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CN109136291A - 一种发酵方法 - Google Patents

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CN109136291A
CN109136291A CN201811101693.8A CN201811101693A CN109136291A CN 109136291 A CN109136291 A CN 109136291A CN 201811101693 A CN201811101693 A CN 201811101693A CN 109136291 A CN109136291 A CN 109136291A
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CN
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bioreactor
fermentation
stream
gas
substrate
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Application number
CN201811101693.8A
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English (en)
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L·P·特兰
S·D·辛普森
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Lanzatech NZ Inc
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Lanzatech New Zealand Ltd
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Abstract

用于使用两阶段发酵方法从气态底物产生一种或多种脂质产物的方法和系统。所述方法将包含CO2和H2的气态底物提供给包含一种或多种微生物的培养物的第一生物反应器，并且发酵所述底物以产生乙酸盐。然后将来自所述第一生物反应器的乙酸盐提供给第二生物反应器，在所述第二生物反应器中所述乙酸盐作为底物用于通过一种或多种酵母发酵产生脂质。

Description

一种发酵方法
本申请是题为“一种发酵方法”的第201280043987.4号发明专利申请的分案申请。原申请对应国际申请PCT/NZ2012/000161，申请日为2012年9月7日，优先权日为2011年9月8日。
技术领域
本发明涉及一种从气态原料产生脂质的方法。所述方法包括用于从气态原料产生一种或多种脂质产物的两阶段系统。
背景技术
全球能量危机已经增加了人们对燃料生产的替代方法的兴趣。用于运输业的生物燃料是有吸引力的石油替代物并且以低浓度混合物的形式迅速进入燃料市场。生物质来源的生物燃料的生产已经作为提高替代能量生产并减少温室气体排放的主要方法而出现。从生物质产生生物燃料使能源独立成为了可能，这已经被证明可加快农村地区的发展并增强可持续的经济发展。
第一代液体生物燃料使用碳水化合物原料，例如淀粉、蔗糖、玉米、油菜籽、大豆、棕榈油和植物油。第一代原料带来了许多重大的挑战。这些碳水化合物原料的成本受到它们作为人类食物或动物饲料的价值的影响，并且用于乙醇生产的产淀粉或产蔗糖的农作物的栽培不是在所有地理条件下都是经济上可持续的。持续使用这些原料作为生物燃料的来源会不可避免地对耕地和水资源造成巨大压力。因此，开发将更低成本和/或更丰富的碳源转化为燃料的技术是有利的。
第二代生物燃料为产生自纤维素和藻类的那些。由于藻类的生长速率快并且有能力消耗二氧化碳及产生氧，因此选择藻类产生脂质。
已经看见活跃性增加的一个领域是脂质的微生物合成，其包括生物燃料产生所需的原材料。许多研究已经证明，通过在不同底物上(例如工业甘油、乙酸、污泥、乳清渗透物、甘蔗糖蜜和稻草水解产物)使用产油酵母(oleaginous yeast)能够积累脂质。由于生产成本高以及与原料的运输和贮存相关的成本高，这些第二代生物燃料技术同样面临着问题。
早就已经认识到可以使用催化方法将由CO、CO2或氢气(H2)组成的气体转化成各种燃料和化学品。然而，也可以使用微生物将这些气体转化成燃料和化学品。这些生物方法虽然普遍比化学反应慢，但是它们相对于催化方法有若干优势，包括特异性更高、收率更高、能源成本更低和抗中毒性更强。
已经证明，通过厌氧发酵一氧化碳和/或氢气和二氧化碳可产生乙酸、乙酸盐和其他产物(例如乙醇)。参见例如Balch et al,(1977)International Journal of SystemicBacteriology.,27:355-361；Vega et al,(1989)Biotech.Bioeng.,34:785-793；Klassonet al(1990)Appl.Biochem.Biotech.,24/25:1等。
已经证明，产乙酸细菌(例如醋酸杆菌(Acetobacterium)属的那些)利用含H2、CO2和/或CO的底物并且通过以乙酰Co-A合酶为关键酶的Wood-Ljungdahl通路将这些气态底物转化成乙酸、乙醇和其他发酵产物。伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)是一种在约30℃的温度下生长良好的严格厌氧且不形成孢子的微生物，已经显示其由H2和CO2产生乙酸盐。Balch et al.首先公开了细菌伍氏醋酸杆菌，其通过厌氧氧化氢并还原二氧化碳来生长。Buschorn et al证明伍氏醋酸杆菌基于葡萄糖产生并利用乙醇。伍氏醋酸杆菌的发酵是在最高达20mM的葡萄糖(果糖)浓度下进行。Buschorn et al发现当葡萄糖浓度增加到40mM时，在伍氏醋酸杆菌进入静止生长期时剩余了几乎一半的底物，并且乙醇作为额外的发酵产物出现。Balch et al发现，根据以下化学计量：4H2+2CO2->CH3COOH+H2O，所检测到的伍氏醋酸杆菌发酵H2和CO2的唯一主产物为乙酸盐。
本发明的一个目的在于提供一种至少在一定程度上克服上述缺点的方法和发酵系统，或至少为公众提供了一种可用的选择。
发明内容
在第一方面，提供了一种从气态底物产生一种或多种脂质产物的方法，所述方法包括：
i.将所述气态底物接收入含有一种或多种微生物的培养物的第一反应器中，并且发酵所述气态底物以产生一种或多种酸和/或醇；和
ii.将所述一种或多种酸和/或醇的至少一部分传递至含有一种或多种酵母的培养物的第二生物反应器中，发酵所述一种或多种酸以产生一种或多种脂质产物。
在一个实施方案中，所述气态底物至少包括CO2和H2。在某些实施方案中，所述气态底物来自工业来源。在某些实施方案中，混合来自一种或多种工业来源的一种或多种气体以提供具有所需组成的气态底物。
在一个实施方案中，所述一种或多种酸选自乙酸盐(acetate)、丁酸盐、琥珀酸盐或丙酸盐。
在一个实施方案中，所述一种或多种醇选自乙醇、丁醇、甲醇或丙醇。
在各个实施方案中，在第一阶段中产生的所有酸和/或醇在第二阶段中被转化成脂质。在各个实施方案中，回收在所述第一阶段中产生的酸和/或醇的至少一部分。
在第二个方面，提供了一种从含有CO2和H2的气态底物产生一种或多种脂质产物的方法，所述方法包括：
i.将所述气态底物接收入含有一种或多种微生物的培养物的第一生物反应器中，并且发酵所述气态底物以产生一种或多种酸；和
ii.将所述一种或多种酸的至少一部分传递至含有一种或多种酵母的培养物的第二生物反应器中，发酵所述一种或多种酸以产生一种或多种脂质产物。
在一个实施方案中，所述一种或多种酸为乙酸盐，所述一种或多种微生物选自伍氏醋酸杆菌和热醋穆尔氏菌(Moorella thermoaceticum)。
在本发明的一个实施方案中，所述第一生物反应器中发酵的pH维持在约pH 6至约pH 8。在一个优选的实施方案中，pH维持在pH 7。
在一个实施方案中，通过所述第二阶段产生的脂质用于产生一种或多种第三产物。在一个实施方案中，所述一种或多种第三产物选自乙醇和生物柴油。
在第三方面，提供了一种通过厌氧微生物发酵产生一种或多种产物的方法，所述方法包括：
i.将含有CO2和H2的底物接收入含有一种或多种微生物的培养物的第一生物反应器中，所述微生物选自醋酸杆菌属、穆尔氏菌属(Moorella)、梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、醋酸杆菌属、真杆菌属(Eubacterium)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、产醋杆菌属(Oxobacter)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷八叠球菌属和脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)；厌氧发酵来自步骤的底物以产生包含乙酸 盐的发酵液
ii.将所述发酵液进料至含有一种或多种酵母的培养物的第二生物反应器中；和
iii.发酵乙酸盐以产生一种或多种脂质产物。
在一个实施方案中，加工合并的发酵液以除去至少一部分乙酸盐，然后再将所述流进料至第二生物生物反应器中。
应理解以下实施方案可应用于上述的任何一个方面。
在一个实施方案中，将合并的发酵流的pH调节至pH6到pH8，然后将其进料至第二生物反应器。
在本发明的一个实施方案中，所述第二生物反应器中发酵液中乙酸与氮的比例为至少10:1。在一个实施方案中，所述第二生物反应器中发酵液中的碳与乙酸的比例为49:1。在本发明的一个实施方案中，处理从所述第一生物反应器中排出的酸流以提供纯化的或浓缩的酸流，所述纯化或浓缩的酸流将被传递至所述第二生物反应器。在本发明的一个实施方案中，监测所述第二生物反应器中发酵液的碳:氮比例，调整输入至所述生物反应器中的碳与氮的输入量以确保碳:氮的比例大于49:1。
在本发明的一个实施方案中，在第一生物反应器中产生的乙酸盐的浓度为至少约5g/L或至少约10g/L，或者至少约15g/L或至少约20g/L。
在本发明的一个实施方案中，在第一生物反应器中乙酸盐的产生速率为至少约20g/L/天或至少约40g/L/天或至少约60g/L/天。
在本发明的一个实施方案中，所述一种或多种酵母为产油酵母。在本发明的一个实施方案中，所述产油酵母选自假丝酵母属(Candida)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母菌(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)。在一个优选的实施方案中，所述一种或多种酵母为弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatii)。
在本发明的一个实施方案中，在所述第二生物反应器中发酵的pH维持在约pH 6至约pH 8。在一个优选的实施方案中，pH维持在pH 7。
在本发明的一个实施方案中，所述第二生物反应器中的pH基本上与第一生物反应器中的pH相同。在替代的实施方案中，将从所述第一生物反应器中排出的流的pH调节至约pH 7，然后将其进料至所述第二生物反应器。
在本发明的一个实施方案中，在所述第二生物反应器中的脂质浓度至少为约至少10g/L或至少约20g/L，或者至少约40g/L，或者至少约60g/L，或者至少约80g/L，或者至少约100g/L，或者至少约150g/L。在本发明的一个实施方案中，在所述第二生物反应器中的脂质产生速率为至少约5g/L/天，或者至少约7g/L/天，或者至少约10g/L/天，或者约15g/L/天，或者至少约20g/L/天，或者至少约30g/L/天。
在本发明的一个实施方案中，所述方法为连续式两阶段发酵。在一个实施方案中，所述方法为半连续式两阶段发酵。
在一个实施方案中，将在所述第一生物反应器中产生的所有乙酸盐转移至所述第二生物反应器以发酵成脂质。
在一个实施方案中，回收在所述第一生物反应器中产生的乙酸盐的至少一部分。
在一个实施方案中，从第二生物反应器排出的流的至少一部分被循环至第一反应器。在一个实施方案中，加工所述排出流(exiting stream)以基本上除去所有生物质，然后将其传递至所述第一反应器。在某些实施方案中，进一步处理所述排出流以除去可溶性蛋白质和其他不想要的组分。在其他实施方案中，调节所述流的pH然后将其进料至所述第一反应器中。
在一个实施方案中，在所述第二生物反应器中产生的脂质被用于生产一种或多种第三产物。在一个实施方案中，所述一种或多种第三产物选自乙醇、生物柴油、脂肪酸甲基酯(FAME)和脂肪酸乙基酯(FAEE)。
在一个实施方案中，使用一系列第一反应器来给至少一个第二反应器进料。例如，使用三个第一反应器来给一个第二反应器进料，四个第一反应器来给两个第二反应器进料等。
在一个实施方案中，所述气态底物为来自工业过程的废气或排气。在一个实施方案中，所述废气选自来自制氢工厂的尾气、焦炉煤气、天然气、催化重整气、石油脑裂化器废气、炼油厂燃气、制甲醇工厂尾气、制氨工厂尾气和石灰窑气。
本发明还可单独地或综合地(以两个或更多个所述部分、要素或特征的任意结合或所有结合)包括在本申请说明书中提及或指出的部分、要素或特征，并且当本文提及在本发明涉及领域中有已知等价物的具体整体(integer)时，所述已知等价物被认为是纳入本文的，正如其被单独提出一样。
附图说明
现将参照附图更详细地描述本发明，其中：
图1为如本发明第二方面所定义的用于从CO2和H2产生脂质的双发酵罐系统。
图2示出了根据本发明的一个实施方案从CO2和H2产生乙酸盐。
图3a示出了利用葡萄糖底物的弯曲隐球菌(C.curvatus)的生长。
图3b示出了利用来自本发明CO2/H2发酵方法的乙酸盐底物的弯曲隐球菌的生长。
具体实施方式
本发明广义上涉及通过发酵含有CO2的气态底物产生醇的方法。本发明的方法还广义上涉及在碳捕获方面的改进，其中CO2被转化成有用的产物，即醇。
定义
除非另外定义，在本说明书中通篇使用的以下术语的定义如下：
渗透物——发酵液中可穿过分离器并且不会被分离器保留的基本可溶的组分。渗透物通常含有可溶性发酵产物、副产物和营养液。
稀释率——在生物反应器中发酵液的替换速率。稀释率是以每天被营养培养基替换的发酵液的生物反应器体积数测定。
发酵液——在生物反应器中存在的组分的混合物(包括发酵液培养物和营养培养基)。
营养培养基——向发酵液中加入的溶液，其含有营养素和适于微生物培养物生长的其他组分。
含有一氧化碳的底物等术语应理解为包括任意的底物，其中一氧化碳可被一种或多种细菌菌株利用以进行例如生长和/或发酵。
发酵放出液(broth bleed)——从生物反应器中移出的未被传递至分离器的一部分发酵液。
发酵液培养物——在发酵液中存在的微生物培养物。
发酵液培养物密度——在发酵液中微生物细胞的密度。
分离器——经改造适用于从生物反应器接收发酵液并且使发酵液穿过过滤器传递以便获得渗余物和渗透物的模块。过滤器可以为膜，例如，错流膜或中空纤维膜。
包含二氧化碳和氢气的气态底物等术语为包括含二氧化碳和氢气的任何气体。二氧化碳和氢气可以以各种比例存在，即基本相同％的二氧化碳和氢气，或较多的氢气，或较多的二氧化碳。
酸——如在本文中使用的，该术语既包括羧酸又包括相关的羧酸阴离子，例如存在于如本文中所描述的发酵液中的游离乙酸和乙酸盐的混合物。在发酵液中的分子酸与羧酸盐的比例取决于系统的pH。术语“乙酸盐”包括单独的乙酸盐以及分子乙酸或游离乙酸与乙酸盐的混合物，例如存在于如本文描述的发酵液中的乙酸盐与游离乙酸的混合物。在发酵液中的分子乙酸与乙酸盐的比例取决于系统的pH。
在本文中使用的脂质包括脂肪酸、糖脂、鞘脂、糖类脂(saccharolipid)、聚酮化合物、固醇脂和异戊烯醇脂(prenol lipid)。
生物反应器或发酵罐——包括由一个或多个容器和/或塔或管道排列组成的发酵装置，其包括连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、流化床生物膜反应器(MBBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、膜反应器(例如中空纤维膜生物反应器(HFMBR))、静态混合器或者适合气体-液体接触的其他容器或其他装置。
第一生物反应器——如在本文中所使用的，该术语意欲包括一个或多个可以与第二生物反应器串联或并联的反应器。所述第一生物反应器使用厌氧发酵以从气态底物中产生酸。使用一个或多个第一生物反应器的酸产物的至少一部分作为在一个或多个第二生物反应器中的底物。
第二生物反应器——如在本文中所使用的，该术语意预包括任意数目的其他生物反应器，其可以与第一生物反应器串联或并联。任何一个或多个所述其他生物反应器还可以与其他分离器连接。
发酵、发酵过程或发酵反应及类似术语——如在本文中所使用，意欲包括所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。如在本文中进一步描述的，在一些实施方案中，生物反应器可以包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，将金属或组合物加入到发酵反应中应该理解为包括加入到这些反应器之一或两者中。
通过厌氧发酵气态底物产生酸的方法在本领域中是已知的。
虽然以下描述集中于本发明的某些实施方案，但是应理解本发明可以适用于产生其他醇和或酸，并且本发明所属领域的技术人员在考虑了本公开内容后会知道使用其他底物。同样，虽然特别提到了使用伍氏醋酸杆菌和热醋穆尔氏菌进行的发酵，但是本发明也适用于其他微生物，所述微生物可以用在相同或不同的方法中，所述方法产生有用产物，包括但不限于醇，例如乙醇。
如上文所限定的，在一方面，本发明涉及使用两阶段发酵方法从气态底物产生脂质产物的方法。在第一阶段中，厌氧发酵包含CO2和H2的气态底物以产生一种或多种酸。在所述方法的第二阶段中，将来自第一阶段的一种或多种酸进料至含有一种或多种酵母的培养物的第二生物反应器中。厌氧发酵所述一种或多种酸以产生一种或多种脂质产物。
本发明的一个方面的方法包括在含有液体营养培养基的第一生物反应器中培养一种或多种厌氧、产乙酸细菌的菌株，所述菌株能够从含CO2和H2的底物产生乙酸盐，并将所述气态底物供应至所述生物反应器。所述发酵方法产生了乙酸盐。将在第一生物反应器中产生的乙酸盐进料至含有一种或多种产油酵母的培养物的第二生物反应器中，所述产油酵母能够从含乙酸盐的底物产生脂质。
所述能够从含有CO2和H2的底物产生乙酸盐的厌氧产乙酸细菌的一种或多种菌株来自醋酸杆菌属、穆尔氏菌属、梭菌属、热球菌属(Pyrococcus)、真杆菌属、脱硫肠状菌属、一氧化碳嗜热菌属(Cabroxydothermus)、产醋菌属(Acetogenium)、醋厌氧菌属(Acetoanaerobium)、丁酸杆菌属、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、瘤胃球菌属、产醋杆菌属和甲烷八叠球菌属。更特别地，所述细菌选自伍氏醋酸杆菌和热醋穆尔氏菌。
本发明各个方面的发酵方法的效率还可通过另外一种方法来改进，所述另外一种方法将从第二生物反应器排出的流循环至至少一个第一反应器。从第二生物反应器中排出的流可以含有未使用的金属、盐和其他营养组分。通过将所述排出流循环至第一反应器，可减少向第一反应器提供连续营养培养基的成本。该循环步骤具有降低连续发酵方法的水需求的其他优点。可处理从生物反应器中排出的流再将其传递回第一反应器中。在优选的实施方案中，分离并加工生物质以回收一种或多种脂质产物。然后可将基本上无生物质的流传递至第一反应器。或者，可进一步处理所述无生物质的流以除去可溶性蛋白质或其他不想要的组分，接着再将其传递至第一反应器中。可向回到第一反应器的流中加入另外的金属和盐，以提供具有所需组分的营养流。根据在第一反应器中发生的发酵过程监测并调节所述流的pH。
使用二氧化碳和氢气底物的发酵
本发明特别适用于支持从气态底物(例如含CO2和H2的工业燃气)产生乙酸盐和乙醇。一种这类型的气体流为来自制氢工厂的尾气，其通常含有50-60％CO2、20-30％H2、5-15％CO和5-15％CH4。另一种产生富含CO2和H2的尾气的工业过程为氨制造。类似的流产生于任意基于碳的原料的加工，所述基于碳的原料例如石油、煤和生物质。本发明还适用于产生其他醇的反应。
从气态底物产生乙醇和其他醇的方法是已知的。示例性的方法包括记载于例如WO2007/117157、WO2008/115080、US6,340,581、US6,136,577、US5,593,886、US5,807,722和US5,821,111中的那些，所述文献各自通过参引的方式纳入本说明书中。
已知多种厌氧细菌能够将CO2和H2发酵成醇(包括乙醇)和乙酸并且适用于本发明的方法。产醋酸菌具有通过Wood-Ljungdahl通路将气态底物(例如H2、CO2和CO)转化成产物(包括乙酸、乙醇和其他发酵产物)的能力。适合用于本发明的这些细菌的实例包括产醋菌属的细菌，例如伍氏醋酸杆菌菌株((Demler,M.,Weuster-Botz,“Reaction EngineeringAnalysis of Hydrogenotrophic Production of Acetic Acid by AcetobacterumWoodii”,Biotechnology and Bioengineering,Vol.108,No.2,2011年12月)。
已经证明伍氏醋酸杆菌通过发酵包含CO2和H2的气态底物产生乙酸盐。Buschhornet al.证明了伍氏醋酸杆菌能够在磷酸盐限制的葡萄糖发酵中产生乙醇。
其他合适的细菌包括穆尔氏菌属(moorella)的细菌，包括穆尔氏菌HUC22-1(Sakai et al,Biotechnology Letters 29:第1607-1612页)和,一氧化碳嗜热菌属的细菌(Svetlichny,V.A.,Sokolova,T.G.et al(1991),Systematic and Applied Microbiology14:254-260)。其他实例包括热醋穆尔氏菌(Morella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、伍氏醋酸杆菌、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)(Simpaet.al.Critical Reviews in Biotechnology,2006Vol.26.第41-65页)。此外，如同本领域技术人员会理解的，应理解其他产乙酸厌氧细菌也可用于本发明。还应理解本发明可适用于两种或多种细菌的混合培养物。
适用于本发明的一种示例性微生物是伍氏醋酸杆菌，所述伍氏醋酸杆菌具有以标识保藏号DSM 1030保藏于德国生物材料资源中心(German Resource Centre forBiological Material,DSMZ)的菌株的鉴定特征。
本发明方法中使用的细菌培养可使用任意数目的本领域中已知使用厌氧细菌来培养和发酵底物的方法进行。示例性技术在下文“实施例”部分提供。举例来说，可使用在以下文章中综述的使用气态底物进行发酵的那些方法：M.Demler and D.Weuster-Botz(2010).Reaction Engineering Analysis of Hydrogenotrophic Production of AceticAcid by Acetobacterium woodii.Biotechnology and Bioengineering 2010；D.R.Martin,A.Misra and H.L.Drake(1985).Dissimilation of Carbon Monoxide toAcetic Acid by Glucose-Limited Cultures of Clostridium thermoaceticum.Appliedand Environmental Microbiology,Vol 49,No.6,第1412页-第1417页。通常，所述发酵可在任意合适的生物反应器中进行，例如连续搅拌釜反应器(CTSR)、鼓泡塔反应器(BCR)或滴流床反应器(TBR)。同样地，在本发明的一些实施方案中，所述生物反应器可包含其中培养所述微生物的第一生长反应器和第二发酵反应器，将来自所述生长反应器的发酵液进料给第二发酵反应器，并在其中产生大部分发酵产物(例如，乙醇和乙酸盐)。
含有CO2和H2的底物
优选地，用于发酵的碳源可为包含二氧化碳和氢气的气态底物。类似地，气态底物可以为作为工业过程的副产物获得的或从一些其他来源获得的含有CO2和H2的废气。全球CO2排放的最大来源来自发电厂、工业设施和其他来源中化石燃料的燃烧，所述化石燃料例如煤、油和气。
气态底物可以为含有CO2和H2的废气，其作为工业过程的副产物获得或者从其他来源例如汽车排放尾气获得。在某些实施方案中，所述工业过程选自制氢、制氨、燃料燃烧、煤的气化和石灰岩及水泥的生产。所述气态底物可以是因为混合一种或多种气态底物以提供混合流。技术人员应理解，富含H2或富含CO2的废气流比既富集H2又富集CO2的废气流更加丰富。技术人员应理解混合一种或多种的气流(其包含所需的CO2和H2组分之一)是落在本发明的范围内。
富含氢气的气流是通过各种方法产生，包括烃的蒸汽重组，尤其是天然气的蒸汽重组。煤或烃的部分氧化也是富含氢气的气体的来源。富含氢气的气体的其他来源包括水的电解、来自用于产生氯的电解池的副产物，以及来自各个炼油厂和化学品流的副产物。
通常富含二氧化碳的气流包括烃燃烧的废气，所述烃例如天然气或油。二氧化碳还作为氨、石灰或磷酸盐的生产的副产物产生以及来自天然二氧化碳井(wells)。
流的混合
如之前所指出的，需要将工业废物流与一种或多种其他流混合以改善发酵反应的效率、酸和/或醇生产，并且/或者总的碳捕获。
因此，如果工业流具有高CO2含量但包括了少量H2或无H2，则需要将一种或多种包含H2的流与包含CO2的废物流混合，然后将混合的底物流提供至发酵罐。发酵的总效率、醇生产力和/或总的碳捕获将取决于所述混合流中CO2与H2的化学计量比。然而，在具体的实施方案中，混合的流可以基本上包含以下摩尔比的CO2和H2：至少1:2，至少1:4或至少1:6或至少1:8或至少1:10。
将流混合还可以具有其他优势，尤其是在包含CO2和/或H2的废物流实际上是间断的情况下。例如，包含CO2和/或H2的间断废物流可以与包含CO2和/或H2的基本上连续的流混合，并且将其提供至发酵罐。在本发明的具体的实施方案中，基本上连续的流的组成和流速可以根据所述间断的流而有所不同，目的是维持向发酵罐提供组成和流速基本上是连续的底物流。
混合两种或多种流以实现所需的组成可以包括改变所有流的流速，或者可以使所述流中的一种或多种维持恒定而改变其他流，从而将所述底物流“修剪”或优化成所需组成。对于连续加工的流，可能需要稍微进行进一步的处理或不进行进一步的处理(例如缓冲)，并且所述流可以直接提供给发酵罐。然而，如果一种或多种流是间歇地获得的，和/或如果各种流是连续获得的但是却以不同的速率使用和/或产生，那么可能需要为各种流提供缓冲储存器。
本领域的技术人员会理解，在混合之前有必要监测所述流的组成和流速。对混合流组成的控制可通过以下方式实现：改变组成流的比例以达到目标或所需组成。例如，基础载气流可以主要为CO2，可以混合包含高浓度的H2的次级气流以达到特定的H2:CO2比例。混合流的组成和流速可通过本领域中已知的任何方式监测。混合流的流速可独立于混合操作进行控制；然而，抽出独立组成流的速率需控制在一定范围内。例如，间歇产生的，从缓冲储存器中抽出的流必须以既不耗尽又不装满缓冲储存器的速率抽出。
在混合时，各独立的组成气将会进入混合室，所述混合室通常为小的容器，或者为一段管。在这些情况下，可以向所述容器或管提供静态混合装置，例如挡板，布置所述静态混合装置以促进各独立组分的湍流和快速均化。
如果需要，还可提供所述混合流的缓冲储存器，以维持向生物反应器提供基本上连续的底物流。
可任选地将一种处理器纳入系统中，所述处理器被改造为适于监测所述组成流的组成和流速并且控制所述流以合适比例混合，从而实现所要求的或所需的混合。例如，可以以所需的或可用的方式提供特定组分以优化醇生产力和/或总的碳捕获的效率。
在本发明的某些实施方案中，所述系统适合连续监测至少两种流的流速和组成并且将所述流结合以产生一个具有最佳组成的单一混合底物流，以及用于将优化的底物流传递至发酵罐的装置。
以非限定实例举例，本发明的具体实施方案包括使用来自石灰或水泥生产的二氧化碳气体作为CO2来源。通常，所述流含有少量H2或不含有H2，因此需要将包含CO2的流与包含H2的流合并以实现更合乎需要的CO2:H2比例。H2通常在轧钢厂的焦炉中大量产生。
因此，来自焦炉的包含H2的废物流可与包含CO2的石灰窑废物流混合以实现所需的组成。
可以被混合以形成CO2/H2底物流的其他CO2和/或H2来源包括氨合成和尿素合成。
气态底物还可以为从一些其他来源(例如汽车尾气)获得的含CO2和H2的废气。在这些实施方案中，可以在所述含有CO2和H2的气体被排放至大气之前使用任何常规方法将其从工业过程中捕获。根据含有CO2和H2的气态底物的组成，还可能需要在将所述气态底物引入至发酵之前对其进行处理，以除去不需要的杂质例如尘埃颗粒。例如，可以使用已知的方法过滤或洗涤气态底物。
所述含有CO2和H2的底物还可以源自发酵过程，其中碳水化合物或气体被发酵以形成产物，例如乙醇。例如，通过梭菌属的微生物厌氧发酵包含CO的气态底物使得产生包含乙醇的产物。CO2和任选的氢气是该发酵反应的副产物。
在本发明的一些实施方案中，包含CO2的底物来自含碳废物，例如工业废气或来自其他废物的气化。因此，本发明的方法代表了捕获原本会被排放到环境中的碳的有效方法。在某些实施方案中，所述方法提供了用于通过将CO2转化成有用的产物(例如酸和/或醇)而捕获CO2的改良方法。
所述含有CO2和H2的底物通常含有较大比例的H2，例如至少约30体积％H2，或者至少40体积％H2，或者至少50体积％H2，或者至少60体积％H2，或者至少70体积％H2，或者至少80体积％H2，或者至少85体积％H2。
所述气态底物通常含有至少约10体积％CO2，或者至少15体积％CO2，或者至少20体积％CO2，或者至少25体积％CO2，或者至少30体积％CO2，或者至少40体积％CO2。
用于从其他气态组分中分离CO2的方法是公知的。分离技术可分为三大类：燃烧后、燃烧前和富氧燃烧(oxyfuel)。燃烧后技术使用溶剂从燃烧后烟道气中吸收CO2。燃烧前技术从进料燃料中分离CO2，其使用公知的方法，例如烃气化和水变换反应，并且使用剩余的氢气作为燃料。富氧燃烧装置在燃烧室中用纯氧替代空气。当用纯氧燃烧时，烃释放出几近纯的CO2流和蒸汽，这有助于CO2的终末分离(end separation)。
技术人员应理解，可传递烃流通过一些过程以产生包含CO2和H2的底物。例如，根据本发明的一个方面，将烃流(CH4)通过蒸汽甲烷重整器以产生至少包含CO和H2的气流；然后使该气流进行水煤气变换反应以产生包含CO、CO2和H2的底物。将底物通过变压吸附器(PSA)以分离至少部分的气体。应理解可使用多于一个PSA阶段以能够分离所述气流的不同组分。
如技术人员(the skilled addressee)所理解的，底物的CO2组分和所述气流的H2组分可来自不同来源。CO2组分可来自通常富含二氧化碳的工业废气流，而源自替代来源的氢气可与CO2混合以产生具有所需组成的CO2和H2底物。可使用已知的分离技术分离出每种工业废气的所需组分，并且可将所需组分混合在一起以形成包含CO2和H2的底物。
通常会以气态将二氧化碳加入到发酵反应中。然而，本发明的方法并不限于以该状态加入二氧化碳。二氧化碳易于溶于水。在室温下，CO2的溶解度为90cm3CO2/100ml水。二氧化碳以多种形式存在于水性溶液中。当将CO2加入到水性溶液中时，其会溶解。
Co2(g)→Co2(aq)
然后在溶解的CO2和碳酸氢根之间建立平衡；
碳酸氢根然后离解：
存在于水性溶液中的各种形式的二氧化碳的量取决于一些因素，包括溶液的pH、以及压力和温度条件。溶液中存在的其他离子也可影响存在于溶液中不同形式的二氧化碳的量。
技术人员应理解可以水性形式向所述发酵提供二氧化碳。技术人员还应理解可以气态及水性形式向所述发酵反应提供CO2。
反应化学计量
已证明厌氧细菌可通过乙酰CoA生物化学通路从CO、CO2和H2产生乙醇和乙酸。
产乙酸细菌(包括伍氏醋酸杆菌)从包含H2和CO2的底物形成乙酸盐的化学计量如下(Balch et al.,1977)：
4H2+2CO2->CH3COOH+2H20.
为了实现细菌的生长和发生从CO2和H2到酸和/或醇的发酵，除了包含CO2和H2的底物气体外，还会需要将合适的液体营养培养基进料至生物反应器中。营养培养基含有足够使所用的微生物生长的维生素和矿物质。适于使用CO2作为唯一碳源进行的乙酸盐和/或乙醇发酵的厌氧培养基是本领域中已知的。例如，合适的培养基记载于美国专利5,807,722和6,340,581。本发明提供了新型的培养基，其增加了发酵过程中支持微生物生长和/或醇产生方面的效率。该培养基将在下文进行更详细的描述。
所述发酵应理想地在合适条件下进行以实现从CO2和H2到乙酸盐和/或乙醇的发酵。应当考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜反应器)、接种物水平、确保所述液相中的CO2不会成为限制的最大气体底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。在WO02/08438、WO07/117157和WO08/115080中描述了合适的条件。
所述最佳反应条件部分取决于使用的具体微生物。但是，一般而言，所述发酵优选地在高于环境压力的压力下进行。在增高的压力下运行可使CO2从气相向液相的传递速率显著提高，CO2在所述液相中可被微生物摄取作为产生乙醇的碳源。这进而意味着当生物反应器保持在提高的压力而非大气压力下时，保留时间(定义为所述生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)可减少。
还合乎需要的是，引入包含CO2和H2的气态底物的速率为例如确保在液相中CO2和H2的浓度不会成为限制的速率。这是因为，CO2和H2受限的条件可能是因为乙醇产物被所述培养物消耗掉。
使细菌生长最快以及乙酸盐生产速率最高的最佳温度是通过在一系列不同温度点下运行发酵罐来确定。发酵罐最初在30℃下运行，并且将温度升高至数个不同的温度。令人惊奇的是发现使细菌生长最快的最佳温度为至少32℃，或者至少33℃，或者至少34℃，或者至少35℃，或者至少36℃。
使用酸作为底物的酵母发酵
本发明特别适合用于支持从含有乙酸盐的底物产生脂质。一种这类型的底物为通过厌氧微生物发酵转化H2和CO2气体而获得的乙酸盐。
从碳源(例如葡萄糖、木糖、乳糖、甘油和乙醇)产生脂质的方法是已知的(Chi etal.,“Oleaginous yeast Cryptococcus curvatus culture with dark fermentationhydrogen production effluent as feedstock for microbial lipid production”International Journal of Hydrogen Energy,Vol 36,2011,pp 9542-9550.)。示例性的方法包括例如Chi et al所描述的方法。
已知许多产油酵母能够进行由糖到脂质的发酵，并且其适合用于本发明的方法。适合用于本发明的这些酵母的实例包括隐球菌属(Cryptococcus)的酵母，例如弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus，还称为Candida curvatus)的菌株(Chi et al.)。
已经证明弯曲隐球菌通过发酵包含乙酸盐的底物而产生脂质。Chi et al.证明了弯曲隐球菌在乙酸盐发酵中产生脂质的能力。
已经证明通过弯曲隐球菌发酵进行的脂质生产是通过限制氮得到改善。已经证明49:1的碳：氮比例对脂质生产有显著影响。已知弯曲隐球菌在许多碳源上生长，所述碳源包括葡萄糖、乙酸盐和乙醇。弯曲隐球菌生长的理想pH为pH 7。
弯曲隐球菌在乙酸盐和乙醇上生长的能力，使得本文中描述的CO2/H2发酵方法的产物流成为酵母发酵的理想发酵底物。来自CO2/H2发酵的产物流是特别理想的，因为其富含乙酸盐，并且其pH为约pH 7。
其他合适的酵母包括以下属的酵母：假丝酵母、油脂酵母属、红冬孢酵母、红酵母菌、酵母属和耶氏酵母。此外，应理解本领域的技术人员会知道其他产油酵母可以应用于本发明。还应理解本发明适用于两种或多种酵母的混合培养物。
应理解其他产油细菌或真菌也可以用于本发明，所述其他产油细菌或真菌选自布拉氏霉菌属(Blakesle)、隐球菌属、小克银汉霉属(Cunninghamella)、被包霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、须霉菌属(Phycomyces)、腐霉菌(Pythium)、破囊壶菌(Thraustochytrium)和毛孢子菌属(Trichosporon)。
用于本发明方法的酵母的培养可以使用任何数量的本领域中已知用于使用产油酵母培养和发酵底物的方法进行。
通常，发酵是在任意合适的生物反应器中进行，例如连续搅拌釜反应器(CTSR)、鼓泡塔反应器(BCR)或滴流床反应器(TBR)。同样地，在本发明的一些实施方案中，所述生物反应器可包含其中培养所述微生物的第一生长反应器和第二发酵反应器，将来自所述生长反应器的发酵液进料给第二发酵反应器，并在其中产生大部分发酵产物(脂质)。本发明的方法和系统通过参考附图描述于本文。
图1证明了从包含CO2和H2的气态流产生一种或多种脂质的两阶段系统。该系统提供了第一生物反应器101，所述第一生物反应器101具有培养基进口102、气体进口103、分离器装置104、渗透物流出口107和放出流出口108。第一生物反应器与第二生物反应器201连接，第二生物反应器201具有分离器205、渗透物流出口207和放出流出口208。
在使用中，第一生物反应器101含有发酵液，其在液体营养培养基中包含一种或多种产乙酸细菌的培养物。将培养基以连续或半连续的方式通过培养基进口102加入到生物反应器101中。气态底物经由气体进口103提供给生物反应器101。改造所述分离器装置以通过第一输出管道104接收来自生物反应器101的至少一部分培养液并且将其传递通过分离器105，配置分离器105以从剩余的反应液(渗透物)中基本上分离微生物细胞(保留物)。将至少一部分的保留物通过第一回流管道106返回至第一生物反应器，所述第一回流管道106保证发酵液培养物的密度维持在最佳水平。改造分离器105以将至少一部分渗透物经由渗透物输送管道107传递出生物反应器101。所述渗透物输送管道将无细胞的渗透物进料至第二生物反应器201。在本发明的一些实施方案中，在渗透物流被进料至第二生物反应器201之前，移出至少一部分的无细胞渗透物以用于产物提取或循环利用。提供发酵液放出出口108以将来自第一生物反应器101的发酵液直接进料至第二生物反应器。在一些实施方案中，先将发酵液放出液和渗透物放出液合并再将其进料至第二生物反应器。合乎需要的是先纯化所述流，再将所述流传递至第二生物反应器从而确保碳:氮的比例为至少10:1或至少25:1或至少49:1。
第二生物反应器202在液体营养培养基中含有一种或多种产油酵母的培养物。第二生物反应器以连续或半连续的方式通过发酵液放出液出口108和渗透物输送管道107接收来自第一生物反应器的发酵液和渗透物。改造分离器装置以通过第一输出管道204接收来自生物反应器201的至少一部分发酵液，并且将其传递通过分离器205，配置分离器205以从剩余的发酵液(渗透物)中基本上分离微生物细胞(保留物)。将至少一部分的保留物通过第一回流管道206返回至第一生物反应器，所述第一回流管道206确保了发酵液的培养物密度维持在最佳水平。改造分离器205以将至少一部分的渗透物经由渗透物移出管道207传递出生物反应器201。提供发酵液放出液出口208以从第二生物反应器201直接移出发酵液。使用已知的方法处理发酵液放出液流以除去生物质进行脂质提取。合并基本上无生物质的放出流和渗透物流以产生合并的流。在本发明的一些方面，可将合并的流返回至第一反应器从而补充连续加入的液体营养培养基。在一些实施方案中，需要进一步加工所述循环流以除去所述第二发酵的不想要的副产物。在一些实施方案中，可以调节所述循环流的pH，并且添加其他维生素和金属以补充所述流。
在一些实施方案中，作为酵母发酵过程的副产物产生的CO2可被循环至第一生物反应器以用作底物。在优选的实施方案中，处理从第二生物反应器中排出的气体流以移除任何微量的氧，再将该气体流传递至第一生物反应器中。
实施例
实施例1：材料和方法
培养基：
使用Balch et al限定的方法(参见，例如，Balch et al,(1977)InternationalJournal of Systemic Bacteriology.,27:355-361)制备pH6.5的培养基。
细菌：从德国生物材料保藏中心(DSMZ)获得伍氏醋酸杆菌。给予该细菌的登录号为DSM1030。
在生物反应器中的发酵
将1500ml的培养基装入三升反应器中。通过用氮气连续吹扫从培养基中除去氧。在接种前30分钟将气体由N2换为60％H2、20％CO2和20％N2的混合物。所述接种物(150ml)来自用相同气体混合物进料的连续的伍氏醋酸杆菌培养物。在接种时生物反应器维持在30℃并且在200rpm下搅拌。在接下来的分批生长期期间，搅拌逐渐增加到600rpm。根据生物质增加而导致的顶空H2/CO2的下降，以50ml/min逐渐增加气流。为了抵消产生的乙酸，使用5MNaOH自动控制pH到7。在整个发酵过程中，以0.2ml/小时的速率将0.5M的Na2S溶液泵入发酵罐中。1天后连续制备培养物。为了达到高的生物量连同高的气体消耗，在发酵罐中需要保持乙酸盐的浓度低于20g/L水平。这通过以下方式实现：以相对高的稀释率(D～1.7/天)运行发酵罐同时使用孔大小为0.1μm的聚砜膜过滤系统(GE医用中空纤维膜)将微生物保留在发酵罐中。用于连续培养的培养基为不包括复合微量金属溶液的溶液A，其使用自动注射泵以1.5ml/小时的速率单独进料。在发酵过程前至少1天将培养基脱气并且在发酵的整个过程中连续脱气。
取样和分析方法：
在30天内每隔一段时间采集培养基样品。
所有样品用于确立在600nm下的吸光度(分光光度计)以及底物和产物的水平(GC或HPLC)。常规使用HPLC对乙酸盐的水平进行定量。
通过Gas-GC(Varian 4900Micro-GC)每小时自动分析发酵罐的顶空。
结果
在三十天的时间里，乙酸盐以12.5g/L的浓度产生。乙酸盐的产生速率平均为21.85g/L/天。
在连续培养中乙酸的最大浓度为17.76g/L(296mM)。
实施例2方法和材料
细菌：将产油酵母弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)DSM 721在含有葡萄糖10g/L、酵母提取物1g/L和蛋白胨1g/L的培养基中复苏。
1.将所述培养物接种到来自伍氏醋酸杆菌方法的渗透物中。在锥形烧瓶(50ml培养基在250ml烧瓶中)中在25℃和pH 7下发酵所述培养物。弯曲隐球菌在来自伍氏醋酸杆菌方法的渗透物中生长并且将存在于渗透物中的所有乙酸转化成生物质。在培养过程中所述培养物的pH由7增加到9.3。
2.将弯曲隐球菌的培养物接种到2L CSTR中CO发酵的渗透物中。加入B族维生素和金属。设置搅拌为300rpm并且将pH调节到pH 6。在运行期间，将pH调节到pH 7，在该pH下所述培养物显示出最佳生长以及乙酸盐消耗。
3.脂质提取：在三种不同的培养基中培养弯曲隐球菌酵母，所述三种不同的培养基如下：(i)包含10g/L葡萄糖的培养基；(ii)包含15g/L乙酸钠的培养基和(iii)来自伍氏醋酸杆菌发酵方法的渗透液，其包含15g/L乙酸盐。在含有250ml培养基的烧瓶中一式两份实验各种培养基类型。所有烧瓶先在25℃下孵育然后将温度增加到30℃。
使用已知的提取方法从所述生物质中提取脂质。考虑到烧瓶的尺寸，可获得有限的生物质进行处理。结果如下：在培养基(i)的生物质中含有的脂质浓度为0.325％，在培养基(ii)的生物质中的脂质浓度为2.66％；在培养基(iii)中的脂质浓度为4.88％。
本说明书中对任何现有技术的引用不是，也不应被视为，承认或以任何形式暗示所述现有技术在任何国家形成所属领域中公知常识的一部分。
在整个说明书和以下的任何权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”(comprise,comprising)等应该以与排除意义相反的包括意义来解释，也就是说，“包括但不限于”的意思。

Claims (14)

1.一种从气态流产生脂质的方法，所述方法包括：
a.使包含CO2和H2的底物流至含有伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)或热醋穆尔氏菌(moorella thermoaceticum)的培养物的第一生物反应器中；
b.厌氧发酵所述包含CO2和H2的底物以产生乙酸盐(acetate)；
c.使(b)的所述乙酸盐的至少一部分流至含有一种或多种酵母的培养物的第二生物反应器；和
d.发酵所述乙酸盐以产生一种或多种脂质。
2.权利要求1的方法，其中所述废气选自来自制氢工厂的尾气、焦炉煤气、天然气、催化重整气、石油脑裂化器废气、炼油厂燃气、制甲醇工厂尾气、制氨工厂尾气和石灰窑气。
3.权利要求1的方法，其中所述含有CO2和H2的底物含有至少40％H2和至少10％CO2。
4.权利要求1的方法，其中所述含有CO2和H2的底物含有至少60％H2和至少20％CO2。
5.权利要求1的方法，还包括以下步骤：
a.分离从所述第二生物反应器中排出的发酵液流以提供生物质部分和基本上无生物质的废物流；
b.从所述生物质部分中提取一种或多种脂质产物；和
c.将所述基本上无生物质的废物流的至少一部分传递至所述第一反应器。
6.权利要求5的方法，其中在将所述基本上无生物质的废物流传递回所述第一生物反应器之前先将其传递至处理阶段。
7.权利要求5的方法，所述方法还包括从所述基本上无生物质的废物流除去可溶性蛋白质。
8.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述第二生物反应器的发酵液还包含氮，并且乙酸与氮的比例为至少10:1。
9.权利要求1的方法，其中所述一种或多种酵母为选自以下的产油酵母：假丝酵母属(Candida)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母菌属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和隐球菌属(Cryptococcus)。
10.权利要求9的方法，其中所述酵母为弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)。
11.权利要求1的方法，其中两次发酵的pH均维持在约pH 6-pH 8。
12.权利要求1的方法，其中所述方法为连续或半连续式的两阶段发酵反应。
13.权利要求1的方法，其中使用一系列第一反应器来给至少一个第二反应器进料。
14.权利要求1的方法，其中在所述第二生物反应器中产生的所述一种或多种脂质的至少一部分被回收并转化成一种或多种选自生物柴油和乙醇的第三产物。
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