CN108704127A

CN108704127A - 抗高致病性猪生殖与呼吸综合征(hp prrs)的疫苗

Info

Publication number: CN108704127A
Application number: CN201611130224.XA
Authority: CN
Inventors: 迈克尔.B.鲁夫; 埃里克.沃恩
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2008-08-25
Filing date: 2009-08-24
Publication date: 2018-10-26
Also published as: KR20110068980A; CN102316895A; CL2011000382A1; CA2734390A1; AU2009285843A1; KR101653177B1; US20110117129A1; RU2011110910A; EP2328612A1; WO2010025109A1; UA106475C2; BRPI0917887A2; JP2012500852A; EP2328612A4; WO2010025109A8; JP5890469B2; JP5619004B2; RU2561595C2; AU2009285843B2; JP2014193902A

Abstract

本发明涉及方法和减毒病毒组合物，它们用于预防和治疗与猪生殖与呼吸综合征(PRRS)，如高致病性猪生殖与呼吸综合征(HP PRRS)这种感染猪的疾病有关的高热型疾病形式。

Description

抗高致病性猪生殖与呼吸综合征(HP PRRS)的疫苗

本发明是基于申请日为2009年8月24日，申请号为“200980133325.4” (国际申请号为PCT/US2009/054775)，发明名称为“抗高致病性猪生殖与呼吸综合征(HP PRRS)的疫苗”的专利申请的分案申请。

序列表

本申请包含纸件形式和计算机可读形式的序列表，其教导和内容都引入本文作参考。

发明背景

技术领域

本发明总体上涉及抗传染病的疫苗。更具体地，本发明涉及抵抗高致病性猪生殖与呼吸综合征(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,HP PRRS)的疫苗，所述HP PRRS是一种感染猪的病毒性疾病。

背景技术

猪生殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)被认为是严重的猪疾病，特征在于怀孕母猪流产，或呼吸道窘迫 (distress)，尤其见于吃奶的猪(sucking pigs)。该病毒性疾病首先是在1987年的美国被发现，随后在欧洲发现，二十世纪九十年代早期在亚洲被鉴定。迄今，PRRS已在全球传播，在养猪的国家引起地方性流行，每年造成巨大经济损失。PRRS的病因是猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，其与小鼠的乳酸脱氢酶病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus,LDEV)，马动脉炎病毒(EAV)，以及猴出血热病毒(simian hemorrhagic fever,SHFV)，都属于套病毒目(Nidovirales)的动脉炎病毒科(Arteriviridae)。

PRRSV是一种小的包膜病毒，有近15.1–15.5kb的单链正链RNA (+ssRNA)基因组，包含至少8个开放读框(ORF)，编码约20个公认蛋白。该基因组还包含两个非翻译区(UTR)，位于5′-和3′-端。详言之，ORF1(ORF1a 和ORF1b)位于5′-UTR下游，占据了整个基因组的三分之二还多。ORF1a 是直接翻译，而ORF1b是通过核糖体进行的框架移动来翻译，产生大的ORF1ab聚蛋白，经蛋白水解而形成与病毒转录和复制机制有关的产物。 ORFs 2–7位于3′-UTR上游，编码一系列与病毒体有关的病毒结构蛋白，如包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)。这些蛋白都从亚基因组(sgmRNA)的3′-同末端套式组合(coterminal nested set)来翻译。

对来自全球不同地理区域的PRRSV分离物进行系统发生分析，结果清楚表明存在两种主要基因型：I型代表欧洲原型(Lelystad病毒,LV)，II型以北美株ATCC VR2332(其基因组序列参见GenBank登录号AY150564)为原型 (Murtaugh et al.,Arch Virol.1995；140:1451–1460)。此外，一些研究显示，ORF5 以及非结构蛋白2(NSP2)-编码基因(nsp2)可能代表PRRSV基因组中最具有遗传可变性的区域。VR2332的NSP2序列参见SwissProt登录号Q9WJB2 或SEQ ID NO:2。很多文献也记载了，不同的PRRSV株在致病性方面差异很大。

2006年，空前大规模地爆发了一种起源不明、带有PRRS症状的所谓“高热(highfever)”疾病，它传播了10个以上的省，感染了超过2,000,000头猪，约400,000例是致命的病例。与传统的PRRS不同，很多成年母猪也被这种“高热”病感染。这种非典型的PRRS大流行最初被认为是猪霍乱样疾病，表现出神经学症状(如战栗(shivering))，高热(40–42℃)，红斑转白疹(erythematous blanching rash)等。尸检联合免疫学分析清楚表明，多个器官受到高致病性 PRRSV感染，观察到严重的病理学改变(Tian et al.,PLoS ONE.2007；2(6):e526)。对分离的病毒进行全基因组分析，结果显示，这些PRRSV分离物归属于II型，且都与HB-1(PRRSV的中国株)高度同源(96.5％核苷酸同一性)，也与JX143高度同源(Yuan et al,2007International PRRS Symposium, Chicago)。JX143的基因组序列参见SEQ ID NO:1或EMBL/GenBank登录号 EU708726。还发现，这些病毒分离物包含特有的分子标记：在非结构蛋白 2(NSP2)之中间断有30个氨基酸的缺失(Tian et al.,PLoS ONE.2007；2(6): e526)。PRRS的“高热疾病”形式现也称“高致病性PRRS”或HP PRRS。

已有多篇文献描述了PRRS病毒(PRRSV)的分离，以及含改良活(减毒)PRRSV或灭活PRRSV的抗PRRS疫苗的制备(WO 92/21375,WO 93/06211,WO93/03760,WO 93/07898,WO 96/36356)。具体地，WO 93/03760 披露了PRRS病毒的分离、培养、减毒、以及制备相应疫苗的方法，尤其是PRRS II型原型分离物ATCC VR-2332。WO 96/36356披露了上述分离物的一种特别有用的减毒后代，是通过在猴细胞中进行一系列传代得到的，其已被保藏，保藏号为ATCCVR-2495。还可以从Boehringer Ingelheim以商标名PRRS MLV购买一种改良活(MLV)疫苗产品。另一种基于II型分离物的MLV疫苗可以以商标名PRRS ATP买到。

预防PRRS的合适策略是免疫接种。但是，目前尚不清楚是否免疫接种能有效抵抗HP PRRS，以及可以采用何种形式的疫苗。

发明描述

本发明人意外发现，减毒的PRRS II型病毒株可以用于对猪接种，保护猪免受与猪生殖与呼吸综合征有关的高热疾病形式的影响。对PRRS II型病毒减毒株的预防特征的鉴定使得能够治疗那些处在例如HP PRRS的高风险之中的猪。这样的免疫接种或治疗可能有助于减少那些与2006年毁掉中国猪产业、并导致灭杀将近两千万头猪的HP PRRS相似的其它HP PRRS爆发的概率或影响。

本发明一个方面在此提供预防性保护猪免受高热疾病影响的方法，包括对有相应需要的猪施用含有效量PRRS II型病毒，优选减毒PRRS II型病毒的致免疫组合物。所述组合物还可包含可药用载体。所述组合物还可包含佐剂。所述方法可以作为预防或治疗措施来使用。此外，给予有效量的所述致免疫组合物导致PRRS的高热疾病形式的发生率减少，或其临床症状的严重程度减弱。

还在此提供了对猪免疫接种以抵抗高热疾病的方法，包对猪施用含有效量PRRSII型病毒的致免疫组合物，所述病毒优选减毒的PRRS II型病毒。所述组合物还包含可药用载体。所述组合物还包含佐剂。所述用有效量致免疫组合物进行的免疫接种优选导致PRRS的高热疾病形式的发生率减少，或其临床症状的严重程度减轻。

所述高热疾病可以是与猪生殖与呼吸综合征有关的形式。猪生殖与呼吸综合征可以是高致病性的(“HP PRRS”)。HP PRRS或高热疾病形式可以在显示以下一或多种临床症状的猪中检测到：皮肤发红(rubefaction)，出血点 (blood spots)，瘀斑(petechiae)，红斑转白疹，和小脓包(pimple)，常见于耳，口，鼻，背，和大腿内侧(inner thigh)。其它常见症状可包括：高热(超过40℃)，抑郁(depression)，厌食(anorexia)，咳嗽(cough)，哮喘(asthma)，跛行(lameness)，战栗，呼吸道疾病，和腹泻(diarrhea)。HP PRRS由HP PRRS病毒引起。

本发明另一方面在此提供了包括预防性保护猪免受HP PRRS感染的方法，包括对有相应需要的猪施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫组合物，所述病毒优选减毒的PRRSII型病毒。

于2002年在中国变得明朗的作为PRRS 2型基因型成员的HP PRRS病毒与所谓高热疾病有关。HP PRRS病毒因此在中国数省变得突出，表明在受感染的猪群内传播时，相比于其它PRRS病毒而言有选择优势。

术语“HP PRRS病毒”是指，但不限于，具有与SEQ ID NO:1基本相同的核苷酸序列的PRRS病毒株。优选地，HP PRRS病毒是具有与SEQ ID NO:1 基本相同的核苷酸序列的PRRS病毒株。与SEQ ID NO:1基本相同是指， PRRS病毒株的核苷酸序列优选包含与SEQ ID NO:1有85％-100％相同的序列，优选在HP PRRS病毒并非本文所述PRRS II型病毒的条件下，例如与作为参考病毒分离物的VR2332相比，ORF 5的核苷酸同源性低于91％，优选低于92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％。HP PRRS病毒株核苷酸序列优选有超过80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,or 89％与SEQ ID NO:1相同，同样优选在HPPRRS病毒并非本文所述PRRS II型病毒的条件下，例如与作为参考病毒分离物的VR2332相比，ORF 5的核苷酸同源性低于91％，优选低于92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％。还更优选地，PRRS病毒株核苷酸序列有超过90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或超过99％与SEQ ID NO:1相同，优选在HP PRRS病毒并非本文所述PRRSII型病毒的条件下，例如与作为参考病毒分离物的VR2332 相比，ORF 5的核苷酸同源性低于91％，优选低于92％,93％,94％,95％,96％, 97％,98％或99％。

术语HP PRRS病毒还指任何在NSP2蛋白中具有指定修饰的PRRS病毒株。根据该定义，HP PRRS病毒株是编码NSP2蛋白的PRRS病毒株，其中对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置482的亮氨酸缺失，而且它引起高热临床症状。或者，或除了SEQ ID NO:2的氨基酸位置的亮氨酸缺失以外，对应于 SEQ ID NO:2的氨基酸534-562的氨基酸可以从PRRS病毒编码的NSP2蛋白中删除。在此上下文中，SEQ ID NO:2也应被理解为是一种举例，术语 NSP2蛋白不应限于SEQ ID NO:2所示的NSP2蛋白。根据以上教导，本领域技术人员很容易在具有与SEQID NO:2不同的NSP2蛋白序列、但具有相同修饰的PRRS病毒株中鉴别出任意相应修饰，这意味着，缺失与SEQ ID NO:2的482位亮氨酸对应的亮氨酸，和/或缺失与SEQ ID NO:2的氨基酸 534-562对应的氨基酸。

此外，术语HP PRRS病毒还指，具有与SEQ ID NO:1(如上述定义)基本相同的核苷酸序列、且编码NSP2蛋白的PRRS病毒株，其中与SEQ ID NO:2 的氨基酸位置482的亮氨酸对应的氨基酸，和/或与SEQ ID NO:2的氨基酸 534-562对应的氨基酸从PRRS病毒编码的NSP2蛋白中删除。

此外，术语HP PRRS病毒还指，作为具有与SEQ ID NO:1基本相同核苷酸序列的PRRS病毒株的HP PRRS病毒，在HP PRRS病毒并非本文所述 PRRS II型病毒的条件下，例如与作为参考病毒分离物的VR2332(如上述) 相比，ORF 5的核苷酸同源性低于91％，优选低于92％,93％,94％,95％,96％, 97％,98％或99％，且编码NSP2蛋白，其中与SEQ ID NO:2的氨基酸位置 482的亮氨酸对应的氨基酸和/或与SEQ ID NO:2的氨基酸534-562对应的氨基酸从PRRS病毒编码的NSP2蛋白中删除。

此外，术语HP PRRS病毒还指，作为具有与SEQ ID NO:1基本相同核苷酸序列的PRRS病毒株的HP PRRS病毒，优选在HP PRRS病毒并非本文所述PRRS 2型病毒的条件下，例如与作为参考病毒分离物的VR2332(如上述)相比，ORF 5的核苷酸同源性低于91％，优选低于92％,93％,94％,95％, 96％,97％,98％或99％，且编码NSP2蛋白，其中与对应于氨基酸位置536-550 或546-560或476-490的肽反应的抗体显示无反应性。

此外，以下PRRS病毒分离物已知是HP PRRS病毒株。因此，术语HP PRRS病毒株在本文中应包括这些病毒株中的任一种，以及它们的后代：HP PRRS病毒株AH-1；AHCFSH；AHCFZC；BB07；BD-8；BQ07；CL07；CX07； CZ07；FY060915；FY080108；GC-2；GCH-3；GD1；GD2；GD2007；GD3；GD4； GDSD1；GDY1-2007；GDY2-2007；GDYF1；GS2008；GXHZ12；GXHZ13； GXHZ14；GXHZ16；GXHZ19；GXHZ2；GXHZ21；GXHZ4；GXLZ5；GXLZ7； GY；GZCJ；GZDJ；GZHW1；GZHW2；GZHX；GZJS；GZKB；GZKY；GZLJ1； GZWB；GZWM；GZZB；Hainan-1；Hainan-2；HB1；HB2；HB3；HB-Tsh1；HB-Xt1；HEN46；HeN-KF；HeN-LH；HeN-LY；HLJDF；HLJMZ1；HLJMZ2； HLJMZ3；HLJZY；HM-1；HN2；HN2007；HN3；HNld；HNly；HNLY01；HNNX01；HNPJ01；HNsp；HNXT1；HNyy；HNyz；HQ-5；HQ-6；HUB；HuN； HUN1；HUN11；HUN15；HUN16；HUN17；HUN2；HUN3；HUN4；HUN5； HUN6；HUN7；Hunan-1；Hunan-2；Hunan-3；HUNH2；HUNH4；HuNhl；HUNL1； HUNX4；HZ061226；HZ070105；Jiangsu-1；Jiangsu-2；Jiangsu-3；Jiangxi-2； Jiangxi-4；JLYS；JN；JX1；JX143；JX2；JX-2；JX2006；JX3；JX4；JX5；JXA1； KS06；LC07；LJ；LS06；LS-4；LY07；NB070319；SC07；SD；SD14；SDWF2；SH02；ST-7；SX2007；SY0608；TJDMJ；TJZHJ2；TJZHJ3；TQ；TQ07；TWO7； WF07；XJ07；XL2008；YN2008；YNBS；YNDL；YNMG；YNWS；YNYS； YNYX1；YNYX3；ZJ06；ZJCJ；ZJWL；ZX07；ZS070921。后代是指，但不限于，来源于上述任一种亲代病毒、且与相应的亲本病毒株有超过86％,87％,88％, 89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％和99％的核苷酸序列同一性的病毒。

术语“PRRS II型病毒”是指，但不限于，与作为ATCC-VR2332保藏的病毒分离株或其任何后代基本相同的PRRS病毒株。基本相同在本文中是指，编码ORF5蛋白的核苷酸序列与作为ATCC-VR2332保藏的病毒分离株的核苷酸序列、即SEQ ID NO:3所示序列有85％-100％相同。ORF5核苷酸序列优选与SEQ ID NO:3有超过86％,87％,88％,或89％相同。还更优选地，ORF5 核苷酸序列与SEQ ID NO:3有超过90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或超过99％相同。优选地，本文所用PRRS II型病毒是，与作为 ATCC-VR2332保藏的病毒分离株或其任何后代(如上述)基本相同、但在与 SEQ ID NO:2之氨基酸534-562对应的氨基酸的NSP2基因中不具有缺失的 PRRS病毒株。PRRS病毒ATCC-VR2332的完整序列可见于GenBank登录号U87392。

术语PRRS II型病毒还应包括来源于上述任一种PRRS II型病毒株的任何减毒病毒。例如，术语PRRS II型病毒还应包括作为ATCC-VR2495保藏的PRRS II型病毒。此外，减毒的PRRS II型病毒可以是作为ATCC-VR2332 保藏的病毒分离株的任何减毒后代。在一些优选形式中，PRRS II型病毒和可药用载体可以是Boehringer Ingelheim Vetmedica,Inc.(St.Joseph,MO)的PRRS MLV疫苗(系列号JA-A64A-149)。术语PRRS II型病毒还可包括已知为如下的分离物：HB-1；BJ-4；CH-1a；CH-1R；CH-1R01；HB-2；HN1； HT06；HZ07；LS05；LY03；NH04；PL97-1；S1；SH061130；SX071226；TW07-1；WF03；XX03；ZJJ04；ZJJ05；ZJJ07，它们都是起源于中国的非-HP PRRS病毒株。

本发明另一方面在此提供了包括预防猪感染HP PRRS的方法，包括对有该需要的猪施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫组合物，所述病毒优选减毒PRRS II型病毒，其中所述PRRS II型病毒是与作为ATCC-VR2332保藏的病毒分离株或其任何后代基本相同的PRRS病毒株。优选地，PRRS II 型病毒在与SEQ ID NO:2之氨基酸534-562对应的氨基酸的NSP2基因中不具有缺失。还更优选，PRRS II型病毒是作为ATCC-VR2495保藏的减毒PRRS II型病毒。此外，PRRS II型病毒是PRRS MLV疫苗(系列号 JA-A64A-149)的病毒。

PRRS II型病毒的有效量可以是该病毒在施用了有效剂量的该病毒的动物中激发或能够激发免疫应答的量。有效量可取决于疫苗的成分和给药时间表。如果采用灭活病毒或改良活病毒制剂，可以推荐每剂含约10^2.0-10^9.0 TCID₅₀(组织培养感染剂量50％终点)，更优选10^3.0-10^4.0TCID₅₀，还更优选，约10^4.0-10^8.0TCID₅₀的疫苗量。

本文所述PRRS II型病毒可以作为PRRS II型病毒的灭活的完整被杀灭病毒或减毒形式用于在猪中预防本文所述高热疾病的影响。此外，亚单位，包括PRRS II型病毒的免疫原性片段或组分，也可用于于在猪中预防高热疾病的影响。

本文所述减毒PRRS II型病毒可以是，在可药用载体中含一或多种活的上述病毒株的改良活疫苗(MLV)。此外，或或者，可以用灭活病毒制备上述被杀灭的疫苗(KV)。MLV可以被配制为允许每剂给予10¹-10⁷个病毒粒子，更优选10³-10⁵个病毒粒子，还更优选10⁴-10⁵个病毒粒子。KV可以按照每剂10³-10¹⁰,10⁴-10⁹,10⁵-10⁸,或10⁶-10⁷个病毒粒子的预灭活滴度来配制

PRRS II型病毒，优选减毒的PRRS II型病毒，可以在猪暴露于引起HP PRRS的PRRS病毒株之前作为预防措施来施用，在猪暴露于引起HP PRRS 的PRRS病毒株的同时施用，或在猪暴露于引起HP PRRS的PRRS病毒株之后作为治疗措施来施用。目标猪可以表现HP PRRS或上述高热疾病形式的一或多种临床症状或常见表现。目标猪可以特别易感于与HP PRRS有关的高热疾病。目标猪可以特别易感于HP PRRS。目标猪可以因免疫缺陷而易感于HPPRRS。目标猪可以因饲养场地而易感于HP PRRS。易感的猪可以是在中国饲养的。易感的猪可以是在中国的诸如江西省、河北省或上海市饲养的。见Tian et al.,PloS ONE.2007；2(6):e526，其内容引入本文做参考。减毒的PRRS II型病毒可以通过注射、吸入、或植入来给药，特别优选注射。根据免疫接种和治疗所需持续时间以及效力，PRRS II型病毒，优选减毒PRRS II型病毒，可以施用一次或数次，也是间歇地，例如按每日施用的基础施用数日、周、或月，并且是施用不同的剂量。这其中，优选施用单一剂量。注射可以是在末梢静脉或中央静脉，以所需量进行，或者连续输注。PRRS II型病毒，优减毒PRRS II型病毒，可以口服、胃肠外给药、皮下给药、肌肉给药、皮内给药、舌下给药、透皮给药、直肠给药、透粘膜给药、局部吸入、口腔给药(buccal administration)，或采用组合方式。PRRS II型病毒，优选减毒PRRS II型病毒还可以作为植入物来给药，其可以允许释放减毒病毒。肌肉注射可以应用0.5-3mL，更优选1-2.5mL，还更优选1.5-2mL。最优选肌肉注射2mL。皮内注射可以应用0.05-1mL，更优选0.1-0.8mL，还更优选0.1-0.5mL，还更优选0.2-0.4mL。最优选皮内注射0.2mL。鼻内应用可以是0.5-5mL，更优选1-4mL，还更优2-3mL PRRS II型病毒。最优选鼻内应用3mL。

可药用载体可包括溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、保存剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂，吸收延迟剂，等等中的任一种或全部。

“佐剂”在本文中可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷(saponin)如Quil A， QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)，GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)，油包水乳剂，水包油乳剂，水包油包水乳剂。乳剂可尤其基于轻液体石蜡油(欧洲药典(European Pharmacopea)类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油，油酸乙酯，丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)，甘油三-(辛酸酯/葵酸酯) 或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(例如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol) 的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等,The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.).JohnWiley and Sons,NY,pp51-94(1995)and Todd et al.,Vaccine 15:564-570(1997)。

例如，可使用"Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach"，M.Powell和M.Newman编，Plenum Press,1995的第147页描述的SPT乳剂，以及该书第183页所述的MF59乳剂。

另一例佐剂是从丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。有利的佐剂化合物是交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联。这些化合物已知被称为卡波姆(Phameuropa Vol.8,No.2,June 1996)。本领域技术人员还可参见美国专利2,909,462，它描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基，烯丙基，和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售；(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中，可提及卡波普974P,934P和971P。最优选使用卡波普971P。在顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的众多共聚物中，顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)也可以考虑。这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。

其它合适的佐剂包括，但不限于，α-生育酚醋酸酯，RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)，Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)，SAF-M(Chiron,Emeryville CA)，单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)，Avridine脂质-胺佐剂，大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)，霍乱毒素，IMS 1314或胞壁酰二肽，等等。

优选地，佐剂添加量为约100μg-约10mg/剂。还更优选地，佐剂添加量为约100μg-约10mg/剂。还更优选地，佐剂添加量为约500μg-约5mg/ 剂。还更优选地，佐剂添加量为约750μg-约2.5mg/剂。最优选地，佐剂添加量为约1mg/剂。

本文还提供了制备减毒PRRS II型病毒的方法，所述病毒能治疗或免疫目标猪以抵抗HP PRRS。所述方法可包括一或多个下述步骤：(a)将ATCC-VR2332或与ATCC-VR2332基本相同的任何PRRS II型传代，如下述，以修饰病毒，使病毒无毒力、且能免疫目标猪以抵抗HP PRRS，(b)收获产病毒的细胞或细胞培养物，(c)向该产病毒的培养物中添加稳定剂；和/或(d) 冻干所述产病毒的培养物。病毒传代可以包括传统的繁殖和选择技术；例如，在稳定的宿主细胞中持续繁殖以延伸减毒表型。传代可以产生具有获得性突变的病毒株，其中很多并不显著改变亲代株的特性。减毒PRRS II型病毒可以是，在宿主细胞中，将ATCC-VR2332或与ATCC-VR2332基本相同的任何PRRS II型传代至少60,65,70,75,80，或更多次后得到的。减毒的PRRS II型病毒可以是，在宿主细胞中，将ATCC-VR2332或与ATCC-VR2332基本相同的任何PRRS II型传代50-100次，60-90次，70-80次，或65-75次而得到的。减毒PRRS II型病毒可以是，在宿主细胞中，将ATCC-VR2332或与ATCC-VR2332基本相同的任何PRRS II型传代70或75次而得到的。合适的宿主细胞可包括猴(simian)细胞系，Vero细胞，或猪肺泡巨噬细胞。优选的猴细胞系是MA-104。宿主细胞可以是细胞培养物。细胞系可以用需要传代的病毒感染。每次传代可能需要将所得的被病毒感染的细胞系或细胞培养物在34℃-40℃，更优选35℃-39℃，还更优选36℃-38℃，还更优选 35℃-37℃温育。最优选，每次传代可能需要将所得的被病毒感染的细胞系或细胞培养物在37℃温育。收获步骤可以包括冷冻被病毒感染的细胞培养物。冻干可以包括，将被病毒感染的细胞培养物的冻存样品抽除水分(subliming moisture)。

病毒修饰也可以用于产生减毒的PRRS II型病毒，可以通过用合适的基因工程技术直接突变该病毒株的核酸序列来实现。这样的技术可以利用构建病毒基因组的全长互补核酸拷贝的技术，所述拷贝可以用核酸重组和操作方法进行修饰。这样的方法可以利用定点诱变技术。病毒蛋白的抗原性位点或酶特性因此被修饰。

本文还提供了进行上述任一种方法的试剂盒。该试剂盒可包含容器，致免疫组合物(优选含减毒PRRS II型病毒)，可药用载体，佐剂，以及对有相应需要的动物施用该致免疫组合物、以减少PRRS感染的发生率或减轻其临床症状的严重程度的说明，和优选地，PRRS的高热疾病形式或HP-PRRS。该试剂盒还可包含注射工具和/或另一种给药形式的用途。该试剂盒还可包含溶剂。减毒的疫苗可以冻干，并可以用该溶剂重建，得到注射溶液和/或吸入溶液。所述溶剂可以是水，生理盐水，缓冲液，或辅助溶剂。所述试剂盒还可包含分开的多个容器，用于容纳减毒病毒，溶剂，和/或可药用载体。所述说明可以是传单(leaflet)和/或贴在一或多个容器上的标签。

附图说明

图1描述如何对肺进行评分，以及通过目测肺炎评估受感染区域所占百分比；

图2比较了接种组和未接种组的猪的直肠温度；

图3比较了接种组和未接种组的猪的平均S/P比，其中，用平均组ELISA S/P比恒量各个组对PRRSV的血清学反应；

图4比较了接种组和未接种组的猪的组平均临床评分，其中，记录了接种组和未接种组的猪的呼吸疾病评分；

图5比较了接种组和未接种组的猪的平均日增重(ADG)；和

图6概述了接种MLV的猪和未接种/受攻击的猪中PRRSV RT-PCR阳性区域的百分比。

发明详述

定义

本文所用术语仅仅是为了描述具体的实施方式，不应被理解为限制。如说明书和权利要求中所用，除非另有明确说明，单数形式“a,”，“and”和“the”包括复数含义。

就本文引述的数值范围而言，居间的每一个具有相同精确程度的中间数值都明确要考虑。例如，对于6-9这个范围，除了6和9以外，7和8也要考虑，对于6.0-7.0这个范围，数值6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6,9, 和7.0都要明确考虑。

“减毒病毒”在本文中可以表示不引起PRRS病的临床症状、但能在目标哺乳动物中诱导免疫应答的无毒力病毒，还可以表示，被减毒PRRS病毒感染的动物与被非减毒的这种病毒感染、且未接受该减毒病毒的“对照组”动物相比，临床症状的发生率减少或严重程度减轻。在该上下文中，术语“减少”表示，与上述对照组相比，减少至少10％，优选25％，更优选50％，最优选优选超过100％。

“免疫原性片段”在本文中可表示，PRRS II型病毒的能在宿主中激发抗 PRRSV免疫应答(包括细胞免疫应答和/或抗体介导的免疫应答)的肽或多肽或核酸序列的一个部分。

“相同”或“同一性”在本文中描述两个或更多个多肽或核苷酸序列时，可以表示，这些序列在特定区域具有特定百分比的相同残基或核苷酸。所述百分比可以如下计算：优化地比对这两个序列，比较这两个序列的所述特定区域，确定这两个序列中出现相同残基的位置的数量，以此得到匹配位置数，将该匹配位置数除以该特定区域的位置总数，将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。当这两个序列长度不同，或比对时出现一或多个错开的末端，以及所比较的该特定区域仅包括单个序列时，将单个序列的残基包括在计算公式的分母而非分子中。

PRRS分离株ATCC VR-2332于1991年7月18日按照布达佩斯条约的规定保藏在美国典型培养物保藏中心(美国马里兰州，Rockville)，保藏号为 ATCC VR-2332，分类命名为SIRS病毒，BIAH-001。

PRRS分离株ATCC VR-2495于1995年1月28日按照布达佩斯条约的规定保藏在美国典型培养物保藏中心(美国马里兰州，Rockville)，保藏号为 ATCC VR-2495，分类命名为PRRS病毒-减毒，BIAH 12793。

“致免疫组合物”或“疫苗”在本文中表示一种组合物，其包含PRRS II型病毒(MLV或灭活病毒)或其任何免疫原性片段或组分，优选减毒PRRS II型病毒，如Ingelvac PRRSMLV或Ingelvac PRRS ATP，其在宿主中激发“免疫应答”，是抗PRRSV的细胞免疫应答和/或抗体介导的免疫应答。优选地，该致免疫组合物能赋予保护性免疫力以抵抗PRRSV感染和与此相关的临床症状。

“激发免疫学应答或免疫应答”在本文中是指，针对致免疫组合物或疫苗的任何细胞免疫应答和/或抗体介导的免疫应答，所述致免疫组合物或疫苗被施用给接受该致免疫组合物或疫苗的动物。通常，"免疫应答"包括但不限于下列一或多种效应：产生或激活抗体，B细胞，T辅助细胞，T抑制细胞，和/或细胞毒T细胞和/或yd T细胞，它们特异性针对目标组合物或疫苗中所含的一或多种抗原。优选地，宿主表现出治疗性或保护性免疫学应答，从而与未接受所述致免疫组合物或疫苗的对照相比，增强对新感染的抵抗力，和/或减弱疾病的临床严重程度。这样的保护作用通过上述与宿主感染有关的症状的发生率减少、或严重程度减弱、或直至症状消失来证实。

“保护性免疫力”在本文中是指，一组动物对PRRS(优选HP PRRS)感染的抵抗力与对照组动物相比增强，所述对照组动物被HP PRRS感染、但未接受含PRRS(优选PRRS II型)的致免疫组合物或疫苗。术语“抵抗力增强”在本文中是指，接受本发明致免疫组合物或疫苗的动物，与感染了PRRS但未接受所述致免疫组合物或疫苗的一组动物相比，有不到10％，优选不到 20％，更优选不到30％，更优选不到40％，更优选不到50％，更优选不到 75％，更优选不到100％，出现一或多种与高热(优选本文所述HP PRRS所致高热)有关的临床症状。

"基本互补"在本文中可以表示，第一个序列在有8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80, 85,90,95,100个或更多个核苷酸的区域内，至少60％,65％,70％,75％,80％, 85％,90％,95％,97％,98％或99％与第二个序列的互补序列相同，或这两个序列在严格杂交条件下杂交。

"基本相同"在本文中可以表示，第一个序列和第二个序列，在有8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,30,35,40,45,50,55,60, 65,70,75,80,85,90,95,100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内，有至少 60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,97％,98％或99％相同，或者，在核酸的情况下，第一个序列与第二个序列的互补序列基本互补。

“猪(Swine)”，“猪(pig)”和“猪(piglet)”在本文中可互换使用。

“接种”是指，在暴露于PRRS的高热疾病形式或HP-PRRS之前，施用本文所述致免疫组合物或疫苗。

“保护”或“保护作用”是指，因被施用本发明的致免疫组合物，使 HP-PRRS感染或PRRS的高热疾病形式的临床症状的严重程度减弱或发生率减少。严重程度的减弱或发生率的减少，是与一或多个未接受本发明致免疫组合物的动物相比。

优选实施方案

以下实施例描述了本发明优选的材料和方法。尽管与本文所述相似或等同的任何材料和方法都可以用于实施或检验本发明，这里描述的是优选的方法，装置，和材料。但是，应理解，这些实施例只是以举例说明的形式提供，它们中的任何内容都不应被视为限制本发明的总体范围。

实施例

以下实施例举例说明PRRSV分离物JX143的强毒力特性。接种PRRS MLV的猪与未接种的猪相比，在用强毒力PRRSV株攻击后，100％存活，抗体应答水平显著较高，临床PRRS和病毒血症比例较低，肺损伤较不严重，临床症状较轻且持续时间较短，直肠温度高的时间较短。

1.材料和方法

1.1 疫苗和病毒

PRRS MLV疫苗(系列号JA-A64A-149)来自Boehringer IngelheimVetmedica。强毒力PRRSV分离物JX143由上海兽医研究所分离。 PRRSV JX143组织培养物(105.2TCID₅₀/ml)用DMEM稀释5倍，以便对猪进行接种。

1.2 引物和试剂

逆转录聚合酶和DNA序列梯从Tiangen biotechnology company购买。 2×PCRMix来自Dongsheng company。和引物来自Invitrogen company。

表1.RT-PCR扩增所用的引物

引物名称	序列
		SF14413	5’-CTGATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTG-3’(SEQ ID NO:4)
SR15497	5’-CAATTAAATCTTACCCCCACACGGTCG-3’(SEQ ID NO:5)
		Qst	5’-gagtgacgaggactcgagcgcattaaTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO:6)

1.3 动物来源和分组

从河南Muyuan养猪场购买50头29日龄猪。抵达当日采血样，进行RT-PCR(用于PRRSV和PCV 2)和ELISA(抗PRRSV试剂盒，IDEXX Laboratory,Inc.)这三项试验的每一项，结果证实，它们是PRRSV阴性和PCV2 阴性。称重后，将这些猪随机分配到组1，组2，或组3，各组分别有22， 14和14头猪。然后，根据这些猪的分组，在不同的隔间进行圈养。

1.4 免疫接种和病毒攻击

组1的22头猪(被接种/被攻击)在第0天肌肉接种单个2mL剂量的PRRSMLV疫苗。组2的14头猪(未接种/被攻击)在第0天注射2mL PBS。第28天，对组1和组2的猪，鼻内施用3mL经稀释的PRRSV JX143。组3的猪(未接种/未攻击)未被接种且未被攻击，作为严格阴性对照，它们在第28天注射3mL DMEM。在第14和42天，每组选2头猪，尸检，观察。剩下的猪在第49天尸检。

1.5 直肠温度

从第0天至第49天(攻击后21天)，每天在同一时间记录直肠温度。

1.6 血清学

在第0,7,14,21,28,32,42,和49天，从所有猪采血，用IDEXX PRRSV ELISA试剂盒测试抗PRRSV抗体。

1.7 临床评价

从第0-49天，每天监控这些猪，并就行为改变的程度，以及临床呼吸症状(包括呼吸和咳嗽)进行评分。临床症状评分系统见表2。

表2.临床症状评分系统

*呼吸：分值2(轻微)对应于浅呼吸(superficial respiration)，流鼻涕(nasaldischarge)，受刺激时异常的“重(thumping)”呼吸。分值3(严重)对应于快速浅呼吸，流鼻涕，开口呼吸，异常的“重”呼吸。

*行为：1.嘴、鼻、耳和腿内侧的皮肤变红，充血(congestion)，起红点，丘疹(papula)，2.抑郁，毛发硬(rough hair coat)，3.厌食，4.跛行，发抖(tremor)，惊厥(convulsion)，5.瘦弱(emaciated)。分值2对应于上述一或两项症状。分值3对应于上述三项以上症状。

*咳嗽：分值2对应于无痰的咳嗽。分值3对应于有痰的咳嗽(productive cough)。

1.8 生产力评价

在第0天(接种前)，第28天(攻击前)，第49天(攻击后21天)记录所有猪的体重。

1.9 在对免疫接种的猪进行攻击后，通过与攻击对照和阴性对照组相比，评价临床症状，肺损伤评分，和直肠温度来评估PRRS MLV 的效力。当1)直肠高温(41℃)超过3天，2)抑郁，厌食，结膜炎(conjunctivitis)，咳嗽，呼吸疾病，和3)肺炎很明显时，认为猪在临床意义上被PRRS感染。

1.10 肺损伤

在第49天(PRRSV攻击后21天)进行尸检。对每头猪，由检验者在不知情的情况下目测肺炎(水肿，充血，出血，肉质化(meaty)，以及硬纤维结构 (firm fibrous structure))，以此评价肺部受损面积(0-100％)。

1.11 PRRSV RNA检测和定量

在第0,7,14,21,28,32,35,42天，从组1的猪(被接种/被攻击)采血，在第28,32,35和42天，从组2的猪(未接种/被攻击)采血。用QIAamp viral RNA mini kit(QIAGEN)从每份140μL血样提取RNA。再用特异于PRRSV RNA (Genbank)保守区的引物-探针(Invitrogen)组合(表1)进行RT-PCR。

每个RT反应组成如下：12.5μL RNA模板,4μL dNTP,2μL 10倍缓冲液, 0.5μL引物Qst和1μL Quant逆转录酶。将此化合物在37℃水浴保温1小时，贮存在-20℃。然后用1μL该RT反应物，每种SF14413和SR1549引物各1μL，2μL 10倍缓冲液，2μL dNTP，5个rTaq聚合酶单位，加水补足总体积20μL后，进行PCR。将反应板在测序系统中于特定条件(94℃5min；然后按照94℃30秒，65℃30秒，72℃75秒，进行40个循环；最后72℃ 10min)下进行反应。PCR扩增的片段通过琼脂糖凝胶分离，在紫外光下检测。

1.12 用免疫组化检测PRRSV抗原

尸检后48小时内，用PRRSV抗-N-蛋白单克隆抗体(SR30或SDOW17) 和第二偶联抗体，在福尔马林固定且石蜡包埋的肺组织切片上进行免疫组化，以检测PRRSV特异性抗原。

2.结果

2.1 攻击后直肠温度的改变

接种强毒力PRRSV JX143后，接种组和未接种组的猪的直肠温度都很快升高。最高温为41℃，75％的猪在接种了攻击病毒后立刻发烧。接种组的猪的直肠温度在10天内降至攻击前的水平，而未接种/被攻击组的猪具有较长的发烧期，直肠温度维持高温的时间也显著更长(图2)。

2.2 血清学反应

用平均组ELISA S/P反应衡量各个组对PRRSV的血清学反应(图3)。阴性对照猪在整个研究期间保持PRRSV抗体阴性。在被接种/被攻击组，接种的10-14天后首次检测到所述抗体，S/P比值在接种(p.i.)的14天后≥0.4，20 头猪中有8头阳性，接种的21天后，被接种/被攻击组的20头猪有13头为阳性。被接种/被攻击组的最高S/P比值在攻击后观察到，且直至研究结束时都维持高位(ELISA S/P≈2)。未接种/被攻击的猪被攻击后迅速发生血清转换，在接种后7天时，12头猪有9头阳性，S/P比≥0.4。

2.3 临床症状

记录被接种/被攻击组和未接种/被攻击组的呼吸疾病评分(图4)。攻击后，被接种/被攻击组的20头猪有5头表现出呼吸症状和咳嗽，2头表现异常“重”呼吸。未接种/被攻击组的12头猪有8头在接种后的21天以前就死亡，未接种/被攻击组中剩余的猪显示严重呼吸症状和伴有异常“重”呼吸的咳嗽。未接种/被攻击的猪连续10天评分在6以上，最高分值达到7。被接种/被攻击的猪未出现明显临床症状，它们连续7天将高平均分值维持在4-5的范围。作为严格阴性对照，未接种/未攻击的猪未显示临床症状，它们的平均分为 3(正常)。

2.4 攻击前后的平均日增重

平均日增重(ADG)总结于图5。从0-28天，接种组(0.3301±0.0414Kg)和未接种组(0.3008±0.0653Kg)的ADG无显著差异。从第28(攻击日之前)-49天，接种组的猪具有与未接种/未攻击组的对照猪相似的ADG(0.3373±0.0800kg 比0.3484±0.0890kg)，而未接种/被攻击的猪的ADG低很多(0.0392±0.2398)。

2.5 接种效力

攻击后，MLV接种猪马上出现临床症状，平均临床分值为5，有3头以上的猪有直肠高温(41℃)和肺损伤。根据方法章节所述的评判标准，25％ (5/20)的MLV接种猪有PRRS，75％(15/20)的所述猪被保护。相反，所有未接种的猪在攻击后都有PRRS，8头猪在尸检前就已死亡。

表3.MLV接种的效力

2.6 肉眼可见的损伤

尸检时，未接种/被攻击组有4头幸存的猪可观察到损伤，包括肺衰竭/ 崩解(lungfailure/collapse)，斑驳的褐色(mottled tan)，充血，腹股沟(groin)、颌(jowl)、肠系膜(mesentery)的淋巴结肿大并充血，部分有肝坏死。被接种/ 被攻击组有一些猪具有类似但较不严重的损伤。未接种/未攻击的对照猪不具有肉眼可见的损伤。

2.7 总体肺损伤评分

MLV接种组的猪的总体肺损伤评分比未接种/被攻击的猪低得多，提示 MLV提供良好的保护作用以抵抗高致病性PRRSV接种(表4，其中宏观肺损伤的发生率为0-100％)。

表4.比较不同组的猪的宏观肺损伤严重性

2.8 检测病毒血症

PRRSV RT-PCR阳性血清百分比总结于图6。MLV接种组的猪60％在接种的7天后检测到病毒血症，攻击前降至20％。攻击后，所述接种的猪70％有病毒血症，在接种的7天后降至60％，在接种的21天后20％有病毒血症。相反，未接种/被攻击的猪100％在攻击后有病毒血症，且维持高水平，未接种/被攻击的猪在攻击后21天时70％有病毒血症。

2.9 用免疫组化检测抗原

在显微镜下观察显微肺损伤。所有被攻击的猪都可观察到被PRRSV感染的细胞。MLV-接种/被攻击的猪具有较少的被PRRSV感染的细胞。记录不同区域中的细胞总数和被PRRSV感染的细胞的数量。各组之间，细胞感染比率差别很大：未接种/被攻击的猪为23.34±4.691，被接种/被攻击的猪为 9.36±8.069，未接种/未攻击的猪为0.24±0.114(表5)。

表5.猪肺石蜡包埋块经免疫组化分析所观察到的PRRSV感染细胞

序列

SEQ ID NO:1(JX143,GenBank EU708726的序列)

SEQ ID NO:2(VR2332的NSP2,SwissProt登录号Q9WJB2)

PRRS VR2332的SEQ ID NO:3ORF5序列(GenBank登录号U87392)

序列表

<110> 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica,Inc)

<120> 抗高致病性猪生殖与呼吸综合征(HP PRRS)的疫苗

<130> P10-0115/WO/1

<150> US 61/091614

<151> 2008-08-25

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15373

<212> DNA

<213> PRRS病毒菌种JX143

<400> 1

atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60

ggcacagccc aaaacttgct gcacgggaac accctcctgt gacagccctc ttcaggggga 120

ttaggggtct gtccctaaca ccttgcttcc ggagttgcac tgttttacgg tctctccacc 180

cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc tagggtgttt 240

gtggcggagg gccaggtcta ctgcacacga tgtctcagtg cacggtctct ccttcctctg 300

aatctccaag ttcctgagct tggggtgctg ggtctatttt ataggcccga agagccactc 360

cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gtcgagtgct cccccgccgg ggcctgttgg 420

ctttctgcga tttttccgat tgcacgaatg actagtggaa acctgaactt tcaacaaaga 480

atggtgcggg tcgcagctga aatctacaga cccggccaac tcacccctac agttctaaag 540

actctacaag tttatgaacg gggttgtcgc tggtacccca ttgtcgggcc cgtccctggg 600

gtgggcgttt acgccaactc cctgcatgtg agtgacaaac ctttcccggg agcaactcat 660

gtgttaacca acttgccgct cccgcagagg cccaaacctg aggacttttg cccttttgag 720

tgtgctatgg ctgacgtcta tgacattggt cgtggcgctg tcatgtatgt ggccggagga 780

aaggtctctt gggcccctcg tggtgggaat gaagtgaaat ttgaacctgt tcccaaggag 840

ttgaagttgg ttgcgaaccg actccacacc tccttcccgc cccatcacgt agtggacatg 900

tccgagttta ccttcatgac ccctgggagt ggtgtctcca tgcgggttga gtaccaatac 960

ggctgcctcc ctgctgacac tgtccctgaa ggaaactgct ggtggcgctt gtttgactcg 1020

ctcccaccgg aagttcagta caaagaaatt cgccatgcta accaatttgg ctatcaaacc 1080

aagcatggtg tccctggcaa gtacctacag cggaggctgc aagttaatgg tcttcgggca 1140

gtgaccgaca cacatggacc tatcgtcata cagtacttct ctgttaagga gagttggatc 1200

cgccacctga agttggtgga agaacccagc ctccccgggt ttgaggatct cctcagaatc 1260

agggttgagc ccaatacgtc accactggct agaaaggatg agaagatttt ccggtttggc 1320

agtcataagt ggtacggtgc cggaaagaga gcaaggaaaa cacgctctgg tgcgactact 1380

atggtcgctc atcacgcttc gtccgctcat gaaacccggc aggccacgaa gcacgagggt 1440

gccggcgcta acaaggccga gcatctcaag cgctactctc cgcctgccga agggaactgt 1500

ggttggcact gcatttccgc catcgccaac cggatggtga attccaactt tgagaccacc 1560

cttcctgaaa gggtaaggcc ttcagatgac tgggccactg acgaggatct tgtgaacacc 1620

atccaaatcc tcaggctccc tgcggccttg gacaggaacg gcgcttgcgg tagcgccaag 1680

tacgtgctta aactggaggg tgagcattgg actgtctctg tgatccctgg gatgtcccct 1740

actttgctcc cccttgaatg tgttcagggt tgttgtgagc ataagggcgg tcttgtttcc 1800

ccggatgcgg tcgaaatttc cggatttgat cctgcctgcc ttgaccgact ggctaaggta 1860

atgcacttgc ctagcagtac catcccagcc gctctggccg aattgtccga cgactccaac 1920

cgtccggttt ccccggccgc tactacgtgg actgtttcgc aattctatgc tcgtcataga 1980

ggaggagatc atcatgacca ggtgtgctta gggaaaatca tcagcctttg tcaagttatt 2040

gaggattgct gctgccatca gaataaaacc aaccgggcta ctccggaaga ggtcgcggca 2100

aagattgatc agtacctccg tggcgcaaca agtcttgagg aatgcttggc caaacttgag 2160

agagtttccc cgccgagcgc tgcggacacc tcctttgatt ggaatgttgt gcttcctggg 2220

gttgaggcgg cgaatcagac aaccgaacaa cctcacgtca actcatgctg caccctggtc 2280

cctcccgtga ctcaagagcc tttgggcaag gactcggtcc ctctgaccgc cttctcactg 2340

tccaattgct attaccctgc acaaggtgac gaggttcatc accgtgagag gttaaattcc 2400

gtactctcta agttggaaga ggttgtcctg gaagaatatg ggctcatgtc cactggactt 2460

ggcccgcgac ccgtgctgcc gagcgggctc gacgagctta aagaccagat ggaggaggat 2520

ctgctaaaac tagccaacac ccaggcgact tcagaaatga tggcctgggc agctgagcag 2580

gtcgatttaa aagcttgggt caaaagctac ccgcggtgga cacctccacc ccctccacca 2640

agagttcaac ctcgcagaac aaagtctgtc aaaagcttgc cagaggacaa gcctgtccct 2700

gctccgcgca ggaaggtcag atccgattgc ggcagcccgg ttttgatggg cgacaatgtc 2760

cctaacggtt cggaagaaac tgtcggtggt cccctcaatt ttccgacacc atccgagccg 2820

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Trp Asp Val Val Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Thr Gln Thr Ile Lys

290 295 300

Leu Pro Gln Val Asn Gln Cys Arg Ala Leu Val Pro Val Val Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Leu Asp Asn Asn Ser Val Pro Leu Thr Ala Phe Ser Leu Ala

325 330 335

Asn Tyr Tyr Tyr Arg Ala Gln Gly Asp Glu Val Arg His Arg Glu Arg

340 345 350

Leu Thr Ala Val Leu Ser Lys Leu Glu Lys Val Val Arg Glu Glu Tyr

355 360 365

Gly Leu Met Pro Thr Glu Pro Gly Pro Arg Pro Thr Leu Pro Arg Gly

370 375 380

Leu Asp Glu Leu Lys Asp Gln Met Glu Glu Asp Leu Leu Lys Leu Ala

385 390 395 400

Asn Ala Gln Thr Thr Ser Asp Met Met Ala Trp Ala Val Glu Gln Val

405 410 415

Asp Leu Lys Thr Trp Val Lys Asn Tyr Pro Arg Trp Thr Pro Pro Pro

420 425 430

Pro Pro Pro Lys Val Gln Pro Arg Lys Thr Lys Pro Val Lys Ser Leu

435 440 445

Pro Glu Arg Lys Pro Val Pro Ala Pro Arg Arg Lys Val Gly Ser Asp

450 455 460

Cys Gly Ser Pro Val Ser Leu Gly Gly Asp Val Pro Asn Ser Trp Glu

465 470 475 480

Asp Leu Ala Val Ser Ser Pro Phe Asp Leu Pro Thr Pro Pro Glu Pro

485 490 495

Ala Thr Pro Ser Ser Glu Leu Val Ile Val Ser Ser Pro Gln Cys Ile

500 505 510

Phe Arg Pro Ala Thr Pro Leu Ser Glu Pro Ala Pro Ile Pro Ala Pro

515 520 525

Arg Gly Thr Val Ser Arg Pro Val Thr Pro Leu Ser Glu Pro Ile Pro

530 535 540

Val Pro Ala Pro Arg Arg Lys Phe Gln Gln Val Lys Arg Leu Ser Ser

545 550 555 560

Ala Ala Ala Ile Pro Pro Tyr Gln Asp Glu Pro Leu Asp Leu Ser Ala

565 570 575

Ser Ser Gln Thr Glu Tyr Glu Ala Ser Pro Pro Ala Pro Pro Gln Ser

580 585 590

Gly Gly Val Leu Gly Val Glu Gly His Glu Ala Glu Glu Thr Leu Ser

595 600 605

Glu Ile Ser Asp Met Ser Gly Asn Ile Lys Pro Ala Ser Val Ser Ser

610 615 620

Ser Ser Ser Leu Ser Ser Val Arg Ile Thr Arg Pro Lys Tyr Ser Ala

625 630 635 640

Gln Ala Ile Ile Asp Ser Gly Gly Pro Cys Ser Gly His Leu Gln Glu

645 650 655

Val Lys Glu Thr Cys Leu Ser Val Met Arg Glu Ala Cys Asp Ala Thr

660 665 670

Lys Leu Asp Asp Pro Ala Thr Gln Glu Trp Leu Ser Arg Met Trp Asp

675 680 685

Arg Val Asp Met Leu Thr Trp Arg Asn Thr Ser Val Tyr Gln Ala Ile

690 695 700

Cys Thr Leu Asp Gly Arg Leu Lys Phe Leu Pro Lys Met Ile Leu Glu

705 710 715 720

Thr Pro Pro Pro Tyr Pro Cys Glu Phe Val Met Met Pro His Thr Pro

725 730 735

Ala Pro Ser Val Gly Ala Glu Ser Asp Leu Thr Ile Gly Ser Val Ala

740 745 750

Thr Glu Asp Val Pro Arg Ile Leu Glu Lys Ile Glu Asn Val Gly Glu

755 760 765

Met Ala Asn Gln Gly Pro Leu Ala Phe Ser Glu Asp Lys Pro Val Asp

770 775 780

Asp Gln Leu Val Asn Asp Pro Arg Ile Ser Ser Arg Arg Pro Asp Glu

785 790 795 800

Ser Thr Ser Ala Pro Ser Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ser Phe Thr

805 810 815

Asp Leu Pro Pro Ser Asp Gly Ala Asp Ala Asp Gly Gly Gly Pro Phe

820 825 830

Arg Thr Val Lys Arg Lys Ala Glu Arg Leu Phe Asp Gln Leu Ser Arg

835 840 845

Gln Val Phe Asp Leu Val Ser His Leu Pro Val Phe Phe Ser Arg Leu

850 855 860

Phe Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Ser Pro Gly Asp Trp Gly Phe Ala Ala

865 870 875 880

Phe Thr Leu Leu Cys Leu Phe Leu Cys Tyr Ser Tyr Pro Ala Phe Gly

885 890 895

Ile Ala Pro Leu Leu Gly Val Phe Ser Gly Ser Ser Arg Arg Val Arg

900 905 910

Met Gly Val Phe Gly Cys Trp Leu Ala Phe Ala Val Gly Leu Phe Lys

915 920 925

Pro Val Ser Asp Pro Val Gly Ala Ala Cys Glu Phe Asp Ser Pro Glu

930 935 940

Cys Arg Asn Ile Leu His Ser Phe Glu Leu Leu Lys Pro Trp Asp Pro

945 950 955 960

Val Arg Ser Leu Val Val Gly Pro Val Gly Leu Gly Leu Ala Ile Leu

965 970 975

Gly Arg Leu Leu Gly Gly Ala Arg Cys Ile Trp His Phe Leu Leu Arg

980 985 990

Leu Gly Ile Val Ala Asp Cys Ile Leu Ala Gly Ala Tyr Val Leu Ser

995 1000 1005

Gln Gly Arg Cys Lys Lys Cys Trp Gly Ser Cys Ile Arg Thr Ala

1010 1015 1020

Pro Asn Glu Val Ala Phe Asn Val Phe Pro Phe Thr Arg Ala Thr

1025 1030 1035

Arg Ser Ser Leu Ile Asp Leu Cys Asp Arg Phe Cys Ala Pro Lys

1040 1045 1050

Gly Met Asp Pro Ile Phe Leu Ala Thr Gly Trp Arg Gly Cys Trp

1055 1060 1065

Ala Gly Arg Ser Pro Ile Glu Gln Pro Ser Glu Lys Pro Ile Ala

1070 1075 1080

Phe Ala Gln Leu Asp Glu Lys Lys Ile Thr Ala Arg Thr Val Val

1085 1090 1095

Ala Gln Pro Tyr Asp Pro Asn Gln Ala Val Lys Cys Leu Arg Val

1100 1105 1110

Leu Gln Ser Gly Gly Ala Met Val Ala Lys Ala Val Pro Lys Val

1115 1120 1125

Val Lys Val Ser Ala Val Pro Phe Arg Ala Pro Phe Phe Pro Thr

1130 1135 1140

Gly Val Lys Val Asp Pro Asp Cys Arg Val Val Val Asp Pro Asp

1145 1150 1155

Thr Phe Thr Ala Ala Leu Arg Ser Gly Tyr Ser Thr Thr Asn Leu

1160 1165 1170

Val Leu Gly Val Gly Asp Phe Ala Gln Leu Asn Gly Leu Lys Ile

1175 1180 1185

Arg Gln Ile Ser Lys Pro Ser Gly

1190 1195

<210> 3

<211> 603

<212> DNA

<213> PRRS病毒菌种ATCC VR2332

<400> 3

atgttggaga aatgcttgac cgcgggctgt tgctcgcgat tgctttcttt gtggtgtatc 60

gtgccgttct gttttgctgt gctcgccaac gccagcaacg acagcagctc ccatctacag 120

ctgatttaca acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctagc taacaaattt 180

gattgggcag tggagagttt tgtcatcttt cccgttttga ctcacattgt ctcctatggt 240

gccctcacta ccagccattt ccttgacaca gtcgctttag tcactgtgtc taccgccggg 300

tttgttcacg ggcggtatgt cctaagtagc atctacgcgg tctgtgccct ggctgcgttg 360

acttgcttcg tcattaggtt tgcaaagaat tgcatgtcct ggcgctacgc gtgtaccaga 420

tataccaact ttcttctgga cactaagggc agactctatc gttggcggtc gcctgtcatc 480

atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgaa ggtcatctga tcgacctcaa aagagttgtg 540

cttgatggtt ccgtggcaac ccctataacc agagtttcag cggaacaatg gggtcgtcct 600

tag 603

Claims

1.对猪进行接种以抵抗PRRS的高热疾病形式的影响的方法，包括对猪施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫组合物。

2.权利要求1的方法，其中所述PRRS的高热疾病形式来自中国PRRSV，所述中国PRRSV具有与HB-1或JX143的核酸序列至少95％同源的核酸序列。

3.权利要求1的方法，其中所述高热疾病形式由HP PRRS病毒引起。

4.权利要求1的方法，其中所述PRRS II型病毒是减毒的。

5.权利要求3的方法，特征在于，所述PRRS II型病毒是保藏号为ATCC VR-2332的病毒株的减毒形式，或其后代。

6.权利要求4的方法，特征在于，所述PRRS II型病毒是保藏号为ATCC VR-2495的病毒株的减毒形式，或其后代。

7.权利要求1的方法，其中所述中国PRRSV株选自：AH-1；AHCFSH；AHCFZC；BB07；BD-8；BQ07；CL07；CX07；CZ07；FY060915；FY080108；GC-2；GCH-3；GD1；GD2；GD2007；GD3；GD4；GDSD1；GDY1-2007；GDY2-2007；GDYF1；GS2008；GXHZ12；GXHZ13；GXHZ14；GXHZ16；GXHZ19；GXHZ2；GXHZ21；GXHZ4；GXLZ5；GXLZ7；GY；GZCJ；GZDJ；GZHW1；GZHW2；GZHX；GZJS；GZKB；GZKY；GZLJ1；GZWB；GZWM；GZZB；Hainan-1；Hainan-2；HB1；HB2；HB3；HB-Tsh1；HB-Xt1；HEN46；HeN-KF；HeN-LH；HeN-LY；HLJDF；HLJMZ1；HLJMZ2；HLJMZ3；HLJZY；HM-1；HN2；HN2007；HN3；HNld；HNly；HNLY01；HNNX01；HNPJ01；HNsp；HNXT1；HNyy；HNyz；HQ-5；HQ-6；HUB；HuN；HUN1；HUN11；HUN15；HUN16；HUN17；HUN2；HUN3；HUN4；HUN5；HUN6；HUN7；Hunan-1；Hunan-2；Hunan-3；HUNH2；HUNH4；HuNhl；HUNL1；HUNX4；HZ061226；HZ070105；Jiangsu-1；Jiangsu-2；Jiangsu-3；Jiangxi-2；Jiangxi-4；JLYS；JN；JX1；JX143；JX2；JX-2；JX2006；JX3；JX4；JX5；JXA1；KS06；LC07；LJ；LS06；LS-4；LY07；NB070319；SC07；SD；SD14；SDWF2；SH02；ST-7；SX2007；SY0608；TJDMJ；TJZHJ2；TJZHJ3；TQ；TQ07；TWO7；WF07；XJ07；XL2008；YN2008；YNBS；YNDL；YNMG；YNWS；YNYS；YNYX1；YNYX3；ZJ06；ZJCJ；ZJWL；ZX07；和ZS070921。

8.权利要求1-7之一的方法，其中所述组合物还包含佐剂。

9.对猪进行接种以抵抗PRRS病毒JX143的高热疾病形式的影响的方法，包括对猪施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫组合物。

10.减少PRRS的高热疾病形式的发病率或减轻其临床症状的严重程度的方法，包括对需要该方法处理的猪施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫组合物。

11.减少PRRS的高热疾病形式的发病率或减轻其临床症状的严重程度的方法，包括对需要该方法处理的猪施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫组合物，其中所述PRRS的高热疾病形式来自中国PRRSV，所述中国PRRSV具有与HB-1或JX143的核酸序列至少95％同源的核酸序列。

12.PRRS II型病毒对猪进行接种以抵抗PRRS的高热疾病形式的影响的用途，包括对猪施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫组合物。

13.权利要求12的用途，其中所述PRRS的高热疾病形式来自中国PRRSV，所述中国PRRSV具有与HB-1或JX143的核酸序列至少95％同源的核酸序列。

14.PRRS II型病毒用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于对猪进行接种以抵抗PRRS的高热疾病形式的影响，包括对猪施用含有效量PRRS II型病毒的致免疫组合物。

15.权利要求14的用途，其中所述PRRS的高热疾病形式来自中国PRRSV，所述中国PRRSV具有与HB-1或JX143的核酸序列至少95％同源的核酸序列。

16.检测PRRSV RNA的RT-PCR反应方法，其RT反应组成如下：12.5μL RNA模板,4μLdNTP,2μL 10倍缓冲液,0.5μL引物Qst和1μL Quant逆转录酶；将此化合物在37℃水浴保温1小时，贮存在-20℃；然后用1μL该RT反应物，每种引物各1μL，2μL 10倍缓冲液，2μL dNTP，5个rTaq聚合酶单位，加水补足总体积20μL后，进行PCR；将反应板在测序系统中于特定条件(94℃5min；然后按照94℃30秒，65℃30秒，72℃75秒，进行40个循环；最后72℃10min)下进行反应；PCR扩增的片段通过琼脂糖凝胶分离，在紫外光下检测。