UA124976C2 - Вакцина для захисту тварини свині від зараження вірусом prrs - Google Patents

Abstract

Винахід стосується вакцини для захисту тварини свині від зараження вірусом PRRS, де вакцина включає: (a) європейський вірус PRRS, що кодується полінуклеотидною молекулою SEQ ID NO: 5 або полінуклеотидною молекулою, яка є щонайменше на 90 % ідентичною до SEQ ID NO: 5, при цьому зазначений вірус був адаптований для росту в свинячих клітинах або несвинячих клітинах ссавців, які експресують свинячий рецептор CD163, до введення зазначеної вакцини тварині свині; (b) зазначену кодуючу полінуклеотидну молекулу; (c) зазначену полінуклеотидну молекулу у формі плазміди; або (d) вірусний вектор, який містить зазначену полінуклеотидну молекулу; в кількості, ефективній для вироблення імунозахисту проти інфекції, та носій, який придатний для ветеринарного застосування, і причому зазначена вакцина забезпечує легку та безпечну вакцинацію вже з моменту, коли порося одноденного віку або менше, і причому зазначена вакцина забезпечує тривалість імунітету протягом аж до 6 місяців.

Description

Галузь техніки винаходу

Представлений винахід передбачає вакцини, які захищають свиней різного віку, як самців, так і самок, від Європейських штамів вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (РКК5). Представлений винахід, зокрема, передбачає безпечну та ранню вакцинацію поросят до відлучення від матері, в тому числі від безпосередньо після народження (тобто тільки у віці близько 1 дня або менше) до трьохтижневого віку, в будь-який час, необов'язково, у комбінації з полівалентними комбінованими вакцинами для свиней, такими як двовалентні вакцини проти РЕКЗМ/Мусоріазєта Ппуорпештопіає (М.пуо), двовалентні вакцини проти

РЕКБЗМ/свинячого цирковірусу типу 2 (РСМ2), та тривалентні вакцини проти

РЕКБЗМ/М.пуо/РСМ2, або просто у вигляді моновалентної вакцини проти РЕКЗУ, причому компонент вакцини РКК5, як правило, відповідає його генотипу (та підтипам зазначеного генотипу), визнаним циркулюючим на Європейському континенті, та включає в себе як Західну

Європу, Середземноморські регіони, Скандинавські регіони, так і Східну Європу, такі країни як

Росія, Туреччина та Україна.

Представлений винахід в цілому направлено на нові класи атенуйованих європейських штамів РКК, які в модифікованій живій формі обидва є виключно безпечними та ефективними, коли їх вводять навіть наймолодшим тваринам як вакцини, і забезпечують дуже велику тривалість імунітету.

Передумови створення винаходу

Вірус репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (РКК5) характеризується абортами, мертвонародженням та іншими проблемами репродуктивної функції у свиноматок та молодих свиней (до першого опоросу), а також респіраторними захворюваннями у молодняку свиней. Збудником є РКЕ5 вірус (РЕКЗМ), представник родини Агіегімігідає та ряду МідомігаІев.

Нідовіруси представляють собою оболонкові віруси, які мають геноми, що складаються з одного ланцюга РНК з позитивною полярністю. Геномна РНК вірусу з позитивним ланцюгом РНК виконує подвійну роль як у зберіганні, так і у експресії генетичної інформації. Жодна ДНК не приймає участі у реплікації або транскрипції у нідовірусів. Неструктурні білки транслюються безпосередньо з геномної РНК нідовірусів у вигляді крупних поліпротеїнів та як наслідок розщеплюються вірусними протеазами на дискретні функціональні білки. 3'-котерминальний

Зо вкладений набір субгеномних РНК (сгРНК) синтезується з геному та використовується як інформаційні РНК для трансляції структурних білків. Таким чином, розмноження нідовірусної геномної РНК представляє собою комбінований процес реплікації геному та синтезу сгРНК.

В кінці 1980-х років, два різних генотипи вірусу з'явилися майже одночасно, один у Північній

Америці, а інший у Європі. Вірус РККЗ в даний час є ендемічним захворюванням майже у всіх країнах-виробниках свиней, і вважається одним з найбільш економічно важливих захворювань, що впливають на світову індустрію свинини. Крім того, високовірулентні генотипи були виділені в Китаї та сусідніх країнах, і такі генотипи, як правило, тісно пов'язані з генотипами Північної

Америки.

Незважаючи на значні успіхи в розумінні біології РЕК5М, боротьба з вірусом залишається складною. Вакцинація тварин в польових умовах виявилася в значній мірі неефективною. РКЕК5 зазвичай знову з'являється в імунізованих стадах, і більшість кампаній вакцинації проти РКЕ5М на фермі в кінцевому підсумку не в змозі контролювати захворювання.

Не обмежуючись теорією, інфікування свиней немутантного типу РКЕ5М або їх вакцинація живою атенуйованою формою цього патогену, на жаль, викликає тільки надлишковий виробіток не нейтралізуючих антитіл. Наприклад, протягом цього інтервалу часу генеруються тільки обмежені кількості клітин, які секретують інтерферон (ІЕМ)-у. Таким чином, РЕКЗБУ, очевидно, за своєю природою стимулює незбалансовану імунну відповідь, що відрізняється послідовно надмірним гуморальним (на основі антитіл) імунітетом, а також варіабельною і обмеженою, але потенційно захисною Т-хелперною (Ті) 1-подібною ІЄМ-у відповіддю. Однією з характеристик інфекції РКК5ЗУ, яка, скоріш за все, сприяє несбалансованому розвитку адаптивного імунітету, є відсутність адекватної вродженої імунної відповіді. Зазвичай інфіковані вірусом клітини секретують інтерферон І типу "ЕМ" (включаючи ІЄМ-с та ІЄМ-ВД), який захищає сусідні клітини від інфекції. Крім того, вивільнений ІЕМ типу І взаємодіє з піднабором наївних Т-клітин, щоб сприяти їх перетворенню на вірус-специфічні клітини, що секретують ІЕМ типу Ії (ЕМ-у). Навпаки, ІЕМ-а реакція свиней на вплив РЕКЗМ практично відсутня. Таке неефективне стимулювання продукування ІЕМ-са патогеном, як могло би очікуватися, значно впливає на характер адаптивної імунної відповіді господаря, оскільки ІЕМ-сж активує експресію гену ІЕМ-у. Відповідно, перший цитокін, ймовірно, контролює домінантний шлях, який сприяє розвитку адаптивного імунітету, а саме, опосередковані Т-клітинами відповіді ІЕМ-ВД та пік антивірусного імунного захисту. бо В зв'язку з цим стало очевидним, що ймовірний зв'язок між вродженим і адаптивним імунітетом під час вірусних інфекцій відбувається через особливий тип дендритних клітин, який має здатність продукувати велику кількість інтерферону типу І!, і відіграє критичну роль в поляризації функції Т-клітин. Зокрема, нечастий, але примітний тип дендритних клітин, - плазмоцитоїдні дендритні клітини (РОС), також відомі як природні клітини, що продукують ІЕМ- а/В, відіграють критичну роль у противірусному імунітеті за рахунок їх здатності провокувати наївні Т-клітини диференціюватися в клітини, що секретують ІЕМ-у. Незважаючи на рідкість,

РОС є надзвичайно потужними продуцентами ІЕМ-са, причому кожна клітина здатна продукувати 3-10 пг ІЕМ-с« у відповідь на вірус. Навпаки, моноцити продукують у 5-10 разів менше ІЄМ-с у перерахунку на клітину. фенотип та деякі біологічні властивості свинячого РОС були описані (Зиттетпієїа еї аї., 2003, Іттипоіоду 110:440). Нещодавні дослідження визначили, що РЕК5М не стимулює РОС свині секретувати ІРМ-« (СаіІгада еї аї., 2010, Меїегіпагу ІттипоЇІоду апа

ІттипораїНпоіоду 135:20).

Цей факт в поєднанні зі спостереженням, що екзогенно-доданий ІЕМ-с під час вакцинації, як було виявлено, покращує інтенсивність РЕКЗМ-специфічної ІЄМ-у відповіді (МУ.А. Меїег еї аї.,

Меї. Іттипої. Іттипораїй. 102, рр 299-314, 2004), підкреслює найважливішу роль, яку ІЕМ-а відіграє під час інфікування свиней даним вірусом. Враховуючи очевидну критичну роль ІЕМ-а у розвитку захисного імунітету, важливо визначити здатність різних запасів вірусу РКК5 стимулювати та/або інгібувати продукування ІЄМ-са. Відповідно, гостра необхідність у нових та покращених модифікованих живих вакцинах для захисту проти РЕК5.

Європейський РЕКЗ звичайно позначають як "тип 1", щоб відрізняти його від віддалено зв'язаних північноамериканського або РЕКЗ "типу 2", і дані два типа є ідентичними тільки приблизно на 6095 за загальним нуклеотидним рівнем. Перший чітко визначений ізолят європейського РЕКЗМ був розкритий У/епвмоогі еї аї., як агент Лелістада (дивіться ізолят 1102 інституту Пастера, і патенти США 5,620,691 та 6,197,310 ії їх міжнародні аналоги). Різноманітні підтипи європейського РККЗ (всі з яких можуть бути захищені в усіх аспектах представленого винаходу) більш детально описані у М. Р. Мигацодй еї аї., Міги5 Кезеагсі, Мої 154, рр. 18-30, 2010; апа М. 5Ні єї а!., Міги5 Везеагси, мої 154 рр. 7-17, 2010. Ранні північноамериканські ізоляти

РЕКЗ розкриті у патентах США 5,476,778 та 5,840, 563.

Автори представленого винаходу виявили, що можливим є запропонувати атенуйовані

Зо форми європейських штамів РЕК, які виявляються як безпечними, так і ефективними, коли їх дають наймолодшим тваринам, і, які на відміну від багатьох інших доступних на даний час вакцин проти РЕК, не блокують багато аспектів механізмів відповіді імунної системи тварини, такі як вищезгадані, тим самим ще більше сприяючи безпеці та ефективності. Як добре відомо в даній галузі техніки, виявилося дуже важким культивувати вірус РЕККЗ5. Історично лінія клітин нирки мавпи МА-104 і її похідні використовувалися майже виключно для розмноження та послаблення комерційних модифікованих живих вакцин проти РЕКЗМ вакцини, хоча невідомо, чому такі клітини були придатні для цієї мети (дивіться патент США 5,476,778).

Відкриття того факту, що клітинний поверхневий білок ссавців "С0О163" природним чином використовується вірусом РККЗ для проникнення в клітини ссавців (дивіться, наприклад, патент США 9,102,912) дозволило розробити нові РЕКЗМ-пермісивні клітинні лінії. Несподівано, атенуація на цих більш нових клітинних лініях призводить до появи вакцинних вірусів з властивостями, які відрізняються від існуючих вакцин (дивіться патент США 9,566,324 та публікацію заявки США 2013-0309263).

Відповідно, було несподівано виявлено, що європейські віруси РЕК5, адаптовані для культивування або на (1) свинячих клітинах, або (2) несвинячих клітинах, які включають рецептор свинячого СЮО163 (дивіться патент США 7,754,464), зберігають профіль безпеки та ефективності, які в більшій мірі мають значення для свиней, ніж ті, які забезпечуються вакцинними вірусами, культивованими традиційними способами, та, крім того, що захисний імунітет може бути досягнутий навіть під час вакцинації в ранньому віці. Таким чином, представляється, що звичайна адаптація РКК5 до культури у клітинній лінії нирок мавпи МА- 104 (яка дивним чином експресує мавпячий СО163, можливо, у зв'язку з функцією захоплення гемоглобіну, і в якій зазначений мавпячий СО163 є тільки на приблизно 85 95 ідентичним свинячому СО163) призводить до профілю безпеки/ефективності, який завжди буде менш біологічно значущим і неоптимальним. Репрезентативні приклади свинячого СО163 описані у патенті США 7,754,464 та членах його сімейства, патентах США 8,058,050; 8,486,685; та 9,102,912 (дивіться, наприклад, ЗЕО ІЮ: МО:14 та 5ЕО ІЮ МО:2 у зазначених документах). Як додатково описано в цьому сімействі патентів, стосовно до практики представленого винаходу, для рекомбінантної клітини, що експресується немає необхідності експресувати повнорозмірний

СО163, за умови, що поліпептид СО163 має трансмембранний домен для закріплення в 60 мембрані і експресує його поверхневі, що піддаються дії домени, таким чином, С-термінальний домен може бути відсутнім або зменшуватися.

Крім того, вакцини згідно представленого винаходу, як очікується, не будуть перешкоджати інтерферонній відповіді господаря, тоді як вакцини відомого рівня техніки, такі як ІпПдеїмас МІГМ (дивіться 05 5,476,778 та 5,846,805), які адаптовані для культивування в клітинах мавпи (які забезпечують тільки мавпячий СО163 як рецептор), зазвичай показують сильний інгібуючий ефект на ІЕМ- альфа відповідь господаря (дивіться, приклад 5 в цілому, і фігуру 4 в патенті США 9,566,324).

Вірус РКК5 звичайно викликає найважчі симптоми у наймолодшої тварини, і при цьому є здатним забезпечити вакцинацію, яка є одночасно як безпечною, так і ефективною для порося, якому всього один день, наприклад, суттєво сприяє розвитку тваринництва, а не тільки шляхом зниження смертності молодих поросят, а також забезпечення можливості переміщення тварин між господарствами в найкоротші терміни після відлучення від матері.

Ще один аспект винаходу передбачає розпізнавання того, що сучасні європейські вакцини на основі клітин мавп можуть бути поліпшені шляхом повторної адаптації, що лежить в основі вірусів, або для зростання у відповідних свинячих клітинах (дивіться обговорення, наприклад, клітин РК-9 нижче), або несвинячих клітин, які експресують свинячий СО163, в результаті чого вакцини, як правило, більш безпечні і можуть безпечно викликати надійну і стійку імунну відповідь в набагато більш ранньому віці. Таким чином, типові вимоги безпеки та ефективності, пов'язані з традиційними вакцинами, які були виготовлені в клітинах мавп (тобто такі вакцини вводяться тільки у віці близько З тижнів або пізніше), можуть бути скасовані з поліпшеними характеристиками, також досягаючи ефективності вже у 1-ий день життя. Таким чином, враховуючи велику різноманітність типів, підтипів і штамів РЕКЗМ, способи відповідно до представленого винаходу також можуть бути використані для підвищення поточної релевантності та ефективності багатьох раніше існуючих живих вакцин проти РКК5.

Про те, що вакцини проти РКК5З типу 2 (Північна Америка) можуть бути безпечними та ефективними, коли раніше повідомлялося про введення перед відлученням від матері відносно північноамериканських/азіатських штамів РККЗ (дивіться УМО2013/173443, наприклад, у прикладах 9 та 10), зокрема, під час порівняння зі зразком атенуює "Р129 штам" північноамериканського вірусу РЕКЗ (дивіться, наприклад, 5ЗЕО І МО:б у зазначеному документі, а також РСТ/В2011/055003 та 5 6,500,662). Проте, європейські та північноамериканські віруси РКЕ5 є ідентичними тільки приблизно на 60 95 на нуклеотидному рівні, і ведуть себе дещо по-різному в залежності від типів патологій у різних класів тварин (вік, стать тощо).

В даному документі описується застосування як вакцини клітинних ліній, що експресують свинячий СО163, для послаблення та вибору штамів генотипу 1 (європейський) РККЗУ, які володіють чудовими властивостями.

Суть винаходу

В першому варіанті здійснення, представлений винахід передбачає виділену полінуклеотидну молекулу, яка включає послідовність ДНК, що кодує інфекційну молекулу РНК, яка кодує вірус РЕК5, який генетично модифікований таким чином, що як вакцина він викликає ефективну імунозахисну відповідь проти вірусу РККЗ у тварин свиней. У певних аспектах винахід передбачає послідовність ДНК, як викладено у даному документі, яка включає ЗЕО ІЮ

МО.:5. Кодуючі послідовності, які є, щонайменше, на 80 95 ідентичними до 5ЕО ІЮ МО:5 (і більш переважно, що має 85 95, 90 Фо, 95 Фо, 96 95, 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентичність до неї), також є функціональними в практиці згідно представленому винаходу, за умови, що вони забезпечують різні ключові мутації, як описано нижче, які відрізняють зазначені ізоляти від інших штамів або штамів-попередників.

Додатковий варіант здійснення винаходу включає послідовності РНК, що відповідають вищезгаданим полінуклеотидам ДНК, і які можуть бути експресовані з них, і фактично віруси, які можуть бути зібрані з такої експресії. Додаткові атенуйовані європейські віруси РЕКЗ, корисні у практиці винаходу, включають ті, що кодуються послідовністю ДНК, яка гібридизується з комплементом послідовності ДНК ЗЕО ІЮО МО:5 в дуже жорстких умовах, які включають гібридизацію для фільтрації пов'язаної ДНК у 0,5 М МаНРоО», 7 95 505, 1мММ ЕДТУ при 65 градусах С, та промиванні у 0,1 552С2/0/1 96505 при 68 градусах С.

Для цілей винаходу "відповідний" означає, що відносні послідовності можуть бути оптимально вирівняні з використанням алгоритму ВГОБОМ, як описано у Непікої еї аї. Ргос

Май. Асад. З5сі., ОБА, 89, рр. 10915-10919, 1992.

В певних варіантах винаходу, винахід передбачає плазміду, яка включає виділену полінуклеотидну молекулу, як викладено в даному документі, і промотор, здатний бо транскрибувати полінуклеотидну молекулу в прийнятній клітині-господарі. В іншому варіанті винаходу, європейська РЕКЗ-кодуюча послідовність плазміди в даному документі додатково кодує один або декілька гетерологічних антигених епітопів, що детектуються. Представлений винахід передбачає трансфіковану клітину-господар, яка включає плазміду, представлену в даному документі.

В іншому аспекті, представлений винахід передбачає вакцину для захисту тварини свині від зараження вірусом РАНО. Вакцина може включати європейський вірус РЕК5, що кодується молекулою інфекційної РНК, причому кожна з молекул інфекційної РНК кодується виділеною полінуклеотидною молекулою, як викладено в даному документі. В ще іншому аспекті, вакцина включає плазміду або вірусний вектор, який включає полінуклеотид в даному документі.

Вакцина, представлена в даному документі, може необов'язково включати вакцинний носій, прийнятний для ветеринарного застосування. В одному важливому аспекті, вакцина володіє зниженою інгібуючою дією она інтерферон-й в порівнянні з європейськими вірусами немутантного типу та іншими доступними вакцинами.

В одному варіанті винаходу, представлений винахід передбачає діагностичний набір, який включає полінуклеотидні молекули, які розрізняються (так званий тест ОСІМА) між тваринами свинями, природно інфікованими польовим штамом вірусу РЕКК5, і тваринами свинями, вакцинованими модифікованою живою вакциною, представленою в даному документі.

В інших варіантах винаходу, винахід передбачає спосіб захисту тварини свині від зараження штамом вірусу РКК5, який включає введення тварині імуногенно захисної кількості вакцини згідно з формулою винаходу, представленою в даному документі.

Представлений винахід також передбачає плазміду, здатну безпосередньо трансфекукати підходящу клітину-господар і експресувати вірус репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (РККЗ5) з підходящої клітини-господаря, таким чином, трансфікованої, причому плазміда містить: (а) послідовність ДНК, що кодує інфекційну молекулу РНК, яка кодує вірус РЕКУЗХ, та (Б) промотор, здатний транскрибувати зазначену молекулу інфекційної РНК.

В наступних переважних варіантах винаходу, зазначена плазміда містить промотор, який являє собою еукаріотичний промотор, здатний забезпечувати запуск ДНК в цільових еукаріотичних клітинах, або прокаріотичний або фаговий промотор, здатний спрямовувати транскрипцію плазміди іп міго. Винахід аналогічним чином передбачає спосіб генерування

Зо вірусу РЕКЗ, де спосіб включає трансфектування підходящої клітини-господаря відповідної плазміди та отримання вірусу РКК5, генерованого трансфікованою клітиною.

Винахід також передбачає клітини-господарі, трансфіковані полінуклеотидними молекулами, та передбачає вакцини для захисту тварини свині від зараження вірусом РЕК5, причому вакцина включає: (а) генетично модифікований європейський вірус РКК5, що кодується такими вищезазначеними полінуклеотидними молекулами, або (Б) зазначену інфіковану молекулу, або (с) зазначену полінуклеотидну молекулу у формі плазміди, або (4) вірусний вектор, що містить зазначену полінуклеотидну молекулу, причому вірус РККЗ здатний викликати ефективну імунозахисну відповідь проти зараження вірусом РККЗ5 у кількості, ефективній для створення імунозахисту проти інфекції, та носій, який підходить для застосування у ветеринарії.

Зокрема, винахід включає спосіб генерування європейського вірусу репродуктивного і респіраторного синдрому свиней (РКК5), причому спосіб включає трансфектування підходящої еукаріотичної клітини-господаря композицією, вибраної з групи, що складається 3: (а) плазміди, яка містить (1) послідовність ДНК, що кодує інфекційну молекулу РНК, яка кодує європейський вірус РКК5, причому зазначена кодуюча послідовність ДНК являє собою

ЗЕО І: МО:5, або кодуючу послідовність ДНК, яка є, щонайменше, на 85 95 ідентичною до 5ЕО

ІЮ МО:5, ї (2) промотор, здатний управляти транскрипцією зазначеної послідовності ДНК, кодуючу зазначену молекулу інфекційної РНК у зазначеної підходящої клітині-господарі; і (Б) інфекційної молекули РНК РЕК, отриманої в результаті транскрипції іп міго плазміди, що містить послідовність ДНК, кодуючу зазначену інфекційну молекулу РНК РЕКК5, кодуючу європейський вірус РКЕК5, причому зазначена кодуюча послідовність ДНК являє собою 5ЕО ІЮ:

МО:5, або кодуючу послідовність ДНК, яка є, щонайменше, на 85 95 ідентичною до ЗЕО ІЮ МО:5, причому, для випадків (а) та (Б) використовується кодуюча послідовність, яка є, щонайменше, на 85 95 ідентичною до 5ЕО ІЮ МО:5, і містить одну або декілька конкретних мутацій в порівнянні з еталонною послідовністю.

В переважних прикладах, для порося (або самця, або самки) може бути передбачена як захисна, так і безпечна вакцинація в одноразовій дозі у віці менше одного дня, наприклад, через 8-16 годин після народження, до двотижневого віку, або тритижневого віку, приймаючи до уваги те, що порося може бути відлучене від матері в будь-який момент від приблизно двох- до тритижневого віку. Таким чином, представлений винахід є, як правило, застосовним до ранньої 60 вакцинації одноразовою дозою, тобто в будь-який час в перший день життя (від народження до

24-годинного віку), аналогічно у 2-ий день, 3-ій день, 4-ий день, 5-ий день, 6б-ий день, 7-ий день, 1-10-ий дні, 1-14-ий дні, та 1-21-ий дні, або просто вакцинації, яка проводиться раніше, ніж приблизно у день відлучення від матері. При бажанні можуть бути використані дві або більше доз.

Рання вакцинація (звичайно внутрішньом'язовим або інтраназальним шляхом) проти вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (РЕКЗБМ) за таких умов також забезпечує ранній початок захисного імунітету, наприклад, у віці від однієї до восьми тижнів; або приблизно від двох до шести тижнів після вакцинації; та звичайно приблизно через 28 днів після вакцинації.

Вакцинація відповідно до практики винаходу, як правило, забезпечує тривалість імунітету у порося, яка складає приблизно 23-28 тижнів, звичайно, щонайменше, приблизно 26 тижнів, що є цілком очікуваною тривалістю життя ринкової свині. Таким чином, програми вакцинації, які стали можливими завдяки представленому винаходу, захищають поросят, коли вони найбільш уразливі для інфекції і з ними найлегше поводитися. Така вакцинація також дозволяє настанню імунітету збігатися з моментом, коли відлучені поросята віддаляються від свиноматки, і можуть бути транспортовані в інші господарства, де може бути присутнім подальший ризик зараження

РЕКЗМ. Вакцини згідно винаходу також є високо ефективними для захисту кабанів; та свиноматок і молодих свиней, таким чином, непрямо захищаючи потомство яке не народилося.

Хоча переважним є припускати внутрішньом'язову та інтраназальну вакцинацію, інші способи також є застосовними.

В додатковому прикладі винаходу, хоча він і менш переважний, поліпептид СО163, що експресується рекомбінантними клітинами, в яких культивується європейський вірус РЕКЗ (Ї, таким чином, попередньо адаптований до інфекції та росту у тварин свиней), не є свинячим

СО0163, але скоріше СО163 ссавця, що має амінокислотну послідовність, яка відносно близька до свинячої послідовності, наприклад, щонайменше, на 90 95 ідентичної послідовності зЕО ІЮ

МО: 2 або 14 05 7,754,464. Більш переважно, щоб дана амінокислотна ідентичність складала 92 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 95 або 99 95.

Винахід також передбачає діагностичні набори, що містять полінуклеотидні молекулі, які розрізняють тварин свиней, природним чином інфікованих польовим штамом вірусу РЕКУХ, і

Зо тварин свиней, вакцинованих вакцинами згідно винаходу, причому ці вакцини (віруси) переважно свідчать про зниження ефекту інгібування інтерферону-а в порівнянні з немутантним типом.

Винахід, крім того, передбачає репрезентативні послідовності всього геному РЕКЗМ, отримані з європейського (бельгійського) ізоляту РКК5М 96М198. Ізолят 96198 сам по собі був одержаний у 1996 році професором Напо5 Мацугупск, спепі Опімегейу, Веїдіит, з легень молодої свині з респіраторними ознаками (пасаж 0, таким чином, був вилучений із сироватки зараженої свині (ЗЕО ІО МО: 1).

Пасаж 1 (5ЕБЕО ІЮ МО:2) є результатом одного пасажу на первинних альвеолярних макрофагах свині (РАМ). Всі наступні пасажі виконані на клітинній лінії ВНК21-С12-26. Пасаж 9 (ЗЕО ІО МО:3) виконується безпосередньо перед біологічним клонуванням вірусу за допомогою трьох раундів обмеженого розведення. Пасаж 14 (ЗЕО ІЮ МО:4) являє собою клон 1 (з шести клонів, досліджених та оцінених). Клон 1 продовжував перетворюватися в головний виробничий вірус в пасажі 44, та М5УЖ5 пасажів ставали продуктом Зимахуп? РККЗ МІ М в пасажі 49 (ЗЕО

ІО МО:5). Всі геноми мають довжину 15 092 нуклеотидів. Всі геноми є, щонайменше, на 99,5 95 ідентичними один до одного, і є приблизно на 92 95 ідентичними вірусу Лелістада.

Короткий опис креслень

Фігура 1 представляє повнорозмірну нуклеотидну послідовність (15 092 основ) ізоляту пасажу 49 для продукту Зимахуп? РАН5 МІ М, 5ЕО 10 МО:5.

Короткий опис переліку послідовностей

ЗЕО ІЮО МО:1 представляє пасаж 0 ізоляту РЕК5М 96М198.

ЗЕО ІЮ МО:2 представляє пасаж 1 ізоляту РЕК5М 96М198.

ЗЕО ІЮ МО:З представляє пасаж 9 ізоляту РЕК5М 96М198.

ЗЕО ІЮ МО:4 представляє пасаж 14 ізоляту РККЗМ 96М198.

ЗЕО ІЮ МО:5 представляє пасаж 49 ізоляту РККЗМ 96М198.

ЗЕ ІЮ МОБ: 6-8 представляють послідовності праймера ПЛР.

Детальний опис винаходу

Як використовується в даному описі та формулі винаходу, що додається, форми однини включають посилання множини, якщо контекст явно не пропонує інше. Таким чином, наприклад, посилання на "спосіб" включають в себе один або декілька способів і/або стадій, описані в 60 даному документі, які стануть очевидними для спеціалістів в даній галузі техніки після прочитання даного розкриття тощо.

Якщо не зазначено інше, всі технічні та наукові терміни, використовувані в даному документі, мають те ж значення, яке звичайно розуміють звичайні спеціалісти в даній галузі техніки, до якої належить даний винахід. Хоча будь-які способи та матеріали, подібні або еквівалентні тим, які описані в даному документі, можуть бути використані під час практичного застосування або випробування винаходу, переважні способи та матеріали описуються зараз.

Здійснення на практиці представленого винаходу буде використовувати, якщо не вказано інше, загальноприйняті способи вірусології, імунології, мікробіології, молекулярної біології та методики рекомбінантних ДНК, відомі фахівцям в даній галузі, багато з яких описані нижче з метою ілюстрації. Такі методики повністю пояснюються в літературі. Дивіться, наприклад, затргооК, еї аІ. Моїесшаг Сіопіпа: А І арогаїгу Мапиа! (2пй Еадйоп, 1989); Мапіаїйв еї аї.

Моїесшіаг Сіопіпд: А І арогаюгу Мапиаї! (1982); ОМА Сіопіпд: А Ргасіїса! Арргоаси, мої. І І (0.

Спіомег, єд.); Оіїдописіеоїіде Зупіпезів (М. Сай, ейд., 1984); Мисівіс Асіа Нубгіаіганоп (В. Натез 5 5. Ніддіп5, еаз., 1985); Тгапзсгірійоп и Тгапзіайоп (В. Натез 4. 5. Ніддіп5, ей5., 1984); Апітаї СеїЇ Сийиге (А. Егезппеу, ед., 1986); Регваї, А Ргасіїса! Сіціде ою МоїІесшціаг Сіопіпу (1984). "Північноамериканський вірус РКК5" означає будь-який вірус РКЕК5, який має генетичні характеристики, зв'язані з ізолятом північноамериканського вірусу РКК5, таким як, але не обмежуючись цим, вірус РЕК, який був вперше виділений у Сполучених Штатах приблизно на початку 1990-х років (дивіться, наприклад, Соїіпв5, «). Е., еї аї., 1992, 9. Меї. біадп. Іпмеві. 4:117- 126); Ізолят північноамериканського вірусу РЕК МІМ-16 (Куапо, «у. еї аї., 1994, 9. Меї. Оіадп.

Іпмеві. 6:293-296); штам Оцерес І АБР-ехр91 РАВЗ5 (Магааззві, Н. еї аї., 1995, Аген. Мігої. 140:1405- 1418); та Північноамериканський вірус РЕКЗ ізолят МЕ 2385 (Мепо, Х.-/ еї аї., 1994, 9). Сеп.

Мігої. 75:1795-1801). Генетичні характеристики відносяться до подібності геномної нуклеотидної послідовності та подібності амінокислотної послідовності, характерною для штамів північноамериканського вірусу РКК5. Штами вірусу азіатського РКК5 звичайно свідчать про 80- 9595 ідентичності нуклеотидної послідовності з північноамериканськими штамами (дивіться величини за замовчуванням для алгоритму Сіивіаї! МУ в наборі програмного забезпечення

Іазегдаепе, ОМАЗТАК, Іпс.), та північноамериканські штами є, аналогічним чином, на від приблизно 85 95 до 100 95 ідентичними один до одного.

Зо "Європейський вірус РЕК5" (РЕВ5У-1, або раніше РКК5М тип 1) відноситься до будь-якого штаму вірусу РКК5, який має генетичні характеристики, зв'язані з вірусом РЕК5, який був вперше виділений у Європі близько 1991 року (дивіться, наприклад, Ууепв5моогї, с., еї аї., 1991,

Меї. 0. 13:121-130, вірус Лелістада, дивіться, також патенти США 5,620,691 та 6,197,310).

Європейський вірус РКК5 також, як правило, відноситься до вірусів, який має повнорзмірні нуклеотидні послідовності, які є приблизно на 80 95 ідентичними або вище до ізоляту Лелістада.

Слід відмітити, що в межах РКЕКЗУ-1, прийшли до визначення підтипів, так що вірус Лелістад був названий прототипом для підтипу 1 та вірусу Лєна (О. КаптіуспикК еї аЇ., ВМС Меїегіпагу

Кезеагсі, 2010, Мої 6, Мо. 30) став називатися як прототип підтипу 3. Дані два віруси приблизно охоплюють максимальні поточні розбіжності РКЕК5М-1, і таким чином, наприклад, під час використання ОКЕ5, Лелістада та Лена є приблизно на 82,8 95 ідентичними на нуклеотидному рівні, та с використанням повних геномів, Лелістад та Лена є приблизно на 80,7 95 ідентичними на нуклеотидному рівні. Оптимізація вирівнювання незначно варіюється в залежності від параметрів алгоритму, але рідер звичайно посилається на значення за замовчуванням для алгоритму Сіизіа! УМ у програмному забезпечені І азегдепе (ОМА5ЗТАН, Іпс.).

Європейські штами РКК5, як правило, приблизно на 6095 ідентичні як північноамериканським, так і азіатським (китайським) штамам. Наприклад, під час використання нуклеотидної послідовності ОКЕ5 (яка дає добру або достовірну оцінку всього геному, коли повні геноми невідомі), прототип вірусу Лелістада РКЕКЗМУ-1 та прототип північноамериканського штаму МК2332 є приблизно на 65,0 95 ідентичними на нуклеотидному рівні. Використовуючи нуклеотидну послідовність повного геному, прототип вірусу Лелістада і прототип вірусу МК2332 є приблизно на 58,6 95 ідентичними на нуклеотидному рівні, знову використовуючи значення за замовчуванням для процитованого алгоритму Сіизіаї! МУ. "Ефективна імунозахисна відповідь", "імунозахист", і подібні терміни для цілей представленого винаходу, означають імунну відповідь, направлену проти одного або декількох антигених епітопів патогену, таким чином, щоб захистити від інфекції, викликаної патогеном, вакциновану тварину. Для цілей представленого винаходу, захист від зараження патогеном включає не тільки абсолютну профілактику інфекції, але також будь-яке зниження ступеня або швидкості зараження патогеном, що виявляється, або будь-яке зниження тяжкості захворювання, що виявляється або будь-який симптом або стан, викликане в результаті бо зараження патогеном у вакцинованої тварини в порівнянні з невакцинованою інфікованою твариною. Ефективна імунозахисна відповідь може бути індукована у тварин, які раніше не були інфіковані патогеном та/або не інфіковані патогеном під час вакцинації. Ефективна імунозахисна відповідь також може бути індукована у тварини, вже зараженої патогеном під час вакцинації.

Генетично модифікований вірус РКК5 є "аттенуйованим", якщо він менш вірулентний, ніж його немодифікований батьківський штам. Штам є "менш вірулентним", якщо він показує статистично значуще зниження одного або декількох параметрів, що визначають тяжкість захворювання. Такі параметри можуть включати рівень віремії, лихоманку, тяжкість респіраторного розладу, тяжкість репродуктивних симптомів або кількість або тяжкість уражень легень тощо. "Клітина-господар, здатна підтримувати реплікацію вірусу РКК5" означає клітину, яка є здатною генерувати інфекційний РКЕКЗ під час зараження вірусом згідно винаходу. Такі клітини включають свинячі клітини моноцитарної/макрофагової клітинної лінії, такі як свинячі альвеолярні макрофагові клітини та похідні, клітини нирки мавпи МА-104 та похідні, такі як клітини МАКС-145; та клітини, трансфіковані геном, кодуючим рецептор вірусу РККЗ5 (дивіться патент США 9,102,912, який відноситься до призначення поверхневого білку СО163 ссавцю як нормальний рецептор клітини вірусу РКК5). Термін "клітина-господар, здатна підтримувати реплікацію вірусу РКЕК5" також може включати клітини у живій свині. "Відкрита рамка зчитування", або "ОКЕ", як використовується в даному документі, означає мінімальну нуклеотидну послідовність, необхідну для кодування конкретного білку вірусу РЕКЗ без проміжного стоп-кодона. "Свинячий" та "свині" використовуються взаємозаміно в даному документі та відносяться до будь-якої тварини, яка є членом родини БЗ!цідає, такою як, наприклад, свиня. Вакцини та протоколи способів згідно винаходу є застосовуваним до всіх свиней, будь то самці будь-якого віку, або самка будь-якого віку, включаючи свиноматок та молодих свиней, і такі способи також здатні непрямо захищати самців та самок поросят за допомогою захисту, який вводять матері- свиноматці. Термін "РКК вірус", як використовується в даному документі, якщо не зазначено інше, означає будь-який штам з або північноамериканського, азіатського або європейського вірусу РЕК.

Зо "РКК5" охоплює симптоми захворювання у свиней, викликаного інфікуванням вірусом РКЕК5 (РЕК5БМ). Приклади таких симптомів включають, але не обмежуються цим, лихоманку, аборт у вагітних самок, респіраторний дистрес, ураження легень, втрату апетиту та смертність у молодняка свиней. Як використовується в даному документі, вірус РКК5, який є "нездатним продукувати РКК5" відноситься до вірусу, який може інфікувати свиню, але який не викликає жодних симптомів захворювання, звичайно зв'язаних з інфекцією РККЗ у свині. "Трансфікована клітина-господар" означає практично будь-яку клітину-господар, яка під час трансфікування РНК вірусу РКК5, може продукувати, щонайменше, перший раунд віріонів

РАВ5. "Інфекційна молекула ДНК", для цілей представленого винаходу, являє собою молекулу

ДНК, яка кодує необхідні елементи для підтримання реплікації, транскрипції та трансляції у функціональному віріоні з підходящої клітини-господаря.

Аналогічним чином, "виділена полінуклеотидна молекула" відноситься до композиції речовини, яка включає полінуклеотидну молекулу згідно представленому винаходу, очищену або контрольовану до будь-якого ступеня, що виявляється з її природного стану, якщо вона існує.

Для цілей представленого винаходу, нуклеотидна послідовність другої полінуклеотидної молекули (або РНК, або ДНК) є "гомологічною" до нуклеотидної послідовності першої полінуклеотидної молекули, або має "ідентичність" до зазначеної першої полінуклеотидної молекули, причому нуклеотидна послідовність другої полінуклеотидної молекули кодує таку ж поліамінокислоту, що й нуклеотидна послідовність першої полінуклеотидної молекули виходячи з виродження генетичного коду, або коли вона кодує поліамінокислоту, яка є в достатньому ступені подібною поліамінокислоті, що кодується нуклеотидною послідовністю першої полінуклеотидної молекули таким чином, щоб бути корисною у практиці представленого винаходу. Гомологічні полінуклеотидні послідовності також відносяться до смислового та антисмислового ланцюгів та у всіх випадках до комплементу будь-який таких ланцюгів. Для цілей представленого винаходу, полінуклеотидна молекула корисна для практичного застосування представленого винаходу, і тому є гомологічною або має ідентичність, причому вона може бути використана як діагностичний зонд для виявлення присутності вірусу РЕКЗ або вірусного полінуклеотиду у зразку рідини або тканини інфікованої свині, наприклад, бо використовуючи стандартні методики гібридизації або ампліфікації. Як правило, нуклеотидна послідовність другої полінуклеотидної молекули являє собою гомологічну нуклеотидну послідовність першої полінуклеотидної молекули, якщо вона має, щонайменше, приблизно 7095 ідентичність нуклеотидної послідовності до нуклеотидної послідовності першої полінуклеотидної молекули на основі алгоритму ВГАБТМ (Майопа! Сепіег їТог ВіоїесппоІоду

Іптогтайоп, також відомого як МСВІ, (Веїпезаа, Магуїапа, ОА) інституту Опіейа Зіагез Майопаї

Іпзійше ої Неапйй). У конкретному прикладі для розрахунків відповідно до практичного застосування згідно представленого винаходу, робиться посилання на ВІ А5ТР 2.2.6 |Ташвома

ТА апа ТІ Масдаєп, "ВІАБТ 2 5едиєпсеб5-а пем/ ї00! ог сотрагпа ргоїєїп апі писіеоїде зедцепсе5.» (1999) РЕМ5 Місгобіо! Гей. 174:247-250.|. Коротко, дві амінокислотні послідовності вирівняні для оптимізації показників вирівнювання з використанням штрафу за відкриття пробілу 10, штрафу за розширення пробілу 0,1 та матриці оцінки "Ббіо5итб2" від Непікоїї та

Непікой (Ргос. Маї Асай. осі. ОБА 89:10915-10919. 1992). Відсоток ідентичності потім розраховується наступним чином: загальна кількість ідентичних збігів х 100/ розділене на довжину більш довгої послідовності ж кількість пробілів, введених у більш довгу послідовність для вирівнювання двох послідовностей.

Переважно, гомологічна нуклеотидна послідовність має, щонайменше, приблизно 75 95 ідентичність нуклеотидної послідовності, навіть більш переважно, щонайменше, приблизно 8095, 85 90, 90 95 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 та 99 95 ідентичність нуклеотидної послідовності.

Оскільки генетичний код є виродженим, гомологічна нуклеотидна послідовність може включати будь-яку кількість "мовчазних" змін основ, тобто нуклеотидних заміщень, які, проте, кодують одну й ту ж саму амінокислоту.

Гомологічна нуклеотидна послідовність може додатково містити немовчазні мутації, тобто заміщення, делеції, або додавання основ, які в результаті призводять до амінокислотних відмінностей у поліамінокислоті, що кодується, за умови, що послідовність залишається, щонайменше, приблизно на 7095 ідентичною до поліамінокислоти, що кодується першою нуклеотидною послідовністю, або інше є корисним для практичної реалізації представленого винаходу.

В цьому відношенні можуть бути зроблені певні консервативні амінокислотні заміщення, які, як правило, розпізнаються, при цьому не активуючи загальну функцію білку: наприклад, у

Зо відношенні позитивно заряджених амінокислот (та навпаки), лізину, аргініну та гістидину; у відношенні негативно заряджених амінокислот (та навпаки), аспарагінової кислоти та глютамінової кислоти; та у відношенні визначених груп нейтрально заряджених амінокислот (та у всіх випадках, а також навпаки), (1) аланін та серін, (2) аспарагін, глютамін та гістидин, (3) цистеїн та серін, (4) гліцин та пролін, (5) ізолейцин, лейцин та валін, (6) метіонін, лейцин та ізолейцин, (7) фенілаланін, метіонін, лейцин та тирозин, (8) серін та треонін, (9) триптофан та тирозин, (10) ії наприклад, тирозин, триптофан та фенілаланін. Амінокислоти можуть бути класифіковані відповідно до фізичних властивостей та внеску у вторинну та третинну структуру білку. Консервативна заміна відома в даній галузі техніки як заміщення однієї амінокислоти іншою амінокислотою, яка має подібні властивості. Типові консервативні заміщення можуть бути знайдені у УМО 97/09433, сторінка 10, опублікована 13 березня 1997 року (РСТ/5896/02197, подана б вересня 1996 року). Альтернативно, консервативні амінокислоти можуть бути згруповані, як описано у Іеппіпдег, (Віоспетізігу, Зесопа Еайіоп; УмМогій Рибіїзпегв, Іпс. МУ МУ (1975), рр. 71-77). Додаткові підходящі консервативні зміни та їх застосування описані нижче.

Гомологічні нуклеотидні послідовності можуть бути визначені шляхом порівняння нуклеотидних послідовностей, наприклад, з використанням ВІГАБТМ, зазначеного вище.

Альтернативно, гомологічні нуклеотидні послідовності можуть бути визначені шляхом гібридизації у вибраних умовах. Наприклад, нуклеотидна послідовність другої полінуклеотидної молекули є гомологічною ЗЕО ІЮ МО:5 (або будь-якій іншій конкретній полінуклеотидній послідовності), якщо вона гібридизується з комплементом 5ЕО ІЮО МО:5 в помірно жорстких

БО умовах, наприклад, гібридизація зі зв'язаною на фільтрі ДНК у 0,5 М МангРох, 7965 до децилсульфату натрію (505), 1 мМ ЕДТО при 65 "С, та промиванні у 0,2х55С70,1 956 505 при 42 оС (дивіться А!цзибеї еї аї еййогв, Ргоїосої!5 іп МоїІесціаг Віоіоду, УМієу апа 5опв, 1994, рр. 6.0.3 Ю 6.4.10), або умови, які в протилежному випадку будуть в результаті призводити до гібридизації послідовностей, які кодують вірус РЕКЗ як визначено нижче. Модифікації в умовах гібридизації можуть бути визначені емпірично або точно розраховані на основі довжини і відсоткового співвідношення основ гуанозин/цитозин (03) зонду. Умови гібридизації можуть бути розраховані, як описано у Затргоок, еї аї!., (Едв.), Моїесшаг Сіопіпд: А І арогаїюгу Мапиаї, Соїай

Зргіпу Наог І арогаюгу Ргезв: Соїд бргіпа Нагброг, Мем Могк (1989), рр. 9.47 їо 9.51.

В іншому варіанті винаходу, друга нуклеотидна послідовність є гомологічною ЗЕО ІЮ МО:5 бо (або будь-якої іншої послідовності згідно винаходу), якщо вона гібридизується з комплементом

ЗЕО ІЮ МО:5 у дуже жорстких умовах, наприклад, гібридизація зі зв'язаною на фільтрі ДНК в 0,5

М Манрво»х, 7 95 505, 1 мМ ЕДТО при 65 "С, та промивання у 0,1х55С/0,1 95 505 при 68 2С, як відомо в даній галузі з рівня техніки (А!,зебеї еї аІ. Сиггепі Ргоїосоїв5 іп МоїІєсшціаг Віоіоаду, Стеепе

Рибіїзпіпу и Уміеу Іпіегосіепсе, Мем/ ХогК, 1989.

Крім того, слід розуміти, що виділені полінуклеотидні молекули та виділені молекули РНК згідно представленого винаходу включають як синтетичні молекули, так і молекули, отримані за допомогою рекомбінантних технологій, таких як клонування та транскрипція іп міїго.

Полінуклеотидні молекули можуть бути генетично мутовані з використанням рекомбінантних способів, відомих спеціалістам в даній галузі, включаючи сайт-направлений мутагенез або випадковий мутагенез, такий як вплив хімічних мутагенів або радіації, як відомо в даній галузі. "Мутації можуть бути виконані стандартними способами, відомими в даній галузі з рівня техніки, наприклад, шляхом сайт-направленого мутагенезу (дивіться, наприклад, затюогоок еї а1.(1989)

Моїесшіаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиаї, 2па Еа., Соїа 5ргіпу Нагбог І арогаюгу Ргевз5, Соїд 5ргіпд

Нагбог, М.М.) інфекційної копії, як описано (наприклад, Мешепбего еї аїІ., Адм. Ехр. Меа. Віої., 1998, 440:199-206).

В зв'язку з наданням переважних послідовностей європейського вірусу РКК5, які є як безпечними, так і ефективними під час введення поросятам перед відлученням від матері, серед амінокислотних положень, які можуть бути модифіковані, можуть бути виділені наступні.

Під час визначення цих специфічних мутацій, звичайно, відмічається, що консервативні заміщення для даних переважних амінокислотних залишків, як визначено безпосередньо вище, також можуть бути використані. Під час визначення переважних амінокислот, що кодуються відповідні/вихідні амінокислоти немутантного ізоляту штаму 96М198 також показані у скобках, таким чином, пасаж 0 (5ЕБО ІО МО: 1) порівнюють з пасажем 49 (переважний вакцинний матеріал, ЗЕО ІО МО: 5). Таким чином, для амінокислотної послідовності, що кодується з

ОК Та, 5 знаходиться в амінокислотному положенні 19 (М); У в - амінокислотному положенні 24 (Р); А - в амінокислотному положенні 156 (Т); МУ - в амінокислотному положенні 157 (Н); О - в амінокислотному положенні 268 (М); Н - в амінокислотному положенні 294 (ХУ); М - в амінокислотному положенні 416 (С); 5 - в амінокислотному положенні 742 (Р); Ї - в амінокислотному положенні 884 (Б); Р - в амінокислотному положенні 908 (5); К - в

Зо амінокислотному положенні 916 (Е); К - в амінокислотному положенні 977 (Е); 5 - в амінокислотному положенні 1138 (Р); Е - в амінокислотному положенні 1160 (3; 5 - в амінокислотному положенні 1500 (Р); К - в амінокислотному положенні 2094 (0); Р - в амінокислотному положенні 2254 (5); та Ї - в амінокислотному положенні 2290 (Р). Для амінокислотної послідовності, що кодується з ОКЕТБ, 5- в амінокислотному положенні 567 (М); та Н- в амінокислотному положенні 912 (С). Для амінокислотної послідовності, що кодується з

ОКЕЗа, І. знаходиться в амінокислотному положенні 22 (5); Е - в амінокислотному положенні 88 (М); М - в амінокислотному положенні 94 (І); та Е - в амінокислотному положенні 95 (1). Для амінокислотної послідовності, що кодується з ОКЕ20Б, | знаходиться в амінокислотному положенні 47 (Р). Для амінокислотної послідовності, що кодується з ОКЕЗ, 5 знаходиться в амінокислотному положенні 52 (Т). Для амінокислотної послідовності, що кодується з ОКНЕ4, Т знаходиться в амінокислотному положенні 151 (І). Для амінокислотної послідовності, що кодується з ОКЕ5, Е знаходиться в амінокислотному положенні 20 (3; та О знаходиться в амінокислотному положенні 37 (М). Для амінокислотної послідовності, що кодується з ОКЕ5а, М знаходиться в амінокислотному положенні 18 (А); та К знаходиться в амінокислотному положенні 35 (0).

Відповідно, представлений винахід, крім того, передбачає спосіб отримання генетично модифікованого європейського вірусу РКЕ5, причому спосіб включає мутування послідовності

ДНК, кодуючої інфекційну молекулу РНК, яка кодує вірус РКК», як описано вище, та експресує генетично модифікований вірус РКК5 з використанням підходящої експресійної системи.

Генетично модифікований вірус РЕКЗ може бути експресований з виділеної полінуклеотидної молекули з використанням підходящих експресійних систем, як правило, відомих в даній галузі з рівня технікию, приклади яких описані в представленій заявці. Наприклад, виділена полінуклеотидна молекула може знаходитись у формі плазміди, здатною експресувати вірус, що кодується у прийнятній клітині-господарі іп міго, як більш детально описується нижче.

Послідовності М-білку північноамериканського РЕКБ5М є висококонсервативними, та зазначені послідовності мають приблизно 93-100 95 ідентичність один з одним. М-білки північноамериканського та європейського РЕКЗМ є приблизно на 57-59 95 ідентичними и мають спільні структурні мотиви. Як правило, під час порівняння кодуючих послідовностей та ізолятів

РЕК5, які можуть бути пронумеровані по-різному відносно конкретних нуклеотидів або 60 кодованих амінокислот, ідентифікація підходящих областей легко досягається шляхом ідентифікації збережених характерних амінокислот у штамі РЕКХЗХ, який цікавить і зіставлення її з еталонним.

Технологія рекомбінантної ДНК включає надзвичайно різноманітні та потужні методи молекулярної біології, спрямовані на модифікування нуклеїнових кислот на рівні ДНК, і дозволяє аналізувати і модифікувати геноми на молекулярному рівні. В цьому відношенні віруси, такі як вірус РКК5 через скромний розмір його геному, особливо схильні до таких маніпуляцій. Однак, технологія рекомбінантної ДНК не відразу застосована до не ретровірусних

РНК-вірусам, тому що дані віруси не охоплюють проміжну стадію ДНК у своїй реплікації. Для таких вірусів необхідним є розробити інфекційні клони кДНК, перш ніж технологія рекомбінантних ДНК може бути застосована до їх геному для створення модифікованого вірусу.

Інфекційні клони можуть бути отримані шляхом конструювання повнорозмірної (геномної довжини) кКДНК (в даному документі використовується в широкому сенсі ДНК-копії РНК, та не тільки в суворому сенсі ДНК-копії мРНК) досліджуваного вірусу, після чого інфекційний транскрипт синтезується іп мімо в клітинах, трансфікованих повнорозмірною кДНК, але інфекційні транскрипти також можуть бути отримані шляхом транскрипції іп мйго з повнорозмірної кДНК у плазмід, яка має прокаріотичний промотор, в присутності транскрипційного коктейлю, або знову іп міго з використанням легованих фрагментів КкДНК часткової довжини, які містять повний вірусний геном. У всіх випадках транскрибування РНК несе всі модифікації, які були введені у кКДНК, та може бути використана для подальшого пасирування модифікованого таким чином вірусу.

Отримання інфекційного клону ізоляту європейського вірусу РЕКЗ або вірусу Лелістад описується в патенті США Мо 6,268,199, який, таким чином, повністю включений як посилання.

Отримання інфекційного клону кКДНК ізоляту північноамериканського вірусу РКК5, позначеного

Р129 (І ее еї аї., 2005; Моо еї аІ., 2004) описується в патенті США Мо 6,500,662 який, таким чином, повністю включений як посилання. Послідовність РІ29 кКДНК розкрита в СепрапкК з реєстраційним номером АЕ494042 та в патенті США Мо 6,500,662. В нашій роботі, наведеної нижче, використовується такий інфекційний клон, який в контексті плазміди експресується безпосереднім раннім промотором СМУМ та позначається як роМмММ-5-Р129, і також розкривається в патенті США Мо 6,500,662. Як описується в патенті США Мо 6,500,662 існують інші плазміди та промотори, підходящі для використання в даному документі.

Враховуючи повну послідовність будь-якої відкритої рамки зчитування, що представляє інтерес, та місцезнаходження амінокислотного залишку, що цікавить, спеціалісту в даній галузі просто потрібно звернутися до таблиці кодонів для того, щоб сконструювати зміни в конкретному бажаному положенні.

Кодони представляють собою триплетні послідовності нуклеотидів в мРНК та відповідні їм молекули кКДНК. Кодони характеризуються основним урацилом (І), коли присутній в молекулі

МРНК, але характеризуються основним тимідином (Т), коли присутній в ДНК. Проста зміна в кодоні такого ж амінокислотного залишку в полінуклеотиді не змінює послідовність або структуру кодованого поліпептиду. Очевидно, що, коли фраза, яка стверджує, що конкретна 3- нуклеотидна послідовність "кодує" будь-яку конкретну амінокислоту, спеціаліст в даній галузі техніки визнає, що наведена вище таблиця надає засоби для ідентифікації конкретних нуклеотидів, що розглядаються. Наприклад, якщо конкретна тринуклеотидна послідовність кодує лізин, наведена вище таблиця розкриває, що двома можливими триплетними послідовностями є ААА та ААбО. Гліцин кодується (А, (Ос, (ЗТ (ЗО), якщо в РНК) та 50.

Щоб замінити залишок лізину на гліцин в білку, що кодується, можна замінити триплет ААА або

ААС на будь-який з ОСА та БОС, ОТ або ос у кодуючій нуклеїновій кислоті.

Дослідження по імунобіології вірусу РКК5 дозволяють припустити, що взаємодія вірусу

РККЗ з РОС заслуговує вивчення. Цей тип клітин складає 0,2 95 -0,8 96 мононуклеарних клітин периферичної крові у людей, мишей, щурів, свиней та мавп. Не дивлячись на дефіцит, дана клітина є важливим компонентом вродженої імунної системи і здатна секретувати рясні кількості

ІЕМ-« після вірусної стимуляції. Саме завдяки секреції ІЕМ-є РОС відіграють основну роль в регуляції противірусного вродженого та адаптивного імунітету, оскільки вони стимулюють функцію природних клітин-кілерів, В-клітин та Т-клітин. Крім того, дозріванню свинячих моноцитарного походження дендритних клітин (МобсС) сприяє ІЄМ-са, секретований РОС, що в результаті призводить до підвищеної здатності МООС представляти антиген та активувати Т- клітини. На більш пізній стадії вірусної інфекції РОС диференціюються в унікальний тип зрілої дендритної клітини, яка безпосередньо регулює функцію Т-клітин та спрямовує диференціювання Т-клітин в клітини, здатні секретувати ІЕМ-у, який є основним медіатором противірусного імунітету проти вірусів, які включають вірус РКК5. Не дивно, що існують віруси бо людини, такі як респіраторний синцитіальний вірус та вірус кору, які, як відомо, пригнічують здатність РОС секретувати ІЕМ-а. Даний інгібуючий ефект, як вважається, грає роль у перевазі гуморальної імунної відповіді та зв'язаної з нею імунопатології, що спостерігається в результаті інфікування даними вірусами, а також у підвищеному сприйнятті господаря до вторинних бактеріальних та вірусних інфекцій.

Як вже згадувалось, існує багато відомих штамів та ізолятів європейського, північноамериканського та китайського РЕК, і нові штами продовжують розвиватися або бути виділеними. Хоча між всіма даними штамами існує високий рівень гомології амінокислотної послідовності, кваліфіковані спеціалісти в даній галузі відразу зрозуміють, що деякі варіації дійсно існують, і дійсно можна скористатися перевагами цих відмінностей та подібностей для подальшого покращення фенотипових властивостей всіх вакцинних штамів.

По перше, що стосується всіх амінокислотних мотивів, визначених ЗЕО ІЮ МОБ, як зазначено нижче, можливим звичайно є перевірити відповідні експресовані білкові послідовності з будь-яких інших європейських РКК5, щоб знайти відповідний амінокислотний мотив, навіть якщо додаткові зміни відбулися у таких інших штамах, в результаті еволюції, викликаючи заміщення та/або видалення, або додавання. Таким чином, можливим повинно бути легко ідентифікувати зіставний мотив в іншому штамі РКК5, якщо, наприклад, валін у ньому заміщений ізолейцином, або лейцином, або будь-яким іншим залишком, або якщо залишок просто відсутній або додано додатковий залишок. Існують численні комп'ютерні програми для ідентифікації вирівнювань і, таким чином, визначення, чи відповідають мотиви поліпептидних послідовностей, наприклад, так звані таблиці Віозит (на основі заданого рівня відсоткової ідентичності), дивіться 5. Непікоїї еї аІ. "Атіпо Асіа зЇирзїйшіоп таїгісе5 їот ргоїеїп ріоскв", Ргос Маї! Асай 5сі, ОА, 89(22), рр. 10915-10919, Мом 15, 1992., та дивіться також А. Г.

І еппіпдег еї аї!. Ргіпсіріє5 ої Віоспетівігу, 2005, МасмМіШап и Сотрапу, 4" еййіоп. Консервативні амінокислотні зміни також розпізнаються на основі класифікації за 5 загальними групами: сульфідріл (Су); ароматичні (Ре, Туг, та Тгр); основні (Гуз, Аго9, Ні); аліфатичні (маї, Пеи, Геи,

Ме), та гідрофільні (Аа, Рго, сіІу, Сім, А5р, Сіп, Ап, Зег та ТПг). Таким чином, до практики винаходу входить модифікація будь-якої кодуючої нуклеотидної послідовності європейського

РЕКЗ для включення у відповідне положення, що відповідає вимогам будь-яких з амінокислотних змін, забезпечуваних 5ЕО ІО МО:5, навіть якщо одна або декілька інших амінокислот, які є сусідами із зазначеним положенням, були додані, видалені або замінені. Такі амінокислотні заміни, звичайно, можуть бути введені у відповідні кодуючі нуклеотидні послідовності вірусу з використанням сайт-спрямованого мутагенезу, ПЛР та інших методів, які добре відомі в даній галузі з рівня техніки.

Загальний показник атенуації

Для того, щоб продемонструвати, що конкретний генетично модифікований штам є атенуйованим, може бути використаний експеримент, описаний наступним чином.

Щонайменше 10 молодих свиней на групу включені у кожне випробування, які отримані з ферми, на якій був відсутній РКК5М. Тварин досліджують на відсутність специфічних сироваткових антитіл до вірусу РКК5З та негативних відносно РКЕКЗУ. Всі тварини, включені у дослідження, мають одне й те саме джерело та породу. Розподілення тварин за групами було рандомізованим.

Контрольне зараження проводиться на 90-ий день вагітності за рахунок інтраназального застосування 1 мл РЕКБЗМ 105 ТОСІОво на ніздрю. Існує, щонайменше, три групи для кожного досліджуваного набору установок: одна група з немутантного типу вірусом; одна досліджувана група з контрольним зараженням можливо атенуйованим вірусом; і одна група суворого контролю.

Дослідження вважається дійсним, коли суворі контролі залишаються РКЕК5М-негативними протягом всього періоду дослідження, та, щонайменше, на 25 956 менше живих здорових поросят народжується в групі з контрольним зараженням немутантним типом в порівнянні із суровим контролем.

Атенуація, іншими словами, менша вірулентність, визначається як статистично значуща зміна одного або декількох параметрів, що визначають репродуктивну функцію або інші симптоми:

Значне зниження, щонайменше, одного із наступних параметрів для досліджуваної групи (можливо, атенуйований вірус) в порівнянні з групою, інфікованої немодифікованим батьківським штамом, буде показником атенуації: а) частота мертвонароджених р) аборт під час або до 112 дня вагітності с) кількість муміфікованих поросят бо а) кількість муміфікованих поросят е) смертність перед відлученням від матері.

Крім того, переважним є значне збільшення одного з наступних параметрів для досліджуваної групи в порівнянні з групою, інфікованої немодифікованим батьківським штамом:

У) кількість поросят, відлучених на свиноматку 9) кількість живих здорових поросят, народжених на свиноматку.

Альтернативно, респіраторні симптоми та інші симптоми інфекції РЕК5М можуть бути досліджені для встановлення атенуації.

Атенуйований штам є цінним для формуляції вакцин. Представлена вакцина є ефективною, якщо вона захищає свиню від зараження вірусом РКК5. Вакцина захищає свиню від зараження вірусом РКК5, якщо, після введення вакцини одній або декільком не ураженим свиням, подальше контрольне зараження біологічно чистим вірусним ізолятом (наприклад, будь-якого європейського немутантного типу) в результаті призводить до зниження тяжкості будь-яких великих або гістопатологічних змін (наприклад, ураження легень) та/або симптомів захворювання в порівнянні з тими змінами або симптомами, які звичайно викликаються ізолятом у подібних свиней, які не захищені (тобто відносно відповідного контролю). Зокрема, представлена вакцина, як може бути показано, є ефективною шляхом введення вакцини одній або декільком підходящим свиням, які потребують цього, а потім після закінчення відповідного періоду часу (наприклад, 4 тижні), контрольного зараження великим зразком (1097 ТОЮ; (5о)) біологічно чистого ізоляту РЕКЗУ. Зразок крові потім забирають у зараженої свині приблизно через один тиждень, і потім роблять спробу виділити вірус зі зразка крові. Виділення великої кількості вірусу є показником того, що вакцина може бути неефективною, в той час як виділення зменшеної кількості вірусу (або зовсім жодного вірусу) є показником того, що вакцина може бути ефективною.

Таким чином, ефективність представленої вакцини може бути оцінена кількісно (тобто, зменшення відсотку консолідованої легеневої тканини в порівнянні з відповідною контрольною групою) або якісно (наприклад, виділення РЕКЗМ з крові, виявлення антигену РЕКЗМ у зразку тканини легені, мигдалини або лімфатичного вузла за допомогою імуноаналізу). Симптоми репродуктивного та респіраторного захворювання свиней можуть оцінювати кількісно (наприклад, температура/лихоманка) або напівкількісно (наприклад, наявність або відсутність одного, або декількох симптомів або зменшення тяжкості одного або декількох симптомів, таких як ціаноз, пневмонія, ураження легень тощо).

Не уражена свиня являє собою свиню, яка або не піддавалась впливу інфекційного агента, який викликає репродуктивну та респіраторну хворобу свині, або яка піддавалась впливу інфекційного агента, який викликає репродуктивну та респіраторну хворобу свині, але не проявляє симптомів захворювання. Уражена свиня являє собою свиню, яка проявляє симптоми

РЕК, або з якої може бути виділений РЕКЗМ.

Вакцини згідно представленого винаходу можуть бути сформульовані відповідно з прийнятою конвенцією для включення прийнятних носіїв для тварин, включаючи людей (якщо може бути застосовано), таких як стандартні буфери, стабілізатори, розріджувачі, консерванти та/або солюбілізатори, і також можуть бути сформульовані для полегшення сповільненого вивільнення. Розріджувачі включають воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин тощо. Добавки для ізотонічності включають, серед іншого, хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт та лактозу. Стабілізатори включають, серед іншого, альбумін. Інші підходящі вакцинні носії та добавки, включаючи ті, які особливо корисні під час формуляції модифікованих живих вакцин, відомі або будуть очевидними для спеціалістів в даній галузі з рівня техніки. Дивіться, наприклад, Кетіпдіоп'є Рпагтасецшцііса! Зсіепсе, 181п ей., 1990, Маск Рибіїзпіпоу, яка включена в даний документ як посилання.

Вакцини згідно представленого винаходу можуть додатково включають один або декілька додаткових імуномоделюючих компонентів, таких як, наприклад, ад'ювант або цитокін, серед інших. Необмежуючі приклади ад'ювантів, які можуть бути використані у вакцині згідно представленого винаходу, включають систему ад'ювантів КІВІ (КіБі Іпс., Натійоп, Мопі.), квасці, мінеральні гелі, такі як гель гідроксиду алюмінію, емульсії олія-в-воді, емульсії вода-в-олії, такі як, наприклад, повні та неповні ад'юванти Фрейнда, блок-співполімер (СуїЕх, Айапіа, са.), О5- 21 (Сатріідде Віоїесй Іпс., Сатргідде Мазв.), БАЕ-М (Спігоп, ЕтегуміППе Саїї.), АМРНІСЕМ.АТМ. ад'ювант, сапонін, Оці А або інша фракція сапоніну, монофосфорилліпід А, та авридіновий ліпід-амінний ад'ювант. Необмежуючі приклади емульсій олія-в-воді, що використовуються у вакцині згідно винаходу, включають модифіковані склади ЗЕАМБб62 та ЗЕАМ 1/2. Модифікований

ЗЕАМб2 являє собою емульсію олія-в-воді, яка містить 5 95 (0б./06.) сквалену (Зідта), 1 95 (об./06.) БРАМ.КТМ. 85 детергенту (ІСІ З,ипасіапів), 0,7 95 (06./06.) ТМ/ЕЕМ.КТМ. 80 детергенту бо (ІСІ Бипасіапів), 2,5 95 (06б./06.) етанолу, 200 пг/мл Оці А, 100 мкг/мл холестерину, та 0,5 95

(об./06.) лецитину. Модифікований ЗЕАМ 1/2 являє собою емульсію олія-в-воді, яка містить 5 95 (об./06.) сквалену, 1 95 (06./06.) БХРАМ.КТМ. 85 детергенту, 0,7 95 (06./06.) Тиееп 80 детергенту, 2, У (06./06.) етанолу, 100 мкг/мл Опції А, та 50 мкг/мл холестерину. Інші імуномоделюючі агенти, які можуть бути включені у вакцину, включають, наприклад, один або декілька інтерлейкінів, інтерферонів або інших відомих цитокінів.

Вакцини згідно представленого винаходу необов'язково можуть бути сформульовані для сповільнення вивільнення вірусу, молекули інфекційної РНК, плазміди або вірусного вектора згідно представленого винаходу. Приклади таких складів з пролонгованим вивільненням включають вірус, молекулу інфекційної РНК, плазміду або вірусний вектор в комбінації з композитами біосумісних полімерів, таких як, наприклад, полі(молочна кислота), полі(молочно- гліколева кислота), метилцелюлоза, гіалуронова кислота, колаген тощо. Структура, вибір та використання полімерів, які розкладаються в засобах доставки ліків були розглянуті в декількох публікаціях, включаючи А. отр еї аї!., 1992, РоїЇутег5 тог Адмапсей Тесппоїодіев 3: 279-292, яка включена в представлений документ як посилання. Додатковий посібник з вибору та використанню полімерів в фармацевтичних складах може буті знайдена в текстах, відомих в даній галузі з рівня техніки, наприклад, М. Спабхтіп апа К. Гапдег (едз), 1990, "Віодедгадавіе

Роїутегз аз Огид Оєїїмегу Зузієтв" іп: Огид5 апа те РНаптасеціїйса! бсіеєпсевз, Мої. 45, М. Реккет",

М.У., яка також включена в даний документ як посилання. Альтернативно або додатково, вірус, плазміда або вірусний вектор можуть бути мікрокапсульовані для покращення введення та ефективності. Способи мікроіїнкапсулювання антигенів добре відомі в даній галузі з рівня техніки, та включають способи, описані, наприклад, в патенті США Мо 3,137,631; в патенті США

Мо 3,959,457; в патенті США Мо 4,205,060; в патенті США Мо 4,606,940; в патенті США Мо 4,744,933; в патенті США Мо 5,132,117; та Міжнародній патентній публікації УМО 95/28227, всі з яких включені в даний документ як посилання.

Ліпосоми можуть також бути використані для забезпечення сповільненого вивільнення вірусу, плазміди або вірусного вектору. Подробиці відносно того, як виготовляти та використовувати ліпосомні склади, можуть бути знайдені, серед іншого, в патенті США Мо 4,016,100; в патенті США Мо 4,452,747; в патенті США Мо 4,921,706; в патенті США Ко 4,927,637; в патенті США Мо 4,944,948; в патенті США Мо 5,008,050; і в патенті США Мо 5,009,956, всі з яких включені в даний документ як посилання.

Ефективна кількість будь-якої з вищеописаних вакцин може бути визначено звичайними методами, починаючи з низької дози вірусу, плазміди вірусного білку або вірусного вектора, а потім збільшуючи дозування, одночасно відстежуючи ефекти. Ефективна кількість може бути отримана після одноразового введення вакцини або після багаторазового введення вакцини.

Відомі фактори можуть бути прийняті до уваги під час визначення оптимальної дози на тварині.

До них відносяться вид, розмір, вік та загальний стан тварини, наявність інших лікарських засобів у тварини тощо. Фактичне дозування переважно вибирають після розгляду результатів інших досліджень на тваринах (дивіться Приклади 3-7 нижче).

Одним із способів визначення того, чи була досягнута адекватна імунна відповідь, є визначення сероконверсії і титру антитіл у тварини після вакцинації. Час вакцинації та кількість ревакцинацій, якщо такі мають місце, переважно буде визначатися лікарем або ветеринаром базуючись на аналізі всіх відповідних факторів, деякі з яких описані вище.

Ефективна кількість дози вірусу, білку, молекули інфекційної ДНК, плазміди або вірусного вектора згідно представленого винаходу може бути визначено з використанням відомих методик, приймаючи до уваги фактори, які можуть бути визначені спеціалістом в даній галузі, такі як маса тварини, що підлягає вакцинації. Кількість дози вірусу згідно представленого винаходу у вакцині згідно представленого винаходу переважно знаходиться у діапазоні від приблизно 10 до приблизно 107 БУО (бляшкоутворюючих одиниць), більш переважно від приблизно 102 до приблизно 109 БУС, та найбільш переважно від приблизно 103 до приблизно 107 БУО. Кількість дози плазміди згідно представленого винаходу у вакцині згідно представленого винаходу переважно знаходиться у діапазоні від приблизно 0,1 мг до приблизно 100 мг, більш переважно від приблизно 1 мг до приблизно 10 мг, ще більш переважно від приблизно 10 мг до приблизно 1 мг. Кількість дози інфекційної молекули ДНК згідно представленого винаходу у вакцині згідно представленого винаходу переважно знаходиться у діапазоні від приблизно 0,1 мг до приблизно 100 мг, більш переважно від приблизно 1 мг до приблизно 10мг, ще більш переважно від приблизно 10 мг до приблизно 1 мг.

Кількість дози вірусного вектора згідно представленого винаходу у вакцині згідно представленого винаходу переважно знаходиться у діапазоні від приблизно 10! БУО до приблизно 109 БУС, більш переважно від приблизно 102 БУО до приблизно 108 БУО, і ще більш 60 переважно від приблизно 103 до приблизно 107 БУО. Підходящий розмір дозування знаходиться у діапазоні від приблизно 0,5 мл до приблизно 10 мл, і більш переважно від приблизно 1 мл до приблизно 5 мл.

Дози, що підходять для вірусних білкових або пептидних вакцин відповідно до практики згідно представленого винаходу знаходяться у діапазоні від, як правило, від 1 до 50 мікрограмів на дозу або більш високі кількості, які можуть бути визначені стандартними способами, з кількістю ад'юванта, яка повинна бути визначена визнаними способами щодо кожної такої речовини. В переважному прикладі винаходу, що стосується вакцинації свиней, оптимальний вік для тварин складає від 1 до 21 дня, яка перед відлученням, може також відповідати іншим запланованим щепленням, таким як проти Мусоріазта Нпуорпештопіає або РСМ. Крім того, переважний графік вакцинації для племінних свиноматок буде включати аналогічні дози із щорічним графіком ревакцинації.

Одним із способів визначення того, чи була б досягнута адекватна імунна відповідь, є визначення сероконверсії та титру антитіл у тварини після вакцинації. Час вакцинації і кількість ревакцинацій, якщо такі мають місце, переважно буде визначатися лікарем або ветеринаром базуючись на аналізі всіх відповідних факторів, деякі з яких описані вище.

Ефективна кількість дози вірусу, молекули інфекційної РНК, плазміди або вірусного вектора згідно представленого винаходу може бути визначено з використанням відомих методик приймаючи до уваги фактори, які можуть бути визначені спеціалістом в даній галузі, таких як маса тварини, що підлягає вакцинації. Наприклад, вакцини можуть доставлятися перорально, парентерально, внутрішньошкірно, підшкірно, внутрішньом'язово, інтраназально або внутрішньовенно. Пероральна доставка може включати, наприклад, додавання композицій до корму або питва тварин. Фактори, що впливають на дозування вакцини, включають, наприклад, маса і вік свині.

Представлений винахід, крім того, передбачає спосіб отримання вакцини, що містить РЕКНЗ вірус, молекулу інфекційної РНК, плазміду, або вірусний вектор, описаний у даному документі, причому спосіб включає комбінування ефективної кількості одного з вірусу РКК5, молекули інфекційної РНК, плазміди або вірусного вектора згідно представленого винаходу, з носієм, прийнятним для фармацевтичного або ветеринарного застосування.

Крім того, жива атенуйована вакцина згідно представленого винаходу може бути модифікована, як описано в патенті США Мо 6,500,662 для кодування гетерологічного антигенного епітопу, який вставлений у вірусний геном РКК5З5 з використанням відомих рекомбінантних методик. Дивіться також патент США 7,132,106, який включений як посилання в повному обсязі. Антигенні епітопи, застосовні як гетерологічні антигенні епітопи для представленого винаходу, включають в себе антигенні епітопи від патогену свиней, іншого, ніж вірус РКК5, які включають, але не обмежуються цим, антигенний епітоп з патогену свиней, вибраних з групи, що складається з свинячого парвовірусу, свинячого цирковірусу, свинячого цирковірусу, свинячого грипу, вірусу псевдосказу, вірусу трансмісивного гастроентериту, свинячого респіраторного коронавірусу, класичного вірусу чуми свиней, вірусу африканської чуми свиней, вірусу енцефаломіокардіту, свинячого параміксовірусу, вірусу гепатиту ТТУ, вірусу трансмісивного гастроентериту, респіраторного коронавірусу свині, Асііпобасійи5 рівигорпеитопіає, Асіїпобасіїив5 в5иців, Васійи5 апійнгасі, ВогаєїейНйа Бгопспізеріїса, СіобШашт паетоїуїісит, Сіовіідійт рептіпдепе, Сіовіпдіцт їеїапі, Е5сНегпісніа соїї, ЕгузіреіоїНгіх гпизіораїпіає, Наеторпіїи5 рагазиїй5, І еріозріга 5рр., Мусоріазєта пуорпеитопіає, Мусоріазта

Нуогпіпіз, Мусоріазта ПНуозупоміа, Равієшгейа тийосіда, ЗаІтопеїйа споіІегаєвзиї5, ЗаІтопеїЇа

Іурпітигішт, зігеріососсив5 едпізтіїї5, та еігеріососси5 зці5. Нуклеотидні послідовності, що кодують антигенні епітопи з вищезгаданих патогенів свиней, відомі в даній галузі з рівня техніки і можуть бути отримані з загальнодоступних баз даних генів у всесвітній мережі, таких як

Сепрапк з (США) Національного центру біотехнологічної інформації.

Додаткові ознаки та варіанти винаходу будуть очевидні для спеціалістів у даній галузі техніки з всієї цієї заявки, включаючи детальний опис, і всі такі ознаки призначені як аспекти винаходу. Аналогічним чином, ознаки винаходу, описаного в даному документі, можуть бути повторно об'єднані у додаткові варіанти здійснення винаходу, які також призначені як аспекти винаходу, незалежно від того, чи конкретно зазначена комбінація ознак як аспект або варіант здійснення винаходу. Крім того, тільки такі обмеження, які описані в даному документі як критичні для винаходу, повинні розглядатися як такі; варіанти винаходу, в яких відсутні обмеження, які не були описані в даному документі як критичні, призначені як аспекти винаходу.

Буде зрозуміло, що винахід може бути здійснений інакше, ніж конкретно описано у зазначеному вище описі та прикладах.

Відповідно, вакцина проти РЕК5, що базується на вірусі БЗЕО ІЮО МО:5 буде розглядатися як бо репрезентативна для тих, які мають профіль безпечності та ефективності, які забезпечують значне покращення, що дозволяє успішно проводити вакцинацію поросят, навіть у перший день життя, з тривалим імунітетом до приблизно 6 місячного віку. Такі безпрецедентні покращення ефективності вакцин несподівано забезпечуються культивуванням і ослабленням вірусу в середовищі культивування клітин, яке максимізує відношення до біології свиней, в тому числі шляхом розв'язання відповідної і безпечної реплікації вірусу у господарі-свині, не знижуючи при цьому необхідну імунну відповідь господаря. Такі переваги надаються для поросят, кабанів, та свиноматок і молодих свиней (як до, так і під час вагітності); і у всіх випадках, чи є тварина серопозитивною або серонегативною під час вакцинації.

Очевидним також є те, що вдосконалення в галузі культивування згідно представленого винаходу в рівній мірі застосовні до європейських вірусів незалежно від того, використовуються вони, піддавались або будуть піддаватися маніпулюванню рекомбінантними засобами або тільки були виділені, збережені або культивовані та адаптовані переважно не рекомбінантними засобами; у всіх випадках, включаючи питання про те, чи є будь-які використовувані клітини для культивування самі по собі рекомбінантними або ні.

Багаточисленні модифікації і варіації представленого винаходу можливі в світлі вищенаведених ідей і, отже, знаходяться в межах обсягу винаходу.

Наступні приклади призначені для ілюстрації, але не для обмеження винаходу.

Приклад 1 - Генерування клітинної лінії ВНК21-С12-26

Генерування клітинної лінії ВНК21-С12, батьківської клітинної лінії ВНК21-С12-26, що використовується в цих дослідженнях, було раніше описано у 05 9,102,912. В даному патенті клітинна лінія ВНК21-С12 згадується як ВНК/СММУ/м11 412 у Прикладе 14 та на Фігурі 6. Коротко кажучи, звичайно використовувана клітинна лінія ВНК-21 нирки новонародженого хом'яка була трансфікована плазмідою РСММУ-5и5С20163М1, яка містить усічений варіант (м!) свинячого (515)

СО0163 РКК5М рецепторного гену, під контролем промотору СММУ. Плазміда також містить стійкість до канаміцину/неоміцину під контролем подвійних прокаріотичних/зукаріотичних промоторів для селекції в клітинах Е. соїї та ссавців, відповідно. Після трансфекції клітини піддавали одночасному відбору з 5418 (Сепеїфсіп, аналог неоміцину) та клонуванню окремих клітин у 96-лункових планшетах. Один з отриманих в результаті клонів (212, або "С12") був вибраний для подальшого використання та позначений як ВНК21-С12.

Зо Клітину лінію ВНК21-С12 серійно пасерували 65 разів під селекцією (5418 та зберігали

РАВ5М-пермісивний фенотип. Під час пасажу 64 було виявлено, що декілька клітин вижили після зараження вірусом РКК5, що показує на ранні стадії фенотипової нестабільності. Було проведено додаткове клонування окремих клітин, та багато нових клонів були оцінені на предмет наявності РККЗМ-пермісивного фенотипу і загальних характеристик зростання. З них був вибраний клон 226 за те, що він перевершує інші клони і батьківську клітинну лінію ВНК21-

С12. Клон 226 був позначений ВНК21-С12-26, та використовувався для послаблення вірусу

РАВ5 96М198.

Приклад 2- додаткові клітини, підходящі для адаптації та культивування вірусу, який є безпечним та ефективним у дуже ранньому віці, наприклад, для вакцинації в 1-й день після народження

Клітини РК-9 являють собою лінію трансгенних клітин, отриману шляхом стабільного трансфектування клітинної лінії нирки свині РКО8О9 плазмідою, яка кодує віддалену версію гену

СО163 свині та гену стійкості до неоміцину. Деталі конструкта та характеристики клітинної лінії

РК-9 були описані раніше (дивіться патент США 9,102,912).

Слід відмітити, що адаптація вірусу першого пасажу з клітин РАМ до росту на клітинах РК-9 може бути утруднена і вимагає декількох спроб з декількома паралельними клітинними лініями.

В цьому випадку інфекція може контролюватися з використанням імунофлюоресценції дубльованих лунок з використанням ЕРІТС-кон'югованого моноклонального антитіла БВООММ17, специфічного для вірусного нуклеокапсидного білку (Кига! Тесппоїодіе5 Іпс, ВгооКіпд5 Зоцїйп

Бракоїа). Ранні пасажі можуть в результаті призвести до появи декількох невеликих осередків і не генерувати достатню кількість безклітинних вірусних частинок для того, щоб ініціювати зараження свіжого моношару. Дані пасажі, тим не менш, можуть бути виконані шляхом обробки інфікованого моношару акутазою (замінником трипсину) і повторного посіву клітин в декілька лунок зі свіжим середовищем з додаванням або без додавання неінфікованих клітин РК-9.

Після декількох таких пасажів деякі лінії повинні демонструвати явне збільшення частоти та розміру флуоресцентних осередків. Деякі з них повинні набути здатність до пасерування з використання безклітинних вірусних рідин. Як правило, очікується, що відповідні пасажі свідчать про знижену здатність пригнічувати альфа-інтерферон.

Безпека і ефективність вакцин проти європейського РККЗ згідно винаходу додатково 60 підтверджуються експериментальними протоколами і даними, що містять приклади 3-7, які слідують далі.

Приклад З - Тривалість імунітету, забезпечуваного європейським РЕКЗ МІУ, введеним поросятам у віці 17 день, з подальшим контрольним зараженням додатковим європейським ізолятом РКК5М приблизно через 26 тижнів після вакцинації.

Мета дослідження полягала в тому, щоб оцінити тривалість імунітету (БОЇ) модифікованої живої вакцини проти європейського РЕК (вірусу, що кодує ЗЕБО ІЮ МО: 5) у свиней, вакцинованих у віці 1 дня внутрішньом'язовим (в.м., група Т02) або інтраназальним (і.н., група

ТО03) способом з подальшим респіраторним контрольним зараженням через 26 тижнів після вакцинації іншим європейським ізолятом РЕККБУ. Основною змінною під час визначення ефективності було вірусне навантаження в сироватці крові (віремія) в групах обробки Т02 та

ТОЗ в порівнянні зі свинями Т01. Ураження легень, ректальні температури, виділення, клінічні ознаки і маса тіла порівнювалися як вторинні змінні.

У віці 1 дня свиням з груп 702 та ТО3 вводили одноразову дозу ІМР по 2 мл внутрішньом'язовим (Т02) або інтраназальним (Т03) способом. Свині з контрольної групи (ТО01) отримували 2 мл внутрішньом'язово та 2 мл інтраназально сольового фізіологічного розчину.

Через 26 тижнів після вакцинації (182 дня) свиней контрольно заражали інтраназально ізолятом

ЕЕ РЕКЗМ О10ЦО1 (дивіться .). Юигап еї аї., Мігиє Сбєпев, мої 14 Мо. 1., 1997, рр 19-29 та 7.ї и еї а!., Мігоїюоду Удоигпаї, мої 11, Мо 42, 2014) як респіраторне контрольне зараження. Під час фази контрольного зараження проби крові, мазки з носу та рота, клінічні спостереження та ректальні температури збирали кожні 3-4 дні до дня розтину. Свиней зважували перед вакцинацією, перед контрольним зараженням та під час розтину. Через дев'ять або десять днів після контрольного зараження свиней умертвляли і піддавали розтину. Після розтину легені оцінювали на наявність пошкоджень РЕК5БМУ та оцінювали. Дослідження було дійсним, так як всі свині ТО1 залишалися вірусно-негативними на РКЕ5М протягом періоду вакцинації, і не було виявлено жодних змішаних факторів захворювання.

Під час порівняння вірусного навантаження в сироватці крові між групами спостерігався захисний ефект вакцинації як в.м., так і ї.н. Обидві групи, вакциновані ІМР (Т02 та ТО03), мали значно (Р«е0,05) більш низькі титри вірусу в порівнянні з контрольною групою у всі дні забору проб після контрольного зараження (3, 6, 8 та 9/10, що відповідає дням дослідження 185, 188,

Зо 190 та 191/192). Ефективність також підтверджується значним зниженням уражень легень, зв'язаних з РКК5МУ, під час розтину, а також значним зниженням виділення з носу та рота в обох вакцинованих групах в порівнянні з контрольною групою.

Порівняння між вакцинованими групами показало, що через З дні після контрольного зараження група, вакцинована і.н. способом (ТО3), мала значно більш низьку віремію, виділення з носу та пероральне виділення в порівнянні з групою, вакцинованою в.м. способом (7102). Дані результати показують, що в умовах представленого дослідження захист, отриманий після вакцинації і.н. способом, був сильнішим, ніж після вакцинації в.м. способом.

Вакцинація індукувала розвиток РЕК5М-специфічних антитіл в межах 28 днів після вакцинації. Всі вакциновані свині були серопозитивними до антитіл РКК5 під час контрольного зараження (через 26 тижнів після вакцинації), що показує на те, що обидва способи введення могли викликати сильну та захисну відповідь антитіл на вакцинацію. Однак рівень титрів антитіл, виявлених під час контрольного зараження був значно вище у групі вакцинованою і.н. способом в порівнянні з групою, вакцинованою внутрішньом'язово, що пояснювало би значне зниження вірусного навантаження, виявленого як в сироватці, так і у шляхах екскреції у і.н. групі в порівнянні з в.м. групою через З дні після контрольного зараження.

На завершення, результати даного дослідження продемонстрували, що одноразове введення вакцини ЄЮ РКЕКЗМ ММ (ЗЕО ІЮО МО:5), що містить дозу 2,5 0910 ССІЮ50 поросятам у віці 1 день внутрішньом'язовим або інтраназальним способом давало захисну тривалість імунітету 6,5 місяців (26 тижнів).

Скорочення, використовувані у прикладах 3-7, включають: АААГАС, Асоціація за оцінкою та акредитацією по догляду за лабораторними тваринами; АЕ, несприятлива подія; ССІЮО5О, 50 95 інфекційна доза клітинної культури; СР, контрольний продукт; ОС, День контрольного зараження; ОСЕ, форма збору даних; ОКАС, щоденний огляд по догляду за тваринами; І, ідентифікація; ІР, імунофлуоресценція; в.м., внутрішньом'язово; і.н., інтраназально; в.в., внутрішньовенно; ІМР, дослідницький ветеринарний продукт; МОА, материнські антитіла; МІ М, модифікована жива вакцина; М5Е, провідна документація дослідження; ММ, вихідний вакцинний вірус; МА, не застосовується; РАМ, свинячі альвеолярні макрофаги; РКК5У, вірус репродуктивного та респіраторного синдрому свиней; РВ5, Фосфатний буферний сольовий розчин; КТ-ДРСК, кількісна зворотна транскрипційна полімеразна ланцюгова реакція; ЗАКТ, бо звіт про хворих тварин та лікуваннях; 5ОР, стандартна операційна процедура; 5/Р, з до позитивного; та ТВО, підлягає визначенню.

Дизайн

День Доза .

Дозування контрольного Кінець

Група Опис (фактичний| Спосіб День контрольного зараження |дослідження| М обробки введення | зараження . титр) (оС) (фактичний (ОМ) титр)

І р191/ тик ятеняежтковю (бе 2.5 обо 5.7 одію | 0191/

Т02 | МР осів 2о вою р1і82 ССІОво/свиня| 0192 18 2.2 |0до

УСЕ: НИ Н мл

У віці 1-го дня дозу 2 мл (в.м. спосіб введення) і дозу 2 мл (і.н. спосіб введення) СР вводили поросятам ТО01. Крім того, одноразову дозу 2,0 мл ІМР вводили поросятам Т02 шляхом в.м. введення та поросятам ТО3 шляхом і.н. введення. Через двадцять шість тижнів після вакцинації свиней здійснювали контрольне зараження РКК5ЗМ О10МО1, і через 9-10 після контрольного зараження їх піддавали евтаназії та розтину. День 0 - День вакцинації.

Рандомізація

Безпосередньо після народження поросят змішано вигодовували таким чином, що поросята були рандомізовані і як можна більш рівномірно розподілені по всім свиноматкам. Під час відлучення свиноматок видаляли, і поросят утримували в загонах на фермі-джерелі (1 загін на обробку).

Визначені параметри для тварин є наступними:

Еапт Саї Магднев

Походження: 27 ові Мапитасійгіпд є Незеагсі зЗраїп ЗІ.

І Ста Сатртодоп в/п Ріпса "а Віра" 17813 Маї! ає

Віапуа (Сігопа), Зраїп

Дванадцять вагітних свиноматок були використані для отримання 117 поросят. За день до передбачуваної дати опоросу пологи були викликані внутрішньом'язовою ін'єкцією клопростенолу (Сусіїхю Рогсіпо, Міграс). Всі свиноматки опоросились на наступний день (0-1).

Для скорочення тривалості пологів і кількості мертвонароджених поросят всім свиноматкам, крім двох (71 та 78, у яких вже закінчився опорос), ін'єкційно вводили окситоцин (Рагіомек» рем).

Під час фази вакцинації, 8 поросят померли або були піддані евтаназії. З решти 109 поросят, 55 були взяті для представленого дослідження.

Для того, щоб зменшити агресивну та сексуальну поведінку у самців свиней в більш старшому віці, поросят кастрували в б-денному віці, слідуючи методам утримання тварин, специфічним для конкретної ділянки. Троє поросят (232, 284 та 286) не могли бути кастровані, тому що у них була мошонкова грижа. Приблизно через 1 місяць після вакцинації, дві раптові

Зо смерті з однаковими патологічними ознаками разом з наявністю білих плям на полу та у деяких свиней з білою сечею в кінці процесу сечовипускання свідчать про бактеріальну інфекцію, що вражає сечовивідні шляхи. Вважалось, що даний процес не вплинув на результати дослідження, оскільки всі тварини добре реагували на лікування, та жодних інших випадків не спостерігалося протягом решти фази вакцинації (наступні З місяці до контрольного зараження).

Будь-яка тварина з травмою або клінічним захворюванням, не зв'язаним з процедурою дослідження, яка може вплинути на здоров'я тварини та оцінку результатів, може бути виключено з дослідження на розсуд дослідника. Дослідницький ветеринарний продукт (ІМР) був отриманий з ліофілізованої фракції, яку знову суспендували у фізіологічному розчині при 2,5 Ід 10ССіІОво/мл (ЗЕО ІО МО: 5 вірус).

Реконструкція

В день 0, ІМР розбавляли вакцинним розріджувачем (партія Т22019), щоб відповідати цільовому титру (2,5 Ісдіо ССІЮво/2 мл). Одну аліквоту ІМР збирали для титрування на клітинах вВНК-21-С012-26 для підтвердження дозування. Додатковий зразок ІМР заморожували (-80:210 "С) та зберігали як контрольний зразок. Титрування на клітинах ВНК-21-С12-26 проводили відповідно до місцевих стандартних процедур. Відновлена та розбавлена вакцина мала титр 1019 ССіІОво/мл, що відповідає 1022 ССІЮОво/2 мл (2,2 ІсдтоССІОзо/2 мл). В день 0 ІМР розбавляли вакцинним розріджувачем (партія Т22019) для того, щоб відповідати цільовому титру (2,5 Іод'о

ССІО5о/2 мл). Одну аліквоту ІМР збирали для титрування на клітинах ВНК-21-С12-26 для підтвердження дозування. Додатковий зразок МР заморожували (-80-10 7) та зберігали як контрольний зразок. Титрування на клітинах ВНК-21-С12-26 проводили відповідно до місцевих стандартних процедур. Відновлена та розбавлена вакцина мала титр 1079 ССіІЮОво/мл, що відповідає 1022 ССІЮОво/2 мл (2,2 ІодіоССІЮОво/2 мл), контрольний продукт (СР) являв собою розріджувач вакцини (фізіологічний розчин) та вводився у вигляді 4,0 мл (2,0 мл в.м. -- 2,0 мл і.н.).

В день 0 поросят вакцинували ІУР або СР, як описано. Поросятам груп ТО1 та 702 ін'єкційно вводили внутрішньом'язово у правий бік шиї. Поросятам груп Т01 та Т03 вводили інтраназально, доставляючи 1,0 мл в кожну ніздрю.

Введення контрольного зараження

Всіх свиней піддавали контрольному зараженню інтраназально (і.н.) із загальним об'ємом контрольного зараження 2,0 мл шляхом закапування 1,0 мл матеріалу контрольного зараження в кожну ніздрю з вірусом О1І0ї/91 при титрі 1057 ССІО5о / 2 мл.

Результати - вірусемія

Всі свині були негативними на ЗТ-кКПЛР (кількісна полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією) РЕККО5М у сироватці крові перед вакцинацією (00) та перед

Зо контрольним зараженням (0181). Після контрольного зараження, 100 96 свиней з групи Т01 ставали віремічними в день 185 (З дня після зараження, ОС-я-3) та залишали позитивними до кінця дослідження. У вакцинованих групах 100 95 (група Т02) та 88 95 (ТО3) свиней також були позитивними в ОС-3. Однак відсоток позитивних свиней в обох вакцинованих групах знизився у часі та став значно нижче в ОС--8 та у день розтину (ОМ) в порівнянні з контрольною групою

ТО1.

В обох вакцинованих групах кількість вірусного завантаження, виявленого у сироватці, також була значно зниженою в порівнянні з групою ТО1 у всі дні забору зразків після зараження. В день 185 (0С-3) також спостерігалось значне зниження вірусних титрів в групі ТОЗ3 по відношенню до 702. Таблиця 1 підсумовує результати вірусемії протягом 10-денного періоду після контрольного зараження.

Таблиця 1

Підсумовування результатів вірусемії за групою та днем дослідження (дата фази контрольного зараження) 77711111 одо РНК копій/млсироватки.///://)/Ш

Середнє значення, Фо віре-

Група День отримане ФЕ . Нижче Вище мічних дослідження методом Діапазон 95958 | 9595 СВ | тварин найменших квадратів тої фртів1(рс-) | 20 | 169 | ол |170-570 1931 | 208 | 00 то2 фрів1(рс-) | 18 | 171 | ол 170-570 193 | 209 | 00 тоз (рів1(0с-) | 17 | 170 | 026 |170-70 117 | 222 | 00 тої фрті85(0сС3) | 20 | 647 | ол8 | 528-795 609 | 6,85 | 100,0

Таблиця 1 (продовження) 77711111 одо РНК копій/млсироватки.///://)/СШ

Середнє значення, Фо віре-

Група День отримане . Нижче Вище мічних дослідження методом ЗЕ Діапазон 95958 | 9595 СВ | тварин найменших квадратів

М: кількість; зЕ: стандартна помилка; СВ: довірча межа; Ю - день дослідження; ОС: день контрольного зараження; ОМ: день розтину; ЗТ-КПЛР-позитивна: » 1,7 0910 РНК-копій/мл.

Назальні виділення

Всі свині були негативними на РЕКЗМ за ЗТ-КПЛР у назальних мазках перед контрольним зараженням (0181). Після контрольного зараження, всі свині з ТО1 почали мати назальні виділення. У вакцинованих групах, відсоток свиней, які мали виділення назальним шляхом, складав 94 95 (Т02 група) та 8895 (ТОЗ3 група). Що стосується групи ТО1, значне зниження відсотка назальних виділень спостерігалось у групі ТОЗ на день 185, 188 та 191/192 (ОС-3,

ОСч6 та ОМ) та у групі Т02 на день 191/192 (ОМ). Жодних значних різниць у відсотку назальних виділень між вакцинованими групами виявлено не було. Кількість вірусу, що виділяється назальним шляхом, була в значній мірі вище у групі ТО1 в порівнянні з групою Т02 в ОСяб та

ОМ, та у порівнянні з групою ТОЗ в ОС--3, ЮОС-6 та ОМ. Порівняння між вакцинованими групами продемонструвало, що вірусні титри у групі Т02 були в значній мірі більш високими у порівнянні з ТО3 в ЮСя3. Таблиця 2 підсумовує результати назальних виділень протягом 10-денного періоду після контрольного зараження.

Таблиця 2

Підсумовування результатів назальних виділень за групою та днем дослідження (дата фази контрольного зараження) 71111111 офокопійРНЮМАЛГ//1

Середні

День значення. до назальних!

Група дослідження отриманні ЗЕ Діапазон Нижче Вище виділень методом 95958 | 9595 СВ найменших квадратів тої фртів1(рс-) |201 170 | оле 170-170) 1,32 | 208 | 00 то2 ф|ртів1(рс-) (18) 168 | 020 170-170) 128 | 208 | 00 тоз (рів1(рс-) (161 169 | бі 170-170) 127 | 21 | 00

Таблиця 2 (продовження) 71111111 офокопійРНЮМАЛГ//1

Середні

День значення до назальнихі

Група дослідження отриманні ЗЕ Діапазон Нижче Вище виділень методом 9595 8 | 9595 СВ найменших квадратів

М: кількість; зЕ: стандартна помилка; СВ: довірча межа; ЮО - день дослідження; ОС: день контрольного зараження; ОМ: день розтину; ЗТ-КПЛР-позитивна: » 1,7 0910 РНК-копій/мл.

Виділення з ротової порожнини

Всі свині були негативними на РЕК5М за ЗТ-кПЛР у виділеннях з порожнини рота перед контрольним зараженням (0181). Після контрольного зараження, частина свиней, які мали виділення оральним шляхом склала 9/20 (45 95), 8/18 (44 95) та 7/17 (41 95) у групах ТО1, Т02 та

ТО3, відповідно. До кінця дослідження, всі свині з групи 702 та всі крім однієї в групі ТОЗ були негативними у виділеннях з порожнини рота. У контрольній групі ТО1, 5/20 були все ще позитивними на той момент часу; відмінності у відсотку виділень з порожнини рота між ТО1 та

Т02 були статистично значущими у кінці дослідження (ОМ). Кількість вірусу, що виділяється оральним шляхом, була в значній мірі вище у групі ТО1 у порівнянні з групою ТОЗ3 на день розтину, що відповідає 9/10 дням після контрольного зараження. Вірусне навантаження також було в значній мірі більш високим у групі Т02 у порівнянні з як ТО, так і ТОЗ на день 185 (ОС).

Таблиця З підсумовує результати виділень з порожнини рота протягом 10-денного періоду після контрольного зараження.

Таблиця З

Підсумовування результатів виділень з порожнини рота за групою та днем дослідження (дата фази контрольного зараження) 17771111 одокопійРНКУМЛЛГ/:/СССССССС

Середні значення до виділень

Група День отримані . Нижче Вище |з порожнини дослідження методом ЗЕ Діапазон 95958 | 959565 СВ рота найменши х квадратів тої фртівт(рс-) 20) 770 | 007 |7,70-170) 757 | 183 | 00 |/ то2 фрівт(рс-) (18) 770 | ла |7,70-170) 145 | 195 | 00 тоз (рівт(рс-ї) 117) 770 | 008 |7,70-1,70) 754 | 186 | 00 /і тої фр190(0с-8) Щ|20| 770 | 007 |7,70-1701 757 | 183 | 00 то2 |р190(0с-8) Щ|17| 775 | оз |,70-170) 149 | 200 | 00 тоз (о190(0с-8) Щ|17| 770 | 008 |7,70-1,70) 754 | 186 | 00 |(

Таблиця З (продовження) 17771111 одокопійРНКУМЛЛГ/:/СССССССС

Середні значення до виділень

Група День отримані . Нижче Вище |з порожнини дослідження методом ЗЕ Діапазон 95958 | 959565 СВ рота найменши х квадратів то2 ф|рт91л92(0м)|17| 773 | оз |7,70-170) 148 | 199 | 00 |4

М: кількість; зЕ: стандартна помилка; СВ: довірча межа; Ю - день дослідження; ОС: день контрольного зараження; ОМ: день розтину; ЗТ-КПЛР-позитивна: » 1,7 0910 РНК-копій/мл.

Клінічні спостереження

У жодної зі свиней не було ненормального загального стану, депресії, дихальної недостатності, кашлю або чхання протягом всього періоду після контрольного зараження.

Ректальні температури

Таблиця 4 підсумовує результати ректальної температури протягом періоду після контрольного зараження. У групі ТОЇ, у 5/20 свиней (2595) була лихоманка (КТ 2 40,5), щонайменше, один раз протягом періоду після контрольного зараження. У вакцинованих групах

Т02 та ТО3, частина свиней, у якої була лихоманка після контрольного зараження, складала 8/18 (44 95) та 12/17 (71 95), відповідно. Ректальні температури були у значній мірі вище в обох вакцинованих групах 702 та ТО3 у порівнянні з групою ТО1, на день 185 (ОС3).

Таблиця 4

Підсумовування результатів ректальної температури у поросят за групою та днем дослідження 95 свиней з ти дюйстнн| м їзм | ве | дашкн | зУтх обме, дослідження Діапазон | д55,сВ | 95958 | (ВТ»40,5) тої рів2г(рс) |20| 39,5 | 009 /394032| 393 | 397 | 00 тоз |рів2г(рс) |17| 39,7 | бла 38944043! 394 | 399 | 00 тої рі85(рс3)20| 39,99 | 009 3906-4082 397 | 401 | 50 тої рі88(р0с-6)20| 40,0 | 009 /391440,8| 398 | 401 | 250 тої рі90(0с-83/20| 39,5 | 009 /389-4026| 393 | 397 | 00 тої рі9ц0сС-9)|20| 39,5 | 009 38,85-39995Ї 393 | 397 | 00 то2 |рі910с9)117| 39,7 | 014 3902402| 394 | 400 | 00

І 5М: Середні значення отримані методом найменших квадратів; ЗЕ: Стандартна помилка; СВ: довірча межа; КТ: Ректальної температури.

Ураження легень

Відсоток легень з ураженнями для кожної групи лікування показаний у таблиці 5. Візуальні оцінки легень показані у таблиці 6. Під час розтину, 18/20 свиней (90 95) з контрольної групи ТО1 мали позитивний візуальний бал легень, що свідчить про те, що контрольне зараження РКЕА5М було вдалим в індукуванні уражень легень. В групах Т02 та ТО3, 12/17 (71 95) та 7/16 (44 95) свиней також отримали позитивні результати. У одної свині з групи ТОЗ (2300) спостерігалась катарально-гнійна плевропневмонія, яка вражає від 10 до 70 95 правих часток легені, від 2 до

ЗО 95 лівих часток легені та 70 95 від додаткової частки, таким чином маскуючи присутність будь- якого потенційного ураження, пов'язаного з РЕКЗУ. Дані від цієї свині були марковані з аналізу (дивіться доповідь з маркування у М5БЕ). Відсоток легень з ураженнями, який спостерігався під час розтину, був значно вищий у контрольної групи ТО1 в порівнянні з вакцинованими групами

ТО02 та ТО3. Не було виявлено жодних розбіжностей між вакцинованими групами.

Таблиця 5

Підсумовування результатів відсотка легень з ураженнями

Зворотно Нижче 95 96 Вище . 0,2-13,5 00-44 0,0-5,2 х Різні літерні позначення вказують на статистично значущу відмінність.

Таблиця 6

Візуальна оцінка легень за групами лікування загальні 0 1 о. З спостереженн

Група (жодних уражень) |(слабкі ураження) (помірні (важкі ураження) я раження тої 12 | 100 | 17 | 850 | 1 | 50 | 0 | 00 | го то2 | 5 | 294 | 12 | 706 | 0 | 00 | 0 | 00 | 17 тоз | 9 | 563 | 7 | 438 | 0 | 00 | 0 | 00 | їв

Результати серології (ІФА)

Короткий опис результатів серології показаний в таблиці 7. Результати ІФА, отримані зі зразків, зібраних з місячними інтервалами під час фази вакцинації, підсумовані лише з описовою статистикою (середнє геометричне значення та стандартні відхилення); розбіжності між групами не могли бути оцінені, тому що не було реплікації експериментальної одиниці (лікування не було замасковане). Розбіжності між групами були досліджені лише на 181-й день дослідження, після того, як тварини з'явилися у фазі контрольного зараження. Всі свині були негативними за ІФА перед вакцинацією (співвідношення ІЮЕХХ 5/Р « 0,4). Свині з контрольної групи ТО01 залишались негативними до контрольного зараження. Через один місяць після вакцинації (28-ий день) всі свині з груп Т02 та ТОЗ3 вже виробили антитіла до РЕКЗУ, і всі вони залишалися позитивними на момент контрольного зараження (через 6,5 місяців після вакцинації). Порівняння між групами на день 181 (0С-1) продемонструвало значно більш високі середні значення за методом найменших квадратів титрів антитіл у групі ТОЗ в порівнянні з групою Т02.

Таблиця 7

Підсумовування результатів співвідношення 5/Р за ІФА.

Кількість день Середнє до серо- лікувань ослідження геометричне ЗБ/ЗЕ Діапазон позитивності

У д д значення/! ЗМ" 0,023 0,002 | -0,019-0239| 00 0,006 0,000 -0,015-0140| 00 0,001 0,000 -0018-0100| 00 -0,013 -0,000 | -0,025-0018| 00 2,487 0,174 | 2,112-2,923 100,0 2,496 0,218 | 2,022-3,037 100,0

Таблиця 7 (продовження)

Кількість день Середнє й до серо- лікувань дослідження геометричне З/ЗЕ Діапазон позитивності значення/І ЗМ" тої 0 |Деньбб// 120 | 0010 |-0001|-00790и182| 2 Щщ 00 ж ЖЖ тої |День83///// 20 | 0011 | 00001 -001330080| 2 щ 00 ж ЖЕВ тої |Деньї!ї3 20 | 0042 | 00011 -000340091| 2 щ 00 ж Е тої 0 |Деньї40/// 20 | 0023 | 00011 -00050и18| 2 щ 00 ж ЖЗІ тої |Деньї68,/// 20 | 0034 | 0001|-00020и22| 00 К( тої 0 |Деньї8ї,// 20 | 0055 |0001|00060200| 00 КК З "Результати з днів 0, 28, 56, 83, 113, 140 та 168 виражаються у вигляді середнього геометричного значення та стандартного відхилення (500). День 181 у вигляді зворотно перетворених - середнього значення за методом найменших квадратів (І ЗМ) та стандартної помилки (ЗЕ); ІФА позитивний: співвідношення 5/Р 2 0,4

Вірусемія та виділення

Перед статистичним аналізом ЗТ-КПЛР перетворили з використанням відповідного логарифмічного перетворення. Перетворені дані були проаналізовані з використанням загальної лінійної змішаної моделі з повторними вимірюваннями. Попарне порівняння обробки проводилось у кожний момент часу, якщо ефект лікування або лікування на момент часу було значним (Рх0,05). Середнє значення за методом найменших квадратів та 95 95 довірчі інтервали лікування були зворотно перетворені для представлення. Відсоток вірусемічних/з виділеннями тварин також був розрахований. Кожний зразок був визначений як позитивний, якщо» 50 копій РНК РКК5М/мл (1,7 Ісд910 копій РНК РКК5М/мл), що відповідає половині межі виявлення методу (100 копій РНК РКК5ЗМ/мл). Крім того, було визначено, чи була тварина коли- небудь вірусемічною або коли-небудь були у неї виділення протягом Днів х ОС (стосується періоду перед контрольним зараженням) та Днів » ОС (після контрольного зараження). Таблиці частот для статусу вірусемія були розраховані для кожної точки часу, якщо у тварини коли- небудь була вірусемія протягом декількох днів до контрольного зараження та днів після контрольного зараження.

Ректальні температури

Ректальні температури були проаналізовані з використанням аналізу загальної лінійної змішаної моделі з повторними вимірюваннями. Попарне порівняння обробки проводилось у кожний момент часу, якщо ефект лікування або лікування на момент часу був значним (Р«0,05).

Середнє значення лікування за методом найменших квадратів, 9595 довірчі інтервали, максимум та мінімум були розраховані для кожної часової точки. Описові статистичні дані, середні значення, стандартні відхилення та діапазони були розраховані для кожного лікування і дня дослідження до контрольного зараження.

Розподілення частот тварин з лихоманкою (ректальна температура 40,52С) розраховували для кожної обробки та збирали дані за часовими точками. Було визначено, чи була у тварини лихоманка протягом днів х ОС і днів » ОС. Таблиці частот для випадків, коли у тварини коли- небудь була лихоманка, були розраховані для кожного періоду, дні х ОС і дні » ОС.

Зо Серологія (ІФА)

Перед статистичним аналізом серологія була перетворена, де це необхідно, з використанням відповідного логарифмічного перетворення. Перетворені серологічні дані аналізували з використанням загальної лінійної змішаної моделі з повторними вимірюваннями.

Порівняння парного лікування проводили у кожний момент часу, якщо ефект лікування або лікування на момент часу було значним (Р «х 0,05). Середнє значення за методом найменших квадратів та 95 95 довірчі інтервали лікування були зворотно перетворені для представлення.

Крім того, частотні розподілення позитивних/негативних результатів були розраховані для кожної обробки у кожний момент часу. Крім того, для кожної тварини було визначено, чи є вона сероконвертованою (2 0,4 співвідношення 5З/Р) в будь-який час протягом дослідження.

Розподілення частот того, чи є тварина сероконвертованою або ні, розраховували для кожної обробки. Описові статистичні дані, середні значення, стандартні відхилення та діапазони були розраховані для кожної обробки, перед контрольним зараженням.

Клінічні спостереження

Частотні розподілення клінічних ознак перед контрольним зараженням та клінічних ознак після контрольного зараження розраховували окремо для кожної обробки та збирали дані у певні точки часу. Частотні розподілення того, чи мала тварина коли-небудь клінічну ознаку, для кожної фази (дні х ОС та дні » ОС), розраховували для кожної обробки.

Маси тіла

Маси тіла аналізували з використанням загальної лінійної змішаної моделі з повторними вимірюваннями. Середнє значення лікування за методом найменших квадратів, стандартні помилки, 95 95 довірчі інтервали, максимуми та мінімуми були розраховані для кожної обробки у кожній часовій точки. Порівняння парного лікування проводили між обробками у кожний момент часу, якщо ефект лікування або лікування за взаємодією на момент часу був значним (Р « 0,05).

Стандартні помилки та 95 95 довірчі інтервали оцінок були розраховані. Описові статистичні дані, середні значення, стандартні відхилення та діапазони були розраховані для кожної обробки, перед контрольним зараженням. Оцінки середнього щоденного приросту та порівняння були розраховані з використанням оцінок параметрів з моделі.

Ураження легень

Відсоток всієї легені з ураженнями розраховували за наступною формулою: Відсоток всієї легені з ураженнями - (0,10 х лівої краніальної частки) «- (0,10 х лівої середньої частки) ях (0.25 х лівої каудальної частки) -- (0,10 х правої краніальної частки) «ж (0,10 х правої середньої частки) їх

Зо (0.25 х правої каудальної частки) ї- (0,10 х додаткової частки). Перетворення квадратного кореня арксинуса застосовували до відсотку від загальної частини легень з ураженнями до аналізу. Трансформовані ураження легень аналізували за загальною лінійною змішаною моделлю. Попарне порівняння було зроблене між групами лікування, якщо ефект лікування був значним. Розраховували зворотно перетворені середні значення за методом найменших квадратів відсотка загальної частини легені з ураженнями, їх стандартні помилки, та їх 95 95 довірчі інтервали, а також мінімуми та максимуми.

Бали оцінки ураження легені

Частотні розподілення балів оцінки ураження легень розраховували для кожної обробки.

Бали, нормальні або ненормальні, були проаналізовані з використанням узагальненої лінійної змішаної моделі для біноміальних даних. Якщо загальна лінійна змішана модель не сходилась, для аналізу даних використовувався точний критерій Фішера. Якщо основний ефект лікування був значним, то проводилось попарне порівняння лікування.

Моделі для аналізів

Перетворений відсоток від загальної частини легені з ураженнями аналізували з використанням загальної лінійної змішаної моделі з фіксованими ефектами, лікуванням, та випадковими ефектами загону та блоку в межах загону. Лінійні комбінації оцінок параметрів використовувались у апріорних контрастах після тестування стосовно значного (Р«:0,05) ефекту лікування. Порівняння були зроблені між обробками. Рівень значущості 595 (Р«0,05) використовувався для оцінки статистичних розбіжностей. Середні значення за методом найменших квадратів (зворотне перетворення), стандартні помилки, 95 95 довірчі інтервали середніх значень та діапазонів були розраховані для кожної обробки.

Статус вірусемії аналізували з використанням загальної лінійної змішаної моделі з повторними вимірюваннями з логіт-зв'язком з фіксованими ефектами: обробка, момент часу та вплив контрольного моменту часу на результати лікування, а також випадкові ефекти: загін, блок в межах загону та тварина в межах блоку, загін та лікування, яке відноситься до терміну "тварина". Лінійні комбінації оцінок параметрів використовувались у апріорних контрастах після дослідження стосовно значного (Р «х 0,05) ефекту лікування або впливу контрольного моменту часу на результати лікування. Порівняння були зроблені між обробками у кожний момент часу.

Рівень значущості 595 (Р х 0,05) використовували для оцінки статистичних розбіжностей. бо Середні значення за методом найменших квадратів (зворотно перетворені), стандартні помилки, та 95 95 довірчі інтервали середніх значень були розраховані для кожної обробки та моменту часу. Якщо модель не сходилась, для аналізу даних використовувався точний критерій

Фішера.

Бали оцінки легені, нормальні/ненормальні, і, якщо коли-небудь, вірусемії були проаналізовані з використанням узагальненої лінійної змішаної моделі з фіксованими ефектами лікування та випадковими ефектами: загін, блок в межах загону з використанням СІ ІММІХ.

Якщо основний ефект лікування був значним, то проводились попарні порівняння лікування.

Якщо СГ ІММІХ не сходився, для аналізу даних використовувався точний критерій Фішера.

Вірусне навантаження, серологія, маса тіла, та ректальні температури аналізувалися з використанням узагальненої лінійної змішаної моделі з повторними вимірюваннями з фіксованими ефектами: обробка, момент часу, та вплив контрольного моменту часу на результати лікування, та випадкові ефекти: загін, блок в межах загону та тварина в межах блоку, загін та лікування, яке відноситься до терміну "тварина". Лінійні комбінації оцінок параметрів використовувались в апріорних контрастах після дослідження стосовно значного (Р - 0,053 ефекту лікування або впливу контрольного моменту часу на результати лікування.

Порівняння були зроблені між обробками у кожний момент часу. Рівень значущості 5 95 (Р « 0,05) використовували для оцінки статистичних розбіжностей. Середні значення за методом найменших квадратів (зворотно перетворені стосовно вірусного навантаження та серології), стандартні помилки, 95 95 довірчі інтервали середніх значень та діапазонів були розраховані для кожної обробки та моменту часу. Всі дослідження гіпотез були проведені на рівні значущості 0,05 з використанням двосторонніх критеріїв.

Обговорення

Таким чином, мета представленого дослідження складалась в тому, щоб оцінити тривалість імунітету (БОЇ) модифікованої живої вакцини ЄС РКК5 (5ЕО ІО МО: 5) у свиней, вакцинованих у віці 1-ого дня шляхом внутрішньом'язового (в.м., група Г02) та інтраназального (і.н., група ТО03) введення під час інокуляції ізолятом РКК5 генотипу І як респіраторне контрольне зараження через 26 тижнів після вакцинації. Основною змінною під час визначення ефективності була вірусне навантаження у сироватці крові (вірусемія) в групах обробки Т02 та ТО3 в порівнянні зі свинями Т01. Ураження легень, ректальні температури, виділення, клінічні ознаки та маса тіла

Зо порівнювались як вторинні змінні.

Дослідження було дійсним, оскільки всі свині ТОЇ залишалися вірусно-негативними на

РЕКЗМ протягом періоду вакцинації та не було виявлено жодних змішаних факторів захворювання. Захисний ефект вакцинації як в.м., так і ін. спостерігався під час порівняння вірусного навантаження у сироватці крові між групами; контрольна група Т01 мала значно більш високі вірусні титри в порівнянні з вакцинованими групами 102 та ТО3 у всі дні забору проб після контрольного зараження. Крім того, по відношенню до контрольної групи частина віремічних свиней також була значно зниженою на 8-ий та 9/10-ий день після контрольного зараження в обох вакцинованих групах. Коли порівнювали вакциновані групи, значно більш низькі титри вірусу були виявлені на 185 день (ОС--3) в групі, вакцинованої і.н. шляхом (ТО3), в порівнянні з групою, вакцинованою внутрішньом'язово (Т02). Перевага як в.м., так і і.н. вакцинації відносно реплікації вірусу також підтверджується значним зниженням, яке спостерігається в обох вакцинованих групах, кількість вірусу, який виділяється назальним шляхом, а також відсотка назальних виділень. Крім того, позитивний ефект вакцинації також спостерігався за виділеннями порожнини рота на 9/10-ті дні після контрольного зараження, про що свідчить значне зниження вірусного навантаження (група ТО3) або відсоток позитивних свиней за виділеннями з порожнини рота (група 702) відносно контрольної групи.

Після контрольного зараження, ректальні температури були в значній мірі вище в обох вакцинованих групах в порівнянні з контрольною групою в ОС--3. В той же час частина свиней з лихоманкою (КТ240,52С) в групах, вакцинованих ІМР в.м. та і.н. способом, складала 6/18 (33 95) та 9/17 (53 95), відповідно. У контрольній групі, лише у 1/20 (5 95) була лихоманка в ОС-3. Однак слід відмітити, що в той час (0С--3) вірусне навантаження, виявлене у сироватці крові, дійсно значно знижувалось в обох вакцинованих групах в порівнянні з контрольною групою, що дозволяє припустити, що реплікація РКЕК5МУ, ймовірно, була не єдиною причиною підвищеної ректальної температури, яка спостерігалась у вакцинованих свиней незабаром після контрольного зараження. Крім того, с того моменту ректальні температури у вакцинованих свиней знижувались, і до 8-ого дня після зараження середні ректальні температури у всіх групах вже були нижче 40 "С.

Крім підвищених ректальних температур, в жодної зі свиней в жодній групі не було клінічних ознак, зіставних з РКК5М (ненормальний стан тіла, депресія, респіраторний дистрес, кашель бо або чхання) протягом всього періоду після контрольного зараження. Крім того, між групами не було виявлено жодних розбіжностей у масі тіла або середньодобовому прирості маси.

Під час розтину 18/20 свиней (90 95) з контрольної групи ТО1 мали позитивний візуальний показник легень, що свідчить про те, що зараження РЕКЗМ було вдалим стосовно індукування ураження легень. В групах Т02 та ТО3 12/17 (71 95) та 7/16 (44 95) свиней також дали позитивні результати. Порівняння між групами лікування показало значно більш високий 95 легені з ураженнями в контрольній групі, ніж у вакцинованих групах, демонструючи перевагу вакцинації за рахунок зменшення уражень легень, зв'язаних з РЕКЗУ, незалежно від способу введення.

Серологічні дані продемонстрували, що вакцинація з використанням ІМР з використанням в.м. або ін. способу індукувала розвиток РКК5М-специфічних антитіл протягом 28 днів після вакцинації. Всі вакциновані свині були серопозитивними до антитіл РЕКЗМ під час контрольного зараження (через 6,5 місяців після вакцинації), що свідчить про те, що обидва способи введення могли викликати сильну та захисну відповідь антитіл на вакцинацію. Однак порівняння між вакцинованими групами показало значно більш високі титри антитіл в групі, вакцинованої і.н. способом введення, в порівнянні з групою, вакцинованою в.м. способом введення.

Хоча вакцинація ін. та в.м. способом забезпечувала чіткий захист від РККЗМ в контрольному заражені через 26 тижнів після вакцинації, порівняння між групами продемонструвало, що через З дні після контрольного зараження у групи, вакцинованої і.н. способом (ТО3), була значно більш низька вірусемія, виділення з носа та виділення з порожнини рота в порівнянні з групою, вакцинованою внутрішньом'язово (102). Дані результати показують, що в умовах представленого дослідження захист, отриманий після і.н. вакцинації, був сильніше, ніж після в.м. вакцинації. Дані розбіжності у вірусологічному результаті могли б бути пояснені значно більш високими титрами антитіл, виявленими ІФА перед контрольним зараженням в групі, вакцинованою і.н. (діапазон співвідношення 5/Р: 0,665-2,422), в порівнянні з групою вакцинованою в.м. (діапазон співвідношення 5/Р: 0,477-1,959).

Вакцинація шляхом одноразового введення вакцини МІМ БО РЕК (5ЕО ІЮ МО: 5), що містить дозу 2,5 0910 ССІЮ5БО, серонегативним свиням у 1-денному віці, або в.м., або і.н. способом, забезпечувала імунітет тривалістю 26 тижнів, так як це видно по значному зниженню вірусного навантаження, виявленого у сироватці після контрольного зараження патогенним штамом ЄЮ РЕКЗМ через 26 тижнів після вакцинації. Ефективність також була підтверджена

Зо значним зниженням відсотка уражень легень під час розтину, а також зменшенням виділення з носа та порожнини рота.

Лабораторні способи

Стосовно ЗТ-КПЛР, вірусемія (навантаження РККБЗМ в сироватці) та виділення (навантаження РКК5ЗМ в матеріалі мазку) вимірювали за допомогою кПЛР зі зворотною транскрипцією (ЗТ), яка виконується після локальної ОР на зразках сироватки, зібраних перед вакцинацією (0-1), перед контрольним зараженням (062) та у 3, 5, 7 та 10-ий дні після контрольного зараження (066, 068, 070 та 073). Коротко, очищена вірусна РНК використовувалась як матриця, транскрибована зворотно при 50 "С протягом 30 хвилин та денатурована при 95 "С протягом 5 хвилин. ПЛР програма відповіді складалася з 40 циклів денатурації при 95 "С протягом 20 секунд та ренатурації при 53 "С протягом 40 секунд. ЗТ-КПЛР проводили у термоблоці системи ПЛР в реальному часі 7500. Праймери, що підходять і зонд були вибрані для вірусу Лелістада наступним чином:

Прямий праймер (Лелістад Р): 5-Я4САССАССТСАСССАСАС-3 (5ЕБО ІО МО: 6, кінцева концентрація 0,5 мікромоль).

Зворотний праймер (Лелістад К): 5-САС,ттОоСтасассттТаАТ-3 (5ЕБО ІЮ МО:7, кінцева концентрація 0,5 мікромоль).

Зонд (Лелістад 5): 5'-6-БАМ-ССТоТасСсттасААТССАТОСАСАС -ТАМНАА-3" (5ЕО І МО:8, кінцева концентрація 0,6 мікромоль).

Серологія (ІФА)

Сироватки, зібрані перед вакцинацією (00), перед контрольним зараженням (067) та під час розтину (077), досліджували на антитіла до РКЕК5М з використанням ІФА ІЮЕХХ РККЗ ХЗ, дотримуючись інструкцій виробника. Коротко, зразки сироватки розводили 1:40 у 96-лунковому планшеті, покритому рекомбінантним антигеном РЕКЗУ, та інкубували 30 хвилин при 18-26 "С.

Після промивання додавали анті-свинячий пероксидазний кон'югат хріну, та планшети інкубували протягом ще 30 хвилин при 18-26 "С. Незв'язаний кон'югат вимивали і у лунки додавали субстрат ТМВ. Розвиток кольору вимірювали за 650 нм. Значення 5/Р були записані для кожного зразка. Якщо співвідношення 5/Р складало 2 0,4, зразок був класифікований як позитивний на антитіла до РРОС. Якщо співвідношення 5/Р складало « 0,4, то зразок був класифікований як негативний. Інструкції ІФА були включені до файлу дослідження. бо Приклад 4 - Виникнення імунітету (9ОЇІ) від модифікованої живої вакцини ЄЮ РЕКБЗМУ,

введеної 2--ижневим свиням проти контрольного зараження європейським ізолятом РКК5 через 4 тижні після вакцинації.

Мета даного дослідження полягала у тому, щоб оцінити виникнення імунітету (ОО) від експериментальної вакцини МІГМ ЄС РЕККБЗМ (вірус 5ЕО ІЮ МО: 5), яку вводять свиням 2- тижневого віку для профілактики респіраторного захворювання, викликаного РКК5БУ, через 4 тижні після вакцинації. Первинною змінною під час визначення профілактики захворювання було вірусне навантаження у сироватці крові в групі лікування 702 (вакцинованою досліджуваним об'єктом) в порівнянні з групою ТО1 (вакцинованою контрольним продуктом), що підтверджується ураженнями легень, виділенням з ротової порожнини та назальним виділенням, клінічними спостереженнями, ректальними температурами та масою тіла.

У віці 14-15 днів, одноразову дозу 2,0 мл контрольного продукту (СР) або досліджуваного об'єкту (вірус ТІ, ЗЕО ІО МО:5) вводили у вигляді внутрішньом'язової ін'єкції кожній тварині

Через чотири тижні після вакцинації, свиней піддавали контрольному зараженню інтраназально ізолятом ЄЮ РККЗМ О101/91 як респіраторне контрольне зараження. Під час фази контрольного зараження, зразки крові, назальні виділення та виділення з порожнини рота, клінічні спостереження та ректальні температури збирались кожні 2-3 дні до дня розтину. Свиней зважували за день перед вакцинацією, перед контрольним зараженням та під час розтину.

Через десять днів після контрольного зараження, свиней анестезували, піддавали евтаназії та розтину. Після розтину легені оцінювали на наявність уражень та осередків РКК5М. Дане дослідження було дійсним, оскільки свині ТО1 залишалися РКК5МУ серо- та вірусно-негативними протягом періоду вакцинації, та не було виявлено жодних змішаних факторів захворювання.

Захисний ефект вакцинації спостерігався під час порівняння вірусного навантаження у сироватці крові між групами. Група, вакцинована ТІ (Т02), мала значно більш низькі вірусні титри в порівнянні з контрольною групою у всі дні забору зразків після контрольного зараження.

Ефективність також була підтверджена значним зниженням відсотка легень з ураженнями під час розтину (через 10 днів після контрольного зараження), зниженням назальних виділень та виділень з порожнини рота, а також зниженням ректальних температур через 7 днів після контрольного зараження. Жодних розбіжностей у масі тіла виявлено не було. Вакцинація індукувала розвиток РКЕКЗМ-специфічних антитіл протягом 4 тижнів після вакцинації. Через

Зо десять днів після контрольного зараження, титри антитіл залишалися значно вищі в групі Т02 в порівнянні з контрольною групою (Т01). На завершення слід зазначити, що одноразове внутрішньом'язове введення експериментальної вакцини ЄЮ РКК5ЗМ МІУ, що містить дозу 2,0

Іодіо ССіЮво свиням 14-15 денного віку (серонегативні відносно РЕКБЗМУ) захищало від респіраторного захворювання, викликаного після контрольного зараження патогенним штамом

ЕЕ РЕКЗ через 4 тижні після вакцинації. Дизайн експерименту виглядає наступним чином:

ВАКЦИНАЦІЯ (День 0) матеріал матеріал продукт продукт мл

На 27-ий день після повторного розміщення у стайнях свиней, всіх тварин піддавали контрольному зараженню 2 мл контрольного штаму О1Ї091 інтраназальним (ІМ) способом.

Свиней піддавали контрольному зараженню загальним об'ємом контрольного зараження 2,0 мл шляхом закапування 1,0 мл матеріалу, що зараджує в кожну ніздрю. Свині утримувались в положенні з піднятою головою протягом декількох секунд після контрольного зараження.

Клінічні спостереження та ректальні температури

Клінічні спостереження включали загальний стан, депресію, чхання, кашель та дихальну недостатність. Ректальні температури реєстрували відповідно з місцевими стандартними процедурами. В ті дні (перед та після вакцинації/контрольної імунізації), коли повне клінічне обстеження не проводилось, загальний стан здоров'я свиней спостерігали та реєстрували у формах щоденного огляду по догляду за тваринами (ОКАС), дотримуючись стандартної БОР.

Розтин та оцінка легені.

Під час розтину ураження легень оцінювали з використанням наступних способів: 1) відсоток ущільнення для кожної частки (лівої краніальної частки, лівої середньої частки, лівої каудальної частки, правої краніальної частки, правої середньої частки, правої каудальної частки та додаткової частки) буде оцінюватися та реєструватися як відсоток частки, що спостерігається з ураженнями; та 2) числовий візуальний бал (0, 1, 2, 3).

ЗТ кПпПлР

Вірусемія (навантаження РККБЗМ у сироватці) та виділення (навантаження РЕКЗМ у назальних виділеннях та виділеннях з порожнини рота) вимірювались за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції (кКПЛР) зі зворотною транскриптазою (ЗТ), що здійснюється відповідно до стандартних процедур. Коротко, очищену вірусну РНК використовували як матрицю, зворотно транскрибували при 50 "С протягом 30 хвилин та денатурували при 957 протягом 5 хвилин. Програма ПЛР реакцій складалася з 40 циклів денатурації при 957 протягом 20 секунд та ренатурації при 53 "С протягом 40 секунд. ЗТ-КПЛР проводили у системному термоблоці ПЛР у реальному часі 7500. Результати виражали у вигляді копій

РНК/мл.

Серологія

Сироватки, зібрані перед вакцинацією, перед контрольним зараженням та під час розтину, були досліджені на антитіла до РКК5М з використанням ІФА ІЮЕХХ РЕК5 Х3, дотримуючись інструкцій виробника. Коротко, зразки сироватки розводили 1:40 у 96-лунковому планшеті, покритому рекомбінантним антигеном РЕКБЗМУ, та інкубували 30 хвилин при 18-26 "С. Після промивання додавали анти-свинячий кон'югат пероксидази хріну, та планшети інкубували протягом ще 30 хвилин при 18-26 "С. Незв'язаний кон'югат вимивали та у лунки додавали субстрат ТМВ Розвиток кольору вимірювали при 650 нм. Значення 5/Р були записані для кожного зразка. Якщо співвідношення 5/Р складало 2 0,4 зразок був класифікований як позитивний на антитіла до РКЕК5. Якщо співвідношення 5/Р складало « 0,4 зразок був класифікований як негативний. Інструкції за ІФА включаються у файл дослідження. Дослідження закінчилось на 37 день (евтаназія).

Вірусемія та виділення

Перед статистичним аналізом дані ЗТ-КПЛР були перетворені з використанням відповідного логарифмічного перетворення. Перетворені дані були проаналізовані з використанням загальної лінійної змішаної моделі з повторними вимірюваннями. Попарне порівняння лікування проводилось у кожний момент часу, якщо ефект лікування або вплив контрольного моменту часу на результати лікування є значним (Р«0,05). Середнє значення за методом найменших

Зо квадратів та 95 95 довірчі інтервали були зворотно перетворені для представлення. Відсоток днів вірусемій/виділень був також розрахований. Кожний зразок був визначений як позитивний, якщо 2250 РККЗМ копій РНК/мл, що відповідало половині межі виявлення методу (500 РЕК5М копій РНК/мл зразка). Також було визначено, чи була тварина коли-небудь вірусемічною або коли-небудь мала виділення протягом днів х27 (стосується перед контрольним зараженням) та днів 227 (після контрольного зараження).

Ураження легень

Відсоток від загальної частини легені з ураженнями розраховували, використовуючи наступну формулу: Відсоток від загальної частини легені з ураженнями - (0,10 х лівої краніальної частки) «т (0,10 х лівої середньої частки) я (0,25 х лівої каудальної частки) я (0,10 х правої краніальної частки) -- (0,10 х правої середньої частки) «ж (0,25 х правої каудальної частки) т- (0,10 х додаткової частки). Перетворення квадратного кореня арксинуса застосовували до відсотку від загальної частини легень з ураженнями до аналізу. Трансформовані ураження легень аналізували за загальною лінійною змішаною моделлю. Попарне порівняння було зроблене між групами лікування, якщо ефект лікування був значним. Розраховували зворотно перетворені середні значення за методом найменших квадратів відсотка загальної частини легень з ураженнями, їх стандартні помилки, та їх 95 95 довірчі інтервали, а також мінімуми та максимуми. Частотні розподілення балів оцінки ураження легень розраховували для кожної процедури. Бали, нормальні або ненормальні, були проаналізовані з використанням загальної лінійної змішаної лінійної моделі для біноміальних даних. Якщо загальна лінійна змішана модель не сходилась, для аналізу даних використовувався точний критерій Фішера. Якщо основний ефект лікування був значним, то проводилось парне порівняння лікування.

Оцінка легені

Відсоток легень з ураженнями для кожної групи лікування показаний в таблиці 8. Візуальні оцінки легень представлені в таблиці 9. Під час розтину 17/18 свиней (94,4 95) з контрольної групи ТО1 мали позитивний візуальний показник легень, який свідчить про те, що контрольне зараження РЕКЗМ було вдалим в індукуванні уражень легень. В групі Т02, 14/19 (73,7 Об) свиней також були оцінені як позитивні. Контрольна група ТО01 мала в значній мірі більш високий середній відсоток І 5 легень з ураженнями в порівнянні з групою Т02. Що стосується загального візуального показника легені, то легені від усіх свиней групи 702 були оцінені як 0 (без уражень) бо або 1 (легкі ураження). В контрольній групі ТО1 7/18 (38,9 95) свиней отримали візуальний бал 2

(помірні ураження). Жодній з легень в жодній з груп не було надано візуальне значення З (тяжкі ураження).

Таблиця 8

Підсумовування результатів відсотка легень з ураженнями

Зворотно перетворене Стандартна о о . середнє помилка Нижче 95 95 СІ | Вище 95 95 СІ Діапазон значення І 5

От до 29

Ото до 10

Різні індекси означають значні розбіжності між групами.

Таблиця 9

Візуальний показник легені за групами лікування

Загальні о (жодних уражень) 1 (слабкі ураження) | 2 (помірні ураження) |Іспостереження

Обробка 2-08 20В 7 208-- то2 | 4 | 263 | 714 | 737 | 0 | 00 | 19

Результати ЗТ-КПЛР, вірусемія (навантаження РККЗУ у сироватці крові)

Всі свині, як було виявлено, є РКЕК5М-негативними за ЗТ-кПЛР в крові на день 0. Під час контрольного зараження (27-ий день), РНК РКК5М можна було виявити у 100 95 свиней, вакцинованих ТІ (група Т02). До того часу всі свині ТОЇ були все ще РАН5ЗМ-негативними. У контрольних свиней, вірусемія була вперше виявлена на 29 день (через 2 дні після контрольного зараження), і свині залишалися позитивними на РКК5М до кінця дослідження. У всі дні забору зразків після контрольного зараження, вірусні навантаження, виявлені у контрольній групі ТО1, були значно вище, виявлені у групі Т02. В таблиці 10 підсумовані результати вірусемії з 27-го дня (дня контрольного зараження) по 36-ий день. Підсумовування результатів середніх значень, отриманих методом найменших квадратів та розбіжностей середніх значень І 5 між групами показана у таблиці 11.

Таблиця 10

Підсумовування результатів вірусемії за групами та днем дослідження

Год1Окопій РНК / мл сироватки

Середнє оу ослідження "Методом Стандартна Діапазон ов чо лові чої. вірусемічни д д етод помилка довірчої довірчої х свиней найменших межі межі квадратів я тов |роож

Таблиця 10 (продовження)

Год1Окопій РНК / мл сироватки

Середнє оу дослідження "методом Стандартна Діапазон м овірчої А оврчої вірусемічни в помилка : : х свиней найменших межі межі квадратів то2 |День3з! | 69 | 027 |від4до8,9 100,0 95 вд42до8!| 59 | 69 | 100,09

Позитивна ЗТ-кПЛР: » 2,4 Іод10 копій РНК/мл

Таблиця 11

Підсумовування результатів таблиці середніх значень, отриманих методом найменших квадратів для результатів за вірусемією

Номер Середнє значення за методом найменших квадратів на різні дати дослідження лікування то2 11605 | 56» | 69 | 64» | 568

Різні індекси означають значні розбіжності між групами.

Назальні виділення та виділення з порожнини рота

Всі свині, як було виявлено, є РКЕКЗМ-негативними за ЗТ-кПЛР у мазках з носа та порожнини рота на день 0. Під час контрольного зараження (27-ий день), у 7095 та 8595 свиней вакцинованих ТІ (група Т02) виявлялася РНК РКК5ЗМУ в назальних виділеннях та виділеннях з порожнини рота, відповідно. Жодна свиня з групи ТО1 не виділяла в той момент часу. Протягом періоду після контрольного зараження, відсоток назальних виділень в групі ТО1 знаходився в діапазоні від 85 95 (34-ий День) до 100 95 (29-ий День). В групі 02, відсотки назальних виділень знаходились в діапазоні від 42 95 (36-ий День) до 90 95 (29-ий День). Що стосується виділення з порожнини рота, відсоток позитивних свиней знаходився в діапазоні від 95 до 100 95 в групі Т01 та від 73,7 до 100 95 в групі Т02. Порівняння І 5М між групами продемонструвало значні, більш високі вірусні навантаження в групі ТО1 у всі дні після контрольного зараження, але на 34-ий день для назальних мазків та на З31-ий і 36б-ий день для виділень з порожнини рота.

Результати стосовно назальних виділень та виділень з порожнини рота з 27-ого дня (дня контрольного зараження) до 36-ого дня підсумовані у таблиці 12, і таблиці 14 відповідно.

Короткий виклад І ЗМ та І 5 середніх значень відмінностей між групами показані у таблицях 13 та 15.

Зо

Таблиця 12

Підсумовування результатів назальних виділень за групою та днем дослідження

Копій РНК / мл (на мазок)

Середнє о,

День значення за о о о дослідження| методом Стандартна Діапазон Нижче 95 6. Вище 35 ів |Виділення

В помилка довірчої межіїдовірчої межі свиней найменших квадратів грон

Позитивна ЗТ-кПЛР: » 2,4 Іод10 копій РНК/мл

Таблиця 13

Підсумовування результатів таблиці середніх значень, отриманих методом найменших квадратів для назальних виділень

Номер Середнє значення за методом найменших квадратів на різні дати дослідження лікування

Таблиця 14

Підсумовування результатів виділень з ротової порожнини за групою та днем дослідження

Копій РНК / мл (на мазок

Середнє о,

День значення за о о о дослідження| методом Стандартна Діапазон Нижче 95 в. Вище 95 ів й видіЛеННЯ

В помилка довірчої межі|довірчої межі! свиней найменших квадратів відг4дога| 20 / 28 | 0095 відг4до74| 43 | 54 | 85095 від2,4до 59 38 / 46 95095 від2,4до52| 35 / 46 90095 100,0 бе

Таблиця 14 (продовження)

Копій РНК / мл (на мазок)

Середнє оу

День значення за о о о дослідження| методом Стандартна Діапазон Нижче 95 в. Вище 95 ів й видіЛеННЯ

В помилка довірчої межі|довірчої межі! свиней найменших квадратів від24добб| 38 / 49 94795 від3,7доб,7| 45 | 53 |100,095 від З до 5,8 100,0 96 від 3,5 до б. 100,0 96 від2,4до52| 33 | 44 | 73,7 96

Позитивна ЗТ-кПЛР: » 2,4 Іод10 копій РНК/мл

Таблиця 15

Підсумовування результатів таблиці середніх значень, отриманих методом найменших квадратів для виділень з ротової порожнини

Номер Середнє значення за методом найменших квадратів на різні дати дослідження лікування

Різні індекси означають значні розбіжності між групами.

Серологія

Всі свині були серологічно негативними відносно РЕКБЗМ перед вакцинацією (співвідношення Б/Р ІОЕХХ «0,4). Під час контрольного зараження (через 4 тижні після вакцинації), всі контрольні свині залишалися серонегативними, в той час як 90 95 свиней, вакцинованих ТІ були сероконвертованів РККЗМ (співвідношення З/Р ІЮЕХХ » 0,4). На 36б-ий день (через 9 днів після контрольного зараження), всі свині були серопозитивними до РЕКЗМ.

Свині з групи Т02 мали в значній мірі більш високі середні значення І 5 титрів антитіл в порівнянні з контрольною групою Т01. В таблиці 16 підсумовані серологічні результати, отримані за допомогою ІФА.

Таблиця 16

Результати співвідношення 5/Р за ІФА (середні значення І 5 і діапазон) та 9о серопозитивності свиней за групою та днем лікування

Обробка (середні значення І 51. «.Ісередні значення І 51. й . ую серопозитивності й ую серопозитивності (діапазон) (діапазон) 0,01т2 о 1,5822 о від -0,087 до 0,123 від 0,846 до 2,357 тро зе 1,6175 о 1,9605 о від 0,31 до 2,561 від 0,762 до 2,884 Т00 то

Різні індекси означають значні розбіжності між групами.

Обговорення

В даному дослідженні оцінювали виникнення імунітету (00) від модифікованої живої вакцини проти РКЕКЗМ у свиней, вакцинованих у віці 14-15 днів після інокуляції патогенним ізолятом РКЕК5ЗМ генотипу І, як респіраторне контрольне зараження через 4 тижні після вакцинації. Дослідження було дійсним, оскільки всі свині ТОЇ залишалися РКЕ5М серо- та віро- негативними протягом періоду вакцинації, та не було виявлено жодних змішаних факторів захворювання.

Первинною змінною під час виявлення ефективності було вірусне навантаження у сироватці крові групи лікування 102 в порівнянні зі свинями ТО1. Ураження легень, ректальні температури, виділення, клінічні ознаки та маса тіла порівнювались як вторинні змінні.

Захисний ефект вакцинації спостерігався під час порівняння вірусного навантаження у сироватці крові між групами ТО1 та Т02; група, вакцинована ТІ, мала значно більш низькі титри вірусу в порівнянні з контрольною групою Т01 у всі дні забору проб після контрольного зараження.

Після контрольного зараження у всіх свиней можуть бути виявлені виділення з порожнини рота та носа незалежно від групи обробки. Проте, значно більш високі вірусні навантаження були виявлені у групі ТО1, причому всі дні, крім дня 34, для мазків з носа та на 31-ий та 36-ий день для виділень з порожнини рота.

Що стосується уражень легень, захисний ефект вакцини також спостерігався у свиней Т02 під час порівняння середнього значення зворотного перетворення за методом найменших квадратів відсотка уражень легень між групами. Крім того, всі 14 свиней з групи 702, яким під час розтину дали позитивний візуальний бал, були оцінені як 1 (слабкі ураження). Навпаки, легені з 17 свиней в групі ТО1, які також отримали позитивний результат, 10 отримали оцінку 1 (слабкі ураження) і 7 - оцінку 2 (помірні ураження).

Протягом періоду після контрольного зараження, ректальні температури були значно нижче у свиней, вакцинованих Ті, на 7-ий день після контрольного зараження. До цього часу у 20 95 свиней з групи ТО1 була лихоманка, тоді як у жодної свині з групи Т02 лихоманки не було.

Перед контрольним зараженням, ректальні температури в групі Т02 були значно нижче в порівнянні з ТО1. Однак у жодної зі свиней не було лихоманки, і в цій групі не було явного клінічного стану, який міг би викликати підвищення ректальної температури. Крім підвищення ректальної температури, жодних інших клінічних спостережень, сумісних з РКК5 (депресія, респіраторний дистрес, кашель або чхання), не спостерігалося у жодної свині протягом всього періоду часу. Крім того, жодних розбіжностей у масі тіла не могло бути виявлено в будь-який момент часу між групами.

Серологічні дані продемонстрували, що вакцинація ТІ (група Т02) викликала розвиток

Зо РАВ5М-специфічних антитіл протягом 4 тижнів після вакцинації. Титри антитіл в групі Т02 збільшувались до кінця дослідження і були в значній мірі вище, ніж титри, виявлені до того часу в невакцинованій групі ТО1 з контрольним зараженням.

Вакцинація одноразовим внутрішньом'язовим введенням експериментальної вакцини МІ М

Є РЕКЗУ, що містить дозу 2,0 Ісдто ССІЮОво свиням 14-15 денного віку захищала від РЕК5У, про що свідчить значне зниження вірусного навантаження, виявленого у сироватці крові після контрольного зараження патогенним штамом ЕО РКК5 через 4 тижні після вакцинації.

Ефективність була також підтверджена захисним ефектом, що спостерігається відносно відсотка уражень легень під час розтину (через 10 днів після контрольного зараження), зниженням виділень з ротової порожнини та назальних виділень, а також зниженням ректальної температури через 7 днів після контрольного зараження.

Приклад 5.- Оцінка потенційного впливу антитіл материнського походження на ефективність модифікованої живої вакцини ЕЮ РККЗУ, введеної одноденним серопозитивним свиням проти зараження європейським ізолятом РКЕКЗУ.

Мета представленого дослідження полягала в тому, щоб оцінити вплив антитіл материнського походження (МОА) на ефективність МЕМ БЮ РАКЗ (вірус, що експресується з

ЗБЕО ІЮО МО: 5) під час введення поросятам у 1-денному віці внутрішньом'язовим (в.м., група

ТО2) або інтраназальним (і.н., група ТО3) способом.

Дослідження було розроблене на основі рекомендацій ЕМА/СЄММРЛИУР/439467/2007: "ВейПесіп рарег оп Ше детопвігайоп ої а розвіріє ітрасі ої таїегапПу дегімей апіродіє5 оп массіпе ейісасу іп уоипуд апітаІє" та Європейської фармакопеї (РИ. Еиг.) Монографія 04/2008:50207: "ЕмаІчайоп ої ейісасу ої мегегіпагу массіпе5 апа іттипозега". Обидва документи рекомендують, що слід адекватно оцінити вплив пасивно здобутих та отриманих від матері антитіл на ефективність вакцини. Крім того, у ЕМА/СММРЛМУР/439467/2007 говориться, що ефективність вакцини у тварин, вакцинованих в присутності МОА, повинна, незважаючи на нормальні біологічні варіації, бути аналогічній тій, яка була отримана у тварин того ж віку, але вакцинованої у відсутність МОА.

На основі вищезгаданих специфікацій виникнення захисного імунітету (00Ї) модифікованої живої вакцини проти ЄЮ РАВ5БМУ було оцінено у серопозитивних свиней, вакцинованих (в.м. та ін. способом), у 1-денному віці після інокуляції патогенним ізолятом РКК5М генотипу | як бо респіраторне контрольне зараження. Тварин піддавали контрольному зараженню в той час,

коли рівні МОА, виявлені з використанням тесту серонейтралізації (5МТ) у контрольній групі (ТО1), ставали такими, що не виявляються. Для того, щоб продемонструвати захист проти зараження, були оцінені ті ж параметри, які оцінювались у попередньому дослідженні, проведеному на серонегативних тваринах (вірусне навантаження у сироватці крові, ураження легень, ректальні температури, виділення, клінічні ознаки та маса тіла).

Дослідження було дійсним, так як всі контрольні свині (група ТО1) залишалися віро- негативними на РЕКЗМ протягом періоду вакцинації, і не було виявлено жодних супутніх факторів захворювання.

Коли ММ БО РЕКЗ вводили в.м. способом, спостерігався захисний ефект вакцинації, про що свідчить значне зниження вірусного навантаження у сироватці в порівнянні з контрольною групою; ефективність також була підтверджена значним зниженням назальних виділень та виділень з порожнини рота, а також значним зниженням ректальної температури. Розбіжності у середньому значенні відсотка уражень легень були близькі до значення (р - 0,092).

Ефективність, яка спостерігається після в.м. введення у представленому дослідженні, є аналогічною ефективності, отриманої у попередньому дослідженні, в якому ефективність оцінюється у серонегативних тварин; в обох дослідженнях значний вплив вакцинації спостерігався на первинну змінну (зниження вірусемії), а також підтверджувалось зниженням назальних виділень та ректальної температури.

Коли МІМ БО РКК5 вводився ін. способом, не було досягнуто жодного захисту від контрольного зараження РЕЕЗУ, про що свідчить відсутність значних розбіжностей в жодному з оцінюваних параметрів.

На закінчення слід зазначити, що результати представленого дослідження демонструють відсутність інтерференції материнських антитіл з ефективністю вакцини, коли вакцина вводиться внутрішньом'язово поросятам у 1-денному віці. Однак, коли вакцина вводиться і.н. способом, у більшості свиней імунна відповідь після вакцинації не викликалась, очевидно, через нейтралізацію вакцини МСА. Для отримання позитивних на РКЕК5ЗМ МОА поросят шість вагітних свиноматок були вакциновані вакциною МІ М ЕС РКЕ5ЗМ партії ММКО13-015 (5 Іодто ССІОво/2 мл) протягом першої половини вагітності (45 днів вагітності). За день до передбачуваної дати опоросу пологи були викликані внутрішньом'язовою ін'єкцією клопростенолу (Сусіїх? Рогсіпо,

Зо Мігбас). Всі свиноматки опоросились на наступний день. Всі свиноматки були серопозитивними до РККЗ на О0-ий день. Результати показані.

Вакцинний вірус вводили із вмістом діючої речовини 6,0 Іодіо ССІОзо/мл. На день 0, ІМР розбавляли вакцинним розріджувачем (партія Т22019) для того, щоб відповідати цільовому титру (2,5 Ісдіою ССІЮОво/2 мл). Одну аліквоту МР збирали для титрування на клітинах ВНК-21-

С12-26 для підтвердження дозування. Додатковий зразок ІМР заморожували (-80-10 С) та зберігали як контрольний зразок. Титрування на клітинах ВНК-21-С12-26 проводили відповідно до місцевих стандартних процедур. Відновлена та розбавлена вакцина мала титр 101,8

СсСіІЮОзво/мл, який відповідає 102,1 ССІЮво/2 мл (2,1 Іосдіо ССІЮО5о/2 мл).

На день 0, поросят вакцинували ІМР або СР як описано у розділі 4. Поросятам груп ТО1 та

Т02 ін'єкційно внутрішньом'язово вводили в правий бік шиї. Поросятам груп ТО1 та ТОЗ3 вводили інтраназально, доставляючи 1,0 мл у кожну ніздрю. Матеріалом для контрольного зараження був іспанський ізолят Оі0Шеї РЕКБЗМ генотипу 1, вирощений у свинячих альвеолярних макрофагах (РАМ). Даний штам був виділений у 1991 році під час випадку пізнього аборту у свиноматок.

Вірусемія

Всі свині, як було виявлено, є РЕК5М-негативними за ЗТ-КОЛР у сироватці крові перед вакцинацією (00), ії всі свині з групи ТОЇ залишалися такими до контрольного зараження.

Навпаки, 8/16 (50 95) поросят з групи 102 (вакциновані в.м) та 1/19 (5,3 95) поросят з групи ТОЗ3 (вакциновані і.н.) були РЕК5М-позитивними ЗТ-КПЛР під час контрольного зараження (через 67 днів після вакцинації).

Після контрольного зараження, 100 95 свиней з групи ТО1 ставали вірусемічними у 070 (через З дні після контрольного зараження) та залишалися позитивними до кінця дослідження (0Ся10). У вакцинованих групах (102 та ТО03), у всіх свиней був виявлений позитивний результат РКК5МУ, щонайменше, один раз; однак, до кінця дослідження (0С--10), лише 11/16 свиней 702 (68,8 95) все ще були вірусемічними. Навпаки, всі свині ТОЗ3, крім однієї, були позитивними у всіх точках забору зразків після контрольного зараження.

Свині з групи 102 мали в значній мірі нижче вірусне навантаження у сироватці, ніж у свиней з контрольної групи ТО1 у всі дні забору зразків після контрольного зараження. Під час ОС 3 та ре10, вірусне навантаження у групі Т02 також було у значному ступені нижче, ніж у групі ТО03. бо Жодних значних різниць не було виявлено між групами ТО1 та ТО3.

Таблиця 17 підсумовує результати вірусемії протягом 10-денного періоду після контрольного зараження.

Таблиця 17

Підсумовування результатів вірусемії за групою та днем дослідження (дата фази контрольного зараження)

Годібкопій РНК / мл сироватки

Середні

День значення о

Група . отримані . Нижче Вище |віремічних дослідження методом ЗЕ Діапазон 95 95 СВ|95 95 СВ| тварин найменших квадратів

М: кількість; ЗЕ: Стандартна помилка; СВ: довірча межа; Ю- день дослідження; ОС: день контрольного зараження; ЗТ-КПЛР позитивний: » 1,7 І0діо копій РНК/мл

Вірусемія та виділення

Перед статистичним аналізом дані ЗТ-КПЛР були перетворені з використанням відповідного логарифмічного перетворення. Перетворені дані були проаналізовані з використанням загальної лінійної змішаної моделі з повторними вимірюваннями. Попарне порівняння лікування проводилось у кожний момент часу, якщо ефект лікування або вплив контрольного моменту часу на результати лікування були значними (Рх0,05)3. Середнє значення за методом найменших квадратів та 95 95 довірчі інтервали були зворотно перетворені для представлення.

Відсоток днів вірусемії/виділень також був розрахований. Кожний зразок, як було визначено, був позитивним якщо» 50 копій РНК/мл РЕК5ЗУ, що відповідає половині межі виявлення методу (100

РЕКЗМ копій РНК/мл). Крім того, було визначено, чи була тварина коли-небудь віремічною або коли-небудь мала виділення протягом днів ОС (стосується перед контрольним зараженням) та днів ОС (після контрольного зараження).

Метою представленого дослідження було оцінити вплив антитіл материнського походження (МОА) на ефективність МІМ БО РКК5, коли їх вводять поросятам 1-денного віку внутрішньом'язовим (в.м., група 702) або інтраназальним (ін., група Т03) способом.

Ефективність оцінювали у серопозитивних свиней, вакцинованих у 1-денному віці після інокуляції патогенним ізолятом РККЗМ генотипу І як респіраторне контрольне зараження.

Тварин піддавали контрольному зараженню в той час, коли рівні МОА, виявлені 5МТ в групі ТО1, ставали такими, що не виявляються (День 67).

Первинною змінною під час визначення ефективності було вірусне навантаження у сироватці крові (вірусемія) в групах обробки Т02 та ТО3 в порівнянні зі свинями групи ТО1.

Ураження легень, ректальні температури, виділення, клінічні ознаки та маса тіла порівнювались як вторинні змінні.

Дослідження було дійсним, оскільки всі свині ТО1 залишалися вірусно-негативними на

РЕКЗМ протягом періоду вакцинації і не було виявлено жодних змішаних факторів захворювання.

Захисний ефект вакцинації в.м. спостерігався під час порівняння вірусного навантаження у сироватці крові між групами ТО1 та Т02; група, вакцинована ІМР в.м. способом, мала значно більш низькі титри вірусу в порівнянні з контрольною групою ТО1 у всі дні забору зразків після контрольного зараження. Між групами ТОЇ та ТО3 не було виявлено жодних відмінностей у титрах вірусу, що вказує на відсутність захисного ефекту від ін. вакцинації на вірусне навантаження після контрольного зараження. Відсутність ефективності у групі ТОЗ також була підтверджена значним збільшенням вірусного навантаження, що спостерігається в цій групі, в порівнянні з групою 702 через З та 10 днів після контрольного зараження.

Захист, забезпечений після в.м. вакцинації (група 702), був підтверджений значним зниженням відсотка назальних виділень, а також кількості вірусу, виявленого у назальних виділеннях та виділеннях з ротової порожнини в групі Т02 в порівнянні з контрольною групою

ТО1. Подібно тому, що спостерігалося для вірусемії, жодного позитивного ефекту вакцинації не спостерігалося під час виділення вірусу, коли ІМР вводили і.н. способом (ТО3 група), оскільки не було виявлено жодних розбіжностей між групами ТО1 та ТО03. Фактично, кількість вірусу, що

Зо виділяється як назальним, так і оральним шляхом в групі ТОЗ також була в значній мірі вище, ніж у групі Т02.

Вакцинація в.м. способом також позитивно вплинула на ректальну температуру. Перед контрольним зараженням (067), середні значення ректальних температур були в значній мірі нижче в групі Т02 в порівнянні з ТО1 та ТО03; однак, оскільки у жодної зі свиней з будь-якої групи не було лихоманки (КТ240,5) в той же час і ректальні температури на 067 реєструвалися до того, як тварини були взяті на фазу контрольного зараження, то можна зробити висновок, що дані розбіжності, ймовірно, пояснюються стресом тварин які були вперше оцінені. Протягом періоду після контрольного зараження, відсоток свиней, у яких була лихоманка, щонайменше, один раз складав 61 95, З1 95, та 42 95 в групах ТО1, Т02 та ТО3, відповідно. Контрольні свині (ТО1) мали в значній мірі більш високі ректальні температури, ніж свині, вакциновані ІМР (групи

ТО02 та ТО3) на день 70 (через З дня після контрольного зараження); однак, на ОС--10, ректальні температури групи ТОЗ були в значній мірі більш високі, ніж в групах Т01 та Т02. Крім підвищення ректальної температури, інших клінічних ознак, сумісних з інфекцією РККЗУ, не спостерігалося. Що стосується маси тіла, жодного ефекту від вакцинації не спостерігалося, що видно по відсутності значних розбіжностей між групами.

Під час розтину 13/18 свиней (72 95) з контрольної групи ТО1 мали позитивний бал за візуальною оцінкою легень. В групах Т02 та ТО3, 7/16 (44 95) та 13/19 (68 95) свиней також отримали позитивний бал. Порівняння між групами лікування не показало жодних значних розбіжностей убо легень з ураженнями. Однак розбіжності, що спостерігаються між контрольною групою ТО1 та групою, вакцинованою ІМР в.м. способом (102) були близькі до значущості (р-0.092).

Всі свині мали присутність РЕКЗМ-специфічних антитіл перед вакцинацією, як було виміряно за допомогою ІФА (співвідношення 5/Р 2 0,4), таким чином, відповідаючи критеріям включення. Перед контрольним зараженням (через 67 днів після вакцинації), 39 96 свиней в контрольній групі все ще залишалися серопозитивними, що вказувало на наявність МОА, що залишилися на той час (середнє значення співвідношення 5/Р: 0,279). Однак той факт, що у всіх свиней з контрольної групи розвинулась вірусемія після контрольного зараження, і що 13/18 мали також позитивний бал при оцінці легень під час розтину, свідчить про те, що МОА, що залишився, виявлений за допомогою ІФА, не заважав проведенню контрольного зараження. бо Фактично, коли рівні РЕКЗМ-специфічних нейтралізуючих антитіл були визначені у даних свиней з використанням 5МТ, негативні результати були виявлені у всіх свиней ТО1 перед контрольним зараженням (день 52). У групі, вакцинованої ІМР в.м. способом, у 9/16 свиней спостерігалося збільшення рівнів антитіл, визначених з використанням ІФА, з дня вакцинації до 67 днів після вакцинації, і всі вони були серопозитивними перед контрольним зараженням (середнє значення співвідношення 5/Р: 1,803), що вказує на розвиток антитільної відповіді після в.м. вакцинації навіть на фоні МОА. Навпаки, лише у 2/19 свиней, вакцинованих ІМР. і.н. способом було збільшення антитіл до РКК5 від вакцинації до контрольного зараження, і лише 32 95 було серопозитивні на Об67 (середнє значення співвідношення З/Р: 0,328), яке свідчить про те, що жодної гуморальної імунної відповіді не було індуковано у інших 17 свиней через нейтралізацію вакцини МОА. Після контрольного зараження (077), всі свині, незалежно від групи лікування, були серопозитивними і жодних значних розбіжностей у титрах ІФА не було виявлено між групами.

У посібнику ЕМА/СУМРЛУ Р/439467/2007 "ВейПесійоп рарег оп Ше детопвігайоп ої а розвіріе ітрасі ої таїегттаПу депймей апіродієє оп массіпе ейісасу іп усипуд апіта!є" говориться, що ефективність вакцини у тварин, вакцинованих в присутності МОА, повинна бути такою: не дивлячись на нормальну біологічну мінливість, подібну тій, яка отримана у тварин такого ж віку, але вакцинованих у відсутність МОА. На основі цих специфікацій ефективність, що спостерігається в даному дослідженні, повинна бути аналогічною ефективності, отриманої у попередньому дослідженні (С/394/13), в якому ООЇ оцінювали у серонегативних тварин, вакцинованих в 1-денному віці і.н. та в.м. способами.

Коли МГМ БО РЕК5 вводили в.м. способом, ефективність могла бути продемонстрована незалежно від серологічного статусу свиней, так як в обох дослідженнях спостерігалося значне зниження вірусемії (первинної змінної). Захисний ефект в.м. вакцинації також був продемонстрований для назального виділення та ректальної температури в обох випадках. Крім того, після в.м. вакцинації свиней МОАх, виділення з ротової порожнини також було в значній мірі знижено, і розбіжності у 95 легень з ураженнями були близькі до значних. В цілому, ці дані ясно демонструють відсутність впливу МОА на ефективність вакцини, коли вакцина вводиться поросятам 1-денного віку внутрішньом'язово.

Коли МГМ БО РЕКЗ вводили і.н. способом, ефективність могла бути продемонстрована

Зо лише у відсутності МОА, про що свідчить значне зниження вірусемії та назального виділення, що спостерігається у серонегативних тварин. У свиней з МОАх ін. вакцинація не індукувала захисту, про що свідчить відсутність значних розбіжностей ні за будь-яким одним з оцінюваних параметрів.

Таким чином, вакцинація одноразовим введенням вакцини МІ М ЄО РККЗУ, що містить дозу 2,5 10дл1о ССІЮОво серопозитивним свиням 1-денного віку в.м. способом захищала від РЕКЗУ, про що свідчить значне зниження вірусного навантаження, виявленого у сироватці крові після контрольного зараження патогенним штамом БО РКАКЗ через 67 днів (9,6 тижнів) після вакцинації. Ефективність також підтверджувалась значним зниженням назальних виділень та виділень з порожнини рота, а також ректальних температур після контрольного зараження. Крім того, розбіжності в середньому значенні відсотка уражень легень були близькі до значущості (р - 0,09). Вакцинація одноразовим введенням вакцини МЕМ ЄЮ РКК5ЗМУ вакцина, що містить дозу 2,5 |0діо ССІО5о серопозитивним свиням 1-денного віку і.н. способом не захищала від РКК5ЗМ під час контрольного зараження. Результати представленого дослідження демонструють відсутність інтерференції материнських антитіл з ефективністю вакцини, коли вакцина вводиться внутрішньом'язово в 1-денному віці. Коли вакцина вводиться і.н. способом, більшості свиней (17/19) не вдається виробити імунну відповідь після вакцинації, яка вимірювалась методом ІФА. Це вказує на нейтралізацію вакцини МОА, що може поставити під загрозу ефективність вакцини на рівні стада.

Приклад 6- Поширення, розподілення та безпека введення одної дози, повторної дози та передозування модифікованою живою вакциною ЄЮ РККЗМ 96М198 слона 1 М5МУ-3 свиням 1- денного віку

Мета даного дослідження полягала в тому, щоб оцінити безпечність повторної дози та передозування, а також розповсюдження, розподілення та безпечність однієї дози модифікованої живої вакцини проти РКК5М 96 к198 клону 1, що вводиться свиням 1-денного віку в.м. та і.н. способом. Дослідження проводилось з використанням М5МУ--3, який є найменш атенуйованим рівнем пасажу (дивіться сторінку 8, М3М-5 являє собою стандартний пасаж 49), який присутній у партії вакцини.

Відповідно до діючого європейського законодавства, для отримання дозволу на продаж необхідно продемонструвати безпечність вакцини. В цьому випадку протокол був розроблений бо з урахуванням Європейської фармакопеї; директиви 2009/9/ЄС та керівних принципів МІСН бі44 для того, щоб продемонструвати безпечність однієї дози, повторної дози та передозування під час ін. та в.м. способу введення для поросят одноденного віку - запропоновані способи та категорія тварин, для який призначена вакцина.

Безпечність оцінювали відповідно до рекомендацій Європейської Фармакопеї для вакцин ветеринарного застосування, тобто для оцінки ректальної температури, а також місцевих та загальних реакцій, щонайменше, до 14 днів після інокуляції. Розподілення вакцинного штаму оцінювали від вакцинованих (одна доза) до не вакцинованих індикаторних свиней; виділення (носовий слиз, рідини ротової порожнини та фекалії) та розповсюдження в тканинах у вакцинованих тварин (одна доза) також були досліджені.

Дослідження проводилось відповідно до правил Належної лабораторної практики (СІ Р), відповідно до відповідних керівних принципів ОСОЄЕ та відповідно до вимог Європейської фармакопеї 7.7 04/2013:50206 (Оцінка безпечності ветеринарних вакцин та імуноферментів).

Досліджуваний продукт являє собою МІМ БО РКК5 (клон 1 96М198), найменший атенуйований рівень пасажу (М5М--3), під час максимального титру вивільнення 105,2 ТСІО50/2 мл при дозі 2 л і.н. або в.м., причому нижній пасаж (менш атенуйований) був вибраний як краща міра безпечності. Для досліджуваної системи протокол був розроблений з урахуванням

Європейської Фармакопеї; директиви 2009/9/ЄС та керівних принципів МІСН 01 44 для того, щоб продемонструвати безпечність застосування однієї дози, повторної дози та передозування під час і.н. та в.м. способу введення для поросят 1-денного віку - запропонованої категорії тварин, для яких призначена вакцина.

Достатня кількість свиноматок (п-11) була використана для отримання поросят, необхідних для проведення дослідження (щонайменше, п-80). Застосовуваний дизайн, що дозволяє належним чином описати безпечність, розповсюдження та розподілення вакцини для обох способів введення, в.м. та ін. Свиноматки прибули на експериментальну ферму з ферми негативної за РКЕКЗМ (Додаток І). Свиноматки були розташовані у 11 ізольованих ящиках у приміщеннях. На експериментальній фермі у свиноматок брали перед опоросом та знову аналізували на наявність РКЕК5М-специфічних антитіл з використанням комерційного ІФА (РАВ5 ХЗ АБ Тевзі: Неї. 99-4095, ІЮЕХХ І абогафогіе5;) (Додаток І). Як профілактичне лікування свиноматкам робили внутрішньом'язове введення цефтиофура натрію (13 мл / свиноматку).

Зо Опорос свиноматок синхронізували, введеним 1 мл в.м. ЮО-клопростенолу (баїарап,

ІММЕЗА;) (додаток ХМІ) приблизно через 111-113 днів після осіменіння (з синхронізацією опоросів). Поросята народилися протягом наступних 40 годин (9 та 10 квітня). Початок вакцинації було зроблене 10-го; на цю дату вік всіх поросят становив приблизно х 24 год. (1- денний вік).

Перехресне виховання проводили протягом першого дня після опоросу (перед вакцинацією) для того, щоб збалансувати потомство та гомогенізувати потомство. В кінці кінців, було використано десять свиноматок із загальною кількістю поросят в кожній групі, яка дорівнює або перевищує мінімальний розмір вибірки, для проведення досліджень безпечності, встановлених у Європейській фармакопеї. Загальна кількість: 80 поросят; 40 поросят для кожного способу введення: і.н. та в.м. (28 вакциновані експериментальним продуктом - доза, повторна доза та передозування, 8 тварин - як контроль та 4 тварини -- як індикатори).

Тридцять зайвих поросят також були розподілені по всім групам від ТО1 до Т12 як резерв, які повинні бути включені у дослідження, лише якщо якась група не досягла мінімальної необхідної кількості поросят через мертвих поросят або виключення (Додаток ІІ та Додаток ХІМ;

Поправка Мо 2); необроблені дані цих поросят були записані у додаткові записні книжки з необробленими даними, позначені знаком (5) (записні книжки з номерами від 13 до 24). В кінці кінців було використано десять свиноматок, і у кожної з них було по 11 поросят.

Експериментальна гіпотеза

Дане дослідження було розроблене для того, щоб продемонструвати безпечність вакцини

МІМ БО РККЗ5 у свиней 1-денного віку (клон 1 96М198) у експериментальних умовах шляхом порівняння з контрольною групою, інокульованою розріджувачем вакцини (негативні контролі) для всіх параметрів, описаних нижче, але температуру аналізували з урахуванням основної температури кожного поросяти перед вакцинацією як контрольне значення. Вакцина вважалася безпечною, якщо не було відмічено серйозних місцевих або системних реакцій по причинам, зв'язаним з вакциною, та середнє підвищення температури для всіх свиней у вакцинованій групі не перевищувало 1,5 "С в порівнянні із середньою основною температурою до вакцинації, та жодний з поросят в експериментальній групі не показав підвищення температури більше ніж на 2 "С в порівнянні із основною температурою у кожного поросяти перед вакцинацією. Оцінювали розповсюдження та розподілення вакцинного штаму, досліджуючи наявність вакцинного штаму бо у індикаторних свиней. Розповсюдження у вакцинованих тварин оцінювали, досліджуючи кількість вірусу у зразках крові, з носу, з ротової порожнини та ректальних зразках та у тканинах.

Ректальні температури - Інтраназальний та внутрішньом'язовий способи введення.

Що стосується температури, може бути зроблений висновок, що вакцина безпечна у всіх оцінених протоколах (спосіб введення, титр та кількість доз), тому що отримані результати відповідають рекомендаціям Європейської фармакопеї для вакцин ветеринарного застосування.

Місцеві реакції

Інтраназальний спосіб введення. Місцеві реакції не спостерігалися.

Внутрішньом'язовий спосіб введення.

Під час розтину лише два поросяти у Т12 (максимальний титр під час в.м. способу введення) мали макроскопічні слабкі ураження. Мікроскопічні, ураження спостерігалися лише у чотирьох свиней з групи Т10; ураження характеризувалися дуже слабкою осередковою або багатоосередковою присутністю мононуклеарних інфільтратів запальних клітин.

Системні реакції та побічні ефекти

Інтраназальний спосіб введення: Відсутність системних реакцій та клінічних ознак, зв'язаних з вакцинацією, вказують на те, що вакцина безпечна.

Внутрішньом'язовий спосіб введення.

Несприятливі події після введення вакцини спостерігалися лише у 2 з 8 поросят, що належать до групи, яка отримала найвищий титр (максимальний титр вивільнення х10) під час в.м. способі введення (група Т12). Дані події зникли до 4 годин, і поросята повністю одужали.

Що стосується щоденної клінічної оцінки, випадки кульгавості не можуть розглядатись як явища, зв'язані з введенням вакцини; кульгавість спостерігалась також у поросят контрольної групи.

Причина, яка лежить за межами єдиної смерті, що спостерігається під час дослідження, була викликана роздавлюванням; отже, слід враховувати, що ця смерть не була пов'язана з введенням вакцини. Таким чином, вакцинний штам 96М198 СІ ОМЕ 1 під час в.м. способу введення слід вважати повністю безпечним, за винятком несприятливих подій, описаних для найвищого титру (х10).

Маса тіла

Інтраназальний спосіб введення.

Під час порівняння засобів збільшення ваги Т07 показував більш низькі значення, ніж відповідний контроль (102) (р «0,055 з 0 до 14 дня. Однак, ця розбіжність зникла під час порівняння збільшення ваги з 14 до 28 дня і, особливо, коли всі дослідження - з 0 до 28 дня - були прийняті до уваги. Отже, збільшення ваги поросят, вакцинованих інтраназальним способом введення, не залежало від отриманої дози.

Внутрішньом'язовий спосіб введення.

Таким же чином, Т11 показав більш низькі значення, ніж відповідний контроль (Т04) (р «0,05) з 0 до 14 дня. Ця відмінність зникла, коли аналізувався період з 14 до 28, але вона знову з'явилася, у всіх дослідженнях - з 0 дня до 28 дня. Дані розбіжності можуть пояснити тим, що збільшення маси тіла у трьох поросят з Т11 було найменшим, включаючи всіх розкритих поросят на 28-ий день, незалежно від продукту, титру або способу введення (це означає Т02,

Т04, Т07 та Т11). Всі індивідуальні збільшення у вазі з 0 до 28 дня дорівнювали або перевищували 5,5 кг, за винятком трьох вищезгаданих поросят (збільшення у вазі 4,08, 2,89 та 3,05 кг для поросят по199, 202 та 205, відповідно). Цікаво, що ці поросята страждали кульгавістю протягом найдовшого періоду. На закінчення, неможна відрізнити, якщо розбіжності, що спостерігаються між збільшенням у вазі Т04 та Т11, були викликані подіями кульгавості або вакцинацією.

Розповсюдження

Інтраназальний та внутрішньом'язовий способи введення. Розповсюдження вірусу було продемонстровано присутністю вакцинного штаму майже у всіх тканинах, оцінених у вакцинованих тварин, незалежно від використовуваного способу введення. Присутність штаму 96М198 клону 1 в титрах, які можуть вважатися високими у легенях, мигдалинах та трахеобронхіальних лімфатичних вузлах, а також в селезінці та брижових лімфатичних вузлах, свідчать про повне органічне розповсюдження вакцинного штаму.

Розподілення

Інтраназальний та внутрішньом'язовий способи введення. Хоча виявлення вакцинного штаму в ротовій рідині та ректальних мазках було непостійним у вакцинованих поросят, воно було постійним та високим у назальних мазках; розподілення частоти виявлення вакцинних штамів з часом зменшувалось. Дані результати разом з виявленням вакцинного штаму у зразках крові від усіх індикаторних свиней, демонструють, що 96М198 клон 1 активно та бо безперервно виділяється після вакцинації. Крім того, наявність вакцинного штаму у тканинах та зразках крові від індикаторних поросят вказувало на те, що вірус, що розповсюджується від вакцинованих поросят, був активним; він міг інфікувати індикаторних тварин та міг розмножуватися в них; і навіть одна в.м. індикаторна свиня з Т09 мала ураження легень, відповідні РКК плюс позитивний результат для ІНС. На завершення слід відмітити, що вищезгадані результати показують, що 96М198 клон 1 може послідовно передаватися від вакцинованих до невакцинованих поросят, щонайменше, в ранній період після вакцинації.

Ураження легень

Інтраназальний та внутрішньом'язовий способи введення. Всі дев'ять свиней з макро- та мікроскопічними ураженнями, відповідні РКК5З (інтерстиціальна пневмонія), плюс позитивний результат для ІНС РЕКЗУ, були з в.м. груп. Таким чином, може бути зроблений висновок, що і.н. спосіб введення був безпечним, тоді як в.м. спосіб введення міг індукувати ураження легень, відповідні РКК5МУ, щонайменше, у однієї свині в кожній групі (з Т09 до Т12).

Приклад 7. - Безпечність повторного введення одноразової дози модифікованої живої вакцини РКК5м ЕЄШ під час введення вагітним свиноматкам серопозитивним на РКК БУ.

Представлене дослідження було розроблене для того, щоб продемонструвати безпечність введення повторної одноразової дози МЕМ БО РКК5 серопозитивним свиноматкам у другій половині вагітності (87 днів вагітності). Жодних системних реакцій після вакцинації не спостерігалося після першого або другого введення. Крім того, жодних клінічні спостережень не було зареєстровано у жодної з свиноматок протягом всього періоду спостереження.

Що стосується ректальних температур, у жодної з свиноматок не було зареєстровано лихоманки в будь-який момент після вакцинації (КТ 240,1 "С). Крім того, середнє значення ректальної температури після вакцинації не перевищувало середнє значення ректальної температури перед вакцинацією плюс 1,5 "С, та у жодної з свиноматок не спостерігалося перевищення власної ректальної температури до вакцинації плюс 2 "С.

Місцеві реакції в місці ін'єкції спостерігалися у 63 95 та 50 95 свиноматок, вакцинованих досліджуваним елементом під час 1-го та 2-го введення, відповідно. Реакції складалися з відчутного та/або видимого набряку (від 0,4 до 2,8 см в діаметрі), який зникав між 1 та 6 днями.

У жодної з свиноматок не спостерігалося почервоніння, збільшення місцевого тепла або болю у місці ін'єкції після будь-якого введення.

Зо Що стосується репродуктивної функції, жодних абортів, або передвчасних опоросів зареєстровано не було. Крім того, не спостерігалося явного впливу вакцинації на число мертвонароджених, муміфікованих, низько життєздатних поросят та на смертність перед відлученням від матері. Вакцинація не викликала трансплацентарну інфекцію, про що свідчать негативні результати ЗТ-КкПЛР, виявлені у зразках сироватки крові, зібраних під час народження та під час відлучення поросят від матері. На завершення, повторне введення вакцини є безпечним для серопозитивних свиноматок у другій половині вагітності.

Скорочення, що використані в даному документі, включають: ВНК-21, клон 21 нирки новонародженого хом'яка; ВЕР, протокол випуску серії; ССІО50; 50 95 інфекційна доза клітинної культури; СР, контрольний продукт; 0, день; ОКАС, щоденний огляд з догляду за тваринами; ІЮ, ідентифікація; (з! Р, належні лабораторні практики; ІБ, імунофлуоресценція; в.в., внутрішньовенно; ММ, модифікована жива вакцина; М5М, вихідний вакцинний вірус; МА, не застосовували; Р, Пасаж; РВ5, фосфатний буферний сольовий розчин; РІ, після інокуляції;

РЕКЗУ, вірус репродуктивного та респіраторного синдрому свиней; КТ, ректальні температури;

ЗТ-КПЛР, кількісна зворотно-транскрипційна полімеразна ланцюгова реакція; ОР, стандартна операційна процедура; 5/Р, зразок до позитивного; ТВО, належить визначенню; Ті, досліджуваний препарат, та МІСН, ветеринарна міжнародна рада з гармонізації.

Мета дослідження та обгрунтування

Модифікована жива вакцина (МЕМ) ЄЮ РКК5М призначена для активної імунізації молодих свиней та свиноматок у середовищі, зараженому РЕК5, для зниження вірусемії, трансплацентарної інфекції та абортів, викликаних зараженням європейськими штамами вірусу

РЕКЗ. Відповідно до діючого законодавства, для отримання дозволу на продаж є необхідним продемонструвати безпечність вакцини. Дане дослідження було розроблене відповідно до

Європейської фармакопеї 7.7:04/2013/50206 - Оцінка безпечності ветеринарних вакцин та імуноферментів та МІСН 01 44 - Цільова безпечність тварин стосовно ветеринарних живих та інактивованих вакцин - посібник. Метою даного дослідження є оцінка безпечності повторного введення (їх-їх) МЕМ БО РКК5 серопозитивним свиноматкам у другій половині вагітності.

Досліджуваний матеріал являв собою 6,6 Ібдіо ССІЮвсо/рлакон ЄЮ РЕКЗМУ, штам 96бм198сС1, (М5М-3), з дозою 5,2 Ісдіо ССІЮво в 2 мл/ внутрішньом'язово за ЗТ-кПЛР.

Вірусемія (навантаження РЕКК5М у сироватці) вимірювалась за допомогою кКПЛР з бо зворотною транскрипцією (ЗТ), яку виконували відповідно до стандартних процедур. Коротко,

очищену вірусну РНК використовували як матрицю, транскрибували зворотно при 50" протягом 30 хвилин та денатурували при 95 "С протягом 5 хвилин. Програма ПЛР реакцій складалася з 40 циклів денатурації при 95 С протягом 20 секунд та ренатурації при 537 протягом 40 секунд. ЗТ-КПЛР проводили у системному термоблоці ПЛР в реальному часі 7500.

Послідовності праймерів та зонду є наступними (5ЕО ІЮ МО5 6-8, послідовно):

Прямий праймер (Лелістад ЕР): 5-(4САССАССТСАСССАСАС-3' (Кінцева концентрація 0,5

МКМ).

Зворотний праймер (Лелістад К): 5-САСТтОоСтТа,асСассттТаАТ-3' (Кінцева концентрація 0,5

МКМ).

Зонд (Лелістад 5): 5-6-ГАМ-ССТоТасттасСсААТССАТССАСАС -ТАМНАА-3" (Кінцева концентрація 0,6 мкМ).

Серологія

Зібрану сироватку свиней перед вакцинацією досліджували на антитіла до РЕКЗМ з використанням ІФА ІЮЕХХ РКНК5 ХЗ3, дотримуючись інструкцій виробника. Коротко, зразки сироватки розбавляли 1:40 у 96-лунковому планшеті, покритому рекомбінантним антигеном

РЕК5БУ, та інкубували 30 хвилин при 18-26 "С. Після промивання додавали кон'югат анти- свинячий пероксидази хріну та планшети інкубували протягом ще 30 хвилин при 18-26 276.

Незв'язаний кон'югат вимивали, та у лунки додавали субстрат ТМВ. Розвиток кольору вимірювали при 650 нм. Значення 5/Р реєструвалися для кожного зразка. Якщо співвідношення

З/Р було 2 0,4, зразок був класифікований як позитивний на антитіла до РКЕК5. Якщо співвідношення 5/Р було «0,4, зразок був класифікований як негативний. Інструкції ЕГІ5А були включені до файлу дослідження.

Клінічні спостереження

Жодних аномальних клінічних спостережень за будь-якою свиноматкою у період після вакцинації зареєстровано не було (з БО до 028).

Ректальні температури

Для того, щоб дослідити ректальні температури, були дотримані два критерії: а) Середнє значення ректальної температури після вакцинації для всієї групи не повинно перевищувати середнє значення ректальної температури перед вакцинацією плюс 1,5 70.

Зо 1-а вак.: Середнє значення ректальної температури після вакцинації (у або Бо-4год, 01, 02, рЗ або 04) «х |Середнє значення ректальної температури перед вакцинацією (Середнє значення 0-1/00)) я. 1,576. 2-а вак.: Середнє значення ректальної температури після вакцинації (у або ЮО14--4год, О15, р16, 017, або 018) х |Середнє значення ректальної температури перед вакцинацією (Середнє значення 013/014)| ж 1,5 76.

Юр) Індивідуальна ректальна температура кожної свиноматки після вакцинації не повинна перевищувати ректальну температуру перед вакцинацією (Рге-мас) плюс 226. 1-а вак.: Індивідуальна ректальна температура після вакцинації "у або ООж4год, 01, 02, ОЗ або р4) « (Індивідуальна ректальна температура перед вакцинацією (Індивідуальне середнє значення О-1/00)| 4 2,070 2-а вак.: Індивідуальна ректальна температура після вакцинації (у або О14-4год, 015, 016, 017 абор18) х (Індивідуальна ректальна температура перед вакцинацією (Індивідуальне середнє значення 013/014)| - 2,070

В обох групах Т01 та Т02 середнє значення КТ після вакцинації не перевищувало середнього значення перед вакцинацією плюс 1,5 "С. Крім того, КТ після вакцинації кожної свиноматки не перевищувала таку ж ректальну температуру свиноматки перед вакцинацією плюс 2 "С у будь-якої зі свиноматок з груп Т01 або Т02. Після першого введення максимальне збільшення КТ становило 0,81 "С (день 2) у ТО1 та 0,76 "С (день 0-4 год.) в групі Т02. Після другого введення максимальне збільшення спостерігалося на день 17 як у групі ТО1 (0,81 С), так і групі Т02 (0,47 С). У жодної зі свиноматок з групи ТОЇ або Т02 не спостерігалося підвищеної ректальної температури (240,1 "С) у будь-який момент часу після вакцинації.

Системні реакції після вакцинації

Жодної системної реакції після вакцинації не спостерігалося у жодної зі свиноматок з групи

ТО1 або Т02.

Місцеві реакції у місці ін'єкції

Перед вакцинацією всіх свиноматок оглядали на наявність місцевих реакцій в області шиї, викликаних попередніми щепленнями, які могли завадити оцінці місцевих реакцій у місці ін'єкції.

Три свиноматки, дві з групи ТО01 (1802 та 2259) та одна з Т02 (1663), показали старі реакції у правому боці шиї через попередні щеплення. Однак всі ці реакції були розташовані нижче та бо були віддалені від відповідної точки інокуляції. Коли лівий бік шиї був оглянутий перед другою вакцинацією, старі реакції також спостерігалися у чотирьох свиноматок, двох з групи ТО1 (316 та 1802) та двох з групи 702 (2547 та 2842). Як відмічено для правого боку шиї, дані реакції були розташовані нижче точки інокуляції. У всіх випадках (як для правого, так і для лівого боку шиї) старі реакції не вважалися такими, що потенційно заважають оцінці місцевих реакцій після вакцинації. У жодної зі свиноматок, вакцинованих СР (група ТО1), не проявилося локальної реакції у місці ін'єкції у будь-який момент часу після вакцинації. Місцеві реакції, що спостерігаються після вакцинації у групі Т02, підсумовані у 17.

Після першої вакцинації 63 95 свиноматок Т02 (5/8) мали видимий та/або відчутний набряк у місці ін'єкції у правому боці шиї. Максимальний набряк, що спостерігається був реакцію діаметром 2,8 см (відповідає З балам), яка тривала б днів. У жодної зі свиноматок не спостерігалося почервоніння, посилення місцевого жару або болю у місці ін'єкції.

Після другої вакцинації у 50 96 свиней Т02 спостерігався видимий та/або відчутний набряк (лівий бік шиї) (4/8). Всі реакції, що спостерігалися були оцінені як 1 або 2 (максимум 1 см у діаметрі) та продовжувались максимум 5 днів. Як відмічалося після 1-ої вакцинації, у жодної зі свиноматок не спостерігалося почервоніння, посилення місцевого жару або болю у місці введення.

Таблиця 18

Підсумовування результатів місцевих реакцій у групі Т02

Бік шиї |почервонінн оцінки діапазон В : температур набряк у й набряк реакція я набряку (дні) и

Посмертне обстеження місць ін'єкцій

Під час макроскопічного дослідження було помічено, що у декількох свиноматок з обох груп були ураження м'язів шиї, які в основному складаються з більшості вузлів казеозного матеріалу, які були розподілені по всій області шиї. Дані ушкодження були приписані старим ін'єкціям, тому що вони не були виявлені у точці ін'єкції.

Під час огляду точок інокуляції свиноматок Т02 у 1/8 спостерігалась видима реакція у правому боці шиї та 3/8 на лівому боці шиї. В групі ТО1 у однієї свиноматки (1/7) також була видима реакція у першій точці інокуляції (правий бік шиї). Всі реакції були описані як наявність блідих м'язових волокон, ву більшості випадків, чітко спостерігаючих за траєкторією голки та які не піддаються вимірюванню. Крім того, у двох свиноматок Т02 спостерігалися численні вузлики (ліва точка інокуляції).

Репродуктивна здатність

В жодній з груп лікування не було зареєстровано жодних абортів або передчасних опоросів.

Тривалість вагітності знаходилася в діапазоні від 114 до 117 днів в групі ТО1 та від 114 до 119 днів в групі Т02. Поросята, народжені здоровими у кожної свиноматки, були ідентифікованими з використанням ушних бирок та утримувались у

В представленому дослідженні, безпечність повторного введення одноразової дози МІ М ЄЮ

РКК оцінювалась у другій половині вагітності (87 днів вагітності) у серопозитивних свиноматок. Параметри безпечності включали системні реакції на вакцинацію, ректальну температуру після вакцинації, клінічні спостереження, місцеві реакції в місці ін'єкції, репродуктивну здатність та посмертне обстеження місць ін'єкції.

Жодних системних реакцій після вакцинації не спостерігалося після першого або другого введення. Крім того, жодних загальних клінічних спостережень не було зареєстровано у жодної зі свиноматок протягом всього дослідження.

Що стосується ректальних температур, у жодної зі свиноматок не було лихоманки у будь- який момент після вакцинації (КТ 240,1 7С). Крім того, середнє значення ректальної температури після вакцинації не перевищувало середнє значення ректальної температури перед вакцинацією плюс 1,5 "С, та у жодної зі свиноматок не перевищувалась власна ректальна температура перед вакцинацією плюс 2 "с.

Місцеві реакції у місці ін'єкції спостерігалися у 63 95 та 50 95 свиноматок з групи 702 під час 1-ої та 2-ої вакцинації, відповідно. Після 1-0ї вакцинації спостерігався максимальний набряк діаметром 2,8 см, який тривав не більше 6 днів. Після другої вакцинації максимальний набряк складав 1 см в діаметрі, а максимальна тривалість складала 5 днів. У жодної свиноматки не спостерігалося почервоніння, підвищення локальної температури або болю у місці ін'єкції після будь-якого введення.

Під час посмертного огляду видима реакція у місці інокуляції спостерігалась лише у 3/8 вакцинованих свиноматок. Дві з них (15 та 1663) відповідали тим, у яких найвищий бал набряку (2 та 3, відповідно), даний під час оцінки місцевих реакцій; макроскопічні, ураження були описані як бліді м'язові волокна після траєкторії голки, які були діагностовані як помірний гранулематозний міозит із залученням м'язових волокон. У випадку свиноматки 15 всередині ураження спостерігалися краплі вакцини, підтверджуючи той факт, що це пошкодження було викликане в результаті введення досліджуваного продукту. Для другої свиноматки 702 (2547), яка показала видиму реакцію, ураження також описувалось як бліді м'язові волокна, наступні траєкторії голки, але у цьому випадку також з численними вузлами, які містять казеозний матеріал. Під час гістопатологічного аналізу дані ураження були діагностовані як важкий гранулематозний міозит з наявністю осередкового, але поширеного некрозу. Оскільки наявність численних вузликів у області шиї, але не конкретно у точці інокуляції, спостерігалося також у 8/8

Т02 та 5/7 свиноматок ТО1, можливо, що ураження, яке спостерігається у свиноматок 2547, було викликане попередніми ін'єкціями, а не досліджуваним продуктом. Це підтверджується тим фактом, що під час оцінки локальних реакцій іп мімо у цієї свиноматки був набряк діаметром менше 0,5 см, який продовжувався 5 днів.

РАВ5МУ-асоційовані репродуктивні розлади характеризуються підвищеним числом опоросів, пізніх абортів, мертвонароджених або мало життєздатних поросят та муміфікованих плодів. У представленому дослідженні, не було зареєстровано жодного аборту або передчасних опоросів. Крім того, не спостерігалося явного впливу вакцинації на кількість мертвонароджених, муміфікованих або мало життєздатних поросят. Інфекція РКК5М може також збільшити смертність перед відлученням від матері. У представленому дослідженні, середнє значення 95 смертності поросят перед відлученням від матері становило 6,0 та 5,3 у групах ТО1 та 702, відповідно, що вказує на відсутність впливу вакцинації на виживання поросят.

Нарешті, всі зразки сироватки, отриманні під час народження або під час відлучення від матері, у поросят, народжених від свиноматок, як групи ТО1, так і Т02, були негативними до

РЕКЗМ за ЗТ-КкПЛР, що вказує на відсутність трансплацентарної інфекції після вакцинації.

Таким чином, введення повторної одноразової дози МІМ БО РККЗМ РЕКБУ- серопозитивним свиноматкам на 87 день вагітності: не викликало патологічних системних реакцій (анафілактичний шок, блювання); не викликало будь-яких клінічних спостережень протягом 14 днів після вакцинації не викликало аномальних ректальних температур після вакцинації; викликало локальні реакції у місці ін'єкції у 63 95 та 50 95 свиноматок після 1-ої та 2- ої вакцинації, відповідно, причому такі реакції складалися з пальпованого та/або видимого набряку (від 0,4 до 2,8 см у діаметрі), який зник протягом від 1 до 6 днів; не впливало на репродуктивні параметри; і не викликало трансплацентарну інфекцію.

МНЕВЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«ЗОМ сові зегузкех м свічегж, ЗдУ сгедогу

Ваїзесв, Моліся

КОЖ, Мама веайксв, розоїах 5. кеїїв. часі М, «1205 ЕЗЕКТИВНА ВАКЦІНАЦІЯ ПРОТИ ЕВРОПЕЙСЬКИХ ШТАМІВ ВІБУКУ РЕПРОДУКТИВНОГО

РЕСПІРАТОРНОГО

СиМмаАРІМУ СРКВЯУ ДО ВІДЛУЧЗЕННЯ ВІД МАТЕРІ «30 ЖЕН МЯВА РТ «а» би, 145 «іі 018-334 «ЗО» 8 «170» ватевств чегеіоп 5. «20 1 «ії» ЕН «фа» ДНК І І «2М3» Штучна послідовність «лей» шо «33» Тзолят ЧБМіЗ8 вірусу РВВ5 - пвсвЕ 8 «НЮХ захват з Фета ссс сстзсатасв спасвоієх зе е мет аова Е2еВ жсшщіозсосас ашесссоссс сесстсттов ссестексех застав ссажесетсх 176 сткіссовоацс свосесасса свита с сс а поаааовесі сказ 385 їни асетосттта созЗатстсс зсссєтстяає сзкохстаЗа зсЯкЕстссс А взаїсвасацино свесссеВех осссозатаї сітсваасЯс соЗзссаВаєе ктстусасає зо патаксісад туссосоатиж скКстстстс соодвЗсттсвВ позевстаас стсястоєна зо їкеазсітені Кіасзазссї заззасааЗс КісзстоЗаз авксксстако дос сскЕс чо ааотвоватеа тастсеотсс звис оса Свіст Своє зва тЯзсскскЗоа сзаксвкаде ЕЕ стксзас засткЗізав зі какстаї ІКТ зай часно сцикассє созасвхстєс зсззастсса ззсстасова сосзуастаєа аб астовіассс заткасовоО сесзтясско чоатазчїех Ззівссоває сссамкасо Бад тріссажжа ассотітссї сусгоссзстс атотастзаєс заавсткасст «тосскевоє 720 зеащектазкоа зсацесяїКЖ квіссакстто зоовазеїса КжссЗасЗуа вс соох ТВО говавкксяї закіжкіавО зве скї стовсовес3 аїсксясвсо акзкаовсає йо сазааєссоа свасісЗасї оссттавває свсзсвсс сЗазстаоаав саксазЗс щю заатссткаї ксоовВежЕ сетосссасс ассстетеоа саїжассаає ооо са ІК скззаккєсс птеассасоЗх сЕБІЄєстЕсВ Фсасувсіса КЕсстЯаОЄ твесктассє 1025 зазассеїза саке потазутоке Заст етко ство стпссовсся То5О «звоїзксовсоа ксвкозоЗао сзжстзоаста зсесссісво таскзавВес ЗАЯВУ ЧОСО і сторінка Х

А така сточсза ВгдссЕссяц сасваєтс вра сепрза саїзсесас зн 1250 стовіочкес сакссвсЗех зазасоєтак сттяассоска зкстсоавЕс задсвестов і2бо сесєтазатсв тасуссако ссацоашекУ ссесксазс вЕссстекоЄ веб сов 1358 зсзказваси тастаЄкікс сеовкстЕкс зако осаїзааєза табоасаста ї580 сеодеввасі зшсжсакУсї заоесакоєсу стзамннам палвзатеса естессвссе 1 ссазаефісак сскассовЕс ссевсстУто заассзссЗс стастстесв ссдзсвасоу 1500 сто тоо тоосатакс стіоссоссв баатозассе оатозсває закуаоктеВ 1550 кетсекстст озстссоїВе засззаєсай везаковкко оЗсітсаї тато 1Бео сксзодскат ссваїоїста саветоассто сівесогоЗЕ ссчозотсок остов. ї1650 зсоассваФта сстсвтазаа сісзасвовО тссаскчоЗа зако то ин евопаз 1740 тачсжссжсЗ стстКЕЖїсх сосовпасо коЗітоФфсах стескстаав зо ог3у 18) «асцит пса ВВє Засн са ЗМ свсх казус сттО везе з8яо засазоаїттасє сестваєіої зЕїзастєта зесаттастав «ЕжжЄткаст васесаксс 120 тісзоамааЕх стоовссктс засмаааєют пеасскссокє зісвесва сі ссесЕ 1ако тестах псзхзавісе стаїтхаваоа сІЗзкІсєвеа заавкесеї зссвеуваа заз пизсжтїсоаї статостокх ЗаозазатЯї газо хссзасскос аазвевцєсв. 100 зочссстїсї зддсазвавкї заавікксаї сстсавацає «сс сс роасо іо зиоакжссє гасодатуєт ссвоєсоаст ссозассвзає зустсзуяа зЗасоскваа.

Кг жк чни а: тестах с стосястсас суазаясваз зозЗзїссоза оаааснес 2250 «зозазазЗї тсазвазазї дессасваза ксасскускє сасакттате зссозо 2340 сттазсяатЗа всзопійссо засто сся зкоайсзвек заадессаЗх оЗссосяїК 2403 чЕсшсва ззатостсах заззасає тозссксовас саріссвасї авта РЕЖ скзачааветЕ ссесскетіса аасісєсвіЗа зазаЗзазсах пексватазс сподазаеася 252о зассзктоЗза сЕтзксссаа ссвасассяо стастагаат засссктако ззадзаєзваа Іа смссорасав сстОсскх ззкоассаоте сЕТТесссВЕ свесекоа зах 540 сзасвацаєсс хжкасіксвЕ свтфскавеє вста са дуачісновс аск К зт саєсектаза кетоїКЕЕвЕ жесвавссс сочузесасює сітазаєсске сесбаксу 276 сетзЗссває: охоче асс деоїетовес сржшетачає ссасооєню соесувасста 28 чека асежсуааак жест ст зсвасватеє ароскттсва стос азас зва тзстоватс свт зксовассто ассрасавУ ззасастого зсув 25 сстстотоюв сттазсоосе ссозавсувод сссжстокає зйетяатоЄк кЕсозвактту БІ сксозасткза осасссоасЯ сектссЗсвс вЕеЗЄсттаВі тезссааЯсє зага БО ксоеасопксска сосвзавата заозадссово сзсазкЗазсв Зтосстссва остео ктовоє 3120 стчасашса сасвасстса есксассазуо засо сісоа бавлатосою звеншео зо зсахдазовс коса стЗї зссксасвак сссвзазстоВ топа стх со кокекка 3240 сторінка З вайккссжссс раса сзояасзсвс сасстсскаї тссхзазазаа захсаЗакта 330 зчтоаїзакас сестзазо созстозтвя сосасзсодоз садзаазсте зохзсавеесе ЗО сект тсзза вк висеча сслпакастїв асквавікУє сесттксск асо аск 3520 зоасзазавоа саксаєстесс тесоавкнє свістсвкес дсспдаЕсєї сствоаєсова 3380 тазасвсозо зоозвастоЗ задяаосскто састесство їасссатстє кода 350 чізатсвосв жстсзтавса Тож ся ЗУ тетс севзжстссса сЖ має зав їсасастеТЕ стсоссвою оосостатоо стссвоотой стопах садок БЕН

ТК ЕцК гоЖКсТСОС тексоїкеу всессвуїаєх спон сесЗсоу ЗУ ес Тисі сКагО скессосУс чекає ЕКО КСЕ тод ЗВО хевстчсаех тетВЕТстсЯ астссвісса асссВоаксЯв Тс ЗассЗсЯВ ЗО «шщсодВнно ссоатастовоО сітжтовсто стовосазсо ссзастттв вас З

Чезассктяї Засн сова сскКї гатеїтОсах тестова СВОЮ ЗБ шщисасаска ссестовсах ЗЕКТЕсттвЄ Зсстаосах зсжосаоВЕ СКС чо сісскасттз соКОоїцсє сводроВсосЕ аісзсвзавто стовЗоЗааао тоївгащуВя яаОоКо «застссЧдс ооо стсватУКаї есе сорсястасс стае 140 їжхаКоКсККХ зкосозксчв сІссваткоє сзааваоазче авбесіЗзс тасокоЗсза КО копа осо сватів тотгозсавя яїсесвтїса ссавссзсвс сзаааясося 280 їзоастсакас стазісїооаї опзааадааай каїстассса азс осо 4320 зкззісссва совоуассвЕс завтосста зи ева ср озавЗЗа зссаккаци ЗБ зссзасскас зсстозЗаК зіссосчЕак ссзааакссс сотка сов «340 саааВаКсс дессазсска чвітатааао сіїзосеа сссбоовсаєт таксу з чюиїсЗсто сопстасісв зсаасзсває теопфісссзоо ссозодисває сттоссЗааХ 4550 таазксвочх ссессісаЧи зЗстіссаїск сезесзааає засос зсстсккака 58

СКС К ск сава КЕ сказав Єжсттеактка секс дач «585 їгсасптсасс ссзвотаїЗ пассоззаав ссїскоассс аїзасяксса заст Аа свтасссівс слакавсссЕ зчаЗіНах Ккксстскся астізасота сс соВКа аю соЧоЕсасксю зссаїітестс ссовоссотоо сесвастстк сосптзодова чуб збо їхвЕІтОовї остсотстсс їіоатоаст їодсссассо саіоосестх азоосвоВся 358 їзхтЗзасоцдЕ стжжестоЗсх стеосОсЕ асосстодсе савтовостся точкове ЗНО астісттксс сасастстто заЗсЯзУска сестссвссс кежтастака сте тпвоОКає 5540 зсІса ст зас сесаено скочцевкссх ссзвстаова віааскУВес з тстєтзЗзас сов азскає сотзстсзЗа їтЗссозааї табтвсасст касове 153 зесвотасає сістоЗєся сто во савссотВЄ саєзрсясся азаВасВскх З22о0 вкжтвассвс сессзоаоаа пстостттва стозасяває сесавіссс весссусто 5ЗаВО стовінка З саттодакк ссттстсоаа оозостктса Фозсссатаз асссКоїКїх засассоква 5340 жжостакаоЗ сісктессх от тссовсо Зоасксає габсЗасеє здавзаао АЮ іа щастас твсссацекоа скзавсощже зсасвзостао вехсвссУВє ззвсетсссасв хаБ згссусатеса їастїїсвзо вссаватавіЗ вссатассто дісссзеня звЕдас 5325 пиЧесоктас ссср взозесоах за кассоа сузкОкс века Зв каєсзвасїзоа сзтсозассс потоїтахто возазозаїє сесстЕстоє стсассвссї Зо свасозаїтс одозісвссс ассаїстсво важтссЗаоа їсжсзЕтЯдя вкссаївссо 3703 чткавазтазз асттацеЕкст зотсжтотав сазеесстоз зсдбзазаса собак сакеа 550 ааздазассва зстстстуає стткссваВає аттітссосада сссадясх секс о 5520 аіасгтазатї вазіссавеє зКсакессто відсваєвес саїтскомії Заєткуасях вва састсствЕс сексоссссх птаЯатодвао соЗсстскс оассостсаа СЕК о 554 жест хсст всстоезсос зезаточасс зкесстзаає сосовЕкє сс ОО кс Жаст озаїоааавже сттссвасво скота їссо зЗссотїЕк сте тУКає що песен снасцюосс ассссстоаді стресасвоачі зстоатаакте завсесстеа віза ссатстсе савссосявс звостісстс соазсагсств сакзстсоча зас са 58 щітсвоскЯс тоазваїсово аск сто ссвааїтасс базасвест саввкестКх ще кзасатаско кістах мив стко сізтассва сок кссо віесвесвиса ИН тЕЧосодасх ссаївесскс ветотавккс сЗсоЗЕку кскзавзіассва состав 35 всаїтостсек бостзасово зас тсва соасссЕстк сстасодтаї тітоасвовУє 3 пштазкстсцо заавастоке совок бкоосасзай Євасвасієє спас єто «ЗкО скківасІКо сазціїяїса саВоастозсс ткож сова все ЕСВ У аштес З вІкстосттсо засакоаааз аТОсКОссцЮ ссвасвкаКе оззесоусах БОЮ зІвесзасвк сстососсаз оаоккЗосат стставітсВЗ озітозсада згоаазЗ3ао БВ) ттсаїссва встсезодес сттостоаза сзствсссс сїссстковс абводтаВся 520 таза осттпозсва катскасєвсо дакстатсст сазтаїтват дхосозасте УВО знесзазас ик ссвка сезоаовсс рн стаао саутісєсвав сс 840 жшЕВСТЧІКОХ Зістаасвся ссоаКоцВсоЯ кектваскоо саксксастс своасвесва ВО сессЕстККї созодасоуї ссасотквіє зсарсозазоя зоасзаїск: заавієоава 5ЗВО пааізазова асавстяЯївко кекс сацсх коссасвасаї сваїзасава озкеквекося РаХО зозакстоозоз сазоїссвсс зутозсвесї тсізсасозЗа гоаттсссоа сакасссвсу ?О5О зесатасттї ссводасвод своссрасї зсадзовсяо звастатовоа оз тосавя ті сен сссссв всвзезаиеї заїссаанаї стававессє тзсчкКасї зага тва зЗзсозтаїтає зЗіа:завсзза таїстааста ззоогзазда зВсїстаес сссавосссо 7аба зсааттВссї тазавостесс заст стя ттузосазвс кстсЗстовяа зі ссвай 7528 сіІтхзсовску тавсауеїве: зва уїтазаЗко свісаісац: савсїессвау 738 стовінка 4 вІскзассвс тазасвоазсї їтдавскУсх вассцствасє застає сто чсео 7480 щи дасеа зас тасто ззаксозсоУє зазвакіоса зоаіяскаса сок ЗВО сасптмчвує сечо їзавазссос ство ваза закквастов. Т55О

Фсаззвксас ост стасео савасствтвй КтстовтяїЕ зсвЕжЗат овес 752 акезжссст зстЯвсаКтЄ Єстозавсе сроасттозс зказсаксся бсатсвасс 7БВО зачосакоо зскосровата содасЗззоа сеогіссяїЕ соБоаіттта павсецесасе ТТ сасзвасася зазстсаВОї готссваоса затавтссаз освізсоваЗз ссовоЗсосоо 780 позахассссп зассгссавс єсесткасза сте сса Ззбсашюоча ассхоа9со 7850

Зсаїзхацоєс соссттвтся вхзессвозх копязаєеоО ссжхасазаа стскжксваца 7950 свжсваксс зсзасссасе соска секасвсссс засос соска Тако тжкизавкес зсаїттавоса ссастстіся зсзсовікс зазЗесжїтака кессастщї о ссстасзос сксзісазо: вссїтавес всзссставе ассскстста феСасассва ЕН авсагвакаст сесозЗастО стосазацуа сехжесозаяа сСакоВссках сеассесвазу щ15О зії сста сессії с ївсаїсівої асосаваттс зЕсоітоЗсс втасіооїва і: звчсезссасся стос сатсавсттв ссссоссвао авскстасзо своооакесва го тоЗоссзоаоу ктсссаасва даззсоїтса звасахзесе ЗааакіЗата ааататое 8340 ссдсгостотс зазаззаате Зосаяаєтає одасассттоє зссстсвзай засаЯтає кю тссазасся ззавссвоза ссаїссттоай сассзасвас сесВеЯссх фобстсвсвО іо вісзВвевстсо звесЗЗциса стос свіозавааа осстцоЯваЗх сессовІс 8530 стсорозааз засззаїтта зпозеїтося стзсассатс оссодсазаї ЗсстсочОве БО сам Ецнис скоба с еаосВссск воссаксатО ВН ко ідея ВО скскЗтасова сттосозц отоаадвоїа ссотассазос сакЗзсасссвз вто сса 8 тзасствзота зсазвсосаза аїісЗсяссте свсваязасих Зесаасстах саїстовдаца ЗУБО сесстесхасс зокосгУтсса зсасзостата сусавстаоте азіссастассс зосасатузх БУ

Зк єчисе стадо Фісвізаває созсстсадя сс сЗао васвосесва ВО шетспазоавс стісссавав бссаЗсстах пкттовтясаї сстоакВаєс стотактата во тястоазаза сссдсстесс ссваїтассі стпазсопате язосасеста зсстоатосх во авт стазо асвоЗасскаа вавазозссех кезкааскозас ававсссаекє сестОстО ЗОБО кадаазтсайЗ осоозасоас авастовстсє сазвксасдає сокажіскоя сток ізо агатсвкактоа зваішососадв зкессссаов сїзЕсатсо сстостцсся сзатістовх 150 жщфвстсуках зсутосвко вкссзсоаїсс тозЗзсоатаї озвЗасстка тесосоосах 95430 хастсоазтє Ззсесассаза зізастасав кЕссКавє сспссектск совка ссвЕ ЗНю чечбоаааао стозаззУусс зсеасузацу савоззаєтє сессвскако яса За З350 сассамиис впассаїасВЕ сснетзсоЯа яса ія секс зексцсВекх заго сторінка 5 їсвісаасас тассететха єтстовУска века состав ваза ЗО зсвасзїсєна ссасстатто заостза весскесс Завіса сИє поваасаяих ж сссоїзсааа ссссстсатс стаусвесях опазотувас засвавсва саасскт ка ЗБ «стадо сзісавтесс Фа аїсх ТУстНстокс зазарочОока тес саа аа тазочесаВе сткасмвия сз3астатїсз оса ска ссая сежосвавий Зх саїязасато стозавотао стобєваєцї остаєткацє ве єсвіяа севодссвес РЕ минпїсстм азоасовесеї постастзаз ссзаассво зсасчатоасо ом ететас що веєтВвесссВх своазксяі їсорасатаЗї савівесстс завоїхтоха засвтксках З кесвоїаєх ссаасісЄ КЕКІіЖЄсВеЄ пЧкссосава стос сЯї сао кавОосХ Ка каста с Ффсасаїсс стозссоЯах зксозізссеї озсовооска Засаттасах що їсажсчнни аЕкстсвовс КОС сСтвая дасЗсетежЕ ЗБЕ ОЗ шЕЗаСКЕКеВ. ее іазстткас ссср КтоасесЕся КтОЕЕЗКуКЕ Тесоувесвва тес Катав ї1961хо юШваставсє зствіїїата сте сс свататстЗє сстоссВіКс заст ка 10205 сацзсоззана стсуавксев «сооссвОоаз сасказаа зе веко ессдасскає КЕНЕ дасте кЗає сзазаєтав соесаїаієса бзащнесає мосзаесва сова Весах ага вазЕксвіКс «аа цкиа кекс сів то каТкоЗеКаек соссае ЗОЗ8О сстЗаесвай ссесоеке їКозОстах саке век оВа КСВ ЕВ. АСК тоассстса аассоваєстес озааотЕЕеє саасЕтався ссхцзоасоси сток тоєва цю соісУуєцікс зассвсюює зссваествоє зас товат Зсбацакавто касове цюО тосоуосізяє За ню сеодсскУєс ссасттсов обаїсваоВеє савоцтоква НО

ЧЕстстттка зохастоасе собссвесї оЗзааовоЗє кесзкЗкеає сскасиаає Не) пасасасааК сте асеЕсЕсксє позсацеска Ясажекосвс сесКусезаа 90 зазасмнка ссзасвікчвк сот вВс тво азвсслуЗсВх засос 1500 асЕтассяк: восакосяос свЗсеЗаєос ссзстасвос ааосстакою ке КЯс зОяво втзтотЗаїЕ здосеозієса стЕТЕсСттОо састЕстоОх ЗіЗЗсНЕКах зстасстсове цяго сенсах звоЗчасвос сесвоветх зесуоааєа сс стквня Сас ах ЗО застаставе каессенеа зЕстеовкеє застава ожшекеа зва жсее ца щосзккс астузасовко ссавацотає сесвЗзсоЗЗа зва ссясс авсаїкасвЕе мо завасвсстх сссаскх бусссВвагу стан Якої сонВО оз соєє іме сЗасааоцех вксааазсса усахастее сзосазсе св еско вастесосе мо ататітосва стоозаасво свтсоанато стозазасте взаствоаєю свое 1250 свв вхссмаваО Фоссвссоє зак ссаа скЗовоЗНОє ссзсаТВце ЗАКО мине Фаставтска зукжкекіка зескассйиза яатоссЗко ВокасВкаВ їн скочив дзассоосва своссваєтеа їааоБсо воваставєва аекозсоЗеє З155О тазсствоса ям аскОх всрвктакоа стаз с зестїаста сзасстовх 31528 стовінка й сао ссух опоссосвує довацастеЕ заст сай сосстксваЯс Осо Ка сктсозизас зскааих зе сзсЗсотсВе асо дезаааВса То састоастях застоовахї вівса асаєссвках сс ою «Фев млю тдассятасЗ тажсастстОо сесстоВсяс соваєтосай зсасвоскво зевазессев Мо петассесесе дводсааотає сотовисстя оззоєзасоса аквозцісвс готоцво кава 11590 «аж сни «темно зеЗссЕтсВе Как скс змиє сваха ї388О

КажсКЕссКк оксакаєскек кеооБКесає семкосвеєє сеФчекасмею ст їмо саозОєсаКЕ босі ТЕС с сосен ЯКІ сВСТеКЕ сеоааЕВіц: аю павосжссти вобесета сівссівау осяозсспоа вассксвсла тео Вая 12хо5а дасасссяік фуетатаєтт соосасатвє омиттессса ста їдає чаваєоотех 18150 кЕсцеєвсвк козесвозасс зкоЗзасас свв зоасствоавая секта 12г185о

Зсозвастзє тстсасзазя стоксзавоє ссовсвсяох стос Ес сао 12250 ссЗсйакевоз засо КК Жес са єсвкО ЗеОцмваке стоаваах юю ттостестоє сазтятовоє сізсаосвся всаєствсоєє давесосеїї зааєтсасее за386 тсссзасвес здусасовВоє сссазастов сосок сао Ісаак оє 12456

Вес КЕКВ ЯКОС ККсаК са вес СН АК

Чазскссвас скасує з жкезсевес сасосааса своя ї2540 зсітзассвтс загтасзста гтатотазцсс стЗжсксясс вавесзяасЗО стос з зстсЗазесс ЗОгсасваса соц асва ваїаорвакає зксзсекака воза гоа 19550 ската грцієзака сс снибасонх засстсванє теза 3926 ттвоастЕва СКК Кокс с Стас снежесвжє сзоаоикеВЕ ЗІ БО соцзжкзОоЗа заток ссови осв скїсоК уЗзаїваакою сассвоттса стат ассяов КН дскавсвасова сзааасткаа сої есвВк сазасатаах зобов атакує МОЮ шастассвс сассасиство зсосоооєав тедогтссяє стозатодЄ гасне га с«хжжжсКтЄс сервоазквє їсзатежтс акезсетссв аоБотсоє сере се 13020 тат стсказ сосаттїа зов іеас зесазеасВа сс созтее їз зуклесаза зсзісвзаста сіхссвсвеє оусісвЗваою сасзааєзає БВрржесве їх возазоссвк сссзнїеся совзссаВе сопсасксеес зЗсвсатевза оатаасацее із затдтовссо асоввІєвта сіїотакзає Зсочветтоє созкескес тост їЗ85О їсте сзазвоаєсава сова сіваВаксв ваза рес вас 13359 шетутетсса сстеокассаа ссхїзсауаЕ бат оВессс з аєска ясзквсесао 133850 каосзжсвВих коосавссла ссвсзетко3 сіостасяєї ссстовсасєс акхсвзсазВ 13445

Ммрекичоачета саваскзетає сажа сс сКсх таосоакаке афаквікех ТУЮ зсазассроз тес стто асжссосаст ст кто ще сеЯстОКОВ з3552

Стовінка У ссвостє сте зссовуозка зкоосавсвЯ стсЗасатвє савЕжкавках іза2о атаасттовс датакосозо стоавсча ссоваатчцєт Зессдаскак ставка ї305О сввксдецає КТС свсссзаКоЗ совсткасає ссжстеасте ЗО етсева ЗР) сзасвиаЕса ЕЕЖсСТівак сце сВатс зКопзостох зЕсвОєтвся ЗО КЕКОКО 3500 всевнсома саїосїсвоає аасохотаєз асастзнос зссвосвосоа сс і3550 зе акесо тостуєсваа зактвкакав «ттдссЗска састсоїсе сок 13520 всхжкаєвау: фиизассво совмиеес асо ао асстссвата тестова їх ззісзеаіза ззстзасасс засос скоксассах свзасвсас ВЕКеКеКНу 140 чЧазтсва тсаасссттЗ зспазазст спассозсз ющозоцєє тадатавЕЕ за сина к сссвссосса свлазавУсї соїчсаасс сбтаодсвска сваха 1 скаїсатака сзеостестз тає савссвс Тева Сас 3822о зазамісств кекс совет со дівсзізаевВ ізсаасВік соавессає зок сзассвткє чсостіаєсв кОООЧОасох БОЖЕ ССЄВ стосовсо тата з953 сатаззаша секта озсссва зхЯасаане си есваа Яссокааа ї0а сатсстоосс сетосесасс аскутаозаво состосаовс стєсвтсса гсссвосцЕЄ Іо тзодсзвссаз чезсасосто суазвачосс сбоастався ссадсжасЯ Зевс іо висвеннсїї «срааассесо тоастазосод савасуваєт обтазасаза ЗавтоУсаа 1458 сосок сваа саецссВОх зазаассаза Зссавачав чав совка ко зноезавтдо ссауїсвакс васваєтох зссаостаст сросасвака яка А0О мис зсссвнювом зас «ваза зо мааа сао іа «кссішостеє совзвонкоас зсссовсасс аїсжсвВсссз оВссовусиЄ Кс тОсх задо тасва ах севдасаВс ста сава Зкеасвочас сек ее ї4555О споаззай сс їсвоЗїх аск акоє тассоцітос ссатасвото состав ї-8о са твесссвсє м смюаа саавіазе сові ає пак кю пса ачка зерсовесике Заоекасктіа Фжсваєтзоав зсВажсвсях пов своа ВХ тихватиааа сзаоаавссвх Ззсаавсосоаваа ЖЕ УМ «0 «ії» 5 «бій» ДНК хеіїх штучна послідовність

КД Кх І «ВЗ» Щаолнт ЗБУ1Я вірусу РАКХ «є пасвж 1 «Нюх ммс а доб тссс ссївсвізса совеасттех зБііка гоасствВовО 18 шеосооцезе весесососоє сасебеутша сесстакієх зсссаавева ее 128 «см жосЧвоє зезкосасс ссср скхтесвнка Буває сесвау 50 тесті Оє ЗестОсТтка систе всестетває сатуїствоо зсеактскске а сторінка 5 пк асакака сассссоцкх Зсссззуах котра акоє сосок Екс зо пасатстсва сосок ех стстсвкіє свдадсутся довсасєтодас стсоастосай Зо ксозсттаЕх стасязоасєсх зааозсавос кісассЗоааа закесстаес Как 20 зовтоцаока їзстокатск ока ссоїЕ достютсває саїсттсоєє скоса соса зо їзаєстссов сзассвсавс тетссссЗас застава зо ссах ЗК зо сотрасоосво стече сВеЄї спасаеси осозастссв восоїасова сш соса ОО аоктовзіасс заксасЗЗва сесассско зозсзва аасоасас сстакусиу ВО тав в зссаскЕсск ЗЗсоссвоес аїЗкУускОає завсссвост стае саЯє тев зЗичЕЕІесо зсяЧесоКих ссссВКеЕа вобзооксса Єсесоакчха зов КОцх ЕУУ ззазастсех засто зас ск: ставсвяссо зесссосато атоїзаасає я свцавсссов сувою єх местіяоваа гаетоскасє козаствиаа Ок сУуВаксВ 500 аважнксяо сова кстцкссвКс всесствссоВ саїкассвас са тВ яв ктавогссес товусвсЗИ Ес сісх псасаїстсва тестами пасе ее цнв ззавсссеви сах фа част сеєс ЕЕ теНОВє стра щоКо заз соа ссабчмиа каЗжстаЗска асусетКсоє ссаскаамис ЗзВцКюОса мо хВсзсоцпсва ссвоссссво сосачостєєс зопіскосує сатоасуїнс яїзУєсааке 1200 стат Есс свессзх паса сехоасссссз зскчюас зас ехОВ і кістзвякца гоазсаїсясс ссвзозайтко ттодостаає зісссітсоє всего 1325 всяасвзянцес ївстастєє спас к зас тезває Зсагазаета гака скУ З козвсазасст састсотнсх азосясоско стзаадчоков охадааттся ястсссвске 1440 сесваЗаксВс соссассацЕс сссаост зЗаветасєсвс стастстсся сс асо МОЮ

ЗБК кОнсеакс стос я тааоваскУ сзкаакавнає Заказ еса їі катсексіКЕ Засжскесак яасзассяє завіз аАККО застава хасевесО що стсвоЗсває ссазтосква савстассто стассомоч ссооассвє астма ї5БО асвссзаціз сстсатазай сесавоооЗу сссестоояз Зав вними а З тоайсккстсв ЄтсІсЕТтсх сутазатато тобгтоаасях гіпсова пог тетого зо сассдеєстка сссоесаовє синів апсваоєвесє спаокеКо осот усеє іо зсщаксвес скстзакес чеснот зсаскоска секс авпосясеке 155 ктсвоЧчеаих сісбдвосесс звсваватаї тезссїсссс оїсаєсвазе каскссаасї 1385 тетстацкЕХ Зсаїзаатта стзкізовоО кед соса заватвеок зссасцОази що

Заст сОє ставте овоззанток товацеаєто сс заасвавека що щюссеекск сзсваазакк заавсєкссвЕ сстсззаЯВс сесУжстВтЯ сс Каже ву сжссе сзсзавН стсвассавсх еавоссвасє зістсвоаа аудеессвах зи еБсвОкос тост сусс стоку ісве свулазкайя зозастсовВа аа же сторінка З сязааозаої їсазововох сзссасваво сеосссдс чає зесвеє аа ствасаатиз асводіссо зу стсєсо Фесаєвасх ЗавосссЗаЄ Зак сНикх ЖаНО кдасодісва зазтисесах паз есе вок аасекоакн БЕН зсодваассх ссссксоттсз Застссатаа авовоавесвЕ зексазевоє Ту асо ЗО звксакіова тіготессав сепрсвссао стосувсаве овсесітосО зааВБсааа КО смс сза сстзбатсКсІ даїксооВко сектссссух савссотісва аваКккОее Б сезсвоессс хзсаскссВЕ сзвіокковоє векекосає зозаісвадє Явсеосих ю сОсестсяша КСО стЕЗЕ сосаааске созассвоєє сібзааека есте укео 760 сІївоссвВаЯх звовоссаєс осеєстовсс сстоодсенюЮє ссасуцувоє се сся ЗВ тет козаз зссісовоаає ЯсжкіскстО зсВасчаттк зассстволя сссоЗзоязоє я щрістозатс седссссзтс вісн ст в асо заакстсса зсоНЕсвасо ща сессжотв себоасасх ссЗавсОВ ссКестстах ЗЕ геспаа То щНюЮ сгоовесєтева есе сОКах БЕЕКесОсАК Мити ОаССаОЄ КС ИВИКК ОБО ссазсоїссв тосзаззаєа завззассодо свсатоваєв зе скесвО етеру Зо семи а смавсоссєв св саяао засщастсаа сазан оз ам НеО. ЗІКО всасзазовс їіоокастЯх всстсвсвах тсосааоство ссЗсВтТсКЕ сві ссКВ За зажжестссс тозсаїтзаеї свозаєсвєвс свсетестає ссоссзо3цаае засос Іщю зказізатес спосстоваа созстазтяо сосвоїтолов саЗзаззаєкУ зукосавссс х55о сссстїсзаз зссодЕтоаа сксозасассто зесвазттеає ссесетсвссс Зоо 3а2о ака аава тажксзетіже ксЗа Ну каска сас яссоааск сова ксВах ЗО таачасасаза Хоча засн скастсю АСК сн жа сівоїсваса фтїсасвася това св зо есвс ссавтстєска зсхтттасає щНЮ тевсастЕтЕ стеоссовОО оЗзстссатоя стесацекВа саке зезуЗсаа ЗО

ЕМЕЖасттоЄ ЇСтеСТОЄСТС КОКОС Вей СВОЄ сЕЕ сестеВЕКЗО 3720 фізкекстус тоЗсестосто соососаєсє зсстодоОЄ СС созаоосе ЗО тека таки кЕкажікксв асіссвксска вссеавО кіс ісЕКах зак ахЕ ЗО щи оз носво стос ставка ссавссекао зас кє Ка чес сс оОссс сус бас Ве стос ЗаЗ стВстсЗаУ БО зсоїсакЗіїз сстстовсвк пттттсїІаЄє згітатвся асіхасвайї таза Б сІсттатккаЗ кокос свозоаасаїх вісасхавтв ЕсЗозуВаа зга ЗаЗаа ВО каско ФУ сткавсаток КсссТЕсвс дсосоствесс соасайстее я

КОКС фвсозисвО ессваосОс сзадаооОх тОзїссако вас сза а сна зи сосоавсом вЕсссактса ссавссвсас сзвазассея БО

Каретка зако завазноває сасскся застав зсссове Зк засватсссвВ хаос ззохасстує заз тоса базсозовоча зсесаоа аЗко

Сторінка 18 вссзаєссяє зсстаВатс ЗЕссотоакак ссовалаес сжЕстх саке аа сзаазЗєксс зажсдассся зессотааоо скоба сс еВ Стос КЯ «5 св їсостЗ соодстастка зсаздсвиаВс фооексввоО ссводеає ери 4550 зазатсвеак ксесстсвно зектесатєє єсяссанавє зктвисоцо дссекткака чо

КссЕКЯстах Ззастсзацє етос аа сЕСЕТОКЕся стат Заст КоВЕ яко зсасноє созазкакоє зосскУума сеестоавссс асоотокеся азс ча сзвивсссЕвс ство сс зУзатає пастка вся хека БЕ син сактек зесектчсє козесковН: сесвастеє собувнново епох чо еВ ЕЗа: Зстсосвес Кін оКЕк соусєсквсосв сах звоцсжаса ло из Е сежЕжстаЗсе КЕКТобастЄ зсЗсствКс сабоВаЄвсс ЗОВ УВО чек сс аск тоО Вацак сссткеке ВКА си кН

Всяке зт каУЄ сезссаЗсяй сезосавеех сесаааще яка що место звс пасм сес ктЕастсвОО се соНаВт тат тасвосх сага щей зссвоїаєвс стстоооссВ сохооКастО сзостосеас саєвосссса савадсвсхх 522а кат сесСосопаоа зекосектаа сензсваас ета вору єта ЗеВО сасстзовеє сссжстсаЗа ЗазОевесв зезстсвїяа всстеНхх засво зо зЕптасня ситету оці ссоВКо ас; Тов АВК О БНюЮ тк кастоє бреєсзкеа стлпзаслоєа зеасвоєтв засо є опЄєкесвасв Мак зсеосакоса їзстїїсваво асеватоота зЕтаїоєсто ссссаїаех засос оде 5520 «осв сестосцчихє зазчкосоуз зо ссо скоса хек євав 5588 савжсвасєтов см еєЗваєсс доста двозоотх сускжесках стсвссвося ЗО птоцсчастс поч с зісвтстсаоа затссоокоз ссотсастоЧаА звіссвЕзос УВО и есваВіз зе заст саке акрннивКа кУсоесака Ка ч«вохивссав зстссеїоас стстссазвс вії сосвод сссавасаТЕ ссестесоою хАХО зкВкїзааЕт зазоеїсказсє аїсвиссска Зк ааснис свїсссваа: аску еВЕ 5аНО

Костсскакс сссоВТсКсх зе соЗаО осецосЕсвс овес кіКаа СЕК МО

ЖОТЕЕЕжссСт зстттоЗсяЯЄ збоаатоВосс ЗкОсетОдас ссссаЕКЕ соц БО жк тстаст дЗаЗКЗАВаКХ песо свВО ККЗ сссв ЗСУ ек яК НО ттжЕтотщєт чнсаоЗс ассссствох кстосзонцо: ЗсхозтЗат заст сКев. що садах сазссесавх аиЗежЕжЄ саорссха снасицчКю попою ЩО шини жес болавссє аск тоско ЗзеааЗОоне ба воксх сиве БАЧ кзасатассо сстстсассї заваесств статовосаЗ Стас їсск весвЕсаеВ 53 их ДЕС зосетаає те сваВвеКоц КОС ака БО асатостсох коатовеВоЗ адже ссза зсессвіскєе сстзсоцдеВї єткосвВВОоВ що сторінка чезвасстсаи пази сс ссх Фев тажмчвсє єтоз оса щік сежЕзастто саавтмниса сзаасцвоє степах діссвстта асо а ма захо зієтвссіко ззбатодаза зіоствесоє ссаосаєм дааасевсє ОО зізссаацюс сестососсве паектОосВе скстаВУккса Баствасвнаа втозавооау доб мае ссза всжоеасоесс ЕсКОосковаа снасті вес воВе вішак гео таких дссаоаса са асвсоЗ паса Ксст ставте пе ЧчОвсО 5783 зеасзазас тато сзаозоассс повоєсувоЗз соцетссазяа тс БО

ЧізстЗЕскчу чістазевся сссосооасв ссїкаассов сежсксаскс сесвкаєсва Ба сЕКСТКТЕКЕ созозвтОЯх ссрсоїсякс освзсозаоз доазсовсх завксовоа ще здатоазааа зезстана сесстсоцсї їжсзсавсаї савтвоєааа засос а гО2а заакетниа саавевссвкс ЗО аскх тітасвєвО мин св пажбасосасВ ТВО висаїасЕ швовзасаво омесеавее асасововсво доастаква ока кках тм севссксскоа садок заессвавоє стдазасссє Зуєсошсвкх чес Те псзатаствс пса свуЗ їзЕстоастя Зої аавОа пуск скЗаКх сесаацсосо Теща зсазжтТисст таззастесє засто стозоєває ссїсостово асаоуссвай тео сттосезвссх тасвастЗєє зазобоовав вок азЗся саїсвтсве сайвстссвВа ПАБ

Зсеткоассає сазасвоокх севаВетОєт вассВстаає щасттоВоКЄ соц то сист ка Зітсткасто звасоЗсозх вааавссета зЗежаєсвска кацаветех Уа смт счас сс савиє тававакоВе СесмзнКОо заочна ЗВ еВ то вкачзессас зе з свеоссвКе кс ЗК вас тво жито ЗгтовеЧт стстоцазес сзозасесвас вскаєаєссо секс та пазцсасєе оссоочазта Босак оаза сзотЕссасї УВО то дизесосВее г) сасваатжниа савеесяаої сЗієсавосз заїватсосяа асатетвану созвососоа ЩО пежкчксссв закжжесаве ск тасав ск св зсаооВаНО кс цаАвеВ 7550

ФсатазаоВс сокевтаксоз ажвссва: сровоаето секасавоВ сс скевЗяЗ що сассдвотсок ссвакссасо сне сссзсасссс авсувооскс себто. тако

З Звиззассс асатезодєв єсвсжеткоа зезоаЯкс посі тата кссстасує ВО кестаїзВЕ іс вав зестханс зсосссюае зсссссттва саке а щю вка сосна стосаавоЗа сстосзазаа какая ссвеесиВох ЗО

ІС текета семою єс сасосстеае зсясаантіс вієфебвуєє зтактовтаа КО

Чесасснсв ст сЕсх сассваєтка тсссцксеава авижекаО сце КоВО тоазссозоваа гссссазсве завесегЕка Заасаеое Зазааїсоато аа Зо седсцетОУєє зазозааасЕ опасазаствак заеосскщОЄ зсссїсаааа азс а00 кхксазоссх хазжемщов скатксекі гассзавсвзс ксакеОсКЕ МОСКВА капо

ЗксЗзасВстє вес чіжа сесасУке сатана сс соска оНе вза сторінка 13 сетовОсваа засазаескЗ зок кУса сесастотс ЗссооЕаВВ зссссоооє ЗВО сзастасс спас освосасєєє ддЗссзістИ затока сс сяасся най сет всзЗаз стісзоЯцє зімаовака ссзвсаває баса зссоктоссВ Во тавсстовзса Зсзасасзаа атоЗзсеассе свеазвасоє забОосссає сасстодана Вя сессасєсвсс аЗІЧкосссв зсасаокота сісасточе зеувтЯКЕе васвся оди вах зсіцтсоцсЕ стзхаоазко) отжатовавзе свосстсваю ктсосісовоЗ засзОсттаа ЯВИ чЕссазозас СЕКС созаа тссаВсетВх зсбоїакає кстоааєє сага 5540 хастазвааца сжжасКЕксс ссаВетєа ние озасасстко яса сх щМЮ жах зе зсзовсссав зазауастУє сакластввс аавсссВоєє есе таДсто ОКО казав зсоунщас заст саме сосактце стос оє що джхвтсвсатв аадососвов йсоссетсвазав зсаїтатоса стостоска секс Ей зоастсотї Ззсттосаїк зссвкозккс сазатоотах оазаасєстса з скахт вт) став сає пессцесвмв запо аєво сстоссвадс сезсосшЕсх оз кссях о зЗІЧоозвозаа ста зсавсуааВ савовавіїс соссвсту саке согов я сассазацшсс затсасесеє ссосстУтвВ кита кесскоКксє аКсесосВсЕх за2а втсвасзс ассстока ссеїЗадекО соуссвЕсВх соці сва взозатасе ЗаВі азс ксвестВІко ЗаостуЗкаа акскесоюех паїтасвуоє сризасаває Зо кссотасаав сессстсоєс стдтєатКаї дааоЗстооає загааваасаа соавессткдх Зою ксспопОва гассявКссс ЯгоВоОеЖ фс тоаге зазосООка Оса ЗБ газо аХ сесостаахО знака оутавеоссс стжЕсвоссяа сстесвадов ав скаїтааасати осозаоотоо стотсавтЗє остаєтсвос зазтісаєво бос свсє ко зе ссссоО: завасовисх сет еВ сесоявсако ссаїсєтаїає зЗвай зсскассосак сздассвтає соззсесацк сао засос раса жо ссКВОоКОцсХ ссароестее сЕжесссвсс ЗсесоссвоВ сторассах освоює ЗБ скЕтостаНс зве асВккс «стоцсксоаак аесвЕВееЕ засво света ЗО0ХО іїсатскоцвх ЗЕїстозОас кає севВа сзоасс зно щас св МОВО щшавсттсас сесетессоЗке ттоЗстеЕка СЕЗ ЄЄ жо свяаз сОасстКахаВ ЕТ чЧсвастваск аствЕссата савестОсєє сват є сема вка зщОх0о свозцавава сіє еєка авоссаооза свстаооЗко зве сессії засво шко сао оссуз созссасаїся гзазовВсКУЄ зесозкесО сива 326 зааетсвксс сязЗооаасса сссстоаках сесасассо своєї зе зако сселазсяйз теку с ттОсВостат сасесодосв звоБкасаЗаЕ кеВ ка МЕНІ

Ходекстса азосаВесксс Фах сзасісвасва ссточасосая сао МБО сис висно «созестоах зе їєЗзазї ссзовеваєя смихавсоає то5Б50

Стовінка 15 миска зав се жсх сот сов зслесвовВеє савоЗсдсаа 10029

Зветста океОсикОєх созссзех зозадодацоє рас гукеуканех зОоБКО сесасвтваї СтОЗООКК: веттстстес зоатаутсса псасітоєве сістоссава 075 зазясстовся ссаєзінн сезїоЧсвас сасбтсводає ааскаодюсає пдосссовесо ОБО зостщесвнсЕ звосатосоуЄ кзастозатОс сеостасвосє звавкетасо козВкасаоЗ збо зіжсдїчакк оооссакесв стос сасіссмв ЗзаОтаксвяЕ СІВ СТсАЄ го

Ззстаїжкатс ковоотовУє ссесзЗасст зскодаоасв стсуєсісзЗ соЗоасотах 1о985о застастачх косовоачх зосасВс зе козоаозва зваосвзска зааВеКссе що тсвеосвІжс «кто кКкан своє все оЗЗа зво свеє вкахкасВе їКю зазахасстх сссвоЗсксї тосссвачов стссвстасє кто чава миша се 169 коса зссзавЗссо сс астеє свссвавЕа СЕКС о вес Мо зІзжтутЗсВЗ ссоЗааасво свтсвадатО стодзааске засто тео 1 сдозстао честооваво звоссассос ві сссва столова є гсасвтоЯе 1340 щаезстоссс паствтоска яВтісатеся Ястаєсаваа асссоттЯ тотасат а ню ще сек ва сааксавссо аа зовасіаєви ес 133650 тає а збовсвсках зеавстасоя хеасісвЗасо акістоаста сне какЕ Уурухо ще ВскЖЕу пшсоксацх ца еЕх мне сва сссстсанє сце А38О ст щевває зещцниваєе Зоосоаакессх сасасвЕсЯє зкозасзасо созаоацасха тів касти вах засто чааЕЕ зас асосссасВЕ зссакскаєоЗ засво цю таассяївс саїсястЕКа сссскоосаЄ соайастосаа зтуаостав Яїаавеоссо 250 щпстассвВсст ощоасваокає саковатста Засоби а згасає саговаставй То зас ксва ссрісе акоасстксас солиссссте зго коя класах ЗІ саАЖеМеКСЄК вес аЄМОХ Бек ає секта саоОо соціо ех ВБЕНО тазик тоскккосве БесжсеФевс дес КоВОссЄ ВижКаСВех сов КСО чяазиксста сопоостка скасстааех дсвоаскуов оскссасав кесдсавесВ НО адєзсссвВеЕ доохакаске мюзсачм а ісссв скезатоде зазасоБсх зх180 стеркеоскає стассацасс збораакакх сапрожсвясє ве стувава свозсЯцеа ХО шодазоастас ссксасавоа стсаазає гсвЯзсатнах теїскасжкє сапсекетов 12-40 ссосаатвох пока ЕсХ сусоскккєс ткзостезсо зсжжОокзако стзаваааке Не стос савтжазех стасвоса зсассасох пувссосоєє зас саех їА55о

Хессавсвесс заотакевцв ссказаккоз сецажектве всааозеєс зво є ї1-42а зсдетктаж КОЖКТссЕКСЕ ЗО стеВ са ассЕх Еко стос ТО пзаттессвак тетасаєтає зсгжкскоаВЕК сссвасторсс сасозсазса сабсвеесоа ВИННІ шкзассатк ваккакасєта сзтосааусс «ктексісвес зохсзазсоя сссозсаааа ТаБпО остсовассє доссоєнвся сет сосаа затазодвсяє зссвсеота водазсяєоа жо сторінка 34 ссвісвізаи сеЕчсскаа ссастоє сота звассїснаве КНУ ЄтХ РІВ тенет сен жеке Фавестіхс фзівсвсвВОс сеАТЕтсВІє сви НЕО с«зцразсчию азіатки зе Ках зваахааасвО систе Секс суВ ЗБ пеясптасюоа сзааатесаз ссоїатскас соансатазк акстоссях кексу зя5ОВ

Зізствссас сассвоазеса) авсяЯЗзЗодсва КЗ сзс стоЗзаасцає КОсЗОоКсТеЕ ТУ стКЖжЕсСсЕсс тоЧсЕвоїЗс сезатзех ато зворот екоє стосазвесс НА ат тсвЗ сосаєсєтатс зпататквад зесазвсасЗа ссзсозсєтос сацксстсато 15088

ЧЕссіссацо зсатсвасто сстссвсаУЄ постсаовоЗ сасааакає сао севЕе і3158 зазаацвсах сесвасоско аа зосасксксс вусвеакаа ЗасаясуВсе їзщю вахотавссе зсазассаїв сігакасавс спос кКас квас аск 350 чІстакоассЕ свозувісччо соввавнвн їставазтса КЕ ДОа Вес є З вот тстсса сток всВа З тасвБах ак їОоске з заєссв авсатвессВа за35о карсзжксЗЕЕ тцЗважксВаЇ КеЗсакксОЗ КтОстасВЕВ скстоасвсє ВесЗВсВЗО КНУ

ЗЕ тА слекеакЕає тет ФссеежесЕ соЗсоввта зуакЧееве 135 дсзааїсову Заст зсбссаоасЕ СЕС ста ЗСОаСЕЕ гост 15555 «хна скаче сс коВея зведено сосок ВА сват акакВх 138590 згазскуове пз тосова сточатаЗча ссочавни акссявссВх ства мює ї3059 саптсоацає секта еє тасссавіво свастсаває сс Зак сЕксВ 13980 кзасажнатїся тКтсскКаВх осагксовсс ксобоазаскх зесатаси зак НО чека совка зосососвку псасекОає семи аося сс Зках КК «кож ЕВтсКо тОстуссзаа даже секс а КОКО сасє стае 339 зстісаїтаї ЗзатоассоО ополоватся осот згстссвааїа зво содина Іо зактазцутав зезсмчвкКекс дососчаєє хвссзссах сазасаїУєє звесесавО зо зпазтсвааає тсавсссткЯ зсезОЗасхе созссоввеа зеоаоваосє ета КЕН кіБсваслат кссассоаскоО свезааааст смоссзОсс ссср акся свіакасасе 14150 квісатові аск ссіа зуВіЗїсасВ соссЯВс сни тох соасзсастх СУ зиасістоа заст Зона сво вівса оасз сао сказ 33250 сазссятаск зкаєттевєся тТоЗбооеЯх сесвесскЕ стотодезся ста не сатаизачека сива ЕЕа ксветтссао Зіка есте стаа сенсах БеНюЮ скани ссжасосасє всзсвавааа сто сВоВс сессвесєва МОНЕ ен тсрізассав всасвсосто козузазесє соаставсяз сезотовасо дсастсввх 15520 всеаоВастх сенсстсо хзсвимКО) сзаасУнкх зскааасона овоїдЯхаа зако сестсВІсааО Важно заавассвца Зссацавова завдяаааах ссвастссаз За щцюсозасю ссзоссвОїс зассвастоє зссвастуєї Зодосаевио абзазеєесє з стовінка 15 магоаскасс зксозаозаа засво ста заазуаззаа ЗеЄмноваз сасвеТЕке зЗя7 5 смс созадасавс Ябссвосвос вісбкасска ассоне ССС К заго тасаатссвЕ сезапвсЗаєт сетаассвЗВ ЯсесоВодаає Коса ссЯкК ссакссас 1ЗБ8о ззазааткос ксттсВОЕЕ звЗсЕсактос сзссруєтє ссвївсае сосстаКес Нм зсаусавстс свсвіссв ФресзоЗато сзааставех сао ЗезаВсє УМО звкожисЗєсо когоассст сзОксвести хтсазткзва осоагсасях задово УУБО скттватзОсє скасаасках Зівзесаяа КЕ 15993 «ід З «її» 35092 «Мій ДЕ «еїї» штучна пе ДОВ нНИть «од» , «Ва» їЗолву ЗБИВ вірусу РЕЖ - пасзжк З «З» 3 й «зако досві ско сктасаквса коасветех век сассековао 5 зЗсЗтовасзя звуссссассє савсстоЗ сессках засссяакав таке Ще секс ззосвсвссЗ сскостестс сстуосвоаса оЗавеассе соска каєх. ї85а тесрозоааює зосоостїев совоатетсс ЗссстіїВаЄс сзсостодО Секс ва шнчксако сасеєсцасх асссецеат ксзввеасак содесаанх Ве ЕоСВов: ЗО

ВИС стквО косе сю скік Єжик ККсВ сус овВе сус. збо тхоесткаст кгасзаех зааасазс сккасівпова чес зсаскске ЗА зач кастТссвксс оцет ос сїсавє сВЕсттКскс Стос 880 не тссоВ савтсасааєс екс скавс ска сеза засто стаВе ЗБЕ се 50 пеязсяцска сутодесаскї сзасвестс всозасся аакскасаяа сасОЗсесх 5 зстозівссє заїсвсоЗаЯ сссоасосо ода х зссває єссакосася 50 твЕссОисга Все есе ЗКЗїЗЕїЗас ЗаасжеВесЕ сс 720 січе всяку хобсгсасто зосвозккса сссвзаєзха гасзЗзаква ТВО ащеащкисі застЕтіко зате стоасоууссв ассксосяко зкЗЕЗаВгає нав сзозатссца скоайстсцаєх зесттаража гаїтассасс созаєхазаз текс ся юю азаїкеккех сени сстосссасс зесстоїсов свісасєсяає НМА я стоазетессю соазосасцх жежтссттса ЗсасаЕсіа КЕстсНх асо кассє Що задвесктоа еМаскіцах сек звеакОиЕ зас стто кіхікчвнє сс а їо5о ваФіоеюосо ссзвідвозає сажстаоста зсассттсво стассавзєс зазінника а хосвеасав зеаестссвВа сс зежеЗєза сеї: ущекаВс ї150о сов кес саїссасося зазЗсосках сжкккокса аксссоцас воацрсвестаа її кЕстаавсов тезкоїсясс ссзЗовкссо сбсаєсставе аїссстієас зттвацесоа Що земацМмкс смсжассткє саке с ч«аккоовеас ясатазасво асо У сторінка 36 косовдсазасо зстсакост заосакоссея ссаазоооа дЗазоваскка осккесасоє 1440 ссзацвкссас сстоссваїс сссвсстясй Заазссассяє стастєтсса ссоасяцаєсо 15 пехстжокЧю тост кЄ скррвоеосса тватоваєс3 сжватаває орав ї55О сис застав ас васазасєсво засо ствах Ву ЗАТ ссвозвсзах ссазкоїста саастоєста ствесотоВЕ сон ає пес есв Хе85 асасказеата сстсвтааая сесавсоЯВоа ксосастовоВ зотазолоотя засо а 1795 зе сіко ССС ЕСТ сота коБітовкаї схоссєт3ва зу огскка ії свссасетів гссвзасзває Зоастассви засазаєзсх сзавоссєто псостцскЕ їщ6о зсзЗОсеас сестааккаЄ ЗстаЗсЕстО ссзстосюуа сетесгтОК: засос 1520 сесаваааех стоовссске дзсзааатах Бас сксс пісасслуви сопе ссоасЕ 9850 кекствакІК зізтавакев єв аню кекси вааасмХ асо НО пдстстсЗє сеЗзІЗскЗїх заз сла чассо сссавасє азасадасев «ай козвсестест досззавахї зазастссву сстсвааоає сссаїстатО ксссаки жа аместссєс хяесизасвкт скацдксЧакт ссзаоксвх чеКтсавОна зазскссава тео зитекоакоє бастаєаєс стабоєсас созаазеваа вет свавз заазасацєсе тА сзвозаоаавас гозазаонУує оЗксасаавов сссессосКс тост он о ставслаїтоя зсааисассо» Зтоеєтоссв ЗсааОєвас бас ссвоє патецсх ню чеканні ав панщина тавестсаве пай сваАЄх зво ва я песоожаєть ссссосстієз засіюезіва вавзазавсах сів аоє кофувадаєа 252 закгсастоца ттжцісксва ссоцсасквоа Кк тасавж чвеесвсм дозоавосаля е55о свасгссоасаз сс тсєх забассдаса сежессекає своесоїтеоа завтЕенсе за спасасцовес тасасієсї свтдгтааоє астезвсас заз авоє засеосзекх ВО касета ссЖаїсКеаЕ серсазвасеє сдозесвОся токзаатста ссср со УВО стдоссвУї заЗаоссасс осо стоавес сктаастоцає ссасоддтадав сатовосста 282 сс ваЇ зсстсоавааї зесхтстст всоасоаВсс воасостсва сеча «ВО че ватс спостссосх збо тто зскосисано ззатеаєїксо осв «о сесстОттва стхозсочКт фсвВаакавю со сїктої соток стсвавсмо МО стсеоаасікай пезсссокок Встуссосвс авосеткааї соазссоноОЄ обсесаса КН сксвасяїсса сосазааака вауваассооу сатаівавка феосссесво осетаковос За сов авксв сс сся вссзссВваа Закуосєткоа завис ВО ча З авсзвтбааоає тебсєтих асрссцсао тесзаоскос ссосВісте ссотессета зай засткекссс сасвІЧаЕх свозаквсає сасстсстОХ хсстводвааа засщаса ОВ чЧкеозЕВНхОс куческаО сБастоокни ссзЗ ува саозазаїко звоакосавВссе ЗНю ссссттсваа зссдотссооз ссзакасттва вссаззатках сс ксаєсс зсермнивссе БЕУЖИ

Сторінка Ж? бо ачсзацанна иа есозстечає сатетсАОєЄ песо сотавтсцая КОЗИ таззсасЗаиа содової івоа забаасст сасісте гасесЕсте сок ся 550 ін сеОКа КЕ свеаєи бочку зе сов стеесВ ЗСУ Є ЗБОЮ тсвезсІЖЖЕ сіоссозОє зассстасов ССО сеоатОУє осв Но кс ЕВетае Сетсстостс КОКСУ ЗсесаЯТаЕК соавотоєсЕх ска ТкоВ 3720 поет с ксзаскссотоа сЗасосакс ЗіссацЗЗах стсжавтсе соазатаЗсКх зт состав сов тстса вестссаїссв вссовОссро ксжсККуЄ зассаєзакх зав сассочаає: ссаїОстово сКЕтЕнасєтє таза КЯ совно зазвссезце ЗО

Зевасствх озісобсесє КебоЗКевсу гатотаїсак ссттвасВаа КеВсжКЗОКО ВО еассасакка кссстесве ЗК ЗЕВС секс а КОКС Б стсїтокЕса косу токес сзоооосояїх ояїсасааока ксзоЗоваао сЗсвтааова ОО сарстссооає сопвотОасЕ стсавтевОок фсестЕсКс езсОєтвеє сутацесесте о тека естї отосавієвОо біссазОсас сзазаоювої сові сскОакО аску саВ АЗОВ спос шко сооокоскоє коса соаай Фев ксвВ ксовассбсвє саван оса збо твасттатас сзахетОаК завазчозаав саїстоєссв авсОЧх сс ссєве «зх згдассскас сезеоссЗес вазтосстовз аа теасв засос чекає 5359 весвасссас зсстовоВ зіссозсатах ссоаавтекс сфтоксееє секс ре Н свгавщий кс ж сзвсска заїтїнаай сттоБазаЗ стсоуаасаєї са Я сачЕсснсто сопстаєтка всазсвсяає сом ткаво ссннсаас есОссяяЯх «550 жзазвссвомї ЖКсссстсВ ВассосЗкех ссзсєзаає зсвсблосоод соска ЯИХо сссттастої шсестсазОКЕ жстотакода стсттотесв страте с Зассе тва ке тсасцЗсня ссаве ака ес ава сект вен ескев зва с сасзссстяє статшасскс зЗоЗзсекаї ветсетстсо астттовуку стуєсовсо що парк сВотс асо іцє екс оа сесвасє сота ЗНОВ БО ттактстцек остсєсЕсс жтозсолеЕх саосссвссо сатуссскх заоосаоаса Зо

Уста чОЕ ск ВТО асЕЄ зснсстес саговостес тацстоатх Зако секс басасжека забава ссстсевссє ТеЕКВЕЕВКа ско що межсастяти оз схах стссвВОасВО скаже ке сеснює зак щи

КТС СТОЦОК сут Еооссоє СктастозвЗ сгтоссуоват бак асвссх катЗаВсВЕс УЕН зесвосзсас стекоцассв сум есо «вестокоюс сасвосесся свадасвякЕ БУ ахтасовссзс сціссспаза зскоускеева сточосоває їЕтазЕсЕКс ЗссосЕВ ЖИ сашфітдазіє ссттсЕсуЗа Бас а ддастсакаа ЗесТКЯЕСКХ засвссавад 5340

ВідістОєвнн сбекекесте укіс соЗсо сеобЕстсає ато є заз Б зак сасєтак Брекатвто сеоавсооко зеасаосте заказ заст ЗО вссрсваізса кастттгавО всосзамнво зіхвивКеке вісскатоєх века 5525 сторінка 3К

«чазасакмв: сссстсовЕє заоч сва заЗаусассо сис касцчвеав ЗБЕ) саксаваство суссзавеєсє добу таєки оса сОссЕхсКх ЕКоВеСаКЄх що ззЗнеоаутс пЗочесассе зисасстєво заїссашеоа тстсзтенв ассякаєся ОВ чжсзазева зесжоакісї заказ а свасссства «опа иася БЕЗ сса св Щ760 задазвсєав зсістстає сестскасвє атіїсосавц сесивасе ссткекЗЧоЮ Зно звтктазасх запіссзвеє вксаїсссту аїатаакаюєє каїіссодоє часа кає 5ЗВВО сс акс сс ссх земицозво Зсоцссістє овесдітсва се єоО аа вевІжКкх Вот оЗсв асани зЕосстоває Оса х есе вОщО хости жвсх зва сібссзасВа ВЕК ЮКссо Вас Н ТКУ Осо хх ттоКасх сосзеас зесесстоаЯх суОсасаЦЕ ЕТО ЯКх зов ста щі скабсажетеж свассвкази авЗстекекс сбасцїста сосастсоЯВо яса ео БІО

Згїзассоас сЗаазісоО аск аско ЗеааЗктОКс тувастокесє салат вва сзасатасєїв ска сс звоассетко сівтоассао ост ссе векаксВеВ 3 ство ачасх ссавУскккс затосааКе сакоЗСТОєх канахассю осв ся 53Бо вовче їсВЕ соЗісаює во еткав кос сстасзВках стос оВ У пазсстсзЗО заааоОсеЕ жсосаокссх пезосатоВа азс стаю БК сот сззастосз состава сс КтОаЕККеЕ Зкссяастеа зсозасекев 5340 мкс тЯї зестостЕсе зататоваза асо сва ссаоасвтх пазосовеох вда акассваааєс сетососсза зво стскаатеса оз есаза зуоааавова ВЯБО ктІтоїсква звстсоазосє СеБОсіваай свостастес чекає візок аКу БУХ твзатт сх осстоовсав саїссаєвся оасстаєск базах Зоо УВО ааасазеааи зді скака казав сс чузЗсссмв паз кесваа тво Куких вка шівстотсят зЕскавсЗса сесоЯїОоасо сКттавссва саткссаєтс «ацасяссва АЮ «есте е тааозВі соус свв аназа вас е защисвива чо повтоааова зсистетако кссотсооєх сссвслясак сзасаорсляв зас са та2о возекОЗнюх сзаеатссасєк заїЗасвоксе стсзсакода КВааїессоЮ таїассеВсо що жан ск тсзосасаво сслоєсозсх асзоаоасну доска коао еко сааа СТ стркесссся зсаоватех фкссвааах сграасскє кс асх засо ТОВ пса кас чеаЕзвасаНо свЕстанста зваасазача загтстОих сежансесВ Тео асавіжассх хозвастаєс зазстасте рвав кеткУєа вка Зо сЕщкУаскЕ засваесЕсс депукоодзаи востазаосо сассасває сазстесвай 7380 шесмннвисаєсє цЗаасвоОсї ткзайстаєх воссостває Засттвасєсє остео та«а коЧсоостта пса єто заасзаєсоює ззазаєтоха зовіассвса зсявавсткх ю смоежинюк сс засн сестоауко озосенеиюа загсвастов и й сСтавінка 15

ФфоаФфюеся зссскаєВо савасєта) стсеЯаєо таза ЗВесессох ТВЖО зссзсссстЕ птсчвсеес сістозавис сок ас вбвасксо ЗезкеКае ЯНВ дазасатово яссзпозати сус садя сок еВЕ созозУекта ває 7830 скасвазвоса бпадстсзаях сосссааася зватазіссва осаботявна сеадосяєоа "ВО ззатоассссо аасстссавс жсссттасза ястстаїсса ЗїсвояЯОЗя всстовОсе 750О цсатіадаююс соскттаеса аїассвоясх содазвжкїкУ ссесзкавза стсстсваЗа 7520 сзссзацтсс дсазтссвсв состава сстсвсссс авеасек сосок ков 7О8о тзоаїзазЕск зсзЕісаюєа ссвстеттсв асасдакекс ззосатО есе Зсах 8053 пфссствЕвцх Фісатоани зсесттзатес збоссскає ассссетека ат Зссва ВІбо звсаївшакасє сссожоні) стосзоавЗаа сстєреаай свтаевеВЕ сезсссауВ я ска сста ссооцоцікс зе скваї всровомс аїстктвасс асзеказива вах часзссдесв стасжесксс свісавсжеа бсесуєсазЗ аВетссямк зу сва щево тЗоссадаава сжсссазсва запвсакткз чаосасассх пазазетвата заст 8390 сопе Кете азаовЗаас: дазастох Заст ежтає зесстєваах вас аю їхссвзоссЕ засни ссатссткоЗ сасезасзає КтсЗЕТВес гоасковсво БаДо віспосястс засос ся стсаоОкНасх сатозааана ЗсстонцаааЕ ссесоВксоє в32о секопоувая аасзажетта аобасткоєв стоснетаєє зсспоасаз зеетсовоце ЗВО смс Коссак ЗСаОсВКСЄ «На НО оз соЗ босевасКЕ ОО сскуївсовВа «тн казка стоссам зт ка астакускв. Б таке зсаасвкааа ЗзУБОСВсСК свсазааКВх засаетВє саксаОа Уа пессоаккасс ах мнссв зсзеацсзка Ісака то вЕжКасоєтс восасвкаце вахО січ Кт тоззпахщИ асвіоазак єкта троса паса ка БА

Чітсовиовс сітсесоавач сссмасєстаЕ зіщнегвиає ства терас КОЗО жкастазаєа ккевВКеКЕКс сеча стек (кас сКо востаннє Е ОО пдассЕсвва зезувеєскає зазваастах сеїзаестойс аавсссвоєс тесту НІ тцвкассваз зсощиЯсеає авсцниес серекває сраки сс КУ ататсвсато звошзеосваз зезсстсвой зів осєВ сс стосо са естоах що оастсетях сія со зесвсовтєс знах сна сстсз тстосовсах зго тасЕКоакеє осссессаЗа зчзиасвзиа ес аОє ес Кієт Фет щюЮ тво стовавааіє зсвасовни садова соссзесук саке Зою кеаскзацосс Заксасаси ссесстаєнЯ чека іка сс ккеє зе БЕ сеїсавсас места сестеавоста соОсСевеках бесоціїсав заовакУєес ЗВО видитетсно Ковсстоїто ЗзоссЗоїва ЗЕссессстк зано каЄ сазвзасяває 4 кесикасзая сокссссекк сс саЕ завдає закваавсяй сезскекоа ЗБОЮ тес ва сассвнятсск ЗзесЗацУсс щас тОкс зафинкюета сросваоєсаи ЗБ сторінка 20 тозвостщат сісаскозтО дацассвіся басоовоассє сестоєсах соєва 250 свідаасвт ховав тас став остасссаоє азоттсатно подо Зува засос засне щзустактовУ сао зако тека ЗВЖО асссвстсах сдозсскї їсоазсатавт саатоссстс авазістокВ ЗакажтесВх яю сосна ссзоааєтсс сежбсссвсс зессоссвов ссоюаскеє ВЗ енюсх З96о сомоствоє Фовсасатсс ствосєсовах зжсатасстї зазеозаасся чатастосад що їсзЕстлоВЕ аїтесссвавє КОсТЕсТВА ФВсасСКсТЄ тост ЗтоВсссв МюБа певаєсттсає ссср кеоастсжка свуєтвкОоКе а Есзав мес ню сзаєстовиє астаестата обажстоВссс сзатакстех ТстОссвІс ВассекОкеа іо сивмоаазаа «са зессвоЗай састзОоцко иа сссосКух ї05Бо кс сзозковтоав сассазїитев КаавуассвЄ звксозсвсав Єтатааєссає мне зчаїтсаїсс сводазОсев сша сЗтавсостЗ свЕттеассях сосен То35О сскоаасааа сссКезиккс какао сеаК светецвося пика секс а МО тдзесстсах яассвастсє саше свзсттваєз сстососа Сеат сав іо кекс зассвсюзо асазокоВЕ аекссоза баса сассасдає Кз кучнитазо зссснюация садосесеєс сват сксоВ аа ссвуаїс савоокасая ів8хо0 пс тив зссОсшєх сЗоссаоксх дозадоаоює оса тоссосаа 19580 псясатнажх сіна х вежескекеє зовтааесєв зкаїтстасвс сесрнсава ї5540 возостаасв совка совеє своє тає задтсововає аассвацсах песика зОБО0 зсутаєсисх зотаїтосояс савссявеЗс сеастяєвоОс вавсстакю ссоохса9а ТОББО шаТоєопЕе дооксЗКеса СЕЖТКСТЕОО саКЖеСОсЄ зви ОЄКак ЗсЕаксКсяе 1097 сто всаєс зриотааос сссвоуссЄ пссозаоаса стос саа сзодасуках іо9580 застветдаї таїсаоває вистав застозвЗОаЗ зааосваста заЗвасткес Мцо

КсзсеосвВЕтс згин сзаавОтаєх тасзеков ооо есвес везе УЮ заватасктх сесимщісєсх Єдсссазаов стссєтоасс сіни сЯдас газо осх ПО снах зссвааессо ас асісї свзосовтЗси КАЇсЕтЕссв3 ЗастссВцЄє 1920 зтатттвсва ссораваєве саїсоааако ссоповаасеї зазетиЗаєї сеаоовує мово сввастаЗко «сиза пабссассоє заст ессва станов сесасвсОц каже зодсастсес дЗастакусєка суєстсвЕжсвВ осівссвавй деїоесоєто тає ков Її кссохасата дросессза «своссмнсо савоОстоко ззааестаєво азстзаеовОє Ба тозвестозсв зсевсяскех асовстакоа састсвовес ашжЕеЕцаєста света 1525 саЗЗассск зООссусВОх заз зЗзозесоєва ссстесавоє Зав лі сесоваває сват зеВсоВісст ркасексос зідзасозакиа зсваоцаса ме каста засн: засссевса зсБеесаєає зссвЕстаєв Засаскссу ТУЮ сторінка тцвссзжасЗ кассвстето ссесоосвс созаскЗсаа стзоаОство ЗзВассося Ти пстзвсснх Фвсаватає єдіавек:а Оадіввесєя зіоооєсає тетозавакав 135526 заксзассяв стасссцеза зіссстісає казус Зззасаа терка 3185О сажстесстЕ Зссзтастеє птооОБиЕсеє сежтосвВООу СОН тастоє ВСЕКТТКЕ ЗЕ саазатнОке хост ссосес ссстссвКЄ ОсеЯсЕсоєс ЗЕВС ссоааска те 12Оо0о савозесєта хаосу та єтасставтї осзоазекоЗа кусіссвесва шксцсаеса 12058 зве соска: коса зва са сс оазачассх 15150 сісоссосВЕ сівссзаакс ЗбозаасажЕ сводесвацє пусстодаво садка з215о сізазостас хстсзсвада стоїсзаЗає ссзасаїаак кссссВсЕс свасвкстод 35245 ссосазтзаа боса соссЗсЕВКс ссаостсвсоЯ вста ставте 32300 стоїки сах стасвоабаса звсвесВиХх Ззааесеса ово ї33565а ксСесвасасс запас сссаваїсов ссВаКїкай всазідостя зва ує 154га

ЗСасЕестакх КТС Є ЗзЕацсекевВЕ сваїтвесеї ссання скік 12489 чавтіссвує ета КОцсВЕ зе ЄЕ ТсеастоЗсє свовесака сет сов 1-58 чставссвсє азствитств каерамне ссзссжсвУ зсоваасоЮ стсасЗааМа кеВ шетсувасес Зуїсосвака хоборсасзя азтаоЗасає зссасесвте волоса сив зав ксатовенні ствЕсзаков сс ссаїс созаксакозх: аасежсааає ккоБацОєа що ттасосттов сіасКаКтЕ их ЄтвКосвсс савтжїКатс саоавотокЕ 12780 кузЗаатазчв за сас ЗсекІсоє заказ саскацітев Бек оссох 12540 зсвесакечи саздажтсав сота ссяс срвасвтлаї зсїжеєсосах Оса Всоос ТОЮ зезсезвссає сассадоїно всозооосав ско кссвс сеоззатцає есе МеВ стек чиста ає вав Кс зсоцссста вобсаєксоє ства єке їх

Щити кЗсаскУВсє зЗаізетазо весазсасоа ссосоВсє са НО пісстесвоо зсатсвасте ттбссвсва: достсводОа сисвавсов: соБтєссаке 15359 зчазавсеєюс сссоватассв созацесеє соусастессс артасвссва закаасВсє 13700 захотаассоу зксоватссата сміоїзсавс сода еве таз Кос ї3и0о їістасвссє саозозтоо созозааове стає ск оззав сакстЕкоце 13328 что сто ссва тт Езсацак саке єс аїстдаєсся звкаквессвВО 133Ко сзУусвісахЕ кока ая кое Ооз ксерокс кествасасс зесвіавха за зн озаста сват ст ЯссаеВеЕ миша ВО і35559 моаавтсвоо акт вежссусаск стКестіке Іа ККЕх ккосСсОкока і13550

СЕКС КС СВО ТеКВЕХ оссовідеасв асювсвасвю стсзасвтаєс сдаїтататах 13620 зезвсеттачс заетатсаац ства товов ссозатоосї зсссввссаї теза соде ізо сайїсчваас ЖтстОоКУуЄєс сасвоєоу сопзвсітсатаї ссісжевека ЗК ЕКеся ї37ч0 кчякавахсв тс тЗзає зсекткоєє сепожестех фккзактяка кто МНю стерінка й зсасасцоса сасасксацс зцсасаасЯ зЗсБвсохас застає СТА І385О тка таїссЗ їостоссзаз азвїтастатяо сстоєсоста тесісаївеє стр аєса 15520 зкттсвини оздамвесос ооо віссю с ссваея пос оцава їв заттаозтав зостозсес зосоосовсе орссассвх сзавасвтав: асосєгвовав інно зас ваває теваскскто зсозодасткх соцссулоаєз зЕочовоВсє саовтаакек 15100 канава сесассоосо савсдязацсх жо стааєс ссЕВасиїка сВКВЕясВоЄ ї415о саїсатовтй тасусссттз мобаісася сонсснцасс ссоцовиОЄ СроасвЕсхх 14280 чакасксто ажскоктктх: тсзсекесво всасвіовса ажатосаке зтоваїскає Зяго савсснївє зсастувеса тосоЗОцчео Оси ссКе стос я ЕВ аКЕЕ 1435 «ай еся мимазеежа ссасекксм) ака сзжоссва ска ве гас ннх сстасссаєс асоївозааа коастасвозс скссовхесва тссоеное їв торі вассза бсйтаєдвсто стововавОсє соуаставса сова свайсв дсастстшах 34525 зсасцастх «комросксо сосок сааасоааєє Якквазооо за таа 14580 «сісиїсвац тзіодссовс зезазскнов дссаоваяза аазВазааах ссзмостссах ЩО сна ссавісаїє йаїсазстОя зсосвасеВсЇ заесзсвака зіва 1440 засвссвосо звссосвоеа зрасвоЗсів ааазовзаай Фестоадвав ссвсакіке за 80 сксствостоєс сзазоикозс етссазсаєс зкстсвсссв оассзавсас вссскткосї 35и20 тдсавісзах ссздасвОаст стізассвзва демадоазає боса свіссвоса 348580

Факс кс Зачкжкакес сасоЗекє ссатасазоВ сосок інно зкотовскеєс свсяежкоссосє Ззоїсезозсяо слазетазет бвсазоїсвоа ссовзатасе і5о

ЧезавітоОсо сш сКкх засво ва сазан зсозсвсях пдопоетсада ЗМО «кізаствак сесдозноках яхасесава СЕ ЕН «а 8 «ВІ ВННЮ «ід» ДНК «Я» Штучна послідовність «лад «Вей» їЗОлят ЗБУТОВА вівусуУ ККВ5 з пасаж 15 «НМ й мірмтутета зубів сстасвіасв совкаствсх зоре тО госссооо що шсчтоосіак зоссссоссс свссесктов сссстаксЄ зесссвасау зак их 120 кЕстсмщес свое оско сспмостє сстхЗказса сззасваест себе БО сссооавос зестосієтя соозатеккс вессіжтаВс сатескову асокесвюсє кеВ шщаксаКНу сессесвЯєт дессЗоЗзтає сстоззасує сдуссва сасеусаєае Зо песто сзсВсОесх секс кЗозостека зозсяссоас стсоєсцсаа збо сесттогЕ гезсазаєсх зааовсзаоас кссаскодуа вусссстажс зщЕВЕсесТе 420 сторінка 23 заслано Сас жукє «ца засестсас свое цес чо минав сажасває стксессває Засттосваз вестєтвуах зіестех 540 пшіовсЗасто стос сх сЗасаесткє совасткса зекееевая ссказкЕчка БОЮ зстзасвесе звісасрооо сскотосксо бак Збасосцваєс тост Осасо Бо тотосовссв ВКоцКсссЕ кос сасх зтотосізас заастеВесу сте ВОою хо дазсттео вовоскакЕ кекесвжека аЗоазаксв кессовсока каса МЕ; позавтсснк засто аа смс ак жсренко тав ас що качаатссков саасхсозех осстквЗаво саїждссакєс їозасізова соссовекся воо зашіссска: сах сетосссвує вості ссоа саїсвссаає гедоааєсса. ке ствоєсксс свсасак сіє са пере ся кссскасах сасссасоє що задзесутоа сота товс зако остео стек стоскувссо іо зааїЗсоЗся тсатЗацове саїставста зсвссстсво ттазссавасс зак цовасУ мо щкахвазтаз Фассіссва сосаЗскк ацОсесКсоВ свосакасх св аакс 1206 сік цаєсс свієсзвсЯх зааасустах сотесссссв зскчщаїс микаксстов 1566 сстзааа спасе сс ааека Кс тае ВессктіКає зем сУВ. 5356 зсвсвсавеєс гассасЕкес сосакстскс ост тчоВеас оса єа гато сосо ІЗ5О ссвосаззов озсссоїОсї задсосассо ставаоцтва Зазузаккса зстеесвесе 1 сеззозЕїсає сстоссозс сссосстаКеа оваттассвє стаєтстсса ссвасєзвасу 1550 засто ква стлосакокс стЕоссоссз гтазізавссе Забозівзах обста 1555 сотссссисЕ застосо гтас засаЗассво зба актО чоЄтестцає кате 1525 сІсвудсвах ксаатвЕста свастуссто сстассЗкцує ссзовОксус цестосссеВ 1585 зсссвацей сстсатааая сєтсаЗасООО їссзскООоаа зставзаоос ассткачова 74

Хо СКТсВ сік Котова остео кЕщКжстОах ака о 15О «каскоскЕхи тссвасзаас Зооствссао васоасвВех совок секКо со сТосЕх ЗБ сво тасс стстааВсКої З'кЗОосЕсто ЗзоЗетастаа сс вже ске зо сисацозаєх стоовсссеє Засааавтях бевсстсссє Збсєвосавая соЗосоЯее 15о екстаз дфізжтааатва скаїїіаовн стат ссоса зажекасвУх шскасодаВО о

ЗО СКЕККОХ КЕаАщОсЕОКЕ зззаиаЗЕ газони Тесс вес єя «ЩІ тошескттст овсвазавЕх ваза сіссаї ссхсаваедє сесесстова секта Вся МО зВсаКЕкессК СасоцуаеКх єсвескзаєх сероссядеє аїсесаЗааа зоапсссевяВ ге чиссощеи пу кчоє соте еве сопозазеваа заз сова зваасвосе зяВО свпазейек ссваннУує зусевсааоз ссзсксестс ТОсаАКТЕ песо ше сівасазтще мевчюжкассо асдосвоссо яскомкасх заащкссдах зако акї що осла дазтуєтсвх юааоукокеє муссксаає сао свасс авсстовтав я во зЗскаЗоааст ксссссЕтсВ застксавов заз осає зстсаааос подав -52о стеврінка 5 заЕсвстни КітОссссва ссопсассво стуттасває бассстіко зоаозесааа яз «сни а сосок Фсасоссоое сис ско й ЗааКЕККос БЕХ зжрсвмнищсс сасастюєоЕ саїосмчвоє астосовсає зовотсовоє пасаасВх ЕВ сессетова КсІрсуах жсосвзалесєс тоБассвВосє Еставаксюв песик сКО ТВО сттопоссвої заооссВек зи стовес сток оЗВї ссакоохВаО соус ко тсЕЕасЗав зсстсозаВ сте сто зеасоаВс авессттса стсодоаЗе 2850 мита сосок зісевеск ассооаюаво занос пес 2 ссхстастов сттоасоЗсх теЗазвсавав скететстак оз ттсаваттко НиЮ ссойастсва зсссКосех сстсссосас застав соассомн що зОБо ссовсавтссв Косаваавха ааохассооо сзтатоваєсв зтпсстссво песто воє ЗО «ктчзБВкасіка свсоавсскеса зесакенна звіросскай саван зак вУкОв 380 зсаїтцаааас коса звесксосаує сссвадеєсою тсоєасЕсїх зсаїсеска зга ажтсссссс соасЗтЯних сауоасвсас сасстскВЕ со саав ВеСЧекКОЗа 5500 сеаасасуто зссаавктах сесссоссс асОоосвВессс зосаззоаава тссасееє З3БО тстовсзаас свЕстсвкОоє оскоаднїссї скік сува хЗаасакава габоз тов 3420 звозассвки єство сасссдісєєс ден ссса Кезассзоса са ЗасВ. ЗащО

МЕ ІЖЕКО ащцЕКЕСтс секс тсска ості ткає сеасвстК сссоссоЗОО 540 стат оЗ сттсзаакоз СТОК Е ЗевооКосх стЕВесєкас ес тостс Зкю

ЧСС зсссвасатх са сКх состкактоо зе сККтс саВсеК В ЗО свіасусаси: зкстЗаЧООє ЕКЗ сочатоасЕ кеостакНЕх КетаКІсТсо Уа астжкаксев акесаОксоЗ тс зассєатхи сассоцавм ке са З стання ЕсоаєвВоси ссЗасеВОВ оааєстЗснє ЗсЯцссеКоЄ чипїсцасссе ЗВО кокс іо шкаї сскіцесааа ска зукссасаєта тестова За

ЧІжтЕсктає зстаоєВх Часктоасииаї всех стома сота 3960 сани ЗЕсаксааку сова оса ваоаВ садстесцОє поз Ох стсзатитах ВсссЕсЕстЄ Зсасоскасє собаастесюс стае зтосваксоа ЯКО есавк савани ВІКО тасетозкня сус се аКц ЗІ тохоссовоз Якессаїтса їсвассесає сававасесвз тазсттатоє баасстох БУ зазаловажа саїстосска вози астесссає вкаже єсапоссае БО заатясскаа звук жеЗся з3соЗоме зссассцев весвцсссво зостовацеє 3380 шЕСКш ТЗ Ж села стжстевасс сезЕжКе сазавачес вабснееся азКО ши їотазвца стогоона гісвовсасх сто стО сежсосто сооствекся 354 вещасває ето ов сснвцуєе: ск ресавок бваатсааах кессстсасу ях жшнтстатех ссасеаавоє пакешсоа зестстеаса сссттастО срстсавих 55 сторінка 25 скоба СЕСТКОКЕсЗ СОС АКеС ЗОССКК: совок сясе созаЗї Іа зассязозав сссоветс Зі са Вас ката стає ккатускке зва)

Часта пежсеїстео зем ят сстассевся чЗЕсяктсх ЗСУ сЕе 4740 савоссства стсваєстск се аовоа бнюааКЕ жЕвеВечни: ЗеСКТее ЯВоо шщкеносстї стоосксяске самшессюі: аавосзоувся ЗуксоаоЗє стЕестцСя 550 зе сжк всосставВсс сакаавстсс соБсТоЗКЕ СЕС Заст о 4550 запив тя сестссвкес теттастате ект оЗОаКоє стае КУ КККЄ «980 сЕссвщеа ссписазесх стсастабев збавстовеє Керч ню Фе тоде ЗО кетастсаца сфтоссвОаае тастакасєск татовсатес дес асає стстдасса цю «косо саветавви сенс чає вкасеесає секс З протест єтазв сснюккозавс стсавесс мок ссса свасацакс кексу а ЗЕ зазаствтсз чФзастсатва жссттЗКсє азсаксатаз зако гаЯа сЕстоосюкх за паттссаосо наст тсвВс паса ЄВ зЗайзавскеа стоеєассає сЗесскасма 54О тковясозсв асасвоаство япкевсснос оветестася зесосащя сасетстозва ню зссзвіовта зееасасса віссоеажаєх заказ севас ооБасажжУє ссскосваке 5 защссся вазі сесочисс касссена саїсазство сесовассе 352а поса саїте обоз аоНсх сОЄсЕКеТок стсЗссВссх ун опис ЗВО чісзісссні викєсвахЗа ска вієсвіаска Бгїсазиніва зе Знад

Фо ттетов сазсссхтоа ззбававаса сукаскакха заозаассва бетстещає ЗРОЮ «жк єсВЕно Вис ВеВ спав: скота Веахевавих ЗаакесаВеЄ зло віхаксосю зкатазсаки своє зас ах саке сс 52 чЕЗНсаЗаВО асо овссотсза ска аКЯ ВСЕ КСС века еВЕ ЗВО взято акесевиве гсссвЕаЕх оссасацає кет тасх заатоааах Уа сЕКесВОсВО КЕТІ ООКссОо ВОссОКаЕЕ тес ВЕК тоКакуасє яю всссссіак сіуеасаесх яса зУвежкекса секс савесцєаах БОБ засос козак Іста сосастсоЗа сошассасе з оссає казав 52

Вес ЕТо ссяаактасєс сазан с севассекже сувсяста стек віча ачВтестто статки КОКОС ассакатса кове ссзкасеске ща бусокавтес соц сазаєвссои тесскесвся засзтасікає кефзаконо 53 зе вч сстмечзни ах іс аваВ зтазістсав заазоцЕКЕ БО сасватсст збпесакоаз тазтовцєє стаз со сам сВ БІО сао ЖКОВІТКЖЖЕ іссВасті асезастссв вот сеКх зУскасесо БІО закзтазнав зхтессасква ссзвкасажи зам соосех зве сваояє сстососеав БО заеспосех сесівасієя пагтдясавя асозазоцаю се есаз зстсеєє ОЗ тЕКОЄТОВаа кВОсеастКе пес помнизасю вес остов сав БЕЗ сторінка 25 свЕстасаси заїссаксс божа жсяаЕ зкуЗОаоВссОо вмюзавас кекс ЗУ сазовозассс засто со їссзав ттєзаєцтет састотсвх Ззсстзасяка 5/ВО кесоїЗпасо сстїазассяо саісссастс сзоасвесаа ссссЕстКЕЕ тозОаВКОФ БО сс тсяхє зовосозаоа зоасцакеЕх завзссоана Здатавова асвссцкека яю сссстсвОєї їссвсзасвх саазїдосяза зстсастося зоастковаЗ сао БаБО щозовссї бЕсасасВоЗ КовЕссссоО гЗгасссасо свое КеВБКеО ло їжасссвасх зсвозожеао ЗБаствіове доба госава скасссссся вена ТОЩО цатссзааяї стозаасссс Ммисносясх зов сопе зеахвасвою Уха так нккя зок аніс сесаасосВ зсаатКкекх туазаЧчесес 290 ззастЕстєс ткззосязоє сс атоплоассзаа сЕТОСЯВсех тасяостВсє Ти зазчсазава зоаоссанаако саксвсежчи савокссавя БСК с т32о тсзавстосії вассвствас Яасстаяссе ЗстесЯзссо сЗОсоВсВ І ВсВ 2350 земевиа: взайвітека зовіасовке вказа сассхкОЄ секс Уа їзавменсоє ста зазОїзазоЇ зажсаастцяа всзооцссяс песен НН с«вааскхаки сс КЕ Ззіасеоака ЗассКсаКИЄ Кс КОВО е 55 ттстазаасє созасєєецве асзаєвсеєсв зсастсвасє ораосакода зссовоааая БЕН щосна себстекаки кода те заасесасє сасааацса пас КОвВах "що такссздаса заїзасєссза ЗзсабусЗау ссаЗасЗсвВо ЗЗакЗєсссз вассессває та зсссїтасва зсїссаїсса ЗзесаЗОЗоуу акссовосоа осаснующує сессктака ко акакеаитЕ Єрниасека ссткасазой КЕсстсанаа секкааиекє цеаажскасу УВО секта Ко сссосзссє васуацасес сезтекстаз спвтлавтеє зсакезовев Уго кевстсктса зсвсоокКс заасіКіВа сс ВстОх Бета пса УВО зесімниїс всвесстовВс всссесжеЗ саїотасєсва зсахокаєс сенат що стЗсаУанЬ кети оваза каса сЕКаАК ссання «сто сосочок ЗМ сзсЗзста зсосзоаеїс ажссутоаЗсє зако таа зосвссоска стос ВМ хвЕсазсжоа токсоскавоа засжетакао сао ев есе каа пес заз кз чавасаїассх двазжезато зазтассоє ссвсоскаїс завада во звсваястає засо ассстсваах засмуаже кессавассю звакассвооа во тиЗЕссттОв кассзасавс кова Еасех совстсасвО фесоцевс зов и Бе кісаенеВЕї сасолпизааа сс ссссовє семенюааа аасзааекА ВаБО змен твса ссрюасеУє зесцобаяЕ зссксазаає сеасттовес хека ЗАВ чсапсевсссс пассаїсосо озгзаітта зтоссвасс сстоєвеоаа сетосооЄ я зкдазуазтя сттосса жатожстся зе тосся тозсстоЗзка сайасосава ВО атуасцссех сасававкає дагаєстя? свіствовой ссссоезсє затія БУ сторінка 7 зсасаотота сісвссаута астсаКОстє васасВцнЕ осцичнх казав яУБо

Фсаїзанак споссксоваа стссксЗао засзасттав зкссозаове ст тсОудах БІО ксесвцкєїЗзЕ Фісовтатаї стовіовсє бтотаткаха ссааада сссаесвкоє 5 ссзаїівска сіосїоооїх звосвсссто звсесїдатосє зи іга всадяєссай во зваасвстаї сатавстовс азасссацеї хісттоост саозатсваа фовощосоає ЗО застязітсс само мовс спосо сстазстситає зсаїсясава зазакасаоа КО зсасєксовеох ката теєа ссіОствсЗ совет ооастакОє ссеєвеке З32о зосвсвяиїсс сон тах задо ев сстасоосих тоже ясосесюю ЗІ

ЗЕпуетакас сеїсссвВООє ссессотЕех сс сах зсонмаоаау суааазеке Я зсазтвазос сзаойавтте соссастУєз зсвстУосав сояссаваасє засво сох АВ сеВсстаїЗО осісзаткта стасстекжсс яктсвдеВ фсвтсквасає Тасосмна ЗО стстЗаасто сооссаїсв Зевс їсва вадавізєсє вони сва аску З езосівуїва шієсшеесіх паїв їоє коазаєвзваї «сснасави єессєтсоке З ствІсасВЕ сзасвсооас засзазасав ковсссєтіва сесоосааоо татсаоккє ЗО

ЧЕСНЕ тесжестаї: ззааоюфния фкасзЗвеза аю ївах сксоєказко Ю ззаастаєса покчексєє се оссза сестосвазох сахзааєвке заз ЗБ сжОхсватие сестасссвоє заастсасзО опо совВеє зе овес ЗО

Зевс каста ЯзтовтовсВ тсвїстВіВе Вежі сво ЗІ тсзасазтацЕ саяіцссстс ззадЕстаїВ десажсссях сссаЗоОсє сосваоостеє З840 кттжкссвес бсссКеаскаФф стоком сваха суєта озвсасакке 9 кторесцаах «сват засожозссо затактосаа свісвоЗаЕ аКЕстсвИаЄ БО

ТаСТКсстиВ фаЄаКетсеЄ осо тєв отовесктєа дсааетікас сс сЕ ко хтавссскта стві тУ геїЗабсвв гессксатаа всвиєкевєє пеки ко ваїхтнассс свататстеє зеркс вассхжеєюа каре скоса КЕ знисаоцаа свсєтвацека вереск ка єссвассоках пес вЗцї сєшнсаїкох 1200 скассататсз сазадвссеє вссосткау стаіащисах зовстсажсє се ауєся 0280 ссетттеЯезтакх сахуаеЗскео кате соскаоаЗЕс сстзаасвав тес 1332 мегвастат састсвоса зе ооої сесхсвтсєв севссстсаї дассааєтеє зо ца сКЕКК савясттався сстовесоса стааскаєва сет вакекацоВ за звезайтют зустстазаї осві аао садтхсзсовс тожерстааЗ ТЕС 30500 «ве ссоко сот сей зсассвнисє савозісавВ зе песня зако саФскацїсх осазоозоос сосакассас сосспсвах дасаєвтвах сеї 106520 аскжексієсє заасвоїсєа зевстуосас стстуссваз зозЗстоеЗ ссасІкОдє ЗО5О «достат ас каса ас зассядосах зосссазесо всеж свсї затикасуве що «ашттовмк сецстасзеєс застава ЗчУнасааа зна созссгаєсея ТОБ

Сторінка 88

КІВ КВа сВстссєИх ЗісосОксВЕ астакстсяс здстатасн ЗНО тощо сЕсвОВсЕ ссср стсчиєссав содасохх ааскасає усе: ЗВО асстсоес зостоуазсаа Зазосвоста забаастєсс ссасусаттє вето ТОЧНО чсзашуукас асист зе йсвхтакекс завеакасе єесанукеК зно тоасссзазоз стосЯстасє ЗхоЗссвоаВО оз сЗ соєва осв Ка такса сзссоатаєо сажсЕксссо восуссовес айзесєросва ссуЗдааета це свтсазатЯ стоопзаасеЕ завшсадааєт тсезфнакоає свойстовсу ЗзстОО цого дзескассиє асзстїссаа стає гсасаковес авсоскесє Застаткся зл28о пвіїсвесса Зстассадав Затассоєта сеївсастаз сесотасвЗка аовссасяа НО своссззссе свазаскето збазвстаєзо зітовенн ковсстодка Зевса ка зсаВкстасви пасссвовоє Ек Оаскя кассЕКОоке саовееКх ке: ЗКБО ззазаа: зозостоасза ссскксзвоє баса ою сіттозааає зссозаах З55ХО же сосасвісоєю зів асявВсо дсазроаети сасквасєтає зассюааєе 11580

ЕосссєдЧаса асдсссва восатекася застосо риса хасоа кЗзЕсасеку зво сссствосас созастосяа поло ссви дтавасстсв остассосех зз3зсавУсаю цю сусоаастя дес емо тод зОосава заксвассва се Іво віск Вя тозаттожжх ЗІЗ схов сао ВК ЦО

Кен стсЗс сект освооЯ тозстастов СЕК сзезавоВею мостосо сс 31550

ЖЕСТЕЕЧЕКС Ясосістуск ЗЕЖСВСТСКХ ссовастВЕЄ пазууеста ку я 11950 ссасстааиу осавассоВа сзїгссозсаа ен аєз жщкасссвІї поза МОЮ тазсасасс Фааетсссса сетвакКове зай тє сесоскусах касова ОБО асяФфзвасвтж казвсааВєс оса сао Фіфеаастає костсзсивОов 15150 сечі саВває ссозсатвиЕ сстЄсастЕє савсзВсскОй ссосваїзоа поса МАО

Кос сосни їсвесе зе сєбааааавкс стос ссов свасвіовоє їжа сасзатасв зсаксасЯ озассзков: Зазсссак соссавсвеє вро асоВою 12щю сесаваства ссзасЕкЕЗО асаяковско дссаотокоє аспссєтає ТЕС 123 півассесат свуєтассте зіїсвіято сессошекес дааттссяяЄ себе х То шк: сссаттоссє сасоусався сзтсаїтсуа остазвсосвїс закжВсвка зУа8о какає стос: вОксвВеОсв стсцасаавзО сестсвавссє оуксуєвиса 32540 «збо тосва затжнюсає зссавсоБа зоозосотоах ссахванвя сич свакуа 12505 стаїтссеєс сЗзУсасове заст сзаає сс єка ттасуєстоє сЕасТЕКЕ 15650 змркесскетє єтасосяцес савкттсаКЄ сзузЯТКВІї своааазгаоо зах зх720 век сткКах зозіааасоз свссааітса їстотОсКкоз ЗеасєЗмчнвь сазазекеай ке ссвтакссвс сЗайаситаае зктїксосаї свзиво застає сассаооах іга сторінка 25 звоозаласза стос сВк сспозясеаЮє ес скек секс ета кає о тсваувектс аБООТКестО аосвссЕесес сккаяуєєє Кекс сова сесатекате Р3В5О завіастаце зссавсасва сени сотка зіссткацо зкаткансто ЕН ссвсад: дасссвоаоаа сзсавасоає спатсссві: возах сссавкаску ІЮ5О чазвоассіс Яосастсскк зпстасатсав заїаасовсє заїстасса зсдазЕсата ЗУБ сстотясває бсзоаетеос фас Є ТОсоБаЄСЕЕ ЄКстВсДесе свозовсоВО і3200 базова сбвавияхса Ксттбовоаа ас тоОЄ ЗМО сект оксня 13260 т касзоа: татасооссс вістовессв асвтасскаЗ саЗовксак товтвассяв 13125 тсвсзессвЗ стостзсакї тсстувсвск атсзосвато зозбочВстя савссастоє з53КО

ТВОЄ ВссаТІстсХ тгопсовтятя «ові зсазаєсоюа саке о зетежеосзск «тає ха зкоцеЇкКех зтостастоїа ссдосттОех спе ї3500 песоатОоса возвсовсво сесовсаиає сватайвтве аїзасєвов аа з35БО стозакоооа ссоазатяцх чссеассаї кКтаЗзЕаце саЗкедадца ІКОН жо їзсєсаятО созстсахах сстстезстО пост созоааВкся КОСА 15550 чек тової ЗсважеВея «вуста спа КОКО ЗУ засатосасо псосттесс астассвасе сксотатоєх стеттаїсся хОстоссваа ЕН заз аємю сікасєсоасіа остов каєє сво ївсса аскісВї дова ЗО подана зЕсоіОВО псстссавка Всзесооваа застава аск То фаз Ччаєс сецтсноках савани с вієстсвазо ваоуксованує сазшокекО УЗЧчО зсваосавстЕ сооссовоса зони са аКеЕ стесвасах «ссосВессс їмо гасзвазваєх сотостаасс кгізосаїся сутатасвес сзісаеоаїа касосссека КЕН щас собссовехе ЄЕоЗоавстах Коасасвееех зав тстя вас 3150 їхасабЕсво візсакцасв таїясях ттозакссає савссосаєє состав заго хооЗпоазокої: коссасссіЕ соЗнюЗса сет аЗЕк: сазізоаатса сооааокЕта 14583 тез жкссас зірсзовсКо сестусєствО оссобсавія СЗТ ЧНсс сок 1445 зсибсляважх КОСКТОСВОВС Стос ТссОЗВ ВсссоВосисс сова ссва псЗсаКОсО 13400 їчззоваззсс совастааса ссвоїовасо освескаЗЕ весадаєте сфе стов За) састовосоо сзаасваВсї Зієзавсову Частота ссісоєтазиу свїосоЗах 133 залазссвох зссвознова аааовававкх севктссав аа ссацтсвае з1А58О заїспастех дссвостаєт зазсзсяаоЗ зкзавассс воски асссацаця їмо

Зчасвзонеста ззазодазая ссєрвав кока ссстоессяс Овод 1 шессевщкаск жесксвкксх засос есеї соесаасвах скавреасх ХТО тттватиІз; зсСлсжеаає косо коса оа заавочсна ТіК сВаОх іч чи тІВІВК каже ває хо невато сеасстаасхс сЯсаасткк ВВЕ асЕ. зАВВО ши сженвто сязакіааки: говізВскаЗ зївзасвоєс зсочаековса СН зо сторінки 30 зацесяскта стсаВекщие осбассвках ЗопЗЗксааа стовассвоз саояаєсах ЕЕ зедассвава сіїсссвувВа зБавтсоцоєс саіватаає Ффесоою зосоецє їщне

Чососвосво дасзоаавах сера сс 15 Х «0» Я «ії БУ «ФЩйх ДНЕ ких» штучна пОослідваність «ЯК» «ЖІ їзалят ЗБУТ в'юусу ВАНЯ - пасаж ЯЗ «00» 5 зховізкОї: опсасс сстасатаєз сСовсастесх зубило преса Ба чем евиак зассоссзсск сасскстаай сесстКсх зЗсксавсаЗ ЗЕВС КК: соска оє ас зссв секс сетеОсацюв ваоаееєх схБНУЮНКЄ ЗВО тссоововис звестоєтуєв своцЗаексє зссеветавс «зЕВістоо зсексесе 240

Фресвивха сесссовск зсссоОоах ето соЄ вис ато сакає ще писвестсве насос стіжтстее са єв ооасвсаасє спа З58

Ітавсетаїх тазсазоссї зазЗзасааас сосастоо ат стато ак Єке а чеїоозакя тастесоксє Звокестах зосісксває свісттєссс цик осоєа З тазсетосоо сезісясвас їЖЕсессяВє заст ова остов е зе аее З дЕзасВОстТа стсаЗсассх созжасстїє Зсазасетссв з еозо сесоЗстоасх що зетодсасеє засевзанюй сесососссо жо ззевовас бесясаенсо щоб тиссЗасся зесетісссї м оссастх акетаєтавс зЗаастевссх сеЗсстевоє 720 щем зсвоєсвїт м сосЗЕКтОо зоБазвсся сесснеотВа каса В Меч зозаатЕсях засттутосо овжтсстсЕх стузсцоассо зісзсзсац абс НІ свочатссяв сявстснх псссізовао стаїтаєсзск кЗааєтвова сохкЗаассВ ЗО заштєстсви коса Ех сстосссвсс зесскассва сяїКассавс Чит са ЗВО стазатсссс тоааєВеІ СТІ тсВ осасасетса ЕСЕ ТЯТОНХ ас ВСКе го задзвссєтса сотої єтовІ ово єаєе есте ко стмеетодає стоссдвсса 1О5о азутятозси зовн саїсжхзасеа асосстЕсеє таксваасс ааоцчниюЯ ЕВ масами аа касета) сеснюс вн еєсосоо стос сї дає 1290 ста Есс савкссасеЕх озвОсЯстоХ сттяссссса ЯЕскНюВє ще ТО сІствазтоа тЗаеНксвекс сабо кЕсесствВас звЕсссттсвє яса 32 -каєсвоваск тикжтясжскс сратЄтїє «Не тоовосЄ осаїааоатоє саЗісете ї3ЕО ссачЧсзаасв сосесЯатосх задсубоссо сізаааотна Зайзозасіся астоссвссє така ссааруєсяс сскассцУк ссевссхвтіЗ азажеассас стастсвсся ссозсадася ї5ю стека сток атУєє сттоссосся сабо зовн зоеїовеека ї55О сторінка 31 сек естєт дастссоуєає засзовссвм зпозтажсо чессестврат татовесксо ЗО сктсвесаах ссазтзсста сзастесска стассх ссозакес сс еска 15 зсвссазака ссссвіаааа стсвасад пссастоЗоа ЗцізовоЗкяЯ зозусвая 1740 сорсжсстко ССС сотовакеко собітоосвЕ Стос вВа зе зво сассоссехВ спав озостассаЗ засос асх сво осо скх 1580 асвзсттаєє сістВЕсЯЕ пеіайсссВ сао стоВ СЕТ звсссВссКе їі сесвооаяек сззаєссссс засвазасає саасстсссе зссассваво саке ї350 тЕтссВвітх зхатаанежа став скщіосася завазкесоЯи десесауава ЗІ заоссЕкКаї статостОкх ааозозатУє соуааЗовео хссдацеєеє заасвмацееся щу чек сх цосвалазЕх заавтЕскак сетсаавоВо сессмрЯ тест аВка І закис сасцоВОеМх всвоссцасх ссцпаЗссвас зстсвоова здессевах зу пЕкссовіос остов статок сяс сало їава зовотсоаа даацсвасеє дико седааоавеє тсавозозОє оЗссасааОи тспсскастх КасаЕКТОКЕ оссозЗовае 240 ствасватах поза Зес засто ссі сосоаукаасх зааасеєци охо саЕ Ко поса давтосксах зазЗаіЗе спосстсавс євоїжсоЗасс аасосваакау БО всоасвасеЕ «сссссктсз звстесастоа зазадааєВЕ зсесватзаЄ КабозаовКо 52 зассаєтоав сі єссазв ссовевссво стзїїнсвах зассстотяЯя зозовоасааа 2580 сасссвасва секр затоуссвеса ссгссссах сассзкесза заакетаке зо какао сасветссОх сет с зстзсчосає зовоїсвОоє заесвосвОх 790 сасссттооа тстОксттах оЗсосааВссх бцассвОєє тставатска кесткореся ЖРВО сн езЗаї подо всє зсасссавсє ствастови ссасоцтяоа се ста. Во

ТЕТ ЕовМа СЕС НЕ «ЕКС КСТО яна іє вожсстісВа ство гЕ8 чистив сет есх ач вцу ТО акжовасазоа азам окО Но Т сеестаЕаа СІТОК скоса ов сесЖежсКаК пЗсбовесех аа ЩО ссевасхсза шкосскасих кт сеосас ваоссжхваЄ фокссаацОє покесВеу ЗОБО скавсакска сисаванака авмуесзоз сабсасоавка зсоссесаа сети Зо «танк зоссЗ сосазсеска зссзссазаи вуса ссоа сааваі пава оо що асвтцвяцає стос кКтчє асстсвкаех сссааНецО хе аске зсБгссстЕа 3245 загс свсацякх савзаєзвсає саєстествї тествоззає зассваоста Зх зкшзсаатос сдосстовза сорастоЗтоз сосаакоцна смак о зубосаасо Зо сссстїсаав весосехЗов ссвасастто ассвавкіах сет Кос Ве НеКо За арвмниаоз хпЕсясттКс їусоатзОає саксксаває песюаааеея ста сваа ЗЯКО тозОсвсоЯво сювозоїстЯв заоОасссво сесістсводо сассооатке деоовакева З550 сїзоїссзЗса тттсатовса Фото засіїїткс секс Ост окає ЗщюЮ тевсвеКтет «їТссеовВВО заст ке сасокаа сова акех денне ЗББО «товінка 57 тт чи ботестесте КасесЗКСеЕ вескавКажх ско секта З7хО

Якожсктекс коукжстоко сеосекє зістовадех СОС Он ссех З7ВО пеостасах: тає тсяЯ ЗссссяКссВ вссоВоксОЮ КОХ пассасцаєх БЕК сгессозоната їтсатестояа єттттаоєте їтозассвоєюв ссовастєв Васко є КБ И цесопдессає зуссосесє соски кажу їсах се сяВО СОЗСТСВЯКО 3950 зієвсотїа ссхскоЗсаї ВЕСТІЄТттас Осстясасях осткОсвоВе Соус Ого кісті та тотозсяксє сзозоосНх Фісасзавтю счяюезаза ссевказова ОБО сасстєсвзиє зааоотозсї стезаеВКах гесстІжеЕс зссстаєє сени 8150 хІжехшаЕсстЄ стзсоВЕсЗ КТссзаКеє сеазаоуБОх таз кестетО таКЕХОцеВя 20 сЗозїсзосо соЗзабаєтао сабо овоа зсссаттся тсавссосВЄ сазацвесєи я каостсахос сзесстозах дазавозаваа таїстнссса засо зе я32о сша свое ссовкє зассвесєтов вага озсчнюОваВи есе ко вен ессакс зостоаавОсс Зсув ссЗавакеск сист Как 350 казаеєккся заїсяаєссв пастогааов роз сооВ гтсЗОВсяКЕ ЕтЯхОоКхВ. 5 сазетсостоЗ сустзесв асозоусаєвиєс соску узва сечу саае тує сВаЧЕ 550 твавісвавЕ жсссхсацо австсквЕєх ссвссаааОє заскодевОЗ дес тасв 520 сОККЕКЖОХ Заст ЗК кува стік ков стае вас зо тхезсоссаоє ссзаосатає зоссозоадааа сетстоастс аібокаїеска зате 7 саївссстає ссвіЗакссс зоЗастеатак остссестсо асіїк тота сстаєсоасо СЕ цеаїсастєт зксасеотеє ссзассао стаєте сообзововО ссооцах Я їтаїтссооЄ зсесасстсє гозсозсїї босссассо сабоосестє звозсвовсВ що тассовтОс секс ооєЕ сет сТЕ зсзсстрєс сатозастсс соц саТех 980

МеЖЖЕТКІХК таєВсеКтто вашей ти єескссовоєс феттасєтата соми Ооє НО

ЗЕКСВЕЖКЖК сек стрес кофе сесстаоа Віа цю кс Нює пОттеоссс етсестсацо гтоссооааї атак сК такое 180 вес такас сескодасса са сто сазстачнК сасвоасссса ззаакасех 5и2о0 зеащцнксас сусссозавя ассастЕєза стозвсозає тееаасївс засос су ЗАКО пиття ост стсоВа санок Здастсахаа Вес Нехх засвоєна 5340 ахоктикацОа стсттссстО Зестссвосе повії ттсас састазсвос ввазаватку ща кхосесВстоє сосссві ктЗааЗсооасО асзсяВекає захсаєсоОє ато асВ 5 весБсавЗка фаст ЕсазО аксааїзаи ака еассто згсссавасх ззеаассоде У оачаскк состасчас азаазетесяз зодазаєко сс бастоосвав 53 «віжкаастЗсе сосовассс потостко зподхаоовІ сесстістах бЕсВесВесх АЙ чспосоакте зо їсвссс зЗісвістсво засос сстсаЕковз акссаївесо хАВО сторінка 33 втєсазаїая всих сек ков сазсссКта еннюзвадса секассакКа БРБО зззазнесав Ясістсовс стстссває атттсосава сисавосатх сскстацОЗ 5520 зтжежнаак: озаіссвосє зісавкееєста аезтвасаїє састесоВоє засо а є ЗАКО щесестаєс стжевткесх отазіваа зсозестеє зассвстсва ска У же жтссях зе еЗасЯє зсоазінюєє мент тсссвеКаЄє чес ОВ хек таст ззатовазеї стрссвасвЯ сЕттвогсосУ аОсСеВТЯККЕ зе тосає ОБО тЕщжеатасх касах асесссжаВЕ сома сяВах піна аа сККеВ 512 сеченікксх сазссцсних зВастЕКстс Осо БектаА сосвеесови ЗОцОсОкс ВО чекає соззаїсодоу асіїттаєко дсазаєтвсс сова щцисЕ сазвосеех БІО сезсасаста СІТІ сЕ мюсоїсстсо ссатоассва татко є вссзісВЕеся 53

Есобтооаєх совКЧссєт оогоїзакЕс КОСІ КОЄх саззтаєсво косстссвсв БІБ чзсвкосссцї Зефсозке заст етсва сек сстасовЕвВ суто сВОаеу мо птвзкся) «вас х КосвесКЕ стос кай касок стос о щі сгїхаоссти свазетексв созостовес стос осссацстеа ясозастесВ БО хан стої зсссвстсе заіасзавхх зкостассЗа ссвасвевВе завосовсЯх ВЕ вик казеясє сетасоссвя оз ЗосВх стсїаакесса заїтявсяза збпвазЗавао ВЕБ їжи ссав асюнинщес кттастоваа садствссск Зсссстєває ідо оако Бад кавЕках жі нюкав свієсвкасю засстаксех гоазкаїевах оценка БУВО завозаазс хоасВіссоцро сазазваєсє зЗаосстава саобтіссвав жена тщеКЕ вяа звести сат зіставсвей сссасовас состава саке саораская БОЮ сшКстиКЖх сова ссоосчкаке осами возсвакекЕ зараза а шртЗавнма аезстаїуса сссстсоас гссаєзасат сзатодсзаа зЕстастоєа. ЕК: воасетомоа кеаодЕсквВсс зсіцасвксе сіжасакпоя їЗаїшсКсЗоа ЗІЗ я ТВО вссзсвстст севодасвов тсзвссзаєт зсзаззає паастатово зе акасава 7-3 сссссссв вевоОоаКкх зЗвіссзвааає стоваассос усчинн зах ТО децдажкаїттає зівінасацв світів вуззсазооя Осі сЕНУЕ ссоваассся та5) зеватєтвсєх козассвесс жнитекстє стовосавоає тстсостаза зсоооссзаа 735

Киеве ХК ес Фк ооаза ззтїакавсо сегсаксаеї свастесахя БАЗ чіІставссас хозясзОасх ттзавстасе зассЗскВОє Застізаскє ехо са 7440 козусочетуа сутоєтаст ззасоусяоЕ зжааяккожка зозтвесяеа дпсаожастех 75 касктмече єсстонюасс сзвзавоєсас ес оадосо Задоїоалов Захсваєтов 550 посадок: чес оКоЗ сзазссєзко КСО за тоавтав зассусакеє 7520 зосадтссстх Фе тестозавсе седвсткзає зовзсасссо дент овВее ТВО зооцсанню Фесодовиса мне сЗоїкссах боапровієео авассосвеє га сзсвзааоса заасизвак сїссеуоса заїазиесаз Зевса оЗава епос ло сторінка диееаксссо зазсксесває ссосткасай сток за вес ко ТИВ псаізайшос сусстіаісв зі саВОї: їдфватето ссітвсявов стестсавоя тах сассвацісс асеатссасо сопссутта ссбокасссє еко сеча 7аво ташізнатсс зсаттвоЗсВ совстсттся всасЗОсЕс оса ке фе що зт Віаех Фесзіпааї зосттаахжк асессснє вссссккеха сага а зання сссозоцекЗ сстзсвавава сстосазааа саКоаоКкВЕ ссвкксКВО Бій

Чітчнсста ссроааєсс касоїскацє вксаааЕє зе таЯсє ВВЕ спикВа БУ зЗзсвссвссв ств сстсЄ сафозасстя їсссоссаво азсестатоя св аесаа 85280 туассвмоі кісссяякаа заансОккса ФфНсвеассє ато важку єоє ЗО кевсосєкУєє ззаризавнкх сдосавасєте: засоссттоє всесксвава яасвОївтта БЕН

Ежскзазскх зааессаооа совЕсскО фассоваєсає КЕеЗККОКИК С коасву що зем астс зосоаїтотса стсавосоєт сабозазива зессоваех ссссооаесяс 5520 стсцпюоайа засеааккка зе скаса сеосасєє сс песо це аУКО сис є сет сс Зсадсвсссс шессаїсосе заток то оса ЩО «етотвсоза «ксізсваВЕї зіва сіїосовн; сами сх вес сВ Б/В тоасеєсоОто Фсазсосаза атак сесзавасах зчикодзсстох саскЗцаца БУК сеесвкІВсК вес Ччікса зеасвокчїв кесастовку ака соасКе ака: виго штучних стозазакоз сбсзеЗзаавж сн стсаау КесестсовВвОЗ аасвеасттаа КО шЕтсравнвс сестсрвяа їссвосстВЕ ЯїївЗататах сезваковес атака о кзссрааоа Кесакеткес севасезеся Кс Ззосассєка вес кекх ю папок та зсзявсссва азавдаєтоє ситавесдас авасссвий есбін То Зоо тала Фо Чеас засееєккс сзссосОає сОсвЕсетвО сс КоЄ ЗІ2о зЕдїсвсято задососвЗа зсбсстка Зіаїкакако кетостесся саке о пастка х сс осаКкоЇ засос оз ає ововасстсв секс о саЯстсезтає Бсжоасквоаз зкостасвВе КеКесса сов КЗ сВХ Зк всщовиаЗ ставок асазвезавоє свадваякУє сассасіто ссатетасавй ЗБ саесксажинне Яагсвічск соосссоїцО псктоВЕЕка босу псксвсКх о ссвїсааєВе Тесс тка сестозЗсво єсцссаксвї оссоостсва задааїассс па зсгзвасвЕсау ссвсстаїкЗ зза3стовсав ВЕссеесгЕ несу є сон У «ссвтвсява сосесткас стаїсвісат звазосозає зав суассскКоВ а сесецомноз сзтсваеск Зксвачексх СЕС ями коса саа МВ) казати сесЯстоако заст вЕса оЗтоОЕссс «тт тассав сстоєлазаВ МІЖ: свіззасатЗ осозаове стдтсватУє астастсзас за сакаа ас соєе вЗУКО жачЕтксоВе зазасМек Засемнвм ссовачесєзв заказ света а

Сторінка 35 всстзсссає сабо сезасввак сан оссєіс вазі стата дасте аа сесаачзних їсаповзетск стЕссссвсе щсссоссвов КстоЧакСЯЄ ОЧНІ Єх що саітостадче оБосасаісс стооскоаняї зсеатасстЕ зал ся агат сяа 1020 тсасстазаї «ст сваас кс ео овкасстстх зані Фідассееса ОКО зсвастісвс ссівковаст товсті ткз сток такок: кттовієвса тосевсвЕна 1054о зсвасхвасс власті каєв пастка сск саасестає ссхосевсїє аасетсвика МОЮ сазооззааа стсодассха ачдесвОиа састашее Кк жткаста оса є 32

Заст сос: сао оав соссасатсв вза аксоетсвВа саке 30359 воазвжеткассс садзавоєса сєстттоаек ссозсосто сек сок зТо3Ко сстуваєвай їсссВааско сУжзастви савстсоВасв воЗКатаяОє свв їаака тойссстсвї зассвастесс звавоєтікї саастеваєв собачка стозЕКоая НОВ сежсватактє азссонОо возах зни Зсвасвате са асоас МБО тоссостааа ссср судЧасссвес ссооКесов зтахсавако сука 1 іст оссасткасх сузссавїст сзазуозаОє тестує сяє кОсссваоє 19550 поасзвсаізає сток асокевежесє заЗкавкссв зеахікосве стека 307480 зозаствася ссзсвітаас соя гаЗисвоває засєсвоасве зсосовссо за8оЗ сти жасе вхатосече секс ссестасвиє засос со с Зоо чізиЕ одовоссвессв сесессЕтОВ свт пон чксвЕ векатетсВає їа92о пецрвса: вин ачоаає сссацЗсєсех ссеоовасвка сесатевсаа срок зЗа9ЗБо частастоиї саїсозовщи ас є зОстрасава заеосаоска авзуаваоєсеє цк

ЕсвеосвЕхс «етос ссзааооєвс асан позбав зезкхЗсЯе що вааватвссктї сесасатскї стасссвиаЗ стссаствсс особЕсоанО жене що снмавасх зссаавасса саше сассавате сви вас є Му зхіасєстчсва ссоразаєва сСитєдазате соцющайаєте авзствВоВс ссевооза ве м19Ко казастовссо ссстоозава Заассассосє Зевс ссаз спюзОоозає ЄсвсакЗас зо зосустссс басіатсса ЗоїтсажїесвЗ Зстассвнав защрееЗео акад щ140о щссЗтосвта Опасссосяа сядссазсся тазуітася зазастасва векуОсоаоє що хзасстпоса Згбасаєсек вес сосікачвоє звітна сао То сщапозсстх сооссосаоє ззаасеех зуоастасва ссссав сво 115856 стЕтозаайе вка Кс тЗсвсОксОс звіоВНеНУ зсазоЗасеа МБО кастевстах застане се ссо зсосссомає зесМметаса засос МЕлЮ тслассвтвсия татсовестека сессвозсає сазаєтуєа зіааєкав охавасстсе що стече заззсавеває сощазкко деотазтаса зЕЗзвазас еахозЗавай МАУ захозаїтсяв стосскоїоча візссіесвсє сенс піхвою тота ЩО саїсттсстх ассакастяає ттооОїтсає сатосвооо теза скоВ ЕСЕ її сторінив 36 садах фаст істо ас стєє ВЕТСВЄТСТЕ ссдвасВЕс ЗОМ павовієств їозпоашео «івсствасх одсвовесвов фотіссасєвв срскаієВ Іо засакссаЕЖЕ ФуокаСЕтх КоЗкасатоєс заЗЕжтКесВ сктзасає давати 12120 сжедсссВЕ сізесвОВсє зе асавяк сзозесвавк засто саке ТА1О зідаазекас ФстсвзеВвнюв стЗїсвавос бсовсатваї ТохссВеТТс саасЗестоВ РІВХЧО ссвоаавтааа песо еєт сссостксеє теаостсвсе вожтохонО стоваанаКе тез схесцуа савтарзазс став саеа зсвссвоВих засне заЗекАх Тео їсесзасн здакасоаває сесвааж ско еу асан Фев кає 138

ЗеОКЕККЕаЕ ВЖЕ СТЕХ Заст ВЕ сВОсЕВосКх ЗКЕсакаО КЕН Ке ілаКо зчазЕтсюснми іїстасостах пкт ктовВих кссВіТщВеЄс сзспеєансв Каса сов за зстаассваЕє заскзежсва сасеїваЗе стяїсжовес звуссззасва сесвасаває ТгщО штощааскс свїсосзаса сус аавсащвсиє ассасамака зач НН сситовтзас сіфсавтва ссзікскеакс сосатасвах засстсвавк стома. КУ ттВсесжтОв Стос ЕК Жосестттє стасосавес сзветсахс сову Т27БО сазан вата зеркс чав Є сс ка стос ТО преасовсоца сазааїтсва ссотатсєвс созаєснтвах всісеосих тотатосвоє їНЮ отаєтасеас кассавотза аснннюєза гтозїїссає стоозатове осо стЕї те5Ба сЕжехескеє косо са с вувБукКОєве вус КеЄ скоса е зЗОхО та стсЗЗ сесатеезЕс здасзІтОЗа вксзасЗсЗа сосок є сс Т505О чЕссктсзООа асажсвасту сс сакаЗЄ дустказацу сасзааоває щщсссаке НО зозвазассух сесааїоссия гоазассаєс досасєтссссє зосасвісва затааєоєс 13800 засскуассв зсоззваксвеа стоїки соска Є ЗО ес к з3850 зістасоссх сзозокова сода є сіізайваксв ст Здаая асо Ве 13320 іти стссв сткогутсєза ктКсасаЗає базі оссс ассовссся зе о 335О сасасассВЕК тодбазссяв тевсясісвОа ЇТтвстясате: єсстоасясє зтсзасоЗта їй акне сзассветоє Сток оссакксксх соосоаато заз зх вксанажстосоо баткестсо всессосаєт стжОєттЕК обох тасімога 15

Серет стоки оссонеуся асодсуаєвзо сісовсатає сазхатакає 1362 зсавстнчне двтатосезо стпвясаоЗа ссзаакосх зестоассві сет това 36 свецсмнни жсТЇтесвсте ізсссгеасотов сопзстсвжає сстстсаєте ості 17 кчасваакса Ес ах пезессонс стозаастЯх зссвакеасВ аа: ако 580

Ше та «сптЗсксВас вниекусвсЗ сок кокає аскавевосв сова 1855 тім таєсто хоссодссвав застотатою ссїосесЗста тесті асє сет каска ХО мтс позтазссов зЗазаваїсс асо зестєкавка Зіка а їх95О спнінка 37 зактннива весен зосОосаєс сс ассах сааакашє кКССКОВНа їно «адісвзавеас їсазсссїта звсозаооаєте судссзаоса згода с сво ваххх 10 стосазсоаї сссассоссв сикадааост сотастзасс сіаасаїся села 14360 твЕсаїоата сзсОссст ооо сасв сосок СН ТаХ КесвовеКіх 15920 затажіссто вста х совет сЯв яізсакунсв такса КЕ стає 1АІВО кавсеос соска кодопоЗсах Каса Єсехх скобсвозаса КВ КаЯЕХ 10 сакваащнея ща сеасетесвВа зба ее совО зе, 14300 сан сет ссвс зефізоваавО стос с сессКеКох ТКС Мао куйгнассяа осауасвєте гоувзазаавсє созЗастазся їсядечавсе ясастстцях зач ассвовастї саоссккс пр інвеоВ сазасЗаваст згіаааказоа паогодктав Ма хБО сстсцісавоа їв жо зааажокаой оскаовасянз завоаааавх сс скав їЯвБ8О тзЗоздззатозв ссвоассвате ваксаветУє сессвЗстастх озосасвате візавосеєє 13700 жщиоссвосо зсоссааОоца засно сеа зжмозаааа зесхово сЯсаККес 14750 сестецдст созазвсває Зессодовсє вістсвссовВ ЗвосявЗсяє сс Осх ії58580 хосваїсвах сенасоЗеї стаз тсвае обесаосм сосок тезкссвосВ ААВКО пзазааксоа ссстсацеке ззакттатує бассооетос бсасвсвота ср ха зсатожсттс басвтссасс тс атО слеаттаак: сзаївоєсво піоаащасс юю пан гусок Есї сви ств гайте саке еВ 5000 сії свои сфпассовав тХ БЗОВи «Їй» Б хеїію ЗВ «аі2ж ДНК й І «21їх ВнУучна послідовність «Кк еИх й «ем бпіговуклвотивний прзймео «ню 5 зкассасотс всссдове ІВ «М У «аж їй «за» ДНК «їй НУЧчНа У ВіДеВЄТЬ ках «еї» овігонуклейтидний прайме) «Че 7 сват ссжоє сс їВ «м В «кам ДЕК й хежів штучна песвідОовВНіств

Сея

Сторінка 3 «2335 оліговуклестидний прайнер «НН З х кекс сватсватск возс 73

Claims (7)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Вакцина для захисту тварини свині від зараження вірусом РКК5, де вакцина включає: (а) європейський вірус РКК5, що кодується полінуклеотидною молекулою 5ЕО ІО МО: 5 або полінуклеотидною молекулою, яка є щонайменше на 90 95 ідентичною до 5ЗЕО ІЮ МО: 5, при цьому зазначений вірус був адаптований для росту в свинячих клітинах або несвинячих клітинах ссавців, які експресують свинячий рецептор СО163, до введення зазначеної вакцини тварині свині; (5) зазначену кодуючу полінуклеотидну молекулу; (с) зазначену полінуклеотидну молекулу у формі плазміди; або (4) вірусний вектор, який містить зазначену полінуклеотидну молекулу; в кількості, ефективній для вироблення імунозахисту проти інфекції, та носій, який придатний для ветеринарного застосування, і причому зазначена вакцина забезпечує легку та безпечну вакцинацію вже з моменту, коли порося одноденного віку або менше, і причому зазначена вакцина забезпечує тривалість імунітету протягом аж до 6 місяців.

2. Вакцина за п. 1, причому зазначена вакцина забезпечує захист від інфекції під час введення поросяті, вік якого складає приблизно 8-12 годин.

З. Вакцина за п. 1, причому виникнення імунітету наступає, починаючи з двох тижнів після вакцинації.

4. Вакцина за п. 1, причому виникнення імунітету наступає, починаючи з 24-28 дня після вакцинації.

5. Спосіб вакцинації тварини свині проти інфікування європейським вірусом РЕК5, який включає введення зазначеної вакцини в період від приблизно 12 годин після народження до 3- тижневого віку, перед відлученням від матері зазначеної тварини, причому зазначена вакцина включає: (а) виділену полінуклеотидну молекулу, яка містить послідовність ДНК, яка кодує інфекційну молекулу РНК, яка кодує європейський вірус РКК5, кодований полінуклеотидною молекулою ЗЕО ІЮО МО: 5 або полінуклеотидною молекулою, яка є щонайменше на 90 95 ідентичною до ЗЕОІЮО МО: 5, (р) молекулу інфекційної РНК, яка кодує європейський вірус РКК5; Зо (с) зазначену полінуклеотидну молекулу (а) у формі плазміди, (а) вірусний вектор, який містить молекулу інфекційної РНК (Б), або (є) європейський вірус РКК5, кодований полінуклеотидною молекулою 5ЕО ІЮО МО: 5 або полінуклеотидною молекулою, яка є щонайменше на 90 95 ідентичною до 5ЕО ІЮ МО: 5, |і причому зазначений вакцинний вірус був адаптований для росту в свинячих клітинах або несвинячих клітинах ссавців, які експресують свинячий СО163 рецептор, перед введенням зазначеного вакцинного вірусу тварині свині.

6. Спосіб за п. 5, за яким захисний імунітет виникає не пізніше ніж приблизно через 28 днів після вакцинації.

7. Спосіб за п. 5, за яким тривалість захисного імунітету, що забезпечується, складає аж до 6 місяців.

і тОНОо Бук ТВ СК: і ЕІ ЕЕ із КЗ хо. З : тк С рев ЖЕК хх ех хх х я. ї Ж

Ь. ЗОЇ МІ Кк уз сем ккиккк в хх я Ку Я І: У і Ж Я г ОК ЗВ їй жа ик жом км еко ЖК сн я вче ще Ай КИ Ж я пен рми пасаж БУ о я о що х у. Ши Б ЕЗ3 нео ї Ж ККУ 3 МЖК кю д уки ху КО Ух ак Ж ге зе й й й жа и и и в А КВ ох ху З : АХ тк В ЕК КИ : всмрзузуути и ів ЧЕ І: горе Ур их ; АХА КУА КК АКА Х х. ЩІ КОХ бе їх в с М г рив З З ТЕ Я ТЕ

3 в. ЕЯ це м А ЕКОН І ЕК М АМКУ о А АТАК МАЖА У г ху куки сх зе АХ ом АК А А У Теза в керу у схуд кю У щі З Е ; пемзи мих ми ур уг я. х Я ко Ех Її ІК ке ї7 Н у ТЕМУ ее о Я Ви Ве ЕК ЯКІ Как М КАВА В КК КУ Х Ме хх КАХ кох «М ев, йу її ЧУ есе кешу Ст КЗ я ее КЕ и В КО В Ж ВК о и КК ПЕ Ж ВК КІ и КА ши ентечичитя уегвнг она з І Я Ви с с Аа І ВАК КА ій Ей опи ВЕ чив КЕ ЖК АТУКИ КМ ОА КАМ М хм КОМ и ХК Кох хека СА АЗЕММ КУ ке М -е Не : ее «ЖК їх Те нш и Ех КЕ и М хе МУ Хе ЕХ Я Ж м їз де ге Ж Ж дж вх х тех вих хщ ки в дру УКР іє Хм М и ОБУ ЗДУ ЗК М За Аа и КО ово В в я и и З В ва я те а а ее З АСК Я ВА НО БУК УА, БУХ х НЕ ТГЕ Б. і К х КЕ ОО Ко еВ, ух ук ЖК пути у и : ся Ж СО руд. у пише ПА се уроч в ех мим КЕ еМ Мя З МАН АК КА шевччвка г чу Я С а М М Ко же ій ; но ЗЕ СО ре ДАЧА МЕ ее еВ а ек вх мук их кж о вих шо М МТМ Ся ЕК КАВА АХ ї ККУ Я Я ХЕ б В СЕУ УДО ЕМО ух УМ ух и и у тв ВУХ я сх серчекк ля х 5 СУ хх ех тр гу ГУ и М у их м их З х Ма КУ и мим ІМК Кк кх ГИ у ВІЗИ учуи я цик тири и Ж У ще ми МЕМ Мк КО Ех КК КВК х М КЗ Х. БО у Сх КО о х й І АЗИ Те їх тр Не їх її Я с і ке ОК Ока ОЗ ОК ка и В КК ЗК НА Пе КО панна нео У ОК КК КЕТІ цу вк ау Кк ЕК ЕЕ ЕЕ их В ; іх й У З А НК Нв НК З І Зм а и ВЕ ВА Кі ВЕБ а Я Кави С НЕ КК КК ЕК НК НЯ КОМА ТЕ АС жук к КН я ке и а и МА МЕ ви МК ЗЕ туру их оду сах З ТУТ хе ; що Ше ; ті у кух ох у З КУТ і вух, ур Ку є Уа М КО ЕК Ул рик Нникв в вчи ТВ г У 5 Ме Її ик ОНКО А ХК АК ак КЗ ех и и и а а КЕ ВК ги В хх «ЕМ В КАЗКОВУ ЯМ о В КЕ зх ето их пошану ТАК МОЖЖК ХХ жи. КА МЕЖА, В тус хи и ко ух В ОКО ХЕ их им МК ВН В и и и В ЕН В КМ А 2 й ї Зх КК Как В Ем І ВМ КН ЕЕ ве В БЕ ЕЕ ЕК сно в с и ох У Я хе в ЕЕ Ме Б зе ра. Ж МЖК ях МК еВ. М КЕ і ві й ; чи У Х А ї ЕЕ їх З У СЕ й КК УА КАТ КОКАМа КБ А М МИ КККУ Ж АОС х пох Кук М м ши с й й пи : чув: хм хм у КУКИ У уУВУ сх и и У я с Ко а па и В І а Нв и и и Он З З З й С гер віха ЕН НЕ ЕФ КОШЕНЯ РК ЕК чем в ЕЕ ВЕ ; ск Му тки я ЧО о и КЕ НН ЕН ож е я к д еа ВУ Ножі й Аді НАУ пу Ев у ха сих гаку и и В Кур кує хви іІх ки Кук тож. КК КЕ и ЩО «ТКА г Ек КВН Ко я ТЕТ Е КЕ Ми ке ки и о ав З ВИ Ї Ї м Мн А Ми МЕ ККЗ КО У КЯ 4 Е Я С СС о ЕІ й о чи п ин сМиКя Я ОМА а КВ А ДАЮ МВ КК ю Ух їх р у х З З г5У жук я к г ІЗ учету их мУжж т Ж ЖЖ ХК ТУ І Ж : ення М В ХО с З ВИ МИ ГА й їх у В Н ОЗ КО ВЕ ЕН Ії З ТЕ я крите ххх Ху атм о Кк УЖ хх ЯОхах ВАТУ А Хе и КВ с КК в ак ее хх ПО Нео с нянь, М й " Я В ЛЬ я ж ЖК я х питаю вивих кх У хх. АС АВ Ео Е КНК тега зи и ЕЕ ЕХ МК АКА ЕН ВАННА КК Кк и АТ Са СЕТ ТАС г 5 в АС дня ння ее КОЖ ХК МОДА КК КАТ я

1. КУ Ко ЗКУ З зихіІт елек в В ге 3 Як І В, УА М є КЕ с В Я КВ СЯ сер узров ми ке аг м ких гро ї5 ЖК КУМ МКК ек КК КУ Я с В чо ЕК, БА й ТАС ч ся ех ї ов о моли в но в и а СМ КО ОХ Бе їй СТ Ух. ном і А З ЯК А КОДАХ 7 її Тих ху ев ек умо схо их ему хх ї х о УК ЧНУ ЕЕ КЕ о а С НК В т оку Х їх УА Се А ВА КК аа КВ С ЗА Є УК - і СЯ о: щ й ВЕН ча т Ку їЗ ЕЕ 5 уч що мекокх, У Сея о НН ЧК НАМИ на ВЕ гри кт х. ск 3 м ел нхт ре я УК и во В ВЕ БВ ВИ ИУ. КЕКВ МК Ву ди и Ку Ж Я вх Х ЗЕ ІЗ ої Т МЕ З ж В ку дяк т Ки рух дю им у отр Уж их о Ок Ех в я ОО о а ТК КК М А Мав СЯ ї ж АК в о А МАХОМ УЖ ЖЕ ЖАТКИ Хе КОВКА Ка БЕ них Що На а НК ЯН НК ЗИ ЗЕ М Мов ожкІкІууУх м х КМму ами В Ки, хх ст ЕВ Я ВОК ду шко еко св КК Кк рух Кор З КТК сх о Я КК КК Кн ро з І и в В и ВК я г ех: є є М МІК ХК за хе МЕТ А МІК ОК МЕМ Укуси ЕЕ Х ве ем ния о нн мі - ДУХУ ме КК и и МК ; х ; КЕ дк ик их УКВ се Ж ІК кекс з : х Я КЕ і у в МИ ВН и ОК ЕВ сив чив в ЕД СоАСТЕ ЦО в ее У В Ї Ї ЩЕ ДО тд й М А чив В качок тах х. ; У Кн МЕН ЕЕ МК и МАСКА пана їх хх х хх; МЕЖЕЮ МА КЕ МЕМ МУ т мг ие м и КК с а - У жому ; й в у пили ша сечу м щі УВК Как Ма МК як СК щем рохучаи не м и ве ви ад А МАННА ОК Кок КВК Ко «Ко М Б ЕЕ і ще АХ ї В х ! хе о З З НЕ А Ж В МО НЕ Ва ЗЕ У вудку кр о в ЧЕТ у попа х з хоче ов ЧР ру Ох рими Я піз Кл у ви и в и а В І а Х і МНК КО КІВ Коко я ГУК СЯ М З ЕНН й тк чн СА її їУ й Те М Я пам В А В КК КАН КА ОВ Кк о кум Кух Вк ішов че ох те нкектння ясне й й Щі й кіп ІК хів учи В х їх Мк тихе: у повезе инин 5 мороки км уз в ери : а СК На щу ЕЕ кА ТЕ поем КЕ У АТ ЕЕ У х Ж КМ АК АСК КЕ. ОА КУ: ях о їх ХК ще х САМ КЕ х Ко с ї ї КЕ Зах у і З з : ЛК т й ФК. Ї» г савнки і " х х х К ях АЖ КО МЕТ ОКХ МКМ КАМ их Сер Її пуер погризти сим гу й ц ша ве ау ек Ме Ах М жо КАДІмх У СР Ко КУ ЕМ У ВЕ ТЗ йй ен ик у й їх Ох а ду вк ж на ЗЕМ УАЗ СОБАКА Я Х АМІНИ певним ери и чо с я Й ей ж ме АЖКХХ АС 5 К Ме хе ек пд Ух НЕЗЯЕЯ ЩЕ МН 7 Е К- ОК в и о КН КУ су З Мк Ка хе КЕ Ми КМ А МУ СС МА їз КОКО УК Кия Те У й МИ і Мох ве о а о А у ККУ г пет дз кв ЧЕКУ Ве В ЕТ ха ех х В. АХ МУЛОМ Пт ї АК КК СОДИ и В В ВК я Я г У Кт ОК АКТУ щ Ще КУКА УВК Як а Ск ОХ ХХ, ХХ їй ї5 СЯ ж МЕ: А ПРЕД " ї ХК Ку а еВ З ВК Я а ВЕ Я ВЗ М ек яке допхуч и ватні йо як ОА КАТКИ КО КО АКТ Хе Зх у т и В и ЕК Ок х те уж шк В ГООВЕЕНИЕ пек их кер жа КО КЕ У Ж КА КТК Ка Ка о ВК ВК А В о Й й тку З КК Кая ї ККУ ТЕ їх Ех х КОЗИ с В Ек г ї іх з її їх та г г ді КО ту шу ях КУ ья Ка ка СМ Ов НА НК і о У і Кн км х поши г Х з в Ка В ЯК КК Я У я ОК Ж КМУ КЕ у т а к х сло бич УЖ Ух. що х рве Ну ЕІ и В В ГЕ ЕВ тах ККУ М ї МО тити кети в Ех кинути иа. ск ди ЕМО М МА АН БЕТА ЕН ОК Ну Ух щу ЗА мес ником ще що ок, ДМЕ Ка МК М КК АХ ЕК вч Де АОТАХ АКО Кози КЕ жах АСК КМ М г ЗІ ух тут ж у ж ж и М ЕК КК ЖК ж зу см. УЖ ЮК АН ЕХ ї КО Ко ВЕ чу ие МКК ки НЯ ХК кН КЕ ОА ЕВ КУ щі т ве С т ТС й С й й й м джин у 7 з и КУ ка и ни С ЗИ А Кох з ча Же ку Бе; перев евих Втр ря УЖ ВЕН их це В рик икую Й МАК ОК НИ г БЕ ІЗ ГК ПЕ Ві ми о А и М В В МЕ В Ех Кв км мк ух кит х Х МАО ОВ А КМ ЯКО Мх ИКх ОАЕ т ЖК 3 ик У «шок ж ку с Ж КЕ КИ МК Хе КЕ МИ МЖК А я х Х У пу и им ук ик и М Ди, х Я ШИ М АЮ КЕ Уж в ІК и Ку ; п и о З ИН СИНУ ОК т Ки ух ие Ди КК М чия 4 ЕМ АК а С ГУ 7 тр 5 КК к. чів ШК КО зе Нм Х ще Кая т ЗИ в ЗК А Ки В В В ОК КЕ КК МУК ик Ї МАК Мак Ки КК ЕК МАХ ; ІЕЕ ух и тр й ми я жк ВЖЕ КЕКВ шк се й Ма и ВЕК МИ МК В КН оніми и І В и а Я В х они Ви и и Ми В о З НК ДА ЕЕ м Машу ху Ма що Оу д Я: А ще х ХХ хх бе Ж ж Хе м КМ ї ЕК Ка пивом ШКТ у А КК а кн а ГТ На ГІКТТМ; умер юха ху у таки ув Ум с і ех оч иа и в и и и В І Ви В ВХ ТЕН В еЕх ен и С о НН ОНКО НЕЗЕИВЕВ Бе ИН ви а и Зх о ХЕ сх Бе - Ах с ї - НН о КЕ А ЕТ о НАЕК В ЕЯ щу ї п фифут ж етері С Ко Й і; вк ЖАТКИ РОГУ М регу м укр ки кту ур ик ря їк же КАЗКУ чт БО я Ка ВА КИ В Рая і пи ЕЕ Х МАЮ ЕК ни І МАК КАВА КАК Ве ак ї5 Ж че З Її 5 АРГОН ТЕ я и и не и ке Ж а КК о А У НУ УЖ ЕЕ ЕК и г. сх па я м Е ур Рух І М ЛУКОМ КУ сх: с й й ТОК КТ р рт жа и в сек дк З ехо ОК и М НК УХУУКЕ І м ук у ЕК сук 5 с УЖ НК ТА КК КО ОА д АТС Роз АТО ОХ а МІ КА КАК о Я Кк КА пеовнзсенемна послідовність ДЛЯ КО ОМС ФІГУРА 18 вна геномна послідовність для ЗЕО І МО: повна теномна послідовність для ЗК ОО ЧЕК теврлввсвис Кров во ко еррм орв в о р І а о А НИ в М В НК НИ ФІГУРА 1С й КЗ Я. У Я . певна генома после вів М і Я РУХ вх жом ях -х ях й око йМ, - ше Кщне УНК ГОЖж ХХ ве оо АКА МАКЕТ КЕ ех де У сх ака ех душу ху дхх ТОК ЕІ У МЕ хх ок х в ї; у у со хх я о БУ ШО се За і х наче ШК ЗХ 3 У КЕ М ча жна ння сенОоМмини паса я фе ОБ секр юр вх З ЕК КУІ УГТ УТІМ с т у о оо ти ух у ки М и КК ух і в А НЕ З ІК УНК Ки В о в АН и Ки о І ЕН КО Ух щук хи и в и ІМ КУ УМ умру у мулу Ів ока Одрі Уу в БТІ ВЕ Ем ЕЕ ТЕЧЕ ТЕТ ТИ плшмутрр ЕЕ КУ МКК КО РЕАК КАХ ЕК НК и В УК З МЕ ЗНО КЕ Я ЗИ ЗМ ДЕ ЗИ Зо ЗЕ Те Че МЕМ в хи ки у ик КК вих З роту ту и тр Ек утиту КЕ гру Я «АХ ТЕКА ТЕКА КАХ ГКУ «КК Я КУ - Я ме ан КОМЕТ т ТИМ І Кн ик КУ я и КМ МАЕ УМ КК ВУ КЕ КК лускою и утри ху ху укутух м СІК М Утримувати у ФК Ж ГІ КО дагуггнн просторо тт припи про о ко Я и а Ом а а НК У НК СК В Ка В о БОС МИ ЗК о о МИ ВК КК М НЕ ККУ реа Іони ох и и В и А ОВУ суку мих м шими жи Ку ЕТ Ки ка и и Ва Ли КЕ ШК х. ох КК Ж ОК 574 Я ЕХ скх КААКХ ху хі С АВАКОВ Ж Ки о В БУ М ВАВ КН КМУ МЗС УевО ору о и ик Ех Кр КК и РИ ЕК КК ВЕ МУ ХЕ их у МК ду ВУХ ТТ Ж Кк Ж У оз у во о зе ВАН Іза я В ВИ и в о В ВЕ В и ОК о С ВО ОВУ ж Ек З ПО М НВ С М В КК ІВ КК В В ВИ о Я пики ех Ви До жу хв Кк их вкриту Кит Х КВК УВУ сок: що її І: пе Ве В ЛК ва М У Га З з КА КК пи: и п о ни в о нн В о А ВЕ у а ВЕ В о у и В ЕЕ ТК У м о ку СХ х ск КХ, пек сук жа КК х ЕХ. ЯКУ хх з нн ни зи т ПО І ВЕС е«тесоссадетттватеетТеВссСсСестОоСсАВТТОсАТСОТСВСоВА М ЗК КУМ М МЕМ КН ЮК и КК КАСКО КК А и мак КО мк А ВЕ им Кк хи вим сим в ІІ и МУК а тиха ШЕ ах т у уж у В ее кру их А А У с х УК КК КЕ ЕХ ЕХ Ще ТЕТ КЕ ОСА КАН КН АК ССО ТС ААСАССОТАНАТО ТО ТАС деКууКи крик и Ки ху М КОКО ВЕК В ду ки Ко В 0 Вт Пе иа ОА ВИМ Пий Кв Аа Ви В У ВКМ шашка зо соня Кн БОМ ЕК та трах у КК ж Ку ех хх ум В М и и В ув у и в пи В УМ Кк ких ЖЖ ож 5 ХХ. КН реч ЧНУ Її Ем КК ЕН АЖ КАХ ЕК ХХ КУ х ЕК ке хх Іі МН Я МА ОВУ ККУ КЕН ВК йо етрусків В и т Шу вени нво в в ВІзе в ри и рев А ї хі ІК Х їх. Х, ЩО хх Кох Аа А А Ху КА ТАМ А Ох МОУ Как МКУ Мо ХУ М КК У ВК І АХ ще Хек ОХ Уже Ж ЖК ух ет куки Щ тт щих и их о ІК у кутки дк жк м ж укр і хх ї : М ОВ Кк КЕ ХХ Ех кА. її ок х х ІЗ ЗЕ скї Їж А їх Ех кож МЕ кум КА КВУ Я МІ КУ А А МА З МЕМ КАМ и КО КЕ МАВ КК ЕМ ХМ МИ МЕМ Ох ММ чи Ек Ки и а хи. їх зу им м КІ Ку их У В м шу З В БИ ВВ гос Я Тер І су АК І А и З В А КУ о м нн и в ВН НВ КК М п КК М ОВ Во а Он а и а а ІК В и Кв Пс М на и Ви В ВК КЕ ВИ М п я а В Ка ЕЕ ЕК ТЕХ пу КЕТІ М АК КАХ ТАЗА А В с Ка а СЕК ЕК З Х Кя Се Мах УМ А КК КК мк соми м уки м мим М в мими оку кри хвуєи ж су ух ом а КК мух Ме и м В и ЕЕ АК НЯ: ПОТ ГЕ АТ он ак Ве и КУ КЕ ОК А НЕ КК ВК КЕН ЖИ З Зо Ки КЕ А а ринви ІВ Інвентар зятем в Бі В ІНВ Еч ТТ В трете з В ЕЕ В НК ЕХ (5 КК ВКА КК, АК МАЯ АКА КАХ тт В корек о у шу Х вва их утво кети нирки и ТЕЗ АК їх а А АК КО Кт ГМК В Ка я ТЕТ ЕК АКТА ТАТТЯ їх їж ке тек о КЕ а т т М В С СЕ НИ НМ З ЕК НК Ко ке м Ку МКК М ЕК Я масо тУх З. жо жо ІжіІКуК М жуки ух моих УТ ие вух. й у ВХ ї й Її з а В КТК у В ТЕТ І В а В В В ВВ я вк ДВ ВЯ САН С ЕН АТ ТАКА ТОВ САТ СА СК шо де ве Баш ре Ех тих й Се перев по пере вору хевия СЕ СК Кок ше о КЕ АК НЕ У НА Ж І А Мо КУ МК ВЕ В а С КО КК ЗЕ Я ПКУ тру Му джу р мими К І КУКИ Ми Кк КУ У В Ку гуХ Ук Кк ту и ККУ І рудих МО шинв И ЗДА гер в ху рерлеве ру утри мркувеия оо ак я М ех За п о Ак о В и НК ЯН НК КА НК Ки Я Я же в туту и ик ри в и ев І ЕК ку ие ит т ТЕ ОВ ЕТ а Ко МЕ М ВЕ В ВХ В и З а Душ Ж КАТ КВК МЖК МЖК ЕК В АЕН КАВА КІ АВ КОН Б УФК М сх В КК ВК ЖК МУКАХ т жи ук ТЕ ту і ух и м мих км КК х ух

КЕ. ТЕ ут ЕК АТ ТТ ТЕТ у а ай ев ВО а В ВО В Я ОТ КЕ ду ЕЕ М и КА М и и М М В З ЗИ МИ М ЗЕ ВВЕ о о НЕ МК А ВЕ МКК ту ктів Ем с У тугу Ту хух ух Кри Кук у и ух в М КК М ЕЕ В КК ТМ М Ж п у КМ МЕЖ перами ие и в о В Ви В а З А В Іа МИ КОМИ ЕК и І а КК М З З ОЗ и З и а М в МЕ НЕ З ВК В З ЗИ СМ Х косу сущим кими ручними я М вих в ж в ит их шКА БЕ Ж ЕМ Кн и МК ше Кн В ВЕ и В АНА КІ КМ ув хих в кю К В іх вх КОТ Вих» др кох ух Рух Ех дк Урких КІ ур тру ТТ я ух: хх СУКККУ ДК В ВК ТК ухм дих іх КЕ ї У ме они ЗИ и У КУ т ТІ г ТЕ СТАЖУ ЕЕ ДУЕКЖУІ о КБ М КЕ ЕК АВ Ка еКВВ К В АВ В ОЕКК е КА ріжте ие их щ Ми В мух Оу м я и ту оку ТУ ЖЕК дя мере в ув Ов КИ пече ит в я мн и с я ки В ти и М В НИ в В З СВУ шен с се и тими ви Ми о шини ши в М шк по ком МКУ МАО І о М І ТЕКА НЕ І КЕ Кк ун и Ім ум о хв ки ик крим их хі ху гу М суху ху о ву Ек стУТУТІХМ Жх Ж МЖО М, вкю и х АВК ТЕ р. т Саву ее а о ВУ ог и и й ба ха виь ЕК ее В У с КК В КІ ЗИ ОЗ З МН ФК НК С КВН ЗНМ ее КО ту уже юТ их. З Учити их мими руки і м ек утри кутку тр ретро а а Ви Ви зи и в я і Б В и В и ВВ и и и ку и ке іже кА А КМ ОА На КСВ повна геномна послідовність для БО ІЮ МО:Б певна геномМмна посліІдОоВвнієть ДНЯ з МО загін еї-йОЗ човни гпеношниС піабаж З сКе ТО ла УКХ МАЮ БЕХ МЕМ Се МОБНУ ЯК я кеша в ЕН сетасСовТ АТР САС АТО асо ОТТО САС они и в ОН ЕК в ШЕ т я т КВ АТС ОТТО СААТАТОААЛДААТОРОСЮСВОССО ТАКА ТТН НУЄ САС ПОН ПРОСА ССТ АЛЛА СТ ТОСОЛ ОО АБС ТТ ТС АОС АВАТАКТССАЛОСТО ТО АА ЧИСТОЮ ооо ем ТАС АВС ТО ТС ТАС

ФІГУРА ТЕ пана гвиомиі поспіповніх КОЮ МО: повна геномна послідовність ДНЯ ЯКІ й УЗБУу1Зйс1о4О3 вовний геномнин о пасаж ЯЗ І5БО ТО МО: твостовсаостососвстоАоосототоВестеовОосоОоттсАТОВААКАХ ОАОСТОСТАЛАТССССОСТТОоАТОСАОоТОоСТОВАЛОАВАТОССОТАСАВА соссстостостотоаАтсАТОоВАССТОсВСААТАЛАДСВАСОВССОТТОоВ

ФІГУРА 1Е повнатеномна послідовність для ЗО ОО МОЗ ЗБУТ йс1з4АЗ повзий геномниб пасаж ЯЗ КО ТО ОО: ОСТ АСТ САТ ОС ОСТ О ПС С О А ОАТНО СС АС ССО АТ Г ТС ААСТТ А АСАСС ТОВАРА ен ен ам и Кв Не ГОЧИ НЕ КИМ МАК А МАО я ЗУ Бе м А АК МЕ МК их КАХ ТОК тео АВ ТО ОВС ОТАК ФІГУРА 16 повна геномна посвіденність дп КО СН

ЗО ЗНеЇЮчО пейннЯ сененний пасаж ЯЗ ЗК ТО МОБ срхавнттавастьатттовосоА те тео ЮТЬ ГО Сто ААСТООВАТТО ТО ТЕС АВСОВ САС ТО ССО ТАС ОС тет тОоСсТо гот о ТО АТС ТС ССС АСУ Песни а с виш ко с о он Кс о ЕН тав шив М ЕЕ ТтТСОСсВТТСсАВОСАСССАТТОСОТВТОТЕТТООСсАСАТОСОВОТТТСГОВ ОК АЙМЄВ ОХ КУА КУ Как Я БАЖАЛА ЖЬМ М ко А УК А МИ МЖК ОО Ж Хе а СУА СТО ТАТО СОС ТОН Е не у а ки о п п о о и пек оо АКА ТОНЕ ТО КТ АТ ТЕТ ОТОНКЕ їх Ех 2 тру З Ех їз те КЗЗ Ех т те т р ще кхЯ ЕЕ ту їх ях Ф т р З Ех. г ще ха ях. гу Ж к щ Ух шх гак КУ Ех тр їх ща Х Її с ж ще іх Ук КЕН и В І НК І Мк Я Я КАЖАН УК А НЕ ВХ

ФІГУРА 1Н повна геномна песлідоВвнеть Для ЗБ КО ЗаБМІ Часто повинй бсеномний пасаж Я (5 КО Ме ТОВСТА СООО АС ТО ОС КОН О С Т А УТААТЕ ФІГУРА 1!

повна гтеномна послідовність дпя ЗК ОО МО: ОО АСТО СО ПОГ ТР ЕСАТОСВО СОСНА ТП ТАС ФІГУРА 1)