CN101318991A - 一种采用复合层析介质纯化Fc融合蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种采用复合层析介质纯化Fc融合蛋白的方法，该方法采用离子交换疏水复合层析介质，调节层析缓冲系统的pH低于纯化目标蛋白的平均pI，同时调节该层析缓冲系统具有较高的离子强度，利用适当的层析条件，使纯化目标蛋白存在于流穿液中，收集该流穿液，而污染性杂质(如宿主细胞蛋白、聚合体等)则吸附到复合层析介质上，从而提高目标蛋白纯度。采用本发明的方法，最终杂质去除率达1％以上，目标蛋白纯度达99％以上，目标蛋白回收率达90％以上。本发明的方法在实现过程中衔接紧密，能够一步有效去除污染性杂质，具有稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化生产等特点。

Description

一种采用复合层析介质纯化Fc融合蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物蛋白质纯化领域，涉及抗体类蛋白质的纯化，特别是一种采用复合层析介质纯化Fc融合蛋白质的方法。该方法主要用于动物细胞大规模培养生产的治疗用Fc融合蛋白质药物的生产制备。

背景技术

抗体治疗已成为当今生物治疗肿瘤、流行性和感染性疾病的重要手段。抗体类药物以其高度的特异性、有效性和安全性成为国际药品市场上一大类新型治疗剂^[1]。

动物细胞大规模培养生产抗体类药物已成为当今生物制药领域的主流。临床许多抗体类药物，特别是治疗用药，需用较高剂量或长期用药，市场需求较大，因此该类生物制药的大规模生产对工艺质量要求较高，必须符合美国FDA标准。目前，约70-80％的抗体纯化使用了Protein A、Protein G亲和层析^[2，3]，因为该法可一步从细胞培养上清液中几乎完全纯化抗体(通常是IgG抗体)。

蛋白质A(Protein A)来源于金黄色葡萄球菌的一个株系。Protein A作为亲和配体被固定于琼脂糖上，它所包含的5个与IgG Fc段结合的结构域。ProteinA也可以结合另一些免疫球蛋白与如IgA、IgM。天然和重组的Protein A(rProteinA)对于免疫球蛋白IgG的Fc段有特异的结合。重组的Protein A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位点固定于琼脂糖上，增加了其结合能力。ProteinA的色谱行为，与Fc的结合强度依赖于该蛋白的物种来源，而动态结合能力则决定于色谱环境与色谱条件。

随着FDA、SFDA等对于治疗性抗体产品质量要求的不断提高，Protein A亲和层析纯化后的抗体往往仍不能够满足要求，主要表现为一些污染性杂质的存在，例如：脱落的Protein A、宿主细胞蛋白(HCP)、聚合体(D/A)等。

由于Protein A亲和层析介质反复使用时不可避免的会发生某种程度的配体脱落，这可能是由于蛋白酶水解将蛋白质从基质上解离下来的结果。而脱落Protein A或其片段等污染物仍然保留了对IgG抗体的亲和力，这样将会形成复合物而难以从纯化的抗体中除去，这种情况在治疗性抗体药物中是绝不允许的，因此去除是必须的^[4，5]。同时Protein A是细菌蛋白质会引起不良免疫应答反应，根据报道Protein A和IgG抗体形成的复合物在体内可激活携带Fc的白细胞和补体系统得免疫应答，产生氧化和过敏反应^[6]。

Balint等人指出可通过凝胶过滤分离此种Protein A-IgG复合体和IgG单体^[7]，但该方法处理量少，不适于放大。

J.邦纳杰等人证明采用离子交换可以有效去除在使用过程中脱落的ProteinA^[4，5]。其专利中有关抗体纯化的描述：采用离子交换层析，进行分级收集离子交换的流通峰，经Elisa检测分级收集的产品中Protein A-IgG复合体大为降低。但是该法采用了分级分离，对产物回收率造成较大的影响，其回收率为70％-80％，最优仅为80％以上，对于具有高附加值的抗体产品而言这是非常不经济的；而且，该法中仅仅针对较为前期的亲和层析介质的Protein A脱落进行研究，并不具有代表性。

值得关注的是，现有报道中采用的是以往的亲和介质，Protein A脱落问题相对较为严重^[4，5]，其中Streamline重组蛋白质A亲和介质每毫克抗体中可得到大约或超过1000ng污染性Protein A^[8]。因此有必要采用有效方法进行去除。然而，随着技术的发展，目前广泛应用于抗体纯化领域的亲和层析介质已经由Protein A Sepharose FF，rProtein A Sepharose等介质发展为ProSep-Va Ultra，Mabselect，Mabselect Xtra，Mabselect SuRe等新一代介质，这些新型亲和层析介质的Protein A脱落问题有了很大的改善，其中大量研究显示Mabselect SuRe应用潜力更大^{[9，10，11]}。

MabSelect系列的Protein A配体经基因工程改造，C端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫键，同时增加了对IgG的有效结合。蛋白A和凝胶交联时采用了全新的工艺流程，增加了介质的稳定性和胶内孔的表面积，因此增加了流速和动态载量：在线形流速为500cm/h和柱床高度为20cm的条件下，MabSelect的动态载量可以达到30mg IgG/ml以上，超过原来A蛋白介质数倍，在纯化特性方面也明显优于其他几种蛋白A偶联的介质。2004年底推出的MabSelect Xtra和Mabselect SuRe，载量又比普通MabSelect增加了近30％^[12]。

目前，美国FDA建议产品中残留Protein A的量应低于10ppm～12ppm^[13]。R.Hahn等人的研究显示，Mabselect SuRe介质的Protein A脱落相对于其他介质(Mabselect Xtra，ProSep-Va Ultra)更低，一般处于3ppm以下，远低于以上标准^[11]。而且该研究显示经过50个使用循环过后，没有升高的趋势。这是因为MabSelect由于通过环氧共价交联，蛋白A的脱落比其它同类介质低一半以上。由此可见，对于使用Mabselect等介质进行纯化的Fc融合蛋白，脱落的Protein A并不是主要污染性杂质，且在相当使用时期内脱落的Protein A并不会影响产品的质量。

因此，对于其他污染性杂质(如：宿主细胞蛋白、聚合体等)的去除则显得更为突出和重要。

宿主细胞蛋白(Host Cell Protein，HCP)是指生物制品中来源于宿主细胞的蛋白成分，其主要成分包括：宿主细胞结构蛋白和转化蛋白(即细胞分泌的促生长蛋白)，前者危险性在于引起机体过敏反应，后者在于引起细胞转化^[14]。理论上，传代细胞的DNA和蛋白存在致肿瘤的可能性。同时，生物制品中的细胞残留蛋白为异源蛋白(过敏原)，有可能引起机体的过敏反应^[15]。有研究表明，地鼠肾细胞乙脑疫苗的过敏反应可能与疫苗中地鼠肾细胞蛋白含量高有关^[16]。

但是，不同细胞的宿主细胞蛋白是不一样的，就算是相同细胞，在最终产品中的HCP也是不一样的。首先，这与抗体表达的方式有关，其次与使用的纯化方法有关。Rainer Hahn等人比较了不同亲和介质的特性，发现MabSelectXtra，MabSelect SuRe，ProSep-vA Ultra三种亲和层析介质纯化后抗体中HCP的残留各有差异^[11]。

CHO细胞是被WHO和SFDA认可用于抗体和重组蛋白等生物制品的生产的传代细胞。该细胞遗传背景清楚，核型稳定，无外源因子污染，适合生物反应器大规模培养和生产，保证了大批量细胞的均质性和安全性。但该细胞产生的HCP依然会影响产品的质量。有研究显示，亲和层析之后的HCP水平一般在200ppm～3000ppm之间^[17]，更有研究显示，100ppm的HCP能够引起患者的免疫反应^[18]。《中国药典》三部(2005版)对CHO细胞表达的产品提出要求：宿主细胞残余蛋白(HCP)占总蛋白含量的0.1％以下。因此纯化过程中HCP的去除势在必行。

Andreas Stein等人采用一种阳离子交换介质直接从培养液中纯化抗体，其产物中HCP量从发酵液的155000ppm降低至80ppm，纯化系数达1800倍^[19]，取得了良好的效果。但作为第一步从发酵液中初步纯化抗体，在其放大过程中受限制因素较多。

J.邦纳杰等人证明采用离子交换可以有效去除在使用过程中脱落的Protein A^[4，5]，取得了良好的效果。但其对于产物中HCP的去除却没有进行报道。

目前，针对HCP进一步去除的文献比较少，尤其是针对亲和层析之后产品中HCP去除的研究报道更少。

除了去除Protein A和HCP之外，涉及Fc融合蛋白(但可以拓展至任何其他类型的生物医药蛋白)的另一纯化问题是均质二聚体与更高聚合体的形成。与蛋白质A形成复合物(主要基于亲和力甚至天然蛋白质也能形成)相反，自发性的或者由盐、由pH诱导的至少一部分分蛋白质变性使得溶剂可接近表面的疏水区域暴露导致Fc融合或类似蛋白质均受化学质量定律的驱动看时形成聚合体。因此，与基于亲和力的复合物形成相反，非特异性凝聚主要受溶剂排斥作用驱动，在这点上类似于晶体生长行为^[4，5]，最初仍可溶的聚合物随时间而增加，进而蛋白质从溶液中沉淀。药物给予后，低百分比的污染性聚合物还可能引发有害的免疫应答反应^[20]。

迄今为止，能可靠的去除聚合物的方法最常用体积排阻层析(SEC)。然而，SEC是纯化的瓶颈，与其他层析技术相比，它需要大量处理时间，材料昂贵并且加载容量低。据报道^[21]，SEC可以有效检测聚合物的存在，并能对其进行定量研究，但也仅仅作为检测手段进行应用，无法应用于产品制备。

另一方面，在纯化过程中目标产物的纯度固然重要，但是纯化效率也非常重要。纯化效率主要体现在回收率和介质处理能力两方面。

Andreas Stein等人虽然获得了较好的产品质量，但离子交换层析本身要求高，因此样品处理较为复杂，势必会造成产物不必要的损失^[19]。J.邦纳杰等人面临同样的问题。在他们的方法中样品须经过透析和或超滤等方法处理，才能进行下一步纯化^[4，5]。这对时间、设备、环境、人员等因素的要求较高，不容易满足规模化生产的需求。同时，他们采用了分级收集的方式来纯化抗体，这样在获取高纯度产物的同时是以牺牲回收率为前提的(其回收率最高仅为85％以上)^[4，5]。

介质的处理能力由载量和流速两者共同决定。对于规模化纯化而言，更高的载量和流速更加适用。Andreas Stein和J.邦纳杰等人采用的离子交换介质动态载量一般为50mgIgG/ml介质，流速一般为300cm/h～500cm/h^[22]。而且其载量受到样品处理效果、以及操作条件的影响较大，不适合大规模生产

根据申请人所进行的资料检索，检索到和本发明相关的有以下参考文献：

1.米力、唐浩等，一种高效快速纯化片段抗体的方法，2004，中国发明专利，专利号：ZL200410026022.1；

2.Deborah K.Follman，Robert L.Fahrner.Factorial screening ofantibody purification processes using three chromatography stepswithout protein A.Journal of Chromatography A，1024(2004)79-85。

3.Jorg Thommes，Andrea Bader，Markus Halfar，etal.Isolation ofmonoclonal antibodies from cell containing hybridoma broth using aprotein A coated adsorbent in expanded beds.Journal of ChromatographyA，752(1996)11l-122。

4.J.邦纳杰，R.P.布拉克，M.R.戴维斯等，用于纯化抗体的亲和力加离子交换层析，2005，PCT专利申请，申请号：200580035236.8；

5.J.邦纳杰，A.普伦塔，用蛋白A和离子交换层析来纯化抗体，2004，PCT专利，申请号：20048009347.7；

6.Balint，et al.Tumoricidal response following perfusion overimmobilized protein′A：identification of immunoglobulin oligomers inserum after perfusion and their partial characterization，Cancer Res，44(1984)734。

7.Das，et al，Separation of complexes containing protein A and IgGor Fc gamma Fragments by high-performance liquid chromatography，Analyt.Biochem，145(1985)27-36。

8.Ingenmar Johansson，IGG separation medium Amersham，2002，USAPatent(US6399750)；

9.R.Hahn，R.Schlegel，A.Jungbauer，Comparison of protein A affinitysorbents，J.Chromatogr.B 790(2003)35-51；

10.R.Hahn，P.Bauerhansl，K.Shimahara，C.Wizniewski，A.Tscheliessnig，A.Jungbauer，Comparison of protein A affinity sorbentsII.Mass transfer properties.Journal of Chromatography.A 1093(2005)98-110；

11.Rainer Hahn，Kazumichi Shimahara，Franz Steindl，Alois Jungbauer，Comparison of protein A affinity sorbents III.Life time study，Journalof Chromatography A.1102(2006)224-231；

12.MabSelect Xtra Datafile Amersham Biosciences 11-0011-57；

13.The Gold Sheet，2004，38，9；

14.Tanja Wolter and Andreas Richter，Assays for controllingHost-cell impurities in Biopharmaceuticals，BioProcess technical；

15.侯继锋，程雅琴，不同方法测定基因工程药物中中国仓鼠卵巢细胞蛋白残留量的比较与分析，中国生化药物杂志，23(2002)168-170；

16.徐成林，唐巧英，原代地鼠肾细胞乙脑疫苗中残余细胞基质的检测，中国生物制品学杂志，14(2001)48-50；

17.R.L.Fahrner，H.L.Knudsen，C.D.Basey，W.Galan，D.Feuerhelm，Vanderlaan，G.S.Blank，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.18(2001)301；

18.Konrad，M.Immunogenicity of proteins administered to humansfor therapeutic purposes.Trends Biotechnol.7(1989)175；

19.Andreas Stein，Ander Kiesewetter，Cation exchange chromatographyin antibody purification pH screening for optimised binding and HCPremoval，Journal of Chromatography B，848(2007)151-158；

20.任跃明，程雅琴，倪道明，静脉注射人免疫球蛋白的质量控制，中国生物制品学杂志，18(2005)73；

21.S.Gibert，N.Bakalara，X.Santarelli，Three step chromatographicprocedure for the production of a His-tag recombinant kinesinoverexpressed in E.coli，Journal of Chromatography B，737(2007)143-150；

22.Q Sepharose FF.Datafile GE Healthcare.17-0510-10；

23.Chiti，et al.Rationalization of the effects of mutations onprotein aggregation rate，Nature，424(2004)805-808；

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种采用复合层析介质纯化Fc融合蛋白的方法，经过长时间的摸索和大量的实验证明，该方法能够降低产物中污染性杂质的水平，提高了目标产物的纯度，有效保证了产物质量。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种采用复合层析介质纯化Fc融合蛋白的方法，其特征在于该方法选择离子交换疏水复合层析介质，调节层析缓冲系统的pH低于纯化目标蛋白的平均pI，同时调节该层析缓冲系统具有较高的离子强度，利用适当的层析条件，使纯化目标蛋白存在于流穿液中，而污染性杂质则吸附到复合层析介质上，收集所述的流穿液，从而纯化目标蛋白，有效的去除Fc融合蛋白的杂质。

本发明能够有效的去除亲和层析之后产品中的污染性杂质，提高了终产物质量，使其纯度达99％以上。同时采用的离子交换疏水复合层析介质经实践证明是一种高载量、高流速的介质，更加适合于工业生产。综上，本发明工艺衔接紧密，一步有效去除污染性杂质，具有稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化生产等特点。

附图说明

图1是Capto adhere层析色谱图；

图2是Superdex-200色谱图(MabSelect SuRe洗脱液)；

图3是Superdex-200色谱图(Capto adhere流穿液)；

图4是SE-HPLC色谱图(Capto adhere流穿液)；

以下结合附图和发明人给出的具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本发明的采用复合层析介质纯化Fc融合蛋白的方法，采用离子交换疏水复合层析介质，调节层析缓冲系统的pH低于纯化目标蛋白的平均pI，同时调节该层析缓冲系统具有较高的离子强度，通过有效的层析条件，使纯化目标蛋白存在于流穿液中，而污染性杂质(如宿主细胞蛋白、聚合体等)则吸附到复合层析介质上，一步收集该流穿液，从而纯化目标蛋白，有效的去除Fc融合蛋白的杂质。

具体包括以下步骤：

1)选用复合层析介质

复合层析介质是复合了离子交换作用和疏水作用的介质，其中离子交换作用是阴离子交换作用，优选强阴离子交换作用，其中疏水作用优选强疏水作用；

2)选择经Protein A亲和层析法纯化后的Fc融合蛋白，Protein A是天然蛋白质A或其功能性衍生物；

3)调节待纯化样品(含有目标蛋白)pH比所述目标蛋白平均pI低0.5-2.5个pH单位，同时调节其离子强度为10ms/cm～50ms/cm，高于常规离子交换介质所用的离子强度(0ms/cm～5ms/cm)；

应注意此pI指实际收获与纯化抗体的pI，不是只从氨基酸序列预计的pI。实际中许多纯化的抗体分子的多肽骨架被修饰了，例如糖基化。所述修饰可以是加入带电荷部分，从而改变该分子的pI。通过等点聚焦(IEF)测定产物抗体的pI，发现尤其是单克隆抗体蛋白翻译后加工形成的微小不均一性，以及糖基化形式的产物抗体导致更宽的pI范围，所有这些抗体在IEF凝胶中形成类似于成片的条带而非单一条带，至少大多数产物有特定(pI)数值。因此，按照本发明，“平均pI”是指pI处于上述pI优选范围内的抗体产物分子所共有的pI，其前提是假设这合理公平的代表了糖基化形式(抗体)的数量分布。

4)层析缓冲系统的pH值设为比所述目标蛋白的平均pI低0.5-2.5个pH单位，同时缓冲系统的离子强度设为10ms/cm～50ms/cm，高于常规离子交换介质所用的离子强度(0ms/cm～5ms/cm)；

5)层析流速设为100cm/h～600cm/h；使目标蛋白存在于流穿液中，而污染性杂质(如宿主细胞蛋白、聚合体等)则吸附到复合层析介质上。

6)一步收集所有流穿液中的目标蛋白，检测所收集的流穿液，其中蛋白单体的纯度至少为99％，至少去除1％以上的污染性杂质(如宿主细胞蛋白、聚合体形式蛋白)，目标蛋白的回收率至少为90％以上。

所述的Fc融合蛋白是动物细胞表达生产的Fc融合蛋白，即含抗体Fc结构的融合蛋白或IgG类抗体蛋白；其中，含抗体Fc结构的融合蛋白是对ProteinA有较高亲和力的物种蛋白，其中IgG类抗体蛋白可以是鼠源性的，或是人源化的嵌合抗体、CDR-移植抗体以及全人源化的工程抗体。

所述的Fc融合蛋白是基本上非凝聚的单体蛋白。

所述的Fc融合蛋白是由哺乳动物细胞培养表达的Fc融合蛋白，或CHO细胞培养表达的抗体类蛋白。Fc融合蛋白的pI至少为6.5或高于6.5。

本发明的凝聚物应理解为相同蛋白质的非共价结合，所述蛋白质可以由单链蛋白质或共价结合(例如通过二硫键结合)的均质或异质多条多肽构成。与衍生其的单体一样，本发明的凝聚物可溶于水溶液。例如，二聚体凝聚物是两个IgG分子的非特异性结合。凝聚物的形成与对天然蛋白质折叠和蛋白质四级结构的变形影响(因素)紧密相关。例如，加热与pH诱导的蛋白质折叠变性可引发凝聚。因此，给定蛋白的凝聚速率有高度特异性，取决于各蛋白折叠特定的攻击能量稳定性^[23]。

本发明采用的复合层析介质，是一种复合离子交换作用和疏水作用的介质，经申请人的实验证明，它是一种高载量、高流速介质。其动态载量可以达到75-300mg IgG/ml介质，流速可以达到600cm/h，相对于现有技术采用的离子交换层析介质更加适合于规模化生产。

缓冲液的pH设为不同于待纯化产物蛋白的pI或平均pI，所述pH使产物蛋白具有表面电荷，当接触或浸没于所述缓冲液中时，导致产物蛋白与复合介质的带电荷基团之间离子排斥。

缓冲液的离子强度使产物蛋白和污染性杂质具有不同的疏水特性，当接触或浸没于所述缓冲液中时，导致产物蛋白与复合介质的疏水基团之间疏水排斥，污染性杂质与复合介质的疏水基团之间疏水吸附。

以下是发明人给出的实施例，需要说明的是，本发明不限于这些实施例。

申请人采用改造的CHO细胞(TGLA)分泌的单克隆抗体进行抗体的纯化制备，该细胞是经基因工程改造的CHO细胞，能稳定高效表达抗CD20相关抗原的单克隆抗体。

用机械搅拌式生物反应器，大规模高密度悬浮培养TGLA细胞；首先澄清过滤细胞培养液，再采用MabSelect SuRe亲和层析一步吸附大规模细胞培养液中的抗体IgG，接着调节亲和洗脱液的pH和离子强度，然后通过复合介质Capto adhere，获取完全符合标准的单克隆IgG半成品。

本发明的工艺用连续纯化过程获取抗体，其工艺过程主要分以下几步：

1、细胞液澄清：去除100％的细胞及细胞碎片等有形物。

2、MabSelect SuRe亲和介质层析：初步纯化和浓缩目标产物。

3、Capto adhere复合层析介质：获取高纯度目标产物。

实验例：

1.细胞液澄清

采用0.22μm囊式滤器(PALL公司)，硅胶管、蠕动泵(保定兰格泵有限公司)，恒流速过滤CHO细胞培养上清，除去细胞及细胞碎片。

2.MabSelect SuRe亲和层析

利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将20ml MabSelect SuRe(GE Healthcare)亲和层析介质装载于XK16/20(GE Healthcare)层析柱中。以平衡缓冲液(20mM PB+150mM NaCl pH 6.0-7.0)充分平衡亲和层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导、pH保持稳定时开始上样，再以平衡缓冲液冲洗未结合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线和电导、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液(100mM柠檬酸缓冲液，pH 3.0-3.5)直接洗脱，收集洗脱液。

3.Capto adhere复合层析介质

将亲和层析洗脱液用1M Tris-HCl调节至pH 6-7，用NaCl调节离子强度至20ms/cm～50ms/cm。

利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，将20ml Capto adhere(GE Healthcare)复合层析介质装载于XK16/20(GE Healthcare)层析柱中。以平衡缓冲液(100mM柠檬酸-Tris缓冲液/160-320mM NaCl，pH 6.0-7.0)充分平衡Capto adhere复合层析柱，待280nm的紫外吸收回到基线，且电导、pH保持稳定时开始上样，再以平衡缓冲液冲洗未结合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基线和电导、pH保持稳定后，用洗脱缓冲液(100mM乙酸)直接洗脱。收集流穿液，即为目标蛋白。

4.ELISA测定HCP

本法采用Cygnus公司的HCP检测试剂盒(Immunoenzymetric Assay for theMeasurement of Chinese Hamster Ovary Host Cell Proteins，F015，CygnusTechnologies)。参照试剂盒说明书，具体操作步骤如下：

1)向每个离心管中分别加入200ul的标准品(0-75ng/ml)、对照品、检测样品；2)每个离心管中分别加入400ul的碱性磷酸酶标记的抗CHO HCP抗体；3)盖好离心管，混匀，室温孵育2小时；4)向96孔板条中转移已经反应好的以上混合液，每孔200ul；5)盖好板条，并放入密封的塑料袋，室温下180rpm转动孵育2小时；6)甩干板条中的液体，加清洗液350ul，再甩干，重复4次；7)每孔中加入200ul的显色剂；8)盖好板条，孵育90min；9)405/492nm读值。

5.凝胶过滤层析(SEC)测定测定D/A

利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)层析系统，以平衡缓冲液(20mMPB+150mM NaCl，pH 7.2)充分平衡Superdex-200柱，待280nm的紫外吸收回到基线和电导、pH保持稳定时开始上样，再以平衡缓冲液冲洗10个柱体积。

6.SE-HPLC测定产物纯度

利用自动化的Waters HPLC系统，以平衡缓冲液(100mM PB+100mMNa₂SO₄+0.05％NaN₃，pH 6.7)充分平衡TSKgel G3000SWXL柱(10个柱体积)，待280nm的紫外吸收回到基线和电导、pH保持稳定时开始上样，再以平衡缓冲液冲洗10个柱体积。

结果：

1.ELISA测定HCP

表1：Elisa测定Capto adhere层析过程中HCP结果

样品编号	1#	2#	3#
				HCP浓度(ng/mL)	368	26	235
样品浓度(mg/mL)	0.6685	0.3492	0.4901
				HCP含量(％)	0.0005	0.00007	0.00048
HCP含量(ppm)	551	74.4	480

注：1#MabSelect SuRe洗脱峰；2#Capto adhere流穿峰；3#Capto adhere洗脱峰。

表1显示，Capto adhere处理后，大部分HCP均与Capto adhere介质结合，并且在洗脱中收获(见图1)。经过1#样品与2#样品含量计算复合介质Captoadhere去除率为86.5％。处理后，产品中HCP残留量为0.00007％，远小于药典规定0.1％，并且低于100ppm，不会引起可能的免疫反应^[18]。可见，Captoadhere具有良好的去除HCP的效果。同时经计算该步骤回收率为95.7％(结果未列)。

2.Superdex-200测定D/A

表2Superdex-200测定Capto adhere层析过程中D/A结果

样品编号	1#	2#	3#
				D/A含量(％)	3.46	0.25	54.73

注：1#MabSelect SuRe洗脱液；2#Capto adhere流穿；3#Capto adhere洗脱。

对比Capto adhere纯化前后D/A含量，由表2显示以及图2，图3可见，在本发明条件下Capto adhere纯化抗体后，其D/A含量由3.46％降低为0.25％，去除率为92.8％。可见，Capto adhere复合层析介质能够有效地去除D/A，有效保证了产品质量。

3.SE-HPLC测定产物纯度

经SE-HPLC测定经过Capto adhere纯化后的产品纯度由面积积分计算为99.72％(见图4)。

Claims (9)

1.一种采用复合层析介质纯化Fc融合蛋白的方法，其特征在于该方法采用离子交换疏水复合层析介质，调节层析缓冲系统的pH低于纯化目标蛋白的平均pI，同时调节该层析缓冲系统具有较高的离子强度，利用适当的层析条件，使纯化目标蛋白存在于流穿液中，收集该流穿液，而污染性杂质则吸附到复合层析介质上。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法至少包括以下步骤：

1)层析缓冲系统采用复合层析介质，该复合层析介质是复合了离子交换作用和疏水作用的介质，其中离子交换作用是阴离子交换作用或强阴离子交换作用，其中疏水作用是强疏水作用；

2)选用经Protein A亲和层析法纯化后的Fc融合蛋白，Protein A是天然蛋白质A或其功能性衍生物；

3)调节待纯化样品pH比所述目标蛋白平均pI低0.5个pH单位～2.5个pH单位，同时调节其离子强度为10ms/cm～50ms/cm，高于常规离子交换介质所用的离子强度；

4)层析缓冲系统的pH值比所述目标蛋白的平均pI低0.5个pH～2.5个pH单位，同时缓冲系统的离子强度设为10ms/cm～50ms/cm，高于常规离子交换介质所用的离子强度；

5)层析用流速设为100cm/h～600cm/h，使目标蛋白存在于流穿液中，污染性杂质结合在复合层析介质上；

6)收集所有流穿液中的目标蛋白，所收集的流穿液中，流穿液中蛋白单体的纯度至少为99％，目标蛋白的回收率至少为90％以上。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Fc融合蛋白是动物细胞表达生产的Fc融合蛋白，即含抗体Fc结构的融合蛋白或IgG类抗体蛋白；其中，含抗体Fc结构的融合蛋白是对Protein A有较高亲和力的物种蛋白，其中IgG类抗体蛋白可以是鼠源性的，或是人源化的嵌合抗体、CDR-移植抗体以及全人源化的工程抗体。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Fc融合蛋白是基本上非凝聚的单体蛋白。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Fc融合蛋白是由哺乳动物细胞培养表达的Fc融合蛋白，或CHO细胞培养表达的抗体类蛋白。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Fc融合蛋白的pI至少为6.5或高于6.5。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH设为不同于待纯化产物蛋白的pI或平均pI，所述pH使目标蛋白具有表面电荷，当接触或浸没于所述缓冲液中时，导致目标蛋白与复合介质的带电荷基团之间离子排斥。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的离子强度使目标蛋白和污染性杂质具有不同的疏水特性，当接触或浸没于所述缓冲液中时，目标蛋白与复合介质的疏水基团产生疏水排斥，而污染性杂质与复合介质的疏水基团产生亲水吸附。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述收集的流穿液中蛋白单体的纯度至少为99％，且该纯度通过一步收集来实现，去除至少1％以上的污染性杂质。

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