[go: up one dir, main page]

CN119082248A - 应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用 - Google Patents

应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN119082248A
CN119082248A CN202411136421.7A CN202411136421A CN119082248A CN 119082248 A CN119082248 A CN 119082248A CN 202411136421 A CN202411136421 A CN 202411136421A CN 119082248 A CN119082248 A CN 119082248A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mscs
stress
cells
huc
inducer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202411136421.7A
Other languages
English (en)
Inventor
金志刚
张晶晶
陈俊熠
吴进一
梁锦雯
茅佳麒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Normal University CJNU
Original Assignee
Zhejiang Normal University CJNU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Normal University CJNU filed Critical Zhejiang Normal University CJNU
Priority to CN202411136421.7A priority Critical patent/CN119082248A/zh
Publication of CN119082248A publication Critical patent/CN119082248A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用，所述应激颗粒诱导剂采用表达携带可检测的标签的应激颗粒核心蛋白G3BP1和/或G3BP2的真核细胞筛选获得。本发明进一步实验结果显示所述应激颗粒诱导剂可显著抑制细胞中的衰老相关β‑半乳糖苷酶活性，减少阿霉素诱导的衰老hUC‑MSCs中升高的p21表达水平和γ‑H2A.X灶，为后续延缓干细胞衰老和增加干细胞的临床应用提供了新的策略。

Description

应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用。
背景技术
人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它具有自我更新、多向分化和免疫调节功能。首先hUC-MSCs可以不断自我更新，并在某些条件下分化成一种或多种细胞类型，如：成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞进而构成人体的组织和器官。hUC-MSCs细胞本身还可以发挥免疫调节功能：静脉注射hUC-MSCs能够迁移到损伤部位，并对炎症作出反应。除此之外，hUC-MSCs还可以通过自分泌或旁分泌分泌多种生物活性因子或通过胞外囊泡，如外泌体和微囊泡分泌生物活性因子对局部微环境或信号作出反应。对比于其他干细胞，hUC-MSCs具有更加容易获取、分离、培养、扩增和纯化的优点。并且hUC-MSCs具有低免疫原性，因此其在临床应用中具有更加独特的优势。除此之外，与传统治疗相比，hUC-MSCs不仅能够提高生存率，还可以显著改善疾病的各种临床症状，综上hUC-MSCs已经成为了细胞治疗和再生医学中重要的干细胞来源之一。
越来越多的证据表明hUC-MSCs具有治疗多种疾病的优势，但是，hUC-MSCs体外扩增会逐渐失去增殖能力和治疗特性。hUC-MSCs可以培养多次并传代获得大量细胞，但在长期培养过程中，与细胞周期和DNA损伤反应相关的途径异常会导致hUC-MSCs基因组不稳定，并在传代后期细胞形态变长、变大，增殖变慢，增殖相关基因减少。hUC-MSCs衰老后会影响其临床应用，例如：在急性肝衰竭治疗中，第5代细胞比第10代细胞在归巢至肝脏和增强肝细胞增殖和抑制凋亡方面更有效。并且衰老细胞的消除可以促进干细胞增殖并延缓衰老特征的出现。
hUC-MSCs衰老是一个复杂问题，需要多种不同方法来缓解或预防衰老，并提高hUC-MSCs的临床应用。目前逆转或延缓hUC-MSCs细胞衰老并保持其体外增殖能力的方法主要有三种：基因修饰、microRNA处理和预处理修饰。基因修饰包含两种类型的基因重新编程：通过重新编码细胞内基因重置表观遗传的完全重编程和通过DNA甲基化和组蛋白修饰使表观遗传年轻化的部分重编程。microRNA通过多维靶点来延缓hUC-MSCs衰老。预处理修饰是指通过专门设计的环境对细胞进行化学和物理因素的体外处理。预处理修饰可以改善细胞与免疫系统之间的相互作用。然而，现有的三种延缓hUC-MSCs衰老方法都存在一定的临床应用限制。首先，调节hUC-MSCs衰老的关键途径因子也是正常生物学功能的重要生理调节因子，通过干预完全抑制或激活这些途径可能会产生其他负面影响。其次，一个或两个microRNA在延缓hUC-MSCs衰老治疗中没有什么效果，需将几种衰老相关的microRNA联合使用才能发挥治疗功能。所以，目前需寻找一种对机体相对安全的延缓hUC-MSCs有效方法，从而增加并促进hUC-MSCs的临床应用。
应激颗粒(Stress Granules,SGs)是指当细胞受到外界刺激(如热休克、氧化应激和病毒感染)时形成的动态mRNA和蛋白质的复合聚集体。SGs由mRNA以及各种RNA结合蛋白组成，包括G3BP1和Caprin1等，它们被认为是多价相互作用以及SGs组装所必需的中心支架蛋白。衰老细胞也可以在氧化应激的条件下形成SGs，并且最近有文献表明衰老与SGs之间存在一种新的相互作用，SGs可以影响衰老的进程以及衰老细胞的行为。在衰老细胞中诱导产生的SGs可以通过隔离衰老相关因子PAI-1而发挥延缓衰老的功能。PAI-1不仅是细胞衰老的标志，也是细胞衰老的关键中介因子。PAI-1通过自分泌功能阻止Rb依赖于细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CycD1)的磷酸化从而导致细胞生长停滞，除此之外，诱导衰老的信号，如DNA损伤反应以及氧化应激可以诱导肿瘤抑制因子p53的激活，p53通过促进PAI-1的表达和分泌而干扰CycD1依赖的RB磷酸化，从而导致不可逆的细胞周期阻滞。并且有文献表明PAI-1的过度表达会导致小鼠的过早衰老，但抑制PAI-1的产生则可以逆转这种表型。当衰老细胞暴露于氧化应激条件下会诱导SGs的形成，并招募PAI-1隔离进入SGs，当诱导SGs隔离PAI-1后可增加CycD1向细胞核的转运，从而促进RB磷酸化，并改善细胞周期的停滞状态。因此对SGs的干预有可能成为一种新的延缓干细胞衰老的策略。但在hUC-MSCs中诱导SGs的方法、SGs诱导剂对hUC-MSCs衰老的作用及其作用机制尚不明确。
发明内容
本发明通过成功建立hUC-MSCs衰老模型对延缓hUC-MSCs衰老方法进行探究，通过实验发现hUC-MSCs中筛选出的SGs诱导剂可通过诱导SGs隔离衰老相关的分泌蛋白发挥延缓hUC-MSCs衰老作用，为后续延缓干细胞衰老和增加干细胞的临床应用提供了新的策略。
本发明具体技术方案如下：
本发明目的在于提供应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用，所述应激颗粒诱导剂采用表达携带可检测的标签的应激颗粒核心蛋白G3BP1和/或G3BP2的真核细胞筛选获得。
优选的，可检测的标签为荧光蛋白，选自绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP、mCherry)或黄色荧光蛋白(YFP、Venus)。
本发明所述的表达携带可检测的标签的应激颗粒核心蛋白G3BP1和/或G3BP2的真核细胞，采用如下方法制备而成：
(1)将携带可检测的标签的G3BP1或G3BP2核苷酸片段插入到pSin-EF2载体上，构建表达质粒；
(2)将表达质粒进行慢病毒包装，转染入真核细胞。
优选的，所述真核细胞为HeLa细胞、HEK293T细胞或U2OS细胞。
真核细胞使用HeLa细胞时，可以对步骤(2)转染了表达质粒的HeLa细胞使用最低致死浓度的嘌呤霉素筛选并扩增，获得稳定的细胞株。
本发明一个具体的示例，所述模型为表达GFP-G3BP1或GFP-G3BP2的HeLa细胞。采用如下方法构建而成：
(1)设计并合成如下引物用于扩增GFP-G3BP1或GFP-G3BP2：
扩增GFP-G3BP1的引物：
EGFP-Cla-F：5’-gcaATCGATATGgtgagcaagggcgaggag-3’。
hG3BP1-Mlu-R：5’-agtACGCGTtTCActgccgtggcgcaagcc-3’。
扩增GFP-G3BP2的引物：
EGFP-Cla-F：5’-gcaATCGATATGgtgagcaagggcgaggag-3’。
hG3BP2-Mlu-R：5’-agtACGCGTTCAgcgacgctgtcctgtgaa-3’。
(2)以pCS2-GFP-G3BP1或pCS2-GFP-G3BP2为模板，分别以上述引物，采用高保真Q5聚合酶PCR扩增上述编码GFP-G3BP1或GFP-G3BP2融合蛋白的DNA片段。
(3)PCR条件为：98℃变性2min；98℃10s，64℃30s，72℃70s进行30个循环；72℃延伸5min。将GFP-G3BP1或GFP-G3BP2的PCR产物纯化后克隆到pSin-EF2载体，得到pSin-EF2-GFP-G3BP1质粒以及pSin-EF2-GFP-G3BP2质粒；
(4)向无血清的OPTI-MEM培养基加入pSin-EF2-GFP-G3BP1或pSin-EF2-GFP-G3BP2质粒，ΔR病毒包装质粒和VSVG病毒包膜质粒混匀后，加入转染试剂混匀；
(5)将以上含有质粒和转染试剂的混合液加入293T细胞中，5-6小时左右换液(10％ FBS无抗培养基)，继续培养48小时左右，收集上清，用于感染细胞或储存于4℃冰箱备用；
(6)将步骤(4)的病毒转染液加入HeLa细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，可重复操作，再感染24小时；
(7)消化HeLa细胞，培养贴壁后24小时，使用最低致死浓度的嘌呤霉素筛选，待细胞长满后传代(第一次传代需等较长时间，后续约3天传代一次)，筛选约2-3周，获得稳定转染GFP-G3BP1的HeLa/GFP-G3BP1细胞株，以及稳定转染GFP-G3BP2的HeLa/GFP-G3BP2细胞株。
采用嘌呤霉素抗性浓度筛选方法如下：
考虑到每个细胞对嘌呤霉素选择的反应不同，实验之前确定细胞系的最佳嘌呤霉素浓度。(1)第1天在12孔板中培养HeLa细胞，并在37℃、5％ CO2条件下生长过夜；
(2)第2天HeLa细胞生长到约80-90％时，向细胞中加入含不同浓度嘌呤霉素的培养基(嘌呤霉素的最终浓度应为1-10μg/mL，增量为1μg/mL)；
(3)第3天开始每天检查HeLa细胞，每隔一天更换一次含有嘌呤霉素的新鲜培养基，3-5天后导致HeLa细胞完全死亡的嘌呤霉素最低浓度则用于后续筛选浓度。
本发明另一目的在于提供应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用，所述应激颗粒诱导剂采用本发明所述的模型筛选获得。
具体筛选过程如下：向所述的模型中加入候选化合物处理1-2小时，通过荧光显微镜观察细胞中是否有呈液滴状荧光的应激颗粒形成，若加入的化合物能够诱导应激颗粒形成，则判定该化合物为应激颗粒诱导剂。
本发明一个具体的示例，所述应激颗粒诱导剂选自亚砷酸钠、格尔德霉素、紫草素、白花丹素、芬戈莫德或吡啶硫酮锌中的一种或几种。
本发明所述模型还可用于应激颗粒抑制剂的筛选，具体为在稳定表达携带标签蛋白的G3BP1或G3BP2真核细胞株中加入抑制剂候选化合物处理2小时，再用应激颗粒诱导剂处理1h，然后在荧光显微镜下考察应激颗粒形成情况，如果应激颗粒阳性细胞数量减少或者单个细胞中应激颗粒数量减少，则初步判定该化合物为应激颗粒抑制剂。
本发明优点：
1.本发明通过在真核细胞内稳定表达GFP-G3BP1或GFP-G3BP2，可以在活细胞内连续、实时观察应激颗粒组装和解聚的动态变化，优于免疫荧光染色方法只能在固定细胞后的单一时间点观察应激颗粒。
2.本发明利用稳定表达GFP-G3BP1或GFP-G3BP2的真核细胞成功筛选出应激颗粒诱导剂。本发明研究结果表明应激颗粒诱导剂(如亚砷酸钠/甲基巴多索隆)通过诱导应激颗粒产生抑制阿霉素诱导的hUC-MSCs衰老。本发明的研究成果为后续延缓hUC-MSCs衰老和增加hUC-MSCs的临床应用提供了新的策略。
附图说明
图1为稳定细胞株HeLa/GFP-G3BP1和HeLa/GFP-G3BP2作为细胞模型用于实时观察活细胞SGs动态，包括未处理时细胞无SGs、AS处理30min后的SGs组装、AS处理30min恢复1小时后的小部分细胞SGs解聚以及AS处理30min恢复3小时后的大部分SGs解聚。其中HeLa/GFP细胞株作为阴性对照，未显示SGs的动态变化。
图2为稳定细胞株HeLa/GFP-G3BP2作为细胞模型用于应激颗粒诱导剂的筛选。结果为各化合物处理HeLa/GFP-G3BP2细胞2小时后直接由荧光显微镜拍摄获得。
图3为阿霉素(Doxorubicin)诱导hUC-MSCs衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性检测结果。(A)SA-β-gal染色结果。(B)SA-β-gal活性检测结果统计图。
图4为阿霉素诱导hUC-MSCs衰老后细胞内p21的表达变化。(A)为蛋白质免疫印迹结果。(B)半定量分析蛋白质免疫印迹结果。
图5为免疫荧光染色检测阿霉素诱导hUC-MSCs衰老后细胞核内γH2A.X灶的表达变化。(A)γ-H2A.X灶染色结果(绿色)。标尺：20μm。(B)免疫荧光染色结果统计图。
图6为利用免疫荧光染色在hUC-MSCs中验证筛选获得的SGs诱导剂。选取在HeLa/GFP-G3BP2细胞模型中筛选获得的部分SGs诱导剂，通过免疫荧光染色验证其在hUC-MSCs中诱导SGs的效果。
图7为SGs诱导剂对阿霉素诱导的hUC-MSCs衰老的抑制作用。(A)SA-β-gal检测不同浓度亚砷酸钠(Arsenite Sodium,AS)或甲基巴多索隆(Bardoxolone Methyl,BM)对阿霉素诱导的hUC-MSCs衰老的作用。(B)SA-β-gal活性检测结果统计图。(C)CCK8检测不同浓度亚砷酸钠与阿霉素联合使用时对hUC-MSCs的细胞毒性。(D)CCK8检测不同浓度甲基巴多索隆与阿霉素联合使用时对hUC-MSCs的细胞毒性。
图8为SGs诱导剂减少衰老hUC-MSCs中的衰老相关表型。(A)蛋白质免疫印迹结果显示SGs诱导剂亚砷酸钠和甲基巴多索隆抑制阿霉素诱导的hUC-MSCs衰老细胞标记物p21的表达。(B)蛋白质免疫印迹结果统计图。(C)免疫荧光染色结果显示SGs诱导剂亚砷酸钠和甲基巴多索隆抑制阿霉素诱导的hUC-MSCs衰老细胞标记物γ-H2A.X灶。标尺：20μm。(D)免疫荧光染色结果统计图。
图9为SGs诱导剂通过隔离促衰老分泌蛋白PAI-1延缓hUC-MSCs衰老。免疫荧光染色结果检测亚砷酸钠和甲基巴多索隆处理hUC-MSCs后，促衰老分泌蛋白PAI-1的亚细胞定位的变化。
图10为亚砷酸钠和甲基巴多索隆延缓hUC-MSCs衰老的作用依赖于其SGs诱导剂功能。(A)SGs抑制剂ISRIB可以抑制亚砷酸钠/甲基巴多索隆在hUC-MSCs中的SGs诱导作用。G3BP1作为应激颗粒的标记物(绿色)。标尺：20μm。(B)SA-β-gal检测加入SGs抑制剂ISRIB后亚砷酸钠/甲基巴多索隆延缓阿霉素诱导的hUC-MSCs衰老情况。右侧为衰老结果统计。(C)免疫荧光检测加入SGs抑制剂ISRIB后亚砷酸钠/甲基巴多索隆减少阿霉素诱导衰老的hUC-MSCs中的DNA损伤情况。右侧为结果统计。γ-H2A.X灶(绿色)。标尺：20μm。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例的限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详尽描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1应激颗粒诱导剂或抑制剂的筛选模型的构建
1.基于克隆将目的片段GFP-G3BP1或GFP-G3BP2构建到pSin-EF2载体上，构建pSin-EF2-GFP-G3BP1质粒以及pSin-EF2-GFP-G3BP2质粒。
GFP氨基酸序列：GenBank QUW04954.1。
G3BP1氨基酸序列：GenBank NP_005745.1。
G3BP2氨基酸序列：GenBank NP_987101.1。
具体步骤如下：
(1)设计并合成如下引物用于扩增GFP-G3BP1或GFP-G3BP2：
扩增GFP-G3BP1的引物：
EGFP-Cla-F：5’-gcaATCGATATGgtgagcaagggcgaggag-3’。
hG3BP1-Mlu-R：5’-agtACGCGTtTCActgccgtggcgcaagcc-3’。
扩增GFP-G3BP2的引物：
EGFP-Cla-F：5’-gcaATCGATATGgtgagcaagggcgaggag-3’。
hG3BP2-Mlu-R：5’-agtACGCGTTCAgcgacgctgtcctgtgaa-3’。
(2)参考《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室出版社/科学出版社)，分别以pCS2-GFP-G3BP1和pCS2-GFP-G3BP2(制备过程参见中国发明专利ZL202110649944.1)为模板，分别以上述引物，采用高保真Q5聚合酶PCR扩增上述编码GFP-G3BP2融合蛋白的DNA片段。
(3)PCR条件为：98℃变性2min；98℃10s，64℃30s，72℃70s进行30个循环；72℃延伸5min。将GFP-G3BP1或GFP-G3BP2的PCR产物纯化后克隆到pSin-EF2载体(BRICS，#SP-2813)，得到pSin-EF2-GFP-G3BP1质粒以及pSin-EF2-GFP-G3BP2质粒，并送北京擎科生物科技有限公司测序。测序结果显示正确。
2.慢病毒包装方法
(1)将293T细胞接种在6cm细胞培养皿中，待其密度至90％的时候换新鲜不含双抗的293T培养液(DMEM+10％ FBS)；
(2)混合慢病毒载体质粒：取一支1.5mL离心管加入200μL无血清的OPTI-MEM培养基，然后分别加入以下慢病毒载体质粒：2μg pSin-EF2-GFP-G3BP1或pSin-EF2-GFP-G3BP2质粒，2μgΔR病毒包装质粒和0.4μg VSVG病毒包膜质粒。混匀后，将6.6μL转染试剂Lipofect 2000(DNAμg：Lipofect 2000μL＝1:1.5)加入离心管，颠倒混匀后分别静置5分钟后，将二者混匀，室温静置20分钟；
(3)将以上含有质粒和转染试剂的混合液加入293T细胞中，5-6小时左右换液(10％ FBS无抗培养基)，继续培养48小时左右，将细胞培养液3000rpm离心15分钟，收集上清，用于感染细胞或储存于4℃冰箱备用；
3.嘌呤霉素抗性浓度筛选
每个细胞对嘌呤霉素选择的反应不同，实验之前确定细胞系的最佳嘌呤霉素浓度。
(1)第1天在12孔板中培养HeLa细胞，并在37℃、5％ CO2条件下生长过夜；
(2)第2天HeLa细胞生长到约80-90％时，向细胞中加入含不同浓度嘌呤霉素的培养基(嘌呤霉素的最终浓度应为1-10μg/mL，增量为1μg/mL)；
(3)第3天开始每天检查HeLa细胞，每隔一天更换一次含有嘌呤霉素的新鲜培养基，3-5天后导致HeLa细胞完全死亡的嘌呤霉素最低浓度则用于后续筛选浓度。
4.慢病毒转染方法
(1)准备六孔板接种HeLa细胞，待其密度生长至50％-60％即可转染；
(2)吸去细胞培养液，加入混匀了的病毒转染液(1mL培养基+1mL病毒上清+2μL1000×Polybrene)，37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
(3)加3mLPBS清洗细胞(一次即可)，再感染一次(24小时)；
(4)待细胞长满后，将细胞消化下来，传至6cm dish中，贴壁后24小时，使用步骤3中筛选出的最低致死的嘌呤霉素浓度，待细胞长满后传代(第一次传代需等较长时间，后续约3天传代一次)，筛选约2-3周，获得稳定转染GFP-G3BP1的HeLa/GFP-G3BP1细胞株，以及稳定转染GFP-G3BP2的HeLa/GFP-G3BP2细胞株。
5.应激颗粒诱导剂筛选模型的验证
将HeLa/GFP-G3BP1、HeLa/GFP-G3BP2细胞株以及作为对照的HeLa/GFP细胞株接种到6孔板中。当细胞达到70-80％时，细胞不作任何处理或用200μM AS处理30分钟，或用200μM AS先处理30分钟再撤去AS恢复1小时或3小时，然后在荧光显微镜下获取图像。结果如图1所示，HeLa/GFP-G3BP1和HeLa/GFP-G3BP2细胞株均实时反映了AS处理后SGs组装以及恢复过程中SGs解聚的动态过程，而作为对照的HeLa/GFP细胞株未显示SGs动态变化，表明HeLa/GFP-G3BP1和HeLa/GFP-G3BP2细胞株可用于后续SGs诱导剂的筛选。
实施例2应激颗粒诱导剂的筛选
使用实施例1构建的筛选模型对FDA批准药物库(APEXBIO,#L1021)和天然产物化合库(APEXBIO,#L1039)中的化合物进行筛选。将HeLa/GFP-G3BP2细胞株接种到24孔板中。当细胞达到70-80％时，分别加入10μM不同药物处理HeLa/GFP-G3BP2细胞2小时，在荧光显微镜下获取图像。结果如图2所示，筛选到部分化合物能够诱导SGs的形成，包括甲基巴多索隆(Bardoxolone Methyl,BM)、格尔德霉素(Geldanamycin)、紫草素(Shikonin)、白花丹素(Plumbagin)、芬戈莫德(Fingolimod)和吡啶硫酮锌(Zinc Pyrithione)。
实施例3hUC-MSCs衰老模型的制备
1.取新鲜脐带，用含双抗PBS将脐带表面清洗干净，挤出血管中残留血液；
2.无菌手术剪剪去脐带两端，余下剪为2-3厘米长小段；
3.继续用PBS清洗脐带，用镊子将脐带中血液清洗干净；
4.用镊子把脐带组织剥开，用有钩镊轻轻撕走静脉，再撕掉动脉，然后PBS洗3遍，在50mL离心管中剪碎；
5.用0.1％的胶原酶和透明质酸酶消化3-4小时，过滤，离心2-3次；
6.转入培养瓶，均匀铺开，使用含10％胎牛血清的DMEM/F12(1：1)培养基(上海源培生物科技股份有限公司)贴壁传代培养。
7.将hUC-MSCs接种到6孔板中，显微镜下观察，待细胞生长密度达到60％～70％左右时即可进行衰老诱导；
8.取出细胞培养皿，弃掉培养基，用1×PBS缓冲液清洗1遍，加入新鲜培养基。将一定浓度的阿霉素加入细胞中，上下左右轻微摇晃细胞培养皿使其混合均匀，使培养基中阿霉素浓度为0.05μM，移入二氧化碳细胞培养箱培养48小时后，弃掉含有药物的培养基，加入新鲜的细胞完全培养基。继续放入二氧化碳细胞培养箱中恢复培养6天。
使用SA-β-gal染色试剂盒检测hUC-MSCs的衰老情况。在全内反射荧光显微镜下观察并拍取图片，统计各组染色细胞数，如图3所示。结果显示hUC-MSCs细胞出现明显衰老。
提取上述hUC-MSCs细胞总蛋白。蛋白质免疫印迹检测阿霉素诱导衰老细胞中衰老细胞标记物细胞周期抑制蛋白p21表达变化，结果如图4所示。免疫荧光染色检测药物诱导衰老细胞中γ-H2A.X灶变化，结果如图5所示。结果显示，当阿霉素诱导hUC-MSCs经历早熟型衰老后，衰老细胞标记物p21蛋白表达水平和γ-H2A.X灶均显著上调。
实施例4在hUC-MSC中验证筛选获得的应激颗粒诱导剂
将hUC-MSCs细胞接种到6孔板中预先处理的玻片上。当细胞达到70-80％时，分别加入再实施例1构建的模型中筛选得到的部分应激颗粒诱导剂处理细胞2小时，通过免疫荧光染色实验在激光共聚焦显微镜下观察并拍取图片。结果如图6所示，亚砷酸钠、甲基巴多索隆、白花丹素和吡啶硫酮锌(Zinc Pyrithione)等化合物均能不同程度地诱导hUC-MSCs细胞中应激颗粒的形成，并且亚砷酸钠和甲基巴多索隆诱导应激颗粒的效果最为显著。因此选用亚砷酸钠和甲基巴多索隆作为应激颗粒诱导剂的代表进一步研究应激颗粒诱导剂在hUC-MSCs衰老中的作用。
实施例5应激颗粒诱导剂对hUC-MSCs衰老的抑制作用
考察实施例4验证的hUC-MSCs SGs诱导剂亚砷酸钠和甲基巴多索隆对实施例2构建的hUC-MSCs衰老模型的作用。
当hUC-MSCs细胞长至60％-70％时，使用不同浓度应激颗粒诱导剂处理hUC-MSCs，再分别使用0.05μM阿霉素诱导衰老48小时，之后恢复培养，在第6天再次给予不同浓度应激颗粒诱导剂处理，第9天进行样本收集。
使用SA-β-gal染色试剂盒检测各组hUC-MSCs的衰老情况。在全内反射荧光显微镜下观察并拍取图片，统计各组染色细胞数，如图7所示。结果表明50μM和100μM亚砷酸钠可以显著延缓阿霉素诱导的hUC-MSCs衰老，并且通过CCK8检验发现50nM-100μM亚砷酸钠与阿霉素联合使用均无显著细胞毒性。同样，1.5μM甲基巴多索隆可以延缓阿霉素诱导的hUC-MSCs衰老，并且通过CCK8检测发现0.5μM-2μM甲基巴多索隆与阿霉素联合使用无显著细胞毒性。
实施例6应激颗粒诱导剂减少衰老hUC-MSCs中的衰老相关表型
以实施例4中各给药组hUC-MSCs衰老细胞为研究对象，提取各组细胞总蛋白。通过蛋白质免疫印迹和免疫荧光染色实验检测SGs诱导剂亚砷酸钠或甲基巴多索隆处理阿霉素诱导的hUC-MSCs衰老后细胞中衰老细胞标记物细胞周期抑制因子p21蛋白表达和γ-H2A.X灶，结果如图8所示。结果显示100μM亚砷酸钠和1.5μM甲基巴多索隆均可以减少阿霉素诱导的衰老hUC-MSCs中升高的p21表达水平和γ-H2A.X灶。综上，SGs诱导剂亚砷酸钠和甲基巴多索隆均可以延缓阿霉素诱导的hUC-MSCs衰老。
实施例7SGs诱导剂通过隔离促衰老分泌蛋白PAI-1延缓hUC-MSCs衰老
将hUC-MSCs细胞接种到6孔板中预先处理的玻片上。当细胞达到70-80％时，分别加入应激颗粒诱导剂亚砷酸钠45分钟或甲基巴多索隆处理细胞2小时，通过免疫荧光染色实验在激光共聚焦显微镜下观察并拍取图片。结果如图9所示，100μM亚砷酸钠和1.5μM甲基巴多索隆均可以通过诱导应激颗粒形成，将促衰老分泌蛋白PAI-1招募至应激颗粒。PAI-1在应激颗粒中的隔离使PAI-1无法执行其促进细胞衰老的功能，进而延缓hUC-MSCs的衰老。综上，应激颗粒诱导剂亚砷酸钠和甲基巴多索隆通过诱导应激颗粒形成并隔离促衰老分泌蛋白PAI-1于应激颗粒，从而发挥了延缓hUC-MSCs衰老的作用。
实施例8亚砷酸钠和甲基巴多索隆延缓hUC-MSCs衰老的作用依赖于其SGs诱导剂功能
以实施例4中SGs诱导剂亚砷酸钠/甲基巴多索隆诱导hUC-MSCs中SGs为研究对象，联合使用SGs抑制剂ISRIB。将100μM亚砷酸钠和200nM SGs抑制剂ISRIB共同处理hUC-MSCs45分钟，或1.5μM甲基巴多索隆和200nM SGs抑制剂ISRIB共同处理hUC-MSCs 2小时，然后利用免疫荧光染色实验检测SGs诱导情况。结果如图10所示，结果表明SGs抑制剂ISRIB能够显著抑制SGs诱导剂亚砷酸钠/甲基巴多索隆诱导的hUC-MSCs中SGs的形成，表明亚砷酸钠/甲基巴多索隆的SGs诱导功能可以被SGs抑制剂ISRIB阻断。以实施例5和例6中SGs诱导剂亚砷酸钠/甲基巴多索隆延缓阿霉素诱导的hUC-MSCs的衰老以及减少衰老相关表型为研究对象，联合使用SGs抑制剂ISRIB。通过使用SA-β-gal染色试剂盒和免疫荧光染色实验检测SGs诱导剂亚砷酸钠/甲基巴多索隆和SGs抑制剂ISRIB共同处理阿霉素诱导hUC-MSCs衰老模型后的衰老细胞标记物。结果如图10所示，结果表明当SGs诱导剂亚砷酸钠/甲基巴多索隆的SGs诱导功能被SGs抑制剂ISRIB阻断后，SGs诱导剂亚砷酸钠/甲基巴多索隆延缓阿霉素诱导hUC-MSCs衰老的作用被减弱，表明亚砷酸钠/甲基巴多索隆延缓阿霉素诱导hUC-MSCs衰老的作用依赖于亚砷酸钠/甲基巴多索隆诱导SGs的功能。综上，SGs诱导剂亚砷酸钠/甲基巴多索隆延缓hUC-MSCs衰老的作用依赖于SGs诱导剂功能。

Claims (9)

1.应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应激颗粒诱导剂采用表达携带可检测的标签的应激颗粒核心蛋白G3BP1和/或G3BP2的真核细胞筛选获得。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述可检测的标签为荧光蛋白。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。
5.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述表达携带可检测的标签的应激颗粒核心蛋白G3BP1和/或G3BP2的真核细胞采用如下方法制备而成：
(1)将携带可检测的标签的G3BP1或G3BP2核苷酸片段插入到pSin-EF2载体上，构建表达质粒；
(2)将表达质粒进行慢病毒包装，转染入真核细胞。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述真核细胞为HeLa细胞、HEK293T细胞或U2OS细胞。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述真核细胞为Hela细胞，对步骤(2)的真核细胞使用最低致死浓度的嘌呤霉素筛选并扩增，获得稳定的细胞株。
8.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述向表达携带可检测的标签的应激颗粒核心蛋白G3BP1和/或G3BP2的真核细胞中加入候选化合物处理1-2小时，通过荧光显微镜观察细胞中是否有呈液滴状荧光的应激颗粒形成，若加入的化合物能够诱导应激颗粒形成，则判定该化合物为应激颗粒诱导剂。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应激颗粒诱导剂选自亚砷酸钠、格尔德霉素、紫草素、白花丹素、芬戈莫德和或啶硫酮锌中的一种或几种。
CN202411136421.7A 2024-08-19 2024-08-19 应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用 Pending CN119082248A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411136421.7A CN119082248A (zh) 2024-08-19 2024-08-19 应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411136421.7A CN119082248A (zh) 2024-08-19 2024-08-19 应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN119082248A true CN119082248A (zh) 2024-12-06

Family

ID=93661424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202411136421.7A Pending CN119082248A (zh) 2024-08-19 2024-08-19 应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN119082248A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101792732A (zh) 人多能干细胞生长和分化的技术
CN112608972B (zh) Myog基因作为靶点在制备治疗心肌细胞凋亡相关的心血管疾病的药物中的应用
CN109385404B (zh) 一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用
CN116064386A (zh) 永生化干细胞及其制作方法
JP6893633B2 (ja) 分化細胞の抽出方法
CN103028119B (zh) 一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用
CN106591224B (zh) 高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法
WO2018058026A1 (en) Mitochondrial epigenetic reprogramming and transplant
Ruetz et al. In vitro and in vivo CRISPR-Cas9 screens reveal drivers of aging in neural stem cells of the brain
CN103459590A (zh) 可由机体的脐带或脂肪组织分离的多能干细胞
CN104726500B (zh) MicroRNA26b‑3p抑制剂在制备人脐带来源间充质干细胞中的应用
JP7037201B2 (ja) 改変内皮細胞を含む血液脳関門
CN114540309A (zh) 一种用于高效扩增rna病毒的重组细胞及其扩增方法和应用
CN110129272B (zh) 稳定表达map3k8蛋白的pk-15细胞株及其构建和应用
CN111690686A (zh) 一种miRNA高表达在促进脐带间充质干细胞体外增殖和成骨分化方面的应用
NL2030433B1 (en) Shrna lentivirus for inhibiting the expression of long non-coding rna malat1 and use thereof
CN119082248A (zh) 应激颗粒诱导剂在制备脐带间充质干细胞衰老抑制剂中的应用
CN115607689A (zh) Klf7基因在制备逆转细胞衰老的药物中的应用
CN115779084A (zh) 激活猪的tusc1基因表达的制剂在制备猪抗伪狂犬病毒感染药物中的应用
CN109750040B (zh) Heatr1基因或蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
JP2013009742A (ja) 多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物及び方法
JP2018011546A (ja) 骨格筋前駆細胞の製造方法
WO2018169094A1 (ja) 不死化したヒト由来腫瘍血管内皮細胞の樹立方法及び不死化したヒト由来腫瘍血管内皮細胞
CN113999816B (zh) 一种表达hoxa10的人脐带间充质干细胞系及其制备方法和应用
NL2036608B1 (en) An immortalized chicken skeletal muscle satellite cell line, its construction method, and application, within the field of biotechnology

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination