CN109134591A - 一种苦瓜肽提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物多肽提取方法及其应用，具体涉及一种苦瓜多肽提取方法，该方法依次采用微孔滤膜、卷式超滤膜对苦瓜水提液进行纯化除杂，纯化后的截留液再经过浓缩、透析和干燥即得苦瓜多肽，本发明制备的苦瓜多肽含量达30％以上，除杂效果明显，能够显著提高其在降血糖方面的疗效。

Description

一种苦瓜肽提取方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种植物活性肽提取方法及其应用，具体涉及一种苦瓜肽提取方法及其应用。

背景技术

近年来，糖尿病已成为全球威胁人类健康的3大慢性非传染性疾病之一。国际糖尿病联盟第五版指出，中国20-79岁的人群中糖尿病患者超过9240万，约占全球糖尿病患者总数的1/4，糖尿病已成为当前威胁人类健康的一大杀手。我国先后开展了6次糖尿病流行病学调查：1980年开展的30万人口糖尿病调查发现其患病率仅为0.67％；1994年涉及19省市约21万人口的第2次糖尿病普查，发现患病率上升至2.28％；1996年对11省市人口的糖尿病抽样调查显示患病率为3.62％；2002年的调查发现我国城市糖尿病患病率约为4.5％；2010年全国31省市18岁以上9万余人口的糖尿病调查显示糖尿病患者率已高达9.65％。随着人们生活水平的提高、营养物质摄入增加、工作节奏加快，糖尿病患病率逐年攀升，发展趋势不容乐观。

目前，糖尿病的治疗，化药主要使用注射胰岛素、磺脲类药物与双胍类降糖药联用等，效果虽好，但副作用多，一般表现为：低血糖反应、局部皮下脂肪萎缩或增生、胰岛素过敏、胰岛素水肿、屈光不正、体重增加、损伤肝肾等。这些副作用给糖尿病患者带来极大的痛苦。

苦瓜又名凉瓜，属葫芦科植物，为一年生攀缘草木，果实为长椭圆形，成熟时为黄色，表面具有多数不整齐瘤状凸起，种子藏于肉质果实之中。主治中暑、暑热烦渴、暑疖、痱子过多、痢疾、疮肿、结膜炎、目赤肿痛、痈肿丹毒、烧烫伤、少尿等病症。另外，苦瓜的维生素C含量很高，具有预防坏血病、保护细胞膜、防止动脉粥样硬化、提高机体应激能力、保护心脏等作用苦瓜里面含有一种成分，可以有效抑制正常细胞的癌变和促进特变细胞的复原，具有一定的抗癌作用。此外，苦瓜中含有胰蛋白酶抑制剂，可抑制癌细胞所分泌出来的蛋白酶，防止恶性肿瘤，而且还具备有降血脂和血压的作用。1981年Khana报道了由苦瓜果实、种子和组织中提取出分子量为11kDa的成分，该成分经皮下注射对人体Ⅰ、Ⅱ型糖尿病具有良好的降血糖活性，但口服会在肠道中遭到破坏而失活。

专利申请CN101985644A公开了一种苦瓜多肽制备方法，将冻干苦瓜粉直接酶解约8小时得到含苦瓜多肽的混合液，进一步冷藏沉降48-72小时，并在100℃酶灭活处理30分钟。专利申请CN104605136A同样公开了一种苦瓜多肽的制备方法，将苦瓜籽粉经去油后，利用碱水提取过滤、然后加酸沉降的方法分离苦瓜多肽，浸提和沉降时间各为24小时。上述方法中采用各类酶解反应、碱提酸沉或结合其他沉降等生产方法得到苦瓜肽，制备时间周期长且某些步骤如灭酶操作温度高，导致产品失活，效率极低，生产成本高，为广大患者带来极大的经济负担。天然活性的苦瓜多肽是有效调控血糖代谢的关键成分，因此，急需一种能够提取分离纯化较高含量的活性苦瓜多肽蛋白提取物的有效生产方法。

传统中药对糖尿病的治疗积累了丰富经验。《黄帝内经》把糖尿病“多饮多食多尿及体重减轻”的典型三多一少归于“消渴病”范畴。中医基础理论认为，饮食不节致脾胃受损，水谷精微运化受阻，水湿停聚，酿生痰浊，滋生痰湿与内热，痰热内阻发为消渴。多种药材，多种成分配组中药在君臣佐使及辨证论治的理论指导下用于消渴病的治疗，许多经典中药方剂历经千年实践检验得以传承。

然而目前市面上有多种中成药治疗糖尿病，但是其起效慢、治疗效果差强人意，而动物胰腺是一个调控机体糖代谢功能和产生大量活性生物分子的宝库，具有催化蛋白质、脂肪、淀粉水解作用，有助消化，胰脂酶即使在小剂量也有控制脂痢作用，猪胰能够增强脂蛋白脂酶活性，对降低血糖，修复受损胰腺，促使分泌胰岛素起着至关重要作用。专利申请CN104056164A公开了一种治疗糖尿病的中药组合物，其由鲜猪胰、白僵蚕、水蛭、鸡内金、西洋参、三七、苦瓜、北五味子、山海螺、砂仁、核桃仁、枸杞、苍术、黑大豆、山楂、黄芪、野木耳、葛根、山药组成，该组合物富含丰富的氨基酸、微量元素、纤维素、黄酮类化合物等众多营养成分，能够胰岛素的释放，同时促进胃排空，抑制糖和脂肪的吸收，实现糖尿病的治疗。专利申请CN1833706A公开了一种治疗糖尿病的药物，其包括太子参、五味子、生黄芪、制黄精、枸杞子、茯苓、山药、生地、玉竹、麦冬，还可添加动物胰脏提取物，该组合物对西药久治无效的糖尿病及其并发周围神经病变的老年患者治疗13例，经4-5个月治疗，症状、体征及周围运动神经传导速度均有改善。但是上述专利中仅将猪胰腺与中药进行组合配伍，猪胰腺中的主要活性因子受到抑制，难以充分发挥作用，最终治疗效果仍有限。

为减少该病给社会造成的巨大损失、解决广大患者的困扰，提高患者生活质量，研发一种降糖疗效好副作用小的降糖药物刻不容缓。

发明内容

基于上述现有技术的缺陷，本发明提供一种苦瓜肽的提取方法，该方法避免酶解反应、碱提酸沉或结合其他沉降等生产方法，仅通过多级过滤的方式去除苦瓜中杂质，制备得到的苦瓜肽含量高达30％以上。

本发明提供一种苦瓜多肽的提取方法，包括以下步骤：

(1)苦瓜清洗、打浆破碎，加水提取、离心，得离心液；

(2)将离心液依次经过微滤膜系统、卷式超滤膜纯化系统，得到超滤膜截留液

(3)将超滤膜截留液进行浓缩，得到浓缩液；

(4)将浓缩液进行干燥，得苦瓜多肽。

进一步地，所述步骤(2)中微孔滤膜系统的截留分子量为5μm-50μm；所述卷式超滤膜纯化系统采用两级截留，分别为截留分子量为150kDa和800Da的卷式超滤膜纯化系统。

进一步地，所述步骤(3)中采用卷式高压反渗透膜系统进行浓缩，其截留分子量≥100Da。

本发明还提供上述制备方法制备得到的苦瓜多肽。

进一步地，所述制备得到的苦瓜多肽中含量在30％以上。

本发明还提供上述苦瓜多肽在制备治疗降血糖药物方面的应用。

基于上述现有技术的缺陷，本发明通过植物源成分和动物源成分之间的协同作用，服用后可迅速降糖，尤其是苦瓜肽的添加，一方面激活了猪胰腺中胰岛素因子的活性，起到保护患者胰脏的作用，另一方面苦瓜肽与其余植物提取物共同降低患者血糖水平，对胰岛素依赖型糖尿病和非胰岛素依赖型糖尿病均有较好的疗效，完全可替代胰岛素使用，避免了直接使用胰岛素带来的毒副作用。

本发明提供一种降血糖药物组合物，其由黄芪、山药、党参、枸杞子、茯苓、玉米须、桃仁、猪胰腺和苦瓜肽组成。

进一步地，所述组合物由下述重量份数组分组成：黄芪8-12份、山药9-15份、党参5-11份、枸杞子6-12份、茯苓3-8份、玉米须10-15份、桃仁5-10份、猪胰腺10-15份、苦瓜肽5-10份。

更进一步地，所述组合物由下述重量份数组分组成：黄芪9-11份、山药10-13份、党参7-10份、枸杞子8-10份、茯苓5-6份、玉米须12-14份、桃仁6-8份、猪胰腺12-14份、苦瓜肽6-8份。

更进一步地，所述组合物由下述重量份数组分组成：黄芪10份、山药12份、党参8份、枸杞子9份、茯苓5份、玉米须13份、桃仁7份、猪胰腺13份、苦瓜肽7份。

本发明还提供一种降低血糖的药物，其由上述组合物以及药学上可接受辅料组成。

进一步地，所述降血糖药物的剂型为颗粒、片剂、胶囊中的一种。

本发明进一步提供上述组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁加水提取，浓缩，得混合物1备用；

(2)将山药、茯苓进行粉碎，得混合物2备用；

(3)将猪胰腺进行冻干粉碎，得猪胰腺粉末备用；

(4)将苦瓜肽粉及混合物1、混合物2、猪胰腺粉末混匀，即得。

进一步地，所述步骤(1)中先加入酶制剂酶解，再加入水50-60℃提取2-3h。

更进一步地，所述酶制剂为纤维素酶和蛋白水解酶的混合物。

更进一步地，所述纤维素酶和蛋白水解酶的质量比为1-3:1。

更进一步地，所述纤维素酶和蛋白水解酶的质量比为2:1。

进一步地，所述步骤(2)中山药、茯苓粉碎后，过60-100目筛。

进一步地，所述步骤(3)中猪胰腺去除脂肪组织、用生理盐水清洗，捣碎，加入醋酸浸泡15-20h，冷冻干燥、粉碎备用。

进一步地，所述步骤(4)中苦瓜肽粉、混合物1、混合物2通过β-环糊精制备为包合物，再与猪胰腺粉末混合。

本发明进一步提供上述组合物在制备治疗降血糖药物中的应用。

进一步地，所述组合物制备治疗胰岛素依赖型糖尿病和非胰岛素依赖型糖尿病药物中的应用。

本发明的有益效果为：

(1)本发明将植物源成分和动物源成分配合使用，发挥二者之间的协同作用，有效提高其在降血糖方面的效果。尤其是苦瓜多肽的添加，一方面能够进入猪胰腺细胞内部，促进活性因子，如胰蛋白酶等的释放；另一方面，苦瓜多肽也能进入患者胰岛细胞，帮助修复胰岛细胞功能，实现降血糖作用；最后，苦瓜多肽本身具有与胰岛素相似的结构，具有调节血糖的作用。

(2)本发明的组合物中的植物提取物黄芪、山药、党参、枸杞子、茯苓、玉米须、桃仁是常用的降血糖中药成分，但是本发明通过合理的组合，并将其创造性地与猪胰腺和苦瓜多肽组合应用，进一步促进植物提取物发挥作用。

(3)本发明组合物在制备过程中采用黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁酶解水提，而山药、茯苓直接粉碎的方式，是经过不断的研究和探索发现的，黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁加入酶制剂水解后再进行提取，能够破坏其中的纤维结构和蛋白质，实现有效成分的高效富集；而山药、茯苓中活性成分种类较多，且口服吸收效率高，经过水提或醇提反而会降低活性成分的含量。

(4)本发明可以将苦瓜多肽和中药提取物和中药粉末经过β-环糊精包合形成包合物，避免苦瓜多肽和植物成分在储存过程中与猪胰腺直接接触而逐渐导致活性因子失活，经过包合后，各成分进入体内逐渐释放，苦瓜多肽进入猪胰腺细胞内部，进一步促进活性因子的释放，保证活性因子的活性。

具体实施方式

实施例1

降糖药物组合物组成：黄芪10份、山药12份、党参8份、枸杞子9份、茯苓5份、玉米须13份、桃仁7份、猪胰腺13份、苦瓜肽7份。

所述降糖药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁加入酶制剂酶解，再加水于50℃提取3h，减压浓缩，得混合物1，备用；

(2)将山药、茯苓进行粉碎，过80目筛，得混合物2，备用；

(3)将新鲜的猪胰腺减去多余脂肪组织，用生理盐水清洗后，捣碎，加入醋酸浸泡15h然后进行冻干粉碎，得猪胰腺粉末，备用；

(4)将苦瓜肽粉及混合物1、混合物2与β-环糊精混合研磨，制备成包合物，然后再与猪胰腺粉末混匀，即得。

其中所述酶制剂为纤维素酶和蛋白水解酶的质量比为2:1。

实施例2

降糖药物组合物组成：黄芪12份、山药15份、党参11份、枸杞子12份、茯苓6份、玉米须14份、桃仁8份、猪胰腺14份、苦瓜肽8份。

所述降糖药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁加入酶制剂酶解，再加水于55℃提取3h，减压浓缩，得混合物1，备用；

(2)将山药、茯苓进行粉碎，过100目筛，得混合物2，备用；

(3)将新鲜的猪胰腺减去多余脂肪组织，用生理盐水清洗后，捣碎，加入醋酸浸泡17h然后进行冻干粉碎，得猪胰腺粉末，备用；

(4)将苦瓜肽粉及混合物1、混合物2与β-环糊精混合研磨，制备成包合物，然后再与猪胰腺粉末混匀，即得。

其中所述酶制剂为纤维素酶和蛋白水解酶的质量比为2:1。

实施例3

降糖药物组合物组成：黄芪9份、山药10份、党参7份、枸杞子8份、茯苓3份、玉米须10份、桃仁5份、猪胰腺10份、苦瓜肽5份。

所述降糖药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁加入酶制剂酶解，再加水于50℃提取2h，减压浓缩，得混合物1，备用；

(2)将山药、茯苓进行粉碎，过80目筛，得混合物2，备用；

(3)将新鲜的猪胰腺减去多余脂肪组织，用生理盐水清洗后，捣碎，加入醋酸浸泡18h然后进行冻干粉碎，得猪胰腺粉末，备用；

(4)将苦瓜肽粉及混合物1、混合物2与β-环糊精混合研磨，制备成包合物，然后再与猪胰腺粉末混匀，即得。

其中所述酶制剂为纤维素酶和蛋白水解酶的质量比为1:1。

实施例4

降糖药物组合物组成：黄芪11份、山药13份、党参10份、枸杞子10份、茯苓8份、玉米须15份、桃仁10份、猪胰腺15份、苦瓜肽10份。

所述降糖药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁加水于50℃提取3h，减压浓缩，得混合物1，备用；

(2)将山药、茯苓进行粉碎，过80目筛，得混合物2，备用；

(3)将新鲜的猪胰腺减去多余脂肪组织，用生理盐水清洗后，捣碎，进行冻干粉碎，得猪胰腺粉末，备用；

(4)将苦瓜肽粉及混合物1、混合物2与猪胰腺粉末混匀，即得。

其中所述酶制剂为纤维素酶和蛋白水解酶的质量比为3:1。

实施例5

降糖药物组合物组成：黄芪8份、山药9份、党参5份、枸杞子6份、茯苓3份、玉米须12份、桃仁6份、猪胰腺11份、苦瓜肽6份。

所述降糖药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁加入酶制剂酶解，再加水于60℃提取2h，减压浓缩，得混合物1，备用；

(2)将山药、茯苓进行粉碎，过60目筛，得混合物2，备用；

(3)将新鲜的猪胰腺减去多余脂肪组织，用生理盐水清洗后，捣碎，加入醋酸浸泡20h然后进行冻干粉碎，得猪胰腺粉末，备用；

(4)将苦瓜肽粉及混合物1、混合物2与β-环糊精混合研磨，制备成包合物，然后再与猪胰腺粉末混匀，即得。

其中所述酶制剂为纤维素酶和蛋白水解酶的质量比为2:1。

对比例1不含有苦瓜多肽的降糖药物组合物及其制备方法

除不含有苦瓜多肽外，其余同实施例1，具体制备方法为：

(1)将黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁加入酶制剂酶解，再加水于50℃提取3h，减压浓缩，得混合物1，备用；

(2)将山药、茯苓进行粉碎，过80目筛，得混合物2，备用；

(3)将新鲜的猪胰腺减去多余脂肪组织，用生理盐水清洗后，捣碎，加入醋酸浸泡15h然后进行冻干粉碎，得猪胰腺粉末，备用；

(4)将混合物1、混合物2与β-环糊精混合研磨，制备成包合物，然后再与猪胰腺粉末混匀，即得。

对比例2不含有猪胰腺的降糖药物组合物及其制备方法

除不含有猪胰腺外，其余同实施例1，具体制备方法为：

(1)将黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁加入酶制剂酶解，再加水于50℃提取3h，减压浓缩，得混合物1，备用；

(2)将山药、茯苓进行粉碎，过80目筛，得混合物2，备用；

(3)将苦瓜肽粉及混合物1、混合物2与β-环糊精混合研磨混匀，即得。

对比例3

除用泽泻代替玉米须外，其余同实施例1.

对比例4

除用防风代替黄芪外，其余同实施例1.

实验例1不同药物组合物降血糖活性

1.1试验样品

实施例1-5，对比例1-4制备的降血糖药物组合物

1.2实验动物

健康SD小鼠(清洁级)，雌雄各半，体重(20g-30g)。

1.3糖尿病小鼠模型的建立及分组

取小鼠120只，雌雄各半，随机选取10只作为空白对照组，剩余小鼠喂食高糖高脂的饲料一周，再尾部静脉注射新鲜配置的四氧嘧啶溶液65mg/kg，第三天后用血糖试剂盒对禁食12h的小鼠测其空腹血糖，选取血糖高于11mmol/l的小鼠作为实验对象，随机选取合格小鼠分成10组，设糖尿病模型组，实施例1-5组，对比例1-4组。

1.4降血糖实验方法

空白对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水，实施例1-5、对比例1-4分别以40mg/kg的剂量灌胃，连续6周，分别于第2周、第4周、第6周测空腹血糖值。

1.5统计方法

各项指标以x±s表示，均数间的显著性差异用t检验法

1.6口服液降血糖作用分析

表1不同组合物对小鼠血糖的影响

注：各列不同字母之间代表具有显著性差异(P<0.05)

由上表可知，空白组小鼠灌胃后血糖无显著变化，模型组与空白对照组血糖有显著差异(P<0.05)，说明模型建立成功，实施例1-5与对比例1-4各组均与模型组血糖有显著差异(P<0.05)，其中实施例1的降血糖效果最好，实施例4由于制备过程中没有使用酶制剂，也没有添加β-环糊精制备包合物，导致植物成分提取不完全，猪胰脏中有效成分遭到破坏，其降低血糖的效果相对较差。对比例1和对比例2分别缺少苦瓜肽和猪胰脏，其降血糖的效果明显下降，而对比例3和4分别替换了一种功能相近的中药，其疗效也显著降低。由此可见，本发明提供的降糖药物组合物具有显著的降糖作用，各组分之间协同发挥作用，实现良好的降血糖疗效。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种苦瓜多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)苦瓜清洗、打浆破碎，加水提取、离心，得离心液；

(2)将离心液依次经过微滤膜系统、卷式超滤膜纯化系统，得到超滤膜截留液

(3)将超滤膜截留液进行浓缩，得到浓缩液；

(4)将浓缩液置于透析袋中透析后进行干燥，得苦瓜多肽。

2.一种权利要求1所述的苦瓜多肽的提取方法制备得到的苦瓜多肽。

3.权利要求2所述的苦瓜多肽在制备降血糖药物方面的应用。

4.一种降血糖药物组合物，其特征在于，所述组合物由黄芪、山药、党参、枸杞子、茯苓、玉米须、桃仁、猪胰腺和苦瓜肽组成。

5.根据权利要求4所述的降血糖药物组合物，其特征在于，所述组合物由下述重量份数组分组成：黄芪8-12份、山药9-15份、党参5-11份、枸杞子6-12份、茯苓3-8份、玉米须10-15份、桃仁5-10份、猪胰腺10-15份、苦瓜肽5-10份；优选地，所述组合物由下述重量份数组分组成：黄芪9-11份、山药10-13份、党参7-10份、枸杞子8-10份、茯苓5-6份、玉米须12-14份、桃仁6-8份、猪胰腺12-14份、苦瓜肽6-8份；更优选地，，所述组合物由下述重量份数组分组成：黄芪10份、山药12份、党参8份、枸杞子9份、茯苓5份、玉米须13份、桃仁7份、猪胰腺13份、苦瓜肽7份。

6.一种降低血糖的药物，其特征在于，所述药物由权利要求4或5所述的组合物以及药学上可接受辅料组成。

7.一种权利要求4或5所述的组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将黄芪、党参、枸杞子、玉米须、桃仁加水提取，浓缩，得混合物1备用；

(2)将山药、茯苓进行粉碎，得混合物2备用；

(3)将猪胰腺进行冻干粉碎，得猪胰腺粉末备用；

(4)将苦瓜肽粉及混合物1、混合物2、猪胰腺粉末混匀，即得。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中先加入酶制剂酶解，再加入水50-60℃提取2-3h。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述酶制剂为纤维素酶和蛋白水解酶的混合物；优选地，所述纤维素酶和蛋白水解酶的质量比为1-3:1；更优选地，所述纤维素酶和蛋白水解酶的质量比为2:1。

10.权利要求4或5所述组合物在制备治疗降血糖药物中的应用。