CN1093578A - 鱼和甲壳纲动物病毒病的预防和治疗剂以及饲料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于鱼和甲壳纲动物病毒病 的安全、有效的预防和治疗剂以及混有该剂的饲料， 其特征在于含有至少一种下述成分：经灭菌的细菌细 胞、通过对所说的细菌细胞进行机械破碎或酶促处理 而获得的破碎细胞、含有经分级所说的破碎细胞而获 得的细胞壁组分的物质。

Description

本发明涉及用于鱼和甲壳纲动物病毒病的一种预防和治疗剂，以及含有该剂的鱼饲料。

近年来，养鱼技术发展迅速，水产养殖的产量逐年增长。但是，与野生的鱼和甲壳纲动物不相同，这样高密度地饲养导致许多疾病的发生，特别是，由致病细菌和病毒引起的疾病造成许多危害。

例如，最近虾或龙虾黄头病在增加，特别是在泰国。黄头病对黑虎虾（Penaeus        monodon）表现出很高的死亡率，本发明人证实它是一种病毒病。感染了黄头病的虾或龙虾的腹部变成淡颜色，头胸部变成黄色。被感染的群体在病蔓延3-5天内经常全部死亡，给饲养场造成了很大问题（Mali等，鱼病理研究，为日本鱼病理社投稿而准备）。

过去，用抗生素抵抗鱼和甲壳纲动物等等的传染病，但是诸如发生抗性的微生物和抗生素在鱼体中残留等等问题，使得限制了抗生素的使用。已发现当被用来代替抗生素时，细菌细胞壁的组份具有相当大的抗细菌病效果，已在开发它们以作为抗细菌病的高度安全的预防和治疗剂（日本专利申请，已公开No.4-193832），就病毒病来说没有有效的药剂被用来代替抗生素的使用。

顺便提及，很早就已知道将细菌细胞壁组份当作免疫刺激物（辅药），现在正对由牛分枝杆菌的细胞壁制得的制剂就其作为抗癌免疫治疗剂而研究其免疫刺激的作用和其效果（Cancer，Vol.65，pp.493-505，1974）。同时，关于一种对抗家畜（禽）病，已报道使用一种家畜（禽）腹泻预防和治疗剂，该预防和治疗剂采用一种由嗜热双歧杆菌细胞壁制得的制剂（Jpn.J.Vet.Sci.Vo.，49，pp，235-243，1987，日本专利申请，已公开No.62-265231）。

然而，由于鱼和非脊椎的甲壳纲动物的免疫机制同哺乳动物不同，并且细菌和病毒在感染和生长机制上也不同，抗细菌的预防和治疗剂通常被认为不表现有任何抗病毒的效果。

相对照，已公开了一种牲畜、家禽和鱼的饲料，它提供了对伪狂犬病和其它病的抵抗力，它是一种在主料饲料中加入胆粉和含肽聚糖的细胞壁的混合物（日本专利申请，已公开No.4-287647），然而，尽管这种饲料给陆栖动物提供了抗伪狂犬病毒的抵抗力，但是对于鱼，抗病力的唯一迹象是溶菌酶活性的增加，因此，这种饲料没有明显的作为预防和治疗病毒病的效果。而且，对于甲壳纲动物没有参考文献。

依据上述提及的情况，构思了本发明，提供了一种用于鱼和甲壳纲动物病毒病的安全、有效的预防和治疗剂，用来代替抗生素的使用。

本发明的发明人为了解决上述问题，经过了勤奋的研究，发现了细菌细胞壁组份可以有效地抗鱼和甲壳纲动物病毒病。

特别是，本发明涉及一种用于鱼和甲壳纲动物的预防和治疗剂，其特征在于包含至少一种下述成分：经灭菌的细菌细胞、对所说的细菌细胞进行机械压碎或酶促处理而获得的破碎细胞、含有经分级所说的破碎细胞而获得的一种细胞壁组份的物质;还涉及一种含有该剂的饲料。

根据本发明，鱼和甲壳纲动物包括

、海欧鳊、鳗、鲤、虹鳟、香鱼、银鲑、马鲭、罗非鱼、鲽、鲫鲤、虾、黑虎虾等等。病毒病包括虾或龙虾黄头病。根据本发明，预防和治疗剂还包括防止病毒病感染和蔓延或治疗那些已经发生的疾病的药剂。

以下是对本发明的详细描述

根据本发明，根据需要单独或混合使用：灭菌的细菌细胞，或将该细菌细胞进行机械压碎或酶促处理而获得的破碎细胞，或含有通过分级所说的破碎细胞而获得的细壁组份的物质（以下称“细菌细胞壁组份”）。

在上述提及的细菌细胞壁组份制剂中使用的细菌例子包括芽胞杆菌属的细菌如枯草芽胞杆菌等;短杆菌属细菌如乳发酵短杆菌等;棒状杆菌属细菌如谷氨酸棒状杆菌等;埃希氏杆菌属的细菌如大肠杆菌等;乳酸杆菌属细菌如嗜酸乳酸杆菌等;链球菌属细菌如嗜热链球菌等;链霉菌属细菌如田无链霉菌等;双歧杆菌属细菌如嗜热双歧杆菌等。

在培养这些细菌时，可以使用通常能被细菌利用的任何营养。可以使用普通培养基，包含有下述营养物的适当结合，如：碳源包括碳水化合物如葡萄糖、蔗糖等，醇如乙醇，甘油等，有机酸如乙酸、丙酸等，大豆油等，或其混合物;有机或无机含氮营养物包括酵母提取物，胨，牛肉汗，玉米浸泡液，硫酸铵，氨等;无机盐营养包括磷酸盐、镁、铁、锰、钾等;以及维生素包括生物素、维生素B1等。

在pH4.0-9.5的营养培养基上，温度为20-40℃，进行细菌培养，培养时间为12小时到5天。

根据本发明，使用的细菌细胞壁组份可以是通过培养获得的并通过离心分离或过滤而从培养产物中分离的细胞，然后进行热处理以灭菌，并且最好是被破碎的细胞。灭菌方法可以是热处理或高压蒸汽灭菌等。破碎细胞的方法可以是，例如，机械法或使用酶的方法。所使用的细胞可以是活的或是灭菌的细胞。

机械方法可以是，例如：使用French挤压机在大约800-2000Kg/cm²的压力下破碎细胞;将玻璃珠加入细胞悬浮液中，然后进行高速搅拌;应用超声波，使用超声波震动器破碎细胞。如果用酶破碎细菌细胞，则将培养的细胞或已进行机械破碎的培养细胞悬浮于生理盐水中，并向其中加入细胞壁消化酶，以分解细菌细胞壁。本文所使用的酶可以是任何具有分解细胞壁能力的酶，其代表物包括溶菌酶、蛋白酶等。酶处理的条件可根据公知的方法。

在机械和酶促两种方法中，要求细胞破碎率在20%左右或更高，最好在60%左右或更高，以在660nm波长下悬浮液混浊度下降的比率来测量破碎率，等等。另外，为增加破碎率，最好的方法是联合使用机械和酶促方法。

可将破碎细胞进行分级并分离出细胞壁组份以便使用。分级的方法可以是通过离心或过滤简单地除去不溶物，或可以使用公知的根据蛋白质分子量等因素进行的分级方法如超滤，凝胶过滤等。

根据本发明的预防和治疗剂含有上文提及的细胞壁组份，在通常使用的基质中可以由细胞壁组份本身组成或也可以是细胞壁组份的组合物。使用的方法可以是将该预防和治疗剂直接口服给药或添加于饲料中口服给药。

同样，为了制备饲料，应按照要求对通常用于喂养的饲料物质进行适当的选择并结合，上文提及的预防和治疗剂可与其结合。通常使用的饲料物质是鱼粉、骨粉、脱脂乳，棉籽饼、小麦粉、小麦胚芽、稻糠、酿酒酵母、维生素等。上文提及抗病毒病的预防和治疗剂在饲料中的组成比例按干破碎细胞计优选是占饲料总量的0.001-5%，更优先是占0.005-1%。

根据本发明，对预防和治疗剂或含有该剂的饲料的给药阶段没有，但更好的预防效果产生于在较年轻苗期阶段给药。

实施例

以下根据实施例对本发明进行解释

实施例1

下面提供一个制备细菌细胞壁的实施例

（1）收集细胞

将含有溶于100ml水中的1.0克葡萄糖、1.0克酵母抽提物、1.0克胨、0.5克（NH₄）₂SO₄、0.3克K₂HPO₄、0.1克KH₂PO₄和0.05克MgSO₄·7H₂O的50ml培养基（pH7）置于500ml烧瓶中，在115℃灭菌15分钟。

将已在牛肉汁琼脂斜面上于30℃培养1天的枯草芽孢杆菌ATCC        13952、乳发酵短杆菌ATCC        13869、谷氨酸棒状杆菌ATCC        13060、大肠杆菌ATCC        8739、嗜酸乳酸杆菌ATCC        4356、嗜热链球菌ATCC以19987和田无链霉菌ATCC        15238各一环菌量接种至上述培养基中，在30℃振荡培养24小时。在培养完成之后，将每个培养溶液进行离心以收集细胞。然后将细胞悬浮在生理盐水中，其生理盐水的量等于每个培养物溶液量。再在100℃热处理10分钟，再离心收集细胞，表1表示获得湿细胞的量。

表1

细菌菌株        细胞湿重(克/100ml)

杆草杆菌    ATCC    13952        4.0

乳发酵短杆菌    ATCC    13869        5.7

谷氨酸棒状杆菌    ATCC    13060        5.1

大肠杆菌    ATCC    8739        4.5

嗜酸乳杆菌    ATCC    4356        1.0

嗜热链球菌    ATCC    19987        0.4

田无链霉菌    ATCC    15238        2.0

（2）用机械压碎法生产制剂

把通过上述方法获得的细胞（湿细胞）悬浮在25mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，并使其浓度达到10%（重量计）。将细胞悬浮液置于无菌瓶（5ml容积）中，使用超声波震动器（型号UR-200P，Tomi        Seiko，Inc.生产）对细胞悬浮液进行超声波处理15分钟，震动频率为20KHz，输出功率为200W。再对细胞悬浮液进行进一步离心，重新获得细菌细胞壁组份。

（3）酶促处理：

在含有由（2）中获得的、比例为10%固体重量比的机械破碎的细胞的25mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，加入0.01%重量比的白蛋白溶菌酶（Sigma        Co.生产）和0.02%重量比的actinase（Kaken        Seiyaku生产，7000单位），将上述混合物在37℃进行酶促处理12小时。然后在100℃进行热处理2分钟以失活该酶，紧接着按常规方法进行冻干。

实施例2：

（1）制备含有抗病毒病的预防和治疗剂的虾或龙虾饲料：

按表2所示的组份制备黑虎虾的复合饲料，并将实施例1（3）中获得的乳发酵短杆菌的破碎和酶促处理过的细胞加入到复合饲料中，其比例（按重量计）为0，0.01，0.1和1.0%，按常规方法，将最终混合物制成丸剂，即获得黑虎虾饲料。

表2

物质        在混合物中的比例(重量比部分)

米糠        6

米淀粉        3.5

小麦粉        20

麦麸        5

虾粉        10

鱿鱼粉        5

大豆饼        10

鱼粉        30

鱿鱼肝油        2

卵磷脂        1

维生素混合物        1

无机混合物        5

沸石        1.5

（2）抗虾和龙虾黄头病的效果

向因黄头病而死的黑虎虾死体中加入二倍于死体量的缓冲液而获得提取物，用0.2微米孔径滤器过滤提取物，并将其注入健康的黑虎虾腹部肌肉，他们死去而表现出黄头病的特征症状。基于这一点，用电子显微镜观察，非常清楚，黄头病是由一种属于杆状病毒属的病毒所致。

将上述获得的黑虎虾饲料施用给黑虎虾以测试他们抗黄头病的预防效果。每天5次给健康的黑虎虾（平均体重2g）施用上述四种类型饲料。54天后，给施用了各个饲料、各含10只黑虎虾的各个组注射按上述同样方法获得的提取物的10^-7稀释剂，或注射不含病毒的缓冲液做对照，随后观察存活率。表3显示了结果。

表3

当用黄头病病毒感染健康的龙虾时，在第11天其存活率下降至10%，但是通过供给根据本发明提供的饲料，可将存活率提高到40-60%。而即使在无病毒感染的情况下，其自然存活率也低至大约为70%。

下面，用上述同样的方法检测存活率，但是使用10^-6病毒稀释剂，表4显示了结果。

表4

在感染病毒的浓度提高10倍时，在第10天所有的龙虾死亡，但是施用本发明的饲料，存活率是30-50%。

从这些结果看出，本发明的预防和治疗剂以及含有该剂的饲料对抗病毒病是有效的。

Claims (5)

1、一种用于鱼和甲壳纲动物病毒病的预防和治疗剂，其特征在于含有至少一种下述成分：经灭菌的细菌细胞、通过对所说的细菌细胞进行机械破碎或酶促处理而获得的破碎细胞、含有经分级所说的破碎细胞而获得的一种细胞壁组份的物质。

2、根据权利要求1所说的用于鱼和甲壳纲动物病毒病的预防和治疗剂，其中所说的细菌属于芽胞杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、埃希氏菌属、乳杆菌属、链球菌属、链霉菌属或双歧杆菌属。

3、一种用于鱼和甲壳纲动物的饲料，它含有权利要求1或2所说的病毒病的预防和治疗剂。

4、根据权利要求3所述的用于鱼和甲壳纲动物的饲料，其中所说的病毒病预防和治疗剂在饲料中的浓度为0.001-5%（以干破碎细胞计）。

5、根据权利要求3所说的用于鱼和甲壳纲动物的饲料，其中所说的病毒病预防和治疗剂在饲料中浓度为0.005-1%（以干破碎细胞计）。