[go: up one dir, main page]

CN108779143A - 蛋白质纯化 - Google Patents

蛋白质纯化 Download PDF

Info

Publication number
CN108779143A
CN108779143A CN201780018403.0A CN201780018403A CN108779143A CN 108779143 A CN108779143 A CN 108779143A CN 201780018403 A CN201780018403 A CN 201780018403A CN 108779143 A CN108779143 A CN 108779143A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chromatography
protein
matrix
effluent
chromatographic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780018403.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108779143B (zh
Inventor
M·H·罗斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UCB SA
Original Assignee
UCB SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=55752913&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN108779143(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by UCB SA filed Critical UCB SA
Publication of CN108779143A publication Critical patent/CN108779143A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108779143B publication Critical patent/CN108779143B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种纯化蛋白质的方法，包括半连续色谱步骤，由此收集流出物并将其重新装载到色谱基质上。

Description

蛋白质纯化
发明领域：
本发明属于蛋白质纯化领域。更具体地，本发明涉及使用半连续色谱步骤，纯化目标蛋白质如抗体或抗体片段的方法。
发明背景：
蛋白质的大规模经济纯化越来越成为生物技术产业的重要问题。通常，蛋白质通过细胞培养生产，其中通过插入含有该蛋白质基因的重组质粒，使用经过工程改造的哺乳动物或细菌细胞系来生产目标蛋白质。由于所使用的细胞系是活生物体，因此必须喂养含有糖、氨基酸和生长因子的复杂生长培养基。目标蛋白质必须从供给细胞的化合物混合物和从细胞本身的副产物(进料流)中分离到足以用作人治疗剂的纯度。卫生当局为用于人类施用的蛋白质设定的关于来自进料流的杂质的标准非常高。本领域已知的许多蛋白质纯化方法包含需要应用例如低pH或高pH、高盐浓度或其他可能不可逆地危害待纯化蛋白质的生物活性的极端条件的步骤，从而不合适。因此，将所需蛋白质分离至足够的纯度构成了艰巨的挑战。历史上，蛋白质纯化方案已经基于待纯化蛋白质和不需要的蛋白质污染物之间的大小、电荷和溶解度的分子性质的差异进行预期。基于这些参数的方案包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、差异沉淀等。
抗体和抗体片段在一系列治疗领域中变得越来越重要。产生抗体和抗体片段的最重要方法之一是通过重组技术。这些技术使用宿主细胞来表达所需的抗体或，然后将其从生产培养基中分离并纯化。
抗体需要糖基化，并因此通常在使用真核细胞的真核表达系统中表达，特别是哺乳动物细胞如CHO、PER.C6、NS0、BHK或Sp2/0细胞。在真核表达系统中，表达的目标蛋白质如抗体通常被分泌到细胞培养基中。随后可以容易地将培养基与分泌蛋白质的细胞分离，例如，通过离心或过滤。
几乎所有目前的工业抗体纯化平台都使用蛋白A。蛋白A是在细菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的细胞壁中发现的细胞表面蛋白，其与哺乳动物免疫球蛋白的Fc部分结合。蛋白A对人IgG1和IgG2抗体具有高亲和力，对人IgM、IgA和IgE抗体具有中等亲和力。因此，蛋白A纯化不适用于缺乏Fc部分的抗体片段。
亲和色谱基于目标蛋白质(或一组蛋白质)与偶联于色谱基质的特定配体之间的可逆相互作用来分离蛋白质。目标蛋白质和偶联于色谱基质的配体之间的相互作用可以是静电或疏水相互作用、范德华力和/或氢键合的结果。为了从亲和介质中洗脱靶分子，可以逆转相互作用，例如通过使用竞争性配体特异性地进行，或通过改变pH、离子强度或极性而非特异性地进行。亲和纯化需要可以共价连接到色谱基质上的配体。偶联的配体必须保持其对靶分子的特异性结合亲和力，并且在洗去未结合的物质后，配体和靶分子之间的结合必须是可逆的，以允许靶分子以活性形式被取出。尽管其常用，但亲和色谱是昂贵的，特别是在纯化治疗性蛋白质所必需的工业规模上。
离子交换色谱可用于纯化可电离的分子。离子化的分子基于其带电基团与附着于固相支持基质的带相反电荷的分子的非特异性静电相互作用，从而延迟那些与固相更强烈相互作用的离子化的分子而分离。每种离子化的分子的净电荷及其对基质的亲和力根据带电基团的数量、每个基团的电荷以及竞争与带电固相基质相互作用的分子的性质而变化。这些差异导致通过离子交换色谱分辨各种分子类型。通常通过增加缓冲液的离子强度(即电导率)以与溶质竞争离子交换基质的带电位点来实现对与固相结合的分子的洗脱。改变pH值并从而改变溶质的电荷是实现对溶质洗脱的另一种方法。电导率或pH的变化可以是逐渐的(梯度洗脱)或逐步的(分步洗脱)。已知两种一般类型的相互作用：由带负电荷的氨基酸侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)与带正电荷的表面相互作用所介导的阴离子交换色谱以及由带正电荷的氨基酸残基(例如赖氨酸和精氨酸)与带负电的表面相互作用所介导的阳离子交换色谱。阴离子交换剂可分为弱或强。弱阴离子交换剂上的电荷基团是弱碱，其变为去质子化，并因此在高pH失去其电荷。二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素是弱阴离子交换剂的一个实例，其中氨基可以在pH～9以下带正电荷并且在更高pH值逐渐失去其电荷。DEAE或二乙基-(2-羟基-丙基)氨基乙基(QAE)具有例如氯作为抗衡离子。
通过增加洗脱缓冲液的离子强度来洗脱的替代方法(洗脱色谱)是使用对固定相具有比对结合蛋白更高的动态亲和力的分子进行洗脱。这种进行离子交换色谱的方式称为置换色谱。置换色谱与任何其他色谱模式根本不同之处在于溶质在流动相改性剂中不被解吸并且通过迁移速率的差异而分离。在置换中，分子通过置换剂分子的前进冲击波被迫向下迁移到色谱柱，所述置换剂分子对固定相具有比来自进料流的任何组分更高的亲和力。与其他操作模式相比，正是这种强制迁移导致更高的产品浓度和纯度。保留率高，然后将置换剂溶液持续注入柱子中。
用于各种色谱技术，特别是用于大的工业规模的纯化方法的色谱基质非常昂贵。它们通常在清洁后重复使用。由于所用清洁剂的苛刻性质，色谱基质效率随时间降低。通常，本领域不能非常有效地使用色谱基质，因为未充分利用它们的全部最大蛋白质结合能力。在本领域中，使用色谱基质，使得它们装载低于其全部容量的目标蛋白质以提高产率。当蛋白质基质装载目标蛋白质至其全部容量时，许多目标蛋白质将丢失在流出物中。由于色谱基质的高成本和有限的寿命，本领域需要最佳地使用色谱基质的方法。
来自大规模细胞培养方法的粗制蛋白质制备物通常不能在单个纯化循环中被纯化。由于待纯化的蛋白质的量，需要相同纯化过程的几个循环来纯化细胞培养物的输出。因此，待纯化的蛋白质混合物经常在多个纯化循环中逐批纯化，也包括多个色谱循环。在生物制药的大规模制造过程中也实施了连续过程。在连续色谱中，根据方法要求，将多个相同的柱连接成允许柱串联和/或平行操作的布置。与单柱或分批色谱(其中单个色谱循环基于几个连续步骤，例如装载、洗涤、洗脱和再生)相比，在基于多个相同色谱柱的连续色谱中，所有这些步骤同时发生，但各自在不同的柱上发生。连续色谱操作可以更好地利用色谱树脂，缩短处理时间并降低缓冲液要求，所有这些都有利于过程经济性。操作连续色谱的一种具体方式称为模拟移动床(SMB)色谱。在模拟移动床色谱中，包括该系统的所有色谱柱周期性地同时在与样品流相反的方向上移动。通过适当重新引导进/出柱的入口和出口流来实现柱的移动，这需要复杂的设置。
本领域已经描述了半连续色谱，其中不使用单个大的色谱柱，而是在行中使用多个较小的柱子并装载至更高的结合容量。将每个柱的流出物直接装载到下一个柱子上。备选地，将第一柱子的流出物引导回第一容器，其中包含具有目标蛋白质的混合物，然后重新装载到第一柱子上(Mahajan，George等人，2012)。
在行中使用多个色谱柱需要复杂的流控制设备和控制软件，以及额外的色谱硬件，包括泵、阀门、检测器和每个附加柱子的外壳，这增加成本，增加部件故障的可能性，增加验证过程的复杂性并使错误诊断复杂化。此外，为了将来自一个柱子的流出物对准到相邻接收柱子的序列中的正确时段，必须引入延迟时段使得它们匹配，这降低了操作速度。由于每个附加接收柱子必须以交错顺序启动和停止，导致柱子在这些时段内处于非活动状态，因此每次关闭或重新启动操作时都会产生额外的生产率损失。
因此，本领域仍需要简单的、有效率的且成本有效的蛋白质纯化方法，包括使用色谱基质。
发明概述：
本发明通过提供纯化目标蛋白质的新方法解决了上述需要，该方法涉及更有效率地和成本有效地使用色谱基质，同时保持或提高纯化的蛋白质的产率和纯度。
因此，在第一方面，本发明提供了从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：
a)在操作色谱循环中，将第一体积的含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，其被操作使得蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％，50至100％，60至100％，70至100％，80至100％，90至100％，70至90％或70至80％，60至90％，60至80％的色谱基质最大静态结合容量；
b)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和
c)在进一步的操作色谱循环中，重新装载来自第二容器的流出物并将第二体积的目标蛋白质从第一容器装载到同一色谱基质中，其被操作使得目标蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％，50至100％，60至100％，70至100％，80至100％，90至100％，70至90％或70至80％，60至90％，60至80％的色谱基质静态结合容量。
在第二方面，本发明提供了从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：
a)在操作色谱循环中，将第一体积的含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，其被操作使得超过色谱基质的动态结合容量；
b)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和
c)在进一步的操作色谱循环中，重新装载来自第二容器的流出物并将第二体积的目标蛋白质从第一容器装载到同一色谱基质中，其被操作使得超过色谱基质的动态结合容量。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据第二方面的方法，其中在步骤(a)中，当达到至少40％，50％，70％，80％，90％或100％的最大静态结合容量时，停止装载目标蛋白质。
在第一或第二方面的进一步实施方案中，本发明提供了一种方法，其中流出物的收集在流出物中目标蛋白质的预定第一浓度开始并且在流出物中目标蛋白质的预定第二浓度停止。
在第一或第二方面的进一步实施方案中，本发明提供了一种方法，其中色谱选自亲和色谱，例如蛋白A色谱，阴离子或阳离子交换色谱，疏水相互作用色谱，混合模式色谱，例如羟基磷灰石色谱，手性色谱或介电色谱。
在第一或第二方面的进一步实施方案中，本发明提供了一种方法，其中用于一个、两个、三个、四个或所有色谱步骤的一个、两个、三个或所有色谱基质是色谱柱。
在第一或第二方面的进一步实施方案中，本发明提供了一种方法，其中目标蛋白质是抗体或抗体片段。
在第一或第二方面的进一步实施方案中，本发明提供了一种制备目标蛋白质的方法，包括根据本发明实施方案的纯化方法。
在第一或第二方面的进一步实施方案中，本发明提供了通过制备目标蛋白质的方法获得的蛋白质，所述方法包括根据本发明实施方案的纯化方法。
附图说明：
图1显示了半连续工艺的设置示意图。各种液体缓冲组分保持在罐中，并通过阀门顺序泵送通过多孔色谱基质。在从基质中出来后，流出物通过检测器，该检测器分析流出物。然后，如果流出物含有相关量的目标蛋白质则被引导用于收集，或者引导至废弃。在本发明中，流出物可以替代地被引导至单独的再循环罐。然后可以在以下操作色谱循环之一中，将该罐的内容物与新鲜装载物一起顺序泵送回色谱基质上。
图2显示了当使色谱基质过载时，目标蛋白质(靶化合物)的浓度分布。当在动态条件下装载固定化的色谱基质时，例如通过连续流动的装载材料，流中所需的靶化合物最初完全被基质结合。然而，随着对靶化合物的基质容量逐渐填满，一些靶化合物被结合而一些泄漏并与装载流中的其他不需要的蛋白质(例如宿主细胞蛋白质或蛋白质副产物)一起流出，并且在流出物中去掉。一段时间后，基质变得被靶化合物完全饱和，并且不再能够与靶化合物结合，并且任何额外的装载材料保持未结合并通过基质。
图3显示了当以受控方式使色谱基质过载时，目标蛋白质(靶化合物)的浓度分布。色谱基质可以装载含有靶化合物的装载材料，直到显著部分通过基质而没有结合，同时一些额外量的靶化合物继续结合的时候。这种过载的程度不必达到饱和点。这种含有未结合的靶化合物的过载材料可以被引导至循环容器中，并且被收集的区域不需要包括整个长度，可以在靶化合物开始泄漏之后开始并在出现的靶化合物停止泄漏之前结束。
图4显示了根据本发明的方法的图。典型的色谱分离可涉及结合阶段，其中目标蛋白质(靶化合物)与固定化的基质结合，和洗脱阶段，其中靶化合物从基质中化学地除去。在两者之间通常存在洗涤和调节步骤以除去其他杂质并保持基质的质量，在此期间这些材料通常被引导至废弃。在根据本发明的新方法中，施加含有靶化合物的装载物直至其泄漏。其中一部分保留在循环容器中。在本发明方法的后续循环中，在施加含有靶化合物的另外的装载材料之前将其重新施加到基质上。同样，施加它，直到基质过载并且靶化合物泄漏。然后将其引导至循环容器。该过程重复所需的循环次数，然后在最后的循环中施加较小量的新鲜装载物并且不收集再循环。
图5显示了来自从色谱柱出现的流出物流的测量结果的色谱图形(色谱图)，施加的体积在x轴上，测量的UV-强度在左轴上，导电率在右轴上。在该实例中，用Capto S基质(GE Healthcare)填充至20cm床高的柱子，以900cm/h过载。
图6显示了以1.66mg/ml滴度装载到20cm床高Capto S柱上的Fab靶产品的真实穿透(breakthrough)实验的数学模型，以900cm/h直至完全饱和，模型针对在290nm处归一化的穿透吸光度数据减去基线进行了优化。
图7显示了靶Fab以900cm/h在Capto S柱上进行数学优化的过载程度的真实实例，其中生产率(产品/时间)和生产能力(产品/时间/基质数量)的平均计算权重以黑斜线表示。用于再循环的相应收集区域显示为灰线，经数学优化，允许的产品损失高达2％。
图8显示了在所提出的方法学中操作的三个循环类型(初始循环、运行循环和最终循环)的每一个的柱体积中的操作块设置的表格。
图9显示了在根据本发明的方法中，操作初始循环的色谱图，其中吸光度显示在左轴上，电导率显示在右轴上，体积显示在x轴上。
图10显示了在根据本发明的方法中，操作第二、第三和第四循环的三个重叠色谱图，其中吸光度显示在左轴上，电导率显示在右轴上，体积显示在x轴上。
图11显示了在根据本发明的方法中，操作第五和最后循环的色谱图，其中吸光度显示在左轴上，电导率显示在右轴上，体积显示在x轴上。
图12显示了Fab在20cm Capto S柱上以900cm/h操作根据本发明的方法的总结结果的表。产率基于该循环释放的洗脱物与装载的产物进行计算。由于启动循环额外地过载，导致下一个循环的再循环，其产率被人为压低，并且由于最终循环相对装载不足以防止过量再循环，因此其产率是人为地高，因为它接收除了施加的新鲜装载物以外来自前一循环的再循环，其全部一起洗脱，表观产率大于100％。该方法的总产率略高于100％，这在测量的耐受性范围内并且表明装载的蛋白质基本上完全回收。
图13显示了MAb在20cm MabSelect SuRE LX柱上以500cm/h操作根据本发明的方法的总结结果的表。产率基于释放的洗脱物与装载的产物进行计算。由于启动周期额外地过载，导致下一个循环的再循环，其产率被人为压低，并且由于最终循环相对装载不足以防止过量再循环，因此其产率是人为地高，因为它接收除了施加的新鲜装载以外来自前一循环的再循环，其全部一起洗脱，表观产率大于100％。总体改进可以准确测量总产出与总投入。
图14显示了MAb在10cm MabSelect SuRE LX柱上以150cm/h操作根据本发明的方法的总结结果的表。产率基于释放的洗脱物与装载的产物进行计算。由于启动周期额外地过载，导致下一个循环的再循环，其产率被人为压低，并且由于最终循环相对装载不足以防止过量再循环，因此其产率是人为地高，因为它接收除了施加的新鲜装载以外来自前一循环的再循环，其全部一起洗脱，表观产率大于100％。总体改进可以准确测量总产出与总投入。
发明详述：
现在，本发明的发明人已经开发了一种纯化目标蛋白质的新方法，该方法涉及更有效率地和成本有效地使用色谱基质，同时保持或提高纯化的蛋白质的产率和纯度。
在第一方面，本发明提供了从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：
a)在操作色谱循环中，将含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，其被操作使得蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％，50至100％，60至100％，70至100％，80至100％，90至100％，70至90％或70至80％，60至90％，60至80％的色谱基质的静态结合容量；
b)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和
c)在进一步的操作色谱循环中，重新装载来自第二容器的流出物到相同色谱基质中，其被操作使得目标蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％，50至100％，60至100％，70至100％，80至100％，90至100％，70至90％或70至80％，60至90％，60至80％的色谱基质的静态结合容量。
在第一方面的变化中，本发明提供了从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：
d)在操作色谱循环中，将含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，其被操作使蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％，50至100％，60至100％，70至100％，80％至100％，90％至100％，70％至90％或70％至80％，60％至90％，60％至80％的色谱基质的静态结合容量；
e)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和
f)将来自第二容器的流出物重新装载到同一色谱基质中，并在另外的操作色谱循环中另外地装载新鲜的装载混合物，其被操作使得目标蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％，50至100％，60％至100％，70％至100％，80％至100％，90％至100％，70％至90％或70％至80％，60％至90％，60％至80％的色谱基质的静态结合容量。
在第一方面的另一个变化中，本发明提供了从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：
g)在操作色谱循环中，将第一体积的含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，其被操作使得蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％，50至100％，60至100％，70至100％，80至100％，90至100％，70至90％或70至80％，60至90％，60至80％的色谱基质的静态结合容量；
h)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和
i)在进一步的操作色谱循环中，重新装载来自第二容器的流出物并将第二体积的目标蛋白质从第一容器装载到同一色谱基质中，其被操作使得目标蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％，50至100％，60至100％，70至100％，80至100％，90至100％，70至90％或70至80％，60至90％，60至80％的色谱基质的静态结合容量。
与从第一容器装载第二体积的目标蛋白质一起或者优选地在其之前，可以在本发明的方法中执行重新装载来自第二容器的流出物到同一色谱基质中。
在第二方面，本发明提供了从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：
a)在操作色谱循环中，将第一体积的含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，其被操作使得超过色谱基质的动态结合容量；
b)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和
c)在进一步的操作色谱循环中，重新装载来自第二容器的流出物并将第二体积的目标蛋白质从第一容器装载到同一色谱基质中，其被操作使得超过色谱基质的动态结合容量。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据第二方面的方法，其中在步骤(a)中，当达到至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的最大静态结合容量时，停止装载目标蛋白质。
在第二个实施方案中，本发明提供了根据本发明方面的第一个或第二个实施方案的方法，其中进一步的操作色谱循环是紧随其后的色谱循环。
在第三个实施方案中，本发明提供了根据本发明方面的第一个和第二个实施方案的方法，其中流出物中的目标蛋白质浓度是在线、近线或离线测量的。流出物中的目标蛋白质浓度可以在根据本发明的方法中在线测量，例如，使用连接到色谱基质出口的检测器进行实时测量；近线测量，例如使用从色谱基质出口取出的样品并用放置在基质附近的检测器进行测量；或离线，例如使用从色谱基质出口取出的样品并在延迟后在远离的探测器上进行测量，例如在与基质分开的房间里。
流出物中的目标蛋白质或任何其他分子的浓度可以通过本领域已知的任何技术在根据本发明的任何实施方案的方法中进行测量，例如但不限于测量光学吸光度或荧光。
通过观察紫外吸光度或荧光信号的时间过程中超过由流出物中其他蛋白质杂质引起的背景紫外吸光度或荧光信号的稳态水平的增加或减少，可以在根据本发明任何实施方案的方法中确定流出物中的目标蛋白质。
通过本领域已知的任何合适波长的紫外吸光度或荧光，例如在280nm处，并且优选地使用亚最佳激发和/或发射波长，例如在290nm、300nm或310nm处，以允许检测在来自色谱基质的流出物中的目标蛋白质，即使当存在来自流出物中的蛋白质杂质的过量信号，可以在本发明任何实施方案的方法中测量流出物中的目标蛋白质的浓度。
在第四个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个和第三个实施方案的方法，其中流出物的收集在流出物中目标蛋白质的预定第一浓度开始并且在流出物中目标蛋白质的预定第二浓度停止。在进一步的实施方案中，流出物中目标蛋白质的收集在例如流出物中目标蛋白质的浓度为0.05mg/ml、0.1mg/ml或0.2mg/ml开始，并且在例如流出物中目标蛋白质的浓度为0.6mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml或5mg/ml停止。
在第五个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个和第四个实施方案的方法，其中流出物的预定部分，例如流出物的50％、40％、30％、20％、10％或5％被收集在第二容器中。
在第六实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个和第五个实施方案的方法，其中收集在第二容器中的流出物在进一步的操作色谱循环中重新装载到色谱基质上之前或同时不进行处理。
在第七个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个和第六个实施方案的方法，其中收集在第二容器中的流出物在完成色谱循环后，在下一个操作色谱循环中直接重新装载到色谱基质上。
在第八个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个和第七个实施方案的方法，其中收集在第二容器中的流出物在进一步的操作色谱循环中重新装载到色谱基质上之前或同时进行处理。处理可以是，例如搅拌或摇动、稀释(例如在水或缓冲液中)、浓度调节(例如使用真空过滤器组件)、pH调节、电导率调节，缓冲液或溶剂交换、冷却或加热或者其任何组合。
在第九个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个和第八个实施方案的方法，其中将收集在第二容器中的来自多个单独的操作色谱循环的流出物合并并且在另一个循环中重新装载到同一色谱基质上。可以在单个第二容器中或在第二、第三、第四或另外的容器中收集来自两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个操作色谱循环的流出物并在进一步的操作色谱循环中重新装载到色谱基质上。
在第十个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个和第九个实施方案的方法，其中该方法包括超过一个色谱步骤，并且操作两个、三个、四个或所有色谱步骤，使得含有未结合的目标蛋白质的流出物被收集在除了已装载色谱基质的容器之外的容器中，并且流出物从该容器重新装载到稍后的操作色谱循环中的相同色谱基质中。
在第十一个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个和第十个实施方案的方法，其中该方法包括一个、二个、三个、四个或超过四个色谱步骤。优选地，在色谱柱上执行一个、两个、三个、四个或所有色谱步骤。
在第十二个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第十一个实施方案的方法，其中三个色谱步骤是蛋白A色谱，然后是阳离子交换色谱，接着是阴离子交换色谱。在本发明方法的一个实施方案中，将蛋白A色谱的洗脱物进行阳离子交换色谱，以结合和洗脱模式操作，从中回收含有目标蛋白质的洗脱物，并将这样的洗脱物进行阴离子交换色谱，以产生含有目标蛋白质的流出物。本领域技术人员应理解，根据本发明的方法可以在所述三个色谱步骤中的每一个之间包括其他步骤，例如渗滤。
在第十三个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个、第十个、第十一和第十二个实施方案的方法，其中色谱选自亲和色谱，例如蛋白A色谱，阴离子或阳离子交换色谱，疏水相互作用色谱，混合模式色谱，例如羟基磷灰石色谱，手性色谱或介电色谱。
在第十四个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个、第十个、第十一、第十二个和第十三个实施方案的方法，其中用于一个、两个、三个、四个或所有色谱步骤的色谱基质是色谱柱。
在第十五个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个、第十个、第十一、第十二个、第十三个和第十四个实施方案的方法，其中目标蛋白质是抗体或抗体片段。
在第十六个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个、第十个、第十一、第十二个、第十三个、第十四个和第十五个实施方案的方法，其中混合物包含目标蛋白质和原核(例如细菌)宿主细胞污染物，例如宿主细胞蛋白质、核酸或脂质。
在第十七个实施方案中，本发明提供了根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个、第十个、第十一、第十二个、第十三个、第十四个，第十五个和第十六个实施方案的方法，其中混合物包含目标蛋白质和真核(例如哺乳动物)宿主细胞污染物，例如宿主细胞蛋白质、核酸或脂质。
在第十八个实施方案中，本发明提供了一种制备目标蛋白质的方法，包括根据本发明各方面的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个、第十个、第十一、第十二个、第十三个、第十四个，第十五个、第十六个和第十七个实施方案的纯化方法。
在本发明各方面的第十九个实施方案中，本发明提供了通过第十六个实施方案的方法获得的蛋白质，例如抗体或抗体片段。
在本发明各方面的其他实施方案中，根据任何实施方案的方法中的至少一个色谱柱具有大于1L、大于20L、大于30L、大于50L、大于75L，大于100L或大于200L，优选地在20L和200L之间、在30L和100L之间或在50L和100L之间的床体积。
在这些方面的其他实施方案中，本发明提供了根据任何实施方案的方法，其中一个、两个、三个、四个或所有色谱步骤在膜或块吸附剂上操作。
在这些方面的其他实施方案中，本发明提供了根据任何实施方案的方法，其中一个、两个、三个、四个或所有色谱步骤在单个色谱柱、膜吸附剂或块吸附剂上操作。
在这些方面的其他实施方案中，本发明提供了根据任何实施方案的方法，其中在随后的操作色谱循环中，将收集的流出物从第二容器重新装载到色谱基质上，其后将来自含有目标蛋白质的第一容器的新批次混合物装载到所述色谱基质上。在来自含有目标蛋白质的第一容器的混合物之前在随后的色谱循环中重新装载流出物，允许空柱完全结合再循环的目标蛋白质，这确保仅在两个循环中捕获目标蛋白质。
在这些方面的其他实施方案中，本发明提供了根据任何实施方案的方法，其中在来自含有目标蛋白质的第一容器的新批次混合物装载到色谱基质上之后或一起，在随后的操作色谱循环中，将收集的流出物从第二容器重新装载到所述色谱基质上。
在这些方面的其他实施方案中，本发明提供了根据任何实施方案的方法，其中收集在第二容器中的流出物储存至少30分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、24小时、一天、两天、七天、十四天、一个月、两个月、六个月或一年。
如本文所用的术语“阴离子交换色谱”是指这样的色谱，其中固相带正电荷，例如具有与其连接的一个或多个带正电荷的配体，例如季氨基。可商购的阴离子交换基质包括DEAE纤维素、QAE SEPHADEXTM、FAST Q SEPHAROSETM、Capto Q和Capto Q Impres(GEHealthcare)，Unosphere和Nuvia Q(BioRad)、GigaCap Q(Tosoh)、Mustang Q XT(Pall)、Fractogel Q和Eshmuno Q(Merck Millipore)和阴离子交换膜吸附剂如SartoBind Q(Sartorius)和块吸附剂(monolith adsorber)如QA块料(QA monolith,BiaSeparations)。
如本文所用的术语“抗体”是指包含两条重链和两条轻链的单克隆或多克隆四聚体全长抗体。两条重链和两条轻链可以相同或不同，例如在双特异性抗体中，如或术语免疫球蛋白与“抗体”同义使用。如本文所用的术语“抗体”包括但不限于通过本领域已知的重组技术产生的重组抗体。“抗体”可以是任何来源，包括来自哺乳动物物种，例如人、非人灵长类动物(例如人类，例如来自黑猩猩、狒狒、恒河猴或食蟹猴)、啮齿动物(例如来自小鼠、大鼠，兔或豚鼠)、山羊、牛或马物种。本文的抗体针对目标“抗原”。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且将抗体施用给患有疾病或病症的哺乳动物可以在该哺乳动物中产生治疗益处。然而，也考虑了针对非多肽抗原的抗体。当抗原是多肽时，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体，例如生长因子或细胞因子。本发明所包括的抗体的优选分子靶标包括CD多肽，例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD38、CD40和CD40-L；FcRn；OX40；HER受体家族的成员，如EGF受体，HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，如LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和av/b3整合素包括其α或β亚基(如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；趋化因子和细胞因子或其受体，如IL-1α和β、IL-2、IL-6、IL-6受体、IL-12、IL-13、IL-17A和/或IL-17F、IL-18、IL-21、IL-23、TNFα和TNFβ；生长因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；多肽C；PD1、PD-L1、PCSK9；硬骨素等等。
如本文所用的术语“抗体片段”是指抗体的部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括缺少Fc部分或不具有Fc部分的任何抗体。抗体片段的实例还包括例如Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv和scFv片段；以及双抗体，包括形式例如(双特异性T细胞结合子)和DARTsTM(双重亲和重新靶向技术)，三抗体，四抗体，微抗体，结构域抗体(dAb)，如sdAb，VHH和VNAR片段，单链抗体，从抗体片段或抗体形成的双特异性、三特异性、四特异性或多特异性抗体，包括但不限于Fab-Fv、Fab-scFv、Fab(Fv)2或Fab-(scFv)2构建体。如上定义的抗体片段和衍生物是本领域已知的(Kontermann 2012)。为了清楚起见，Fab-Fv应当理解为指含有以任何顺序连接的一个Fv区和一个Fab区的构建体，即Fab-Fv或Fv-Fab，其中一个区域中的最后一个氨基酸后面是下一个区域的第一个氨基酸，反之亦然。类似地，Fab-scFv应当理解为指含有以任何顺序连接的一个scFv区和一个Fab区的构建体，并且在Fab连接至任一多肽链的情况下，即Fab-scFv或scFv-Fab，其中一个区域中的最后一个氨基酸后面是下一个区域中的第一个氨基酸，反之亦然。以相同的方式，Fab-(Fv)2应理解为指含有以任何顺序连接的两个Fv区和一个Fab区的构建体，即Fab-Fv-Fv、Fv-Fab-Fv或Fv-Fv-Fab，其中一个区域中的最后一个氨基酸后面是下一个区域中的第一个氨基酸，反之亦然。类似地，Fab-(scFv)2应当理解为是指含有以任何顺序连接的两个scFv区和一个Fab区的构建体，并且在Fab连接至任一多肽链的情况下，导致20种可能的排列。通常，这些构建体在第一区域(例如Fab)和第二区域(例如Fv)之间包括肽接头。此类接头在本领域中是公知的，并且可以是一个或多个氨基酸，通常由技术人员在长度和组成方面进行优化。备选地，所述区域可以直接连接，即没有肽接头。用于将可变结构域与Fab或Fab'连接的合适接头区的实例描述于WO2013/068571中，其通过引用并入本文，并且包括但不限于柔性接头序列和刚性接头序列。抗体片段可以是非糖基化的或糖基化的。术语“抗体片段”还指包含至少一个抗原结合或fc受体结合抗体结构域的抗体衍生物，所述结构域与另一抗体结构域、不同蛋白质或非蛋白质分子共价连接。
如本文所用的术语“阳离子交换色谱”是指这样的色谱，其中固相带负电，例如具有一个或多个带负电荷的配体，例如羧酸或磺酸基。可商购的阳离子交换基质包括羧甲基纤维素，固定化在琼脂糖上的磺基丙基(SP)和固定化在琼脂糖上的磺酰基，例如Capto S、Capto Adhere和Capto S Impres(GE Healthcare)、Unosphere S和Nuvia S(BioRad)、GigaCap S(Tosoh)、Fractogel S和Eshmuno S(Merck Millipore)或者阳离子交换膜吸附剂如SartoBind S(Sartorius)和块吸附剂如SO3块(Bia Separations)。
与本文所用的色谱相关的术语“色谱柱”或“柱子”是指容器，通常为圆柱形或空心柱形式，其填充有色谱基质。色谱基质是提供用于纯化的物理和/或化学性质的材料。
如本文所用的术语“色谱循环”或“操作色谱循环”是指在色谱基质的给定分配上，处理步骤顺序的单个循环的操作，其可包括但不限于以下步骤的顺序组合中的一些至一个或多个：平衡步骤，重新装载步骤，装载步骤，过载步骤，装载后洗涤步骤，二次洗涤步骤，洗脱步骤，再生步骤，清洁步骤，储存步骤以及任何暂停或保持时段。因此，进一步的循环可以包括重复处理步骤的相同顺序。
与本文所用的色谱相关的术语“动态结合容量”是指在恒定流量下可以与色谱基质结合的目标蛋白质或其他靶化合物的量，而在流出物中不具有显著量的目标蛋白质或其他靶化合物。通过装载含有已知浓度的目标蛋白质的样品来确定色谱基质的动态结合容量。监测柱子上蛋白质样品的装载物，并且其将结合基质到某个拐点，之后未结合的蛋白质将流过基质。从穿透曲线，在损失例如10％蛋白质，发现动态结合容量并停止实验。通常动态结合容量定义为在恒流下可以与基质结合的目标蛋白质的量，不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％或20％的目标蛋白质(优选为在相同时间点装载的目标蛋白质的浓度)损失在流出物中。
如本文所用的术语“流出物”是指使混合物通过或穿过色谱基质获得的液体组合物。
如本文所用的术语“疏水相互作用色谱”是指这样的色谱，其中固相是疏水性的，例如具有一个或多个疏水配体，例如苯基或丁基。可商购的疏水性相互作用基质包括固定化在琼脂糖上的苯基或丁基，例如Capto Phenyl或Capto Butyl(GE Healthcare)、ToyoPearl HIC(Tosoh)和Fractogel EMD Phenyl(Merck Millipore)，或者固定化在膜吸附剂上如SartoBind HIC(Sartorius)。
与本文所用的色谱相关的术语“膜吸附剂”或“膜色谱”是指这样的色谱形式，其中半透膜容纳在容器中，通过该容器供给进料流，并且其表面附着有树脂或配体，所述树脂或配体是提供用于纯化的物理和/或化学性质的材料。
与本文所用的色谱相关的术语“块色谱”或“块吸附剂”是指这样的色谱形式，其中连续体积的多孔聚合物容纳在容器中，通过该容器供应进料流，并且其表面附着有树脂或配体，所述树脂或配体是提供用于纯化的物理和/或化学性质的材料。
如本文所用的术语“混合模式”色谱是指这样的色谱，其中固相可以具有不同带电荷或不带电荷配体的混合物，例如羟基磷灰石。可商购的混合型更多基质包括CeramicHydroxyapatite(BioRad)或Capto Adhere(GE Healthcare)和HA UltrogelHydroxyapatite(Pall)。
如本文所用的术语“混合物”是指包含至少一种目标蛋白质的至少部分液体的组合物，试图将所述目标蛋白质从也可以存在的其他物质中纯化，所述其他物质例如宿主细胞蛋白质、DNA或其他宿主细胞组分。混合物可以是例如悬浮液、水性溶液、有机溶剂系统或水性/有机溶剂混合物或溶液。混合物通常是复杂的混合物或溶液，其包含许多生物分子(例如蛋白质、抗体、激素、多核苷酸和病毒)、小分子(例如盐、糖、脂质等)和甚至颗粒物质。虽然生物来源的典型混合物可以以水性溶液或悬浮液开始，但它也可以包含在早期分离步骤中使用的有机溶剂，所述早期分离步骤例如溶剂沉淀、萃取等。
本文所用的与色谱相关的术语“静态结合容量”是指在静态条件下可以与色谱基质结合的目标蛋白质或其他靶化合物的最大量，而在流出物中不具有显著量的目标化合物或其他靶化合物。静态结合容量通常在烧杯中以分批模式测量，并且通常是指在给定溶剂和蛋白质浓度条件下与色谱介质结合的蛋白质的最大量。
可以通过培养用一种或多种编码重组抗体或抗体片段的表达载体转化的宿主细胞，生产可以根据本发明的方法纯化的目标蛋白质，例如抗体或抗体片段。
根据本发明实施方案的宿主细胞是例如原核细胞，酵母(例如但不限于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和其他克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))，粘菌(例如但不限于盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum))，丝状真菌(例如但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)和其他木霉属(Trichoderma)物种，黑曲霉(Aspergillus niger)和其他曲霉(Aspergillus)属物种)，苔藓(例如但不限于小立碗藓(Physcomitrella patens)，波叶仙鹤藓(Atrichumundulatum))，昆虫或哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞是例如但不限于NSO、SP2.0、3T3细胞、COS细胞、人骨肉瘤细胞、MRC-5细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、VERO细胞、CHO细胞、rCHO-tPA细胞、rCHO-Hep B表面抗原细胞、CHO-S细胞、HEK 293细胞、rHEK 293细胞、C127细胞、rC127-HepB表面抗原细胞、人成纤维细胞、Stroma细胞、肝细胞或PER.C6细胞。
宿主细胞优选地是真核宿主细胞，优选地是哺乳动物宿主细胞，更优选地是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如DG44株的细胞。
对于真核宿主细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)，可以使用不同的转录和翻译调节序列，这取决于宿主的性质。它们可以衍生自病毒来源，例如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猿猴病毒等，其中调节信号与具有高水平表达的特定基因相关。实例是疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等。可以选择允许抑制和激活的转录起始调节信号，从而可以调控基因的表达。已经用引入的DNA稳定转化的细胞可以通过还引入一种或多种标记物来选择，所述标记物允许选择含有所述表达载体的宿主细胞。标记物还可以提供对营养缺陷型宿主的光合营养，生物杀灭剂抗性，例如但不限于抗生素，或重金属如铜等。选择标记基因可以直接与待表达的DNA基因序列连接，或通过共转染引入同一细胞。还可能需要其他的元件来最佳合成本发明的蛋白质。
用编码目标蛋白质的一种或多种表达载体转染真核宿主细胞，随后在任何支持其生长和目标蛋白质表达的培养基中培养。培养基是化学成分确定的培养基，不含动物源性产品，如动物血清和蛋白胨。本领域技术人员可获得不同的细胞培养基，其包含维生素、氨基酸、激素、生长因子、离子、缓冲剂、核苷、葡萄糖或等效能量来源的不同组合，以适当的浓度存在以使得细胞生长和蛋白质生产。另外的细胞培养基组分可以在细胞培养周期的不同时间以适当的浓度包含在细胞培养基中，这是本领域技术人员已知的。
哺乳动物细胞培养可以在任何合适的容器中进行，例如摇瓶或生物反应器，其可以或可以不以补料分批模式操作，这取决于所需的生产规模。这些生物反应器可以是搅拌罐或气升式反应器。可提供各种大规模生物反应器，其容量超过1,000L至50,000L或100,000L，优选地5,000L至20,000L，或至10,000L。备选地，较小规模的生物反应器，例如2L至100L也可用于制备根据本发明方法的抗体。
根据本发明的工艺和方法，在真核宿主细胞(例如CHO细胞)中生产的目标蛋白质，例如抗体或抗原结合片段，通常存在于细胞培养物的上清液中。在本发明的一个实施方案中，所述上清液是在本发明的方法中纯化的混合物。
因此，在本发明的一个特定实施方案中，本发明的工艺和方法包括离心上清液和离心后回收液相的步骤，以获得含有目标蛋白质的混合物，用于根据本发明方法的进一步纯化。
备选地，可以使用本领域技术人员已知的澄清技术回收所述上清液，例如深度过滤。因此，在本发明的一个特定实施方案中，所述方法包括深度过滤的步骤，以获得含有目标蛋白质的混合物，用于根据本发明方法的进一步纯化。
备选地，宿主细胞是原核细胞，优选地革兰氏阴性细菌，优选地大肠杆菌(E.coli)细胞。用于蛋白质表达的原核宿主细胞是本领域熟知的。宿主细胞是重组细胞，其已经经过基因工程改造以生产目标蛋白质，例如抗体片段。重组大肠杆菌宿主细胞可以衍生自任何合适的大肠杆菌菌株，包括MC4100、TG1、TG2、DHB4、DH5α、DH1、BL21、K12、XL1Blue和JM109。一个例子是大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)，其是用于重组蛋白质发酵的一个常用宿主菌株。抗体片段也可以通过培养修饰的大肠杆菌菌株，例如代谢突变体或蛋白酶缺陷的大肠杆菌菌株来生产。
可以根据本发明的方法纯化的抗体片段通常存在于大肠杆菌宿主细胞的周质中或宿主细胞培养物上清液中，这取决于蛋白质的性质、生产规模和所使用的大肠杆菌菌株。将蛋白质靶向这些区室的方法是本领域熟知的。将蛋白质导向大肠杆菌周质的合适信号序列的实例包括大肠杆菌PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信号序列。可以通过依赖天然分泌途径或通过诱导外膜的有限渗漏引起蛋白质分泌来将蛋白质靶向上清液，其实例是使用pelB前导序列，蛋白质A的前导序列，共表达细菌素释放蛋白，丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白，以及向培养基中添加甘氨酸和用于膜透化的kil基因的共表达。最优选地，在本发明的方法中，重组蛋白在宿主大肠杆菌的周质中表达。
重组蛋白在大肠杆菌宿主细胞中的表达也可以在诱导型系统的控制下，由此重组抗体在大肠杆菌中的表达处于诱导型启动子的控制之下。适用于大肠杆菌的许多诱导型启动子是本领域熟知的并且取决于启动子；重组蛋白的表达可以通过改变因子如温度或生长培养基中特定物质的浓度来被诱导。诱导型启动子的实例包括可用乳糖或不可水解的乳糖类似物(异丙基-b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG))诱导的大肠杆菌lac、tac和trc启动子，和分别由磷酸盐、色氨酸和L-阿拉伯糖所诱导的phoA、trp和araBAD启动子。表达可以通过例如添加诱导物或当诱导是温度依赖性时改变温度而被诱导。当通过向培养物中添加诱导物来实现重组蛋白质表达的诱导时，可以通过任何合适的方法添加诱导物，这取决于发酵系统和诱导物，例如，通过单次或多次注射添加或通过经供料逐渐添加诱导剂。应当理解，在诱导物的添加和蛋白质表达的实际诱导之间可以存在延迟，例如在诱导物是乳糖的情况下，在诱导蛋白质表达发生之前可能存在延迟，同时在乳糖之前使用任何预先存在的碳源。
大肠杆菌宿主细胞培养物(发酵物)可以在任何支持大肠杆菌生长和重组蛋白表达的培养基中培养。培养基可以是任何化学成分确定的培养基，例如所描述的。
大肠杆菌宿主细胞的培养可以在任何合适的容器中进行，例如摇瓶或发酵罐，这取决于所需的生产规模。可提供各种大型发酵罐，其容量超过1,000L多至100,000L。优选地，使用1,000L至50,000L的发酵罐，更优选地1,000L至10,000L或12,000L。也可以使用容量为0.5L至1,000L的较小规模的发酵罐。
宿主细胞如CHO或大肠杆菌的发酵可以在任何合适的系统中进行，例如连续、分批或补料分批模式，这取决于蛋白质和所需的产率。与需要时分批模式可以注射添加营养素或诱导剂一起使用。备选地，可以使用补料分批培养，并且在分批模式下生长培养物，以最大比生长速率进行预诱导，可以使用最初存在于发酵罐中的营养素和用于控制生长速率的一种或多种营养物补料方案来维持，直到发酵完成。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括在装载到第一色谱基质上之前的捕获步骤，离心细胞培养物收获物的步骤，然后通过添加提取缓冲液来悬浮宿主细胞。
对于其中目标蛋白质如抗体片段存在于宿主细胞的周质空间中的大肠杆菌发酵过程，需要从宿主细胞中释放蛋白质。释放可以通过任何合适的方法实现，例如通过机械或压力处理的细胞裂解、冻融处理、渗透压休克、提取剂或热处理。这种蛋白质释放的提取方法是本领域熟知的。
在本发明方法的一个特定实施方案中，根据任何实施方案的本发明方法中的混合物通过洗脱与蛋白A结合的抗体或抗体片段而产生，例如用具有适于破坏抗体或抗体片段结合的pH的洗脱缓冲液。所述pH取决于特定分子并且通常由技术人员凭经验确定并调整以实现期望的终点。
本领域技术人员可获得许多含有所述天然重组蛋白A的色谱材料，例如(GE Healthcare)、(Novasep)、Captiv (Repligen)或(JSR)。
适合用作蛋白A色谱中的洗涤和洗脱缓冲液的缓冲液在本领域中是容易获得的，并且作为非限制性实例可以选自：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris、组氨酸、乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液、或MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸咪唑)、BES(N,N-(双-2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)-丙磺酸)或HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)缓冲液。
现在已经充分描述了本发明，本领域技术人员可以理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在宽范围的等效参数、浓度和条件下进行本发明，并且无需过多的实验。虽然已经结合本发明的特定实施例描述了本发明，但是应该理解，它能够进行进一步的修改。本申请旨在覆盖本发明的任何变型、用途或改变，通常遵循本发明的原理并且包括在本发明所属领域内的已知或惯常实践范围内对本发明的偏离，以及可以在所附权利要求的范围内应用于上文所述的基本特征。
如本文所用，“一个/种”可以表示一个/种或多个/种。本文中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代物或替代物是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅涉及替代物和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个其他”可以表示至少第二个或更多个。
如本文所用，“在X和Y之间”可以表示包括X和Y的范围。
本文引用的所有参考文献，包括期刊文章或摘要，已公布或未公开的美国或外国专利申请，已授权的美国或外国专利或任何其他参考文献，均通过引用并入本文，包括所引用参考文献中存在的所有数据、表格、图形和文本。另外，本文引用的参考文献中引用的参考文献的全部内容也通过引用并入。
对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的引用绝不是承认在相关领域中公开、教导或暗示了本发明的任何方面、描述或实施方案。
实施例
实施例1
进行柱过载实验以建立用于后续不连续操作的过载性能参数。将2X GE HiScreenCaptoS 4.67ml的10cm预填充离子交换柱(GE Healthcare Life Sciences产品代码：28-9269-79)末端相连，得到9.313ml的20cm床高阳离子交换柱。这些通过毛细管连接到GEAkta Avant纯化机(产品代码28930842)。将缓冲液连接并引导至入口管线。对柱子进行预清洗(strip)柱子并清除任何结合的材料，使用两个柱体积(CV)的高电导率缓冲液，所述高电导率缓冲液由50mM乙酸钠、1M氯化钠(pH4.5)组成，有85mS/cm的电导率，接着是由2个CV的0.5M氢氧化钠组成的苛性碱缓冲液以900cm/h向下流动方向泵送并在20℃无流动孵育15分钟，然后在向下流动中用3个CV的50mM乙酸钠缓冲液(pH4.5和电导率4.0mS/cm)洗掉以平衡柱子的基质。连接并校准内联(in-line)电导率监测器和三个吸光度检测器以观察流出物。吸光度检测器设定为280nm、290nm和305nm，每个的路径长度为2mm。制备含有过表达的目的片段-抗体(Fab)以及宿主细胞杂质的大肠杆菌细胞提取物，并用水稀释使得Fab的滴度为1.66mg/ml，电导率为10mS/cm并且pH值为4.5。将其以900cm/h装载到柱上，向下流动总共400ml，总共施加71.3mg/ml色谱基质，完全饱和并超过基质带电配体在此浓度对目标Fab的静态或最大结合能力。在此之后，将另外三个CV的50mM乙酸钠缓冲液(pH4.5和4.0mS/cm的电导率)施加到柱子上以洗去弱结合的组分。施加5个CV的50mM乙酸钠和225mM氯化钠缓冲液(pH4.5和15mS/cm的电导率)来置换强烈结合的靶组分，当它们从柱子中出现时收集在容器中-这种收集的材料构成纯化的洗脱物。然后依次施加重复的清洗和清除步骤以备进一步使用(图5)。
UV检测器用于监测和记录在装载阶段从柱中产生的杂质和产物的相对量，并且将记录的施加装载量与通过290nm处测量的洗脱物吸光度的出现信号水平输入以将计算模型拟合到数据以计算产物穿透的中点容量和结合过程的相关动力学(图6)。该模型基于在流出物中出现目标蛋白质的穿透的S形拟合，直至与指数衰减相关的装载量模拟在新鲜装载停止后流出物中出现的剩余未结合目标蛋白质，附加参数以考虑背景蛋白质杂质信号。
在上述用于CaptoS基质的条件下，所述CaptoS基质在具有目标Fab的进料流上操作，以900cm/h施加1.66mg/ml滴度。计算的动态结合容量在10％穿透水平的90％装载下为每循环20.03mg/ml基质，并且计算生产率为23.52mg/ml基质/小时。确定静态结合容量为32.8mg/ml，其对应于动态结合容量为161％。这用于预测在所提出的半连续方法中过载的整个过程的可实现的容量和生产率，其中一部分出现的过载收集在单独的容器中并在该过程的后续循环中重新装载到色谱基质上。通过改变过载程度以及收集过载的起点和终点来进行计算迭代该模型，以靶向优化的容量和生产率的期望平衡，用户定义的允许产品损失限制设置为最大2％，预计以每个循环31.40mg/ml基质的实际容量进行操作并且生产率为25.65mg/ml的基质/小时，代表了生产率提高9.1％并且每周期容量提高56.8％(图7)。
使用这些预测的设置重复纯化操作，柱子以相同的方式清洗、清洁和平衡。然后在该柱子上装载由计算模型投射的23.56个CV的相同批次装载物，并通过连续测量装载体积来控制，并且在施加15.44个CV的装载量之后收集过载洗脱物并收集在容器(第二容器)中，用于随后9.45个CV超出装载阶段，并且1.33个CV进入后续洗涤步骤。然后如前面的实验一样进行相同的洗涤，并且随后进行相同的洗脱过程，同时将出现的洗脱物收集在第三容器中。该过程构成第一循环，其中保留收集在第二容器中的过载部分以供进一步使用，并且第三容器中的洗脱物部分构成纯化的产物，分析其体积、浓度和纯度(图9)。对于第二色谱循环和随后的第三和第四色谱循环，如前所述在开始时重复再生、就地清洁和平衡步骤，然后施加收集的再循环(第二)容器的全部内容物，总共9.45个CV，然后是另外一批大肠杆菌提取物的19.39个CV。对于这些中的每一个，再次将9.45个CV的过载物收集回到原始的第二容器中，将1.33个CV延伸到相同的后续洗涤步骤中，随后对每个循环进行相同的洗脱过程，再次测试洗脱物的性能。这些色谱循环构成了所提出方法中的典型运行色谱循环(图10)。对于第五个色谱循环，如前所述重复清洗、清洁、平衡和重新装载所收集的过载物，但新鲜的大肠杆菌提取物仅以90％负载容量施加至传统操作动态结合容量的点，因为其产生10％的穿透，相当于7.89个CV的额外负载。然后完全进行随后的洗涤和洗脱步骤。这构成了最终的色谱循环，没有预期的过载操作，也没有后续循环(图11)。设置可以在(图8)中看到。在该实验中在色谱循环期间在基质上实现的实际容量为32.2mg/ml，其对应于基质的最大静态结合容量的98.2％。为了比较，该方法在传统的分批方法中也使用相同的条件进行操作，但没有过载和再循环步骤，并且装载阶段仅施加至20.03mg/ml的色谱基质容量，其相当于10％穿透水平的90％装载量，与可比较的传统操作一致。结果与传统操作的比较如图12所示。
实施例2
方法
在该方法的平行实施例中，将2X GE HiScreen MAb Select SuRE LX 4.67ml的10cm预填充蛋白A色谱柱(GE Healthcare Life Sciences产品代码：17-5474-05)末端相连，得到9.313ml的20cm床高蛋白A亲和柱。这些通过毛细管连接到GE Akta PURE纯化机(产品代码29-0182-24)。与前面的实施例类似，将缓冲液连接并引导至入口管线。使用两个柱体积(CV)的pH为2.1的柠檬酸缓冲液和两个CV的0.1M氢氧化钠苛性碱缓冲液以500cm/h的速度向下流动方向泵送，将柱子类似地进行预清洗并清洁任何结合的材料，并在20℃下无流动孵育15分钟。在施加装载到所有色谱循环之前，使用四个CV的组成为50mM磷酸钠的平衡缓冲液(pH7.0和电导率为6.0mS/cm)，在施加装载后，使用相同缓冲液的另外三个CV以洗掉弱结合化合物，并且使用5个CV的30mM乙酸钠pH3.7在所有循环中洗脱结合的产物。按照以前的方法应用了相同的监视器。装载物含有来自哺乳动物宿主细胞的滴度为2.9mg/ml的细胞外表达的单克隆抗体，其经过深度过滤以除去全细胞和大片段，并将滤液以向下流动的方式施加到柱上直至90mg靶抗体/ml基质，超过基质的典型静态结合容量。对出现的流出物的测量类似地用于对穿透过程进行建模，并根据所提出的方法来定义用于过载和再循环的优化参数。然后使用这些设置来操作纯化过程，其具有过载的初始循环、三个过载和再循环的后续色谱循环以及加载不足的最终色谱循环。将其与相同条件下但没有过载和再循环步骤的等效传统分批方法进行比较，并且装载阶段仅施加到色谱基质的29.68mg/ml容量，相当于10％穿透水平的90％负载容量，与可比较的传统操作一致。结果与传统操作的比较如图13所示。
实施例3
方法
在该方法的大规模实例中，在AxiChrom柱(GE Healthcare ife Sciences产品代码：28901831)中将190ml的MAb Select SuRE LX 190蛋白A色谱树脂(GE Healthcare LifeSciences产品代码：17-5474-04)填充至10cm的高度，并通过管道连接到中试净化机(GE Healthcare Life Sciences产品代码29-0086-12)。如前面的实施例所述，将带有缓冲液的容器连接并引导至入口管线上。如前述实施例中所述，使用两个柱体积(CV)的pH为2.1的柠檬酸缓冲液和两个CV的0.1M氢氧化钠苛性碱缓冲液以150cm/h的速度向下流动方向泵送，将柱子进行预清洗并清洁任何结合的材料，并在20℃下无流动孵育15分钟。在对所有色谱循环施加装载物之前，使用5个CV的平衡缓冲液，其组成为50mM磷酸钠，pH 7.0，电导率为6.0mS/cm，在施加装载物之后使用相同缓冲液的另外三个CV以洗去弱结合化合物，并且使用5个CV的60mM乙酸钠pH3.6在所有循环中洗脱结合的产物。按照以前的方法应用了相同的监视器。装载物含有来自哺乳动物宿主细胞的滴度为3.9mg/ml的细胞外表达的单克隆抗体，其经过深度过滤以除去全细胞和大片段，并将滤液以150cm/h施加到柱上。在10％穿透水平的90％装载下，计算的动态结合容量为每循环47.9mg/ml基质，并且对于传统的分批方法，生产率计算为20.9mg/ml基质/小时。确定静态结合容量为77.2mg/ml，这相当于向下流中动态结合容量的143％，超过基质的典型静态结合容量。对出现的流出物的测量类似地用于对穿透过程进行建模，并根据所提出的方法定义用于过载和再循环的优化参数。然后将这些设置用于操作纯化过程，初始循环过载直至84.1mg/ml的装载量，三次过载和再循环后续色谱循环直至运行容量为68.5mg/ml，以及负载不足的最终色谱循环直至22.9mg/ml的容量。在该实验中在色谱循环期间在基质上实现的实际容量为68.5mg/ml，这相当于基质的最大静态结合容量的88.7％，并且以21.0mg/ml基质/小时的生产率操作(对于运行循环)。将其与相同条件下的等效传统批次方法学进行比较，但没有过载和再循环步骤。结果与传统操作的比较如图14所示。
参考文献
Kontermann,R.E.(2012)."Dual targeting strategies with bispecificantibodies."MAbs 4(2):182-197.
Mahajan,E.,A.George and B.Wolk(2012)."Improving affinitychromatography resin efficiency using semi-continuous chromatography."JChromatogr A 1227:154-162.

Claims (14)

1.从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：
a)在操作色谱循环中，将第一体积的含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，操作使得蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％的色谱基质其被静态结合容量；
b)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和
c)在进一步的操作色谱循环中，重新装载来自第二容器的流出物并将第二体积的目标蛋白质从第一容器装载到同一色谱基质中，其被操作使得目标蛋白质与色谱基质结合直至达到40至100％的色谱基质最大静态结合容量。
2.从混合物中纯化目标蛋白质的方法，包括以下步骤：
a)在操作色谱循环中，将第一体积的含有目标蛋白质的混合物从第一容器装载到色谱基质中，其被操作使得超过色谱基质的动态结合容量；
b)在第二容器中收集含有未结合的目标蛋白质的流出物，和
c)在进一步的操作色谱循环中，重新装载来自第二容器的流出物并将第二体积的目标蛋白质从第一容器装载到同一色谱基质中，其被操作使得超过色谱基质的动态结合容量。
3.根据权利要求2的方法，其中在步骤(a)中，当达到至少40％的最大静态结合容量时，停止装载目标蛋白质。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中进一步的操作色谱循环是紧随其后的色谱循环。
5.根据权利要求1、2、3或4的方法，其中流出物的收集在流出物中目标蛋白质的预定第一浓度开始并且在流出物中目标蛋白质的预定第二浓度停止。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中流出物的预定部分被收集在第二容器中。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中流出物在重新装载到色谱基质上之前进行处理，所述处理选自搅拌或摇动、稀释、浓度调节、pH调节、电导率调节，缓冲液或溶剂交换、冷却或加热或者其任何组合。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述色谱选自亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、混合模式色谱、手性色谱或介电色谱。
9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述方法包括三个色谱步骤。
10.根据权利要求9的方法，其中所述方法包括蛋白A色谱，然后是阳离子交换色谱，接着是阴离子交换色谱。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中一个、两个、三个或所有色谱基质是色谱柱。
12.根据权利要求1-11任一项的方法，其中目标蛋白质是抗体或抗体片段。
13.一种制备目标蛋白质的方法，包括根据权利要求1-12任一项的蛋白质纯化方法。
14.通过权利要求13的方法获得的蛋白质。
CN201780018403.0A 2016-02-19 2017-02-17 蛋白质纯化 Active CN108779143B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1602938.1A GB201602938D0 (en) 2016-02-19 2016-02-19 Protein purification
GB1602938.1 2016-02-19
PCT/EP2017/053677 WO2017140881A1 (en) 2016-02-19 2017-02-17 Protein purification

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108779143A true CN108779143A (zh) 2018-11-09
CN108779143B CN108779143B (zh) 2022-08-12

Family

ID=55752913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780018403.0A Active CN108779143B (zh) 2016-02-19 2017-02-17 蛋白质纯化

Country Status (27)

Country Link
US (2) US20190202859A1 (zh)
EP (2) EP3730511B1 (zh)
JP (1) JP6911040B2 (zh)
KR (1) KR102728998B1 (zh)
CN (1) CN108779143B (zh)
AU (1) AU2017220675B2 (zh)
CA (1) CA3014488A1 (zh)
CL (1) CL2018002373A1 (zh)
CO (1) CO2018009057A2 (zh)
CY (1) CY1123802T1 (zh)
DK (2) DK3730511T3 (zh)
EA (1) EA038538B1 (zh)
ES (2) ES2960723T3 (zh)
FI (1) FI3730511T3 (zh)
GB (1) GB201602938D0 (zh)
HR (2) HRP20231432T1 (zh)
HU (2) HUE050774T2 (zh)
IL (1) IL261040B (zh)
LT (2) LT3416974T (zh)
MX (1) MX2018009829A (zh)
MY (1) MY186560A (zh)
PL (2) PL3416974T3 (zh)
PT (2) PT3416974T (zh)
RU (1) RU2018133009A (zh)
SG (1) SG11201806852PA (zh)
SI (2) SI3730511T1 (zh)
WO (1) WO2017140881A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201628649A (zh) 2014-10-09 2016-08-16 再生元醫藥公司 減少醫藥調配物中微可見顆粒之方法
MX2019000935A (es) 2016-08-16 2019-07-04 Regeneron Pharma Metodos para cuantificar anticuerpos individuales de una mezcla.
WO2018081203A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for chromatography data analysis
EP3824906A1 (en) 2016-12-21 2021-05-26 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
GB201711481D0 (en) * 2017-07-17 2017-08-30 Ucb Biopharma Sprl Protein purification
CN118416215A (zh) 2017-09-19 2024-08-02 里珍纳龙药品有限公司 减少粒子形成的方法以及由其形成的组合物
GB201805142D0 (en) * 2018-03-29 2018-05-16 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
TW202448568A (zh) * 2018-07-02 2024-12-16 美商里珍納龍藥品有限公司 自混合物製備多肽之系統及方法
JP7063759B2 (ja) * 2018-07-25 2022-05-09 株式会社日立プラントサービス 精製装置
CN110348089B (zh) * 2019-06-28 2021-05-04 浙江大学 基于层析模型实现多柱连续流层析设计及分析的方法
WO2024056626A1 (en) * 2022-09-13 2024-03-21 Sanofi Aventis Deutschland Gmbh Continuous gradient elution chromatographic fractionation

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103025752A (zh) * 2010-07-27 2013-04-03 Ucb医药有限公司 蛋白质纯化
WO2014158231A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6055162B2 (ja) * 1977-05-26 1985-12-04 参松工業株式会社 カラムクロマト分離法
US9433922B2 (en) * 2007-08-14 2016-09-06 Emd Millipore Corporation Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same
WO2009045897A1 (en) * 2007-10-03 2009-04-09 Dyax Corp. Systems and methods for purifying proteins
CN101318991A (zh) 2008-07-04 2008-12-10 陈志南 一种采用复合层析介质纯化Fc融合蛋白的方法
WO2012057676A1 (en) * 2010-10-27 2012-05-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Chromatography system with guard columns
CN103703015B (zh) * 2011-08-25 2019-07-05 霍夫曼-拉罗奇有限公司 阳离子和阴离子交换层析法
DK2776466T3 (da) 2011-11-11 2017-11-20 Ucb Biopharma Sprl Albuminbindende antistoffer og bindingsfragmenter deraf

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103025752A (zh) * 2010-07-27 2013-04-03 Ucb医药有限公司 蛋白质纯化
WO2014158231A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same

Also Published As

Publication number Publication date
ES2960723T3 (es) 2024-03-06
US20210323999A1 (en) 2021-10-21
DK3416974T3 (da) 2020-09-07
SI3416974T1 (sl) 2020-11-30
CL2018002373A1 (es) 2018-12-07
HRP20231432T1 (hr) 2024-03-01
KR102728998B1 (ko) 2024-11-11
CN108779143B (zh) 2022-08-12
HRP20201415T1 (hr) 2020-11-27
HUE064240T2 (hu) 2024-02-28
LT3416974T (lt) 2020-12-10
US11905310B2 (en) 2024-02-20
LT3730511T (lt) 2023-10-25
WO2017140881A1 (en) 2017-08-24
FI3730511T3 (fi) 2023-10-31
US20190202859A1 (en) 2019-07-04
PL3416974T3 (pl) 2020-12-14
IL261040A (en) 2018-10-31
EA201891878A1 (ru) 2019-01-31
CY1123802T1 (el) 2022-03-24
PT3416974T (pt) 2020-08-11
JP2019509998A (ja) 2019-04-11
IL261040B (en) 2021-07-29
EP3730511B1 (en) 2023-09-20
SG11201806852PA (en) 2018-09-27
EP3730511A1 (en) 2020-10-28
EP3416974B1 (en) 2020-07-29
HUE050774T2 (hu) 2021-01-28
MX2018009829A (es) 2018-09-11
MY186560A (en) 2021-07-27
AU2017220675B2 (en) 2023-11-16
PT3730511T (pt) 2023-10-23
PL3730511T3 (pl) 2024-03-11
KR20180128910A (ko) 2018-12-04
JP6911040B2 (ja) 2021-07-28
SI3730511T1 (sl) 2023-12-29
RU2018133009A (ru) 2020-03-19
EP3416974A1 (en) 2018-12-26
GB201602938D0 (en) 2016-04-06
ES2822918T3 (es) 2021-05-05
DK3730511T3 (da) 2023-10-30
AU2017220675A1 (en) 2018-08-23
CO2018009057A2 (es) 2018-11-13
CA3014488A1 (en) 2017-08-24
BR112018016742A2 (pt) 2018-12-26
EA038538B1 (ru) 2021-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108779143B (zh) 蛋白质纯化
US11498941B2 (en) Chromatography
US11339214B2 (en) Protein purification
JP2022036993A (ja) タンパク質精製方法
JP2022543187A (ja) 抗体を精製するための方法
BR112018016742B1 (pt) Processo para purificação de uma proteína de interesse e método de fabricação de tal proteína
EA043448B1 (ru) Очистка белка
CN112805298A (zh) 制备GLY-Tβ4的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1262623

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant