CN108893438B - 一种提高钝齿棒杆菌合成l-鸟氨酸产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高钝齿棒杆菌合成L‑鸟氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明利用表达质粒pDXW10质粒，将来源于S.marcescens Y213的编码N‑乙酰鸟氨酸脱乙酰酶的基因argE进行克隆表达并测定酶学性质。所得N‑乙酰鸟氨酸脱乙酰酶的比酶活最高为798.89U/mg，最适pH为7.0，pH稳定性为7.0‑9.0，最适温度为37℃，温度稳定性为20‑30℃，添加0.1mM Mn²⁺，Li⁺，Mg²⁺金属离子使比酶活提高50％以上。为国内外首次报道来源于粘质沙雷氏菌的N‑乙酰鸟氨酸脱乙酰酶酶活最高。5‑L发酵罐发酵重组菌株SYPO/pDXW10‑SmargE 96h，L‑鸟氨酸的产量达到38.5g/L，比出发菌株，L‑鸟氨酸的产量提高了33.2％，产率达0.401g/L/h。实现了异源表达N‑乙酰鸟氨酸脱乙酰酶实现L‑鸟氨酸的高效合成。

Description

一种提高钝齿棒杆菌合成L-鸟氨酸产量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高钝齿棒杆菌合成L-鸟氨酸产量的方法，尤其是一种通过引入异源N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶提高钝齿棒杆菌合成L-鸟氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-鸟氨酸(L-ornithine)是一种重要的碱性氨基酸，虽然其不属于组成蛋白质的二十种氨基酸，但其在生物体中有着重要作用，广泛用于食品，医药的添加剂中。目前国内外对其合成和生产都有着比较深入的研究。近年来微生物发酵法生产L-鸟氨酸受到越来越多的关注，各国科学家相继开展这方面的工作。

N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶作为L-鸟氨酸线性化合成途径中的第五步反应所需的催化酶，其催化N-乙酰鸟氨酸生成L-鸟氨酸。该酶具有强大的脱乙酰基功能，被广泛用于乙酰基转移的转化实验中，但是目前没有关于通过过表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶来提高鸟氨酸的报道，这是由于该酶的专一性不强。

发明内容

本发明首先提供了一种重组钝齿棒杆菌，是以钝齿棒杆菌为宿主，以质粒pDXW10为表达载体，表达来源Serratia marcecens JNB5-1的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶。

编码所述来源Serratia marcecens JNB5-1的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供构建所述重组钝齿棒杆菌的方法，是将编码所述来源Serratiamarcecens JNB5-1的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因用EcoR I、Sac I双酶切后，回收基因片段后，与线性化pDXW10(+)连接后转化入钝齿棒杆菌，得到重组菌。

本发明还提供应用所述重组钝齿棒杆菌生产L-鸟氨酸的方法，是将种子液按6％接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为28～31℃，搅拌转速为500～600r/min。发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，pH通过补加50％氨水维持稳定。

所述发酵培养基成分：葡萄糖200g/L，硫酸铵40g/L，酵母提取物12g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，一水合硫酸锰0.02g/L，0.05mM L-精氨酸，去离子水配置，pH 7.0。将上述发酵培养基用50％的氨水调节其pH至7.0，在121℃下高温灭菌30min。

所述种子液的制备方法是从活化平板上挑取单菌落接种于含卡那霉素的BHI培养基中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于种子培养基中，30℃培养24h，种子培养基组成：葡萄糖50g/L，硫酸铵20g/L，酵母提取物12g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，去离子水配置，pH 7.0。

本发明钝齿棒杆菌宿主还可以进一步敲除L-脯氨酸的代谢支路、L-鸟氨酸的下游支路，整合GlnK以解除L-精氨酸的抑制。

本发明的优点和积极效果是：

(1)本发明首次通过pDXW10质粒对不同来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶进行筛选，并且对其酶学性质进行了比较系统的研究，发现最佳来源为S.marcescens JNB5-1的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶，将其利用于L-鸟氨酸的合成。来源Serratia marcecens JNB5-1的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶比酶活最高为798.98U/mg，最适pH为7，最适温度为37℃，0.1mM的Mg²⁺、Li⁺、Mn²⁺金属离子促进酶的比酶活提高了50％；在钝齿棒杆菌中表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶酶活达到128.4U/mL，显著提高了钝齿棒杆菌中胞内乙酰基循环水平。

(2)本发明采用5-L发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终C.crenatum SYPO/pDXW-10-SmargE发酵至96h，L-鸟氨酸产量达到38.5g/L，相比出发菌株，L-鸟氨酸的产量提高了33.2％，产率达0.401g/L/h。可见，通过外源引进过量表达的NAOD，对L-鸟氨酸产量具有促进效果。

具体实施方式

实施例1：不同来源N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的克隆与表达

以E.coli BL21(DE3)、Serratia marcescens JNB5-1、Klebsiella pneumoniaesubsp.Pneumoniae MGH、Bacillus subtilis 168G的基因组DNA为模板，引物P1F/R,P2F/R,P3F/R,P4F/R进行PCR扩增，得到大小1152bp、1152bp、1152bp、1305bp编码383、383、383、434个氨基酸的基因片段，连接至pMD18-T载体测序，比对结果表明不同基因的同源性为66.19％。将T-argE用EcoR I,Sac I双酶切，回收argE片段后，与线性化pDXW10连接后转化E.coli JM109中，阳性转化子提取质粒经EcoR I,Sac I酶切验证，释放8531bp和约1152bp、1152bp、1152bp、1305bp大小的片段，分别对应pDXW10(+)和KpargE、EcargE、SmargE和BsargE的大小，结果表明4种质粒pDXW10-argE构建成功。将所得4种重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)，得到4种重组菌。

将4种重组菌pDXW10(+)-argE/BL21(DE3)，分别经诱导表达培养，将所得菌液经过超声破碎取上清SDS-PAGE分析，检测到分子量约为39KDa,39KDa,47KDa,39KDa的特异性条带。

实施例2：重组菌株酶活力测定

(1)NAOD酶活的测定方法：0.1mL反应体系，2mM N-乙酰鸟氨酸(50mM Chelex 100,K₂HPO₄,pH 7.5)25℃反应10min，酶标仪339nm。

(2)酶活及酶学性质：

将实施例1构建的重组菌BL21/pDXW-10-argE分别接种于10mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养12h，按4％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养3h，IPTG诱导12h，10000r/min离心10min收集细胞，pH 7.0的磷酸钠缓冲液清洗3次，悬浮在pH 7.0的磷酸钠缓冲液中，经超声波破碎后，离心、收集上清液作为粗酶液。将5μL粗酶液加入到酶活力测定缓冲体系中反应10mins测定390nm波长下吸光值的变化。经计算比较比酶活，四种不同的上清液测得酶活为156.8U/g、198.3U/g、30.2U/g、432.98U/g，说明不同argE基因在大肠杆菌中表达，N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶具有生物学活性。采用Ni-NTA亲和层析，纯化后NAOD酶液比酶活为416.26U/mg、460.06U/mg、62.03U/mg、798.98U/mg。进一步对来源S.marcescensY213的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的酶学性质进行试验，结果表明来源S.marcescens Y213的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的比酶活最高为798.98U/mg，最适pH为7，最适温度为37℃，0.1mM的Mg²⁺、Li⁺、Mn²⁺金属离子促进酶的比酶活提高了50％。

实施例3：重组菌株C.crenatum SYPO/pDXW-10-SmargE构建及发酵罐实验

(1)重组菌株C.crenatum SYPO/pDXW-10-SmargE的构建

将上述的重组质粒pDXW10-SmargE，利用电转化的方法，将重组质粒转化到钝齿棒杆菌株中，通过提质粒验证，酶切验证无误，重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPO/pDXW-10-SmargE构建成功。

(2)种子培养

从活化平板上挑取单菌落接种于10mL含卡那霉素的BHI培养基中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于150mL种子培养基中，30℃培养24h，种子培养基组成：葡萄糖50g/L，硫酸铵20g/L，酵母提取物12g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，去离子水配置，pH7.0。

(3)发酵培养

初始发酵培养体积为2.5L，采用的发酵培养基成分如下：

发酵培养基成分：葡萄糖200g/L，硫酸铵40g/L，酵母提取物12g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，一水合硫酸锰0.02g/L，0.05mM L-精氨酸，去离子水配置，pH 7.0。将上述发酵培养基用50％的氨水调节其pH至7.0，在121℃下高温灭菌30min。

发酵条件：将上述培养好的种子液按6％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为30℃，pH为7.0，搅拌转速为600r/min。培养96h。

发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，pH通过补加50％氨水维持稳定。从第24h起，每12h取样一次，采用分光光度仪在A₅₆₂下测定细胞OD值，葡萄糖用生物传感分析仪测定(SBA-50，山东省科学院生物研究所)。

L-鸟氨酸和其他各种氨基酸采用HPLC测定(安捷伦1100，美国)。结果表明，相比于出发菌，重组菌生长的更好，糖耗更快，发酵至96h，重组菌的L-鸟氨酸产量达到38.5g/L，较出发菌株C.crenatum SYPO提高了33.2％，实现了引入外源过表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶使L-鸟氨酸的合成有显著效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高钝齿棒杆菌合成L-鸟氨酸产量的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1152

<212> DNA

<213> Serratia marcecens JNB5-1

<400> 1

gtgaagatga aattacctcc atttattgag ctgtaccggg cgttgatcgc aacgaagtcg 60

atcagcgcca ccgatgccgg cctcgatcag agcaatgagg cgttaatcaa cttgctggcc 120

ggctggtttg ccgacctggg ctttcgcgtc gacgtgcagc cggtgccgga atcgcgccac 180

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accgatacgg tgccttacga cgaaggccgc tggacgcgcg atcccttcac cctgaccgag 300

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ctggatgcgg tgcgcgacat cgacgcgagc aaattgacca agccgctgta cattctggct 420

accgcagatg aagaaacgac gatggccggc gcgcgttatt tcgccgcttc caccgccatt 480

cgtccggatt tcgccatcat cggcgaaccg acctcgctgc agccggtgcg tgcgcacaag 540

ggccacatgg ccaacgccat tcgcatcgtc ggccagtccg gccactccag cgatccggcg 600

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ttcggccata tcagcggcgg cgacgcggcc aaccgcatct gcgcctgctg cgagctgcac 780

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tgccggcagt aa 1152

<210> 2

<211> 1152

<212> DNA

<213> Escherichia coli BL21(DE3)

<400> 2

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tgctggcatt aa 1152

<210> 3

<211> 1152

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae MGH

<400> 3

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tttaagcaga tcgcgcaact gcataatccg gccgatggcg tcgtgcatca gctcgatcgc 540

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ggacatatgt cctttatggg cgcggattgg ctgcagggag gtgggctcgc cgatgatggc 660

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cagggcgtcg agaataaagg cgaaaaagcc tttcatatcg gccgtgccga ggccgtagag 840

tttgttatcg tgttcggtga gggtgaacgg gtcgcgcgtc cagcggccat catcgaacgg 900

cacggtatcg gtatgcccgg cgagcagcag gccgccggcg ccgtgtccgg tgctggccag 960

cagattgaat ttatggcgcg tatccggcac cggctgtacc tcgacgttga agccgagatc 1020

gcggaaccag ccggccagca aattgattaa agactcattg ctctgatcga gagcctcttc 1080

ggtcgcgctg atggacggtg tggcgatcaa cgcgcggtag atctcgataa agggcggtaa 1140

attgtttttc at 1152

<210> 4

<211> 1305

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis 168G

<400> 4

ctactcttta ttgacttgag catccgcatc ctccccatct gtatgaaggc cgcaccaatc 60

catgacaaaa agtgcaataa ttttagcaga ttctatcatg gcttcaacct caatgtattc 120

attggcctga tgagccgttt ttgtttcccc cggcccgaaa acgatcactg gtgtatctcc 180

tgcatggtac aaaagccctc catccgttcc ccacggggaa gcctcaataa tcggctctgt 240

ctgtttcatt ttttgatagg ctgattgcag cacagaaatt aaagggtgat catcaggtaa 300

atcattcggc agccattgag cgccaaacca ttcgacttgt acgggatggc gtttaaacca 360

ttcgtcatgg tattctaaat ccttcagcca gttttccaat tcaagtttta cagcttctgg 420

tttctcatgg ggagcaattc cgcatctccc ttctatgacg acacggtctg caactgaaga 480

tggccaggca ccgcctgaga tggtgccgat attcaccggt accggtattg ggatattgtc 540

atacagcgga tctgaaattc tcgcattgcg gactttctcc agctcttgta tcgctgtgat 600

aacgtgcatg cttttttcaa tcgcgcttac cccttcatag cgtgtgcccc catgtgcgga 660

taatcccttc acagtgatcc gaaaccacat cgaaccctgc tgcttaataa atagtttcat 720

attcgtcggt tcaggaatca gcgccccgtc agcacgatag cctctcatga tggcggaaag 780

tgtaccggcg ccgccgcact cttcatctac aacactctga aacaatacat ctcccttcag 840

tttgacatcg caggcgtgca gggcttctaa agcaaaaaga agggctgtat tgcctccctt 900

catatccgtt gagccgcggc cgtatatttt accgttttct tcgacagctt gatacggttc 960

atacttccaa tcctttacgc ttccttcagg cacaacatcg atatggccgt tcaaaatcag 1020

ggacctgcct ccgccggctc ccgttttttt agccacgata ttcgggctct catgaaaatc 1080

ggatcggtta gatttaaagt agggatgctg ttttaattgc tttatgcttg gctcccatac 1140

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tgaccccaat gtgctttttt ccccaatcag ccttttgaga agacgaatgg ctttggccga 1260

atgctgatca agccactcga ttacttttct ttcaatgtct tgcat 1305

Claims (7)

1.一种重组钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)，其特征在于，是以钝齿棒杆菌为宿主，以质粒pDXW10为表达载体，表达来源Serratia marcecens JNB5-1的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶；编码所述来源Serratia marcecens JNB5-1的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.构建权利要求1所述重组钝齿棒杆菌的方法，其特征在于，是将编码所述来源Serratia marcecens JNB5-1的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因用EcoR I、Sac I双酶切后，回收基因片段后，与线性化pDXW10连接后转化入钝齿棒杆菌，得到重组菌。

3.应用权利要求1所述重组钝齿棒杆菌生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，是将重组钝齿棒杆菌的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为28~31℃，搅拌转速为500~600 r/min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，是将种子液按6 %接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为28~31℃，搅拌转速为500~600 r/min，发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，pH通过补加50%氨水维持稳定。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖 200g/L，硫酸铵 40 g/L，酵母提取物 12 g/L，七水合硫酸镁 0.5 g/L，氯化钾 1 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，七水合硫酸亚铁 0.02 g/L，一水合硫酸锰0.02 g/L，0.05mM L-精氨酸，pH7.0。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述种子液的制备方法是从活化平板上挑取单菌落接种于含卡那霉素的BHI培养基中，30℃振荡培养24 h，然后全部转接于种子培养基中，30℃培养24 h，种子培养基组成：葡萄糖 50 g/L，硫酸铵 20 g/L，酵母提取物 12 g/L，七水合硫酸镁 0.5 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，去离子水配制，pH 7.0。

7.权利要求1所述重组钝齿棒杆菌在生产L-鸟氨酸中的应用。