のタイミングにより、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰを発現する前駆細胞の領域的独自性が決定されることを実証するデータを提示する図である。図２Ａは、公表されたデータに基づく前脳パターン化マーカーの発現とともに、ヒト前脳のモデル（カーネギー発生段階１４（ＣＳ１４）における矢状面図）を示す図である（Ｋｅｒｗｉｎら、Ｊ Ａｎａｔ、２１７巻：２８９〜２９９頁（２０１０年））。図２Ｂ〜２Ｅは、ＮＫＸ２．１、ＯＬＩＧ２、およびＰＡＸ６の産生を示す、カーネギー発生段階１５（ＣＳ１５）におけるヒト前脳の冠状（斜方）半断面を示す図である。ＮＫＸ２．１およびＯＬＩＧ２が、腹側前脳全体にわたり、多様な領域内で産生されたのに対し、ＰＡＸ６の産生は、背側前脳および眼に限局された。これらのタンパク質の産生は、ＯＬ１Ｇ２およびＮＫＸ２．１を共発現した神経節隆起中（図２Ｃ）を除いて、重なり合わなかった。図２Ｂのスケールバーは、１Ｌｍ当たり２００を表す。図２Ｆは、異なる期間にわたり、ＸＬＳＢプロトコールと組み合わせて使用した、ＳＨＨ処理およびプルモルファミン処理についての概略表示である。図２Ｇは、分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群（欄２の顕微鏡写真）および分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群（欄３の顕微鏡写真）におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ系におけるＯＬ１Ｇ２およびＦＯＸＧ１についての免疫蛍光画像であり、ここで、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群（欄１の顕微鏡写真）と比較した場合のＦＯＸＧ１を共発現するＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の百分率の有意な増大は分化１８日目に測定した。分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群はまた、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群と比較した場合のＯＬＩＧ２を共発現するＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の導出の増強（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡの後で、シェッフェ検定を使用）も実証した。ＦＯＸＧ１、ＮＫＸ２．１、およびＯＬＩＧ２の発現は、神経節隆起に特徴的なパターンを証拠立てた（Ｔｅｋｋｉ−Ｋｅｓｓａｒｉｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２８巻：２５４５〜２５５４頁（２００１年））。これらの免疫蛍光データを定量化した。これを、図２Ｈの棒グラフに提示する。図２Ｉは、分化１８日目にＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの発現についてソートした細胞に由来するマイクロアレイ遺伝子発現データであり、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群を、ＳＨＨ非処理群（例えば、対照）と比較している。図２Ｊは、分化１８日目にＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの発現についてソートした細胞に由来するマイクロアレイ遺伝子発現データであり、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群を、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群と比較している。図２Ｋは、分化１８日目にＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの発現についてソートした細胞に由来するマイクロアレイ遺伝子発現データであり、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群を、分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群と比較している。分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群においてより高レベルで発現した遺伝子、および分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群においてより低レベルで発現した遺伝子が示される。全ての変化は、ｐ＜０．００１で有意である。
図３は、ＦＯＸＡ２が、ｈＰＳＣ由来のＮＫＸ２．１＋系統内およびヒト神経節隆起内で一過性発現することを示す例示的データを提示する図である。図３Ａは、分化１８日目において、分化したＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ発現細胞をソートし、次いで、ＳＨＨの非存在下で、さらに２週間にわたり細胞を培養した後におけるＦＯＸＡ２発現の時間経過を示す図である。ＦＯＸＡ２との共標識の百分率は、２週間の経過にわたり低下する。図３Ｂは、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群についての、代表的な免疫細胞化学画像を示す図である。分化１８日目におけるＦＯＸＧ１の発現ならびにＦＯＸＡ２およびＧＦＰの共発現である。図３Ｃは、ＦＯＸＧ１、ＮＫＸ２．１、およびＦＯＸＡ２の発現を示す、発生しつつあるマウス脳の胚生１１．５日目における冠状切片（Ｄ’Ａｍａｔｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８４巻：４３２２〜４３２６頁（１９８７年））を示す図である。間脳（Ｄｉ）内のＦＯＸＧ１の発現は見られず、終脳（Ｔｅｌ）内のＦＯＸＡ２発現も見られない。ＮＫＸ２．１は、内側神経節隆起（ＭＧＥ）内および視床下部（ＨＹＰＯ）内では発現するが、フロアプレート（ＦＰ）内では発現せず、ＦＯＸＡ２との共標識も示さない。図３Ｄは、免疫組織化学解析のために切片化されたカーネギー発生段階１５（ＣＳ１５；妊娠約５．５週）のヒト胚を示す図である。図３Ｅおよび３Ｆは、ＦＯＸＡ２およびＮＫＸ２．１の発現を実証するヒトＳ１５前脳の隣接する冠状（斜方）半断面を示す図である。ＦＯＸＡ２が、神経節隆起内で特異的に発現されると考えられる（図３Ｅ）のに対し、ＮＫＸ２．１は、腹側前脳の多様な領域内で発現される（図３Ｆ）。図３Ｅおよび３Ｆは、ヒトとマウスとの間のＦＯＸＡ２発現における差異を実証し、これは腹側前脳内でＮＫＸ２．１前駆細胞を発生させる代替的機構を示唆する。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで示される（図３Ａ）通り、かつ、より後期のヒト胚についてのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析により示唆される（Ａｌｌｅｎ Ｂｒａｉｎ Ａｔｌａｓ、ｈｕｍａｎ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ）通り、これらのＮＫＸ２．１細胞内のＦＯＸＡ２発現は、一過性でありうる。
図４は、循環神経前駆細胞からニューロン前駆体細胞への転換およびそれらの遊走能の評価を示す例示的データを提示する図である。図４Ａ〜４Ｃは、分化１８日目において、上記の３つのＳＨＨ処理群由来の細胞を、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ発現についてのＦＡＣＳにかけ、これを再播種し、表示するマーカーとの共標識について評価したことを示す図である。３つの群全てについて、前駆細胞マーカー（上パネル：ネスチン；Ｋｉ６７）との共標識における減殺、およびニューロン分化のマーカーにおける増大（下パネル：ＧＡＢＡ；ＴＵｎ；ダブルコルチン（ＤＣＸ）；カルビンディン）が見られた。図４Ｄは、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群における、視床下部で濃縮されるタンパク質ＲＡＸの増大、および分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群における、内側神経節隆起（ＭＧＥ）で濃縮されるタンパク質ＬＨＸ６の増大を示すウェスタンブロットである。解析の前に、細胞を、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰについてソートした。図４Ｅ〜４Ｇは、分化３２日目において、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群に由来するＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の多くはまた、ＤＬＸ２およびＡＳＣＬ１も発現したことを示す図である。図４Ｈ〜４Ｎは、分化３２日目にソートしたＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の、Ｅ１３．５マウス冠状薄片培養物のＭＧＥへの移植についての例示的データを示す図である。図４Ｈは、移植部位および遊走を定量化するための帯域を実証する冠状半断面についての概略を示す図である。図４Ｉおよび４Ｊは、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群および分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群のいずれにおいても、帯域１へと遊走した細胞は極めて少数であり、帯域２へと遊走した細胞はさらに少数であったことを示す図である。図４Ｋおよび４Ｌは、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群により、皮質および線条体領域への有意かつ頑健な遊走が裏付けられたことを示す図であり、多くのＧＦＰ＋細胞が、遊走細胞と符合する二極形態を呈示する（図４Ｌ）。図４Ｍ〜４Ｎは、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群について、ＧＦＰ＋細胞が検出および定量化された領域を示す図である。図４Ｍ：移植後日数（ＤＰＴ）２日である（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡの後で、シェッフェ検定を使用）。図４Ｎ：移植後日数（ＤＰＴ）６日である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡの後で、シェッフェ検定を使用）。図４Ｏおよび４Ｐは、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群由来の３２日目にソートしたＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の、新生仔マウスの新皮質への移植を示す図である。固定した切片を、生後３０日目に評価した。分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群由来のＭＧＥ様細胞とは著しく対照的に（図４Ｐ）、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群（図４Ｏ）も、分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群（データは示さない）も、移植部位からの広範な遊走をもたらさなかった。
図５は、成体マウス皮質内のＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ニューロン前駆体細胞の分布を示す例示的データを提示する図である。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ発現細胞を、分化３２日目にソートし、成体ＩＬ２ＲＧ免疫不全マウスへと移植した。分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群（図５Ａ）および分化５、６〜１８日目ＳＨＨ処理群（図５Ｂ）が、３０日後の皮質内でＧＦＰ発現領域を示したことは、ＧＦＰ細胞体が、移植コアから移出しなかったことを意味する。分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群（図５Ｃ）は、ＧＦＰ発現細胞が、移植コアから移出し、皮質実質の全体にわたり分布することを示した。加えて、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群由来のＧＦＰ発現細胞は、皮質層の全体にわたり分布し、ニューロン形態を提示する（図５Ｄ）。
図６は、新生仔マウス新皮質への移植後における、ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞による分化の緩徐なペースを示す例示的データを提示する図である。分化３２日目における、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群由来のＮＫＸ２．１−ＧＦＰ系の移植の例（例えば、「ＭＧＥ様プロトコール」）が示される。細胞を、ＧＦＰを決定するためのＦＡＣＳにかけ、次いで、遺伝子的免疫不全マウスの新生仔新皮質へと移植し、６週間後に、固定した切片中で評価した。図６Ａは、ＧＦＰ免疫蛍光標識の低倍率図である。スケールバーは１００μｍである。四角く囲った領域は、３個の細胞を示し、図６Ａ１においてより高倍率で示す。ｉｎ ｖｉｖｏにおける分化の６週間後であってもなお、これらの細胞の大半は、比較的未分化の外見であって、しばしば成長円錐（矢印）を先端に有する二極性または単極性の突起を伴う外見を有し続けることに注目されたい。スケールバーは２０μｍである。図６Ｂは、ヒト特異的な細胞マーカーであるＳＣ１２１およびＧＦＰについての免疫蛍光画像（図６Ｂ（ＳＣ１２１／ＧＦＰ）、図６Ｂ１（ＧＦＰ）、図６Ｂ２（ＳＣ１２１））である。全てのＧＦＰ＋細胞は、ＳＣ１２１を発現し、ほぼ全てということはないが大半のこの年齢のＳＣ１２１細胞は、ＧＦＰを発現する（矢印を参照されたい）。移植の２週間後においてもまた、同様の低百分率のＳＣ１２１＋／ＧＦＰ−細胞が見られる（データは示さない）。スケールバーは３５μｍであり、図６Ｂ１〜Ｂ３：スケールバーは４０μｍである。図６Ｃおよび６Ｃ１は、ＧＡＢＡ（赤色）およびＧＦＰ（緑色）についての免疫蛍光を用いた同じ切片図である。強く共標識された２つの細胞を、矢印で指し示す。ＧＡＢＡの免疫検出は、切片内によく透過しないので、細胞体が切片の切り口から５ミクロン以内に位置するＧＦＰ＋細胞だけを選択的にカウントすることにより、共標識を定量した。このアプローチにより、２つの６週間後の移植片に由来する細胞５１個中４６個（９０．２％）が強く共標識された。スケールバーは４０μｍである。図６Ｄは、ＧＦＰ ＮＫＸ２．１およびニューロン前駆体細胞のマーカーであるＤＣＸについての免疫蛍光画像；疑似カラーのＣｙ５シグナル）を示す図である。全てのＧＦＰ＋細胞は、ＮＫＸ２．１発現核（矢印）を有し、また、ＤＣＸについての共標識を有する。スケールバーは４０μｍである。
図７は、ＮＫＸ２．１＋細胞の、生理学的に活性のニューロンへの成熟を示す例示的データを提示する図である。図７Ａは、胚生１３．５日目（Ｅ１３．５）マウスからの皮質興奮性ニューロン培養物の調製を示す図であり、この上に分化３２日目のＦＡＣＳによりソートしたヒトＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞を播種した。図７Ｂ〜７Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ日数（ＤＩＹ）３０日において、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群由来の培養物が、ＧＡＢＡを共発現するＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞について濃縮されていたことを示す図である（図７Ｂ；図７Ｃで定量；＊ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡの後で、シェッフェ検定を使用）。これに対し、分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群は、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）とのＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ共標識について濃縮されていた（図７Ｄ；図７Ｅで定量；＊Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡの後で、シェッフェ検定を使用）。図７Ｆは、２８ ＤＩＶにおいて記録した、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群ニューロンのスパイキングパターンを示す図である。活動電位は、底部に示されるプロトコールにより誘発させた。図７Ｇは、２８ ＤＩＶにおいて記録した、分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群ニューロンについてのスパイキングパターンを示す図である。活動電位は、底部に示されるプロトコールにより誘発させた。図７Ｈは、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるビククリンの非存在下において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンについて濃縮された培養物（分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群）から記録された自発的スパイキングを示す図である。図７Ｉは、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるビククリンの非存在下において、コリン作動性ニューロンについて濃縮された培養物（分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群）から記録された自発的スパイキングを示す図である。図７Ｊは、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるビククリンの存在下において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンについて濃縮された培養物（分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群）から記録された自発的スパイキングを示す図である。図７Ｋは、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるビククリンの存在下において、コリン作動性ニューロンについて濃縮された培養物（分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群）から記録された自発的スパイキングを示す図である。ビククリンが、分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群における自発的発火活性に対してほとんど影響を及ぼさなかったことは、マウスフィーダー細胞またはこのプロトコールにより発生させたヒトＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞のいずれかに由来するＧＡＢＡ作動性細胞の欠如と符合する。
図８は、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、興奮性シナプス入力および抑制性シナプス入力の両方を受容することを示す例示的データを提示する図である。図８Ａ〜８Ｅは、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋、小胞ＧＡＢＡトランスポーター（ＶＧＡＴ；図８Ａ）、およびシナプス後ＧＡＢＡ作動性マーカーであるゲフィリン（図８Ａ）を示す、焦点面をずらしたｚ積層化共焦点画像を示す図である。ゲフィリンと共標識されたこのＧＦＰ＋細胞の樹状突起は、ＶＧＡＴを発現するシナプス前終末を受容しつつある（矢印）。加えて、ＧＦＰ＋軸索突起は、ＧＦＰ陰性でゲフィリンを発現するシナプス後突起に隣接して、ＶＧＡＴ＋シナプス前終末を形成した（アステリスク）。図８Ｆは、全細胞パッチクランプにより、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群のＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ニューロンから記録される自発性抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）が明らかにされることを示す図であり、これはＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるビククリンを添加することにより可逆的に遮断される。図８Ｇ〜８Ｋは、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ、小胞グルタミン酸トランスポーター１（ＶＧＬＵＴ１；図８Ｇ）、およびシナプス後マーカーであるＰＳＤ−９５（図８Ｇ）を示す、焦点面をずらしたｚ積層化共焦点画像を示す図である。このＧＦＰ＋細胞は、ＰＳＤ−９５と共標識された樹状突起であって、ＶＧＬＵＴ１を発現するシナプス前終末に隣接する樹状突起を有する。ＶＧＬＵＴ１を発現するＧＦＰ陰性細胞の存在（図８Ｇの矢印）により、培養物中の興奮性グルタミン酸作動性ニューロンの存在が確認された。図８Ｌは、自発性興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）が、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群のＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ニューロンにおいて検出されたことは、グルタミン酸作動性シナプス入力の見かけの存在と符合することを示す図である。全ての細胞は、分化３２日目におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰについてのＦＡＣＳの後に、マウス皮質フィーダー上に播種した。
図９Ａは、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群のニューロンから記録された自発性ＩＰＳＣおよび微小ＩＰＳＣの例を提示する図である。図９Ｂは、平均ｓＩＰＳＣ（グレー；ｎ＝１Ｓ０）と、平均ｍＩＰＳＣ（黒色；ｎ＝Ｓ６）との例示的重合せを提示する図である。マウス皮質フィーダー細胞上に播種したニューロンを、分化２６〜３０日目に記録した。図９Ｃは、ＩＰＳＣ（グレー）およびｍＩＰＳＣ（黒色）についての例示的な累積確率ヒストグラムを提示する図である。図９Ｄは、分化３０日目における、ヒトＥＳＣ由来の皮質前駆体細胞内のｓＩＰＳＰ（グレー；ニューロンマーカー（ＭＡＰ２）、星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）、ＧＡＢＡ、および皮質マーカー（ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１））の周波数を比較する、群分けした例示的データを提示する図である。全ての細胞は、分化３２日目におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰについてのＦＡＣＳの後に、マウスまたはヒトＥＳＣ由来の皮質フィーダー上に播種した。
図１０は、初代マウス皮質フィーダー細胞と対比したヒトＥＳＣ由来の皮質フィーダー細胞の代表的な表現型特徴付けからのデータを提示する図である。全体的に、初代マウス皮質フィーダーとｈＥＳＣ由来の皮質フィーダーとの間では、同等なマーカー発現が見られた。図１０Ａ〜１０Ｄは、ＦＡＣＳを媒介する皮質ニューロン前駆体細胞の単離であって、ＣＤ２４の発現ならびにＣＤ４４およびＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現の欠如に基づく単離からのデータを示す図である。図１０Ｅ〜１０Ｌは、分化３０日目における、ｈＥＳＣ由来の皮質前駆体細胞内の、ニューロンマーカー（ＭＡＰ２）、星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）、ＧＡＢＡ、および皮質マーカー（ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１）の発現についての免疫細胞化学解析からの画像を示す図である。図１０Ｍ〜１０Ｔは、Ｅ１３．５マウス皮質培養物中のニューロンマーカー（ＭＡＰ２）、星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）、ＧＡＢＡ、および皮質マーカー（ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１）の発現についての免疫細胞化学解析からの画像を示す図である。
図１１は、ＮＫＸ２．１＋皮質介在ニューロンからの代表的な電流クランプ記録を提示する図である。図１１Ａ〜１１Ｃは、推定大脳皮質投射ニューロンについて濃縮された、マウス皮質フィーダー細胞（図１１Ａおよび図１１Ｂ）またはヒトＥＳＣ由来ニューロン（図１１Ｃ）について記録した、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群由来のＧＦＰ陽性ニューロンからの代表的な出力波形記録を示す図である。脱分極電圧応答は、下方に出力波形の各セットを示すプロトコールを使用して誘発した。全ての記録について、保持電位は、−６０ｍＶであった。全ての細胞は、分化３２日目におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰについてのＦＡＣＳの後に、マウス皮質フィーダーまたはヒトＥＳＣ由来の皮質フィーダー上に播種した。
図１２は、マウス皮質フィーダー上で３０ ＤＩＹにわたり増殖させたＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞についての神経化学プロファイリングを示す例示的データを提示する図である。細胞は、表示のマーカーについての免疫蛍光により標識し、結果は、グラフにおいて定量化した（図１２Ａ〜１２Ｅ：平均±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡの後で、シェッフェ検定を使用；（＊）６〜１８群と直接比較した場合にｐ＜０．０５；標準的なシェッフェ検定では、ｐ値は有意性に到達しなかった：ｐ＝０．０８）。細胞の標識の代表的画像を、図１２Ｆ〜１２Ｊに示す。ＳＨＨ２〜１８条件では、細胞の大半は、ＴＨ（図１２Ａおよび１２Ｆ）およびｎＮＯＳ（図１２Ｂおよび１２Ｇ）と共標識された。１０〜１８条件では、ＧＦＰ＋細胞の多くは、カルビンディン（Ｃａｌｂ：図１２Ｃおよび１２Ｈ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ；（図１２Ｄおよび１２Ｉ）、およびパルブアルブミン（ＰＶ；図１２Ｅおよび１２Ｊ）と共標識された。それらの各々は、ヒトでは、成熟皮質介在ニューロンの部分集団内に存在する。全ての細胞を、３２日目におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰについてのＦＡＣＳの後に、マウス皮質フィーダー上に播種した。（図１２Ｆ〜１２Ｊ）中のスケールバーは、５０ｍｍを表す。
詳細な説明
本開示は、前脳ニューロン分化は、増強することができ、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロンを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）のある特定のニューロンは、ある特定の多能性および／または多分化能細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および／またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ））を、１つまたは複数のＷｎｔアンタゴニストと組み合わせた、１つ、好ましくは２つまたはそれより多くのＳＭＡＤ転写因子阻害剤と、ニューロン前駆体細胞を発生させるのに適切な濃度で、これに適切な持続期間にわたり接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に誘導することができ、これらのニューロン前駆体細胞を、適切な濃度の１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と、適切な持続期間にわたり接触させ、これにより、皮質介在ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー１つもしくは複数、視床下部ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー１つもしくは複数、および／または視索前野コリン作動性ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー１つもしくは複数の産生を誘導しうるという発見に基づく。
ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ ｈＥＳＣレポーター細胞系を使用して、適時のＳＨＨシグナル伝達の活性化と併せて、細胞をＸＡＶ９３９で処理すると、３つの異なる腹側前脳前駆体細胞集団を導出しうることが発見された。本明細書で開示される通り、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）およびヒト胚のいずれにおける結果も、腹側前脳内でのヒトＦＯＸＡ２の一過性の発現を含む、マウス前脳の発達とヒト前脳の発達との間の差異を明らかにする。成熟した機能的特性ならびにパルブアルブミンおよびソマトスタチンを含む後期皮質介在ニューロンマーカーの発現は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるこれらの細胞の発達が長期間を要するにも拘らず、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ｈＰＳＣの、ヒト皮質介在ニューロンへの分化を証拠立てた。ＳＨＨシグナル活性化のタイミングを調整することにより、ニューロン分化を、視床下部ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロンの産生に方向付けうることがさらに発見された。
ＸＡＶ９３９とは、名称が３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オンであり、化学式がＣ１４Ｈ１１Ｆ３Ｎ２ＯＳである、市販の低分子である。ＸＡＶ９３９の構造を、下記に挙げる。ＸＡＶ９２９は、タンキラーゼ（ＴＮＫＳ）阻害剤であり、β−カテニンの分解の刺激およびアキシンの安定化を介して、Ｗｎｔシグナル伝達をアンタゴナイズする。ＸＡＶ９３９は、μ−カテニン依存性結腸癌細胞系であるＤＬＤ−１の増殖を阻害する。
したがって、本開示は、様々な安定的ニューロン細胞（例えば、皮質介在ニューロン細胞、視床下部細胞、および視索前野コリン作動性ニューロン）を、ヒト多能性幹細胞の制御された誘導、ならびにこのような幹細胞の、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤および／またはＷｎｔアンタゴニストにより方向付けられた分化から生じるニューロン細胞の制御された誘導であって、移植用の移植片のために、または神経学的障害および疾患についての研究プラットフォームとしてのほか、治療用薬物候補の同定および特徴付けのために利用すると有利でありうる、皮質介在ニューロン細胞、視床下部細胞、および／または視索前野コリン作動性ニューロンを含む細胞の集団を形成する誘導を介して発生させるための、幹細胞および前駆細胞など、多能性および／または多分化能細胞の方向付けられた分化を誘導するための方法を提供する。
本明細書では、神経細胞の方向付けられた分化を制御するのに使用されうる、多様な分化誘導剤および実験プロトコールが提供される。本明細書では、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ ｈＥＳＣレポーター細胞系において、ヒト皮質介在ニューロンの非常に効率的な導出が開示される。ＳＭＡＤおよびＷｎｔ阻害効果を活用して、幹細胞のニューロン前駆体細胞への分化を導くことに加えて、本開示は、ＳＨＨ活性化のタイミングおよび持続期間を操作して、これにより、３つの異なるＧＦＰ＋ニューロン細胞集団であって、各々が特異的なマーカープロファイル、例えば、特異的な転写プロファイルのほか、対応する神経伝達物質の表現型および遊走挙動を呈示する、ＧＦＰ＋ニューロン細胞集団の発生を達成することについてさらに記載する。
本明細書でさらに開示される通り、ｉｎ ｖｉｖｏのマウス皮質環境における分化は、皮質介在ニューロンのシナプス入力および電気生理学的特性を呈示する、パルブアルブミンおよびソマトスタチンを発現するニューロンをもたらす。こうして、ＳＨＨを媒介するシグナル伝達は、ヒト腹側前脳の発達のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞ベースのモデルであって、皮質介在ニューロンモデルを含み、効果的な細胞療法を開発するために、薬物スクリーニングのために、かつ、ヒト神経変性病態およびヒト神経精神病態を研究するために利用されうるモデルの作製を可能とするのに十分に詳細に規定されている。
本明細書で詳細に記載されるこれらの発見および他の発見に基づき、ある特定の実施形態では、本開示は、
（１）皮質介在ニューロンまたは皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を含むニューロンを含む、ニューロンを発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ．多能性細胞および／または多分化能細胞を、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、該多能性および／または多分化能細胞からのニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、
ｂ．ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、皮質介在ニューロンおよび／または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップと
による多能性細胞または多分化能細胞の分化を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法；
（２）視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ニューロン細胞を、多能性細胞または多分化能細胞の分化により発生させ、
ａ．１つもしくは複数の多能性細胞および／または１つもしくは複数の多分化能細胞を、（ｉ）２つまたはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤、および（ｉｉ）１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、
ｂ．ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップと
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法；
（３）視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ニューロン細胞を、多能性細胞および／または多分化能細胞の分化により発生させ、
ａ．１つもしくは複数の多能性細胞および／または１つもしくは複数の多分化能細胞を、（ｉ）２つまたはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤、および（ｉｉ）１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、
ｂ．ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップと
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法；
（４）皮質介在ニューロン細胞および／または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生する１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞が、
ａ．多分化能細胞または多能性細胞を、２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
ｂ．多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
ｃ．多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップ
により産生される、組成物；
（５）視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生する１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞が、
ａ．多分化能細胞または多能性細胞を、２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
ｂ．多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
ｃ．多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップ
により産生される、組成物；
（６）視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生する１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞が、
ａ．多分化能細胞または多能性細胞を、２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
ｂ．多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、
ｃ．多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップ
により産生される、組成物；
（７）ＳＭＡＤおよびＷｎｔシグナル伝達阻害剤および／またはアンタゴニストならびにＳＨＨの活性化因子を同定し、特徴付けるための細胞ベースの方法；
（８）ＳＭＡＤおよびＷｎｔシグナル伝達阻害剤および／またはアンタゴニストならびにＳＨＨシグナル伝達活性化因子の組合せを含む組成物；
（９）前脳細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法；
（１０）パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、多系統萎縮症などの神経変性障害および疾患、ならびに統合失調症および自閉症関連障害などの神経精神障害および疾患を含む神経学的障害および疾患を処置するための方法であって、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および／または視索前野コリン作動性ニューロンをｉｎ ｖｉｖｏにおいて患者に投与するステップを含む方法
を提供する。
本明細書でより詳細に記載される通り、本明細書で開示される方法および組成物は、新規に発見され、本明細書で開示される、ＳＭＡＤ阻害とＷｎｔアンタゴニズムとの関係であって、多分化能、多能性、および／または全能性細胞などの細胞の分化を誘導してニューロン前駆体細胞を発生させ、このようなニューロン前駆体細胞を、皮質介在ニューロンもしくはその前駆体細胞、視床下部細胞もしくはその前駆体細胞、および／または視索前野コリン作動性細胞もしくはその前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を有するニューロン細胞を発生させるように、ニューロン細胞をＳＨＨの活性化因子と、活性化因子の濃度およびタイミングの特定の条件下で接触させることによって皮質介在ニューロン、視床下部、および視索前野コリン作動性系統内の細胞へとさらに分化させることにおける、ＳＭＡＤ阻害とＷｎｔアンタゴニズムとの関係に基づく。
本明細書では、本開示のこれらの態様および他の態様であって、（１）ニューロン細胞を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）、特に、ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）およびヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）を含むヒト細胞を含む多分化能、多能性、および／または全能性細胞から発生させるための方法；（２）皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロン系統の細胞を発生させるのに利用されると有利でありうる例示的なＳＭＡＤ阻害剤、Ｗｎｔアンタゴニスト、およびＳＨＨ活性化因子；（４）ニューロン細胞を、多分化能、多能性、および／または全能性細胞から発生させるための適切な条件、ならびに皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロン系統の細胞を発生させるために適切な条件；（４）皮質介在ニューロン細胞および前駆体細胞のマーカー、視床下部細胞および前駆体細胞のマーカー、ならびに視索前野コリン作動性細胞および前駆体細胞のマーカー、ならびに細胞内のこのようなマーカーを検出するための方法；（５）ｉｎ ｖｉｖｏにおける患者への送達に適切な医薬組成物および処方物を含む組成物および処方物であって、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および／または視索前野コリン作動性ニューロン系統のうちの１つまたは複数の細胞を含む組成物および処方物；（６）多分化能、多能性、および／または全能性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中で、ニューロン細胞の発生を誘導するのに使用することができ、このようなニューロン細胞の培養物中で、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロン系統の細胞の発生を誘導するのに使用することができる、ＳＭＡＤ阻害剤、Ｗｎｔアンタゴニスト、およびＳＨＨ活性化因子の適切な組合せおよび濃度を含む組成物およびキット；ならびに（７）皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロン系統の細胞を投与することにより、神経変性障害もしくは疾患または神経精神障害もしくは疾患に罹患している患者および／またはこれを発症する危険性がある患者を処置するための細胞療法ベースの方法を含む態様が、さらに詳細に記載される。
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語（およびその同族語）は、文脈によりそうでないことが要求されない限りにおいて、以下でそれらに帰せられた意味を有する。
「シグナル伝達タンパク質」への言及における「シグナル伝達」という用語は、膜受容体タンパク質へのリガンド結合または他の何らかの刺激により、直接的または間接的に活性化されるかまたは他の形で影響を受ける（例えば、阻害される）タンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例は、ＳＭＡＤ、Ｗｎｔ、およびＳＨＨ複合体タンパク質を含む。用語は、細胞の応答と直接連関しない、リガンド−受容体間相互作用を含む。したがって、リガンドにより活性化された受容体は、リガンドが細胞の挙動に対して最終的な生理学的効果を及ぼす前に、細胞内部の他のタンパク質とまず相互作用する可能性がある。一連の複数の相互作用する細胞内タンパク質の挙動は、受容体の活性化または阻害の後で変化することが多い。受容体の活性化により誘導される細胞変化のセット全体は、シグナル伝達機構またはシグナル伝達経路と呼ばれ、この用語の意味の中に含まれる。本明細書で使用される場合、以下の用語（およびその同族語）は、文脈によりそうでないことが要求されない限りにおいて、以下でそれらに帰せられた意味を有する。
「ＳＭＡＤ（ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）」または「ＳＭＡＤ」という用語は、幹細胞の方向付けられた細胞分化をモジュレートすることが可能なシグナル伝達分子のクラスを指す。ＳＭＡＤとは、細胞外シグナルを、トランスフォーミング増殖因子ベータリガンドから核に伝達し、そこで、下流の遺伝子転写を活性化させる細胞内タンパク質であり、幹細胞の方向付けられた分化をモジュレートすることが可能なシグナル伝達分子のクラスのメンバーである。
「ウィングレス」または「Ｗｎｔ」という用語は、それらのシグナル伝達が、β−カテニンを伴うかまたは伴わずに媒介される、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体など、ＷｎｔファミリーのリガンドおよびＷｎｔファミリーの受容体から構成されるシグナル経路を指す。
本明細書で使用される場合、「ソニックヘッジホッグ」または「ＳＨＨ」という用語は、ヘッジホッグと呼ばれる、哺乳動物のシグナル伝達経路ファミリー内の３つのタンパク質のうちの１つ（他の２つは、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）およびデザートヘッジホッグ（ＤＨＨ）である）を指す。ＳＨＨは、四肢の指の成長および脳の組織化など、脊椎動物の器官形成の調節において役割を果たすと考えられている。したがって、ソニックヘッジホッグタンパク質は、拡散して、濃度勾配を形成し、その濃度に応じて、発生しつつある胚細胞に異なる影響を及ぼすモルフォゲンである。ＳＨＨはまた、成体幹細胞の細胞分裂も制御する可能性があり、一部のがんの発達に関与している。ＳＨＨは、細胞運命の決定、組織化の再構築、極性、形態、増殖、および分化を含む胚発生中の多様な過程の調節と関連する（ＢｅｒｔｒａｎｄおよびＤａｈｍａｎｅ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００６年、１６巻：５９７〜６０５頁）。
ＳＭＡＤシグナル伝達またはＷｎｔシグナル伝達阻害剤など、シグナル伝達分子またはシグナル伝達分子の経路の阻害への言及における「阻害剤」という用語は、分子または経路のシグナル伝達機能に干渉する（すなわち、低減させるか、または抑制するか、または消失させるか、または遮断する）化合物または他の分子（例えば、低分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体）を指す。言い換えると、阻害剤とは、名指されたタンパク質（シグナル伝達分子、名指されたシグナル伝達分子と関連する任意の分子、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）など、名指された関連分子）（例えば、本明細書で記載されるシグナル伝達分子を含むがこれに限定されない）の任意の活性を、一例では、ＳＭＡＤシグナル伝達に直接接触すること、ＳＭＡＤ ｍＲＮＡに接触すること、ＳＭＡＤのコンフォメーション変化を引き起こすこと、ＳＭＡＤタンパク質レベルを低下させること、またはＳＭＡＤの、シグナル伝達パートナー（例えば、本明細書で記載されるシグナル伝達パートナーを含む）との相互作用に干渉すること、およびＳＭＡＤ標的遺伝子（例えば、本明細書で記載されるＳＭＡＤ標的遺伝子）の発現に影響を及ぼすことを介して変化させる、任意の化合物または分子である。阻害剤はまた、上流のシグナル伝達分子を妨害することにより、ＳＭＡＤの生物学的活性を間接的に調節する分子も含む（例えば、細胞外ドメイン内のシグナル伝達分子であり、シグナル伝達分子および効果の例として、骨形態形成タンパク質を封鎖するノギン、ＡＬＫ受容体１、２、３、および６の活性化を阻害し、これにより、下流におけるＳＭＡＤの活性化を防止する効果が挙げられる。同様に、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎは、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化因子を同様に封鎖する。また、膜貫通タンパク質であるＢａｍｂｉも、細胞外ＴＧＦβシグナル伝達分子を封鎖する偽受容体として作用する。アクチビン、ｎｏｄａｌ、ＴＧＦβ、およびＢＭＰを遮断する抗体は、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化因子を中和するなどの使用のために企図されている）。したがって、一実施形態では、本開示の阻害剤は、デフォルトから非デフォルト細胞型への分化を誘導する（変更する）、または変化させる、例えば、少なくとも３つの阻害剤を含む本開示の方法のうちの１つにより、非デフォルトの神経前駆細胞が産生された。好ましい実施形態では、本明細書で開示される阻害剤は、細胞の分化を、本明細書で開示される皮質介在ニューロンを産生するための非デフォルト細胞型など、本明細書で記載される非デフォルト細胞型に方向付けるために、デフォルトのシグナル伝達を「変化させる」か、または「低下させる」か、または「遮断する」。したがって、本開示の阻害剤は、例えば、本開示の皮質介在ニューロンをもたらす一助となるシグナル分子活性を増大または減少させるための、天然または合成の生物学的化合物の場合もあり、低分子の場合もある。阻害剤は、名指されたシグナル伝達分子の上流の分子に結合し、影響を及ぼし、これが、名指された分子の阻害を引き起こすことにより誘導される阻害に加えて、競合的阻害（活性部位に、別の公知の結合化合物の結合を排除または低減するように結合する）およびアロステリック阻害（化合物の、そのタンパク質の活性部位に対する結合に干渉するよう、タンパク質に、タンパク質のコンフォメーションを変化させるように結合する）との関連でも記載される。
「ＬＳＢ」という用語は、細胞内のトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達およびＳＭＡＤ（ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）シグナル伝達からなるシグナル伝達を低下させるかまたは遮断することが可能な２つの化合物ＬＤＮ−１９３１８９およびＳＢ４３１５４２の組合せを指す。
「ＸＬＳＢ」という用語は、３つの化合物の組合せであって、それらのうちの最初の２つの化合物が、細胞内のトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達およびＳＭＡＤ（ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）シグナル伝達からなるシグナル伝達を低下させるかまたは遮断することが可能なＬＤＮ−１９３１８９およびＳＢ４３１５４２を含み、それらのうちの最後の化合物が、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することが可能なタンキラーゼ阻害剤であるＸＡＶ９３９である組合せを指す。
「ＳＨＨシグナル伝達経路活性化因子」という用語は、ＳＨＨシグナル伝達経路を活性化する物質を指すことを意図する。それがＳＨＨが媒介するシグナル伝達経路を増強するのであれば、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化因子に特定の限定が付与されることはない。ＳＨＨシグナル伝達経路は、２つの膜貫通タンパク質である、Ｐｔｃ（Ｐａｔｃｈｅｄ）およびＳｍｏ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）を伴う。本発明で有用なＳＨＨシグナル伝達経路活性化因子の例は、ヘッジホッグファミリーに属するタンパク質（例えば、精製ＳＨＨ、組換えＳＨＨ）、ＳＨＨ受容体の活性化因子（例えば、プルモルファミン、Ｈｇ−Ａｇなど）、Ｐｔｃの、Ｓｍｏとの相互作用の阻害剤、Ｓｍｏ受容体の活性化因子、Ｃｉ／Ｇｌｉファミリーのレベルを上昇させる物質、Ｃｉ／Ｇｌｉ因子の細胞内分解の阻害剤、およびトランスフェクションによりもたらされるＳｈｈ過剰発現構築物またはＣｉ／Ｇｌｉ過剰発現構築物を含む。一部の好ましい実施形態では、本開示における「ＳＨＨシグナル伝達経路活性化因子」は、組換えＳＨＨおよびプルモルファミンを含む。
分化する細胞系内の細胞に関して使用される場合、「分化」という用語は、細胞が、１つの細胞型（例えば、分化可能な多分化能、全能性、または多能性細胞）から、完全分化細胞など、別の細胞型に分化する過程を指す。より一般に、「分化」という用語は、特化していない幹細胞または前駆体細胞が、脳細胞、心臓細胞、肝細胞、または筋細胞など、特化細胞または完全分化細胞の特徴を獲得する過程を指す。分化は、通常は、細胞表面内に埋め込まれたタンパク質を伴うシグナル伝達経路を介した、細胞遺伝子の、細胞外の物理的および化学的条件との相互作用により制御される。
「方向付けられた分化」という用語は、本開示に従う皮質介在ニューロン細胞など、特定の（例えば、所望の）細胞型への分化を誘導するための幹細胞および前駆体細胞の培養条件の操作を指す。
「分化剤」という用語は、特化していない状態、例えば、幹細胞の状態の、より特化した細胞運命（例えば、中枢神経系細胞、神経細胞、前脳ニューロン細胞、皮質介在ニューロンなど）への移行を促進する、低分子、増殖因子タンパク質、および他の増殖条件のうちの１つまたは複数の使用を指す。言い換えると、分化剤とは、幹細胞を、体細胞をもたらす細胞経路に傾倒させる特性を有する物質である。例えば、このような化合物として、Ｗｎｔ活性化剤またはＳＭＡＤ阻害剤が挙げられうるがこれらに限定されない。
細胞への言及における「分化の誘導」という用語は、デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）を、非デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）に変化させることを指す。したがって、「幹細胞における分化の誘導」とは、細胞を、遺伝子型（すなわち、マイクロアレイなどの遺伝子解析により決定される場合の遺伝子発現の変化）および／または表現型（すなわち、ＮＫＸ２．１などのタンパク質の発現の変化）など、幹細胞と異なる特徴を伴う子孫細胞に分裂するように誘導することを指す。
本発明のこの態様の一部の実施形態では、細胞の集団は、分化形質転換細胞の集団、好ましくは、ヒト分化形質転換細胞の集団でありうる。分化形質転換細胞は、その表現型が、必ずしも多能性表現型または多分化能表現型に戻ることなく、異なる組織の成熟細胞の表現型に分化形質転換または再方向付けがなされた１つの組織型の成熟分化細胞を包摂する。分化形質転を起こし細胞には、任意の体細胞のほか、成体幹細胞が含まれる。当技術分野では、細胞を分化形質転換する方法が公知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍａｓ ＫｕｎｔｚｉｇｅｒおよびＰｈｉｌｉｐｐｅＣｏｌｌａｓ、Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ、１４７巻（Ｒｏｂｅｒｔ Ｌａｎｚａ編、２００４年）を参照されたい）。分化形質転換された神経前駆細胞およびニューロン前駆細胞を産生する方法は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｅｖｅｓｑｕｅらによる、米国特許第６，９４９，３８０号、同第６，０８７，１６８号、および同第７，０４１５０７号；ならびにＳｕｈらによる、米国特許公開第２００６００９９１９０号、およびＤｅｚａｗａによる、同第２００６／０２５１６２４号において記載されている。
細胞を本明細書で開示されるとおりの分子または物質との「接触」という用語は、文脈により要求されうる通りに、分子または物質を培養培地中に入れること、または分子を細胞内に導入することなどにより、分子または物質を、それが細胞に作用することを可能とする場所に置くことを指す。分子は、低分子化合物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド（例えば、精製タンパク質および／または組換えタンパク質）でありうる。加えて、接触はまた、細胞内の遺伝子の発現の誘導、例えば、細胞に分子をコードする核酸を含有するベクターをトランスフェクトすることも含む。接触は、任意の適切な方法を使用して達成することができ、細胞外の場合もあり、細胞内の場合もある。例えば、一実施形態では、接触は、化合物／物質を、それ自体として細胞内に導入することによるものであるか、またはその化合物もしくは物質を発現させるように、細胞を遺伝子改変することによるものである。接触は、細胞を、分子または分子を含有するビヒクルに曝露させる方法、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、トランスフェクションにより細胞に送達する方法を含む、様々な方法で達することができる。接触はまた、接触が、細胞外膜上で生じるように、化合物または物質を細胞培養物に添加することにより達成することもできる。接触はまた、組換えタンパク質の産生により、所与の細胞内で達成することもできる。
本明細書で使用される場合、「分化〜日目」という用語は、幹細胞培養物を分化誘導剤分子に接触させた後における、２４時間（すなわち、１日）間隔を有する時系列を指す。例えば、このような誘導剤分子として、Ｗｎｔ阻害剤およびＳＭＡＤ阻害剤分子が挙げられうるがこれらに限定されない。培養物を誘導剤分子と接触させる日を、分化１日目として言及する。例えば、分化２日目とは、幹細胞培養物を分化誘導剤分子に接触させた２４〜４８時間後の間の任意の時点を表す。
「分化誘導分子」という用語は、ある特定の培養条件下で、多分化能、全能性、または多能性細胞の、例えば、ニューロン細胞への分化を引き起こす特性を有する分子を指す。このような誘導化合物は、Ｗｎｔ阻害剤またはＳＭＡＤ阻害剤またはＳＨＨ活性化因子を含みうるが、これらに限定されない。
細胞分化経路への言及における「デフォルト」または「受動的」という用語は、ある特定の分子で処理しない場合、すなわち、通常の細胞培養条件下において、より特化していない細胞が、培養物中で、ある特定の分化細胞型となる経路を指す。言い換えると、デフォルト細胞は、細胞を、分化細胞型を変化させることが可能な分子（すなわち、モルフォゲン）に接触させない場合に結果として生じる。これに対し、細胞への言及における「非デフォルト」とは、デフォルト細胞と異なる結果として生じる分化細胞型を指す。すなわち、非デフォルト細胞とは、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、または視索前野ニューロンなどを含む本開示の細胞など、非デフォルト条件から生じる分化細胞型である。
「ＡＬＫ」または「未分化リンパ腫キナーゼ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ）」または「未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ」または「Ｋｉ−１」という用語は、膜会合型チロシンキナーゼ受容体を指す。
「ＰＡＸ（ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ）遺伝子６」または「ＰＡＸ６」という用語は、非デフォルトの神経前駆細胞のマーカーを指す。
「幹細胞」という用語は、全能性または多能性または多分化能であり、１つまたは複数の異なる細胞型に分化することが可能な細胞を指す。この用語は、胚性幹細胞として限定されず、器官から単離された幹細胞、例えば、皮膚幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。「全能性」という用語は、分化した生物内の任意の細胞型のほか、胎盤など、胚体外素材の細胞へ分化する細胞の能力を指す。本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、胚性幹細胞と類似するが、体細胞（例えば、成体細胞）を、胚性幹細胞（ＥＳＣ）の「幹細胞性」、すなわち、異なる分化経路に傾倒させるように導かれるそれらの能力を維持するのに重要な因子を発現するように強いることにより、胚性幹細胞様状態に入るように再プログラム化する場合に創出される種類の多能性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、細胞への言及における「前駆細胞」という用語は、該細胞が、もはや多能性幹細胞でないが、また、いまだ完全に傾倒した細胞でもない、中間の細胞段階を指す。本開示における前駆細胞は、体細胞に含まれる。
「多能性」という用語は、任意の最終分化細胞型に分化することが可能な細胞系を指す。
「多分化能」という用語は、少なくとも２つの最終分化細胞型に分化することが可能な細胞系を指す。
「胚性幹細胞」という用語は、培養物中で長期にわたり分化することなく分裂することが可能であり、３つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが可能な着床前期または初期胚（例えば、胚盤胞期までであり、胚盤胞期を含む）に由来する原始（未分化の）細胞を指す。胚性幹細胞はまた、胚または胎盤または臍帯から単離することもできる。
「胚性幹細胞系」という用語は、数日間、数カ月間、またはさらに数年間にわたり分化させずに増殖させることを可能とするｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。
「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、胚性幹細胞と類似する、ある特定の胚遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４トランス遺伝子など）（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ、１２６巻：６６３〜６７６頁（２００６年）を参照されたい）を、体細胞に導入することにより形成される多能性幹細胞の種類を指す。体細胞の例には、骨髄細胞、上皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、肝細胞、腸細胞、間葉細胞、骨髄前駆体細胞および脾臓細胞が含まれるがこれらに限定されない。代替的に、ｉＰＳＣは、体細胞を、胚性幹細胞（ＥＳＣ）の「幹細胞性」、すなわち、異なる分化経路に傾倒するように導かれるそれらの能力を維持するのに重要な因子を発現させるように強いることにより、胚性幹細胞様状態に入るように再プログラム化することにより産生することができる。
当技術分野では、幹細胞、特に、ヒト胚性幹細胞を培養するための方法が公知であり、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、全てがＴｈｏｍｓｏｎおよびＬｕｄｗｉｇによる、ＷＯ２００６／０２９２９７、ＷＯ２００６／０１９３６６、およびＷＯ２００６／０２９１９８、ならびにＢｅｒｇｅｎｄａｈｌおよびＴｈｏｍｓｏｎによる、ＷＯ２００８／０８９３５１において記載されている。
「神経細胞培養物」という用語は、ＦＯＸＡ２、ＳＨＨ、Ｎｅｔｒｉｎ−１、Ｆ−Ｓｐｏｎｄｉｎの発現を含むがこれらに限定されない特徴を提示する細胞系を指す。
「細胞培養物」という用語は、任意のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞培養物を指す。この用語には、連続細胞系（例えば、不死表現型を伴う）、初代細胞培養物、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、および、胚、多能性幹細胞、卵母細胞、および胚を含むが、これら限定されないｉｎ ｖｉｔｒｏで維持された他の任意の細胞集団（とりわけ、ニューロン）が含まれる。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的な環境および人工的な環境内で生じる過程または反応を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境は、試験管および細胞培養物からなりうるがこれらに限定されない。「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、天然の環境（例えば、動物または細胞）および天然の環境内で生じる過程または反応を指す。
細胞または細胞の領域への言及における「前駆体細胞」という用語は、適切な条件下で、すなわち、適正な増殖因子、化合物、細胞外シグナル、細胞内シグナルなどと接触させた場合に発達する（分化する）細胞または細胞の領域の種類を指す。例えば、「ニューロン前駆体細胞」とは、ニューロンとなるよう傾倒しているが、複数種類のニューロン、例えば、皮質介在ニューロンまたは視床下部ニューロンなどに発達する潜在的可能性を有する細胞を指す。
「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、個々に、または２つもしくはそれより多くの超えるマーカーの組合せのメンバーとして、特定の細胞または細胞型を識別する遺伝子またはタンパク質などの分子的または形態的形質を指す。したがって、マーカーは、指定されたマーカー群により、細胞または細胞型を、別の細胞または細胞型から識別しうるようなマーカーの「パターン」または組合せを指す場合がある。例えば、前脳細胞は、前脳細胞を弁別する、マーカー１つまたは複数、すなわち、ＦＯＸＡ２陽性およびＮＫＸ２．１陽性を発現する。
「前脳（ｆｏｒｅｂｒａｉｎ）」または「前脳（ｐｒｏｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）」という用語は、脳の最吻側（最前方）部分を指し、中枢神経系（ＣＮＳ）の初期発生中における、脳の１つの主要部分である。前脳は、間脳（腹側視床、視床、視床下部、視床腹部、視床上部、および視蓋前域）と終脳（大脳）とに分かれる。
「終脳」という用語は、成熟大脳が発生する脳の胚構造を指す。哺乳動物では、背側終脳または脳外套は、大脳皮質に発生し、腹側終脳または外套下部は、大脳基底核となる。背側終脳の例示的なマーカーは、ＥＭＸ２およびＰＡＸ６を含み、腹側終脳の例示的なマーカーは、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、およびＮＫＸ６．２を含む。
「大脳皮質」という用語は、ヒトおよび他の哺乳動物の大脳（脳）の神経組織の最も外側の層構造を指す。
「介在ニューロン」という用語は、神経シグナルを標的ニューロンから受容し、神経シグナルをシナプス後ニューロンに伝達するニューロンとして定義される。介在ニューロンのシグナル伝達は、出力ニューロンとのその直接的なシナプス接続を介する場合もあり、１つまたは複数の介在ニューロンを通す伝達を介する場合もある。
「皮質介在ニューロン」という用語は、パルブアルブミン（ＰＶ）を発現する介在ニューロン、ＣＣＫを発現する介在ニューロン、ＶＩＰを発現する介在ニューロン、およびＳＯＭを発現する介在ニューロンを含むがこれらに限定されない、皮質の介在ニューロンを指す。これらのマーカーに加えて、皮質介在ニューロンについての他の例示的なマーカーとして、ＧＡＢＡが挙げられる。
「皮質介在ニューロン前駆体細胞」という用語は、適切な条件下で皮質介在ニューロンに分化しうる完全に分化していないニューロン細胞を指す。例えば、皮質介在ニューロン前駆体細胞として、ＮＫＸ２．１＋腹側前脳前駆細胞、ＯＬＩＧ２＋神経節隆起に由来する細胞、ならびにＯＬＩＧ２、ＭＡＳＨ１、およびＮＫＸ６．２を発現するニューロン前駆細胞が挙げられる。
「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」、「単離」という用語、および本明細書で使用されるこれらの文法的同等物は、試料に由来する少なくとも１つの夾雑物の量の低減を指す。例えば、ある細胞型は、望ましくない細胞型の量の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の低減により精製され、例えば、混合細胞培養物中に存在する細胞などの、非前脳細胞から単離された分化前脳細胞などである。したがって、細胞型の精製は、「濃縮」、すなわち、細胞培養物中のその細胞型の量および／または百分率における増大を結果としてもたらす。
本明細書で使用される「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的な環境および人工的な環境内で生じる過程または反応を指す。例示されるｉｎ ｖｉｔｒｏ環境は、試験管および細胞培養物を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、天然の環境（例えば、動物にまたは細胞）および胚発生、細胞分化、神経管の形成など天然の環境内で生じる過程または反応を指す。
本明細書で開示される任意の細胞に言及する場合の「〜から導出された」または「〜から確立された」または「〜から分化させた」という用語は、細胞系内、組織（解離胚など）内、または体液中の親細胞から、以下に限定されないが、単一細胞単離、ｉｎ ｖｉｖｏにおける培養、処理および／または突然変異誘発、例えば以下を使用するもの、タンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染、モルフォゲンなど、ＤＮＡ配列のトランスフェクション、培養した親細胞中に含まれる任意の細胞の選択（継代培養によるなど）など、任意の操作を使用して得られた（例えば、単離された、精製されたなど）細胞を指す。導出された細胞は、増殖因子、サイトカインへの応答、サイトカイン処理の選択的進行、接着、接着の欠如、ソーティング手順などにより、混合集団から選択することができる。
本明細書で使用される場合、「培養細胞」という用語は一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持された細胞を指す。培養細胞は、「細胞系」および「初代培養細胞」を含む。この用語には、連続細胞系（例えば、不死表現型を伴う）、初代細胞培養物、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、および胚、多能性幹細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏで維持された他の任意の細胞集団（とりわけ、ニューロン）が含まれる。多くの培養細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖しうるが、一部の培養細胞、例えば、ニューロンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖することが可能ではない。
「単層」、「単層培養物」、および「単層細胞培養物」という用語は、基材に接着しており、細胞１個の厚さである層として増殖する細胞、言い換えると、「付着させた細胞」を指す。単層は、フラスコ、試験管、カバーガラス（例えば、シェルバイアル）、ローラーボトルなどを含むがこれらに限定されない、任意の形式で増殖させることができる。「フィーダー細胞」という用語は、隣接する細胞に、付着する分子および／または増殖因子を提供するために使用される細胞を指し、例えば、共培養物中で、多能性幹細胞を維持するのに使用される。例えば、フィーダー細胞集団は、胚性マウス皮質細胞または胚性ヒト皮質細胞を含みうる。フィーダー細胞は一般に、単層（すなわち、「フィーダー細胞層」）を形成し、または懸濁液中に存在する場合もある。一部の実施形態では、これらのフィーダー細胞は、マウス胚性線維芽細胞を含む。
「培養培地」および「細胞培養培地」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞（すなわち、細胞培養物、細胞系など）の成長を支援するのに適切な培地を指す。用語を任意の特定の培養培地に限定することは意図されない。例えば、定義は、成長培地のほか、維持培地も包摂することが意図される。実際、この用語は、目的の細胞培養物および細胞の成長のために適切な任意の培養培地を包摂することが意図される。培養培地の非限定的な例は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８、ＫＳＲベースのＭＥＦ馴致培地、およびｍＴＥＳｒである。
「細胞」という用語は、単一の細胞のほか、細胞の集団（すなわち、複数の細胞）も指す。集団は、ニューロン細胞の集団または未分化の胚性細胞の集団など、１つの細胞型を含む純粋な集団でありうる。代替的に、集団は、複数の細胞型、例えば、混合細胞集団を含みうる。単数形の「細胞」の使用は、集団内の細胞の数を限定することを意味せず、例えば、細胞の混合集団は、少なくとも１個の分化細胞を含みうる。
本明細書で使用される場合、「疾患」または「障害」という用語は、ヒトを含む生存動物の正常状態の機能障害であって、生命機能の働きを妨げるまたは改変する機能障害を指す。本開示の文脈では、「疾患」および「障害」という用語は、神経系（すなわち、脳、脊髄、または他の神経）の生化学的または電気的異常を含む、神経学的疾患および障害を指す。本開示のある特定の態様では、神経学的疾患および障害として、ニューロンの構造または機能の進行性の喪失と関連する疾患および障害を含むがこれらに限定されない、神経変性疾患および障害、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、および多発性硬化症（ＭＳ）などが挙げられるが、これらは１つまたは複数の神経変性過程を特徴とする。本開示の他の態様では、神経学的疾患および障害として、例えば、不安障害、双極性障害、統合失調症、神経性無食欲および神経性過食症、自閉症および関連障害などの、気分の変化、現実感の認知異常、人格の変化、および摂食障害と関連する疾患および障害を含むがこれらに限定されない、神経精神疾患および障害が挙げられる。本開示のさらなる態様では、神経学的疾患および障害として、全前脳症または小頭症を含むがこれらに限定されない、神経発達障害が挙げられる。
処置されていない対象と比べて、処置された対象における任意の症状の発現に言及する場合の、「低減させる」、「阻害する」、「減弱させる」、「抑制する」、「減少させる」、「防止する」という用語および文法的同等物（「低度の」、「少量の」などを含む）は、処置された対象における症状の量および／または大きさが、処置されていない対象、任意の医療従事者により臨床的に関連があると認識される任意の量だけ低度であることを意味する。一実施形態では、処置された対象における症状の量および／または大きさは、処置されていない対象における症状の量および／または大きさより少なくとも１０％低度、少なくとも２５％低度、少なくとも５０％低度、少なくとも７５％低度、および／または少なくとも９０％低度である。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、ヒトまたは動物（例えば、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長動物、齧歯動物など）であり、入院している必要はない。例えば、外来患者、自宅療養者は「患者」である。患者は、任意の年齢のヒトまたは非ヒト動物を含むことが可能であり、したがって、成人および若齢者（すなわち、小児）の両方を含む。「患者」という用語は、医療処置を必要とすることを含意するとは意図されず、したがって、患者は、自発的または非自発的に、それが臨床上のものであれ、基礎科学研究の支援のためのものであれ、実験の一部をなし得る。したがって、「対象」という用語と「患者」という用語とは、互換的である。
本明細書で使用される場合、「有機低分子」という用語は、薬科学にいて一般に使用される有機分子と同等のサイズの任意の分子を指す。この用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい有機低分子は、約１０Ｄａ〜約５０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、最も好ましくは最大約１０００Ｄａのサイズの範囲である。
「活性化因子」または「活性化すること」という用語は、本開示の細胞の方向付けられた分化を結果としてもたらす分子を活性化する特性を有する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、結合し、アゴニストが媒介する生化学的応答を遮断するかたまたは減衰させる化合物を指す。本開示の方法への言及において、「アンタゴニスト」とは、結合し、Ｗｎｔシグナル伝達の構成要素であるアゴニストが媒介する生化学的応答を遮断するかたまたは減衰させる化合物を指す。Ｗｎｔアンタゴニストは、受容体に結合するが、正常な生物学的応答を引き起こさない薬剤を含む。したがって、アンタゴニストは、例えば、標的遺伝子の転写を抑制するように、Ｐａｔｃｈｅｄの生体活性を強化または反復させる。本明細書で使用される「Ｗｎｔアンタゴニスト」という用語は、Ｗｎｔタンパク質の正常な機能を直接阻害することにより作用しうる任意の薬剤だけでなく、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し、したがって、Ｗｎｔの機能を反復させる任意の薬剤も指す。Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストの例は、ＸＡＶ９３９（Ｈａｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：６１４〜６２０頁（２００９年））、ビタミンＡ（レチノイン酸）、リチウム、フラボノイド、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１（Ｄｋｋ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）（ＷＯ２００９／１３１１６６）、およびβ−カテニンに対するｓｉＲＮＡを含む。
分子の「誘導体」という用語は、目的の分子と実質的に同様であるかまたは実質的に同一な様式で機能するような、目的の分子と十分に類似する構造を有する分子を指す。例えば、化合物の誘導体は、アシル化、メチル化、アルカリ修飾、酸修飾、および無機塩修飾、酸化、スルホン化、フェノール化、ヒドロキシメチル化、ならびにプロテアーゼ修飾、パパインおよびウレアーゼ修飾、ならびにキモトリプシン修飾を含む酵素修飾法を含む様々な方法により修飾されている可能性がある。例えば、ポリペプチドの誘導体には、１つまたは複数のアミノ酸を変化させた変異体ポリペプチドが含まれうる。
本明細書で使用される場合、「操作された」細胞という用語は、改変体ＮＫＸ２．１をコードする核酸など、所望の核酸が導入された細胞を指すことを意図する。操作された細胞は、導入された核酸を含有しない自然発生の細胞から弁別される。本開示の核酸として、天然の供給源から得られた核酸、化学合成された核酸、または組換え技術の技法により産生された核酸が挙げられる。
皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および／または視索前野コリン作動性ニューロンのマーカーを産生するニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法
本開示は、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、視索前野コリン作動性ニューロンのマーカー１つまたは複数を含むニューロン細胞を含む、ニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法を提供する。本方法は、多能性細胞および／または多分化能細胞を、１つまたは複数のＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップを含み、このニューロン前駆体細胞は、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることにより、このニューロン前駆体細胞を、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、視索前野コリン作動性ニューロンのマーカー１つまたは複数を含むニューロン細胞に分化するように誘導することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、皮質介在ニューロンおよび／または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ニューロン細胞を、多能性細胞または多分化能細胞の分化により発生させ、（ａ）１つもしくは複数の多能性細胞および／または１つもしくは複数の多分化能細胞を、（ｉ）２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、および（ｉｉ）１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、（ｂ）ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、皮質介在ニューロンおよび／または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップとを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本開示は、視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ニューロン細胞を、多能性細胞または多分化能細胞の分化により発生させ、（ａ）１つもしくは複数の多能性細胞および／または１つもしくは複数の多分化能細胞を、（ｉ）２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、および（ｉｉ）１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、（ｂ）ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップとを含む方法を提供する。
さらなる実施形態では、本開示は、視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ニューロン細胞を、多能性細胞および／または多分化能細胞の分化により発生させ、（ａ）１つもしくは複数の多能性細胞および／または１つもしくは複数の多分化能細胞を、（ｉ）２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、および（ｉｉ）１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、（ｂ）ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップとを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、多能性細胞および／または多分化能細胞の、ＳＨＨ活性化因子への曝露であって、異なるニューロン細胞型（すなわち、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、視索前野コリン作動性ニューロン）を産生するための曝露の開始および／または持続期間は、使用される培養培地に応じて重なり合う可能性がある。一部の実施形態では、ＳＭＡＤ／Ｗｎｔ阻害の開始後におけるＳＨＨ活性化の開始を、ＳＭＡＤシグナル阻害剤／Ｗｎｔアンタゴニスト導入の約４〜約２０日後、一般に、約６〜１５日後の間に行って皮質介在ニューロンを産生し得るが、また、ＳＨＨ活性化の開始を、例えば、ＳＭＡＤ／Ｗｎｔ導入の約４〜約８日後に行って視索前野コリン作動性ニューロンを産生し得る。これらの時間的間隔は、培養条件に応じて、とりわけ、使用される培養培地に応じて、ある程度変動する。したがって、視床下部ニューロンを作製する場合、ＳＨＨへの曝露は、ＳＭＡＤ阻害剤／Ｗｎｔアンタゴニストの添加と同時であるかまたはこの直後、あるいはＰａｘ６またはＦｏｘＧ１の発現の前という早期に開始することができる。コリン作動性ニューロンを作製する場合、ＳＨＨは、ＳＭＡＤ／Ｗｎｔ阻害の２日後に開始することもでき、これらのマーカーの発現の３日前まで、または３日後までに開始することもできる。これに対し、介在ニューロンを作製する場合、ＳＨＨへの曝露は、これらのマーカーの発現の少なくとも２日後に開始することができ、これらのマーカーの発現の１０日後までに開始することができ、１４日後でもなお開始することができる。したがって、これらのマーカーの発現は、ＳＨＨへの曝露をいつ始めるのかについての代替的指針として使用することができる。
介在ニューロンまたは視床下部ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロンを作製する場合、ＳＨＨ活性化因子への曝露の持続期間は、５〜約３０日間またはこれより長期であることが可能であり、一般に、約８〜約１６日間の間でありうる。具体的な組合せは、例えば、皮質介在ニューロンでは、ＳＭＡＤ／Ｗｎｔ阻害の８〜１８日後にＳＨＨ活性化因子を開始し、その８〜１６日後または８〜２０日間後に終了する（培地を交換する）を含みうる。視床下部ニューロンでは、ＳＭＡＤ／Ｗｎｔ阻害の１〜４日後にＳＨＨ活性化因子を開始し、その５〜３０日後または８〜１６日間後に終了する。前脳基底部視索前野コリン作動性ニューロンでは、ＳＭＡＤ／Ｗｎｔ阻害の４〜８日後にＳＨＨ活性化因子を開始し、その８〜２４日後に終了する。
ＳＨＨ活性化因子への長期にわたる曝露は一般に、無害である。細胞は、ＳＨＨの存在下で、長期にわたり増殖させることができる。例えば、一般に、ＸＬＳＢパラダイム下では、前脳前駆体細胞のうちの９０％が、２０日後までに、領域的にパターン化される。別の形で述べると、ＳＨＨの存在下における前脳前駆体細胞は、背側皮質投射ニューロンへはパターン化されず、パターン化されなかった前駆細胞は、２０日後までに、無視できるレベルに減弱される。細胞が、任意の系統についてＮＫＸ２．１陽性となったら、ＳＨＨを、培養培地中に残したまま、これらの系統のうちのいずれかの前駆体細胞を増殖させることができる。例えば、介在ニューロン前駆体細胞は、生着または発生もしくは疾患についてのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるモデル化などの使用まで、数カ月間（例えば、２５０〜３００日間またはこれを超える期間）にわたり維持することができる。
ニューロンを、数カ月間など、長期にわたり、外因性因子を用いずに、培養物中で維持することができる。
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達」という用語については、既に定義した。本明細書で開示される通り、ＳＭＡＤおよびＷｎｔシグナル伝達経路は、多能性幹細胞もしくは多分化能幹細胞または多能性前駆細胞もしくは多分化能前駆細胞など、多能性細胞または多分化能細胞の、ニューロン前駆体細胞への分化の媒介において重要であり、ＳＨＨシグナル伝達カスケードは、ニューロン前駆体細胞の、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および／または視索前野コリン作動性（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ）ニューロンのマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞への分化の媒介において重要である。
幹細胞の、前脳ニューロン前駆体細胞への分化
本明細書で開示される通り、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロンは、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子を伴うニューロン前駆体細胞の分化を誘導することにより発生させることができる。前方／前脳運命は、ｈＰＳＣのニューロン分化中におけるデフォルトのプログラムとして特定され得る（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年）；Ｅｉｒａｋｕら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、３巻：５１９〜５３２頁（２００８年）；Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、７７巻：４４０〜４５６頁（２０１３年）；およびＧａｓｐａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４５５巻：３５１〜３５７頁（２００８年））。全ての細胞または細胞系が、神経および前方運命を、同等の効率で成立させるわけではない（Ｋｉｍら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、８巻：６９５〜７０６頁（２０１１年）；およびＷｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０４巻：１３８２１〜１３８２６頁（２００７年））。細胞を分化させることにより分泌されるパターン化因子として、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔ、およびレチノイドが挙げられ、これらの因子は、前脳の誘導を抑制し、これにより、尾側の細胞運命の誘導を誘発しうる。
したがって、本開示の方法は、多分化能および／または多能性細胞を、１つまたは複数のＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストの組合せと接触させることによって、多分化能および／または多能性細胞の分化を誘導することにより、ニューロン前駆体細胞の発生を達成する。
ノギンとＳＢ４３１５４２（ＮＳＢとしてもまた公知である）との組合せを利用して、ＦＯＸＧ１＋／ＰＡＸ６＋前駆体細胞の頑健な誘導を達成する、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールによるｈＥＳＣのニューロン分化が、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年）において記載されている。
本明細書で開示される通り、ＡＬＫ２／３阻害剤（例えば、ＬＤＮ−１９３１８９）とＳＢ４３１５４２（ＬＳＢとしてもまた公知である）との組合せはまた、ＦＯＸＧ１を発現する細胞の百分率の対応する低減を伴うが、ＰＡＸ６発現の誘導において有効である。図１Ｂおよび１Ｃを参照されたい。しかし、ＬＳＢで処理された培養物中のＦＯＸＧ１発現は、例えば、組換えＤＫＫ１および／またはタンキラーゼ阻害剤（すなわち、ＸＡ Ｖ９３９）など、１つまたは複数の強力な標準的Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤を添加することにより、大幅に増強された。図１Ｂ〜１Ｄ；Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：６１４〜６２０頁（２００９年）を参照されたい。さらに、ＸＡＶ９３９が媒介するＦＯＸＧ１発現の誘導は、複数の独立の試験したｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３およびＷＡ−０９）および試験したヒトｉＰＳＣ（Ｃ７２およびＳｅＶ６）にわたり一貫していた（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：１２７５９〜１２７６４頁（２００９年）；およびＫｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））。図１Ｅ。
これらの観察に部分的に基づき、本開示は、多分化能および／または多能性細胞の分化を誘導することにより、ニューロン前駆体細胞を発生させるのに、１つまたは複数のＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤を、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと組み合わせて利用する方法を提供する。本明細書で開示される通り、ＤＫＫ１、ＸＡ Ｖ９３９、ＬＤＮ−１９３１８９、およびＳＢ４３１５４２を含むがこれらに限定されない、ＷｎｔアンタゴニストとＳＭＡＤ阻害剤との多様な組合せの使用により、ヒトＥＳＣおよびヒトｉＰＳＣ系の範囲にわたる、前脳運命の迅速で頑健な誘導が可能となる。
多分化能、多能性、および全能性細胞
本開示の方法は、ある特定の多分化能、多能性、および／または全能性細胞を含む未分化および／または傾倒していない細胞は、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔアンタゴニストの組合せと接触させることにより、ニューロン細胞を発生させるように誘導しうるという観察に部分的に基づく。本開示の一部として、このようなニューロン細胞は、ＳＨＨ活性化因子の性質および濃度の両方のほか、ＳＨＨ活性化因子と接触させる持続期間を含む、接触させるタイミングを含む、適切な条件下で、ニューロン細胞を、ＳＨＨの１つまたは複数の活性化因子と接触させることにより、皮質ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野皮質ニューロンを発生させるようにさらに誘導しうることが発見された。
「全能性」、「多分化能」、「前駆細胞」という用語については、上記で記載した。本開示における前駆細胞は、体細胞に含まれる。前駆細胞は、多分化能細胞である。全能性、多能性、および多分化能細胞は、１つまたは複数の異なる細胞型に分化することが可能な「幹細胞」でありうる。「幹細胞」、「胚性幹細胞」、「人工多能性幹細胞」という用語については、上記で記載した。
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、脳の発達および疾患のモデル化に関与すると考えられる。一般に、ヒト皮質は、２つの異なる種類のニューロン集団である、投射ニューロンおよび局所介在ニューロンを含む。皮質介在ニューロンは、神経伝達物質であるＧＡＢＡを発現する多彩な細胞型のクラスを含む。皮質介在ニューロンの機能不全は、統合失調症、自閉症、およびてんかんを含む神経精神疾患に関与している。
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、ヒトの発生および疾患を研究するために使用されており、再生医療における適用のためにも使用されている。多くの神経変性障害および神経精神障害のための有効な療法、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるニューロン特化を効率的に方向付けるプロトコールの利用可能性の欠如を踏まえ、中枢神経系系統に分化させたｈＰＳＣの使用は特別な関心の対象となっている（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年））。
ｈＰＳＣを使用する初期研究は、パーキンソン病における中脳ドーパミンニューロン（ＰＤ；Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年）；Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１３６巻：９６４〜９７７頁（２００９年）；およびＳｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４６巻：３１８〜３３１頁（２０１１年））、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；Ｄｉｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１巻：１２１８〜１２２１頁（２００８年））および脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ；Ｅｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、４５７巻：２７７〜２８０頁（２００９年））における運動ニューロンなど、特定のニューロン型に影響を及ぼすことが公知の神経変性障害に主に向けたものであった。
より最近の研究は、統合失調症（Ｂｒｅｎｎａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４７３巻：２２１〜２２５頁（２０１１年））または自閉症関連症候群（Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、Ｃｅｌｌ、１４３巻：５２７〜５３９頁（２０１０年）；およびＰａｓｃａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１７巻：１６５７〜１６６２頁（２０１１年））など、複合的な神経障害に取り組むことができる可能性を示唆する。ＰＤ、ＡＬＳ、またはＳＭＡの場合と異なり、統合失調症または自閉症をモデル化するために極めて重要なニューロン型は、それほど十分には規定されておらず、これらの研究では、ニューロン亜型の独自性を方向付けるための試みはなされていない。最近、ヒトＥＳＣ由来の皮質投射ニューロンを導出するためのプロトコールが確立された（Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、７７巻：４４０〜４５６頁（２０１３年）；およびＳｈｉら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１５巻：４７７〜４８６、Ｓ４７１頁（２０１２年））。
しかし、皮質介在ニューロンなどの抑制性ニューロンは、統合失調症または自閉症において役割を果たしうる（Ｉｎｓｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ、４６８巻：１８７〜１９３頁（２０１０年）；およびＬｅｗｉｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６巻：３１２〜３２４頁（２００５年））。既に、Ｌｈｘ６：：ＧＦＰレポーターマウスＥＳＣ細胞系を使用する皮質介在ニューロンの導出は、実証された（Ｍａｒｏｏｆら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３０巻：４６６７〜４６７５頁（２０１０年））。しかし、皮質介在ニューロン発生の効率は低く、これらの条件が、ヒト皮質介在ニューロンをｈＰＳＣから発生させるために適用しうるのかどうかは、不確定であった。ヒト皮質介在ニューロンの発生上の起源は、研究により議論が分かれることから、介在ニューロン特化は、哺乳動物の種間で著しく異なりうることが示唆されるので、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト皮質介在ニューロンの発達のモデル化は、特に興味深い難題である（Ｌｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年）；ならびにＹｕおよびＺｅｃｅｖｉｃ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：２４１３〜２４２０頁（２０１１年））。さらに、複数の皮質介在ニューロン型の、長期間を要するｉｎ ｖｉｖｏにおける発生（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、６７巻：７〜２２頁（１９９５年））は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト細胞を使用するそれらの分化のモデル化について、別の難題を表す。
一部の実施形態では、本開示は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）（例えば、ＷＡ−０９／Ｈ９）の使用に関する。他の一部の実施形態では、本開示は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、ＳｅＶ６、Ｃ７２）の使用に関する。
他の一部の実施形態では、本開示は、成体幹細胞の使用に関する。一部の好ましい実施形態では、成体幹細胞は、ヒト神経幹細胞である。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、神経系の主要な表現型を発生させる自己再生する多分化能細胞である。神経幹細胞は、１つは特化していない娘細胞であり、１つは特化した娘細胞である、２つの娘細胞への非対称性の細胞分裂を起こす。ＮＳＣは主に、ニューロン、星状細胞、および希突起膠細胞に分化する（ＡｌｅｎｚｉおよびＢａｈｋａｌｉ、Ａｆｒｉｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１０巻（８６号）：１９９２９〜４０頁（２０１１年））。
幹細胞間の主要な顕著な差異は、一つには、分化するその能力が限定された成体幹細胞があり、一つには、多能性である胚性幹細胞（ＥＳＣ）がある。ＥＳＣは、特定の細胞運命に限定されておらず、むしろ任意の細胞型に分化する能力を有する（Ｃｌａｒｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８巻（５４７１号）：１６６０〜６３頁（２０００年））。ＥＳＣは、自己複製する能力を有する、胚盤胞の内部細胞塊から導出される（ＡｌｅｎｚｉおよびＢａｈｋａｌｉ、Ａｆｒｉｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１１年））。
神経幹細胞は、分化するそれらの能力が限定されているため、成体幹細胞であると考えられる。ＮＳＣは、成体の生涯全体にわたり、神経発生の過程を介して発生する（Ｐａｓｐａｌａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｉｎｄｉａ、５９巻（４号）：５５８〜６５頁（２０１１年））。ニューロンは、中枢神経系（ＣＮＳ）内では分裂しないので、ＮＳＣは、失われたかもしくは傷害されたニューロン、または多くの場合、グリア細胞をさえ置きかえるように分化しうる。ＮＳＣは、胎芽期胚神経上皮の残存物である側脳室のＳＶＺ内のほか、海馬歯状回内でも、新たなニューロンに分化する。成体ＮＳＣはまず、１９９０年代初頭に、マウス線条体から単離された。成体ＮＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する場合、多分化能ニューロスフェアを形成することが可能である。ニューロスフェアは、自己再生し、増殖する特化細胞を産生しうる。これらのニューロスフェアは、特化ニューロン、グリア細胞、および希突起膠細胞を形成するように分化しうる（Ｐａｓｐａｌａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｉｎｄｉａ、５９巻（４号）：５５８〜６５頁（２０１１年））。培養されたニューロスフェアを、免疫欠損新生仔マウスの脳に移植したところ、生着、増殖、および神経分化を示した。
他の一部の実施形態では、本開示は、前駆細胞の使用に関する。一部の好ましい実施形態では、前駆細胞は、ヒト神経前駆細胞である。成体において、神経幹細胞は、前脳脳室帯内で存続し、様々な、より限局された前駆細胞表現型をもたらす。成体ヒト脳の主要な前駆細胞プールは、脳室帯ニューロン前駆細胞、海馬ニューロン前駆細胞、および脳実質グリア前駆細胞を含む（Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ、２６５巻：６６〜８０頁（２００５年））。これらの表現型の各々は、その常在前駆細胞の有糸分裂活性および派生物の両方を緊密に調節する、局所環境的ニッチ内に存在する。例えば、脳室帯ニューロン前駆細胞は、皮質介在ニューロンにさらに分化しうる。
「ＳＭＡＤ（ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）」の阻害剤
ＳＭＡＤ（ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）とは一般に、幹細胞の方向付けられた細胞分化をモジュレートすることが可能なシグナル伝達分子のクラスを指す。ＳＭＡＤとは、細胞外シグナルを、トランスフォーミング増殖因子ベータリガンドから核に伝達し、核において下流の遺伝子転写を活性化させる細胞内タンパク質であり、幹細胞の方向付けられた分化をモジュレートすることが可能なシグナル伝達分子のクラスのメンバーである。
「阻害剤」という用語については、上記で記載した。
本明細書で開示される方法への言及において、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤は、ＳＭＡＤおよび／もしくはＳＭＡＤと会合する分子、またはＳＭＡＤシグナル伝達の他の構成分子と相互作用し、これらの活性を低減または遮断する化合物を含む。阻害剤は、ＳＭＡＤに直接結合し、ＳＭＡＤにおけるコンフォメーション変化を引き起こすことが可能であり、ＳＭＡＤをコードする遺伝子またはＳＭＡＤ標的遺伝子の発現を低減または防止することが可能であり、ＳＭＡＤタンパク質レベルを減少させることが可能であり、かつ／またはＳＭＡＤの、１つまたは複数のシグナル伝達パートナーとの相互作用に干渉しうる。
阻害剤としてまた、上流のシグナル伝達分子を妨害することにより、ＳＭＡＤの生物学的活性を間接的に調節する分子も挙げられる（例えば、細胞外ドメイン内のものであり、シグナル伝達分子および効果の例は、骨形態形成タンパク質を封鎖するノギン、ＡＬＫ受容体１、２、３、および６の活性化を阻害し、これにより、下流のＳＭＡＤの活性化を防止することを含む。同様に、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎは、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化因子を同様に封鎖する。また、膜貫通タンパク質であるＢａｍｂｉも、細胞外ＴＧＦβシグナル伝達分子を封鎖する偽受容体として作用する。
アクチビン、ｎｏｄａｌ、ＴＧＦβ、およびＢＭＰを遮断する抗体は、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化因子を中和するなどの使用のために企図されている）。したがって、一実施形態では、本開示の阻害剤は、デフォルトから非デフォルト細胞型への分化を誘導する（変更する）、または変化させる、例えば、少なくとも３つの阻害剤を含む本開示の方法のうちの１つにより、非デフォルトの神経前駆細胞が産生された。
本明細書で開示される阻害剤は、細胞の分化を、本明細書で開示されるとおりの皮質介在ニューロンを産生するための非デフォルト細胞型など、本明細書で記載される非デフォルト細胞型に方向付けるために、デフォルトのシグナル伝達を「変化させる」か、または「低下させる」か、または「遮断する」。したがって、本開示の阻害剤は、例えば、本開示の皮質介在ニューロンを産生する一助となるシグナル分子活性を増大または減少させるための、天然または合成の生物学的化合物の場合もあり、低分子の場合もある。
阻害剤は、名指されたシグナル伝達分子の上流の分子に結合し、影響を及ぼし、これが、名指された分子の阻害を引き起こすことにより誘導される阻害に加えて、競合的阻害（活性部位に、別の公知の結合化合物の結合を排除または低減させるように結合する）およびアロステリック阻害（化合物の、そのタンパク質の活性部位に対する結合に干渉するよう、タンパク質に、タンパク質のコンフォメーションを変化させるように結合する）との関連において記載される。
本明細書で開示される方法において利用されると有利でありうるＳＭＡＤ阻害剤は、当業者に周知であり、たやすく入手可能なＳＭＡＤ阻害剤を含む。ヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣの神経細胞変換のために利用されているＳＭＡＤ阻害剤については、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年）において記載されている。
本明細書で開示される方法および組成物において使用されうる、例示的なＳＭＡＤ阻害剤として、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ３６４９４７、Ａ７７−０１、Ａ−８３−０１、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＧＷ６６０４、ＳＢ−５０５１２４、レルデリムマブ、メテリムマブ、ＧＣ−Ｉ００８、ＡＰ−１２００９、ＡＰ−１１０Ｉ４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ−５０５１２４、Ｅ−６１６４５２（ＡＬＫ阻害剤であるＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ−２０８、ＳＭＩ６、ＮＰＣ−３０３４５、Ｋｉ２６８９４、ＳＢ−２０３５８０、ＳＤ−０９３、アクチビン−Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン二塩酸塩と命名された化合物、ならびにこれらの誘導体および／または改変体が挙げられる、これらの各誘導体および／または改変体は、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害活性を保有する。
（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン／Ｎｏｄａｌ経路の阻害剤
ＳＭＡＤシグナル伝達経路の阻害は、ＴＧＦβ／アクチビン／Ｎｏｄａｌ経路およびＢＭＰ経路の阻害を含む。
例示的なＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害剤として、ＴＧＦベータ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、下記に記載される区分は、単に構成上の目的のためのものであり、当業者には、化合物は、経路内の１つまたは複数の点に影響を及ぼす可能性があり、したがって、化合物は、規定された区分のうちの複数において機能しうることが公知である。
ＴＧＦベータ受容体（例えば、ＡＬＫ５）阻害剤として、ＴＧＦベータ受容体（例えば、ＡＬＫ５）に対する抗体、そのドミナントネガティブの改変体、およびその発現を抑制するアンチセンス核酸が挙げられうる。例示的なＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤として、ＳＢ４３１５４２（例えば、Ｉｎｍａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、６２巻（１号）：６５〜７４頁（２００２年）を参照されたい）；３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（例えば、Ｔｏｊｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、９６巻（１１号）：７９１〜８００頁（２００５年）を参照されたい；例えば、Ｔｏｉｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されている）としてもまた公知のＡ−８３−０１；２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｌｔｏｎら、ＷＯ２００８／０９４５９７を参照されたい）、ＢＭＰ４（Ｄａｌｔｏｎ、前出を参照されたい）、ＧＷ７８８３８８（−｛４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−２−イル｝−Ｎ（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）（例えば、Ｇｅｌｌｉｂｅｒｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９巻（７号）：２２１０〜２２２１頁（２００６年）を参照されたい）、ＳＭ１６（例えば、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６７巻（５号）：２３５１〜２３５９頁（２００７年）を参照されたい）、ＩＮ−Ｉ１３０（３−（（５−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（キノキサリン−６−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ベンズアミド）（例えば、Ｋｉｍら、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ、３８巻（３号）：３２５〜３３９頁（２００８年）を参照されたい）、ＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）（例えば、ｄｅ Ｇｏｕｖｉｌｌｅら、Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、１９巻（２号）：８５〜９０頁（２００６年）を参照されたい）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）（例えば、ＤａＣｏｓｔａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、６５巻（３号）：７４４〜７５２頁（２００４年）を参照されたい）、およびピリミジン誘導体（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／００６５８３に列挙されているものを参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。
さらに、「ＡＬＫ５阻害剤」は、非特異的なキナーゼ阻害剤を包摂することを意図しないが、「ＡＬＫ５ １０阻害剤」は、例えば、ＳＢ−４３１５４２など、ＡＬＫ５に加えて、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７を阻害する阻害剤を包摂することが理解されるべきである。例えば、Ｉｎｍａｎら、Ｊ Ｍｏｌ Ｐｈａｍａｃｏｌ、６２巻（１号）：６５〜７４頁（２００２年）を参照されたい。本開示の範囲を限定することを意図しないが、ＡＬＫ５阻害剤は、間葉−上皮転換／移行（ＭＥＴ）過程に影響を及ぼすと考えられる。ＴＧＦβ／アクチビン経路は、上皮−間葉移行（ＥＭＴ）を駆動する。したがって、ＴＧＦβ／アクチビン経路を阻害することにより、ＭＥＴ（すなわち、再プログラム化）過程を促進することができる。
阻害剤の具体例として、ＳＵ５４１６；２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩（ＳＢ−５０５１２４）；レルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍｂ）（ＣＡＴ−１５２）；メテリムマブ（ＣＡＴ−Ｉ９２）；ＧＣ−Ｉ００８；ＩＤ１１；ＡＰ−１２００９；ＡＰ−１１０Ｉ４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ−５０５１２４；ＳＢ−４３１５４２；ＳＤ−２０８；ＳＭＩ６；ＮＰＣ−３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ−２０３５８０；ＳＤ−０９３；Ｇｌｅｅｖｅｃ；３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフラボン（ｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）（Ｍｏｒｉｎ）；アクチビン−Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ；およびＴＧＦベータ受容体をターゲティングする、アンチセンスがトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３巻（１８号）：５２６２〜５２７０頁（２００７年）；Ｋａｍｉｎｓｋａら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ、５２巻（２号）：３２９〜３３７頁（２００５年）；およびＣｈａｎｇら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２巻：４３９３〜４４０１頁（２００７年）を参照されたい。
ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤として、ＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３に対する抗体、そのドミナントネガティブの改変体、およびそれをターゲティングするアンチセンス核酸が挙げられうる。阻害剤の具体例として、ＰＤ１６９３１６；ＳＢ２０３５８０；ＳＢ−４３１５４２；ＬＹ３６４９４７；Ａ７７−０１；および３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフラボン（Ｍｏｒｉｎ）が挙げられる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ、前出；Ｋａｍｉｎｓｋａ、前出；Ｓｈｉｍａｎｕｋｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２６巻：３３１１〜３３２０頁（２００７年）；およびＫａｔａｏｋａら、ＥＰ１９９２３６０を参照されたい）。
ＳＢ−４３１５４２（すなわち、ＣＡＳ：３０１８３６−４１−９；ＩＵＰＡＣ：４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド）とは、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達を低下または遮断することが可能な、市販の低分子ＳＭＡＤ阻害剤である。
ＳＢ４３１５４２の構造を下記に挙げる。
ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤として、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、および／またはＳＭＡＤ４に対する抗体、これらのドミナントネガティブの改変体、およびこれらをターゲティングするアンチセンス核酸が挙げられうる。ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤の具体例として、Ｔｒｘ−ＳＡＲＡ、Ｔｒｘ−ｘＦｏｘＨｌｂ、およびＴｒｘ−Ｌｅｆｌが挙げられるがこれらに限定されない（例えば、Ｃｕｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２４巻：３８６４〜３８７４頁（２００５年）；およびＺｈａｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、１７巻：３８１９〜〜１５ ３８３１頁（２００６年）を参照されたい）。
（ｂ）ＢＭＰ阻害剤
例示的なＢＭＰ経路の阻害剤として、ノギン、ＢＭＰ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ１／５／８とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストが挙げられるがこれらに限定されない。下記に記載される区分は、単に構成上の目的のためのものであり、当業者には、化合物は、経路内の１つまたは複数の点に影響を及ぼす可能性があり、したがって、化合物は、規定された区分のうちの複数において機能しうることが公知である。
ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の阻害剤として、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、またはＳＭＡＤ８に対する抗体、そのドミナントネガティブの改変体、それをターゲティングするアンチセンス核酸および低分子が挙げられるがこれらに限定されない。阻害剤の具体例として、ＬＤＮ−１９３１８９およびドルソモルフィン（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔから市販されている）が挙げられる。
ＢＭＰ受容体阻害剤として、ＢＭＰ受容体に対する抗体、そのドミナントネガティブの改変体、それをターゲティングするｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸または低分子が挙げられるがこれらに限定されない。阻害剤の具体例として、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン二塩酸塩、およびＬＤＮ−１９３１８９（例えば、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている）が挙げられるがこれらに限定されない。
ＬＤＮ１９３１８９（すなわち、ＤＭ−３１８９、ＩＵＰＡＣ：４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノロン）とは、市販の低分子ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤である。ＬＤＮ１９３１８９はまた、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の非常に強力な低分子阻害剤であり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１およびＡＬＫ３ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害し、結果として骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびアクチビンサイトカインシグナル、ならびに後続のＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化を含む、複数の生物学的シグナルの伝達の阻害をもたらす（Ｙｕら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１４巻：１３６３〜１３６９頁（２００８年）；およびＣｔｍｙら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１８巻：４３８８〜４３９２頁（２００８年））。
ＬＤＮ１９３１８９の構造を下記に挙げる。
（ｃ）二重ＳＭＡＤ阻害剤
ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤は、二重ＳＭＡＤ阻害剤であるＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ−１９３１８９、またはこれらの機能的な誘導体および／もしくは改変体を含みうる。本明細書で使用される場合、「ＬＳＢ」および「ＸＬＳＢ」という用語については、既に「定義」節で記載した。二重ＳＭＡＤ阻害剤は、分化の効率を実質的に増大させる。
本開示の方法に従い、ＳＢ４３１５４２を、多能性および／または多分化能細胞と、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中において、約０．１μＭ〜約１ｍＭの最終濃度で接触させることができる。ＬＤＮ−１９３１８９を、多能性および／または多分化能細胞と、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中において、約１ｎＭ〜約１０μＭの最終濃度で接触させることができる。
ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達のアンタゴニスト
「ウィングレス」または「Ｗｎｔ」とは、β−カテニンを伴うかまたは伴わずに媒介される、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体など、ＷｎｔファミリーのリガンドおよびＷｎｔファミリーの受容体から構成されるシグナル経路を指す。Ｗｎｔタンパク質は、腫瘍形成、ならびに細胞運命および胚発生中のパターン化の調節を含む、複数の発生上の過程に関与している。
Ｗｎｔ経路は、Ｗｎｔタンパク質活性の下流または上流のタンパク質のうちのいずれかを含む。例えば、これには、ＬＲＰＳ、ＬＲＰ６、Ｄｋｋ、ＧＳＫ−３、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ３（例えば、Ｗｎｔ３Ａ）、Ｗｎｔ１つまたは本明細書で論じられる他のタンパク質のうちのいずれか、およびこれらのタンパク質をコードする遺伝子が含まれうる。
Ｗｎｔ経路はまた、ＬＲＰＳまたはＨＢＭ経路、Ｄｋｋ経路、ｐ−カテニン経路、ＭＡＰＫＡＰＫ２経路、ＯＰＧ／ＲＡＮＫ経路など、Ｗｎｔの下流の経路も含む。「ＬＲＰ５経路」および「ＩＢＭ経路」とは、ＬＲＰ５またはＨＢＭ変異体およびＬＲＰＳまたはＨＢＭ変異体の下流のタンパク質を含む、任意のタンパク質／遺伝子を意味する。「β−カテニン経路」とは、β−カテニンおよびβ−カテニンの下流のタンパク質を含む、任意のタンパク質／遺伝子を意味する。「ＭＡＰＫＡＰＫ２経路」とは、ＭＡＰＫＡＰＫ２およびＭＡＰＫＡＰＫ２の下流のタンパク質を含む、任意のタンパク質／遺伝子を意味する。「ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ経路」とは、ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬならびにＯＰＧおよびＲＡＮＫＬの下流のタンパク質を含む、任意のタンパク質／遺伝子を意味する。「Ｄｋｋ経路」とは、Ｗｎｔ経路の一部である、Ｄｋｋ−１とＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用に関与する任意のタンパク質／遺伝子を含むことを意図する。Ｄｋｋ−１は、ＬＲＰ５活性を阻害する。
本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語については、既に記載した。本明細書で使用される場合、「Ｗｎｔアンタゴニスト」という用語は、Ｗｎｔタンパク質の正常な機能を直接阻害することにより作用しうる任意の薬剤だけでなく、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し、したがって、Ｗｎｔの機能を反復する任意の薬剤も指す。Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストの例として、ＸＡＶ９３９（Ｈａｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：６１４〜６２０頁（２００９年））、ビタミンＡ（レチノイン酸）、リチウム、フラボノイド、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１（Ｄｋｋ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）（ＷＯ２００９／１３１１６６）、およびβ−カテニンに対するｓｉＲＮＡが挙げられる。
例示的なＷｎｔアンタゴニストとして、ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ−２、ＤＫＫ１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質１）、およびＩＷＲ１が挙げられるがこれらに限定されない。さらなるＷｎｔ阻害剤として、ＩＷＲ化合物、ＩＷＰ化合物、ならびにＷＯ０９１５５００１およびＣｈｅｎら、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、５巻：１００〜７頁（２００９年）において記載されている他のＷｎｔ阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。
ＸＡＶ９３９とは、タンキラーゼ（ＴＮＫＳ）１および２の強力な低分子阻害剤であり、それぞれ、１１および４ｎＭのＩＣ５０値を有する（Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：６１４〜６２０頁（２００９年））。ＴＮＫＳ活性を阻害することにより、ＸＡＶ９３９は、アキシン−ＧＳＫ３β複合体のタンパク質レベルを上昇させ、ＳＷ４８０細胞内のβ−カテニンの分解を促進する。公知のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストとしてまた、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質、分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）、Ｗｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ−１）、およびＳｏｇｇｙも挙げられる。Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質ファミリー（Ｄｋｋ−１〜Ｄｋｋ−４）のメンバーは、リンカー領域により隔てられた、２つのシステインリッチドメインを有する分泌型タンパク質である。Ｄｋｋ−３およびＤｋｋ−４はまた、１つのプロキネチシンドメインも有する。Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３、およびＤｋｋ−４は、ＬＲＰ５／６に結合し、ＬＲＰ５／６の、Ｗｎｔ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ複合体との相互作用を防止することにより、標準的なＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストとして機能する。Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３、およびＤｋｋ−４はまた、細胞表面のＫｒｅｍｅｎ−１つまたはＫｒｅｍｅｎ−２にも結合し、ＬＲＰ５／６の内部化を促進する。Ｄｋｋ−３のアンタゴニスト活性は、実証されていない。Ｄｋｋタンパク質は、成体組織および胚組織において異なる発現パターンを有し、組織の発達および形態発生に対して広範にわたる影響を及ぼす。
Ｄｋｋファミリーはまた、Ｄｋｋ−３と相同であるが、他のファミリーメンバーとは相同でないＳｏｇｇｙも含む。ｓＦＲＰとは、膜結合型Ｆｒｉｚｚｌｅｄに類似する５つのＷｎｔ結合糖タンパク質のファミリーである。Ｗｎｔ阻害剤の最大のファミリーであるｓＦＲＰは、ｓＦＲＰ１、ｓＦＲＰ２、およびｓＦＲＰ５からなる第１の群と、ｓＦＲＰ３およびｓＦＲＰ４を含む第２の群との２つの群を含有する。ｓＦＲＰはいずれも、分泌型であり、固有の遺伝子に由来し、いずれも、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリーの選択的スプライシング形態ではない。各ｓＦＲＰは、Ｎ末端システインリッチドメイン（ＣＲＯ）を含有する。他のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストとして、Ｗｎｔタンパク質に結合し、それらの活性を阻害する分泌型タンパク質である、ＷＩＦ−１（Ｗｎｔ阻害因子１）が挙げられる。
一部の実施形態では、本開示は、ＳＭＡＤおよびＷｎｔシグナル伝達経路の阻害剤および／またはアンタゴニストに関する。ＳＭＡＤ阻害剤として、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ３６４９４７、Ａ７７−０１、Ａ−８３−０１、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＧＷ６６０４、ＳＢ−５０５１２４、レルデリムマブ、メテリムマブ、ＧＣ−Ｉ００８、ＡＰ−１２００９、ＡＰ−１１０Ｉ４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−４３１５４２、ＳＤ−２０８、ＳＭＩ６、ＮＰＣ−３０３４５、Ｋｉ２６８９４、ＳＢ−２０３５８０、ＳＤ−０９３、アクチビン−Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン二塩酸塩、およびこれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。Ｗｎｔアンタゴニストとして、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ＳＦＲＰ−１、ＳＦＲＰ−２、ＳＦＲＰ−５、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４、ＷＩＦ−１、Ｓｏｇｇｙ、ＩＷＰ−２、ＩＷＲ１、およびこれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
これらの方法の一部の態様では、ＳＢ４３１５４２とＬＤＮ１９３１８９とを組み合わせて使用して、ＳＭＡＤシグナル伝達経路を阻害することができる。他の態様では、ＸＡＶ９３９を利用して、Ｗｎｔシグナル伝達経路をアンタゴナイズすることができる。
これらの方法の他の態様では、細胞培養物中のＸＡＶ９３９の濃度は、約０．２μＭ〜２０μＭであることが可能であり、細胞培養物中のＬＤＮ１９３１８９の濃度は、約１０ｎＭ〜約１０００ｎＭであることが可能であり、細胞培養物中のＳＢ４３１５４２の濃度は、約１μＭ〜約１００μＭであることが可能である。例えば、ＸＡＶ９３９の濃度は、約２μＭであることが可能であり、ＬＤＮ１９３１８９の濃度は、約１００ｎＭであることが可能であり、ＳＢ４３１５４２の濃度は、約１０μＭであることが可能である。
これらの方法のさらなる態様では、幹細胞を、ＸＡＶ９３９、ＬＤＮ１９３１８９、および／またはＳＢ４３１５４２と、約５日間〜約４０日間の持続期間にわたり接触させることにより、前脳前駆細胞を発生させる。関連する態様では、幹細胞を、ＸＡＶ９３９、ＬＤＮ１９３１８９、および／またはＳＢ４３１５４２と、約１０日間〜約２５日間の持続期間にわたり接触させることにより、前脳前駆細胞を発生させる。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のさらなる態様では、Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストは、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３、Ｄｋｋ−４、ＳＦＲＰ−１、ＳＦＲＰ−２、ＳＦＲＰ−５、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４、ＷＩＦ−１、Ｓｏｇｇｙ、ＩＷＰ−２、ＩＷＲ１、ＩＣＧ−００１、ＫＹ０２１１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＬＧＫ９７４、ＩＷＰ−Ｌ６、ならびにこれらの誘導体および／または改変体からなる群から選択することができ、これらの各誘導体および／または改変体は、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニスト活性を保有する。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストは、ＸＡＶ９３９またはその機能的な誘導体および／もしくは改変体を含みうる。ＸＡＶ９３９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中で、約１０ｎＭ〜約５００μＭの最終濃度において、多能性および／または多分化能細胞と接触させることができる。
ＫＳＲ培地、ＮａＨＣＯ３、Ｎ２Ｂサプリメント（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＮ２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、ならびにＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）およびＮ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含む、様々な細胞培養培地およびサプリメントを使用して、幹細胞を、前脳前駆細胞へと分化させることができる（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））。一部の実施形態では、既に記載されている通り、細胞を、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で維持し、分化のためのＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または継代培養のためのＤｉｓｐａｓｅで解離させる（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年））。
皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および／または視索前野コリン作動性ニューロンのマーカーを産生するニューロン細胞を発生させるように方向付けられた分化
本明細書では、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および／または視索前野コリン作動性ニューロンのマーカー１つまたは複数を含むニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法が提供される。ニューロン前駆体細胞は、多能性細胞または多分化能細胞を、１つまたは複数のＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、多能性細胞または多分化能細胞の分化を誘導して、ニューロン前駆体細胞を発生させることにより発生させ、次いで、これらを、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、視索前野コリン作動性ニューロン、またはこれらの前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導することができる。
ソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｇ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（ＳＨＨ）活性化因子
ＳＨＨシグナル伝達経路は、細胞運命の決定、組織化の再構築、極性、形態、増殖、および分化を含む胚発生中の多様な過程の調節と関連する（ＢｅｒｔｒａｎｄおよびＤａｈｍａｎｅ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１６巻：５９７〜６０５頁（２００６年））。ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）とは、ヘッジホッグと呼ばれる、哺乳動物のシグナル伝達経路ファミリー内の３つのタンパク質のうちの１つであり、他のものは、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）およびデザートヘッジホッグ（ＤＨＨ）である。ＳＨＨシグナル伝達経路は、２つの膜貫通タンパク質である、Ｐｔｃ（Ｐａｔｃｈｅｄ）およびＳｍｏ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）を伴う。ＳＨＨの非存在下では、Ｐｔｃは、Ｓｍｏと相互作用し、これを阻害する。ＳＨＨがＰｔｃに結合すると、Ｐｔｃの、Ｓｍｏとの相互作用が変化し、Ｓｍｏがもはや阻害されなくなり、Ｃｉ／Ｇｌｉタンパク質の核への移入、および標的遺伝子のための転写活性化因子としての作用がもたらされる。それがＳＨＨが媒介するシグナル伝達経路を増強するのであれば、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化因子へと特定の限定が付与されることはない。
本明細書で使用される場合、「ソニックヘッジホッグ」または「ＳＨＨ」という用語については、「定義」節で既に記載した。
高用量のＳＨＨによる、ｈＥＳＣの処理は、ＤＫＫ１の誘導を阻害し、これにより、フロアプレート様細胞の発生を促進することにより、ＦＯＸＧ１などの前脳マーカーを抑制することが報告されている（Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））。しかし、皮質介在ニューロンの発生は、ＮＫＸ２．１＋前駆細胞段階における、強力なＳＨＨの活性化を要求する。Ｘｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２４巻：２６１２〜２６２２頁（２００４年）；およびＸｕら、Ｎｅｕｒｏｎ、６５巻：３２８〜３４０頁（２０１０年）を参照されたい。
腹側前脳前駆細胞集団の転写因子マーカーであるＮＫＸ２．１を使用して、分化をモニタリングすることができる（Ｓｕｓｓｅｌら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２６巻：３３５９〜３３７０頁（１９９９年）；およびＸｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２４巻：２６１２〜２６２２頁（２００４年））。本開示の一部として、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害により、ＦＯＸＧ１の産生が増強され、その後、制御された、ＳＨＨが媒介する多分化能および多能性細胞の、ＮＫＸ２．１＋前脳前駆細胞運命への分化を誘導することにより、腹側化が促進されることが発見された。図１Ａを参照されたい。腹側運命の誘導は、ＸＡＶ９３９、ＬＤＮ−１９３１８９、ＳＢ４３１５４２（ＸＬＳＢ）、およびＳＨＨの組合せを使用することによりさらに特徴付けられた。図１Ａを参照されたい。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰノックインレポーターｈＥＳＣ細胞系を使用して、組換えＳＨＨ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃ−２５ＩＩ）および／またはプルモルファミンによるＳＨＨ経路の活性化後における分化１０日目までに、ＧＦＰの誘導を観察した（図１Ｆ；Ｇｏｕｌｂｕｍら、２０１１年）。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの最大の誘導は、１μＭのプルモルファミンと、５ｎＭのＳＨＨとの組合せによる処理後の分化１８日目において観察された。図１Ｇ。
ｈＥＳＣ由来のフロアプレート細胞の導出についての先行研究は、ＳＨＨによる早期処理（例えば、分化１日目における）は、ＦＯＸＡ２の効率的な誘導を結果としてもたらすことを示唆した（Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））。しかし、本明細書で提示されるデータは、細胞をＳＨＨと、分化後期で（例えば、分化１０日目において）接触させることにより、ＦＡＣＳにより測定される場合、頑健なＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ発現が誘導されることを実証している。図１Ｈ。したがって、本明細書で開示される通り、ＳＨＨと組み合わせたＸＬＳＢにより、ＮＫＸ２．１＋前駆細胞の発生が、高効率で誘導されることが発見された。
ＤＫＫ１など、Ｗｎｔ阻害分子の使用は、マウスおよびヒトＥＳＣの分化中において終脳前駆細胞および視神経前駆細胞を発生させるために、既に提起されている（Ｌａｍｂａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０３巻：１２７６９〜１２７７４頁（２００６年）；Ｍｅｙｅｒら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２９巻：１２０６〜１２１８頁（２０１１年）；およびＷａｔａｎａｂｅら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、８巻：２８８〜２９６頁（２００５年））。また、１つまたは複数のＳＨＨ活性化因子は、前脳の誘導を増強しうることも示されている。例えば、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールを使用して、前脳の誘導を増強するために、ＳＨＨ活性化因子であるＸＡＶ９３９（タンキラーゼ阻害剤）で、組換えＤＫＫ１を置きかえることができる（Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：６１４〜６２０頁（２００９年））。
ＳＨＨは、ｈＥＳＣ由来の神経上皮前駆細胞が、中型有棘線条体投射ニューロンを発生させることが可能なＧＳＸ２陽性でＮＫＸ２．１陰性の前駆細胞へと分化することを誘導するＳＨＨ濃度を使用することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける腹側前脳特化をモジュレートしうることが報告されている（Ｍａら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、１０巻：４５５〜４６４頁（２０１２年））。ＳＨＨ用量に加えて、ＳＨＨ処理のタイミングが、ｈＥＳＣベースのフロアプレートの形成と比べて、腹側細胞運命特化の効率に影響を及ぼすこともさらに報告された（Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））。
これらの観察に部分的に基づき、本開示は、ニューロン細胞、特に、皮質介在ニューロンおよびその前駆体細胞、視床下部ニューロンおよびその前駆体細胞、ならびに視索前野コリン作動性ニューロンおよびその前駆体細胞を発生させるための方法を提供する。本開示のこれらの態様によれば、このようなニューロン細胞系統および集団の発生は、本明細書で開示される通りに発生させたニューロン前駆体細胞などのニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と、多分化能および／または多能性細胞を、１つまたは複数のＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させた後の所定の時点において、皮質介在ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー１つもしくは複数、視床下部ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー１つもしくは複数、および／または視索前野コリン作動性ニューロンもしくはその前駆体細胞のマーカー１つもしくは複数の産生を誘導するのに十分な持続期間にわたり接触させることにより達成される。
本明細書で使用される場合、「活性化因子」または「活性化すること」という用語については、「定義」節で既に記載した。より具体的に、かつ、本開示の方法への言及において、「活性化因子」という用語は、ＳＨＨシグナル伝達を促進および／または増強し、これにより、ニューロン前駆体細胞を、皮質介在ニューロンもしくはその前駆体細胞、視床下部ニューロンもしくはその前駆体細胞、および／または視索前野コリン作動性ニューロンもしくはその前駆体細胞へと分化するように誘導する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「ＳＨＨシグナル伝達経路活性化因子」という用語については、「定義」節で既に記載した。本開示で有用なＳＨＨシグナル伝達経路活性化因子の例として、ヘッジホッグファミリーに属するタンパク質（例えば、ＳＨＨ）、Ｐｔｃの、Ｓｍｏとの相互作用の阻害剤、Ｓｍｏ受容体の活性化因子、Ｓｈｈ受容体の活性化因子（例えば、Ｈｇ−Ａｇ、プルモルファミンなど）、Ｃｉ／Ｇｌｉファミリーのレベルを上昇させる物質、Ｃｉ／Ｇｌｉ因子の細胞内分解の阻害剤、およびトランスフェクションからもたらされるＳＨＨ過剰発現構築物またはＣｉ／Ｇｌｉ過剰発現構築物が挙げられる。
本方法の一部の態様では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＳＨＨ＋プルモルファミン）を、培養の全持続期間または部分的持続期間にわたり細胞培養物へと添加する。一部の実施形態では、細胞培養物中のＳＨＨ活性化因子の濃度は、ＳＨＨ（または組換えＳＨＨ）について、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０００ｎｇ／ｍＬであり、プルモルファミンについて約０．１μＭ〜約２０μＭである。一部の好ましい実施形態では、細胞培養物中のＳＨＨ活性化因子の濃度は、ＳＨＨ（または組換えＳＨＨ）について、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬであり、プルモルファミンについて約０．５μＭ〜約４μＭである。
プルモルファミンとは、名称が９−シクロヘキシル−Ｎ−［４−（モルホリニル）フェニル］−２−（１−ナフタレニルオキシ）−９Ｈ−プリン−６−アミンであり、化学式がＣ３１Ｈ３２Ｎ６Ｏ２である、市販の低分子である。プルモルファミンの構造を下記に挙げる。プルモルファミンは、ヘッジホッグシグナル伝達経路の７回膜貫通Ｓｍｏ受容体に結合し、これを活性化する。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のなおさらなる態様では、ＳＨＨシグナル伝達活性化因子は、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）、ＳＡＧ類似体、ＳＨＨ、Ｃ２５−ＳＨＨ、Ｃ２４−ＳＨＨ、プルモルファミン、Ｈｇ−Ａｇ、ならびにこれらの誘導体および／または改変体からなる群から選択することができ、これらの各誘導体および／または改変体は、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害活性を保有する。例えば、ＳＨＨシグナル伝達活性化因子は、組換えＳＨＨおよびプルモルファミンまたはこれらの機能的な誘導体および／もしくは改変体を含みうる。組換えＳＨＨは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中で、約５ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの最終濃度において、多能性および／または多分化能細胞と接触させることができる。プルモルファミンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中で、約０．１μＭ〜約２０μＭの最終濃度において、多能性および／または多分化能細胞と接触させることができる。
本明細書で提示されるデータは、ＳＨＨによる分化の活性化のタイミングの差異が、前方−後方独自性が多様な異なる腹側前駆細胞の発生を誘発するのに肝要であることを実証している。視床下部原基のマーカーを発現させるｈＥＳＣ由来の前駆細胞の導出における、ＳＨＨシグナル伝達の早期の活性化は、ＦＧＦ−８の存在を必要とする（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））。これに対し、本明細書で記載される一部の実施形態では、ＦＧＦ−８の添加が、視床下部前駆細胞運命を方向付けるのに必要でないことが実証される。
ニューロン前駆体細胞を、ニューロン前駆体細胞を発生させた後、ならびに／または多能性および／または多分化能細胞を、１つもしくは複数のＳＭＡＤ阻害剤および／または１つもしくは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させた後における、所定の期間にわたる継代培養の後で、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることができる。例えば、ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、多能性細胞および／または多分化能細胞を、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させた、約４日後〜約２０日後または約８日後〜約１８日後に開始することができる。ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、約５日間〜約３０日間、または約８日間〜約１６日間の期間にわたりうる。
皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロンのマーカー
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「細胞マーカー」という用語については、「定義」節で既に記載されており、特定の細胞または細胞型を識別する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞のマーカーは、１つのマーカーに限定されなくてもよい。マーカーとは、指定されたマーカー群により、細胞または細胞型を、別の細胞または細胞型から識別しうるような、マーカーの「パターン」を指す場合がある。例えば、本開示の前脳細胞は、前脳細胞を弁別する、１つまたは複数のマーカー、すなわち、ＦＯＸＡ２陽性およびＮＫＸ２．１陽性を発現させる。本明細書で使用される場合、「前脳（ｆｏｒｅｂｒａｉｎ）」または「前脳（ｐｒｏｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）」という用語については、「定義」節で既に記載されており、脳の最吻側（最前方）部分を指し、中枢神経系（ＣＮＳ）の初期発生の間における、脳の１つの主要部分である。前脳は、間脳（腹側視床、視床、視床下部、視床腹部、視床上部、および視蓋前域）と終脳（大脳）とに分かれる。
皮質介在ニューロンおよび／または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカーについては記載されており、当業者にたやすく入手可能であり、例えば、ＳＳＴ、ＰＶ、ＧＡＢＡ、カルビンディン、ＬＨＸ６、ＲＡＸ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＧ１、ＯＬＩＧ２、ＭＡＳＨ１、ＮＫＸ６．２、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１、ＤＬＸ２、ＡＳＣＬ１、およびＣｈＡＴが挙げられる。
他の実施形態では、本開示は、視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ニューロン細胞を、多能性細胞または多分化能細胞の分化により発生させ、（ａ）１つもしくは複数の多能性細胞および／または１つもしくは複数の多分化能細胞を、（ｉ）２つまたはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤、および（ｉｉ）１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、（ｂ）ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップとを含む方法を提供する。
視床下部ニューロンおよび／または視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン前駆体細胞は、ニューロン前駆体細胞の成熟に助力する条件に晒すことができる。例えば、ニューロン前駆体細胞を、ニューロン前駆体細胞を発生させた後、ならびに／または多能性および／または多分化能細胞を、１つもしくは複数のＳＭＡＤ阻害剤および／または１つもしくは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させた後における、所定の期間にわたる継代培養の後で、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることができる。他の一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるニューロン細胞の成熟を加速するように胚性マウス皮質細胞を使用して、皮質フィーダー環境を創出した。
ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、例えば、多能性細胞および／または多分化能細胞を、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞を産生するステップの、約１日後〜約４日後に開始することができる。ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、約５日間〜約３０日間、または約８日間〜約２０日間の期間にわたりうる。
視床下部ニューロンおよび視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカーについては記載されており、当業者にたやすく入手可能であり、ＮＧＦＩ−Ｂ、ｃ−ｆｏｓ、ＣＲＦ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＲＡＸ、ＰＯＭＣ、ヒポクレチン、およびＮＡＤＰＨが挙げられる。
さらなる実施形態では、本開示は、視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生するニューロン細胞を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ニューロン細胞を、多能性細胞および／または多分化能細胞の分化により発生させ、（ａ）１つもしくは複数の多能性細胞および／または１つもしくは複数の多分化能細胞を、（ｉ）２つまたはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤、および（ｉｉ）１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞の発生を誘導するステップと、（ｂ）ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させ、これにより、ニューロン前駆体細胞内で、視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数の産生を誘導するステップとを含む方法を提供する。
視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカーを産生するニューロン前駆体細胞は、ニューロン前駆体細胞の成熟に助力する条件に晒すことができる。
ニューロン前駆体細胞を、ニューロン前駆体細胞を発生させた後、ならびに／または多能性および／または多分化能細胞を、２つもしくはそれより多くのＳＭＡＤ阻害剤および／または１つもしくは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させた後における、所定の期間にわたる継代培養の後で、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させることができる。
ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、多能性細胞および／または多分化能細胞を、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤および１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させて、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞を産生するステップの、約４日後〜約８日後に開始することができる。ニューロン前駆体細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、約５日間〜約３０日間、または約８日間〜約２４日間の期間にわたりうる。
視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカーは公知であり、当業者にたやすく入手可能である。このような視索前野コリン作動性ニューロンおよび／または視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカーとして、例えば、ＣｈＡＴ、ＮＧＦ、Ａｃｈ、ＶＡＣｈＴ、ＬＨＸ８、Ｉｓｌ１、およびｐ７５が挙げられる。
多能性細胞および／または多分化能細胞は、ヒト細胞の場合もあり、マウス細胞の場合もあり、胚性幹細胞、成体幹細胞、神経幹細胞、人工多能性細胞、操作多能性細胞、初代前駆細胞、誘導前駆細胞、および操作前駆細胞からなる群から選択しうることが理解される。
ＳＭＡＤ阻害剤と接触させるステップおよび／またはＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストと接触させるステップは、同時に実行することもでき、逐次的に実行することもできる。接触は、約５日間〜約３０日間の持続期間にわたりうる。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のなおさらなる態様では、ニューロン前駆体細胞は、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＬＨＸ６、ＬＨＸ８、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ５、ＤＬＸ６、ＳＯＸ６、ＭＡＦＢ、ＮＰＡＳ１、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、およびＮＫＸ６．２からなる群から選択される、１つまたは複数のマーカーを含む。
これらの３つの実施形態のうちのいずれかによる方法のなおさらなる態様では、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達アンタゴニスト、および／または１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップは、マウス皮質錐体ニューロン、例えば、マウスＥＳＣから導出されるマウス皮質錐体ニューロンなどのフィーダー細胞の存在下で実行することができる。
一部の実施形態では、本開示による方法を使用して、皮質介在ニューロンおよびそれらの前駆細胞を含む様々な細胞を、当技術分野の最新技術で得ることができない量および純度で産生することができる。一部の実施形態で、本開示の方法を使用することにより得られた、多数の純粋で機能的な皮質介在ニューロンを使用して、統合失調症または自閉症、および他の神経学的疾患について研究することができる。同様に、これらの細胞はまた、薬物スクリーニングおよび細胞療法においても使用することができる。
腹側前駆体細胞を発生させるための方法
ある特定の実施形態では、本開示は、腹側前駆細胞を発生させるための方法であって、細胞を、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）などの腹側化因子へと曝露するステップを含む方法を提供する。代替的に、細胞は、Ｓｈｈを模倣する薬剤またはＳＨＨのアゴニストに曝露される。
本開示の一部の実施形態では、ＳＨＨ経路の活性化を、ＳＭＡＤおよびＷｎｔの阻害を開始した少なくとも８日後かつ最大で１８日後に開始して、皮質介在ニューロンまたはそれらの前駆体細胞を産生する。一部の実施形態では、ＳＨＨ経路の活性化は、その開始の約５日後〜約３０日後に終了する。一部の実施形態では、ＳＨＨ活性化因子は、培養細胞へと、約３０日間〜約６０日間というより長い持続期間にわたり添加することができる。一部の好ましい実施形態では、ＳＨＨ経路の活性化を、ＳＭＡＤおよびＷｎｔの阻害を開始した約８日後〜約１８日後の間に開始し、その開始の約８日後〜約１６日後の間に終了して、皮質介在ニューロンまたはそれらの前駆体細胞を産生する。
本開示の他の一部の実施形態では、ＳＨＨ経路の活性化を、ＳＭＡＤおよびＷｎｔの阻害を開始した少なくとも１日後かつ最大で４日後に開始して、視床下部ニューロンまたはそれらの前駆体細胞を産生する。一部の実施形態では、ＳＨＨ経路の活性化は、その開始の約５日後〜約３０日後に終了する。一部の実施形態では、ＳＨＨ活性化因子は、培養細胞へと、約３０日間〜約６０日間というより長い持続期間にわたり添加することができる。一部の好ましい実施形態では、ＳＨＨ経路の活性化を、ＳＭＡＤおよびＷｎｔの阻害を開始した約１日後〜約４日後の間に開始し、その開始の約８日後〜約２０日後の間に終了して、視床下部ニューロンまたはそれらの前駆体細胞を産生する。
本開示の他の一部の実施形態では、ＳＨＨ経路の活性化を、ＳＭＡＤおよびＷｎｔの阻害を開始した少なくとも４日後かつ最大で１０日後までに開始して、視索前野コリン作動性ニューロンまたはそれらの前駆体細胞を産生する。一部の実施形態では、ＳＨＨ経路の活性化は、その開始の約５日後〜約３０日後に終了するが、より長期にわたり維持することもできる。一部の実施形態では、ＳＨＨ活性化因子は、培養細胞へと、約３０日間〜約６０日間というより長い持続期間にわたり添加することができる。一部の実施形態では、ＳＨＨ経路の活性化を、ＳＭＡＤおよびＷｎｔの阻害を開始した約４日後〜約８日後の間に開始し、その開始の約８日後〜約２４日後の間に終了して、視索前野コリン作動性ニューロンまたはそれらの前駆体細胞を産生する。
本開示の一部の実施形態では、単離した細胞集団を、未成熟介在ニューロン前駆体細胞へと分化させた後で、精製および濃縮した未成熟介在ニューロン前駆体細胞の集団を回収する。この回収手順は、未成熟介在ニューロン前駆体細胞内だけで機能し、他の細胞型内では機能しないエンハンサー／プロモーターを活用するプロモーターベースの分離手順により実行することが好ましい。
本開示で記載される方法により産生した皮質介在ニューロンの独自性は、細胞の分子シグネチャーおよび形態シグネチャーにより確認することができる。ＳＳＴ、ＰＶ、ＧＡＢＡ、カルビンディン、ＬＨＸ６、ＲＡＸ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＧ１、ＯＬＩＧ２、ＭＡＳＨ１、ＮＫＸ６．２、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１、ＤＬＸ２、ＡＳＣＬ１、ＣｈＡＴ、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、皮質介在ニューロンおよびそれらの前駆体細胞のいくつかの分子マーカーが記載されている。ＷｏｎｄｅｒｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、７巻：６８７〜６９６頁（２００６年）を参照されたい。
本開示で記載される方法により産生した視床下部ニューロンの独自性は、細胞の分子シグネチャーおよび形態シグネチャーにより確認することができる。ＮＧＦＩ−Ｂ、ｃ−ｆｏｓ、ＣＲＦ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＲＡＸ、ＰＯＭＣ、ヒポクレチン、ＮＡＤＰＨ、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、視床下部ニューロンおよびそれらの前駆体細胞のいくつかの分子マーカーが記載されている（Ｃｈｅｎｇ ＭＦ、Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２０１３年８月、３４巻（３号）：１６７〜７８頁を参照されたい）。
本開示で記載される方法により産生した視索前野コリン作動性ニューロンの独自性は、細胞の分子シグネチャーおよび形態シグネチャーにより確認することができる。ＣｈＡＴ、ＮＧＦ、Ａｃｈ、ＶＡＣｈＴ（Ｂｒｕｅｌ−Ｊｕｎｇｅｒｍａｎ Ｅら、Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、２０１１年８月１０日；２２１巻（２号）：３７９〜８８頁を参照されたい）、ＬＨＸ８、Ｉｓｌ１、ｐ７５、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、視索前野コリン作動性ニューロンおよびそれらの前駆細胞のいくつかの分子マーカーが記載されている。
ＮＫＸ２．１前駆体細胞のニューロン分化および遊走特性
神経節隆起に由来する皮質介在ニューロンは、皮質回路内の興奮と抑制との平衡化に関与しうる。加えて、皮質介在ニューロンはまた、発生上の可塑性の制御においても役割を果たし、てんかんから自閉症および統合失調症の範囲にわたる多様な病態において機能不全性となりうる（Ｂａｒａｂａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：１５４７２〜１５４７７頁（２００９年）；Ｅａｇｌｅｓｏｎら、Ａｕｔｉｓｍ Ｒｅｓ、４巻：６８〜８３頁（２０１１年）；Ｉｎｓｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ、４６８巻：１８７〜１９３頁（２０１０年）；Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６巻：３１２〜３２４頁（２００５年）；およびＰｅｎａｇａｒｉｋａｎｏら、Ｃｅｌｌ、１４７巻：２３５〜２４６頁（２０１１年））。
本明細書で提示されるデータは、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理前駆体細胞は、マウスの発生中において皮質介在ニューロン前駆細胞ドメインの部分をマーキングすることが公知の転写因子であって、ＯＬＩＧ２、ＭＡＳＨ１、およびＮＫＸ６．２を含む転写因子の多くを発現させることを示唆する。分化１８日目におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ細胞の大半は、ネスチンおよびＫｉ６７の発現により示す場合、前駆細胞の特性を呈示する。しかし、外因性のＳＨＨ活性化の非存在下で培養を長期化させたところ、循環ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ細胞は、徐々に減少した（図４Ａ〜４Ｃ、上パネル）。例えば、Ｋｉ６７の比率の減少は、ニューロン前駆体細胞マーカーであるＤＣＸおよびＴＵＪ１を発現する細胞の百分率の増大と並行した（図４Ａ〜４Ｃ、下パネル）。
加えて、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群および分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群におけるＧＦＰ＋細胞の多くは、ＧＡＢＡを発現し、接線方向に遊走する皮質介在ニューロン前駆体細胞ならびに他の集団のマーカーである（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：４７４〜４７６頁（１９９７年））、カルビンディン発現の時間依存的増大を示す（図４Ａ〜４Ｃ、下パネル）。
分化３２日目におけるウェスタンブロット解析により、マウスにおける有糸分裂後の遊走性の皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカーであるＬＨＸ６タンパク質が、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群において、選択的に濃縮されることが示されたことは、重要なことである。これに対し、視床下部マーカーであるＲＡＸは、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群において、選択的に濃縮された（図４Ｄ）。
さらなる免疫細胞化学データは、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋前駆細胞に由来する大半のニューロン前駆細胞におけるＤＬＸ２およびＡＳＣＬ１の発現を示した（図４Ｅ〜４Ｇ）。これらのデータは、外因性のＳＨＨシグナル伝達活性化因子を中止した後において、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋前駆細胞は、皮質介在ニューロンの前駆体細胞を含む、領域特異的な有糸分裂後ニューロンをもたらすことを示唆する。
また、ヒトＥＳＣ由来の推定皮質介在ニューロン前駆体細胞（例えば、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群）が、マウス脳（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：４７４〜４７６頁（１９９７年））内およびヒト脳（Ｌｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年））内の初代皮質介在ニューロンについて観察された、以前に観察された特徴的な遊走能力を呈示するのかどうかも関心の対象であった。いずれの種においても、皮質介在ニューロンの主要なサブクラスは、腹側終脳から皮質へと分化しながら、接線方向の遊走を起こすと考えられる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：４７４〜４７６頁（１９９７年）；Ｆｅｒｔｕｚｉｎｈｏｓら、Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ、１９巻（９号）：２１９６〜２２０７頁（２００９年）；およびＬｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年））。
ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞を、分化３２日目において、ＦＡＣＳにより回収し、胚生１３．５日目のマウス胚から単離した前脳薄片へと注射した。細胞の注射は、顕微鏡による視覚的誘導下で、内側神経節隆起を注意深く標的とした（図４Ｈ）。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の遊走能力およびそれらの皮質に到達する能力（図４Ｈの帯域２を参照されたい）を、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群、分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群、および分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群の間で比較した（図４Ｉ〜４Ｌ）。
ＧＦＰ＋細胞が、２日目において、注射部位から皮質（帯域２）へと遊走し、注射後６日目において、より顕著となることを観察した（それぞれ、図４Ｍおよび４Ｎ）。分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群に由来するヒト細胞は、マウス薄片の新皮質部分への遊走の頑健な傾向を示したが、他の２つの処理群に由来するヒト細胞は、これを示さなかった（図４Ｉ〜４Ｎ）ことは、注目すべきことである。これらのデータは、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理細胞が、初代マウスＭＧＥ由来の介在ニューロン前駆体細胞について以前に記載された遊走特性を呈示することを示唆する（Ｌａｖｄａｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９巻：７８８１〜７８８８頁（１９９９年）；Ｓｕｓｓｅｌら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２６巻：３３５９〜３３７０頁（１９９９年）；およびＷｉｃｈｔｅｒｌｅら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２巻：４６１〜４６６頁（１９９９年））。
分化１０〜１８日目処理細胞と対比した分化２〜１８日目ＳＨＨ処理細胞の遊走能力は、ＦＡＣＳで単離したＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞を、新生仔の遺伝子的免疫不全マウスの新皮質へと移植することにより決定した。移植の４週間後において、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理細胞は、マウス皮質内の放射面および接平面のいずれにおいても、広範な遊走を示した（図４Ｏおよび４Ｐ）。同様の結果は、成体皮質への移植時にも得られたが、３０日目までの、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の全般的遊走は、新生仔への移植と比較して、それほど広範ではなかった（図５）。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける介在ニューロン前駆体細胞の成熟の程度を決定するために、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群を使用して、形態的外見および移植された細胞内の介在ニューロン関連マーカーの発現を評価した（図５Ｃ）。新生仔マウス皮質への移植の１および２カ月後のいずれにおいても、大半のヒト細胞は、二極性または単極性形態を伴う未分化の外見を呈示し、ＮＫＸ２．１を発現し続けた。さらに、多極性形態を伴う移植細胞を含む本質的に全ての移植細胞が、ニューロン前駆体細胞マーカーであるＤＣＸを発現した。移植されたヒト介在ニューロン前駆体細胞のうちの大多数が、ＧＡＢＡを発現した（例えば、４６／５１のＧＦＰ＋細胞が、切片表面で観察可能である）。これに対し、ＮＫＸ２．１系統の介在ニューロンの主要なサブクラスにおいて検出される２つのタンパク質である、パルブアルブミン（ＰＶ）またはソマトスタチン（ＳＳＴ）についての共標識は存在しなかった。この結果は、移植の６週間後までであっても、ＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋細胞が、成熟介在ニューロンへとまだ分化していないことを示す。
開示される方法の機構を理解することは必要でないが、マウス宿主皮質における移植されたＧＦＰ＋細胞の分化の見かけの欠如は、マウス皮質介在ニューロン内で生じる場合、ＮＫＸ２．１が、成熟後に下方調節され（Ｍａｒｉｎら、Ｊ Ｓｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０巻：６０６３〜６０７６頁（２０００年））、より分化した細胞によるＧＦＰ発現の喪失が結果としてもたらされるためでありうることが考えられる。例えば、切片が、ヒト特異的な汎ニューロンマーカーであるＳＣ１２１の発現について試験された（Ｋｅｌｌｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０１巻：１１８３９〜１１８４４頁（２００４年））。予測される通り、全てのＧＦＰ＋細胞はまた、ＳＣ１２１も発現した（図６）。しかし、移植の６週間後においてもなお、ＳＣ１２１を発現するが、ＧＦＰを発現しないヒト細胞は、１０％未満であった（すなわち、例えば、２つの６週間移植物からカウントしたＧＦＰ＋細胞３７２個のうち２５個）。まとめると、ヒト介在ニューロン前駆体細胞の、長期間を要する、ｉｎ ｖｉｖｏにおける成熟のペースに従う傾向におそらく起因して、移植研究は、移植の最初の２カ月以内では、成熟介在ニューロンの分化を結果としてもたらさなかった。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける皮質介在ニューロンの表現型成熟およびシナプス成熟
皮質介在ニューロン発生については、マウス胚ＭＧＥ由来の前駆細胞を、主にマウス皮質錐体ニューロンおよびグリアから構成される「フィーダー培養物」上に播種した共培養系を使用して研究されている（Ｘｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２４巻：２６１２〜２６２２頁（２００４年））。ヒト介在ニューロンの成熟の態様が、この系では、異種移植片と比べて加速されるのかどうかを決定するために、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞を、分化３２日目において、ＦＡＣＳにより回収し、解離させたマウス胚皮質の培養物上に再播種した（図７Ａ）。皮質細胞は、腹側由来の皮質介在ニューロンの背側新皮質への遊走の前の段階である、胚生１３．５日目のマウス胚から単離した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：４７４〜４７６頁（１９９７年））。
したがって、この共培養系は、グルタミン酸作動性皮質錐体ニューロンの存在下で発達しつつある、ヒトＮＫＸ２．１＋細胞による正常な発達の態様を模倣する。研究は、３つのＳＨＨ処理レジメンの各々から導出したＧＦＰ＋細胞を使用して、並行して実施した（図７Ｂ〜７Ｅ）。
ｉｎ ｖｉｖｏ研究とは対照的に、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群に由来するＧＦＰ＋細胞（「視床下部様」）のうちの４０％および分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群に由来するＧＦＰ＋細胞のうちの１５％と対比して、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群に由来するＧＦＰ＋細胞（「ＭＧＥ様」）のうちのおよそ８０％が、ＧＡＢＡを発現したことは、注目すべきことである。さらに、分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群は、終脳（ＦＯＸＧ１＋）細胞およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）において濃縮されたが、介在ニューロン前駆体細胞のＬＨＸ６において濃縮されなかった（図４Ｄを参照されたい）。
分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理細胞に由来するＧＦＰ＋細胞は、分化６〜１８日目ＳＨＨ処理細胞と比べて、ＧＡＢＡニューロンについて濃縮された。これらの細胞が、ＧＡＢＡ作動性シナプス伝達を起こすニューロンをもたらすのかどうかを決定することが関心の対象であった。識別したＧＦＰ＋細胞についての全細胞パッチクランプによる電気生理学的研究は、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理細胞および分化６〜１８日目ＳＨＨ処理細胞のいずれにおいても、自発的発火を示した（図７Ｆ〜７Ｋ）。しかし、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるビククリンに応答して、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の発火率のモジュレーションを示したのは、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群だけであった（図７Ｊ）。皮質フィーダー細胞は、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群および分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群のいずれにおいても、極めて少数のマウス介在ニューロンを含有したに過ぎないので、これらの結果は、ｈＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンが、抑制性シナプスの出力を媒介することを示す。したがって、ＧＡＢＡ作動性ニューロンがより希少である分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群では、ビククリン曝露後における発火率は、不変のままであった（それぞれ、図７Ｃおよび図７Ｋ）。
分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群を使用して発生させたＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞へのシナプス入力についてさらに解析するために、自発的シナプス後電流および抑制性または興奮性シナプスマーカーの局在化について解析した。マウス皮質フィーダー細胞上で３０日間にわたり培養したＧＦＰ＋細胞は、ＧＡＢＡ作動性シナプスのシナプス前終末内に存在する、高レベルの小胞ＧＡＢＡトランスポーター（ＶＧＡＴ）を発現した。ＧＦＰ＋細胞内のＶＧＡＴの細胞内局在は、ＧＡＢＡ作動性シナプス後マーカーであるゲフィリンの発現に緊密に合致した（図８Ａ〜８Ｅ）。
全細胞パッチクランプ解析により、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞は、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるビククリンを添加することにより可逆的に遮断される、自発性抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）を受容することが実証された（図８Ｆ）。ＧＦＰ＋推定樹状突起に隣接した、小胞グルタミン酸トランスポーター１（ＶＧＬＵＴ１）の発現、およびシナプス後興奮性シナプスマーカーであるＰＳＤ−９５との共標識の存在により実証される通り、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞は、抑制性入力に加えて、興奮性入力もまた受容する（図８Ｇ〜８Ｋ）。
自発性興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）がまた、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ニューロンにおいてたやすく検出された（図８Ｌ）ことは、グルタミン酸作動性シナプス入力の存在と符合する。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞における自発的シナプス活性についてのより詳細な解析も提供する（図９；表２Ａおよび２Ｂ）。
皮質介在ニューロンは、皮質の発達および機能において異なる役割を有する、ニューロン型の多彩なセットを含む（Ｂａｔｉｓｔａ−Ｂｒｉｔｏら、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ、８７巻：８１〜１１８頁（２００９年））。このマウス皮質フィーダー系における比較的急速な成熟のペースにより、他のより成熟した介在ニューロンマーカーの共発現について評価し、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞におけるＧＡＢＡおよびＣｈＡＴ以外の神経伝達物質表現型を規定することが可能となる。
例えば、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群では、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現するＧＦＰ＋細胞が大きな百分率で観察された（図１２Ａ）。これらのデータは、多くのＮＫＸ２．１系統の視床下部ニューロンのドーパミン作動性の性質と符合する（Ｙｅｅら、Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ、５１７巻：３７〜５０頁（２００９年））。ｎＮＯＳおよびカルビンディンについての免疫組織化学は、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群に由来するＧＦＰ＋細胞における、高百分率のｎＮＯＳ細胞を示した一方、高百分率のカルビンディン＋ニューロンが、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群において存在した（それぞれ、図１２Ｂおよび１２Ｃ）。また、ＳＳＴおよびＰＶを含む分化した皮質介在ニューロンに特徴的な他のマーカーも発現した（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。また、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰと共に共発現された各亜群マーカーも同定した（図１２Ｆ〜１２Ｊ）。ＶＩＰおよびカルレチニンは、これらのニューロン培養物中では発現されなかった。これらのデータは、マウスの発生中における尾側神経節隆起などの特徴を呈示する細胞の欠如を示唆する（Ｘｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２４巻：２６１２〜２６２２頁（２００４年））。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける皮質介在ニューロンにおいてこのマーカーの発現が、発生上後期の発現であることを踏まえると、ＮＫＸ２．１＋ＩＰＶ＋の導出は、特に注目すべきことであった（Ｚｅｃｅｖｉｃら、Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、７１巻：１８〜３３頁（２０１１年））。自動式画像解析（例えば、Ｏｐｅｒｅｔｔａ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔスキャナーを使用）によりＧＦＰ＋ＩＰＶ＋としてカウントされた細胞のサブセットだけが、高レベルのＰＶ発現を示し、介在ニューロン様形態を呈示した（全ＧＦＰ＋細胞のうちの約５％（図１２Ｊ））。開示の機構を理解することは必要でないものの、選択的な皮質介在ニューロン亜型の導出のさらなる最適化は有用であると考えられるが、データは、マウス胚皮質ニューロンを使用する、本明細書で開示される共培養戦略が、ｈＰＳＣ由来の介在ニューロン（例えば、ＰＶ＋ｈＰＳＣ由来ニューロン）における亜型特異的な神経化学マーカーの発現を促進させる効果的なプラットフォームをもたらすことを実証している。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＫＸ２．１−ＧＦＰ＋推定介在ニューロン前駆体細胞の成熟が長期間を要することを踏まえると、共培養物系において、介在ニューロン様分化の形態的証拠、マーカーベースの証拠、および生理学的証拠を得ることは、驚くべきことである。ヒト皮質投射ニューロンについて濃縮された培養物上で増殖させた同じＧＦＰ＋細胞もまた、成熟の加速を示すのかどうかを決定するために、ＦＡＣＳで精製したＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞を、ヒト皮質ニューロンと対比してマウス皮質ニューロン上で、並行して共培養した。
ヒト皮質フィーダーは、ｈＥＳＣを分化させた（例えば、改変ＸＬＳＢ条件）後で、ＣＤ４４−／ＣＤ１８４＋／ＣＤ２４＋ニューロンについてのＦＡＣＳを行って得た（Ｙｕａｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、６巻：７５４０頁（２０１１年））（図１０Ａ〜１０Ｄ）。ｈＥＳＣ由来ニューロンの皮質独自性を、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、およびＳＡＴＢ２の発現により確認したところ、極めて少数のＧＦＡＰ＋細胞またはネスチン＋細胞しか存在しなかった（図１０Ｅ〜１０Ｔ）。
ヒト皮質フィーダー上に播種したＮＫＸ２．１＋細胞の電気生理学的成熟と対比して、マウス皮質フィーダー上に播種したＮＫＸ２．１＋細胞の電気生理学的成熟では、記録が、マウスフィーダー条件について１４〜１６ ＤＩＶ、２０〜３０ ＤＩＶのいずれかにおいて得たものであろうと、ヒト皮質フィーダー条件について２０〜３０ ＤＩＶにおいて得たものであろうと、一貫した差異が観察された（表２Ａおよび２Ｂ）。マウス皮質フィーダー細胞上に播種した、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群および分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群のいずれについての基本的な電気生理学的特性の解析も、分化のより後期時点において、より成熟した特徴を示した。時間と共に、静止膜電位（ＲＭＰ）の有意な過分極、ならびに入力抵抗の減少が見られた。加えて、立ち上がり時間および半値幅の減少により証拠立てられる通り、活動電位は速く狭くなった。これに対し、ヒト皮質フィーダー細胞上の２０〜３０ ＤＩＶに記録された、１０〜１８日目ＳＨＨ処理群に由来するＧＦＰ＋ニューロンは、マウス皮質フィーダー細胞上に播種した、より若齢の１４〜１６ ＤＩＶニューロンにおいて見られた測定値と同等の、比較的未成熟な特徴を保持した。例えば、ヒト皮質フィーダー細胞を使用した場合の分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理細胞内のＲＭＰ、活動電位の立ち上がり時間、活動電位の半値幅、および入力抵抗は、同じＤＩＶ範囲で記録された場合のマウス皮質フィーダー細胞と比較した場合に、有意に異なった。多様な条件下における定性的発火特性を示す試料出力波形を収集した（図１１）。
これらのデータは、機能的な成熟のペースが、局所環境の影響を受けることを示唆する。機構に依存せずに、これらのデータは、本明細書で記載される、マウス皮質細胞フィーダー共培養条件が、機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を実施するのに適切なｈＥＳＣ由来の皮質介在ニューロンの効率的な成熟を可能とすることを実証する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで発生させた、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロンを含む組成物
さらなる実施形態では、本開示は、皮質介在ニューロン細胞および／または皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生する１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞が、（ａ）多分化能細胞または多能性細胞を、２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｂ）多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップ、（ｃ）多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグＷｎｔシグナル伝達ナル伝達活性化因子と接触させるステップにより産生されている、組成物を提供する。
本明細書で開示される組成物は、２つまたはそれより多くの細胞の混合物であって、皮質介在ニューロンが、細胞総数のうちの少なくとも約３０％、または細胞総数のうちの少なくとも約４０％、または細胞総数のうちの少なくとも約５０％、または細胞総数のうちの少なくとも約６０％、または細胞総数のうちの少なくとも約７０％、または細胞総数のうちの少なくとも約８０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９５％を占める混合物を含みうる。
組成物は、２つまたはそれより多くの細胞の混合物であって、ＮＫＸ２．１＋／ＰＶ＋皮質介在ニューロンが、組成物中の細胞総数のうちの少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％を占める混合物を含みうる。
組成物は、２つまたはそれより多くの細胞の混合物であって、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）作動性抑制性介在ニューロンが、組成物中の皮質介在ニューロンの総数のうちの少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％を占める混合物を含みうる。
関連する実施形態では、本開示は、視床下部ニューロンまたは視床下部ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生する１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含む組成物であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞が、（ａ）多分化能細胞または多能性細胞を、２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｂ）多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｃ）多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップにより産生されている、組成物を提供する。
組成物は、２つまたはそれより多くの細胞の混合物であって、視床下部ニューロンが、細胞総数のうちの少なくとも約３０％、または細胞総数のうちの少なくとも約４０％、または細胞総数のうちの少なくとも約５０％、または細胞総数のうちの少なくとも約６０％、または細胞総数のうちの少なくとも約７０％、または細胞総数のうちの少なくとも約８０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９５％を占める混合物を含みうる。
組成物は、視索前野コリン作動性ニューロンまたは視索前野コリン作動性ニューロン前駆体細胞のマーカー１つまたは複数を産生する１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞であり、（ａ）多分化能細胞または多能性細胞を、２つまたはそれより多くのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｂ）多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＷｎｔシグナル伝達阻害剤と接触させるステップ、（ｃ）多分化能細胞または多能性細胞を、１つまたは複数のＳＨＨシグナル伝達活性化因子と接触させるステップにより産生されている、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたニューロン細胞を含みうる。
組成物は、２つまたはそれより多くの細胞の混合物であって、視索前野コリン作動性ニューロンが、細胞総数のうちの少なくとも約３０％、または細胞総数のうちの少なくとも約４０％、または細胞総数のうちの少なくとも約５０％、または細胞総数のうちの少なくとも約６０％、または細胞総数のうちの少なくとも約７０％、または細胞総数のうちの少なくとも約８０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９０％、または細胞総数のうちの少なくとも約９５％を占める混合物を含みうる。
皮質介在ニューロンまたは介在ニューロン前駆体細胞は、例えば、ＣＴ−２または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など、検出マーカーを発現するトランス遺伝子で改変されていてもよい。これらの検出マーカーは、本開示のこの態様から逸脱することなく、他の検出マーカーと互換しうることが理解される。
本発明の皮質介在ニューロン前駆体細胞は、成熟介在ニューロンの形態的特性、神経化学的特性、および電気生理学的特性を呈示する機能的介在ニューロンをもたらす。未成熟介在ニューロン前駆体細胞調製物は、それらのｉｎ ｖｉｖｏにおけるニューロン環境を模倣する制御された培養条件下で（例えば、本明細書の実施例で記載される通り、フィーダー細胞の存在下で培養される）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて成熟しうる。代替的に、未成熟介在ニューロン前駆体細胞は、移植され、哺乳動物対象（例えば、ヒト対象）の大脳皮質内に遊走した後に成熟する。本明細書で実証される通り、本発明の未成熟介在ニューロン前駆体細胞は、大脳皮質へと移植されると、非放射状に（すなわち、接線方向に）広範に遊走する。遊走する際に、皮質介在ニューロン前駆体細胞は、急速スパイキング活動電位の放電パターンを呈示する、パルブアルブミンおよびＫｖ３．１を発現する介在ニューロンへと成熟する。代替的に、本発明の皮質介在ニューロン前駆体細胞は、ソマトスタチンを発現する介在ニューロンに成熟し、これは、介在ニューロンのこの亜群の、特徴的なリバンウンド発火パターン、順応性発火パターン、急速でないスパイキング発火パターンを呈示する。これらの、ソマトスタチンを発現する介在ニューロンは、神経ペプチドＹをさらに発現しうる。
皮質介在ニューロン前駆体細胞は、約−４０ｍＶ〜約−７０ｍＶの平均静止膜電位を有する介在ニューロンへと成熟する。時間と共に、平均静止膜電位は、約−５５ｍＶ〜約−７０ｍＶの範囲でより過分極化する。
障害および疾患を処置するための方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ニューロン細胞の、幹細胞または前駆細胞からの導出は、著明な臨床的含意を有し、また、疾患のモデル化および薬物スクリーニングのためにも重要である。本発明のこの方法に従う処置のために適切な状態として、てんかんまたは乳児けいれんなどの発作障害；自閉症、統合失調症、不安障害、および摂食障害などの神経精神障害；全前脳症または小頭症などの神経発達障害；ならびにパーキンソン病が挙げられるが、これらに限定されない。ｈＰＳＣを使用した初期研究は、パーキンソン病における中脳ドーパミンニューロン（ＰＤ；Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年）；Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１３６巻：９６４〜９７７頁（２００９年）；およびＳｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４６巻：３１８〜３３１頁（２０１１年））、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；Ｄｉｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１巻：１２１８〜１２２１頁（２００８年））および脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ；Ｅｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、４５７巻：２７７〜２８０頁（２００９年））における運動ニューロンなど、特定のニューロン型に影響を及ぼすことが公知の神経変性障害に主に向けたものであった。より最近の研究では、統合失調症（Ｂｒｅｎｎａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４７３巻：２２１〜２２５頁（２０１１年））または自閉症関連症候群（Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、Ｃｅｌｌ、１４３巻：５２７〜５３９頁（２０１０年）；およびＰａｓｃａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１７巻：１６５７〜１６６２頁（２０１１年））など、複合的な神経障害に取り組むことができる可能性が示唆される。
本開示の細胞は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｇａｇｅらによる、米国特許第５，０８２，６７０号および同第５，６５０，１４８号；ならびにＪｏｈｅらによる、米国特許公開第２００６０１４１６２２号において記載されている通りに、脳実質内移植または脳室内移植を介して送達することができる。脳実質内移植は、未成熟介在ニューロン前駆体細胞を、宿主脳実質内に注射することにより達成することもでき、外科手段によって空隙を用意して宿主脳実質を露出させ、次いで、細胞移植片を、空隙へと留置することにより達成することもできる。いずれの方法も、移植時に、移植された細胞と宿主脳組織との脳実質内並置をもたらし、いずれも、移植片と宿主脳組織との間の解剖学的統合を促進する。代替的に、移植片は、脳室内、例えば、大脳脳室内または硬膜下、例えば、宿主脳の表面上であって、介在する軟膜またはくも膜および軟膜により宿主脳実質から隔てられている表面上に配置することもできる。脳室への移植は、ドナー細胞の注射により達成することもでき、細胞を、３０％のコラーゲンなどの基材中で増殖させて、固形組織のプラグを形成し、次いで、これを、脳室へと植え込んで、移植片の転位を防止することにより達成することもできる。硬膜下移植のためには、硬膜内にスリットを設けた後で、脳の表面付近に細胞を注射することができる。移植片が、宿主脳の不可欠の一部となり、宿主の生涯にわたり存続することが要求される場合、これは、重要である。
生存問題にかかわらず、本開示で記載されるニューロン細胞および前駆体細胞の移植は、それらのｉｎ ｖｉｖｏにおける成熟の後で研究されうる多数の細胞の移植の成功を結果としてもたらす。
神経変性障害および疾患を処置するための方法
ある特定の実施形態では、本開示は、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）を含む神経変性と関連する障害および疾患を処置するための方法であって、本明細書で開示される方法により発生させた皮質介在ニューロンを、ＰＤまたはＡＤに罹患した患者へｉｎ ｖｉｖｏにおいて投与するステップを含む、方法を提供する。
本明細書で記載される分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群データのＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋前駆細胞におけるコリン作動性ニューロンの主要な分化は、認知機能の喪失と関連する障害のモデル化および処置のための基盤を提供する。例えば、アルツハイマー病では、前脳基底部コリン作動性ニューロンは、疾患の初期において、ニューロンの中で最も損傷を受けやすい（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１５巻：１２３７〜１２３９頁（１９８２年））。
ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰレポーターｈＥＳＣの使用により、６日目またはこれより後にＳＨＨ処理を開始する場合の、分化プロトコールの最適化、およびほぼ全てのｈＥＳＣ後代細胞の、ＦＯＸＧ１＋１ＮＫＸ２．１＋腹側前脳運命への効率的な変換が可能となった（Ｇｏｕｌｂｕｒｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２９巻：４６２〜４７３頁（２０１１年））。皮質介在ニューロンの前駆体細胞の遊走能力のために、本開示は、単独の、または成熟皮質介在ニューロンの投与と組み合わせた、皮質介在ニューロン前駆体細胞の投与による治療的利点を企図する。
本明細書で提示されるデータは、ｈＥＳＣ由来の腹側前脳前駆細胞およびＣＳ１５ヒト前脳組織における、ＦＯＸＡ２のヒト特異的な発現を含む、ヒト前脳の発生とマウス前脳の発生との間の複数の差異を明らかにした。理論により束縛されることを望むわけではないが、一過性のＦＯＸＡ２発現は、ヒト発生中においてＳＨＨシグナル伝達が長期的に必要とされることと関連しうると考えられる。したがって、ヒトにおける長期間を要する前脳の発生、およびヒトとマウスとの間の脳サイズの差異は、ＳＨＨ依存性前駆細胞の長期にわたる増殖に依存しうる。
皮質介在ニューロンの発生における種特異的な差異が報告されており、これは妊娠中期におけるヒト胎児皮質内のＡＳＣＬ１＋細胞の存在に部分的に基づく（Ｌｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年））。したがって、多くの、またはさらに大半の、ヒト皮質介在ニューロンが、皮質自体の中で発生すると考えられる（Ｌｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年））。これに対し、マウスにおける研究により、全てではないが大半のマウス皮質介在ニューロンは、皮質下領域に由来することが実証されている。Ｆｏｇａｒｔｙら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２７巻：１０９３５〜１０９４６頁（２００７年）；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３０巻：１５８２〜１５９４頁（２０１０年）；およびＸｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２４巻：２６１２〜２６２２頁（２００４年）。
本開示の一部として、ＮＫＸ２．１の発現は、ＣＳ１５ヒト胚の腹側前脳内および背側前脳内に限局されることが裏付けられた。さらに、本明細書で提示されるデータは、ｈＥＳＣ由来の皮質介在ニューロン前駆体細胞が、接線方向の遊走能を呈示することを裏付ける。
マウス皮質介在ニューロン前駆体細胞とは対照的に、本開示の一部として、ｈＥＳＣ由来の皮質介在ニューロンは、ＮＫＸ２．１を持続的に発現させることが発見された（Ｍａｒｉｎら、Ｊ Ｓｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０巻：６０６３〜６０７６頁（２０００年））。これらのデータは、ヒト新皮質におけるｉｎ ｖｉｖｏの知見であって、有糸分裂後ＮＫＸ２．１＋ニューロンの存在を明らかにした知見と符合する（Ｆｅｒｔｕｚｉｎｈｏｓら、Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ、１９巻（９号）：２１９６〜２２０７頁（２００９年））。しかし、線条体介在ニューロンは、ＮＫＸ２．１の発現を保持しながら、マウスにおける皮質介在ニューロンのマーカーを共有するので、本明細書で提示されるデータは、本発明者らによるヒトＥＳＣ由来細胞のサブセットが、線条体介在ニューロンに対応する可能性を排除しない（Ｍａｒｉｎら、Ｊ Ｓｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０巻：６０６３〜６０７６頁（２０００年））。
精神障害および疾患を処置するための方法
他の実施形態では、本開示は、例えば、統合失調症および自閉症関連障害を含む、精神障害および疾患を処置するための方法を提供する。
ＰＤ、ＡＬＳ、またはＳＭＡの場合と異なり、統合失調症または自閉症をモデル化するために極めて重要なニューロン型は、それほど十分には規定されておらず、これらの研究では、ニューロン亜型の独自性を方向付けるための試みもなされていない。ヒトＥＳＣ由来の皮質投射ニューロンを導出するためのプロトコールの確立において、最近大きな進歩がなされている（Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、７７巻：４４０〜４５６頁（２０１３年）；およびＳｈｉら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１５巻：４７７〜４８６、Ｓ４７１頁（２０１２年））。
しかし、皮質介在ニューロンなどの抑制性ニューロンは、統合失調症または自閉症において特に重要な役割を果たしうる（Ｉｎｓｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ、４６８巻：１８７〜１９３頁（２０１０年）；およびＬｅｗｉｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６巻：３１２〜３２４頁（２００５年））。本発明者らは依然に、Ｌｈｘ６：：ＧＦＰレポーターマウスＥＳＣ細胞系を使用する皮質介在ニューロンの導出を実証した（Ｍａｒｏｏｆら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３０巻：４６６７〜４６７５頁（２０１０年））。しかし、皮質介在ニューロン発生の効率は低く、これらの条件を、ヒト皮質介在ニューロンをＰＳＣから発生させるために適用しうるのかどうかは、不確定であった。ヒト皮質介在ニューロンの発生上の起源は、研究により議論が分かれることから、介在ニューロン特化は、哺乳動物の種間で著しく異なりうることが示唆されるので、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト皮質介在ニューロンの発生のモデル化は、特に興味深い難題である（Ｌｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年）；ならびにＹｕおよびＺｅｃｅｖｉｃ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：２４１３〜２４２０頁（２０１１年））。さらに、複数の皮質介在ニューロン型の、長期間を要するｉｎ ｖｉｖｏにおける発生（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、６７巻：７〜２２頁（１９９５年））は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト細胞を使用するそれらの分化のモデル化について、別の難題を表す。
ヒト精神疾患をモデル化および処置するための現在のパラダイムは、患者特異的なｉＰＳＣ由来ニューロンを利用する（Ｂｒｅｎｎａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４７３巻：２２１〜２２５頁（２０１１年）；Ｃｈｅｕｎｇら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２０巻：２１０３〜２１１５頁（２０１１年）；Ｃｈｉａｎｇら、Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１６巻：３５８〜３６０頁（２０１１年）；Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、Ｃｅｌｌ、１４３巻：５２７〜５３９頁（２０１０年）；およびＰａｓｃａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１７巻：１６５７〜１６６２頁（２０１１年））。しかし、これらの公表された研究は、ニューロン亜型の独自性が不明であり、亜型特異的なシナプス特性および機能的特性の特徴付けが限定的である、混合神経細胞培養物中で実施された。統合失調症における介在ニューロン関連Ｅｒｂｂ４受容体など、遺伝子欠損を、精神障害と連関させようとする試みでは、死後知見の集約が利用されている（Ｆａｚｚａｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：１３７６〜１３８０頁（２０１０年））。
本明細書で開示される通り、本開示は、ヒト精神障害および疾患についてのモデルとして使用することが可能であり、このような精神障害および疾患を処置するための治療レジメンにおいても使用されうる成熟皮質介在ニューロンの精製された集団を提供する。さらに、本明細書で提示されるデータは、発生上の合図に対してのタイミングを計った曝露の後における、皮質介在ニューロンの非常に効率の高い導出が可能であることを実証する。
理論により束縛されることを望まないが、推定ｈＥＳＣ由来ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、他のヒト介在ニューロンおよび興奮性マウス投射ニューロンからのシナプス入力を受容すると考えられる。皮質介在ニューロンの神経化学特性を呈示する細胞は、マウス皮質培養物上に播種して３０日以内に、かなり成熟した生理学的特性を成立させる。マウス皮質培養物上におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ニューロンの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける成熟の加速機構は現在のところ知られていないが、本明細書で提示されるデータからは、種特異的なタイミング因子の関与が導出される。本明細書で開示されるデータは、シナプスが活性な皮質介在ニューロンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて導出することができ、統合失調症および自閉症を含むがこれらに限定されない精神障害における皮質介在ニューロン病態をモデル化および処置するために有用でありうることをさらに実証する。
統合失調症におけるＰＶ介在ニューロンの機能不全の含意を踏まえると、これらの培養物における、ｈＥＳＣ由来のＰＶを発現するニューロンの発生、およびスパイキングが比較的急速な非適応型ニューロンの存在は、特に興味深い（ＢｅａｓｌｅｙおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ Ｒｅｓ、２４巻：３４９〜３５５頁（１９９７年）；ならびにＷｏｏら、Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１５４巻：１０１３〜１０１５頁（１９９７年））。急速スパイキングＰＶ＋皮質介在ニューロンは、霊長動物の出生前発生の後期において観察され、成年初期まで成熟し続ける（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、６７巻：７〜２２頁（１９９５年）；およびＩｎｓｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ、４６８巻：１８７〜１９３頁（２０１０年））。多様な病態下におけるＰＶ＋ニューロンの役割を踏まえると、本明細書で提示されるデータは、このような機能不全性ニューロン状態のモデル化、ならびに皮質介在ニューロンおよび／またはその前駆体細胞の投与によるこれらの機能不全性ニューロン状態の処置を支援する。
したがって、これらの実施形態のある特定の態様では、本開示は、ソマトスタチン＋およびＰＶ＋細胞などの濃縮された皮質介在ニューロン亜群の発生を提供する。ＭＧＥ前駆細胞は、ＳＨＨシグナル伝達の制御下にある可能性があり、ＳＨＨシグナル伝達レベルが高ければ、ソマトスタチン＋細胞の発生を促進し、ＳＨＨシグナル伝達レベルがより低ければ、ＰＶ＋ニューロンの発生を促進する（Ｘｕら、Ｎｅｕｒｏｎ、６５巻：３２８〜３４０頁（２０１０年））。
ニューロン組織を再生させるための方法
一部の実施形態では、本開示は、再生医療における適用のための、精製ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ導出皮質介在ニューロンモデルを発生させるための方法を提供する。本明細書で提示されるデータは、新生仔マウス皮質への移植後における、ｈＥＳＣ由来の皮質介在ニューロンの遊走能力を例示する。したがって、本開示で産生される皮質介在ニューロンおよびそれらの前駆体細胞は、再生医療において使用することができる。
疾患についての複数の成体ＣＮＳモデルへの移植研究では、ｉ）病理学的発作活動をモジュレートすること（Ｂａｒａｂａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：１５４７２〜１５４７７頁（２００９年））；ｉｉ）パーキンソン病の態様を処置すること（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｅｒｄｅｎｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、６巻：２３８〜２５０頁（２０１０年））；およびｉｉｉ）生後脳内の学習および可塑性を誘導することにおいて、精製された皮質介在ニューロン移植片を使用することにより解決しうる問題が同定されている（Ｓｏｕｔｈｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７巻：１１４５〜１１４８頁（２０１０年））。以前に報告されている移植研究の１つの具体的な難題は、移植されたｈＰＳＣ由来の皮質介在ニューロン前駆体細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける長期間を要する成熟である。長期にわたる成体マウス皮質への移植研究により、移植の３カ月後において、未成熟な成長円錐を保持し、限定的な統合を示す（データは示さない）、ＮＫＸ２．１＋推定介在ニューロン前駆体細胞による緩徐な成熟速度が確認される。
結果として、以前に報告されているデータは、迅速な機能的な統合および表現型の成熟をたやすく達成した、本明細書で開示される、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける共培養研究と対照的である。一部の実施形態では、本開示は、発達の多様な態様を研究するのに使用されうる、異なる腹側前脳ニューロン型の発生のための枠組みを提供する。一実施形態では、枠組みは、多種多様な神経精神疾患に関与している特定のニューロン型の機能不全について研究するためのｉｎ ｖｉｔｒｏプラットフォームを含む。
ニューロン細胞およびその組成物のｉｎ ｖｉｖｏにおける投与
皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ）ニューロンを含む、本開示のニューロン細胞は、細胞の移植を達成するための慣用的な手段により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて患者へと投与することができる。例えば、ニューロン細胞は、髄腔内注射などの注射により移植することができる。移植の適切な方法は、植え込まれたニューロン細胞の、中枢神経系の所望の領域へのホーミングおよび生着をモニタリングすることにより決定することができる。
非自己細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏに投与されると免疫反応を誘導しうるので、非自己ニューロン細胞の拒絶の可能性を低減するための複数の手法を講じることができる。これらは、細胞の特権的な部位への投与、または、代替的に、レシピエントの免疫系の抑制、自己免疫性障害の発症を制御するのに示され得る抗炎症処置の提供、、および／もしくは移植の前における、非自己／半自己細胞の、免疫隔離性の半透膜への封入を含む。封入法として、小型の球形ビヒクルを伴うマイクロカプセル化、およびより大きなフラットシートまたは中空繊維膜を伴うマクロカプセル化が挙げられる（Ｕｌｕｄａｇら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ、４２巻：２９〜６４頁（２０００年））。
マイクロカプセルを調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｌｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、７０巻：４７９〜８３頁（２０００年）；ＣｈａｎｇおよびＰｒａｋａｓｈ、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７巻：２４９〜６０頁（２００１年）；ならびにＬｕら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ、１７巻：２４５〜５１頁（２０００年）により開示されている方法を含む。例えば、マイクロカプセルは、改変コラーゲンを、２−ヒドロキシエチルメチルアクリレート（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）、およびメチルメタクリレート（ＭＭＡ）のターポリマーシェルと複合体化させ、２〜５μｍのカプセル厚をもたらすことにより調製することができるが、負に帯電させた平滑表面を付与し、血漿タンパク質の吸着を最小化するために、これらのマイクロカプセルはさらに、さらなる２〜５μｍのターポリマーシェルとともに封入することができる（Ｃｈｉａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２３巻：８４９〜５６頁（２００２年））。
他のマイクロカプセルは、アルギン酸、海洋性多糖、またはこれらの誘導体に基づく（Ｓａｍｂａｎｉｓ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｔｈｅｒ、５巻：６６５〜８頁（２００３年））。例えば、マイクロカプセルは、塩化カルシウムの存在下における、ポリアニオンである、アルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムと、ポリカチオンである、ポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）塩酸塩との、高分子電解質複合体化により調製することができる。
細胞の封入は、より小型のカプセルを使用する場合に改善されることが理解される。したがって、品質管理、力学的安定性、拡散特性、および封入された細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、カプセルサイズを１ｍｍ〜４００μｍに縮減した場合に改善された（Ｃａｎａｐｌｅら、Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ、１３巻：７８３〜９６頁（２００２年））。さらに、７ｎｍの小ささまで十分に制御した小孔サイズ、調整した表面化学、精密なマイクロアーキテクチャーを有する、ナノ小孔バイオカプセルを利用して、移植中に細胞を免疫隔離することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｍｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ、１０巻：６〜９頁（１９９９年）；Ｄｅｓａｉ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ、２巻：６３３〜４６頁（２０００年））。
本明細書で開示されるニューロン細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける投与と併せて使用されうる免疫抑制剤の例として、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ）、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、エタネルセプト、ＴＮＦアルファ遮断剤、炎症性サイトカインをターゲティングする生物学的薬剤、および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられるがこれらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例として、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサレート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メクロフェナメート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤、およびトラマドールが挙げられるがこれらに限定されない。
本開示のニューロン細胞集団は、培養培地から単離し、薬学的に許容される担体ならびに／あるいは細胞の生着および／もしくは機能性を促進する１つまたは複数のさらなる薬剤（例えば、免疫抑制剤および抗生剤）と組み合わせることができる。このようなニューロン細胞集団は、滅菌生理食塩水および水性緩衝液など、薬学的に許容される担体または希釈剤中で、ｉｎ ｖｉｖｏに投与することができる。当技術分野では、このような担体および希釈剤の使用が周知である。
本開示のニューロン細胞組成物は、所望の場合、ニューロン細胞を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有しうる、ＦＤＡで承認されたキットなど、パックまたはディスペンサーデバイス中で提示することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなど、金属箔またはプラスチックフォイルを含みうる。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための指示書を添付することができる。パックまたはディスペンサーデバイスにはまた、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形式の通知であって、ヒトまたは動物への投与のための組成物の形態についての規制機関による承認を反映する通知も添付することができる。このような通知は、例えば、米国食品医薬品局により承認された処方薬のための表示または承認された製品添付文書を含みうる。
薬学的に許容される担体中に製剤化したニューロン細胞の調製物を含む組成物もまた調製し、適切な容器内に入れて、上記でさらに詳述した通りの適応状態の処置について表示することができる。本開示の方法に従い調製された細胞は、患者へと直接投与してもよく、スキャホールドに播種してもよく、かつ／また細胞を適切な担体または賦形剤と混合して医薬組成物中に製剤化してもよい。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体および賦形剤など、他の化学的成分を伴う、本明細書で記載されるニューロン細胞のうちの１つまたは複数の調製物を指す。医薬組成物の目的は、ニューロン細胞の患者へのｉｎ ｖｉｖｏにおける投与を容易にすることである。
本明細書で使用される場合、「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、互換的に使用され、患者に重大な刺激を引き起こさず、投与された細胞の生物学的活性および特性を無効化しない、担体または希釈剤を指す。「佐剤」という用語は、「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句により包摂される。
本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、医薬組成物へと添加されて、ニューロン細胞の投与をさらに容易とする不活性の物質を指す。適切な賦形剤の例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、多様な糖および各種のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
ニューロン細胞の製剤化および投与のための技法は、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）内に見出すことができる。
ｉｎ ｖｉｖｏへの投与のための適切な経路は、処置される疾患または障害に依存し、例えば、髄腔内注射、静脈内注射、または腹腔内注射でありうる。代替的に、医薬組成物は、例えば、医薬組成物の、患者の脊柱および／または脳を含む、中枢神経系の組織領域など、所望の組織領域への直接的な注射により、全身投与することもできる。
本開示に従う使用のための医薬組成物は、ニューロン細胞を、薬学的に使用されうる調製物に加工するのを容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、慣用的な方式で製剤化することができる。適正な処方物は、所望の投与経路に依存する。
注射のために、医薬組成物のニューロン細胞は、水溶液中、好ましくはハンクス液、リンゲル液、および／または生理的な塩の緩衝液など、生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化することができる。血液脳関門など、透過すべき障壁に適切な浸透剤を、処方物中で使用することができる。当技術分野では、このような浸透剤は周知であり、たやすく入手可能である。
本開示の文脈における使用のために適切な医薬組成物として、ニューロン細胞が、意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物が挙げられる。より具体的に、「治療有効量」とは、本明細書で論じられる通りの、神経変性疾患、神経精神疾患、もしくは他の神経学的疾患などの、神経学的障害もしくは疾患の症状を防止、緩和、もしくは改善し、かつ／または処置される患者の生存を延長するのに有効なニューロン細胞の量を意味する。治療有効量の決定は、とりわけ、本明細書で提供される詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内にある。
本開示の方法において使用される任意の調製物について、投与量または治療有効量はまず、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は、動物モデルにおいて、所望の濃度を達成するように処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
本明細書で記載されるニューロン細胞の毒性および治療有効性は、標準的な薬学的手順により、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは実験動物において決定することができる。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ある範囲の投与量をヒトにおける使用のために製剤化する際に使用することができる。投与量は、援用される剤形および活用される投与経路に応じて変動しうる。正確な処方物、投与経路、および投与量は、個別の医師が、患者の状態に照らして選択することができる（Ｆｉｎｇｌら、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、１章、１部（１９７５年））。
処置すべき神経学的疾患または障害の重症度および応答性に応じて、投与は、単回投与の場合もあり、複数回投与の場合もあり、処置コースは、数日間〜数週間にわたり持続するか、あるいは治癒が施される、または障害もしくは疾患状態の減退が達成されるまで持続する。投与すべき組成物の量は、当然ながら、処置される患者、罹患の重症度、投与方式、および処方医の判断に依存する。本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、化学技術分野、薬学技術分野、生物学技術分野、生化学技術分野、および医療技術分野の従事者に公知であるか、または彼らによって公知の方式、手段、技法、および手順からたやすく開発される方式、手段、技法、および手順を含むがこれらに限定されない、所与の課題を達成するための方式、手段、技法、および手順を指す。
本明細書で使用される場合、「処置すること」という用語は、状態を失効化させること、状態を実質的に阻害すること、状態の進行を緩徐化すること、もしくは状態の進行を逆転させること、状態の臨床的もしくは美容的症状を実質的に改善すること、または状態の臨床的もしくは美容的症状の出現を実質的に防止することを含む。
（実施例１）
ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害とＷｎｔシグナル伝達の阻害との組合せによる、前脳神経前駆細胞の誘導
本実施例では、神経前駆細胞の発生を、ＳＭＡＤおよびＷｎｔシグナル伝達の阻害と、ＳＨＨシグナル伝達の活性化との組合せにより、達成しうることが実証される。
皮質介在ニューロンの発達および他のニューロン細胞のモデル化における最初のステップは、前脳型神経前駆細胞の頑健な誘導である。前方／前脳運命の特化は、ｈＰＳＣの神経分化中におけるデフォルトのプログラムであると考えられる（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年）；Ｅｉｒａｋｕら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、３巻：５１９〜５３２頁（２００８年）；Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、７７巻：４４０〜４５６頁（２０１３年）；Ｇａｓｐａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４５５巻：３５１〜３５７頁（２００８年））。しかし、全ての細胞系が、神経および前方運命を、同等の効率で成立させるわけではない（Ｋｉｍら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、８巻：６９５〜７０６頁（２０１１年）；およびＷｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０４巻：１３８２１〜１３８２６頁（２００７年））。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔ、またはレチノイドなどの分化培養物中で分泌されるパターン化因子は、前脳の誘導を抑制し、尾側の細胞運命の誘導を誘発しうる。本発明者らは最近、早期における高用量のＳＨＨ処理も、ｈＥＳＣ由来のフロアプレート様細胞の導出を結果としてもたらすＤＫＫ１の誘導の阻害を介して、ＦＯＸＧ１などの前脳マーカーを抑制することについて報告した（Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））。これは、ＮＫＸ２．１＋前駆細胞段階において強力なＳＨＨ活性化が必要であると考えられる皮質介在ニューロンの導出に関する懸念である（Ｘｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２４巻：２６１２〜２６２２頁（２００４年）；およびＸｕら、Ｎｅｕｒｏｎ、６５巻：３２８〜３４０頁（２０１０年））。本実施例において、本発明者らは、ＷＮＴシグナル伝達の薬学的阻害は、ＦＯＸＧ１の誘導を改善することが可能であり、その後、ＮＫＸ２．１＋前脳前駆細胞運命への制御されたＳＨＨ媒介腹側化を可能とするのかどうかについて調べた。図１Ａ。
ヒトＥＳＣ（細胞系ＷＡ−０９、ＨＥＳ−３（ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ）およびｉＰＳ細胞（Ｃ７２、ＳｅＶ６）を、以前に記載されている通りに、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で維持し、分化のためにＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または継代培養のためにＤｉｓｐａｓｅで解離させた（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年））。分化のために使用した培地は、既に記載されている（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））通り、ＫＳＲ培地、Ｎ２培地（ＮａＨＣＯ３、Ｎ２Ｂサプリメント（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）、ならびにＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）およびＮ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含んだ。使用した低分子化合物は、ＸＡＶ９３９（２μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ；）、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、およびプルモルファミン（１〜２μＭ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、アスコルビン酸（２００μＭ）、およびジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ、２００μＭ；いずれもＳｉｇｍａ製）を含んだ。組換え増殖因子：ＳＨＨ（Ｃ２５ＩＩ；５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（１２５ｎｇ／ｍｌ）、ＤＫＫ１（２５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、またはＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）についてはＰｒｏｍｅｇａから購入し、手稿に表示の濃度で使用した。
皮質フィーダー細胞培養物は、以前に記載されている通り（Ｘｕら、Ｎｅｕｒｏｎ、６５巻：３２８〜３４０頁（２０１０年））に、背側皮質を、Ｅ１３．５マウス脳の２５０μｍ冠状薄片から解離させることにより調製し、培養した。ヒト皮質フィーダー調製物のために、８〜１０日目において、ＳＨＨアンタゴニストであるシクロパミン（ｃｙｌｃｏｐａｍｉｎｅ）（５μＭ）を添加して、細胞を、ＸＬＳＢが媒介する神経誘導に供した。１８日目において、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅで解離させ、再播種した（８０，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ２）。３２日目において、ＦＡＣＳを使用して、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ陰性（Ａｂｃａｍ）、ＣＤ２４−ＰＥ陽性（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびＣＤ１８４−ＡＰＣ陽性（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）である細胞（Ｙｕａｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、６巻：７５４０頁（２０１１年））を精製した。次いで、さらなる研究のために、精製した細胞を、２０，０００細胞／ｃｍ２で、マトリゲルでコーティングされたウェル上に播種した。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞を、４，０００細胞／ｃｍ２で、４〜７日間前に調製した皮質フィーダー培養物上に播種した。細胞が７０〜８０％コンフルエントに到達した、共培養の５〜７日後、有糸分裂阻害剤であるマイトマイシンＣ（１μＭ；Ｓｉｇｍａ）を、培養物へと、２時間にわたり添加し、その後、新鮮な培地で置きかえた。
培養物を、リン酸緩衝生理食塩液中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡法のために処理した。一次抗体を検出するために使用した二次抗体は、種特異的なＡｌｅｘａ色素コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。一次抗体について、本発明者らは、ウサギＦＯＸＧ１（Ｅｓｅｎｇ Ｌａｉからの贈呈）；マウスＰＡＸ６（ＤＳＨＢ）；マウスＮＫＸ２．１（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ）；ヤギＮＫＸ２．１（Ｃ−２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；ウサギＯＬＩＧ２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；ヤギＦＯＸＡ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；ウサギＬＨＸ６（Ａｂｃａｍ）；マウスＲＡＸ（Ａｂｎｏｖａ）；ウサギＧＡＰＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ヤギＤＣＸ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；マウスＴＵＪ１（Ｃｏｖａｎｃｅ）；ウサギＧＡＢＡ（Ｓｉｇｍａ）；マウスネスチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ウサギＫＩ６７（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ）；マウスＫＩ６７（Ｄａｋｏ）；ウサギカルビンディン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；マウスカルレチニン（Ｓｗａｎｔ）；ニワトリＧＦＰ（Ａｂｃａｍ）；ヤギＣｈａｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；ラットソマトスタチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；マウスＴＨ（Ａｂｃａｍ）；ウサギＮＯＳ（Ｓｗａｎｔ）；マウスパルブアルブミン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；マウスＰＳＤ−９５（Ｚｙｍｅｄ）；モルモットＶＧＬＵＴ１（Ｓｙｎａｐｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）；ウサギＶＧＡＴ（Ｓｙｎａｐｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）；およびマウスゲフィリン（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する抗体を使用した。
ＦＯＸＧ１およびＰＡＸ６の定量化：２０倍の対物レンズを使用して、２５の視野を、３つのウェルおよび４つの独立の分化試験からイメージングした。ＤＡＰＩ＋核の数を分母として使用し、ＦＯＸＧ１＋核またはＰＡＸ６＋核のいずれかを分子に使用した。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの共標識：２０倍の対物レンズを使用して、２５〜３０の視野を、４つの独立の分化物に由来する４つのウェルからイメージングした。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の数を分母として使用し、分子は解析する各マーカーを選択した。各マーカーの対照として、一次抗体の非存在下における二次抗体を、シグナルの特異性を示すための陰性対照として使用した。
全ての実験について、解析は、少なくとも３つの独立の実験から導出した。統計学的解析は、ＡＮＯＶＡの後でダネット検定を使用して実施して、あらかじめ規定した対照条件と比較した場合の、処理の影響を定量化した。
ノギン＋ＳＢ４３１５４２（ＮＳＢ）を使用した、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコール（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年））を介する、ｈＥＳＣの神経分化により、ＦＯＸＧ１＋／ＰＡＸ６＋前駆体細胞が頑健に誘導された。前方神経前駆細胞を発生させるための、二重ＳＭＡＤ阻害パラダイムにおける分化プロトコールを図１Ａに示す（ＮＳＢ：ノギン＋ＳＢ４３１５４２；ＬＳＢ：ＬＤＮ１９３１８９＋ＳＢ３１５４２である）。ノギンを、ＡＬＫ２／３阻害剤であるＬＤＮ−１９３１８９（ＬＳＢ）で置きかえても、ＰＡＸ６発現は同等に良好であったが、ＦＯＸＧ１を発現する細胞の百分率は低減する傾向を示した（図１Ｂおよび１Ｃ；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡの後で、シェッフェ検定を使用）。組換えＤＫＫ１つまたはタンキラーゼ阻害剤であるＸＡＶ９３９を添加する（Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：６１４〜６２０頁（２００９年））。標準的なＷｎｔシグナル伝達の強力な阻害剤の両方が、ＬＳＢで処理した培養物におけるＦＯＸＧ１発現を大幅に増強した。図１Ｂ〜１Ｄ。
図１Ｄは、ＸＬＳＢ処理の後１０日目における、ＦＯＸＧ１およびＰＡＸ６発現についての代表的な免疫蛍光画像を示す図である。ＸＡＶ９３９の、ＦＯＸＧ１誘導に対する効果が、複数の独立のｈＥＳＣ細胞系（ＨＥＳ−３およびＷＡ−０９）およびヒトｉＰＳＣ細胞系（Ｃ７２細胞系（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：１２７５９〜１２７６４頁（２００９年））、ＳｅＶ６（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））にわたり一貫した（図１Ｅ）ことは、重要なことである。図１Ｅは、ＸＬＳＢを使用する、頑健な終脳特化が、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ細胞系であるＳｅＶ６、Ｃ７２；ｎ＝４）において、同等な効率で達成されたことを実証する。３つの低分子（ＸＡＶ９３９、ＬＤＮ−１９３１８９、およびＳＢ４３１５４２；これらを集合的にＸＬＳＢと言及する）を使用することにより、前脳運命の迅速で頑健な誘導が、ヒトＥＳＣおよびヒトｉＰＳＣにわたり可能となる。
ＳＨＨ活性化因子の存在下におけるＸＬＳＢによる腹側運命の誘導について調べた（図１Ａ）。図１Ｆ〜１Ｈは、ＳＨＨシグナル伝達を、ＸＬＳＢプロトコールへと追加することにより、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰを発現する前駆細胞の産生が有意に増強されたことを示す。既に確立されたＮＫＸ２．１：：ＧＦＰノックインレポーターｈＥＳＣ細胞系（Ｇｏｕｌｂｕｒｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２９巻：４６２〜４７３頁（２０１１年））を使用したところ、ＧＦＰの誘導が、組換えＳＨＨ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃ−２５ＩＩ）およびｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの活性化因子であるプルモルファミンによるＳＨＨ経路の活性化後の１０日目までに観察された（図１Ｆ）。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの最大の誘導は、１μＭのプルモルファミンおよび５ｎＭのＳＨＨによる処理（本明細書では「ＳＨＨ」と言及する）の１８日目において見出された（図１Ｇ）。
図１Ｆに提示するデータは、４日目から添加した５ｎＭのＳＨＨ（Ｓｏｎｉｃ Ｃ２４ＩＩ）および１μＭのプルモルファミンにより、１０日目に、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ産生の誘導における相乗効果が呈示されたことを実証する（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＳＨＨと比較）。１８日目におけるＳＨＨおよびプルモルファミンの濃度範囲を、図１Ｇにおいて比較した。共処置は、極めて高い濃度のＳＨＨ単独またはプルモルファミン単独に対して非常に優位であった（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＳＨＨなしの場合と比較、ＡＮＯＶＡの後でシェッフェ検定を使用）。図１Ｈは、ＳＨＨ曝露のタイミングを、分化の約２日後から約１０日後に遅延させることは、１８日目において測定したＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの誘導の効率に劇的な影響を及ぼさなかったことを実証する（＊＊＊ｐ＜０．００１、０〜１８と比較、ＡＮＯＶＡの後でシェッフェ検定を使用。Ｐ：プルモルファミン、Ｓ：ソニックヘッジホッグ）。転写因子であるＮＫＸ２．１は、腹側前脳前駆細胞集団のマーカーである（Ｓｕｓｓｅｌら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２６巻：３３５９〜３３７０頁（１９９９年）；およびＸｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２４巻：２６１２〜２６２２頁（２００４年））。
本実施例で提示されるデータにより、組換えＤＫＫ１などのＷＮＴ活性の阻害剤を使用して、マウスおよびヒトＥＳＣの分化の間の終脳前駆細胞および視神経前駆細胞の発生を誘導しうることが確認される（Ｌａｍｂａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０３巻：１２７６９〜１２７７４頁（２００６年）；Ｍｅｙｅｒら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２９巻：１２０６〜１２１８頁（２０１１年）；およびＷａｔａｎａｂｅら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、８巻：２８８〜２９６頁（２００５年））。
さらに、本明細書で実証される通り、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールにおいて、タンキラーゼ阻害剤であるＸＡＶ９３９（Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：６１４〜６２０頁（２００９年））で、組換えＤＫＫ１を置きかえることができる。３つの低分子（すなわち、ＸＬＳＢ）の使用により、複数の細胞系における頑健な誘導が結果としてもたらされる。本開示の一部として、ＸＬＳＢは、皮質介在ニューロンの発生のほか、広範にわたる他の前脳細胞型を誘導するために利用すると有利でありうることが裏付けられた。
ｈＥＳＣ由来のフロアプレート細胞の導出についての先行研究により、ＳＨＨによる早期処理（分化の１日目）は、ＦＯＸＡ２の効率的な誘導のために極めて重要であることが実証された（Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））。本明細書で開示される通り、分化後期において（ＸＬＳＢプロトコールの１０日目）ＳＨＨへと曝露した細胞は、ＦＡＣＳにより測定する場合、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰを誘導するのにコンピテントなままであった。図１Ｈ。したがって、ＸＬＳＢとＳＨＨとを組み合わせて、ＮＫＸ２．１＋前駆細胞の高効率の発生を誘導することができる。
（実施例２）
ＳＨＨ活性化のタイミングを変化させることによる、異なる腹側前駆細胞集団の誘導
本実施例では、ニューロン細胞のＳＨＨ活性化のタイミングを変化させることにより、異なる腹側前駆細胞集団を発生させうることが実証される。
実施例１により、ＮＫＸ２．１の効率的な誘導は、大部分がＳＨＨ曝露のタイミングとは独立であることから、タイミングが、発生するＮＫＸ２．１＋神経前駆細胞の亜型に影響を及ぼすのかどうかという疑問が提起された。齧歯動物の場合と同様、ＮＫＸ２．１は、ＦＯＸＧ１＋終脳内ならびにＦＯＸＧ１陰性腹側間脳内のいずれにおいても、ヒトの早期神経発生時に発現する。図２Ａは、公表されたデータに基づく前脳パターン化マーカーの発現とともに、ヒト前脳のモデル（カーネギー発生段階１４（ＣＳ１４）における矢状面図）を示す図である（Ｋｅｒｗｉｎら、Ｊ Ａｎａｔ、２１７巻：２８９〜２９９頁（２０１０年）；ならびにＲａｋｉｃおよびＺｅｃｅｖｉｃ、Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ、１３巻：１０７２〜１０８３頁（２００３年））。マウス胚発生中において、終脳（ＦＯＸＧ１＋）内のＮＫＸ２．１の発現は、腹側（皮質下）ドメインに限局される。これに対し、ヒト胎児組織における報告により、ＮＫＸ２．１は、腹側前脳に限局されず、そうではなくて、背側前脳および皮質原基へと拡大する可能性があることが示唆された（ＲａｋｉｃおよびＺｅｃｅｖｉｃ、Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ、１３巻：１０７２〜１０８３頁（２００３年）；ならびにＹｕおよびＺｅｃｅｖｉｃ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：２４１３〜２４２０頁（２０１１年））。しかし、これらの研究は大部分、妊娠中期のヒト胎児についての解析に基づいていた（Ｆｅｒｔｕｚｉｎｈｏｓら、Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ、１９巻（９号）：２１９６〜２２０７頁（２００９年））。これは、ＮＫＸ２．１＋細胞が背側前脳内で実際に誘導されたのか、腹側ドメイン内での誘導の後で背側に遊走したのかを弁別することを困難とする。
初期ヒト胚（カーネギー発生段階１５；受胎の約３８日後）において免疫細胞化学解析を実施することにより、本発明者らは、発生しつつあるマウスＣＮＳと同等な、ＮＫＸ２．１の発現の腹側前脳への限局を観察した（図２Ｂ〜２Ｅ）。図２Ｂ〜２Ｅは、カーネギー発生段階１５（ＣＳ１５）におけるヒト前脳の冠状（斜方）半断面により、ＮＫＸ２．１、ＯＬＩＧ２、およびＰＡＸ６の発現が実証されることを示す。ＮＫＸ２．１およびＯＬＩＧ２が、腹側前脳全体にわたる多様な領域内で発現するのに対し、ＰＡＸ６は、背側前脳および眼に限局される。これらのタンパク質の発現は、ＯＬＩＧ２とＮＫＸ２．１とが共発現される神経節隆起内（図２Ｃ）を除いて重なり合わない。図２Ｂのスケールバーは、２００μｍを表す。ヒト胚腹側前脳内のＮＫＸ２．１ドメインを、ＯＬＩＧ２＋神経節隆起と、ＯＬＩＧ２陰性視索前野領域原基とにさらに細分した（図２Ｃ、２Ｄ）。本実施例についての分化パラダイムを、図２Ｆに示す。
中絶されたヒト胎児に由来する組織は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから得た。研究は、Ｔｈｅ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｅｒｎ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄおよびＴｈｅ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｂｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより承認された（第５２／９１号、第７１／９４号、第１８８／９５号）。説明同意文書は、中絶を望む女性により提出された。
全ての細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を３０分間にわたり使用して解離させ、次いで、Ｙ２７６３２（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７中に再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（生細胞についてのＳＳＣゲーティング／ＦＳＣゲーティング／ＤＡＰＩ陰性除外ゲーティング）でソートした。ソート後解析のために、データは、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）ソフトウェアを使用して加工した。
全ＲＮＡを、分化１８日目において、ＦＡＣＳによりソートしたＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞であって、３つの異なる分化条件に由来する細胞、およびＧＦＰを発現するいずれの細胞も含有しない「ＳＨＨなし」条件に由来する細胞（Ｔｒｉｚｏｌ、Ｓｉｇｍａ）から単離した。３回反復の各群試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａビーズアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＴ−１２）のために、製造元の指定に従い、ＭＳＫＣＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙにより、加工した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＳＨＨ曝露のタイミングが、結果として得られるｈＰＳＣ由来のＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の領域的独自性に影響を及ぼすのかどうかについて取り組むため、ソートした細胞の独自性を、２〜１８日目、６〜１８日目、または１０〜１８日目いずれかのＳＨＨ処理の後の分化１８日目において観察した（図２Ｆ）。早期ＳＨＨ曝露（２〜１８日間）が、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの頑健な誘導にも拘らず、ＦＯＸＧ１の誘導を抑制した（図２Ｇ、左パネル）ことは、フロアプレートの誘導についてのかつての結果（Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））と符合する。図１Ｈを参照されたい。分化１８日目におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ系におけるＯＬＩＧ２およびＦＯＸＧ１についての免疫蛍光を、図２Ｇおよび２Ｈに提示する。
図２Ｈで定量化される通り、６日目以後におけるＳＨＨによる処理（６〜１８および１０〜１８群）は、ＦＯＸＧ１を共発現するＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の百分率を有意に増大させる。１０日目以後におけるＳＨＨによる処理（１０〜１８群）は、ＯＬＩＧ２を共発現させるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の導出を増強した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、２〜１８と比較、ＡＮＯＶＡの後でシェッフェ検定を使用）。ＦＯＸＧ１、ＮＫＸ２．１およびＯＬＩＧ２の発現は、神経節隆起に特徴的なパターンを示す（Ｔｅｋｋｉ−Ｋｅｓｓａｒｉｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２８巻：２５４５〜２５５４頁（２００１年））。これに対し、６〜１８および１０〜１８処理群のいずれも、ＦＯＸＧ１の発現を示したが、ＯＬＩＧ２の発現は異なった（図２Ｇ、中パネルおよび右パネル）。本発明者らは、ＦＯＸＧ１とＯＬＩＧ２との示差的な発現が、初期ヒト発生中に観察される異なるＮＫＸ２．１＋前駆体細胞ドメインを反映し（図２Ａ〜２Ｅ）、マウス前脳の発生中におけるＯｌｉｇ２＋ドメインを模倣すると仮定する（Ｆｌａｍｅｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２７巻：９６８２〜９６９５頁（２００７年））。６〜１８および１０〜１８プロトコールにおけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞のうちの９０％超はＦＯＸＧ１を共発現し、１０〜１８プロトコールにおけるＧＦＰ＋細胞のうちのほぼ８０％はＯＬＩＧ２を共発現した。図２Ｈ。
ＳＨＨ曝露のタイミングの、特定の腹側前駆体細胞集団の導出に対する影響について、グローバルトランスクリプトーム解析によりさらに検討した（図２Ｉ〜２Ｋ、全ての生データは、ＧＥＯ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／：受託番号ペンディングにおいて入手可能である）。図２Ｉ〜２Ｋは、分化１８日目にＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの発現についてソートした細胞からのマイクロアレイデータを示し、遺伝子発現レベルを、１０〜１８日目ＳＨＨプロトコールとＳＨＨなしの場合との間（図２Ｉ）、１０〜１８日目プロトコールと２〜１８日目プロトコールとの間（図２Ｊ）、および１０〜１８日目プロトコールと６〜１８プロトコールとの間（図２Ｋ）で比較する。赤色バーは、ＳＨＨ １０〜１８プロトコールにおいてより高レベルで発現された遺伝子を示し、青色バーは、１０〜１８日目プロトコールにおいてより低レベルで発現された遺伝子を示す。全ての変化は、ｐ＜０．００１で有意である（さらなる詳細を参照されたい）。
１０〜１８日目培養物を、非処理培養物（ＳＨＨなし）と対比する直接的な比較により、ＥＭＸ２およびＰＡＸ６などの背側前脳マーカーを犠牲にして誘導されたＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、およびＮＫＸ６．２など、腹側特化マーカーの頑健な誘導が確認された（図２Ｉ）。ＦＯＸＧ１およびＯＴＸ２など、一般的な前脳マーカーの発現には、差異が見られなかった（図２Ｉ）ことから、いずれの集団も、前脳の独自性を有するという考えが支援される。１０〜１８日目処理培養物の、２〜１８日目処理培養物との比較（図２Ｊ）により、ＦＯＸＧ１など、前脳マーカーの発現の、ＲＡＸなど、間脳マーカーと対比した差異が例示された。これに対し、６〜１８日目処理培養物と対比された１０〜１８日目処理培養物が示す前脳マーカー発現の差異は、それほど顕著ではなかった（図２Ｋ）。全体的に、本発明者らのデータは、ＳＨＨ処理の時期が、ｈＰＳＣ由来のＮＫＸ２．１前駆体細胞の領域的独自性に有意に影響を及ぼすことを実証する。
遺伝子発現データからの１つの驚くべき知見は、１０〜１８日目群を含む、全てのＳＨＨ処理培養物におけるＦＯＸＡ２の誘導であった（図２Ｉ）。補足図１（図３）は、ＦＯＸＡ２が、ｈＰＳＣ由来のＮＫＸ２．１＋系統およびヒト神経節隆起において一過性に発現されることを示す。図３Ａは、１８日目において、分化したＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ発現細胞をソートし、次いで、ＳＨＨシグナル伝達の非存在下で、さらに２週間にわたり細胞を培養した後におけるＦＯＸＡ２発現の時間経過を示す。ＦＯＸＡ２との共標識の百分率は、２週間の経過にわたり低下する。図３Ｂは、１０〜１８日目処理培養物についての、代表的な免疫細胞化学画像を示す。分化１８日目におけるＦＯＸＧ１の発現ならびにＦＯＸＡ２およびＧＦＰの共発現である。図３Ｃは、ＦＯＸＧ１（赤色）、ＮＫＸ２．１（緑色）、およびＦＯＸＡ２の発現を示す、発生しつつあるマウス脳の胚生１１．５日目における冠状切片を示す（Ｄ’Ａｍａｔｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８４巻：４３２２〜４３２６頁（１９８７年））。間脳（Ｄｉ）においてＦＯＸＧ１の発現は見られず、終脳（Ｔｅｌ）においてＦＯＸＡ２発現は見られない。
ＮＫＸ２．１は、内側神経節隆起（ＭＧＥ）および視床下部（ＨＹＰＯ）において発現されるが、フロアプレート（ＦＰ）において発現されず、ＦＯＸＡ２と共標識されない。図３Ｄは、免疫組織化学解析のために切片化されたカーネギー発生段階１５（ＣＳ１５；妊娠約５．５週）のヒト胚を示す。Ｅ、Ｆ）ＦＯＸＡ２およびＮＫＸ２．１の発現を実証するヒトＣＳ１５前脳の隣接する冠状（斜方）半断面である。ＦＯＸＡ２が、神経節隆起において特異的に発現されると認められる（図３Ｅ）のに対し、ＮＫＸ２．１は、腹側前脳の多様な領域において発現される（図３Ｆ）。図３は、ヒトとマウスとの間のＦＯＸＡ２発現の差異を実証し、腹側前脳においてＮＫＸ２．１前駆細胞を発生させる代替的機構を示唆する。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで示される通り（図３Ａ）、かつ、後期ヒト胚についてのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析により示唆される通り（Ａｌｌｅｎ Ｂｒａｉｎ Ａｔｌａｓ、ｈｔｔｐ：／／ｈｕｍａｎ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ／）、これらのＮＫＸ２．１細胞におけるＦＯＸＡ２発現は、一過性でありうる。
こうして、大部分が発生しつつあるＣＮＳ内のフロアプレートに限局されると考えられるマーカーであるＦＯＸＡ２の発現が、分化１８日目に、３つのＳＨＨ処理パラダイム全てのＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞において確認された（図３Ａおよび３Ｂ）。ＦＯＸＡ２発現が、ＳＨＨシグナル伝達の強力な外因性の活性化の後におけるｉｎ ｖｉｔｒｏのアーチファクトを表しうるのかどうか、またはＦＯＸＡ２発現が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける発生中に終脳において生じているのかどうかについて取り組むため、本発明者らは、発生しつつあるマウスおよびヒト前脳において組織学的解析を実施した。マウス胚（Ｅ１１．５）において、マウス前脳におけるＦＯＸＡ２発現は、ＦＯＸＧ１およびＮＫＸ２．１ドメインから隔離されていた（図３Ｃ）。しかし、一次ヒト前脳組織（ＣＳ１５胚）におけるＦＯＸＡ２についての免疫組織化学解析により、終脳ＮＫＸ２．１＋神経節隆起原基における発現が確認された（図３Ｄ〜３Ｆ）。これらのデータは、少なくとも一過性のＦＯＸＡ２発現が、ヒト腹側前脳の発生中に生じることを示唆し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈＰＳＣ分化データと符合する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける腹側前脳特化中のＳＨＨ投与量の重要性は、ｈＥＳＣ由来の神経上皮前駆細胞を、ＧＳＸ２陽性でＮＫＸ２．１陰性の前駆細胞であって、中型有棘線条体投射ニューロンを発生させるように誘導されうる前駆細胞へと方向付けるために、中程度のＳＨＨレベルを使用することにより実証された（Ｍａら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、１０巻：４５５〜４６４頁（２０１２年））。皮質投射ニューロンマーカーとして、ＰＡＸ６、ＴＢＲ２、ＴＢＲ１、ＳＡＴＢ２、ＣＴＩＰ２、ＶＧＬＵＴ１、ＦＥＺＦ２、ＳＦ６Ｃ、およびグルタミン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
ｈＥＳＣベースのフロアプレートの誘導について以前に実証された通り、ＳＨＨ用量に加えて、ＳＨＨ処理のタイミングもまた、腹側細胞運命への特化の効率に影響を及ぼしうる（Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））。ＳＨＨ活性化のタイミングの差異だけで、前方−後方独自性が多様である、異なる腹側前駆細胞の発生を誘発するのに十分であることは、注目すべきことである。視床下部原基のマーカーを発現するｈＥＳＣ由来の前駆細胞の導出は、ＦＧＦ８の存在下における、ＳＨＨシグナル伝達の早期の活性化の後で報告されている（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））。
本明細書で開示される、２〜１８日目プロトコールのデータは、これらの知見を拡張し、ＦＧＦ８の添加が視床下部前駆細胞運命を方向付けるためにそれほど重要ではないことを示唆する。６〜１８日目群から導出されるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋前駆細胞において観察される、主要なコリン作動性ニューロンの運命は、認知機能の喪失と関連する障害のモデル化および処置のために援用することができる。例えば、アルツハイマー病では、前脳基底部コリン作動性ニューロンは、疾患の初期において、ニューロンの中で最も損傷を受けやすい（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１５巻：１２３７〜１２３９頁（１９８２年））。
本明細書で開示される通り、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰレポーターｈＥＳＣ細胞系（Ｇｏｕｌｂｕｒｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２９巻：４６２〜４７３頁（２０１１年））の使用により、６日目またはこれより後にＳＨＨ処理を開始する場合の、プロトコールの最適化、およびほぼ全てのｈＥＳＣ後代細胞の、ＦＯＸＧ１＋／ＮＫＸ２．１＋腹側前脳運命への効率的な変換が可能となった。
本明細書で提示されるデータは、ＳＨＨ活性化のタイミングを利用して、ニューロン細胞から発生させた、ＮＫＸ２．１＋神経前駆細胞の亜型を制御しうることを実証する。ＮＫＸ２．１は、ヒトＦＯＸＧ１陽性終脳ならびにヒトＦＯＸＧ１陰性腹側間脳細胞において、早期神経発生中に産生されうることが示唆されている。例えば、図２ＡおよびＫｅｒｗｉｎら、Ｊ Ａｎａｔ、２１７巻：２８９〜２９９頁（２０１０年）；ならびにＲａｋｉｃおよびＺｅｃｅｖｉｃ、Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ、１３巻：１０７２〜１０８３頁（２００３年）を参照されたい。マウス胚発生中において、終脳（ＦＯＸＧ１＋）におけるＮＫＸ２．１の発現は、腹側（皮質下）ドメインに限局される。これに対し、ヒト胎児組織において、ＮＫＸ２．１の発現は、腹側前脳に限局されず、そうではなくて、背側前脳および皮質原基へと拡大することが報告されている（ＲａｋｉｃおよびＺｅｃｅｖｉｃ、Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ、１３巻：１０７２〜１０８３頁（２００３年）；ならびにＹｕおよびＺｅｃｅｖｉｃ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：２４１３〜２４２０頁（２０１１年））。しかし、これらのヒト研究は大部分妊娠中期の胎児についての解析に基づいていた。これは、ＮＫＸ２．１＋細胞が背側前脳において直接的に誘導されたのか、腹側ドメインにおける誘導の後で背側に遊走したのかを確認することを困難とする（Ｆｅｒｔｕｚｉｎｈｏｓら、Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ、１９巻（９号）：２１９６〜２２０７頁（２００９年））。
本明細書で開示される通り、初期ヒト胚（カーネギー発生段階１５；受胎の約３８日後）において免疫細胞化学解析を実施したところ、ＮＫＸ２．１の発現は、腹側前脳に限局されることが観察された。例えば、図２Ｂ〜２Ｅを参照されたい。したがって、本明細書で開示されるヒトデータは、マウス研究から導出されたデータと同等である。本データにより、ヒト胚腹側前脳内のＮＫＸ２．１ドメインは、ＯＬＩＧ２＋神経節隆起と、ＯＬＩＧ２陰性視索前野領域原基とにさらに細分されることがさらに実証された。例えば、図２Ｃおよび２Ｄを参照されたい。
分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群と、分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群と、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群とを比較することにより、ｈＰＳＣ由来のＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の領域的独自性を評価した。図２Ｆ。これらのデータにより、ＳＭＡＤ阻害剤によるフロアプレートの誘導についての以前の研究から導出される結果が確認される（Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））。早期のＳＨＨ曝露（すなわち、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群）は、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの頑健な誘導にも拘らず、ＦＯＸＧ１誘導の抑制を呈示した。それぞれ、図２Ｇ、左パネル、および図１Ｈを参照されたい。
これに対し、分化６〜１８日目および分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群の両方が、ＦＯＸＧ１の発現を呈示したが、ＯＬＩＧ２の発現は異なった。図２Ｇ、中パネルおよび右パネルを参照されたい。理論により束縛されることを望まないが、ＦＯＸＧ１とＯＬＩＧ２との示差的な発現が、初期ヒト発生中に観察される異なるＮＫＸ２．１＋前駆体細胞ドメインを反映し（図２Ａ〜Ｅ）、マウス前脳の発生中におけるＯｌｉｇ２＋ドメインを模倣すると考えられる（Ｆｌａｍｅｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２７巻：９６８２〜９６９５頁（２００７年））。分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群および分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞のうちの９０％超はＦＯＸＧ１を共発現し、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群におけるＧＦＰ＋細胞のうちのほぼ８０％はＯＬＩＧ２を共発現した。図２Ｈを参照されたい。
ＳＨＨ曝露のタイミングの、特定の腹側前駆体細胞集団の導出に対する影響について、グローバルトランスクリプトーム解析によりさらに検討した。図２Ｉ〜２Ｋおよび表１を参照されたい。
分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群を、非処理培養物（例えば、ＳＨＨ処理なし）と対比する直接的な比較により、ＥＭＸ２およびＰＡＸ６などの背側前脳マーカーを犠牲にして誘導されたＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、およびＮＫＸ６．２など、腹側特化マーカーの頑健な誘導が確認された。図２Ｉを参照されたい。ＦＯＸＧ１およびＯＴＸ２など、一般的な前方マーカーの発現には、有意な差異が観察されなかった。図２Ｉを参照されたい。これらのデータは、両方の細胞集団の前脳独自性を支援する。
分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群の、分化２〜１８日目ＳＨＨ処理群との比較により、ＦＯＸＧ１など、前方マーカーの発現の、ＲＡＸなど、間脳マーカーの発現と対比した差異が例示された。図２Ｊ。これに対し、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群と分化６〜１８日目ＳＨＨ処理群との比較は、前脳マーカー発現の差異が、それほど顕著ではないことを明らかにした。図２Ｋを参照されたい。これらのデータは、ＳＨＨ処理のタイミングが、ｈＰＳＣ由来のＮＫＸ２．１前駆体細胞の領域的独自性に有意に影響を及ぼすことを実証する。
遺伝子発現データにより、分化１０〜１８日目ＳＨＨ処理群を含む、全てのＳＨＨ処理培養物において、ＦＯＸＡ２の誘導が実証された。図２Ｉを参照されたい。発生しつつあるＣＮＳ内の、フロアプレートマーカーであるＦＯＸＡ２の発現は、分化の１８日目において、３つのＳＨＨ処理群全てに由来するＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞において確認された。図３Ａおよび３Ｂを参照されたい。
ＦＯＸＡ２発現が、ＳＨＨシグナル伝達の強力な外因性の活性化の後におけるｉｎ ｖｉｔｒｏのアーチファクトを表しうるのかどうか、またはＦＯＸＡ２発現が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける発生中に終脳において生じているのかどうかについて取り組むため、胚生１１．５日目のマウス胚において発生しつつあるマウスおよびヒト前脳における組織学的解析を実施した。本明細書で提示されるデータにより、マウス前脳内のＦＯＸＡ２発現は、ＦＯＸＧ１およびＮＫＸ２．１ドメインから隔離されていることが実証された。図３Ｃを参照されたい。一次ヒト前脳組織（ＣＳ１５胚）におけるＦＯＸＡ２についての免疫組織化学解析により、終脳ＮＫＸ２．１＋神経節隆起原基においける発現が確認された。図３Ｄ〜３Ｆを参照されたい。これらのデータは、一過性のＦＯＸＡ２発現が、ヒト腹側前脳の発生中に生じることを実証し、これらのデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈＰＳＣ分化データと符合する。
（実施例３）
前脳神経前駆細胞の、ニューロン細胞への方向付けられた分化およびこれらのニューロン細胞の遊走特性
本実施例は、前脳神経前駆細胞の方向付けられた分化による、ニューロン細胞の発生を実証する。
神経節隆起に由来する皮質介在ニューロンは、皮質回路内の興奮と抑制との平衡において、特に重要である。さらに、皮質介在ニューロンは、発生上の可塑性の制御において鍵となる役割を果たし、てんかん、自閉症、および統合失調症を含む多様な病態において機能不全である（Ｂａｒａｂａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：１５４７２〜１５４７７頁（２００９年）；Ｅａｇｌｅｓｏｎら、Ａｕｔｉｓｍ Ｒｅｓ、４巻：６８〜８３頁（２０１１年）；Ｉｎｓｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ、４６８巻：１８７〜１９３頁（２０１０年）；Ｌｅｗｉｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６巻：３１２〜３２４頁（２００５年）；およびＰｅｎａｇａｒｉｋａｎｏら、Ｃｅｌｌ、１４７巻：２３５〜２４６頁（２０１１年））。
１０〜１８日目処理前駆体細胞は、ＯＬＩＧ２、ＭＡＳＨ１、およびＮＫＸ６．２を含む転写因子であって、マウスの発生中において皮質介在ニューロン前駆細胞ドメインのマーカーである転写因子の多くを発現する。分化１８日目におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ細胞の大半は、前駆細胞の特性を呈示するが、これは、ネスチンおよびＫｉ６７の発現により証拠立てられる。
本明細書で実証される通り、外因性のＳＨＨ活性化の非存在下で培養を長期化させたところ、循環ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ細胞は、徐々に減少した。図４Ａ〜４Ｃ、上パネル。１８日目において、表示の３つのプロトコールに由来する細胞を、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの産生についてのＦＡＣＳにかけ、次いで、再播種し、皮質介在ニューロンマーカーとの共標識について評価した。図４Ａ〜４Ｃ。３つのプロトコール全てが、前駆細胞マーカーの産生の低減およびニューロン分化のマーカー（すなわち、ＧＡＢＡ、ＴＵＪ１、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、およびカルビンディン）の産生の増大を呈示した。
Ｋｉ６７の比率の減少は、ニューロン前駆体細胞マーカーであるＤＣＸおよびＴＵＪ１を発現する細胞の百分率の増大と並行した。図４Ａ〜４Ｃ、下パネル。さらに、１０〜１８日目および２〜１８日目条件下のＧＦＰ＋細胞の多くは、ＧＡＢＡを発現し、接線方向に遊走する皮質介在ニューロン前駆体細胞ならびに他の集団のマーカーである、カルビンディンの発現の時間依存性増大を示した（図４Ａ〜４Ｃ、下パネル；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：４７４〜４７６頁（１９９７年））。
分化３２日目におけるウェスタンブロット解析により、内側神経節隆起（ＭＧＥ）で濃縮されるＬＨＸ６タンパク質であって、マウスにおける有糸分裂後の遊走性の皮質介在ニューロン前駆体細胞のマーカーであるＬＨＸ６タンパク質が、１０〜１８日目条件下で選択的に濃縮される一方、視床下部マーカーであるＲＡＸは、２〜１８日目条件下で選択的に濃縮されることが示された。図４Ｄ。さらなる免疫細胞化学データは、１０〜１８日目のＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋前駆細胞に由来する大半のニューロン前駆細胞におけるＤＬＸ２およびＡＳＣＬ１の発現を明らかにした。図４Ｅ〜４Ｇ。３２日目において、１０〜１８条件によるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の多くもまた、ＤＬＸ２およびＡＳＣＬ１を発現したことから、外因性のＳＨＨシグナル伝達活性化因子を中止した後において、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋前駆細胞は、皮質介在ニューロンの前駆体細胞を含む、領域特異的な有糸分裂後ニューロンをもたらしたことが示唆される。図４Ｅ〜４Ｇ。
ヒトＥＳＣ由来の推定皮質介在ニューロン前駆体細胞（１０〜１８日目群）を、マウス脳（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：４７４〜４７６頁（１９９７年））およびヒト脳（Ｌｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年））における初代皮質介在ニューロンについて観察される、特徴的な遊走能力について評価した。
細胞を、Ｒｉｐａ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、およびプロテアーゼ阻害剤の錠剤）で溶解した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により測定した。免疫ブロットのために、全細胞抽出物（試料１例当たり４×１０６個の細胞）を、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で、５分間にわたり煮沸した後、ｉＢｌｏｔエレクトロブロット装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＭＯＰＳ ＳＤＳランニングバッファー中の４〜１２％ビス−トリスゲル上、１００Ｖで２時間にわたる電気泳動により分離した。
ｉＢｌｏｔゲル転写デバイス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、タンパク質を、ニトロセルロース膜へと転写した。非特異的なタンパク質結合は、膜を３％のＢＳＡおよびＰＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）でブロッキングすることにより防止した。膜は、３％のＢＳＡおよびＰＢＳ−Ｔ中、４度で一晩にわたり、一次抗体（ＬＨＸ６（１：５００；Ａｂｃａｍ）、ＲＡＸ（１：２５０；Ａｂｎｏｖａ）、ＧＡＰＤＨ（１：１０，０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）による５回の洗浄の後、ブロットを、それぞれの二次抗体（ウサギ（１：１０，０００）、マウス（１：２０，０００）と共に、室温でインキュベートした。ＥＣＬキットである、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ、を、製造元の指示書（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に従い、検出のために使用した。二次抗体は全て、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。ＥＣＬキットである、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ、を、製造元の指示書（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に従い、検出のために使用した。
厚さ２５０μｍの終脳冠状薄片を、記載される（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２８巻：３５３〜３６３頁（２００１年））通りに調製および培養した。薄片は、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦＧＦ２（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７中で維持した。初期（分化の３２〜３９日目）ｈＥＳＣ由来ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞を、ＦＡＣＳにより単離し、次いで、卵母細胞マイクロインジェクター（Ｎａｎｏｉｎｊｅｃｔ ＩＩ；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ）を使用して、ＭＧＥの脳室周囲領域へと注意深く注射した。脳半球の薄片１つ当たりおよそ５０００個の細胞を注射した。培養物を、２または６日間にわたり維持した後、免疫染色のために固定および加工した。細胞をカウントするために、帯域１を、外側神経節隆起の脳室内帯域から脳外套−外套下間境界部へと広がる領域と規定した。帯域２は、外側皮質から、新皮質を通り、皮質半球までの領域と規定した。
ＮＯＤ−ＳＣＩＤ ＩＬ２ＲＧ−／−マウス新生仔の体性感覚新皮質をターゲティングする移植は、以前に記載されている通りに実行した（Ｗｏｎｄｅｒｓら、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ、３１４巻：１２７〜１３６頁（２００８年））。５０〜８０×１０３個の細胞を、以下のブレグマからの座標（Ａ：２．０ｍｍ、Ｌ：２．５ｍｍ、Ｄ：１．０ｍｍ）の皮質板へと、皮質層３〜６をターゲティングして注射した。動物の管理は、ＷＣＭＣおよび米国立保健研究所における試験実施施設用ガイドラインに従った。
マウスおよびヒトの両方において、皮質介在ニューロンの主要なサブクラスは、腹側終脳から皮質への途上で、接線方向の遊走を起こす（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：４７４〜４７６頁（１９９７年）；Ｆｅｒｔｕｚｉｎｈｏｓら、Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ、１９巻（９号）：２１９６〜２２０７頁（２００９年）；およびＬｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年））。分化３２日目におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞は、ＦＡＣＳにより回収し、胚生１３．５日目のマウス胚から単離された前脳薄片へと注射した。細胞の注射は、顕微鏡による視覚的誘導下で、内側神経節隆起を注意深く標的とした。
図４Ｈは、移植部位および遊走を定量するための帯域を示す冠状半断面の概略を提示する。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の遊走能力およびそれらの皮質に到達する能力（図４Ｈの帯域２を参照されたい）を、３つの処理群（ＳＨＨ処理の２〜１８日目、６〜１８日目、および１０〜１８日目；図４Ｉ〜４Ｌ）の間で比較した。２〜１８および６〜１８条件の両方において、帯域１へと遊走した細胞は極めて少数であり、帯域２へと遊走した細胞はさらに少数であった（図４Ｋ）。皮質および線条体領域への有意で頑健な遊走を示したのは、１０〜１８日目条件だけであり、多くのＧＦＰ＋細胞は、遊走細胞と符合する二極形態を呈示した（図４Ｌ）。
注射後２日目（図４Ｍ）において、ＧＦＰ＋細胞が、注射部位から皮質（帯域２）へと遊走し、６日目（図４Ｎ）において、より顕著となることを観察した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡの後でシェッフェ検定を使用）。１０〜１８処理に由来するヒト細胞は、マウス薄片の新皮質部分への遊走の頑健な傾向を示したが、他の２つの処理群は、これを示さなかった（図４Ｉ〜４Ｎ）ことは、注目すべきことである。これらのデータは、１０〜１８日目処理細胞が、初代マウスＭＧＥ由来の介在ニューロン前駆体細胞について以前に記載された遊走特性を呈示することを示唆する（Ｌａｖｄａｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９巻：７８８１〜７８８８頁（１９９９年）；Ｓｕｓｓｅｌら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２６巻：３３５９〜３３７０頁（１９９９年）；およびＷｉｃｈｔｅｒｌｅら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２巻：４６１〜４６６頁（１９９９年））。１０〜１８日目処理細胞と対比して２〜１８日目処理細胞の遊走能力をさらに調査するために、本発明者らは、ＦＡＣＳで単離したＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞を、新生仔の遺伝子的免疫不全マウスの新皮質へと移植した。図４Ｏ〜４Ｐは、３２日目にソートしたＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞（１０〜１８日目プロトコール）の、新生仔マウスの新皮質への移植、その後の生後３０日目に固定した切片におけるそれらの評価を示す。ＳＨＨ １０〜１８プロトコールに由来するＭＧＥ様細胞（図４Ｐ）とは著しく対照的に、ＳＨＨ ２〜１８プロトコール（図４Ｏ）も、ＳＨＨ ６〜１８プロトコール（図示しない）も、移植部位からの広範な遊走を結果としてもたらさなかった。移植の４週間後において、本発明者らは、マウス皮質内の放射面および接平面の両方において、広範な遊走を観察したが、１０〜１８日目群（図４Ｏおよび４Ｐ）に限られた。
同様の結果は、成体皮質への移植時にも得られた（図５）が、３０日目までの、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の全般的遊走は、新生仔移植と比較して、それほど広範ではなかった。図５は、成体マウス皮質内のＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ニューロン前駆体細胞の分布を示す。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ発現細胞を、分化３２日目にソートし、成体ＩＬ２ＲＧ免疫不全マウスへと移植した。２〜１８条件（図５Ａ）および６〜１８条件（図５Ｂ）は、３０日後に皮質においてＧＦＰ発現領域をもたらしたが、ＧＦＰ細胞体は、移植コアから移出しなかった。ＧＦＰ発現細胞が、移植コアから移出し、皮質実質の全体にわたり分布したのは、１０〜１８条件（図５Ｃ）に限られた。加えて、１０〜１８条件に由来するＧＦＰ発現細胞は、皮質層の全体にわたり分布し、ニューロン形態を示す（図５Ｄ）。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける介在ニューロン前駆体細胞の成熟の程度を決定するために、本発明者らは、１０〜１８日目群に由来する移植された細胞における形態的外見および介在ニューロン関連マーカーの発現を評価した（図６）が、これにより、新生仔マウス新皮質への移植後における、Ｎｋｘ２．１−ＧＦＰ＋細胞による分化の緩徐なペースが実証される。３２日目まで「ＭＧＥ様プロトコール」（ＳＨＨ １０〜１８）により分化させ、次いで、ＧＦＰについてのＦＡＣＳにかけ、遺伝子的免疫不全マウスの新生仔新皮質へと移植し、６週間後に、固定した切片について評価した、Ｎｋｘ２．１−ＧＦＰ系の移植（方法を参照されたい）の例が示される。図６Ａは、ＧＦＰ免疫蛍光標識についての低倍率図を示す。スケールバーは１００μｍである。四角く囲った領域は３個の細胞を示し、パネル内でより高倍率で示す（図６Ａ１）。ｉｎ ｖｉｖｏにおける分化の６週間後であってもなお、これらの細胞の大半は、しばしば先端が成長円錐（矢印）であり、二極性または単極性突起を有する比較的未分化の外見を有し続けることに注目されたい。スケールバーは２０μｍである。図６Ｂは、ヒト特異的な細胞マーカーであるＳＣ１２１（図６Ｂ、６Ｂ１、および６Ｂ３）およびＧＦＰ（図６Ｂ、６Ｂ１、および６Ｂ２）についての免疫蛍光を示す。全てのＧＦＰ＋細胞は、ＳＣ１２１を発現し、ほぼ全てということはないが大半のこの年齢のＳＣ１２１細胞は、ＧＦＰを発現する（矢印）。移植の２週間後において、同様の低百分率のＳＣ１２１＋／ＧＦＰ−細胞が見られる（示さない）通り、これらの細胞が、Ｎｋｘ２．１およびＧＦＰの下方調節を表すのか、ＦＡＣＳを通過したＧＦＰ−細胞を表すのかは不明である（図６Ｂ：スケールバー＝３５μｍ、図６Ｂ１〜６Ｂ３：スケールバー＝４０μｍ）。図６Ｃは、ＧＡＢＡおよびＧＦＰについての免疫蛍光を用いた同じ切片図を示す。強く共標識された２つの細胞を、矢印で指し示す。ＧＡＢＡの免疫検出は、切片内によく浸透しないので、細胞体が切片の切り口から５ミクロン以内に位置するＧＦＰ＋細胞だけを選択的にカウントすることにより、共標識を定量した。このアプローチにより、２つの６週間後移植片に由来する細胞５１個中４６個（９０．２％）が、強く共標識された。スケールバーは４０μｍである。図６Ｄは、ＧＦＰ、Ｎｋｘ２．１、およびニューロン前駆体細胞のマーカーであるＤＣＸ（青色；疑似カラーのＣｙ５シグナル）についての免疫蛍光を示す。全てのＧＦＰ＋細胞は、Ｎｋｘ２．１発現核（矢印）を有し、また、ＤＣＸについて共標識されている。スケールバーは４０μｍである。
移植（新生仔マウス皮質）の１および２カ月後のいずれにおいても、大半のヒト細胞は、二極性または単極性形態を有する未分化の外見を呈示し、ＮＫＸ２．１を発現し続けた。さらに、多極性形態を有する移植細胞を含む本質的に全ての移植細胞が、ニューロン前駆体細胞マーカーであるＤＣＸを発現した（図６）。齧歯動物において生じる通り、ヒト介在ニューロン前駆体細胞のうちの大多数が、ＧＡＢＡを発現した（４６／５１のＧＦＰ＋細胞が、切片表面に位置した；図６）。これに対し、Ｎｋｘ２．１系統の介在ニューロンの主要なサブクラスにおいて検出される２つのタンパク質である、パルブアルブミン（ＰＶ）またはソマトスタチン（ＳＳＴ）についての共標識は存在しなかった。この結果は、移植の６週間後までであってさえ、Ｎｋｘ２．１−ＧＦＰ＋細胞が、成熟介在ニューロンへとまだ分化していないことを指し示す（図６）。
マウス宿主皮質における、移植されたＧＦＰ＋細胞の分化の見かけの欠如に対する１つの説明は、マウス皮質介在ニューロンにおいて生じるように、ＮＫＸ２．１が、成熟後に下方調節され（Ｍａｒｉｎら、Ｊ Ｓｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０巻：６０６３〜６０７６頁（２０００年））、より分化した細胞によるＧＦＰ発現の喪失が結果としてもたらされるということでありうる。この可能性について調べるため、切片を、ヒト特異的な汎ニューロンマーカーであるＳＣ１２１の発現について検討した（Ｋｅｌｌｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０１巻：１１８３９〜１１８４４頁（２００４年））。予測される通り、全てのＧＦＰ＋細胞はまた、ＳＣ１２１を発現した（図６）。しかし、移植の６週間後においてもなお、ＳＣ１２１を発現するが、ＧＦＰを発現しないヒト細胞は、１０％未満（２つの６週間移植物からカウントしたＧＦＰ＋細胞３７２個のうち２５個）であった。まとめると、ヒト介在ニューロン前駆体細胞の、長期間を要する、ｉｎ ｖｉｖｏにおける成熟のペースに従う傾向におそらく起因して、移植研究は、移植の最初の２カ月以内では、成熟介在ニューロンの分化を結果としてもたらさなかった。
本開示は、マウス前脳の発達と対比した、ヒト前脳の発達における複数の驚くべき差異を指摘する。１つの差異は、ｈＥＳＣ由来の腹側前脳前駆細胞およびＣＳ１５ヒト前脳組織におけるＦＯＸＡ２のヒト特異的な発現であった。本発明者らは、長期間を要する前脳の発達、および脳サイズの明白な差異が、ＳＨＨ依存性前駆細胞の長期にわたる増殖に依存しうることを踏まえると、一過性のＦＯＸＡ２発現は、ヒト発生中においてＳＨＨシグナル伝達を長期的に必要とすることと関連しうると推測する。将来、この仮説にさらに取り組むには、ヒト腹側前脳の発生中におけるＦＯＸＡ２発現の時間経過を確立し、ＦＯＸＡ２が、フロアプレートなど、他のＦＯＸＡ２＋ ＣＮＳドメインにおいて一般に観察されるようなＳＨＨ発現と連関しうるのかどうかを決定することが重要である（ＰｌａｃｚｅｋおよびＢｒｉｓｃｏｅ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６巻：２３０〜２４０頁（２００５年））。過去の研究は、皮質介在ニューロンの発生における種間の差異が、妊娠中期におけるヒト胎児皮質内のＡＳＣＬ１＋細胞の存在に部分的に基づくことを報告している（Ｌｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年））。これらのデータにより、多くの、そして、おそらく、大半のヒト皮質介在ニューロンは、皮質自体の中で生じるという仮説がもたらされた（Ｌｅｔｉｎｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻：６４５〜６４９頁（２００２年））。これに対し、マウスにおける研究は、全てではないにせよ大半の皮質介在ニューロンが皮質下起源であることを実証した（Ｆｏｇａｒｔｙら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２７巻：１０９３５〜１０９４６頁（２００７年）；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３０巻：１５８２〜１５９４頁（２０１０年）；およびＸｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２４巻：２６１２〜２６２２頁（２００４年））。本発明者らによる研究は、とりわけこの問題に取り組むことに向けたわけではないが、本発明者らは、ＣＳ１５ヒト胚における腹側前脳内の限局的なＮＫＸ２．１の発現、および背側前脳における発現の完全な欠如を見出した（また、Ａｌｌｅｎ Ｂｒａｉｎ Ａｔｌａｓ、ｈｔｔｐ：／／ｈｕｍａｎ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ／も参照されたい）。さらに、本発明者らによる薄片培養アッセイ、およびｉｎ ｖｉｖｏの発生しつつあるマウス皮質における、ｈＥＳＣ由来の皮質介在ニューロンの遊走する能力は、ヒト皮質介在ニューロン前駆細胞が、マウスにおけるそれらの対応物と同様の、接線方向の遊走能を有することを示唆する。ｈＥＳＣ由来の皮質介在ニューロンにおける別の興味深い特徴は、ＮＫＸ２．１の持続的な発現であった。これに対し、マウス皮質介在ニューロン前駆体細胞では、ＮＫＸ２．１は、マウス皮質介在ニューロン前駆体細胞がＭＧＥから移出して、皮質へと移入する時点までに消失する（Ｍａｒｉｎら、Ｊ Ｓｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０巻：６０６３〜６０７６頁（２０００年））。本発明者らによるｉｎ ｖｉｔｒｏデータは、有糸分裂後ＮＫＸ２．１＋ニューロンの存在を示す、ヒト新皮質におけるｉｎ ｖｉｖｏの知見と符合する（Ｆｅｒｔｕｚｉｎｈｏｓら、Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ、１９巻（９号）：２１９６〜２２０７頁（２００９年））。しかし、線条体介在ニューロンは、ＮＫＸ２．１の発現を保持しながら、マウスにおける皮質介在ニューロンのマーカーを共有する（Ｍａｒｉｎら、２０００年）ので、本発明者らのデータは、本発明者らによるヒトＥＳＣ由来細胞のサブセットが、線条体介在ニューロンに対応する可能性を排除しない。
統合失調症など、ヒト精神疾患のモデル化の現在のパラダイムは、患者特異的なｉＰＳＣ由来ニューロンの使用を特色としている（Ｂｒｅｎｎａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４７３巻：２２１〜２２５頁（２０１１年）；Ｃｈｅｕｎｇら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２０巻：２１０３〜２１１５頁（２０１１年）；Ｃｈｉａｎｇら、Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１６巻：３５８〜３６０頁（２０１１年）；Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、Ｃｅｌｌ、１４３巻：５２７〜５３９頁（２０１０年）；およびＰａｓｃａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、１７巻：１６５７〜１６６２頁（２０１１年））。しかし、これらの公表された研究は、ニューロン亜型の独自性が不明であり、亜型特異的なシナプス特性および機能的特性の特徴付けが限定的であった、混合神経細胞培養物において実施された。統合失調症における介在ニューロン関連Ｅｒｂｂ４受容体など、遺伝子欠損を、精神障害と連関させようと試みる死後知見の集約がなされている（Ｆａｚｚａｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：１３７６〜１３８０頁（２０１０年））。したがって、ヒト疾患をモデル化するためには、成熟皮質介在ニューロンの精製された集団へのアクセスが不可欠である。本発明者らによる結果は、発生上の合図に対するタイミングを計った曝露の後における、皮質介在ニューロンの非常に効率の高い導出が可能であることを実証する。本発明者らは、推定ｈＥＳＣ由来ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、他のヒト介在ニューロンおよび興奮性マウス投射ニューロンの両方からのシナプス入力を受容することを見出す。加えて、皮質介在ニューロンの神経化学特性を伴う細胞は、マウス皮質培養物上に播種して３０日以内に、かなり成熟した生理学的特性を成立させる。
（実施例４）
前脳ニューロン前駆体細胞の表現型成熟およびシナプス成熟
本実施例では、前脳ニューロン前駆体細胞の表現型成熟およびシナプス成熟が実証される。
皮質介在ニューロン発生については、マウス胚ＭＧＥ由来の前駆細胞を、主にマウス皮質錐体ニューロンおよびグリアから構成される「フィーダー培養物」上に播種した共培養系を使用して研究されている（Ｘｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２４巻：２６１２〜２６２２頁（２００４年））。
ヒト介在ニューロンの成熟の態様が、この系では、異種移植片と比べて加速されるのかどうかを決定するために、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞は、分化３２日目において、ＦＡＣＳにより回収し、解離させたマウス胚皮質の培養物上に再播種した（図４Ａ）。この図は、ヒトＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞（３２日目におけるＦＡＣＳの後における）を播種した、皮質興奮性ニューロン培養物の、胚生１３．５日目（Ｅ１３．５）マウスからの調製を示す。
全細胞電圧クランプ記録および全細胞電流クランプ記録は、以前に記載された（Ｙｉｎｇら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２３巻：４６５〜４８０頁（２００６年）；ＹｉｎｇおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ、９３巻：１９３５〜１９４８頁（２００５年）；ならびにＹｉｎｇら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２７巻：８７１９〜８７３２頁（２００７年））ように、そして方法を本研究のために若干改変して実施した。略述すると、４倍の対物レンズおよび４０倍の水浸対物レンズを装備したＮｉｋｏｎ顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ ＦＮ１）を使用して、ニューロンを可視化し、落射蛍光法を使用して、ＧＦＰ陽性ニューロンを同定した。ニューロンは、２３〜２４℃で記録した。入力抵抗は、小電流パルス（−２または５ｐＡ、５００ミリ秒）を細胞内注入することにより誘発された電圧応答から測定した。電気シグナルは、Ｃｌａｍｐｅｘ １０．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用するインターフェースへと接続されたＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器を使用して得た。液間電位は、オフラインで計算および補正した（ＹｉｎｇおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ、９３巻：１９３５〜１９４８頁（２００５年））。
記録の間、ニューロンは、：１２６のＮａＣｌ、２６のＮａＨＣＯ３、３．６のＫＣｌ、１．２のＮａＨ２ＰＯ４、１．２のＭｇＣｌ２、２のＣａＣｌ２、および１７のグルコース（ｍＭ単位）を含有する新たに調製されたＡＣＳＦで持続的に潅流し、溶液を、９５％のＯ２−５％のＣＯ２で飽和させた。ＥＰＳＣについての、全ての電流クランプ記録ならびに電圧クランプ記録のためのピペット溶液は、：１３５のＫ−グルコン酸、５のＮａＣｌ、１０のＨＥＰＥＳ、０．５のＥＧＴＡ、３のＫ２−ＡＴＰ、０．２のＮａ−ＧＴＰ、および１０のＮａ２−ホスホクレアチン（ｍＭ単位）を含有し、ＫＯＨで７．３にｐＨ調整した。ＩＰＳＣの電圧クランプ記録については、ピペット溶液は：１３０のＣＨ３ＳＯ３Ｃｓ、８．３のＣＨ３ＳＯ３Ｎａ、１．７のＮａＣｌ、１のＣａＣｌ２、１０のＥＧＴＡ、２のＭｇ２−ＡＴＰ、０．３のＮａ−ＧＴＰ、１０のＨＥＰＥＳ（ｍＭ単位）を含有し、ｐＨは、ＣｓＯＨで７．２に調整した（ＹｉｎｇおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ、９３巻：１９３５〜１９４８頁（２００５年））。電圧クランプ実験のための浴溶液は、電流クランプ記録のための浴溶液と同じであった。短い電流パルスを適用して、閾値（１倍）〜閾上（４倍または５倍）の強度における発火特性について調べた。薬物は、少なくとも２分間にわたる灌流により適用した。（−）−ビククリンメトクロリドは、Ｔｏｃｒｉｓ製であり、テトロドトキシン（ＴＴＸ）は、Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）製であり、他の全ての化合物は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。データの加工および解析は、既に記載されている通り、ＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ、Ｄｅｃａｔｕｒ、ＧＡ）およびＣｌａｍｐｆｉｔ １０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して実施した（Ｙｉｎｇら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２３巻：４６５〜４８０頁（２００６年）；およびＹｉｎｇら、２００７年）。
皮質細胞は、腹側由来の介在ニューロンの背側新皮質への移入の前の段階（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：４７４〜４７６頁（１９９７年））である、Ｅ１３．５マウス胚から単離した。したがって、この共培養物系は、グルタミン酸作動性皮質錐体ニューロンの存在下で発生しつつある、ヒトＮＫＸ２．１＋細胞による正常な発生の態様を模倣する。研究は、３つのＳＨＨ処理レジメンの各々から導出されたＧＦＰ＋細胞を使用して、並行して実施した（図７）。
図７Ｂ〜７Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの３０日後（ＤＩＶ）において、ＳＨＨ １０〜１８条件に由来する培養物が、ＧＡＢＡを共発現するＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞について濃縮されることを示す（図７Ｂ；図７Ｃで定量化した；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡの後でシェッフェ検定を使用）。これに対し、ＳＨＨ ６〜１８条件だけは、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰの、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）との共標識について濃縮された（図７Ｄ；図７Ｅで定量化した；＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡの後で、シェッフェ検定を使用）。図７Ｆおよび７Ｇは、２８ ＤＩＶにおいて記録した、１０〜１８日目ＳＨＨ（図７Ｆ）ニューロンおよび６〜１８日目ＳＨＨ（図７Ｇ）ニューロンについてのスパイキングパターンを示す。活動電位は、下方に示すプロトコールにより誘発した。図７Ｈ〜７Ｋは、自発的スパイキングが、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるビククリンの非存在下（図７Ｈおよび７Ｉ）および存在下（図７Ｊおよび７Ｋ）において、ＧＡＢＡ作動性（１０〜１８日目ＳＨＨ）ニューロンおよびコリン作動性（６〜１８日目ＳＨＨ）ニューロンについて濃縮される培養物から記録されたことを示す。ビククリンが、６〜１８条件における自発的発火活性に対してほとんど影響を及ぼさなかったことは、マウスフィーダー細胞またはこのプロトコールにより発生させたヒトＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞に由来するＧＡＢＡ作動性細胞の欠如と符合する。
ｉｎ ｖｉｖｏ研究とは対照的に、２〜１８「視床下部様」培養物に由来するＧＦＰ＋細胞のうちの４０％、および６〜１８培養物に由来するＧＦＰ＋細胞のうちの１５％と対比して、１０〜１８処理「ＭＧＥ様」培養物に由来するＧＦＰ＋細胞のうちのおよそ８０％が、ＧＡＢＡを発現したことは、注目すべきことである。同様に、終脳（ＦＯＸＧ１＋）細胞については濃縮されるが、介在ニューロン前駆体細胞のＬＨＸ６を発現する細胞については濃縮されない（図３Ｄを参照されたい）６〜１８培養物は、ＮＫＸ２．１系統のニューロンの他の主要な神経伝達物質で規定されるサブクラス、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現する細胞について有意に濃縮された。本発明者らは、次に、１０〜１８日目処理培養物（ＧＡＢＡの乏しい６〜１８培養物と比べて、ＧＡＢＡニューロンについて濃縮された）に由来するＧＦＰ＋細胞が、ＧＡＢＡ作動性シナプス伝達を起こすニューロンをもたらすのかどうかを決定した。同定されたＧＦＰ＋細胞についての、全細胞パッチクランプ電気生理学的試験（図７Ｆ〜７Ｋ）は、１０〜１８日目および６〜１８日目処理培養物のいずれにおいても、自発的発火を示した（図７Ｈおよび７Ｉ）。しかし、ＧＡＢＡ−Ａ受容体アンタゴニストであるビククリンに応答して、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞の発火率のモジュレーションを示したのは、１０〜１８日目群だけであった（図７Ｊ）。皮質フィーダーは、極めて少数のマウス介在ニューロンしか含有しなかった（１０〜１８日目および６〜１８日目共培養条件のいずれにおいても）ので、これらの結果は、ｈＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンが、抑制性シナプスの出力を媒介することを指し示す（図８もまた、参照されたい）。したがって、ＧＡＢＡ作動性ニューロンがより希少である６〜１８日目培養物（図７Ｃ）では、ビククリン曝露後における発火率は、不変のままであった（図７Ｋ）。
１０〜１８日目プロトコールを使用して発生させたＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞へのシナプス入力をさらに解析するために、本発明者らは、自発的シナプス後電流および抑制性または興奮性シナプスマーカーの局在について検討した。マウス皮質フィーダー上で３０日間にわたり培養したＧＦＰ＋細胞は、ＧＡＢＡ作動性シナプスのシナプス前終末内に存在する、高レベルの小胞ＧＡＢＡトランスポーター（ＶＧＡＴ）を発現した。
図８は、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンが、興奮性および抑制性シナプス入力の両方を受容することを示す。図８Ａ〜８Ｅは、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋、小胞ＧＡＢＡトランスポーター（ＶＧＡＴ）、およびシナプス後ＧＡＢＡ作動性マーカーであるゲフィリンを示す、焦点面をずらしたｚ積層化共焦点画像を示す。図８Ａ。ゲフィリンと共標識されたこのＧＦＰ＋細胞の樹状突起は、ＶＧＡＴを発現するシナプス前終末を受容している（矢印）。加えて、ＧＦＰ＋軸索突起は、ＧＦＰ陰性でゲフィリンを発現するシナプス後突起に隣接したＶＧＡＴ＋シナプス前終末を形成した（アステリスク）。
図８Ｆは、全細胞パッチクランプにより、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ニューロン（ＳＨＨ １０〜１８プロトコール）から記録される自発性抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）であって、ＧＡＢＡ−Ａ受容体アンタゴニストであるビククリンを添加することにより可逆的に遮断されるｓＩＰＳＣが明らかにされることを示す。図８Ｇ〜８Ｋは、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ、小胞グルタミン酸トランスポーター１（ＶＧＬＵＴ１；図８Ｇ）、およびシナプス後マーカーであるＰＳＤ−９５（図８Ｃ）を示す、焦点面をずらしたｚ積層化共焦点画像である。このＧＦＰ＋細胞は、ＶＧＬＵＴ１を発現するシナプス前終末に隣接する、ＰＳＤ−９５で共標識された樹状突起を有する。ＶＧＬＵＴ１を発現させるＧＦＰ陰性細胞の存在（図８Ｇの矢印）により、培養物中の興奮性グルタミン酸作動性ニューロンの存在が確認されることに注目されたい。図８Ｌは、自発性興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）が、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ニューロン（１０〜１８）において検出されたことは、グルタミン酸作動性シナプス入力の見かけの存在と符合することを示す。
全ての細胞を、３２日目のＮＫＸ２．１：：ＧＦＰについてのＦＡＣＳの後において、マウス皮質フィーダー上に播種した。ＧＦＰ＋細胞内のＶＧＡＴの細胞内局在は、ＧＡＢＡ作動性シナプス後マーカーであるゲフィリンの発現に緊密に合致した（図８Ａ〜８Ｅ）。全細胞パッチクランプ解析により、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞が、ＧＡＢＡ−Ａ受容体アンタゴニストであるビククリンを添加することにより可逆的に遮断される、自発性抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ；図５Ｆ）を受容することが実証された。ＧＦＰ＋推定樹状突起に隣接した小胞グルタミン酸トランスポーター１（ＶＧＬＵＴ１）の発現、およびシナプス後興奮性シナプスマーカーであるＰＳＤ−９５との共標識の存在により実証される通り、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞は、抑制性入力に加えて、興奮性入力も受容する（図８Ｇ〜８Ｋ）。自発性興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ；図８Ｌ）もまた、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋ニューロンにおいてたやすく検出されたことは、グルタミン酸作動性シナプス入力の存在と符合する。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞における自発的シナプス活性についてのより詳細な解析は、図９および表２Ｂ中で提供する。
図９Ａは、１０〜１８日目群のニューロンから記録された自発性かつ微小ＩＰＳＣの例を示す。図９Ｂは、平均ｓＩＰＳＣ（グレー；ｎ＝１５０）と、平均ｍＩＰＳＣ（黒色；ｎ＝５６）との重合せを示す。ニューロンは、マウス皮質フィーダー上の２６〜３０日目に記録した。図９Ｃは、ＩＰＳＣ（グレー）およびｍＩＰＳＣ（黒色）についての累積確率ヒストグラムを示す。図９Ｄは、分化３０日目における、ヒトＥＳＣ由来の皮質前駆体細胞におけるｓＩＰＳＰ（グレー；ニューロンマーカー（ＭＡＰ２）、星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）、ＧＡＢＡ、および皮質マーカー（ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１））の周波数を比較する、群分けしたデータを示す。全ての細胞は、３２日目のＮＫＸ２．１：：ＧＦＰについてのＦＡＣＳの後において、マウス皮質フィーダーまたはヒトＥＳＣ由来の皮質フィーダー上に播種した。
皮質介在ニューロンは、皮質の発達および機能において異なる役割を有するニューロン型の多彩なセットを含む（Ｂａｔｉｓｔａ−Ｂｒｉｔｏら、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ、８７巻：８１〜１１８頁（２００９年））。本発明者らによるマウス皮質フィーダー系における比較的急速な成熟のペースにより、他のより成熟した介在ニューロンマーカーの共発現について評価し、ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞におけるＧＡＢＡおよびＣｈＡＴ以外の神経伝達物質表現型を規定することが可能となった。
図６は、マウス皮質フィーダー上で３０ ＤＩＶにわたり増殖させたＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞についての神経化学プロファイルを示す。細胞は、表示のマーカーについての免疫蛍光により標識し、結果を、グラフ中で定量化した（Ａ〜Ｅ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡの後で、シェッフェ検定を使用：（＊）ｐ＜０．０５、６〜１８群と直接比較した場合；標準的なシェッフェ検定では、ｐ値は有意性に到達しなかった：ｐ＝０．０８）。パネル（図６Ｆ〜６Ｊ）は、細胞標識の代表的な画像を示す。ＳＨＨ ２〜１８条件では、細胞の大半は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；図６Ａ、６Ｆ）およびｎＮＯＳ（図６Ｂ、６Ｇ）と共標識された。１０〜１８条件では、ＧＦＰ＋細胞の多くは、それらの各々が、ヒトでは、成熟皮質介在ニューロンの部分集団において存在する、カルビンディン（Ｃａｌｂ；図６Ｃ、６Ｈ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ；図６Ｄ、６Ｉ）、およびパルブアルブミン（図６Ｅ、６Ｊ）と共標識された。全ての細胞を、３２日目におけるＮＫＸ２．１：：ＧＦＰについてのＦＡＣＳの後において、マウス皮質フィーダー上に播種した。
２〜１８日目群では、ＴＨを発現するＧＦＰ＋細胞の大きな百分率が観察され（図６Ａ）たが、これは、多くのＮＫＸ２．１系統の視床下部ニューロンのドーパミン作動性の性質と符合する（Ｙｅｅら、Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ、５１７巻：３７〜５０頁（２００９年））。ｎＮＯＳおよびカルビンディンについての免疫組織化学は、２〜１８日目群に由来するＧＦＰ＋細胞において、高百分率のｎＮＯＳ細胞を示した一方、高百分率のカルビンディン＋ニューロンが、１０〜１８日目群において存在した（図６Ｂ、６Ｃ）。
１０〜１８日目群ではまた、ＳＳＴおよびＰＶ（図６Ｄ、６Ｅ）を含む、分化した皮質介在ニューロンに特徴的な他のマーカーの発現も観察された。ＮＫＸ２．１：：ＧＦＰと共発現した、各亜群マーカーについての代表的画像を図６Ｆ〜６Ｊにおいて提示する。ＶＩＰを発現するニューロンも、カルレチニンを発現するニューロンも観察されなかったことから、マウスの発生中において、尾側神経節隆起の特徴を呈示する細胞の非存在が示唆される（Ｘｕら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２４巻：２６１２〜２６２２頁（２００４年））。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて皮質介在ニューロンにおけるこのマーカーの発現が、発生上後期の発現であることを踏まえると、ＮＫＸ２．１＋／ＰＶ＋の導出は、特に注目すべきことであった（Ｚｅｃｅｖｉｃら、Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、７１巻：１８〜３３頁（２０１１年））。自動式画像解析（Ｏｐｅｒｅｔｔａ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔスキャナー）によりＧＦＰ＋／ＰＶ＋としてカウントされた細胞のサブセットだけが、高レベルのＰＶ発現を示し、介在ニューロン様形態を呈示した（全ＧＦＰ＋細胞のうちの約５％（図６Ｊ））。
これらの結果は、選択的な皮質介在ニューロン亜型の導出をさらに最適化する必要性を強調する。しかし、ＰＶ＋ｈＰＳＣ由来ニューロンが発生したという事実は、マウス胚皮質ニューロンを使用する共培養戦略が、ｈＰＳＣ由来の介在ニューロンにおいて亜型特異的な神経化学マーカーの発現を促進する有益なプラットフォームを表すことを示唆する。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮｋｘ２．１−ＧＦＰ＋推定介在ニューロン前駆体細胞の成熟が長期間を要することを踏まえ、本発明者らは、共培養物系において、介在ニューロン様分化の形態的証拠、マーカーベースの証拠、および生理学的証拠を得たことに驚いた。ヒト皮質投射ニューロンについて濃縮された培養物上で増殖させた同じＧＦＰ＋細胞もまた、成熟の加速を示すのかどうかを決定するために、本発明者らは、ＦＡＣＳで精製したＮＫＸ２．１：：ＧＦＰ＋細胞を、マウス皮質ニューロン上対ヒト皮質ニューロン上いずれかにおいて、並行して共培養する試験を実施した。図１０は、初代マウス皮質フィーダー細胞と対比したヒトＥＳＣ由来の皮質フィーダー細胞の表現型特徴付けを示す。図１０Ａ〜１０Ｄは、ＣＤ２４の発現ならびにＣＤ４４およびＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現の欠如に基づく皮質ニューロン前駆体細胞のＦＡＣＳを媒介する単離を示す。図１０Ｅ〜１０Ｌは、分化３０日目のｈＥＳＣ由来の皮質前駆体細胞におけるニューロンマーカー（ＭＡＰ２）、星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）、ＧＡＢＡ、および皮質マーカー（ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１）の発現についての免疫細胞化学解析を示す。図１０Ｍ〜１０Ｔは、Ｅ１３．５マウス皮質培養物におけるニューロンマーカー（ＭＡＰ２）、星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）、ＧＡＢＡ、および皮質マーカー（ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１）の発現についての免疫細胞化学解析を示す。全体的に、本発明者らは、初代マウス皮質フィーダーとｈＰＳＣ由来の皮質フィーダーとの間で、同等なマーカー発現を観察した。
ヒト皮質フィーダーは、ｈＥＳＣを分化させた（改変ＸＬＳＢ条件、方法を参照されたい）後で、ＣＤ４４−／ＣＤ１８４＋／ＣＤ２４＋ニューロンについてのＦＡＣＳ（Ｙｕａｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、６巻：７５４０頁（２０１１年））を行って得た（図１０Ａ〜１０Ｄ）。ｈＥＳＣ由来ニューロンの皮質ニューロンの独自性を、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、およびＳＡＴＢ２の発現により確認したところ、極めて少数のＧＦＡＰ＋細胞またはネスチン＋細胞しか存在しなかった（図１０Ｅおよび１０Ｔ）。興味深いことに、本発明者らは、表２Ａにおいて示される通り、ヒト皮質フィーダー上に播種されたＮＫＸ２．１＋細胞の電気生理学的成熟と対比した、マウス皮質フィーダー上に播種されたＮＫＸ２．１＋細胞の電気生理学的成熟の一貫した差異を観察した。
記録は、マウスフィーダー条件については、１４〜１６ ＤＩＶまたは２０〜３０ ＤＩＶにおいて、ヒト皮質フィーダー条件については、２０〜３０ ＤＩＶにおいて得た。マウスフィーダー上に播種した、１０〜１８および６〜１８群のいずれについての基本的な電気生理学的特性の解析も、分化のより後期時点において、より成熟した特徴を示した。時間と共に、静止膜電位（ＲＭＰ）の有意な過分極、ならびに入力抵抗（Ｒｉ）の減少が見られた。加えて、活動電位は、立ち上がり時間および半値幅の減少により証拠立てられる通り、急速で狭くなった。これに対し、ヒトフィーダー層上に播種した２０〜３０日後に記録された、１０〜１８日目条件によるＧＦＰ＋ニューロンは、マウスフィーダー層上に播種した、より若齢の１４〜１６ ＤＩＶニューロンにおいて見られる測定値と同等な、比較的未成熟な特徴を保持した。皮質フィーダー条件下におけるＲＭＰ、活動電位の立ち上がり時間、活動電位の半値幅、および入力抵抗は、同じＤＩＶ範囲で記録した、マウスフィーダー上の１０〜１８ニューロンと比較して有意に異なった。多様な条件下における定性的発火特性を示す試料出力波形を、ＮＫＸ２．１＋皮質介在ニューロンからの代表的な電流クランプ記録を提示する図１１に示す。図１１Ａ〜１１Ｃは、推定大脳皮質投射ニューロンについて濃縮された、マウスフィーダー（図１１Ａおよび１１Ｂ）上またはヒトＥＳ由来ニューロン（図１１Ｃ）上で記録した、１０〜１８日目処理群に由来するＧＦＰ陽性ニューロンからの代表的な出力波形記録を示す。脱分極電圧応答は、出力波形の各セットの下方に示したプロトコールを使用して誘発した。全ての記録について、保持電位は、−６０ｍＶであった。全ての細胞を、３２日目のＮＫＸ２．１：：ＧＦＰについてのＦＡＣＳの後において、マウス皮質フィーダーまたはヒトＥＳＣ由来の皮質フィーダー上に播種した。
本開示は、提起された培養系により、統合失調症および自閉症などの精神障害における皮質介在ニューロン病態をモデル化するために鍵となる前提条件である、シナプスが活性な皮質介在ニューロンを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてもたらしうることを実証する。統合失調症におけるＰＶ介在ニューロンの機能不全の含意を踏まえると、これらの培養物中の、ｈＥＳＣ由来のＰＶを発現するニューロンの発生、およびスパイキングが比較的急速な非適応型ニューロンの存在は、特に興味深い（ＢｅａｓｌｅｙおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ Ｒｅｓ、２４巻：３４９〜３５５頁（１９９７年）；ならびにＷｏｏら、Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１５４巻：１０１３〜１０１５頁（１９９７年））。急速スパイキングＰＶ＋皮質介在ニューロンは、霊長動物の出生前発生の後期において観察され、成年初期まで成熟し続ける（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、６７巻：７〜２２頁（１９９５年）；およびＩｎｓｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ、４６８巻：１８７〜１９３頁（２０１０年））。多様な病態下におけるＰＶ＋ニューロンの重要な役割を踏まえると、本発明者らによるデータは、このような状態の疾患モデル化が、本発明者らの分化戦略を使用して実施可能であることを示唆する。将来に向けた別の鍵は、ＰＶ＋細胞と対比したソマトスタチン＋細胞など、特定の皮質介在ニューロン亜群の濃縮された発生を可能とするプロトコールの開発である。ＭＧＥ前駆細胞における本発明者らによる以前の結果は、この決定もまた、ＳＨＨシグナル伝達の制御下にある可能性があり、より高レベルであれば、ソマトスタチン＋ニューロンを促進し、より低レベルであれば、ＰＶ＋ニューロンを促進することを指し示す（Ｘｕら、Ｎｅｕｒｏｎ、６５巻：３２８〜３４０頁（２０１０年））。最後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導出されたヒト皮質介在ニューロンの、再生医療における適用のために、完全なｉｎ ｖｉｖｏにおける潜在的可能性を扱うには、将来の研究が必要となる。本開示は、新生仔マウス皮質への移植時における、ｈＥＳＣ由来の皮質介在ニューロンの、注目すべき遊走能力を例示する。病理学的発作活動をモジュレートすること（Ｂａｒａｂａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６巻：１５４７２〜１５４７７頁（２００９年））、パーキンソン病の態様を処置すること（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｅｒｄｅｎｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、６巻：２３８〜２５０頁（２０１０年））、および生後脳内で学習および可塑性を誘導すること（Ｓｏｕｔｈｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７巻：１１４５〜１１４８頁（２０１０年））における、皮質介在ニューロン移植片の使用の潜在的可能性を踏まえると、疾患についての複数の成体ＣＮＳモデルへの移植研究は、特に興味深い。このような移植研究についての１つの具体的な難題は、移植されたｈＰＳＣ由来の皮質介在ニューロン前駆体細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける長期間を要する成熟である。長期にわたる予備的な、成体マウス皮質への移植研究により、それらの持続的な緩徐な成熟速度が確認され、ＮＫＸ２．１＋推定介在ニューロン前駆体細胞は、移植の３カ月後において、未成熟な成長円錐を保持し、限定的な統合を示す（データは示さない）。これらのデータは、迅速な機能的な統合および表現型の成熟がたやすく達成された、本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける共培養物による研究と対照的である。まとめると、本研究は、発達の多様な態様を研究するのに使用される可能性があり、多種多様な神経精神疾患に関与している特定のニューロン型の機能不全について研究するための強力なｉｎ ｖｉｔｒｏプラットフォームとして用いることができる、異なる腹側前脳ニューロン型の発生についての枠組みを提供する。
まとめると、本開示は、機能的な成熟のペースが、局所環境の影響を受けることを示唆する。明らかに、ヒトフィーダー細胞と対比した、マウスフィーダー細胞の存在下における、より迅速な成熟速度の機構は、いまだ決定されていない。皮質ニューロンの種特異的な成熟速度により、皮質介在ニューロンの成熟のタイミングが誘発されるという可能性もある（例えば、活性を調節することにより）が、単純に、ヒトフィーダー中と対比して、マウスフィーダー中には、成熟を促進する星状細胞がより多いという可能性もある（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２７巻：３０６９〜３０７７頁（２００７年））。将来の研究は、本発明者らによる知見をさらに補強するように、ヒト胚起源の初代皮質ニューロンとの共培養を含むべきである。機構に依存せずに、本発明者らによるデータは、マウスによる共培養条件が、機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を実施のために適切なｈＥＳＣ由来の皮質介在ニューロンの効率的な成熟を可能とすることを実証する。
（実施例５）
（予測的実施例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ））
ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させた皮質介在ニューロンを使用して、薬物をスクリーニングするための方法
本実施例は以下を示す。
神経変性および神経精神疾患のための細胞ベースの薬物スクリーニングは、初代ニューロンの不足およびニューロンを細胞系で置き換えることの困難により制限されている。大半のニューロンは、有糸分裂後であり、したがって、ＨＴＳに適する量で産生することが困難である。しかし、本開示により実証される通り、ＥＳＣおよびｉＰＳＣなどのヒト幹細胞は、ニューロンへと分化させることができ、したがって、ニューロンを使用する薬物スクリーニングを、より利用しやすいものとする。
ｉＰＳＣは、例えば、本明細書で開示され、そうでなくとも、当技術分野で公知の方法により、ヒト線維芽細胞から得ることができる。心筋細胞（例えば、Ｖａｎ Ｏｏｒｓｃｈｏｔ ＡＡら、Ｐａｎｍｉｎｅｒｖａ Ｍｅｄ．、２０１０年６月、５２巻（２号）：９７〜１１０頁を参照されたい）、肝細胞（例えば、Ａｌａｉｍｏ Ｇ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０１３年６月、２２８巻（６号）：１２４９〜５４頁を参照されたい）、腎細胞（例えば、Ｄｅ Ｃｈｉａｒａ Ｌ．ら、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２０１４年２月、２５巻（２号）：３１６〜２８頁を参照されたい）、膵臓ベータ細胞（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｅ．ら、Ｊ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．、２０１２年；７巻（４号）：２１１〜２８頁を参照されたい）、白血球（例えば、ｄｅ Ｐｏｏｔｅｒ ＲＦら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２００７年、３８０巻：７３〜８１頁を参照されたい）を含む、様々な体細胞をもたらす分化プロトコールが公知である。
加えて、本開示は、ＳＭＡＤ／Ｗｎｔ阻害とＳＨＨ活性化との組合せを使用して、幹細胞を、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロンへと分化させうることを裏付ける。これらのニューロンは、精製し、ハイスループットスクリーニングなど、公知のスクリーニング法を使用して、候補薬物をスクリーニングするために使用することができる。
細胞をスクリーニングのために準備できたら、それらを播種して、多様な播種密度および細胞培養容器について調べることができる。例えば、これらの細胞は、６ウェルプレート上、２４ウェルプレート上、９６ウェルプレート上、３８４ウェルプレート上、または薬物スクリーニングを容易にする他の任意のプラットフォーム上に播種することができる。適切なＨＴＳフォーマットを選択したら、栄養素の中止の開始時点および持続期間も最適化される。
ニューロンを含む、幹細胞由来の体細胞に基づく薬物スクリーニングについては記載されている。例えば、Ｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、１２巻：７１３〜７２６頁（２０１３年）を参照されたい。略述すると、低分子生存スクリーニングは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に対抗する薬物を探索するために、野生型のＳＯＤ１マウス胚性幹細胞および突然変異体のＳＯＤ１マウス胚性幹細胞の両方に由来する運動ニューロン（ＭＮ）を使用して実行された。マウスＥＳＣは、ＭＮへと分化させられ、９６ウェルプレート内または３８４ウェルプレート内に播種された。加えて、分化の３０日後における、ヒトＥＳＣに由来するヒトＭＮおよびヒトｉＰＳＣに由来するヒトＭＮも使用された。低分子スクリーニングのために、解離されたばかりの細胞は、ウェル１つ当たりＧＦＰ＋細胞８，０００個（３８４ウェルプレート）またはＧＦＰ＋細胞３０，０００個（９６ウェルプレート）の密度で播種された。４日後、栄養素が除去され、個々の化合物がウェルに添加された。一次スクリーニングのため、各化合物は、３つの濃度（０．１ｍＭ、１ｍＭ、および１０ｍＭ）で２回反復で調べられた。さらなる７２時間後（７日目）、細胞は固定および染色され、全ウェル内の残りのＧＦＰ＋細胞をカウントすることにより、生存するＭＮの数が解析された。生存は、栄養素なしで維持された培養物と比較した倍数増大として測定される。この方法を使用して、Ｙａｎｇおよび同僚は、ケンパウロンという化合物が、ＭＮの健常な生存を延長する目覚ましい能力を有することを発見した。
本開示で記載されているｉｎ ｖｉｔｒｏ分化法と、ＨＴＳプラットフォームとを組み合わせることにより、薬物スクリーニングを、神経変性および神経精神疾患において顕著な役割を果たす、皮質介在ニューロン、視床下部ニューロン、および視索前野コリン作動性ニューロンに対して実施することができる。例えば、ヒト皮質介在ニューロンを本開示に従い産生し、これらの細胞は薬物スクリーニングにおいて調べることができ、播種して、多様な播種密度および細胞培養容器について調べることができる。例えば、細胞は、６ウェルプレート上、２４ウェルプレート上、９６ウェルプレート上、３８４ウェルプレート上、または薬物スクリーニングを容易にする他の任意のプラットフォーム上に播種することができる。適切なＨＴＳフォーマットを選択したら、栄養素の中止の開始時点および持続期間も最適化される。
薬物スクリーニングにおける使用のための分子は、インハウスで設計することもでき、市販品を購入することもできる、低分子化合物ライブラリーを含む様々な供給源に由来しうる。皮質介在ニューロンの場合、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患のための公知の薬物分子であって、生体分子および低分子を含む薬物分子について調べることができる。このような分子を、薬物スクリーニングの有効性を最適化するために、異なる細胞密度と組み合わせた、異なる濃度でスクリーニングすることができる。例えば、Ｙａｎｇらは、約５０００の低分子のコレクションをスクリーニングして、ＡＬＳ薬を探索した。一次スクリーニングのため、各化合物を、３つの濃度（０．１ｍＭ、１ｍＭ、および１０ｍＭ）で２回反復で調べた。さらなる７２時間後（７日目）、ＭＮ細胞は固定、染色され、生存について評価された（Ｙａｎｇら、同上）。
処置を意図する疾患のほか、これらの化合物／分子の、これらの細胞に対する意図される効果に応じて、候補化合物（低分子であれ、生物学的薬剤であれ）への曝露後における皮質介在ニューロンの表現型変化を選択することができる。これらの表現型の変化として、とりわけ、細胞の生存、細胞の形態的変化、細胞によるある特定の因子の分泌、ある特定の細胞表面分子の発現、細胞と他の細胞および／または固体支持体との相互作用、細胞の光学的特性、電気的特性、および化学的特性の変化、細胞の蛍光シグナル（例えば、細胞にＧＦＰ−プロジェリンなどの蛍光タンパク質をトランスフェクトする場合）、ならびに疾患マーカーの減衰または消失が挙げられるがこれらに限定されない。本開示で記載される方法の１つの適用は、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患にとって鍵となるニューロン細胞の健常な生存を延長しうる薬物をスクリーニングすることである。したがって、薬物スクリーニングは、皮質介在ニューロンの生存を促進する化合物を選択するように設計することができる。ＰＤの場合、ＥＳＣまたはｉＰＳＣに由来する皮質介在ニューロンを培養し、播種し、化合物へと曝露し、それらの生存率を評価することができる。さらに、さらなるマーカーを、細胞生存に加えて、薬物スクリーニングのための基礎として活用することができる。例えば、皮質介在ニューロンの公知の細胞表面マーカーまたは細胞内マーカーを、薬物スクリーニングのための基準として使用することができる。１つまたは複数のこれらの機能的マーカーの発現を緩徐化しうるか、停止させうるか、または逆転させうる化合物は、これらの神経変性疾患を処置する一助となりうる薬物の候補となりうる。
ヒットとは、上記で記載した１つまたは複数の皮質介在ニューロン関連マーカーシグネチャーを効果的に逆転させる化合物／分子として定義することができる。例えば、細胞の生存を評価項目として使用する場合、細胞の適切な形態的特徴を保存しながら、生存細胞（例えば、皮質介在ニューロン）の数を実質的に増大させる分子を選択することができる。
一次スクリーニングから選択した候補化合物は、任意選択で、再度調べることができ、用量反応アッセイおよび毒性アッセイを含むがこれらに限定されない、さらなる試験に供することができる。リード化合物を選択することができ、所望の特徴を改善し、かつ／または副作用を低減するように、構造的に改変することができる。リード化合物に対する他の改善は、吸収の増大、半減期の延長、細胞に対するアフィニティーの増大、ならびに局所および／または全身送達の増強を含みうる。リード化合物およびその改変された改変体について、適切な細胞培養物における研究および動物モデル系における研究を含む前臨床研究においてさらに研究することができ、好適な治療的プロファイルおよび毒性プロファイルを呈示する化合物は、ヒト臨床試験において、さらなるｉｎ ｖｉｖｏ試験に供することができる。

Claims (25)

  1. ヒト多能性細胞または多分化能細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、該方法は、
    ヒト多能性細胞、ヒト多分化能細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の出発細胞を、少なくとも１つのＳｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達阻害剤と接触させるステップと、
    該細胞を、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達をアンタゴナイズする少なくとも１つのＷｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）アンタゴニストと接触させるステップと、
    該細胞を、少なくとも１つのＳｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化因子と接触させて、ＦＯＸＧ１を発現する分化細胞を取得するステップと
    を含み、
    ここで、該細胞の該少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子との最初の接触は、該細胞の該少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤との最初の接触から６日目以後である、
    ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法。
  2. 前記分化細胞を成熟させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記１つまたは複数の出発細胞が、ヒト胚性幹細胞、ヒト成体幹細胞、ヒト神経幹細胞、およびヒト人工多能性幹細胞からなる群から選択される、少なくとも１つの細胞のクラスを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤と接触させる前記ステップおよび前記少なくとも１つのＷｎｔアンタゴニストと接触させる前記ステップを同時または逐次的に実行し、各ステップの持続期間が、５日間〜３０日間の間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ３６４９４７、Ａ７７−０１、Ａ−８３−０１、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＧＷ６６０４、ＳＢ−５０５１２４、レルデリムマブ、メテリムマブ、ＧＣ−Ｉ００８、ＡＰ−１２００９、ＡＰ−１１０Ｉ４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ−５０５１２４、Ｅ−６１６４５２（ＡＬＫ阻害剤であるＲｅｐＳｏｘ）、ＳＤ−２０８、ＳＭＩ６、ＮＰＣ−３０３４５、Ｋｉ２６８９４、ＳＢ−２０３５８０、ＳＤ−０９３、アクチビン−Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン二塩酸塩、これらの誘導体およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ−１９３１８９を含む、請求項５に記載の方法。
  7. ＳＢ４３１５４２が、前記細胞を含む培養培地中に０．１μＭ〜１ｍＭの間の範囲内の濃度で提供される、請求項６に記載の方法。
  8. ＬＤＮ−１９３１８９が、前記細胞を含む培養培地中に１ｎＭ〜１０μＭの間の範囲内の濃度で提供される、請求項６または７に記載の方法。
  9. 前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達アンタゴニストが、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３、Ｄｋｋ−４、ＳＦＲＰ−１、ＳＦＲＰ−２、ＳＦＲＰ−５、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４、ＷＩＦ−１、Ｓｏｇｇｙ、ＩＷＰ−２、ＩＷＲ１、ＩＣＧ−００１、ＫＹ０２１１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＬＧＫ９７４、ＩＷＰ−Ｌ６、これらの誘導体およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記Ｗｎｔシグナル伝達アンタゴニストが、ＸＡＶ９３９を含む、請求項９に記載の方法。
  11. ＸＡＶ９３９が、前記細胞を含む培養培地中に１０ｎＭ〜５００μＭの間の範囲内の濃度で提供される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子が、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）、ＳＡＧ類似体、ＳＨＨ、組換えＳＨＨ、Ｃ２５−ＳＨＨ、Ｃ２４−ＳＨＨ、プルモルファミン、Ｈｇ−Ａｇ、これらの誘導体およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子が、組換えＳＨＨおよびプルモルファミンの両方を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記組換えＳＨＨが、前記細胞を含む培養培地中に５ｎｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの間の範囲内の濃度で提供される、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. プルモルファミンが、前記細胞を含む培養培地中に０．１μＭ〜２０μＭの間の範囲内の濃度で提供される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記細胞の前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子との接触を、その開始から５〜３０日で終了する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記細胞の前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子との最初の接触が、前記細胞の前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害因子との最初の接触から８〜１８日であり、前記細胞の前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子との接触を、その開始から８〜１６日で終了する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記分化細胞が、ＳＳＴ、ＰＶ、ＧＡＢＡ、カルビンディン、ＬＨＸ６、ＯＬＩＧ２、ＮＫＸ６．２、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１、ＤＬＸ２、ＡＳＣＬ１およびこれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数のマーカーをさらに発現する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記Ｗｎｔアンタゴニストと接触させる前記ステップを、前記細胞の前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害因子との最初の接触から５日以内に、好ましくは、０〜１日で開始する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ＳＢ４３１５４２を、前記細胞を含む培養培地中に０．１μＭ〜１００μＭの間の範囲内の濃度で提供する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ＬＤＮ−１９３１８９を、前記細胞を含む培養培地中に１ｎＭ〜１μＭの間の範囲内の濃度で提供する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ＸＡＶ９３９を、前記細胞を含む培養培地中に０．２μＭ〜２００μＭの間の範囲内の濃度で提供する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記細胞の前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子との最初の接触が、前記細胞の前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害因子との最初の接触から２０日目以前である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記細胞の前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化因子との最初の接触が、前記細胞の前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害因子との最初の接触から８日目〜１８日目である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記培養培地が、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地およびＫＳＲベースの培地からなる群から選択される、請求項７、８、１１、１４、１５および２２のいずれか一項に記載の方法。
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