CN1093174C - 芽孢杆菌属蛋白酶 - Google Patents
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Abstract
本发明属于可从Bacillus sp.ZI 315新菌株获得的去垢蛋白酶技术领域。并且，本发明直接针对制备该蛋白酶的方法、该蛋白酶作为去垢酶的用途和包含本发明的蛋白酶的去垢组合物。
Description
技术领域
本发明涉及可以从Bacillus sp.的菌株中获得的去垢蛋白酶。更具体地说，本发明直接针对来源于Bacillus sp.ZI 315菌株的新的碱性蛋白酶。并且，本发明直接针对制备这种蛋白酶的方法、这种蛋白酶作为去垢酶的用途和包含本发明的蛋白酶的去垢组合物。
发明背景
去垢酶投放市场已有20年，并且其在遍及全世界的粉末和液体去垢剂中已成为正规的去垢剂组份。
用于洗涤制剂的酶包括许多不同的酶，如蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶以及其它酶或它们的混合物。商业上最重要的酶是所说的蛋白酶。
通过分离自然发现的蛋白酶，然后在去垢剂配方中进行检验开发去垢蛋白酶。大多数去垢蛋白酶从芽孢杆菌属的成员中获得。
商业蛋白酶产品的例子是ALCALASETM、ESPERASETM和SAVINASETM，所有这些都是由Nordisk A/S(丹麦)公司提供的。ALCALASETM蛋白酶是由地衣型芽孢杆菌的菌株产生的。ESPERASETM和SAVINASETM蛋白酶是通过培养-亲碱性(alkalophilic)的杆菌菌株而获得的。
洗涤传统，尤其所用的洗涤温度、所用水的硬度、以及洗涤剂的组份在不同的国家之间改变很大。下文列出了典型条件的要点：
-低pH值和低水硬度：美国和亚洲液体洗涤剂；
-低pH值和高水硬度：欧洲的液体洗涤剂；
-高pH值和低水硬度：美国和亚洲的粉末洗涤剂；和
-高pH值和高水硬度：欧洲的粉末洗涤剂。
(洗涤剂中的低pH一般是在pH 8.0-9.5的范围内，特别是大约为9；洗涤剂中的高pH一般是在pH 10-11.5的范围内，特别是大约为10.5。一般低水硬度是在3-6dH的范围内；一般高水硬度是在15-20dH的范围内；特别是大约为18dH。
并且，这些年来为了使洗涤方法更有利于环境，洗涤剂的组份一直在改变。所有这些去垢剂工业内的不同和变化使这个领域极其复杂。因此，始终有必要发现新的蛋白酶，这种蛋白酶能在一系列特定的条件下最佳地发挥其作用。
发明概述
本发明的一个目的是提供在中等到较低的温度下具有改进了的洗涤性能的新型去垢蛋白酶。
因此，在第一方面，本发明提供了一种蛋白酶，其性质如下：
具有与来源于Bacillus sp.ZI 315，DSM 9702菌株的蛋白酶相同或部分相同的免疫化学性质。
在第二方面，本发明涉及一种Bacillus sp.的菌株的分离的生物学纯培养物，代表性菌株为Bacillus sp.ZI 315。更具体地说，本发明涉及Bacillus sp.ZI 315，DSM 9702菌株、或其突变体或变体。
在第三方面，本发明提供了一种制备所说蛋白酶的方法，该方法包括在含有碳和氮源及无机盐的合适营养培养基中，培养产生蛋白酶的菌株，然后回收所需的酶。在一个更特定的方面，培养Bacillus sp.ZI 315，DSM 9702菌株、或其突变体或变体或者是另一种携带编码具有与来源于Bacillus sp.ZI 315，DSM 9702菌株的蛋白酶相同或部分相同的免疫化学性质的蛋白酶之基因的宿主微生物。
在第四个方面，本发明提供了这种酶作为洗涤酶的用途。在更特定的方面，本发明提供了去垢组合物和含有这种蛋白酶的去垢剂添加剂。
在第五个方面，本发明提供了包括加入这种蛋白酶的洗涤方法。
附图的简要描述
参考附图，进一步具体说明了本发明，其中
图1表明温度和按照本发明的酶的蛋白酶解活性之间的关系(所说的酶制剂是按照实施例1，在pH 9.5时，用1％的酪蛋白为底物获得的)；
图2表明pH和按照本发明的酶蛋白酶解活性之间的关系(所说的酶制剂是按照实施例1，在25℃下，用1％的酪蛋白为底物获得的)。
发明的详细描述
微生物
能够产生本发明酶的本发明的新型微生物由土壤样品中分离的菌株代表。Bacillus sp.ZI 315菌株按照用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的规定于1995年1月30日以保藏号DSM 9702在DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH保藏。
本发明的微生物是芽孢杆菌属的需氧、亲碱性、形成孢子的细菌。形态学上它可以描述为革兰氏阳性，能活动的杆菌，其直径为0.6-0.9微米，长度为1.5-3微米。孢子(很少发生)是近末端中央的椭圆体，具有膨胀孢子囊。
生长的最适温度在30-40℃之间，在50℃下没有生长，同时生长的最适pH在9-10之间，在pH 10.0下有良好的生长，pH7.0下没有生长，这使得该菌株是严格亲碱性的。
此微生物形成黄色至橙色的菌落，在碱性营养琼脂斜面上观察到圆形且光滑的菌落，并且没有色素扩散至琼脂中。
已经鉴别了Bacillus sp.ZI 315为芽孢杆菌属组1(group 1)内的一个新物种。完全的16S rRNA序列分析表明Bacillus sp.ZI 315与坚强芽孢杆菌、环状芽孢杆菌和食苯芽孢杆菌密切相关；它远离组1的其它亲碱性物种(如科氏芽孢杆菌和Bacillus halmapalus)而分支。ZI 315分支远离和其显示的和其最亲密的系统发育亲属的生理差异，由于这些理由认为其是芽孢杆菌属组1的一个新物种。
微生物的培养
可以把本发明的微生物在需氧条件下培养在营养培养基中，这种培养基包含可同化的碳源和氮源以及其它必要的营养物，按照本领域的已知原则组成培养基。
合适的碳源是碳水化合物，如蔗糖、葡萄糖和淀粉或含有如谷类粮食、麦芽、稻米和高粱材料的碳水化合物。培养基中加入的碳水化合物浓度可以变化很大，例如，多可达25％，少可达1-5％，但通常8-10％是合适的，百分比以葡萄糖的当量计。
营养培养基中的氮源可以是有机和/或无机种类。合适的无机氮源是硝酸盐和铵盐。有机氮源中的相当数量常规上用于和细菌培养相关的发酵过程。具体的例子是大豆粉、棉子粉、花生粉、酪蛋白、玉米、玉米浆、酵母提取物、尿素和清蛋白。此外，营养培养基也应该包含通常的微量物质。
本发明的新芽孢杆菌物种是稍微亲碱性的。因此，培养优选在碱性pH值下进行，培养基消毒后通过加入合适的缓冲液(pH9.0-10.5)而得到碱性pH值。由于培养是在桶式发酵灌中进行的，因此有必要利用人工充气。充气的速率类似于常规的罐发酵。
在发酵之后，可以通过从肉汤中除去粗物质来产生液态酶浓缩物或，如果需要，通过如低温下蒸发或反渗透来浓缩肉汤。最后，向浓缩物中加入防腐剂。
可以用盐(如NaSO4)或水可溶的溶剂(如乙醇或丙酮)沉淀纯化的和/或浓缩的肉汤来制备固体酶制剂。通过合适的干燥方法除去肉汤中的水，例如可以使用喷射干燥。
蛋白酶解活性测定
用酪蛋白作为底物测定蛋白酶解活性。一个酪蛋白单位(CPU)定义为在标准条件下(如25℃，pH 9.5培养30分钟)每分钟释放1mM伯氨基的酶量(通过与丝氨酸标准比较而测定)。描述了此分析方法的AF 228卷宗，可以向Novo Nordisk A/S(丹麦)索取而得到，此卷宗的内容包括在本文的参考文献中。
酶
本发明的酶是一种新型的去垢蛋白酶。它通过在合适的包含碳和氮源及无机盐的营养培养基中培养本发明的微生物获得，所述微生物优选的是Bacillus sp.ZI 315，DSM 9702、或其突变体或变体。此酶也可以通过重组DNA技术获得。
本发明的蛋白酶可以具有下面描述的理化性质。
理化性质
通过SDS-PAGE测定的分子量为38kD。可以通过在LKB AmpholineoR FAG平板上电聚焦的方法测定高于9.3的PI。PMSF、α-L-抗胰蛋白酶和火鸡-蛋-白蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶活性。乙二胺四乙酸和大豆-蛋白抑制剂不影响蛋白酶活性。
用1％的酪蛋白为底物在pH 9.5下确定温度活性关系。利用以前描述的测定蛋白酶解活性的方法，对此方法的改进是培养温度在10℃到70℃之间变动。
见图1所示的结果。图中显示，温度在低至10℃到50℃之间，此酶具有蛋白酶解活性，并且最适温度为大约40℃。
通过相同的方法利用pH已调整到6-10范围内的预定值的Britten-Robinson缓冲液确定活性对pH值的依赖性。
见图2所示的结果。图中显示，pH在低至6高到11之间，此酶具有蛋白酶解活性，并且最适pH值在pH 9至pH 11的范围内。
本发明的蛋白酶对使用于低水硬度和适中至较低温度的洗涤剂具有特殊的潜力。
免疫化学性质
本发明的蛋白酶具有与来源于Bacillus sp.ZI 315，DSM 9702菌株的蛋白酶相同或部分相同(即至少部分相同)的免疫化学性质。
各种芽孢杆菌属蛋白酶的免疫化学性质确实是很好的区别特征，而上文描述的最适pH、最适温度、PI等或多或少地相同，在各种洗涤剂中不同的免疫化学性质导致十分不同的稳定性。
可以通过免疫学上的交叉反应鉴别实验来测定免疫化学性质。可以通过众所周知的Ouchterlony双向免疫扩散方法或通过串联交叉免疫电泳完成鉴别实验，这些内容参照N.H.Axelsen；凝胶免疫沉淀技术手册；Blackwell科学出版物(1983)，第5和14章。此书的第5、19、20章描述了＂抗原鉴别＂和＂部分抗原鉴别＂两部分。
通过用本发明纯化的蛋白酶免疫兔产生单特异性抗血清。把免疫原与弗氏佐剂混合并每隔两周皮下注射到兔体内。在完整的8周免疫周期之后得到抗血清，如N.H.Axelsen，supra所描述从中制备免疫球蛋白。
利用上面描述的ouchterlony双向免疫扩散实验，本发明的蛋白酶没有显示和已知丝氨酸蛋白酶的交叉反应：
-ALCALASETM(可从Novo Nordisk A/S得到)
-SAVINASETM(可从Novo Nordisk A/S得到)
-ESPERASETM(可从Novo Nordisk A/S得到)
-枯草溶菌素Novo(可从Novo Nordisk A/S得到)，
-KAZUSASETM(可从SHOWA DENKO得到)，
-在WO 92/07067中所描述的芽孢杆菌属蛋白酶，
-在WO 92/17576中所描述的芽孢杆菌属蛋白酶，
-在WO 92/17577中所描述的芽孢杆菌属蛋白酶，
-在WO 92/17578中所描述的芽孢杆菌属蛋白酶，
-在WO 93/18140中所描述的芽孢杆菌属蛋白酶，
-在WO 93/24623中所描述的芽孢杆菌属蛋白酶，
-在WO 94/01532中所描述的芽孢杆菌属蛋白酶，
-和在WO 95/07350中所描述的芽孢杆菌属蛋白酶，
各种芽孢杆菌属蛋白酶耐受各种去垢剂的能力存在很大差别，目前，区别芽孢杆菌属蛋白酶最好的方法是免疫化学鉴别方法。
去垢组合物
按照本发明，蛋白酶一般可以是去垢组合物的一种组分，例如，洗碗剂或洗衣房去垢组合物。同样地，这种蛋白酶可以以无尘颗粒、稳定的液体或一种保护的酶的形式包含在去垢组合物中。可以如美国4,661,452和4,106,991S所描述产生无尘颗粒(两个都是对Novo工业A/S)，同时通过本领域已知的方法对无尘颗粒可包衣也可不包衣。蜡包衣材料的例子是平均分子量为1000至20000多聚(环氧乙烷)产品(多聚乙烯二醇)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化的烷基苯酚；乙氧基化的醇，其中醇含有15至20个碳原子，其中还有12至80个环氧乙烷单位；醇；脂肪酸；脂肪酸的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯。专利1483591给出了通过流化床技术形成膜的适于应用的包衣材料。按照已建立的方法，例如可以通过加入多元醇(如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸)来稳定液态酶制剂。其它酶稳定剂是本领域众所周知的。可以按照EP 238,216公开的方法制备保护的酶。
本发明的去垢组合物可以存在于任何一种方便的形式中，例如，粉末、颗粒、糊状物或液体。液体洗涤剂可以含水(一般包含高达70％的水和0-30％的有机溶剂)，或不含水。
去垢组合物包括一种或更多表面活性剂，其中每一种可以是阴离子的、非离子、阳离子或两性离子。去垢剂通常包含0-5％的阴离子表面活性剂如线性烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯基磺酸盐(AOS)、硫酸烷基盐(醇的硫酸酯)(AS)、醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、次生的链烷磺酸盐(SAS)、α-硫代脂肪酸的甲基酯、烷基或烯基琥珀酸、或肥皂。它也包含0-40％的非离子表面活性剂如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、烷基苯酚乙氧基化物、烷基聚葡萄糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇胺或多羟酮烷基脂肪酸酰胺(如WO 92/06154中所述)。
去垢组合物还可以包含一种或更多其它酶，如淀粉酶、脂酶、角质素酶、纤维素酶、过氧化物酶、和氧化酶(例如漆酶)。
去垢剂可以包含1-65％的去垢助洗剂或络合剂，如沸石，二磷酸盐，三磷酸盐，膦酸，柠檬酸，次氨基三乙酸(NTA)，乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)，烷基或烯基琥珀酸，可溶性硅酸盐或层硅酸盐(例如来源于赫希斯特的SKS-6)。去垢剂也可以不含助洗剂，例如，实质上无去垢助洗剂。
去垢剂可以包含一种或多种的聚合物。例如羧甲基纤维素(CMC)、聚尿苷酸(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEP)、聚尿苷酸(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯、顺丁烯二酸/丙烯酸的共聚物和月桂基异丁烯酸/丙烯酸的共聚物。
去垢剂可以包含一种漂白系统，这种漂白系统包含一种H2O2源，如和形成过酸(peracid-forming)的漂白激活剂组合的过硼酸盐或过碳酸盐，漂白激活剂如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰苯酚磺酸盐(NOBS)。另外，漂白系统可以包含过氧酸，如酰胺、亚胺或磺型。
本发明的去垢组合物的酶可以利用常规的稳定剂稳定，例如，多元醇如丙二醇或甘油、食糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(如芳香族硼酸酯)，并且，所说的组合物可以如WO 92/19709和WO 92/19708描述的方法配制。
去垢剂也可以包含其它常规去垢剂的组份，例如包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、土壤悬浮剂、抗土壤沉淀剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂、或香料在内的织物调理剂。
pH(在使用浓度的水溶液中测量)通常是中性或碱性的，例如，在7-11的范围中。
在本发明范围内的去垢组合物的特定形式包括：
1)配制成至少具有600g/l堆密度的颗粒去垢组合物，其包含下列组份：
| 线性烷基苯磺酸盐(以酸计) | 7-12％ |
| 醇乙氧基硫酸酯(alcoholethoxysulfate)(如C12-18醇，1-2 EO)或硫酸烷基盐(如C14-15) | 1-4％ |
| 醇乙氧基化物(例如，C14-15醇，7 EO) | 5-9％ |
| 碳酸钠(Na2CO3) | 14-20％ |
| 可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) | 2-6％ |
| 沸石(NaAlSiO4) | 15-22％ |
| 硫酸钠(Na2SO4) | 0-6％ |
| 柠檬酸钠/柠檬酸(C6H5Na3O7) | 0-15％ |
| 过硼酸钠(NaBO3·2H2O) | 11-18％ |
| TAED | 2-6％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如，顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) | 0-3％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂) | 0-5％ |
2)配制成至少具有600g/l堆密度的颗粒去垢组合物，其包含下列组份：
| 线性烷基苯磺酸盐(以酸计) | 6-11％ |
| 醇乙氧基硫酸盐(如C12-18醇，1-2 EO)或硫酸烷基盐(如C14-15) | 1-3％ |
| 醇乙氧基化物(例如，C14-15醇，7 EO) | 5-9％ |
| 碳酸钠(Na2CO3) | 15-21％ |
| 可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) | 1-4％ |
| 沸石(NaAlSiO4) | 24-34％ |
| 硫酸钠(Na2SO4) | 4-10％ |
| 柠檬酸钠/柠檬酸(C6H5Na3O7) | 0-15％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如，顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) | 0-6％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，抑泡剂、香料) | 0-5％ |
3)配制成至少具有600g/l堆密度的颗粒去垢组合物，其包含下列组份：
| 线性烷基苯磺酸盐(以酸计) | 5-9％ |
| 醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7 EO) | 7-14％ |
| 脂肪酸肥皂(soap as fatty acid)(C16-22脂肪酸) | 1-3％ |
| 碳酸钠(Na2CO3) | 10-17％ |
| 可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) | 3-9％ |
| 沸石(NaAlSiO4) | 23-33％ |
| 硫酸钠(Na2SO4) | 0-4％ |
| 过硼酸钠(NaBO3·2H2O) | 8-16％ |
| TAED | 2-8％ |
| 膦酸酯(例如，EDTMPA) | 0-1％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如，顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) | 0-3％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
4)配制成至少具有600g/l堆密度的颗粒去垢组合物，其包含下列组份：
| 线性烷基苯磺酸盐(以酸计) | 8-12％ |
| 醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7 EO) | 10-25％ |
| 碳酸钠(Na2CO3) | 14-22％ |
| 可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) | 1-5％ |
| 沸石(NaAlSiO4) | 25-35％ |
| 硫酸钠(Na2SO4) | 0-10％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如，顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) | 1-3％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
5)含水的液体洗涤剂组合物，包含下列组份：
| 线性烷基苯磺酸盐(以酸计) | 15-21％ |
| 醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7 EO或C12-15醇，5 EO) | 12-18％ |
| 脂肪酸肥皂(油酸) | 3-13％ |
| 烯基琥珀酸(C12-14) | 0-13％ |
| 氨基乙醇 | 8-18％ |
| 柠檬酸 | 2-8％ |
| 膦酸酯 | 0-3％ |
| 聚合物(如PVP，PEG) | 0-3％ |
| 硼酸盐(B4O7) | 0-2％ |
| 乙醇 | 0-3％ |
| 丙二醇 | 8-14％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
6)含结构水的液体洗涤剂组合物，包含下列组份：
| 线性烷基苯磺酸盐(以酸计) | 15-21％ |
| 醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7 EO或C12-15醇，5 EO) | 3-9％ |
| 脂肪酸肥皂(油酸) | 3-10％ |
| 沸石(NaAlSiO4) | 14-22％ |
| 柠檬酸钾 | 9-18％ |
| 硼酸盐(B4O7) | 0-2％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(如PVP，PEG) | 0-3％ |
| 增粘聚合物如月桂基异丁烯酸/丙烯酸的共聚物；摩尔比为25∶1；MW3800 | 0-3％ |
| 甘油 | 0-5％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
7)配制成至少具有600g/l堆密度的颗粒去垢组合物，其包含下列组份：
| 脂肪醇硫酸酯 | 5-10％ |
| 乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺 | 3-9％ |
| 脂肪酸肥皂 | 0-3％ |
| 碳酸钠(Na2CO3) | 5-10％ |
| 可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) | 1-4％ |
| 沸石(NaAlSiO4) | 20-40％ |
| 硫酸钠(Na2SO4) | 2-8％ |
| 过硼酸钠(NaBO3·2H2O) | 12-18％ |
| TAED | 2-7％ |
| 聚合物(例如，顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) | 1-5％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
8)颗粒粒去垢组合物，其组份如下：
| 线性烷基苯磺酸盐(以酸计) | 8-14％ |
| 乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺 | 5-11％ |
| 脂肪酸肥皂 | 0-3％ |
| 碳酸钠(Na2CO3) | 4-10％ |
| 可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) | 1-4％ |
| 沸石(NaAlSiO4) | 30-50％ |
| 硫酸钠(Na2SO4) | 3-11％ |
| 柠檬酸钠(C6H5Na3O7) | 5-12％ |
| 聚合物(例如，PVP，顺丁烯二酸/丙烯酸共聚物，PEG) | 1-5％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，抑泡剂、香料) | 0-5％ |
9)颗粒粒去垢组合物，其包含以下组份：
| 线性烷基苯磺酸盐(以酸计) | 6-12％ |
| 非离子型表面活性剂 | 1-4％ |
| 脂肪酸肥皂 | 2-6％ |
| 碳酸钠(Na2CO3) | 14-22％ |
| 沸石(NaAlSiO4) | 18-32％ |
| 硫酸钠(Na2SO4) | 5-20％ |
| 柠檬酸钠(C6H5Na3O7) | 3-8％ |
| 过硼酸钠(NaBO3·2H2O) | 4-9％ |
| 漂白激活剂(如NOBS或TAED) | 1-5％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如，聚羧酸酯或PEG) | 1-5％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，荧光增白剂，香料) | 0-5％ |
10)含水的液体洗涤组合物，包含下列组份：
| 线性烷基苯磺酸盐(以酸计) | 15-23％ |
| 醇乙氧基硫酸酯(如C12-15醇，2-3EO) | 8-15％ |
| 醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7 EO或C12-15醇，5 EO) | 3-9％ |
| 脂肪酸肥皂(如，月桂酸) | 0-3％ |
| 氨基乙醇 | 1-5％ |
| 柠檬酸钠 | 5-10％ |
| 水助溶剂(如甲苯磺酸钠) | 2-6％ |
| 硼酸盐(B4O7) | 0-2％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-1％ |
| 乙醇 | 1-3％ |
| 丙二醇 | 2-5％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
11)含水的液体洗涤剂组合物，其包含下列组份：
| 线性烷基苯磺酸盐(以酸计) | 20-32％ |
| 醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7 EO或C12-15醇，5 EO) | 6-12％ |
| 氨基乙醇 | 2-6％ |
| 柠檬酸 | 8-14％ |
| 硼酸盐(B4O7) | 1-3％ |
| 聚合物(如顺丁烯二酸/丙烯酸的共聚物、增 | 0-3％ |
| 粘聚合物如月桂基异丁烯酸/丙烯酸的共聚物) | |
| 甘油 | 3-8％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，助溶剂、分散剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
12)配制成至少具有600g/l堆密度的颗粒去垢组合物，其包含下列组份：
| 阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、硫酸烷基盐、α-烯基磺酸盐、α-硫代脂肪酸的甲基酯、链烷磺酸盐、肥皂) | 25-40％ |
| 非离子表面活性剂(如醇乙氧基化物) | 1-10％ |
| 碳酸钠(Na2CO3) | 8-25％ |
| 可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) | 5-15％ |
| 硫酸钠(Na2SO4) | 0-5％ |
| 沸石(NaAlSiO4) | 15-28％ |
| 过硼酸钠(NaBO3·2H2O) | 0-20％ |
| 漂白激活剂(TAED或NOBS) | 0-5％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(例如，荧光增白剂、香料) | 0-3％ |
13)如1)-12)所述的去垢组合物，其中所说的线性烷基苯磺酸盐全部或部分由(C12-18)硫酸烷基酯代替。
14)配制成至少具有600g/l堆密度的颗粒去垢组合物，其包含下列组份：
| (C12-C18)硫酸烷基盐 | 9-15％ |
| 醇乙氧基化物 | 3-6％ |
| 多羟酮烷基脂肪酸酰胺 | 1-5％ |
| 沸石(NaAlSiO4) | 10-20％ |
| 层化的(Layered)硅酸盐(如来源于赫希斯特的SKS-6) | 10-20％ |
| 碳酸钠(Na2CO3) | 3-12％ |
| 可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) | 0-6％ |
| 柠檬酸钠 | 4-8％ |
| 过碳酸钠 | 13-22％ |
| TAED | 3-8％ |
| 聚合物(如聚羧酸酯或PVP) | 0-5％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(如荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂) | 0-5％ |
15)配制成至少具有600g/l堆密度的颗粒去垢组合物，其包含下列组份：
| (C12-C18)硫酸烷基盐 | 4-8％ |
| 醇乙氧基化物 | 11-15％ |
| 肥皂 | 1-4％ |
| 沸石MAP或沸石A | 35-45％ |
| 碳酸钠(Na2CO3) | 2-8％ |
| 可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2) | 0-4％ |
| 过碳酸钠 | 13-22％ |
| TAED | 1-8％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-3％ |
| 聚合物(如聚羧酸酯或PVP) | 0-3％ |
| 酶(以纯化的酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 小组份(如荧光增白剂、膦酸酯、香料) | 0-3％ |
16)如1)-15)所述的去垢剂配方，其包含稳定化的或包在荚膜内的过酸，作为附加的组分或指定的漂白系统的替代品。
17)如1)，3)，7)，9)所述的去垢组合物，其中12)所说的过硼酸盐由过碳酸盐代替。
18)如1)，3)，7)，9)，12)，14)所述的去垢组合物，其另外包含锰催化剂。锰催化剂可以，例如，是“适于低温漂白的有效的锰催化”(自然369，1994，637-639页)中所述的化合物之一。
19)配制的不含水的去垢剂液体式的去垢组合物，其包含液态非离子表面活性剂，如线性烷氧基化的伯醇、助洗剂系统(例如，磷酸盐)、酶和碱。去垢剂也可以包含阴离子表面活性剂和/或漂白系统。
本发明的蛋白酶可以以洗涤剂常规使用浓度加入。目前，已知道在本发明去垢组合物中，可以以相当于每升洗涤液0.00001-1毫克(以纯酶蛋白计)的蛋白酶量加入。
下面的实施例进一步具体说明本发明，其无意于对本发明权利要求范围作任何限制。
实施例1
把Bacillus sp.ZI 315，DSM 9702培养在含有100ml培养基的500ml具挡板的锥形瓶中，30℃下置于旋转床(300r.p.m)上，培养基的组成如下(每升)：
马铃薯淀粉 100g
地面大麦 50g
大豆面粉 20g
Na2HPO4×12H2O 9g
Pluronic 0.1g
钠酪蛋白 10g
在培养基中的淀粉用α-淀粉酶液化，培养基在120℃下加热45分钟消毒。
在消毒之后，通过加入10ml 1M倍半碳酸钠溶液把培养基的pH调至9.7。
在培养(3天)和分离固体物质后，用常规色谱方法纯化蛋白酶。
1.5升培养物肉汤的产量是50ml，CPU/l为70。SDS-PAGE判定纯度超过90％。
按照本实施例所制备的制剂的特征参照此说明书先前说明，并参考本实施例。
实施例2
Bacillus sp.ZI 315蛋白酶的洗涤效能(20℃)
洗涤效能实验在草汁弄污的棉布上进行，20℃下，恒温10分钟的洗涤模型系统。
实验以6，3.2，8，16，32，64和160nM蛋白酶浓度进行。
实验中使用了美国型粉末去垢组合物2.0g/l。这种去垢剂在加入本发明的蛋白酶之前，不包含任何酶。去垢剂溶解在大约6dH(德国硬度)水中。洗涤液的pH是10。纺织品/洗涤液比为每升洗涤液大约5g的纺织品。对每一种酶浓度，进行两个独立的实验。
织物洗涤后，用流动的自来水冲洗衣物20分钟，然后晾干。用DatacolorElre phometer 2000在460nm测定去除率(remission)(％R)的变化(ΔR)，ΔR是加入蛋白酶后的去除率减去未加蛋白酶的去除率，由此评价本发明的蛋白酶和SavinaseTM的蛋白酶的效能。
表1显示这些检验的结果(2个实验的平均值)。
| 蛋白酶浓度nM | ΔRZI315 SavinaseTM |
| 1.63.28163264 | 4.6 0.87.7 2.712.0 6.617.7 8.518.2 14.821.9 17.0 |
从表1可以看出在所有被测量的蛋白酶浓度下ΔR(Bacillus sp.ZI 315)都高于ΔR(SavinaseTM)，也就是说本发明的蛋白酶在20℃下所有测量浓度都有较好洗涤效能。
实施例3
Bacillus sp.ZI 315蛋白酶的洗涤效能(25℃)
洗涤效能实验在草汁弄污的棉布上进行，25℃下，恒温10分钟的洗涤模型系统。
实验以1，2，7.5和20nM蛋白酶浓度进行。
实验中使用了具有下列组份的去垢剂2.0g/l。这种去垢剂溶解在约6dH
线性烷基苯磺酸盐 0.3g/l
醇乙氧基化物 0.04g/l
肥皂 0.1g/l
Na2SO4 0.3g/l
Na2CO3 0.4g/l
Zeolith 0.6g/l
柠檬酸三钠 0.08g/l
羧甲基纤维素 0.006g/l
聚羧酸酯 0.083(德国硬度)水中。洗涤液的pH是10。纺织品/洗涤液比为每升洗涤液大约5g的纺织品。对每一种酶浓度，进行两个独立的实验。
织物洗涤后，用流动的自来水冲洗衣物20分钟，然后晾干。用DatacolorElrephometer 2000在460nm测定去除率(％R)的变化(ΔR)，ΔR是加入蛋白酶后的去除率减去未加蛋白酶的去除率，由此评价本发明的蛋白酶和SavinaseTM的蛋白酶的效能。
表2显示这些检验的结果(2个实验的平均值)。
表2
| 蛋白酶浓度nM | ΔRZI315 SavinaseTM |
| 127.520 | 3.7 2.77.5 2.914.8 7.819.6 13.6 |
从表2可以看出在所有被测量的蛋白酶浓度下ΔR(Bacillus sp.ZI 315)都高于ΔR(SavinaseTM)，也就是说本发明的蛋白酶在25℃下所有测量浓度都有较好洗涤效能。
实施例4
改进因子/模型洗涤剂
在pH为9的条件下，以Savinase为参照，利用模型去垢剂在低水硬度和高水硬度下建立了本发明蛋白酶的改进因子(improvement factor)(下文定义)。
以下列方法测定改进因子：
在460nm下，利用Elrepho 2000光度计(没有紫外)测量试验材料(草和棉布)的去除率值(R)。测量值用于下列公式：
R＝(a·ΔRmax·C)/(ΔRmax+a·c)+b
通过利用曲线的起始斜率计算改进因子(IF)：
IF＝a/aref；
其中
R： 是酶去除率单位的洗涤效果，
a： 是适合(fitted)曲线的起始斜率，
aref： 是参照酶的起始斜率，
b： 是适合曲线和Y轴交点值，
c： 是每升洗涤液中纳摩尔活性酶的酶浓度，和
ΔRmax：是去除率单位酶洗涤效果的理论最大值。
使用了如下的实验条件：
去垢剂： 25％STP(Na5P3O10)
25％Na2SO4
10％NaCO3
20％LAS(Nansa 80S)
5％NI(Dobanol 25-7)
5％Na2Si2O5
0.5％CMC(羧甲基纤维素)
9.5％水
去垢剂剂量：3g/l
pH： 9.0
洗涤时间：15分钟。
洗涤温度：15℃
水硬度： 6.dH和18.dH
酶浓度： 0，3，6，9，15，30和60nM
布样体积：每50ml洗涤溶液5个布样(直径：2.5cm)
试验材料：草和棉布。
获得如下的结果：
当水硬度是60.dH时，IF＝4.8，
当水硬度是18.dH时，IF＝1.4。
此实施例标明本发明的蛋白酶以液体洗涤剂形式(低pH)用于美国和亚洲(该地水硬度低，大约或不到6dH)是有益的。
实施例5
改进因子/商售洗涤剂
也建立了商售洗涤剂Koso Top和Omo Powder China的由实施例4得到的改进因子，以Savinase作为参照。
使用了下列实验条件：
去垢剂剂量：1g/l
pH： 10.5(Koso Top)和
10.2(Omo Powder China)
洗涤时间： 15分钟
洗涤温度： 15℃
水硬度： 30.dH
酶浓度： 3，6，9，15，30和60nM
布样体积： 每50ml洗涤溶液5个布样(直径：2.5cm)
试验材料： 草和棉布
得到了如下结果：
IF＝2.1(Koso Top)，和
IF＝3.1(Omo Powder China)
此实施例说明本发明的蛋白酶以液体洗涤剂形式(高pH)用于亚洲(该地水硬度低，大约或不到3.dH)是有益的。
Claims (10)
1.一种蛋白酶，其特征在于该蛋白酶具有与来源于芽孢杆菌ZI315，DSM9702菌株的蛋白酶相同的免疫化学性质，该蛋白酶还具有下列性质：
(a)38kD的表观分子量；
(b)高于9.3的PI；
(c)在25℃和以酪蛋白为底物测得的最适pH范围从pH9到pH11；
(d)在pH9.5和以酪蛋白为底物测得的最适温度大约40℃；
(e)在pH9.5和以酪蛋白为底物测得的在25℃时的相对活性约60％。
2.权利要求1的蛋白酶，其可从芽孢杆菌ZI 315，DSM9702菌株中获得。
3.一种芽孢杆菌ZI 315，DSM9702菌株的分离的生物学纯培养物。
4.一种制备按照权利要求1-2任一之蛋白酶的方法，该方法包括在含有碳和氮源及无机盐的合适的培养基中，培养按照权利要求3的芽孢杆菌的产生蛋白酶的菌株，然后回收所需的酶。
5.按照权利要求4的方法，其中培养芽孢杆菌ZI 315，DSM9702菌株。
6.按照权利要求1-2之任一蛋白酶用作去垢酶的用途。
7.一种去垢组合物，其包含按照权利要求1-2之任一蛋白酶。
8.按照权利要求7的去垢组合物，其还包含一种或多种其它酶。
9.一种去垢剂添加剂，其包含按照权利要求1-2任一之蛋白酶，以无尘颗粒、液体的形式提供。
10.一种洗涤方法，该方法包括加入按照权利要求1-2任一之蛋白酶。
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