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CN108650882A - 用于治疗表达igf-1r的癌症的组合物 - Google Patents

用于治疗表达igf-1r的癌症的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗表达IGF‑IR的癌症的方法，以及用于所述治疗的组合物和试剂盒。从一个方面，本发明涉及用于确定癌症的IGF‑IR状态的第一抗体和用于治疗所述癌症的用作ADC的第二抗体的组合使用。

Description

用于治疗表达IGF-1R的癌症的组合物
技术领域
本发明涉及用于治疗表达IGF-1R的癌症的方法，以及用于所述治疗的组合物和试剂盒。从一个方面，本发明涉及用于确定癌症的IGF-1R状态的第一抗体和用于治疗所述癌症的用作ADC的第二抗体的组合使用。
背景技术
被称为IGF-1R(或有时被称为IGF1R或IGF-1R)的胰岛素样生长因子1受体是具有酪氨酸激酶活性的受体，其与胰岛素受体IR具有70％同源性。IGF-1R为一种分子量约350,000的糖蛋白。其为一种异四聚体(hetero-tetrameric)受体，其中通过二硫桥连接的每一半由细胞外α-亚基和跨膜β-亚基组成。IGF-1R以非常高的亲和力(Kd#1nM)结合IGF1和IGF2，但同样能够以低100至1000倍的亲和力结合至胰岛素。相反，IR以非常高的亲和力结合胰岛素，尽管IGF仅以低100倍的亲和力结合至胰岛素受体。IGF-1R和IR的酪氨酸激酶结构域具有非常高的序列同源性，尽管同源性较弱的区段分别涉及处于α-亚基上的半胱氨酸富集区和β-亚基的C末端部分。在α-亚基中观察到的序列差异处于配体的结合区段，因此其分别是IGF-1R和IR对IGF和胰岛素的相对亲和力的起源。β-亚基的C-末端部分中的差异导致两个受体的信号通路中的分歧(divergence)；IGF-1R介导促有丝分裂、分化和抗凋亡作用，而IR的活化主要涉及代谢通路水平的作用。
通过配体与受体的细胞外结构域的结合活化胞质酪氨酸激酶蛋白。激酶的活化依次涉及不同的细胞内底物的刺激，所述底物包括IRS-1、IRS-2、Shc和Grb 10。IGF-1R的两种主要底物为IRS和Shc，其通过下游的许多效应子的活化介导大部分生长和分化作用，所述作用与IGF和该受体的连接相关。因此，底物的可用性可以决定与IGF-1R的活化相关的最终生物学作用。当IRS-1占优势时，细胞倾向于增殖和转化。当Shc占优势时，细胞倾向于分化。似乎主要涉及保护以对抗凋亡的作用的途径为磷脂酰基-肌醇3-激酶(PI 3-激酶)途径。
IGF系统在癌发生(carcinogenesis)中的作用已经成为近十年中深入研究的主题。这种兴趣跟随着事实的发现，即除了其促有丝分裂和抗凋亡性质，IGF-1R似乎是转化表型的建立和维持所必须的。事实上，已经非常确定的是，在许多种细胞中，IGF-1R的过表达或组成性活化导致细胞的生长，所述生长不依赖于缺乏胎牛血清的介质中的支持，并导致裸鼠中肿瘤的形成。这本身不是独特的性质，因为过表达基因的许多种产物可以使细胞转化，包括大量的生长因子受体。然而，已经清楚地证明IGF-1R在转化中发挥的主要作用的关键发现已经证明，IGR-1R-细胞(其中编码IGF-1R的基因已经失活)完全难以通过不同的试剂转化，所述试剂为通常能够使细胞转化的试剂，如牛乳头瘤病毒的E5蛋白、EGFR或PDGFR的过表达、SV40的T抗原、活化的ras或最后两个因子的组合。
IGF-1R在许多种肿瘤和肿瘤系中表达，并且IGF经由它们与IGF-1R的连接扩增肿瘤生长。支持IGF-1R在癌发生中的作用的其它争论来自研究，所述研究使用针对受体的鼠单克隆抗体，或使用IGF-1R的显性阴性突变体(negative dominant)。实际上，针对IGF-1R的鼠单克隆抗体在培养物中抑制多种细胞系的增殖，且在体内抑制肿瘤细胞的生长。同样地，已经显示IGF-1R的显性阴性突变体能够抑制肿瘤增殖。
已经开始大量项目开发用于治疗癌症的裸IGF-1R抗体。然而，到目前为止，这些项目都没有成功，并且市场上没有抗IGF-1R抗体。
此外，一系列临床试验已经失败，所述临床试验涉及抗IGF-1R抗体与抗EGFR抗体组合以靶向EGFR和IGF-1R，因为这些抗体均不能治疗KRAS突变患者。
因此，现在IGF-1R不被认为是主要靶点，并且在潜在治疗性抗体的研究中，IGF-1R不再被认为是特别令人关注的。
以前尝试开发可用作相关诊断或预后工具的有价值的抗体已被报道，但是这些都没有令人满意。
如从以下实施例中显而易见的，发明人惊讶地证明了，目前通常用于表达IGF-1R的肿瘤的评分的商业可获得的抗体似乎是不相关的，因为它们给出假阳性和/或假阴性。这个问题可能部分归因于由于患者选择不当而导致IGF-1R抗体的临床试验失败。
此外，使用商业抗体进行的首次研究显示IGF-1R评分与靶向ADC疗法的抗肿瘤活性之间的差异。
然而，还必须注意，产生IGF-1R抗体的努力集中于裸抗体，即通过其固有性质而有用的抗体。在此意义上，IGF-1R被认为是一个不适合于产生ADC如抗体-药物-缀合物(被称为“ADC”)的靶点，因为IGF-1R被描述为一个也被正常细胞(包括血管)广泛表达的靶点。在此意义上，可以注意到，最近的IGF-1R抗体(即AVE1642)被开发为一种未携带药物的裸抗体。其与目前在开发中的其它IGF-1R抗体和与在临床试验中失败的所有那些抗体相同。
本发明旨在通过提供一种治疗表达IGF-1R的癌症的新方法来解决这个问题，所述的方法基于使用第一IGF-1R抗体作为诊断抗体以及第二IGF-1R抗体作为治疗性抗体，优选地作为ADC。
发明内容
本发明涉及一种用于治疗癌症的方法，其包括如果受试者呈现IGF-1R(+)状态，采用IGF-1R靶向治疗来治疗有需要的受试者，其中：
使用第一IGF-1R抗体，从受试者的生物样本确定受试者的IGF-1R状态，所述第一IGF-1R抗体是：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链；
以及
其中采用下式(I)的抗体-药物缀合物或其药学上可接受的盐实现治疗：
Ab-(L-D)n
其中
Ab是第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其结合人IGF-1R并在其结合IGF-1R后内化；
L是接头；
D是药物部分；和
n是1至12。
本发明还涉及一种采用下式(I)的抗体-药物缀合物或其药学上可接受的盐治疗受试者的IGF-1R(+)癌症的方法：
Ab-(L-D)n
其中
Ab是第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其结合人IGF-1R并在其结合IGF-1R后内化；
L是接头；
D是药物部分；和
n是1至12；
以及其中，在治疗之前，通过使用第一IGF-1R抗体的方法已将受试者的癌症确定为IGF-1R(+)，所述第一IGF-1R抗体是：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链。
在另一个可选择的模式中，本发明涉及一种诊断和治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括：
a)使用第一IGF-1R抗体诊断受试者的癌症为IGF-1R(+)，所述第一IGF-1R抗体是：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链；以及
b)采用下式(I)的抗体-药物缀合物或其药学上可接受的盐治疗步骤a)中诊断的所述受试者：
Ab-(L-D)n
其中
Ab是第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其结合人IGF-1R并在其结合IGF-1R后内化；
L是接头；
D是药物部分；和
n是1至12。
本发明还涉及一种用于在具有IGF-1R(+)状态的受试者中治疗癌症或者用于治疗癌症的组合物，其特征在于，其包含下式(I)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)n
或其药学上可接受的盐，其中
Ab是第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其结合人IGF-1R并在其结合IGF-1R后内化；
L是接头；
D是药物部分；和
n是1至12；
以及其中，使用第一IGF-1R抗体，从受试者的生物样本确定所述受试者的IGF-1R(+)状态，所述第一IGF-1R抗体是：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链。
本发明还涉及一种用于治疗受试者中表达IGF-1R的癌症的抗体-药物缀合物，其包括步骤：
A)使用第一IGF-1R抗体，从受试者的生物样本确定所述受试者的IGF-1R(+)状态；和
B)如果受试者呈现IGF-1R(+)状态，则向患者施用所述抗体-药物缀合物，以及其中：
·所述第一IGF-1R抗体是：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链；和
·所述抗体-药物缀合物具有下式(I)：
Ab-(L-D)n
或其药学上可接受的盐，其中
Ab是第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其结合人IGF-1R并在其结合IGF-1R后内化；
L是接头；
D是药物部分；和
n是1至12。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，“抗体或其任何抗原结合片段”具体地意指IGF-1R抗体或其任何IGF-1R结合片段。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，第一和第二抗体不结合相同的IGF-1R表位。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，所述第一IGF-1R抗体是：
i)抗体，其包含序列SEQ ID No.7或与序列SEQ ID No.7具有至少90％同源性的任何序列的重链可变结构域；和/或序列SEQ ID No.8或与序列SEQ ID No.8具有至少90％同源性的任何序列的轻链可变结构域；或者
ii)抗体，其包含序列SEQ ID No.17或与序列SEQ ID No.17具有至少90％同源性的任何序列的重链可变结构域；和/或序列SEQ ID No.18或与序列SEQ ID No.18具有至少90％同源性的任何序列的轻链可变结构域。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，第一IGF-1R抗体是：
i)由2014年9月17日在巴黎巴斯德研究所CNCM提交的编号为I-4893的杂交瘤所分泌的抗体810D12；或者
ii)由2014年9月17日在巴黎巴斯德研究所CNCM提交的编号为I-4894的杂交瘤所分泌的抗体816C12。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，Ab是IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其选自：i)抗体，其包含序列SEQ ID No.21、22和23的三个重链CDR，和序列SEQ ID No.24、25和26的三个轻链CDR；或者ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；或者iii)与i)的抗体结合IGF-1R的相同表位的抗体。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，Ab是：
a)包含序列SEQ ID No.27、22和23的三个重链CDR和序列SEQ ID No.29、25和31的三个轻链CDR的抗体；
b)包含序列SEQ ID No.27、22和23的三个重链CDR和序列SEQ ID No.30、25和31的三个轻链CDR的抗体；
c)包含序列SEQ ID No.27、22和23的三个重链CDR和序列SEQ ID No.29、25和32的三个轻链CDR的抗体；或者
d)包含序列SEQ ID No.28、22和23的三个重链CDR和序列SEQ ID No.29、25和31的三个轻链CDR的抗体。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，Ab是：
a)抗体，其包含重链可变结构域和序列SEQ ID No.29、25和31的三个轻链CDR，所述重链可变结构域的序列选自SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59或与SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59具有至少80％同一性的任何序列；
b)抗体，其包含轻链可变结构域和序列SEQ ID No.27、22和23的三个重链CDR，所述轻链可变结构域的序列选自SEQ ID No.34、37和60或与SEQ ID No.34、37或60具有至少80％同一性的任何序列；或者
c)抗体，其包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域的序列选自SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59或与SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59具有至少80％同一性的任何序列，所述轻链可变结构域的序列选自SEQ ID No.34、37和60或与SEQ ID No.34、37或60具有至少80％同一性的任何序列。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，Ab包含：
a)重链，重链的序列选自SEQ ID No.35、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58和61，或与SEQ ID No.35、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或61具有至少80％同一性的任何序列；和
b)轻链，轻链的序列选自SEQ ID No.36、38和62，或与SEQ ID No.36、38或62具有至少80％同一性的任何序列。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，Ab是i)选自抗体208F2、212A11、214F8、219D6和213B10的抗体，ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；或者iii)与i)的抗体结合IGF-1R的相同表位的抗体。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，药物部分D选自烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、螯合剂、铁吸收刺激剂、环氧合酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、DNA抑制剂、DNA合成抑制剂、凋亡刺激剂、胸苷酸抑制剂、T细胞抑制剂、干扰素激动剂、核糖核苷三磷酸还原酶抑制剂、芳香酶抑制剂、雌激素受体拮抗剂、酪氨酸激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、紫杉烷、微管蛋白抑制剂、血管生成抑制剂、巨噬细胞刺激剂、神经激肽受体拮抗剂、大麻素受体激动剂、多巴胺受体激动剂、粒细胞刺激因子激动剂、促红细胞生成素受体激动剂、生长抑素受体激动剂、LHRH激动剂、钙增敏剂、VEGF受体拮抗剂、白细胞介素受体拮抗剂、破骨细胞抑制剂、自由基形成刺激剂、内皮素受体拮抗剂、长春花生物碱、抗激素或免疫调节剂或任何其它满足细胞毒性或毒素活性标准的药物。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，药物部分D是奥瑞司他汀(auristatin)、多拉司他汀10(dolostatin 10)或其衍生物。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，药物部分D为下式(II)：
其中：
R2为COOH、COOCH3或噻唑基；
R3为H或(C1-C6)烷基；
R9为H或(C1-C6)烷基；
m为1至8之间的整数；
波浪线表示与L连接的点。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，L为下式(III)的接头：
其中
L2为(C4-C10)环烷基-羰基、(C2-C6)烷基、(C2-C6)烷基-羰基，
W为氨基酸单元；w为0至5之间的整数；
Y为PAB-羰基，其中PAB为y为0或1；星号表示与D连接的点；和
波浪线表示与Ab连接的点。
根据本文所述的方法、组合物或试剂盒，抗体-药物缀合物是：
及其药学上可接受的盐，
其中，Ab是i)选自抗体208F2、212A11、214F8、219D6和213B10的抗体，ii)选自与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；或者iii)选自与i)的抗体结合IGF-1R的相同表位的抗体。
本发明还涉及一种用于治疗表达IGF-1R的癌症的试剂盒，其至少包含：
a)第一IGF-1R抗体，其由以下所组成：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链；
和
b)下式(I)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)n
(I)
或其药学上可接受的盐，其中
Ab是能够结合人IGF-1R的第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其选自：i)抗体，其包含序列SEQ ID No.21、22和23的三个重链CDR，和序列SEQ ID No.24、25和26的三个轻链CDR；或者ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；或者iii)与i)的抗体结合IGF-1R的相同表位的抗体；
L是接头；
D是下式(II)的药物部分：
其中：
R2为COOH、COOCH3或噻唑基；
R3为H或(C1-C6)烷基；
R9为H或(C1-C6)烷基；
m为1至8之间的整数；
波浪线表示与L连接的点；以及
n是1至12。
发明详述
本发明涉及一种用于治疗癌症的方法，其包括如果受试者呈现IGF-1R(+)状态，采用IGF-1R靶向治疗来治疗有需要的受试者，其中：
使用第一IGF-1R抗体，从受试者的生物样本确定受试者的IGF-1R状态，所述第一IGF-1R抗体是：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链；
以及
其中采用下式(I)的抗体-药物缀合物或其药学上可接受的盐实现治疗：
Ab-(L-D)n
其中
Ab是第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其结合人IGF-1R并在其结合IGF-1R后内化；
L是接头；
D是药物部分；和
n是1至12。
本发明还涉及一种用于在具有IGF-1R(+)状态的受试者中治疗癌症或者用于治疗癌症的组合物，其特征在于，其包含下式(I)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)n
或其药学上可接受的盐，其中
Ab是第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其结合人IGF-1R并在其结合IGF-1R后内化；
L是接头；
D是药物部分；和
n是1至12；
以及其中，使用第一IGF-1R抗体，从受试者的生物样本确定所述受试者的IGF-1R(+)状态，所述第一IGF-1R抗体是：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链。
本发明还涉及一种抗体-药物缀合物，用于治疗受试者中表达IGF-1R的癌症，其包括步骤：
A)使用第一IGF-1R抗体，从受试者的生物样本确定所述受试者的IGF-1R(+)状态；和
B)如果受试者呈现IGF-1R(+)状态，则向患者施用所述抗体-药物缀合物，以及其中：
·所述第一IGF-1R抗体是：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链；和
·所述抗体-药物-缀合物具有下式(I)：
Ab-(L-D)n
或其药学上可接受的盐，其中
Ab是第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其结合人IGF-1R并在其结合IGF-1R后内化；
L是接头；
D是药物部分；和
n是1至12。
本发明还涉及一种用于治疗表达IGF-1R的癌症的试剂盒，其至少包含：
a)第一IGF-1R抗体，其由以下所组成：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQID No.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链；
和
b)下式(I)的抗体-药物-缀合物：
Ab-(L-D)n
(I)
或其药学上可接受的盐，
其中
Ab是能够结合人IGF-1R的第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其选自：i)抗体，其包含序列SEQ ID No.21、22和23的三个重链CDR，和序列SEQ ID No.24、25和26的三个轻链CDR；或者ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；或者iii)与i)的抗体结合IGF-1R的相同表位的抗体；
L是接头；
D是下式(II)的药物部分：
其中：
R2为COOH、COOCH3或噻唑基；
R3为H或(C1-C6)烷基；
R9为H或(C1-C6)烷基；
m为1至8之间的整数；
波浪线表示与L连接的点；以及
n是1至12。
I-定义
术语“抗体(antibody)”、“抗体(antibodies)”、“ab”、“Ab”、“MAb”或“免疫球蛋白”在最广泛的意义上可互换地使用，其包括单克隆抗体，分离的、工程化的或重组的抗体(例如全长的或完整的单克隆抗体)，多克隆抗体，多价抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)和其抗体片段，只要它们显示所期望的生物学活性。更具体地，该分子由糖蛋白组成，所述糖蛋白包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(或结构域)(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，即CL。VH和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区(region of hypervariability)，所述高变区中散布着被称作框架区(FR)的更保守的区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本说明书中所用，表述“IGF-1R抗体”应与“抗IGF-1R抗体”相似地解释，并且意指能够结合IGF-1R的抗体。
如本文中所使用的术语“单克隆抗体”或“Mab”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即除了可能天然存在的突变(可以少量存在)之外，群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个表位。可以通过B细胞的单个克隆或杂交瘤产生这种单克隆抗体。单克隆抗体还可以为重组的，即通过蛋白工程或化学合成产生。还可以从噬菌体抗体库中分离单克隆抗体。此外，与多克隆抗体的制剂相反，所述多克隆抗体典型地包括针对各种决定簇或表位的各种抗体，每种单克隆抗体针对抗原的单个表位。本文的单克隆抗体包括鼠的，嵌合的和人源化的抗体，如以下所描述的。
术语“重组抗体”是指在活细胞中由重组DNA的表达所产生的抗体。通过使用本领域技术人员熟知的基因重组的实验室方法，产生不会在生物有机体中发现的DNA序列，以获得本发明的重组抗体。
根据本发明的ADC的抗体的“抗原结合片段”或“IGF-1R结合片段”旨在表示任何肽、多肽或蛋白，其保留结合至抗体的靶点(通常也被称作抗原)的能力。在一个实施方案中，该“抗原结合片段”选自Fv、scFv(sc表示单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或双抗体、或已通过化学修饰或通过掺入脂质体中延长半衰期的任何片段，所述化学修饰如加入聚(亚烷基)二醇(如聚乙二醇)(“PEG化”)(被称作Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab'-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”表示聚乙二醇)，所述片段具有至少一个根据本发明的抗体的特有CDR。优选地，所述“抗原结合片段”将包含或将由它们来源的抗体的重或轻可变链的部分序列构成，所述部分序列足以保留与其所起源的抗体相同的结合特异性，和充足的对于靶点的亲和力，优选至少等于其所起源的抗体的亲和力的1/100，更优选至少1/10。更优选地，所述“抗原结合片段”至少将包含或将由它们所来源的抗体的重可变链的三个CDR(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和轻可变链的三个CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)构成。
“结合(binding)”，“结合(bind)”等是指抗体或其任何抗原结合片段与抗原形成复合物，所述复合物在生理条件下相对稳定。特异性结合的特征在于至少约1x10-6M的平衡解离常数。用于确定两种分子是否结合的方法是本领域技术人员熟知的，所述方法包括例如平衡透析、表面等离子体共振、放射性标记分析等。为了避免疑问，这并不意味着所述抗体不能在低水平结合至或干扰另一种抗原。然而，作为一个实施方案，所述抗体仅结合至所述抗原。
CDR区或CDR，旨在表示由IMGT定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高变区。已经定义IMGT独特编号以比较可变结构域，而不管抗原受体、链类型或物种[Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)]。在IMGT独特编号中，保守氨基酸总具有相同的位置，例如半胱氨酸23(第1个CYS)、色氨酸41(保守-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104(第2个CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT独特编号提供了框架区的标准化划界(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)，和互补决定区的标准化划界(CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117)。由于空位代表未占用的位置，CDR-IMGT长度(在括号中显示，并由点分隔，例如[8.8.13])成为了关键信息。在被称作IMGT Colliers de Perles的2D图示中[Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.和Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)]，和IMGT/3D结构-DB的3D结构中[Kaas,Q.,Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHC structuraldata.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]使用IMGT独特编号。
必须理解，在本说明书中没有矛盾的说明情况下，互补决定区或CDR是指如根据IMGT编号系统所定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高变区。然而，还可以根据Kabat编号系统定义CDR(Kabat等人,Sequences of proteins of immunological interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991,和后续的版本)。有三个重链CDR和三个轻链CDR。在此处，根据情况，使用术语“CDR”和“CDRs”以指示一个或多个或甚至所有区，所述区含有大部分氨基酸残基，所述氨基酸残基负责抗体对其识别的抗原或表位的结合亲和力。为了简化本申请的阅读，没有定义根据Kabat的CDR。然而，对于本领域技术人员来说，使用根据IMGT的CDR的定义以定义根据Kabat的CDR是显而易见的。
术语半最大有效浓度(EC50)对应于药物、抗体或毒物的浓度，所述浓度在一些特定的暴露时间后诱导在基线和最大值中间的应答。其通常被用作药物效力的量度。因此，分级剂量应答曲线的EC50表示化合物的浓度，在所述浓度观察到所述化合物的最大作用的50％。量化剂量应答曲线的EC50表示化合物的浓度，在所述浓度在特定的暴露持续时间后群体的50％表现出应答。浓度测量典型地遵循S形曲线，在相对小的浓度变化下快速增加。这可以通过最佳拟合线的推导从数学上确定。
术语“表位”是被抗体结合的抗原的区。表位可以被定义为结构性的或功能性的。功能性表位通常为结构性表位的子集，并且具有直接有利于相互作用的亲和力的那些残基。表位还可以为构象性的，即由非直链氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可以包括决定簇(determinant)，所述决定簇为分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特性，和/或特定的电荷特性。
在本发明的意义上，两个核酸或氨基酸序列之间的“同一性”或“同一性百分比”是指在最佳比对(optimal alignment)后获得的、待比较的两个序列之间的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异沿着它们的长度随机分布。传统上通过在已经将两个核酸或氨基酸序列最佳比对后比较序列，进行所述两个核酸或氨基酸序列的比较，能够通过片段或通过使用“比对窗口”进行所述比较。除了手动比较，可以利用Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)[Ad.App.Math.2:482]，利用Needleman和Wunsch的局部同源性算法(1970)[J.Mol.Biol.48:443]，利用Pearson和Lipman的相似搜索方法(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444]，或利用使用这些算法的计算机软件(在Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI,或通过比较软件BLASTNR或BLAST P)进行用于比较的序列的最佳比对。通过以下计算同一性百分比：确定两个序列之间、优选两个完整序列之间氨基酸核苷酸或残基是相同的位置的数量，将相同位置的数目除以在比对窗口中的位置总数，并将结果乘以100计算同一性百分比，以获得两个序列之间的同一性百分比。例如，可以按缺省参数(尤其是对于参数“开放空位罚分”:5，和“延伸空位罚分”:2；所选择的矩阵例如为由程序提出的“BLOSUM 62”矩阵)使用BLAST程序“BLAST2序列”(Tatusova等人,“Blast 2sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences”,FEMS Microbiol.,1999,Lett.174:247–250)，所述程序可在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上获得；直接由程序计算待比较的两个序列之间的同一性百分比。对于与参考氨基酸序列显示至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的氨基酸序列，优选的示例包括含有参考序列，某些修饰尤其是至少一个氨基酸的缺失、添加或取代，截短或延长的那些。在一个或多个连续或非连续氨基酸取代的情况下，优选其中取代的氨基酸被“等价的”氨基酸替代的取代。在此处，表述“等价氨基酸”是指可能取代一个结构性氨基酸而不改变相应抗体的生物活性的任何氨基酸，以及下面定义的那些具体示例。等价氨基酸可以根据它们与被它们取代的氨基酸的结构同源性或可能产生的各种抗体之间的生物活性的比较试验的结果来确定。作为非限制性示例，下表1总结了可能进行的可能的取代，所述取代不导致相应的修饰抗体的生物活性的显著改变；在相同条件下逆向取代当然是可能的。在一个更优选的实施方案中，对于与含有CDR的抗体的参考氨基酸序列显示至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的氨基酸序列，优选的示例包括至少在参考序列中含有的未修饰的CDR。
表1
在本说明书中可互换使用的术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”是指精确的核苷酸序列，其为修饰的或未修饰的，其定义核酸的片段或区域，其含有或不含有非天然核苷酸，并且其为双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物。
如本文所用，比如“将受益于施用IGF-1R疗法的受试者”和“对采用IGF-1R疗法的治疗敏感的受试者”的短语包括这样的受试者，比如哺乳动物受试者，它们将受益于IGF-1R疗法的施用，例如IGF-1R的检测(例如用于诊断程序)，和/或受益于治疗，即，采用结合IGF-1R的IGF-1R结合分子减轻或预防如癌症的疾病。如本文更详细描述的，IGF-1R结合分子可以以非缀合形式使用，或者可以缀合至例如药物、前体药物或同位素。
“表达IGF-1R的癌症”是指表达、过表达或异常表达IGF-1R的任何癌症。在某些实施方案中，其包含癌前病变、异常细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤或包含表达、过表达或异常表达IGF-1R的细胞的“癌症”。
本文所用的“诊断”疾病是指鉴定或检测与IGF-1R表达相关或IGF-1R表达介导的病理性过度增殖性致癌疾病的存在的过程，监测疾病的进展，以及鉴定或检测指示与IGF-1R表达相关疾病的细胞或样本。
本文使用的“预后”是指从疾病恢复的可能性，或预测疾病的可能发展或结果。例如，当来自受试者的样本对于用IGF-1R抗体染色是阴性时，则该受试者的“预后”比IGF-1R染色阳性的样本更好。如下文将更详细地描述的，可以以合适的标尺对样本的IGF-1R表达水平进行评分。
“生物样本”可以是可以从受试者获取的任意样本。这样的样本必须允许确定本发明的生物标志物的表达水平。因此，样本的性质将因此取决于肿瘤的性质。如果癌症是液体肿瘤，则优选的生物样本包括样本如血液样本、血浆样本、或淋巴样本。如果癌症是实体肿瘤，则优选的生物样本包括样本如活检样本或取自手术切除疗法的样本。优选地，生物样本是生物流体，如人源的血清、全血细胞、组织样本或活检。例如，样本可以包括活检组织，其可以被方便地分析与IGF-1R表达相关的病理性致癌疾病的存在。
在本发明的含义内的“IGF-1R状态”涉及基于通过任何方法比如免疫组织化学(IHC)、荧光激活细胞分选FACS或本领域技术人员已知的其它方法测量的IGF-1R的表达水平的确定，将肿瘤分类为IGF-1R阳性[IGF-1R(+)]或IGF-1R阴性[IGF-1R(-)]。
II–第一IGF-1R抗体
在本发明的一个实施方案中，第一IGF-1R抗体或其任何抗原结合片段包含：
i)具有序列SEQ ID No.1的CDR-H1、序列SEQ ID No.2的CDR-H2和序列SEQ IDNo.3的CDR-H3的重链；和
ii)具有序列SEQ ID No.4的CDR-L1、序列SEQ ID No.5的CDR-L2和序列SEQ IDNo.6的CDR-L3的轻链。
第一IGF-1R抗体的特征在于其包含序列SEQ ID No.7或与序列SEQ ID No.7具有至少90％同源性的任何序列的重链可变结构域。
第一IGF-1R抗体的特征在于其包含序列SEQ ID No.8或与序列SEQ ID No.8具有至少90％同源性的任何序列的轻链可变结构域。
根据所述实施方案，称为810D12的第一IGF-1R抗体的特征在于其包含重链可变结构域序列和/或轻链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包含氨基酸序列SEQ IDNo.7或与序列SEQ ID No.7经最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同源性的序列，所述轻链可变结构域序列包含氨基酸序列SEQ ID No.8或与序列SEQ ID No.8经最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同源性的序列。
在本发明的另一个实施方案中，第一IGF-1R抗体或其任何抗原结合片段包含：
i)具有序列SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQ ID No.12的CDR-H2和序列SEQ IDNo.13的CDR-H3的重链；和
ii)具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1，序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ IDNo.16的CDR-L3的轻链。
第一IGF-1R抗体的特征在于其包含序列SEQ ID No.17或与序列SEQ ID No.17具有至少90％同源性的任何序列的重链可变结构域。
第一IGF-1R抗体的特征在于其包含序列SEQ ID No.18或与序列SEQ ID No.18具有至少90％同源性的任何序列的轻链可变结构域。
根据所述实施方案，称为810D12的第一IGF-1R抗体的特征在于其包含重链可变结构域序列和/或轻链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包含氨基酸序列SEQ IDNo.17或与序列SEQ ID No.17经最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同源性的序列，所述轻链可变结构域序列包含氨基酸序列SEQ ID No.18或与序列SEQ IDNo.18经最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同源性的序列。
本发明的一个具体方面是第一IGF-1R抗体或其任何抗原结合片段不结合胰岛素受体(IR)。
在另一个实施方案中，本发明的第一IGF-1R抗体由单克隆抗体组成。
在另一个实施方案中，本发明的第一IGF-1R抗体由重组抗体组成。
在另一个实施方案中，本发明的抗体由化学合成的抗体组成。
“IGF-1R抗体”包括(无相反说明)鼠的、嵌合的和人源化形式的所述IGF-1R抗体。
为了更清楚，下表2阐明了根据IMGT定义的抗体810D12(表2a)和816C12(表2b)的序列。
表2a
表2b
在一个实施方案中，本文中的单克隆抗体包括鼠的、嵌合的和人源化的抗体。
第一IGF-1R抗体可以源自提交在法国微生物培养物保藏中心(CNCM，法国巴黎巴斯德研究所)的鼠源杂交瘤，所述杂交瘤是通过Balb/C免疫的小鼠脾细胞/淋巴细胞和骨髓瘤Sp2/O-Ag14细胞系的细胞融合获得的。所述杂交瘤可以选自：i)于2014年9月17日保藏在法国巴黎巴斯德研究所CNCM的编号为I-4893的鼠源杂交瘤；或者ii)于2014年9月17日保藏在法国巴黎巴斯德研究所CNCM的编号为I-4894的鼠源杂交瘤。
由所述杂交瘤I-4893分泌的第一IGF-1R单克隆抗体(本文称为810D12)或其任何抗原结合片段显然可用于本发明。
由所述杂交瘤I-4894分泌的第一IGF-1R单克隆抗体(本文称为816C12)或其任何抗原结合片段显然可用于本发明。
在另一个实施方案中，所述第一IGF-1R抗体可以由以下核苷酸序列编码：
i)重链可变结构域的SEQ ID No.9和/或轻链可变结构域的SEQ ID No.10；
ii)重链可变结构域的SEQ ID No.19和/或轻链可变结构域的SEQ ID No.20。
下表3总结了关于抗体810D12(表3a)和抗体816C12(表3b)的各种核苷酸序列。
表3a
表3b
还公开了本发明的第一IGF-1R抗体作为生物标志物的用途。方法可用于检测或诊断与IGF-1R表达相关的各种过度增殖性致癌疾病，所述过度增殖性致癌疾病例如但不限于前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、成胶质细胞瘤、结肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、头颈癌或与IGF-1R表达相关的任意其它癌症。如本领域普通技术人员将认识到的，与具体疾病相关的抗体表达水平将依据预先存在的病症的性质和/或严重性而变化。
可以通过本领域技术人员已知或目前使用的任何方法或技术(通常基于确定IGF-1R的表达水平)来完成IGF-1R状态确定。然而，下面描述了一些非限制性的示例。
分期确定具有潜在的预后价值，为设计最佳疗法提供了标准。Simpson等人，J.Clin.Oncology 18：2059(2000)。例如，实体肿瘤的治疗选择基于肿瘤分期，其通常使用美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)的肿瘤/结节/转移(Tumor/Node/Metastasis，TNM)测试进行。通常认为，虽然这种测试和分期系统提供了关于在患者中已诊断出的实体癌症的分期的一些有价值的信息，但是它是不精确和不足的。尤其是它不能鉴定肿瘤进展的最早分期。
在一个实施方案中，一种用于在体外或离体确定受试者中肿瘤细胞的IGF-1R评分的方法，其可以包括步骤：
(a)将来自所述受试者的生物样本与如上所述的第一IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；
(b)通过荧光激活细胞分选(FACS)或免疫组织化学(IHC)将所述第一IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述生物样本中的IGF-1R的结合水平进行定量；和
(c)通过基于染色强度和阳性细胞百分比的两个参数，将步骤(b)中获得的定量水平与合适的标尺进行比较，来对肿瘤细胞评分。
在一个实施方案中，当组织样本是福尔马林固定的、甲醛代替物固定的、Glyco-fixx固定的、石蜡包埋和/或冷冻的，第一IGF-1R抗体能够结合IGF-1R。
可以使用任意常规的风险分析方法来评价IGF-1R的预后价值。代表性的分析方法包括Cox回归分析，这是一种在存在删失案例的情况下，对存活或时间事件数据进行建模的半参数方法(Hosmer和Lemeshow，1999；Cox，1972)。与其它生存分析例如生命表(LifeTables)或Kaplan-Meyer不同，Cox允许在模型中包含预测变量(协变量)。使用常规分析方法例如Cox，可能能够测试关于原发性肿瘤中IGF-1R表达状态与疾病复发的发病时间(无病生存时间或疾病转移时间)或患病至死亡时间(总体生存时间)的相关性的假设。Cox回归分析也称为Cox比例风险分析。该方法是测试肿瘤标志物对患者生存时间的预后价值的标准。当用于多变量模式时，同时测试几个协变量的作用，以便可以鉴定具有独立预后价值的个体协变量，即最有用的标志物。术语阴性的或阳性的“IGF-1R状态”也可以称为[IGF-1R(-)]或[IGF-1R(+)]。
在诊断或监测癌症期间，样本可能被“评分”。以最简单的形式，通过免疫组织化学的样本的可视化检查判断，评分可以被分类为阴性的或阳性的。更多的定量评分涉及判断两个参数：被取样的染色(“阳性”)细胞的染色强度和比例。
在一个实施方案中，为了确保标准化，样本可以以不同的标尺对IGF-1R表达水平进行评分，其中大部分基于对反应产物的强度和阳性细胞的百分比的评价(Payne等人，Predictive markers in breast cancer–the present,Histopathology 2008,52,82-90)。
在另一个实施方案中，所述评分包括使用基于染色强度和阳性细胞百分比的合适的标尺。
作为第一个实施例，通过与IHC评价雌激素受体和孕激素受体的Quick Allred评分相似的，结合反应强度和细胞染色的比例的评分，可以以从0至8的全局标尺对样本进行IGF-1R表达水平评分(Harvey JM,Clarck GM,Osborne CK,Allred DC；J.Clin.Oncol.1999；17；1474-1481)。更具体地，第一标准的反应强度以标尺0至3评分，0对应于“无反应”，3对应于“强反应”。第二标准的反应比例以标尺0至5评分，0对应于“无反应”，5对应于“67-100％反应比例”。然后将反应强度评分和反应比例评分相加，产生0至8的总评分。总评分为0至2被认为是阴性的，总评分为3至8被认为是阳性的。
根据该标尺，本说明书中使用的术语肿瘤的阴性的或阳性的“IGF-1R状态”分别是指以Allred标尺，对应于评分0至2或3至8的IGF-1R的表达水平。
下表4说明了根据Allred方法解释IHC结果的指南。
表4
根据本发明，所述合适的标尺可以是0至8的标尺，其中无反应被评分为0，并且67-100％比例的反应比例的强反应被评分为8。
换言之，描述了一种在体外或离体确定来自受试者的肿瘤的状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)根据Allred标尺，对来自受试者的肿瘤进行评分；和(b)Allred评分为3至8，则确定肿瘤的状态为[IGF-1R(+)]；或者Allred评分为0至2，则确定肿瘤的状态为[IGF-1R(-)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为3，肿瘤是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为4，肿瘤是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为5，肿瘤是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为6，肿瘤是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为7，肿瘤是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为8，肿瘤是[IGF-1R(+)]。
在本发明的另一个具体的方面，Allred评分为3至8，肿瘤是[IGF-1R(+)]。
本文描述的用于在体外或离体确定受试者中肿瘤细胞的IGF-1R状态的另一个具体的方法的特征在于，其包括步骤：
(a)如上所述对IGF-1R肿瘤细胞进行评分；和
(b)评分为3至8，确定肿瘤细胞的IGF-1R状态为[IGF-1R(+)]；或者
(c)评分为0至2，确定肿瘤细胞的IGF-1R状态为[IGF-1R(-)]。
作为第二个实施例，例如，与HER-2受体的IHC评价的常规评分相似的，可以以或多或少更简单的评分方法对样本进行IGF-1R表达水平评分，所述方法将染色强度(优选膜染色)和显示染色的细胞比例整合为0至3+的组合标尺。
在这个称为简化标尺的标尺中，0和1+是阴性的，而2+和3+表示阳性染色。然而，评分1+至3+可以被记录为阳性的，因为与评分0(阴性的)相比，每个阳性评分可能与复发和致命疾病的更高风险显著相关，但阳性评分中的增加的强度可能提供额外的风险降低。
一般来说，在本说明书中使用的术语肿瘤的阴性的或阳性的“IGF-1R状态”分别是指以简化的标尺，对应于评分0至1+或2+至3+的IGF-1R的表达水平。应该仅考虑侵袭性肿瘤的完整的周围膜的反应，并且通常相似于“铁丝网(chicken wire)”外观。根据目前的指南，需要进一步评价IGF-1R评分为边界线(2+或3+的评分)的样本。作为非限制性实例，当对照和所预期的不同、伪影(artifacts)涉及到大多数样本和样本具有强的正常乳导管(内对照)膜阳性(这表明过量的抗原恢复(retrieval))时，应避免IHC分析，也不要通过FISH、或者任何其它方法进行重复或测试。
为了更清楚，下表5总结了这些参数。
表5
合适的标尺可以是0至3+的标尺，其中肿瘤细胞无膜反应被评分为0，10％以上的肿瘤细胞中强的完全反应被评分为3+。
更详细地说，如上所述，所述合适的标尺是0至3的标尺，其中肿瘤细胞无膜反应被评分为0；10％以上的肿瘤细胞中微弱的可察觉的膜反应被评分为1+；在10％以上的肿瘤细胞中的弱至中度的完全膜反应被评分为2+；在10％以上的肿瘤细胞中具有强的完全反应被评分为3+。
换言之，描述了一种在体外或离体确定受试者的肿瘤的状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)根据如上所述的简化标尺，对来自受试者的肿瘤进行评分；和(b)评分为2+或3+，确定肿瘤的状态是[IGF-1R(+)]；或(c)评分为0或1+，确定肿瘤的状态是[IGF-1R(-)]。
在本发明的一个具体的方面，评分为2+，肿瘤是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，评分为3+，肿瘤是[IGF-1R(+)]。
在本发明的另一个具体的方面，评分为2+或3+，肿瘤是[IGF-1R(+)]。
在另一个实施方案中，用于在体外或离体确定受试者中的肿瘤细胞的IGF-1R状态的方法，其可以包括以下步骤：
(a)根据前述的方法，对来自所述受试者的IGF-1R肿瘤细胞进行评分；和
(b)评分为2+或3+，确定肿瘤细胞的IGF-1R状态是[IGF-1R(+)]；或者
(c)评分为0或1+，确定肿瘤细胞的IGF-1R状态为[IGF-1R(-)]。
一般地，测试或分析的结果可以以各种格式的任意一种呈现。结果可以以定性呈现。例如，测试报告可以仅指示是否检测到具体的多肽，也可能指示检测限。结果可以以半定量显示。例如，可以定义各种范围，并且可以对范围指定评分(例如，依据所使用的标尺，0至3+或0至8)，以提供一定程度的定量信息。这样的评分可以反映各种因素，例如，其中检测IGF-1R的细胞数量、信号的强度(其可以指示IGF-1R或携带IGF-1R的细胞的表达水平)等。结果可以以定量的方式显示，例如检测到IGF-1R的细胞的百分比、蛋白浓度等。
如本领域普通技术人员将理解的，由测试提供的输出类型将依据测试的技术限制和与检测多肽相关的生物学意义而变化。例如，在某些多肽的情况下，仅定性输出提供了重要的信息(例如，是否在某一检测水平检测到多肽)。在其它情况下，需要更多的定量输出(例如，待测样本中多肽的表达水平与正常水平的比例)。
本发明的另一个方面，进行IGF-1R状态的确定，用于监测IGF-1R表达对施用靶向IGF-1R通路的疗法的响应。当所述疗法触发IGF-1R的下调和/或降解时，这种监测可以是非常有用的。
本发明的另一个目的是描述一种用于确定致癌疾病是否对采用IGF-1R靶向疗法的治疗敏感的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)根据上述的方法，在体外或离体确定受试者的肿瘤细胞的IGF-1R状态，以及
(b)如果肿瘤细胞的IGF-1R状态是IGF-1R(+)时，则确定致癌疾病对靶向IGF-1R通路的抗体药物治疗是敏感的。
尤其是，监测细胞表面上的IGF-1R表达可能是评价临床试验和“个体化”疗法期间的治疗功效的关键工具。
IGF-1R水平的增加或降低指示与IGF-1R相关的癌症的进展。因此，通过测量存在于各种组织或细胞中的表达IGF-1R的细胞数量的增加或IGF-1R浓度的变化，可以确定旨在改善与IGF-1R相关的恶性肿瘤的具体治疗方案是否有效。
本发明的另一个目的是一种用于在体外或离体确定治疗方案的功效的方法，所述治疗方案设计用于减轻患有与IGF-1R相关的致癌疾病的受试者中的所述疾病，所述方法包括以下步骤：
(a)如上所述，在第一生物样本中，确定IGF-1R的第一表达水平，所述第一生物样本对应于所述治疗的第一时间点；
(b)如上所述，在第二生物样本中，确定IGF-1R的第二表达水平，所述第二生物样本对应于所述治疗的第二、稍后的时间点；
(c)计算步骤(a)中获得的所述第一表达水平与步骤(b)中获得的所述第二表达水平的比例；和
(d)当步骤(c)的比例大于1时，确定所述治疗方案的功效是高的；或者当步骤(c)的比例小于或等于1时，确定所述治疗方案的功效低的。
在一个优选的实施方案中，所述的设计用于减轻患有与IGF-1R相关的致癌疾病的受试者中所述疾病的治疗方案，包括向所述受试者施用靶向IGF-1R通路的疗法。
本发明的另一个目的是提供一种体内成像与IGF-1R表达相关的致癌疾病的方法。这种方法对于体内肿瘤细胞的定位以及监测其侵袭性是有用的。同样，该方法用于监测先前诊断为IGF-1R介导的癌症的患者的进展和/或对治疗的响应。
一个实施方案是一种用于检测受试者中表达IGF-1R的肿瘤细胞的位置的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将第一IGF-1R抗体或其抗原结合片段施用至受试者；和
b)检测所述第一IGF-1R抗体的结合，
其中所述结合指示肿瘤细胞的存在。
对于表达肿瘤的存在的检测，可以使用本领域技术人员已知的许多技术。然而，优选的方式是IHC和FACS。
III–抗体药物缀合物(ADC)
III.1–第二IGF-1R抗体(Ab)
在一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab由重组抗体组成。
在另一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab由化学合成的抗体组成。
在本申请的一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab的表位优选地定位于人IGF-1R的胞外结构域(也称为IGF-1R ECD)。
在一个具体的实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab或其任何抗原结合片段能够以10×10-10至1×10-10，以及更优选8×10-10至2×10-10的EC50与IGF-1R结合。
作为一个优选的实施方案，在本发明中确定的EC50表征抗体结合至暴露于人肿瘤细胞上的IGF-1R ECD的效力。使用FACS分析确定EC50参数。EC50参数反映了抗体浓度，在该浓度获得对人肿瘤细胞上表达的人IGF-1R的最大结合的50％。使用四参数回归曲线拟合程序(Prism Software)，以剂量应答曲线的中点计算每个EC50值。已选择该参数作为生理/病理情况的代表。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法或技术确定IGF-1R结合的竞争，所述方法或技术如但不限于射线、表面胞质共振(Biacore)、ELISA、流式细胞术等。“竞争结合至IGF-1R”是指至少20％，优选至少50％，更优选至少70％的竞争。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法或技术确定结合至相同表位的确定，所述方法或技术如但不限于射线、表面胞质共振(Biacore)、ELISA、流式细胞术等。“结合至IGF-1R的相同表位”是指至少20％，优选至少50％，更优选至少70％的竞争。
如上面所提及，与一般知识相反，本发明集中于特定的IGF-1R抗体，所述抗体在IGF-1R结合后呈现高的内化能力。如本文中所使用，“被内化的”或“内化的”(两种表述是相似的)抗体为在与哺乳动物细胞上的IGF-1R结合后被细胞摄取(意为其“进入”)的抗体。该抗体作为ADC的一部分是令人关注的，因此其将连接的细胞毒素定位或指向靶向的癌细胞。一旦被内化，细胞毒素触发癌细胞死亡。
令人惊讶地，根据本发明的第二IGF-1R抗体Ab对于CDR-H2、CDR-H3和CDR-L2都显示相同的序列，其它3个CDR是不同的。这种观察似乎是一致的(coherent)，因为作为关于抗体的结合特异性的公知常识的一部分，CDR-H3被描述为对于表位的识别是最重要的且最相关的。
ADC疗法成功的关键被认为是靶抗原特异性和抗原-抗体复合物向癌细胞中的内化。显然，非内化抗原递送细胞毒试剂不如内化抗原有效。在抗原间内化过程是可变的，并且取决于多种参数，所述参数可以受到抗体影响。
在ADC中，细胞毒素赋予细胞毒活性，所使用的抗体负责针对癌细胞的特异性，以及载体(vector)负责进入细胞内以恰当地发挥细胞毒性。因此，为了改善ADC，抗体可以表现出高的内化至靶向的癌细胞中的能力。抗体介导的内化的效率根据靶向的表位而显著不同。有效内化IGF-1R抗体的选择需要各种实验数据，所述数据不仅研究IGF-1R下调，而且还随访IGF-1R抗体向细胞中的内化。
在一个实施方案中，可以通过免疫荧光或FACS(流式细胞术)(如本申请下文中所示例)或本领域技术人员已知的具体用于内化机制的任何方法或过程，评价第二IGF-1R Ab的内化。在一个优选的实施方案中，在结合至IGF-1R后，根据本发明的ADC的抗体可以诱导至少30％，优选50％，更优选80％的内化。
在第二IGF-1R Ab抗体与所述IGF-1R的ECD结合后，IGF-1R/第二IGF-1R抗体Ab复合物被内化，并诱导细胞表面的IGF-1R的量的减少。可以通过本领域技术人员已知的任何方法，如非限制性示例的蛋白印迹(western-blot)、FACS和免疫荧光，将这种减少量化。
在一个实施方案中，优选可以通过FACS测量这种减少(由此反映内化)，并将其表示为在4℃测量的平均荧光强度(MFI)和与第二IGF-1R抗体Ab在37℃孵育4小时后测量的MFI之间的差或Δ。
作为非限制性示例，使用与i)第二IGF-1R抗体Ab和ii)用Alexa488标记的二抗孵育4小时后的乳腺癌细胞MCF7，基于用未处理的细胞和用第二IGF-1R抗体Ab处理的细胞获得的MFI测定该Δ。此参数被定义为使用下式计算：Δ(MFI4℃–MFI37℃)。
这种MFI之间差反映IGF-1R下调，因为MFI与在细胞表面上表达的IGF-1R成比例。
在一个有利的方面，抗体由在MCF-7中触发至少280，优选至少400的Δ(MFI4℃–MFI37℃)的抗体组成。
更详细地，可以根据以下方法测量上面提及的Δ，所述方法必须被认为是说明性且非限制性的示例：
a)在冷的(4℃)或温的(37℃)完全培养介质中，使用第二IGF-1R抗体Ab处理并孵育感兴趣的肿瘤细胞；
b)使用二抗平行地处理步骤a)的经处理的细胞和未处理的细胞；
c)用标记的二抗测量经处理的和未处理的细胞的MFI(代表存在于表面的IGF-1R的量)，所述标记的二抗能够结合本发明的抗体；和
d)从用未处理的细胞获得的MFI中减去用经处理的细胞获得的MFI以计算Δ。
由该ΔMFI，内化百分比可以被确定为：
100x(MFI4℃-MFI37℃)/MFI4℃。
在MCF7中，ADC的第二IGF-1R抗体Ab优选显示50％至99％，70％至90％，优选75％至87％的内化百分比。
第二IGF-1R抗体Ab的具体优点依赖于其内化速率。
通常已知对于ADC，期望所使用的抗体显示快的内化速率，优选在施用抗体24小时内，更优选在12小时内，甚至更优选在6小时内。
在本发明中，内化速率(也被称作细胞表面结合抗体减少或细胞表面抗体衰减)被表示为t1/2(半衰期)，并且对应于获得ΔMFI的50％的减少所需的时间(根据以下示例将清楚地理解该方面)。
具体的优点在于第二IGF-1R抗体Ab具有5至25分钟，优选10至20分钟的t1/2。
第二IGF-1R抗体Ab或其任何抗原结合片段可以包含具有序列SEQ ID No.22的CDR-H2和序列SEQ ID No.23的CDR-H3的三个重链CDR，以及具有序列SEQ ID No.25的CDR-L2三个轻链CDR。
第二IGF-1R抗体Ab或其任何抗原结合片段可以包含序列SEQ ID No.21、22和23的三个重链CDR和序列SEQ ID No.24、25和26的三个轻链CDR。
在一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab或其任何抗原结合片段可以包含三个重链CDR和三个轻链CDR，所述三个重链CDR包含或由序列SEQ ID No.21、22和23或与SEQ IDNo.21、22或23显示至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性的任何序列所组成；所述三个轻链CDR包含或由序列SEQ ID No.24、25和26或与SEQ ID No.24、25或26显示至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的任何序列所组成。
在另一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab或其任何抗原结合片段包含含有序列SEQ ID No.21、22和23的三个重链CDR；和包含序列SEQ ID No.24、25和26的三个轻链CDR。
根据一个具体的方面，第二IGF-1R抗体Ab不结合胰岛素受体(IR)。这方面是令人关注的，因为本文描述的抗体不会对意味着胰岛素代谢的IR产生任何负面影响。
在另一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab的另一个有利方面是不仅能够结合人IGF-1R，而且能够结合猴IGF-1R，更具体地，结合食蟹猴IGF-1R。这一方面也令人关注，因为它将促进临床试验所需的毒性评价。
在另一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab由单克隆抗体组成。
第二IGF-1R抗体Ab优选源自鼠源的杂交瘤，所述杂交瘤提交在法国微生物培养物保藏中心(CNCM，巴斯德研究所，Docteur Roux路25号，75724巴黎Cedex15，法国)，通过融合Balb/C免疫的小鼠脾细胞/淋巴细胞与骨髓瘤Sp 2/O-Ag14细胞系的细胞获得所述杂交瘤。
所述鼠杂交瘤可选自分别于2013年5月30日、2013年6月26日、2013年6月26日、2013年4月24日和2013年6月26日保藏于法国巴斯德研究所CNCM的杂交瘤I-4757、I-4773、I-4775、I-4736和I-4774。
在一个具体的方面，第二IGF-1R抗体Ab为选自以下的抗体：i)由杂交瘤I-4757、I-4773、I-4775、I-4736或I-4774生产的抗体，所述杂交瘤分别在2013年5月30日、2013年6月26日、2013年6月26日、2013年4月24日和2013年6月26日保藏于法国巴斯德研究所CNCM；或ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；或iii)与i)的抗体结合IGF-1R的相同表位的抗体。
在一个实施方案中，本发明的第二IGF-1R抗体Ab由鼠抗体组成，然后被称作m[抗体的名称]。
在一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab由嵌合抗体组成，然后被称作c[抗体的名称]。
在一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab由人源化抗体组成，然后被称作hz[抗体的名称]。
为了避免疑问，在下面的说明书中，表述“IGF-1R抗体”和“[抗体的名称]”是相似的，并且包括(无相反说明)所述IGF-1R抗体或所述“[抗体的名称]”的鼠的、嵌合的和人源化的形式。当必要时，使用前缀m-(鼠的)、c-(嵌合的)或hz-(人源化的)。
为了更清楚，下表6a阐明了用于优选的第二IGF-1R抗体Ab的根据IMGT定义的CDR序列。呈现相同特征的任何其它抗体可以包含在本发明的范围内。
表6a
对于本领域技术人员显而易见的是，如上面所描述的6个CDR的任何组合应当被认为是本发明的一部分。
从该表6a可以观察到，本文所描述的所有第二IGF-1R抗体Ab对于CDR-H2、CDR-H3和CDR-L2具有相同的序列，如上面所描述该性质是特别令人关注的。
在一个给定的方面，第二IGF-1R抗体Ab是鼠(m)抗体。
在另一个方面，第二IGF-1R抗体Ab是嵌合(c)抗体。
嵌合抗体为含有源自指定物种的抗体的天然可变区(轻链和重链)与所述指定物种异源的物种的抗体的轻链和重链的恒定区组合的抗体。
可以通过使用重组遗传学的技术制备嵌合抗体。例如，可以通过克隆重组DNA生产嵌合抗体，所述重组DNA含有启动子，和编码非人单克隆抗体(尤其是鼠)的可变区的序列，和编码异源物种抗体恒定区(优选人)的序列。由一种这样的重组基因编码的根据本发明的ADC的嵌合抗体可以为，例如小鼠-人嵌合体，该抗体的特异性由源自鼠DNA的可变区决定，其同种型由源自人DNA的恒定区决定。
为了更清楚，下表6b阐明了嵌合第二IGF-1R抗体的不同变体的VH和VL序列(可变结构域和全长)的非限制性示例。
表6b
在另一个方面，第二IGF-1R抗体Ab是人源化抗体。
“人源化抗体”是指含有源自非人源抗体的CDR区的抗体，抗体分子的其它部分源自一种(或几种)人抗体。此外，可以修饰一些骨架片段残基(称为FR)以保留结合亲和力。
可以通过本领域技术人员已知的技术制备人源化抗体或其片段。这样的人源化抗体优选在涉及体外诊断或体内预防性和/或治疗性处理的方法中使用。本领域技术人员还已知其它的人源化技术，例如由PDL在专利EP 0 451 216、EP 0 682040、EP 0 939 127、EP0 566 647或US 5,530,101、US 6,180,370、US 5,585,089和US 5,693,761中描述的“CDR接枝”技术。还可以引用美国专利5,639,641或6,054,297、5,886,152和5,877,293。
作为本发明的一个具体的而非限制性的实施方案，本文描述了由hz208F2组成的第二IGF-1R抗体Ab。这种人源化还可以被应用于本发明的其它抗体部分。
在一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab包含重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域具有：
i)分别为序列SEQ ID No.27、22和23的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和
ii)源自人种系IGHV1-46*01(SEQ ID No.86)的FR1、FR2和FR3，和
iii)源自人种系IGHJ4*01(SEQ ID No.88)的FR4。
在一个优选的实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域具有：
i)分别为序列SEQ ID No.29、25和31的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和
ii)源自人种系IGKV1-39*01(SEQ ID No.87)的FR1、FR2和FR3，和
iii)源自人种系IGKJ4*01(SEQ ID No.89)的FR4。
在本发明的一个优选的但非限制性的实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab包含：
a)重链，其具有分别为序列SEQ ID No.27、22和23的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和源自人种系IGHV1-46*01(SEQ ID No.86)的FR1、FR2和FR3，和源自人种系IGHJ4*01(SEQ IDNo.88)的FR4；和
b)轻链，其具有分别为序列SEQ ID No.29、25和31的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和源自人种系IGKV1-39*01(SEQ ID No.87)的FR1、FR2和FR3，和源自人种系IGKJ4*01(SEQ IDNo.89)的FR4。
在另一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab选自：
a)抗体，其包含重链可变结构域和序列SEQ ID No.29、25和31的三个轻链CDR，所述重链可变结构域的序列选自SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59或与SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的任何序列；
b)抗体，其包含轻链可变结构域和序列SEQ ID No.27、22和23的三个重链CDR，所述轻链可变结构域的序列选自SEQ ID No.34、37和60或与SEQ ID No.34、37或60具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的任何序列；和
c)抗体，其包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域的序列选自SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59或与SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的任何序列，所述轻链可变结构域的序列选自SEQ ID No.34、37和60或与SEQ ID No.34、37或60具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的任何序列。
在另一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab选自：
a)抗体，其包含重链和轻链，所述重链的序列选自SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55和57或与SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57显示至少80％同一性的任何序列；所述轻链的序列为SEQ ID No.34或与SEQ ID No.34显示至少80％同一性的任何序列；
b)抗体，其包含重链和轻链，所述重链的序列选自SEQ ID No.33、41、45和55或与SEQ ID No.33、41、45或55显示至少80％同一性的任何序列；所述轻链的序列为SEQ IDNo.37或与SEQ ID No.37显示至少80％同一性的任何序列；和
c)抗体，其包含重链和轻链，所述重链的序列为SEQ ID No.59或与SEQ ID No.59显示至少80％同一性的任何序列；所述轻链的序列为SEQ ID No.60或与SEQ ID No.60显示至少80％同一性的任何序列。
在另一个实施方案中，第二IGF-1R抗体Ab是选自以下的抗体：
a)包含或由序列SEQ ID No.35或与SEQ ID No.35显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
b)包含或由序列SEQ ID No.35或与SEQ ID No.35显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.38或与SEQ ID No.38显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
c)包含或由序列SEQ ID No.40或与SEQ ID No.40显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
d)包含或由序列SEQ ID No.42或与SEQ ID No.42显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
e)包含或由序列SEQ ID No.42或与SEQ ID No.42显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.38或与SEQ ID No.38显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
f)包含或由序列SEQ ID No.44或与SEQ ID No.44显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
g)包含或由序列SEQ ID No.46或与SEQ ID No.46显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
h)包含或由序列SEQ ID No.46或与SEQ ID No.46显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.38或与SEQ ID No.38显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
i)包含或由序列SEQ ID No.48或与SEQ ID No.48显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
j)包含或由序列SEQ ID No.50或与SEQ ID No.50显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
k)包含或由序列SEQ ID No.52或与SEQ ID No.52显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
l)包含或由序列SEQ ID No.54或与SEQ ID No.54显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
m)包含或由序列SEQ ID No.56或与SEQ ID No.56显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
n)包含或由序列SEQ ID No.56或与SEQ ID No.56显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.38或与SEQ ID No.38显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；
o)包含或由序列SEQ ID No.58或与SEQ ID No.58显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.36或与SEQ ID No.36显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体；和
p)包含或由序列SEQ ID No.61或与SEQ ID No.61显示至少80％同一性的任何序列的重链和序列SEQ ID No.62或与SEQ ID No.62显示至少80％同一性的任何序列的轻链组成的抗体。
换言之，本发明涉及一种方法，其中第二IGF-1R抗体Ab为包含以下的抗体：
a)选自SEQ ID No.35、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58和61的序列或与SEQ IDNo.35、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或61具有至少80％同一性的任何序列的重链；和
b)选自SEQ ID No.36、38和62的序列或与SEQ ID No.36、38和62具有至少80％同一性的任何序列的轻链。
为了更清楚，下表6c阐明了人源化抗体hz208F2的不同变体的VH和VL(可变结构域和全长)的序列的非限制性示例。
表6c
III.2–药物(D)
药物部分D可以选自烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、螯合剂、铁吸收刺激剂、环氧合酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、DNA抑制剂、DNA合成抑制剂、凋亡刺激剂、胸苷酸抑制剂、T细胞抑制剂、干扰素激动剂、核糖核苷三磷酸还原酶抑制剂、芳香酶抑制剂、雌激素受体拮抗剂、酪氨酸激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、紫杉烷、微管蛋白抑制剂、血管生成抑制剂、巨噬细胞刺激剂、神经激肽受体拮抗剂、大麻素受体激动剂、多巴胺受体激动剂、粒细胞刺激因子激动剂、促红细胞生成素受体激动剂、生长抑素受体激动剂、LHRH激动剂、钙增敏剂、VEGF受体拮抗剂、白细胞介素受体拮抗剂、破骨细胞抑制剂、自由基形成刺激剂、内皮素受体拮抗剂、长春花生物碱、抗激素或免疫调节剂或任何其它满足细胞毒性或毒素活性标准的药物，并且D优选是奥瑞司他汀、多拉司他汀10或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法和组合物的药物部分具有下式(II)
其中：
-R2为COOH、COOCH3或噻唑基(如噻唑-2-基)，
-R3为H或(C1-C6)烷基(如甲基)，具体是(C1-C6)烷基，
-R9为H或(C1-C6)烷基(如甲基)，
-m为1至8之间的整数，和
-波浪线表示与L连接的点。
本发明中的“烷基”是指直链或支链、饱和的烃链。例如，可以提及的是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或己基。
本发明中的“(Cx-Cy)烷基”是指包含x至y个碳原子的如上面所定义的烷基链。因此，(C1–C6)烷基为具有1至6个碳原子的烷基链。
(C1–C6)烷基有利地为(C1–C4)烷基，优选(C1–C2)烷基。
在本发明的化合物中，一类具体推荐的药物部分对应于式(II)的药物部分，其中R2表示COOH基团。
另一类具体推荐的部分对应于式(II)的部分，其中R2为噻唑(具体是噻唑-2-基)。
另一类具体推荐的部分对应于式(II)的部分，其中R2为COOMe。
根据本发明的一个具体的实施方案，R2更具体地为COOH、COOMe或噻唑-2-基。
根据第一个优选的实施方案，R2为COOH。
根据第二个优选的实施方案，R2为COOMe。
R3具体地表示(C1-C6)烷基，有利地为甲基。
m为1至8之间，具体地1至6之间，有利地1至4之间的整数，优选为1或2。
在一个优选的实施方案中，R2为COOH，R3为甲基，且m为1或2。
在本发明的药物部分中，一类具体推荐的药物部分对应于式(II)的药物部分，其中R9为甲基或氢。
在一个优选的实施方案中：
-R2为COOH，R3为甲基，R9为甲基，且m为1或2，或
-R2为COOH，R3为甲基，R9为氢，且m为1或2。
根据一个优选的实施方案，NR9基团位于苯环上相对于(CH2)m基团的对位。
有利地，药物部分选自以下部分：
(式DH的)药物的制备：
可以使用在下面合成方案中描述的一般方法制备药物，所述一般方法当需要时任选补充任何标准操作，所述操作描述于文献中或对本领域技术人员而言是公知的，或描述于本文实验部分的实施例中。
方案1阐明第一种可用于制备药物的一般方法。在上面通式中，R1＝H，R2和R3如前面式II中所定义，R4代表R4a代表任选为受保护形式的如前面所定义的R4基团，且G为保护基。
第一步由化合物(II)与化合物(III)的缩合组成，所述化合物(II)在其胺官能团上受保护基G保护。X可以代表离去基如氯。在这种情况下，第一步由酰基氯(acidchloride)与胺的反应组成。可以使用本领域技术人员熟知的方法和技术进行该反应。在一个具体推荐的方法中，在有机或无机碱，例如Et3N、iPr2NEt、吡啶、NaH、Cs2CO3、K2CO3的存在下，在溶剂如THF、二氯甲烷、DMF、DMSO中，尤其在-20℃至100℃的温度，使这两种实体进行反应。X还可以为羟基(OH)。在这种情况下，第一步为羧酸(II)和胺(III)的缩合反应。可以依据本领域技术人员熟知的方法和技术进行该反应。在一个具体推荐的方法中，在偶联剂如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳化二亚胺(EDC)、3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮、叔胺如二异丙基乙胺的存在下，在极性非质子溶剂如二氯甲烷或DMF中，尤其在-15℃至40℃的温度，使这两种实体进行反应。在另一个具体推荐的方法中，在氰基磷酸二乙酯(DEPC)、叔胺如三乙胺的存在下，在极性非质子溶剂如二氯甲烷或DMF中，在-15℃至40℃的温度，使这两种实体进行反应。另一个具体推荐的方法由以下组成：在O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲六氟磷酸酯(HATU)、叔胺如二异丙基乙胺的存在下，在极性非质子溶剂如二氯甲烷或DMF中，在-15℃至100℃的温度使这两种实体反应。
在使用本领域技术人员熟知的技术(《Protective Groups in OrganicSynthesis》,T.W.Greene,John Wiley&Sons,2006和《Protecting Groups》,P.J.Kocienski,Thieme Verlag,1994)将中间体脱保护后，可以依据上面所描述的方法和技术将化合物(IV)与化合物(V)缩合，以在脱保护步骤后产生化合物(VI)。然后，在与中间体(VII)缩合并任选脱保护后，该化合物可以导致药物的形成。化合物(VI)还可以与化合物(VII’)偶联，其中R’3为R3的前体，具体是受保护基保护的R3基团。可以依据如前面所描述的相同程序进行偶联，之后基团R’3脱保护产生R3。
方案2阐明第二种可用于制备药物的一般方法。在上面通式中，G为保护基，R1＝H，R2、R3和R4a如前面所定义，且R4b代表
在第一步，将在其胺官能团上受保护基G保护的化合物(IX)与化合物(VI)缩合。X可以代表离去基，例如氯。在这种情况下，第一步由酰基氯与胺的反应组成。可以使用本领域技术人员熟知的方法和技术进行该反应。在一个具体推荐的方法中，在有机或无机碱，如Et3N、iPr2NEt、吡啶、NaH、Cs2CO3、K2CO3的存在下，在溶剂如THF、二氯甲烷、DMF、DMSO中，尤其在-20°至100℃的温度，使这两种实体进行反应。X还可以代表羟基。在这种情况下，第一步为羧酸(IX)与胺(VI)的缩合反应。可以依据本领域技术人员熟知的方法和技术进行该反应。在一个具体推荐的方法中，在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳化二亚胺(EDC)、3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮、叔胺如二异丙基乙胺的存在下，在极性非质子溶剂如二氯甲烷或DMF中，尤其在-15℃至40℃的温度，使这两种实体进行反应。在另一个具体推荐的方法中，在氰基磷酸二乙酯(DEPC)、叔胺如三乙胺的存在下，在极性非质子溶剂如二氯甲烷或DMF中，尤其在-15℃至40℃的温度，使这两种实体进行反应。
在中间体脱保护后，使用技术人员熟知的技术，将所得的化合物(VIII)与R4Y反应后可以产生药物。在这种情况下，Y为离去基如Cl、Br、I、OSO2CH3、OSO2CF3或O-甲苯磺酰基。在有机或无机碱，如Et3N、iPr2NEt、NaH、Cs2CO3、K2CO3的存在下，在极性无水溶剂如二氯甲烷、THF、DMF、DMSO中，尤其在-20°至100℃的温度进行该反应。在另一个具体推荐的方法中，使化合物(VIII)与式R4b-CHO的醛进行反应，其中R4b对应于R4的前体。在这种情况下，该反应为在还原剂如NaBH4、NaBH3CN、NaBH(OAc)3的存在下，在极性溶剂如1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、THF、DMF、MeOH中，任选在异丙醇钛(IV)的存在下，在可以通过加入酸如乙酸控制的pH，尤其在-20℃至100℃的温度的还原胺化反应。
在前述合成方案中，在附加的反应步骤如皂化反应(例如使用技术人员熟知的方法)之后一种药物可以产生另一种药物，由此将代表酯(COOMe)的R2基团转变为代表羧酸(COOH)的R2基团。
如果期望在酸加成盐的状态下分离含有至少一个碱官能团的药物，则可以通过用合适的酸(优选以等同的量)处理药物的游离碱(含有至少一个碱官能团)。合适的酸可以具体地为三氟乙酸。
III.3–接头(L)
在本发明中，“接头”、“接头单元”、“L”或“连接(link)”是指包含共价键或原子链的化学部分，其将至少一种药物共价连接至抗体。
可以使用各种双功能蛋白偶联剂制备接头，所述偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基噻吩(iminothiolane，IT)、亚氨酸酯的双官能团衍生物(如二甲基己二酰亚胺盐酸盐(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。碳-14-标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将细胞毒试剂缀合至寻址系统。其它交联剂可以为BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC和硫代-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是市售可得的(例如，购自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,Ill.,美国)。
接头可以为“不可裂解的”或“可裂解的”。
在一个优选的实施方案中，其在于“可裂解的接头”促进药物在细胞中的释放。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫化物的接头。在一个优选的实施方案中，接头在细胞内条件下是可裂解的，使得在细胞内环境中裂解接头从抗体上释放药物。
例如，在一些实施方案中，可以通过裂解剂裂解接头，所述裂解剂存在于细胞内环境中(例如，在溶酶体或胞内体(endosome)或胞膜窖内)。接头可以为例如肽基接头，其被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体蛋白酶或胞内体蛋白酶)裂解。典型地，肽基接头包含至少两个连续的氨基酸或至少三个连续的氨基酸，或者为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。裂解剂可以包括组织蛋白酶B和D及纤溶酶，所有这些都已知水解二肽药物衍生物，导致活性药物在靶细胞内的释放。例如，可以使用可被硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶B裂解的肽基接头(例如，包含或为Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly的接头)，所述组织蛋白酶B在癌性组织中是高表达的。在具体的实施方案中，可被细胞内蛋白酶裂解的肽基接头包含或者为Val-Cit或Phe-Lys。使用细胞内蛋白水解释放药物的一个优点在于，当缀合时药物常被减弱，并且缀合物的血清稳定性通常是高的。
在其它实施方案中，可裂解的接头是pH敏感的，即在某些pH值时对水解敏感。典型地，pH敏感接头在酸性条件下是可水解的。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)。该接头在中性pH条件下(如在血液中的那些条件下)是相对稳定的，但在低于pH 5.5或5.0(接近于溶酶体的pH)时是不稳定的。在某些实施方案中，可水解接头为硫醚接头(例如，经由酰腙键连接至药物的硫醚)。
在其它实施方案中，接头在还原条件下是可裂解的(例如二硫化物接头)。各种二硫化物接头是本领域已知的，包括例如，使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMTP(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)可以形成的那些。
在某些优选的实施方案中，接头单元可以具有以下通式：
-(T)a-(W)w-(Y)y-
其中：
T为拉伸子单元(stretcher unit)；
a为0或1；
W为氨基酸单元；
w为0至12之间的整数；
Y为间隔子单元(spacer unit)；
y为0、1或2。
拉伸子单元(T)(当存在时)将第二IGF-1R抗体Ab连接至氨基酸单元(W)(当存在时)，或连接至间隔子单元(当存在时)，或直接连接至药物。可以天然地或经由化学改造存在于第二IGF-1R抗体Ab上的有用的官能团包括巯基、氨基、羟基、碳水化合物的异头(anomeric)羟基和羧基。合适的官能团为巯基和氨基。可以通过第二IGF-1R抗体Ab的分子内二硫键的还原产生巯基(如果存在)。可替代地，可以通过第二IGF-1R抗体Ab赖氨酸部分的氨基与2-亚氨基噻吩或其它巯基生成试剂的反应产生巯基。在具体的实施方案中，将第二IGF-1R抗体Ab工程化以携带一个或多个赖氨酸。更优选地，可以将第二IGF-1R抗体Ab工程化以携带一个或多个半胱氨酸(参见ThioMab)。
在某些具体的实施方案中，拉伸子单元与第二IGF-1R抗体Ab的硫原子形成键。硫原子可以源自经还原的抗体的巯基(-SH)。
在某些其它的具体实施方案中，经由抗体的硫原子与拉伸子单元的硫原子之间的二硫键将拉伸子单元连接至第二IGF-1R抗体Ab。
在其它的具体实施方案中，拉伸子的反应性基团含有反应性位点，所述位点可以与第二IGF-1R抗体Ab的氨基反应。氨基可以为精氨酸或赖氨酸的氨基。合适的胺反应位点包括但不限于活化酯(例如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯基酯)、酸酐、酰基氯、磺酰基氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
在另一个方面，拉伸子的反应性官能团包含反应性位点，所述位点与可存在于第二IGF-1R抗体Ab上的修饰的碳水化合物基团反应。在一个具体的实施方案中，使第二IGF-1R抗体Ab酶促糖基化以提供碳水化合物部分，或者使抗体天然糖基化。可以用试剂如高碘酸钠温和地氧化碳水化合物，并且可以将所得的经氧化的碳水化合物的羰基单元与拉伸子缩合，所述拉伸子含有官能团如酰肼、肟、反应性胺、肼、氨基硫脲、羧酸肼或芳基酰肼。
根据一个具体的实施方案，拉伸子单元具有下式：
其中
L2为(C4-C10)环烷基-羰基、(C2-C6)烷基或(C2-C6)烷基-羰基(环烷基或烷基部分被连接至马来酰亚胺部分的氮原子)，
星号表示与氨基酸单元(如果存在)连接的点，与间隔子单元(如果存在)连接的点，或与药物D连接的点，和
波浪线表示与第二IGF-1R抗体Ab连接的点。
本发明中的“(C4-C10)环烷基”是指具有4至10个碳原子的烃环，包括但不限于环戊基、环己基等。
L2可以有利地为(C2-C6)烷基-羰基，如下式的戊基-羰基：
其中
星号表示与氨基酸单元(如果存在)连接的点，与间隔子单元(如果存在)连接的点，或与药物D连接的点；和
波浪线表示与马来酰亚胺部分的氮原子连接的点。
氨基酸单元(W)(当存在时)将拉伸子单元(T)(如果存在)或将第二IGF-1R抗体Ab连接至间隔子单元(Y)(如果存在间隔子单元)，或连接至药物(如果不存在间隔子单元)。
如上面所提及，(W)w不存在(w＝0)或者可以为二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元，其中形成肽的氨基酸可以彼此不同。
因此，可以通过下式代表(W)w：(W1)w1(W2)w2(W3)w3(W4)w4(W5)w5，其中每个W1至W5彼此独立地代表氨基酸单元，并且每个w1至w5为0或1。
在一些实施方案中，氨基酸单元(W)w可以包含氨基酸残基(如天然存在的那些)，以及次要(minor)氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。
氨基酸单元(W)w的氨基酸残基包括但不限于丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、用乙酰基或甲酰基保护的或未保护的赖氨酸、精氨酸、用甲苯磺酰基或硝基保护的或未保护的精氨酸、组氨酸、鸟氨酸、用乙酰基或甲酰基保护的鸟氨酸、和瓜氨酸。示例性的氨基酸接头组分优选包括二肽、三肽、四肽或五肽，尤其是二肽或三肽。
示例性的二肽包括：Val-Cit、Ala-Val、Ala-Ala、Val-Ala、Lys-Lys、Cit-Cit、Val-Lys、Ala-Phe、Phe-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-tosyl-Arg、Phe-N9-硝基-Arg。
示例性的三肽包括：Val-Ala-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Phe-Phe-Lys、Gly-Gly-Gly、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys。
示例性的四肽包括：Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO.93)、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ IDNO.94)。
示例性的五肽包括：Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO.95)。
根据一个具体的实施方案，(W)w可以为二肽(即w＝2)如Val-Cit，或者接头缺少氨基酸单元(w＝0)。当接头缺少氨基酸单元时，其优选也缺少间隔子单元。
根据一个优选的实施方案，w＝0(即(W)w为单键)或w＝2(即(W)w为二肽)，因此(W)w可以选自：
并且具体地为Val-Cit，
其中
星号表示与间隔子单元(如果存在)连接的点，或与药物D连接的点；和
波浪线表示与L2连接的点。
氨基酸接头组分可以在其对特定酶的酶切选择性方面被设计和优化，所述酶例如，与肿瘤相关的蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶。
接头的氨基酸单元可以被酶(包括但不限于，与肿瘤相关的蛋白酶)酶裂解，以释放药物。
氨基酸单元可以在其对特定的与肿瘤相关的蛋白酶的酶切选择性方面被设计和优化。合适的单元为那些单元，其裂解被蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D和纤溶酶催化。
间隔子单元(Y)(当存在时)将氨基酸单元(如果存在)或拉伸子单元(如果存在)或抗体连接至药物。间隔子单元有两种一般类型：自分解的(self-immolative)和非自分解的。非自分解的间隔子单元为间隔子单元，其中在氨基酸单元从抗体-药物缀合物中的酶裂解之后，部分或全部的间隔子单元依然结合在药物上。非自分解的间隔子单元的示例包括但不限于(甘氨酸-甘氨酸)间隔子单元和甘氨酸间隔子单元。为了释放药物，在靶细胞内应当进行独立的水解反应，以裂解甘氨酸-药物单元键。
在一个具体的实施方案中，非自分解的间隔子单元(Y)为Gly。
可替代地，含有自分解的间隔子单元的抗体-药物缀合物无需单独的水解步骤即可释放药物。在这些实施方案中，(Y)为对氨基苄醇(PAB)单元的残基，其经由PAB基团的氮原子连接至(W)w，并经由酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基直接连接至药物。
自分解的间隔子的其它示例包括但不限于与PAB基团在电性上(electronically)等价的芳香族化合物，如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物的残基和邻或对氨基苄基缩醛的残基。可以使用在酰胺键水解后易于进行环化的间隔子，如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统和2-氨基苯基丙酸酰胺。
在一个替代的实施方案中，间隔子单元为分枝的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)单元，其可以用于并入额外的药物。
在一个具体的实施方案中，间隔子单元(Y)为PAB-羰基，其中PAB为(PAB单元的氧连接至羰基)，并且y＝1或接头缺少间隔子单元(y＝0)。
在一个具体的实施方案中，接头具有下式(III)：
其中
L2为(C4-C10)环烷基-羰基、(C2-C6)烷基或(C2-C6)烷基-羰基(这些部分的羰基(当存在时)连接至(W)w)，
W表示氨基酸单元，其中w表示0至5之间的整数，
Y为PAB-羰基，其中PAB为(PAB单元的氧连接至羰基)，并且y为0或1(优选当w为0时，y为0，且当w为1至5时，y为0或1)，
星号表示与药物D连接的点，和
波浪线表示与第二IGF-1R抗体Ab连接的点。
有利地，L2为(C2-C6)烷基-羰基，如下式的戊基-羰基：
其中
星号表示与(W)w连接的点；和
波浪线表示与马来酰亚胺部分的氮原子连接的点。
根据一个优选的实施方案，接头L选自：
其中星号表示与药物D连接的点，并且波浪线表示与第二IGF-1R抗体Ab连接的点。
III.4-抗体-药物缀合物(ADC)
在一个优选的实施方案中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备本发明方法或组合物中使用的抗体-药物缀合物(ADC)，所述方法如，但不限于，i)第二IGF-1R抗体Ab的亲核基团与二价接头试剂反应，然后与药物的亲核基团反应，或ii)药物的亲核基团与二价接头试剂反应，然后与第二IGF-1R抗体Ab的亲核基团反应。
第二IGF-1R抗体Ab上的亲核基团包括但不限于N-末端胺基、侧链胺基(例如赖氨酸)、侧链巯基和当第二IGF-1R抗体Ab糖基化时糖羟基或氨基。
药物上的亲核基团包括但不限于胺基、硫醇基和羟基，优选胺基。
胺基、硫醇基和羟基是亲核性的，并且能够反应以与接头部分和接头试剂上的亲电子基团形成共价键，所述接头部分和接头试剂包括但不限于活性酯如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰基卤；烷基卤化物和苄基卤化物，如卤代乙酰胺；醛；酮；羧基；和马来酰亚胺基团。抗体可以具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可以通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)处理，使抗体具有与接头试剂缀合的反应性。因此，每个半胱氨酸桥在理论上将形成两个反应性硫醇亲核体(nucleophile)。可以通过本领域技术人员已知的任何反应，将另外的亲核基团引入抗体中。作为非限制性示例，可以通过引入一个或多个半胱氨酸残基将反应性巯基引入第二IGF-1R抗体Ab中。
还可以通过修饰第二IGF-1R抗体Ab引入亲电部分以产生ADC，所述亲电部分可以与接头试剂上的亲核取代基反应。可以氧化糖基化抗体的糖，以形成可以与接头试剂或药物的胺基反应的醛基或酮基。所得的亚胺希夫(Schiff)碱基团可以形成稳定的键，或者可以还原形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化第二IGF-1R抗体Ab的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在蛋白中产生羰(醛和酮)基，其可以与药物上合适的基团反应。在另一个实施方案中，含有N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白可以与偏高碘酸钠反应，导致产生醛代替第一氨基酸。
在一个优选的实施方案中，通过制备药物-接头部分，然后将第二IGF-1R抗体Ab的亲核基团(例如半胱氨酸部分的SH基团)与药物-接头部分的亲电基团(例如马来酰亚胺)偶联，制备本发明的ADC。
1.药物-接头
可以通过以下偶联制备药物-接头部分：
-将接头与药物偶联，
-在完成接头的合成之前，将接头的一部分与药物偶联，
-在完成药物的合成之前，将接头与药物的一部分或前体偶联，或者
-在完成接头和药物的合成之前，将接头的一部分与药物的一部分或前体偶联。
亲核基团与亲电基团之间的偶联反应是本领域技术人员熟知的反应。
亲核基团可以具体地为胺基、硫醇基或羟基。在一个优选的实施方案中，其为伯或仲胺基团。
亲电基团可以为任选处于活化形式的羧酸基团(COOH)或活化的碳酸酯部分。
羧酸的“活化形式”是指羧酸，其中COOH官能团的OH部分已被活化的离去基(LG)替代，使得能够将活化的羧酸基团与氨基偶联，以形成酰胺键并释放化合物LG-H。活化形式可以为活化酯、活化酰胺、酸酐或酰基卤，如酰基氯(acyl chloride)。活化酯包括由羧酸基团与N-羟基苯并三唑或N-羟基琥珀酰亚胺的反应形成的衍生物。
“活化的碳酸酯”是指包含-OC(O)OR部分的碳酸酯，其中OR代表好的离去基，使得能够将活化的碳酸酯与氨基偶联，以形成氨基甲酸酯部分并释放化合物ROH。活化的碳酸酯的R基包括但不限于对硝基苯基、五氟苯基、2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基和苄基，优选对硝基苯基和五氟苯基。
当接头具有下式(III)时：
药物-接头部分具有下式(IV)：
并且药物-接头部分的合成的最后步骤通常为下式(V)的化合物与下式(VI)的化合物的偶联：
其中L2如前面所定义，并且LG代表离去基，尤其是卤化物如氯化物，或衍生自N-羟基琥珀酰亚胺的基团，
H-(W)w-(Y)y-D
(VI)
当y＝1且Y＝PAB-羰基时，可以通过将药物(DH)与下式(VII)的化合物(优选其受保护的形式)偶联，制备式(VI)的化合物：
G-(W)w-PAB-CO-OR
(VII)
其中W和w如前面所定义，R如在“活化的碳酸酯”的定义中所定义，并且G为H或保护基。
当式(VII)的化合物为受保护的形式时，最后的脱保护步骤是必要的。
当y＝0时，化合物(VI)具有式H-(W)w-D，其中(W)w和优选地D由氨基酸单元组成。因此在这种情况下，可以通过本领域技术人员熟知的常规的肽合成方法制备化合物(VI)。
2.Ab-接头-药物
根据本发明的一个实施方案由存在于第二IGF-1R抗体Ab上的半胱氨酸与药物-接头部分的亲电基团的偶联组成，优选由存在于第二IGF-1R抗体Ab上的半胱氨酸与存在于药物-接头部分上的马来酰亚胺部分的偶联组成。
可以通过本领域技术人员熟知的方法进行马来酰亚胺-半胱氨酸偶联。
通常，抗体不含有许多(如果有的话)游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基团，所述基团可以连接至药物部分。抗体中的大部分半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在，并且必须用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP，在部分或全部还原条件下还原。可以通过多种不同的方式控制ADC的负载(loading)(药物/抗体比例)，包括：(i)限制药物-接头中间体(D-L)或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，和(iii)用于半胱氨酸硫醇修饰的部分或有限还原条件。
人IgG的二硫键结构现在已被很好地确定(综述于Liu和May,mAbs 4(2012):17-23)。事实上，对于4种人IgG亚类(即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的二硫键结构，存在许多相似性和一些差异。所有IgG亚类总是含有12个链内二硫桥，并且差异存在于它们在重链和轻链之间形成的链间二硫键中。每个链内二硫键与单个IgG结构域，即可变(VL和VH)和恒定(CL、CH1、CH2和CH3)结构域结合。2个重链在其铰链区通过可变数目的二硫桥相连：IgG1和IgG4有2个，IgG2有4个，IgG3有11个。IgG1的重链和轻链通过轻链的最后的半胱氨酸残基和重链的第五个残基之间的二硫键相连，而对于其它亚类IgG2、IgG3和IgG4，轻链通过轻链的最后的半胱氨酸残基和重链的第三个半胱氨酸残基之间的二硫键连接至重链，所述第三个半胱氨酸残基位于VH和CH1结构域的界面。已经描述了IgG2和IgG4的除了这些经典结构以外的二硫键结构(综述于Liu和May,mAbs 4(2012):17-23)。链间二硫键是高度溶剂暴露的，因此其比链内二硫键更具反应性，所述链内二硫键被埋在每个结构域内的反平行β-折叠结构中，并且其不是溶剂暴露的。由于这些原因，无论抗体同种型，在温和还原后，将在链间暴露的半胱氨酸残基上发生偶联。因此，每个链间二硫桥理论上可以形成两个缀合位点。
通过赖氨酸与2-亚氨基噻吩(特劳特(Traut's)试剂)的反应，使胺转化为硫醇，可以将额外的亲核基团引入抗体中。还可以通过将一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基工程化(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)，将反应性巯基基团引入抗体(或其片段)中。US 7521541教导了通过反应性半胱氨酸氨基酸的引入将抗体工程化。
半胱氨酸氨基酸可以在抗体的反应位点被工程化，并且其不形成链内或分子间二硫键(Junutula,等人,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan等人(2009)Blood114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249)。工程化的半胱氨酸硫醇可以与本发明的接头试剂或药物-接头试剂反应，以形成具有半胱氨酸工程化的抗体和药物部分的ADC，所述接头试剂或药物-接头试剂具有硫醇反应性亲电基团，如马来酰亚胺或α-卤代酰胺。因此，药物部分的位置可以被设计、控制和知晓。药物负载可以被控制，因为工程化的半胱氨酸硫醇基团通常以高产率与硫醇反应性接头试剂或药物-接头试剂反应。通过在重链或轻链上的单个位点的取代工程化IgG抗体以引入半胱氨酸氨基酸，在对称的抗体上产生了两个新的半胱氨酸。用缀合产品ADC的接近同质性(homogeneity)可以实现接近2的药物负载。
在抗体的大于一个亲核基团或亲电基团与药物-接头中间体或者与接头试剂反应然后与药物部分试剂反应的情况下，所得的产物为ADC化合物的混合物，其中连接至抗体的药物部分的分布为例如1、2、3等。液相色谱法(如聚合反相(PLRP)和疏水相互作用(HIC))可以按药物负载值分离混合物中的化合物。可以分离具有单一药物负载值(p)的ADC的制剂，然而，这些单一负载值的ADC仍然可能为异质混合物，因为药物部分可以经由接头连接至抗体的不同位点。
对于一些ADC，药物比例可能受到抗体上连接位点的数量的限制。高的药物负载(例如药物比例>5)可以导致某些ADC的聚集、不溶解、毒性或细胞通透性的丧失。典型地，在缀合反应期间，将比理论最大值小的药物部分缀合至抗体。
药物负载(也被称作药物-抗体比例(DAR))为每个细胞结合试剂的平均药物数量。
对于抗体IgG1和IgG4同种型，其中药物在部分抗体还原后结合至半胱氨酸，药物负载可以为每个抗体1至8个药物(D)，即，其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分共价连接至抗体。
对于抗体IgG2同种型，其中药物在部分抗体还原后结合至半胱氨酸，药物负载可以为每个抗体1至12个药物(D)，即，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个药物部分共价连接至抗体。
ADC的组合物包括细胞结合试剂(例如抗体)的集合，所述细胞结合试剂与1至8个或1至12个药物缀合。
可以通过常规手段如UV、反相HPLC、HIC、质谱、ELISA分析和电泳，表征来自缀合反应的ADC的制剂中每个抗体的药物的平均数量。
作为非限制性实施方案，本文提供了与第二IGF-1R抗体hz208F2的缀合。在这种情况下，将药物偶联至至少一个半胱氨酸，所述半胱氨酸选自i)序列SEQ ID No.36、38或62的轻链的214位的残基Cys，和ii)序列SEQ ID No.35、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或61的重链的223、229和232位的残基Cys。
作为非限制性实施方案，本文提供了与第二IGF-1R抗体hz208F2的缀合。在这种情况下，将药物偶联至至少两个、三个或四个半胱氨酸，所述半胱氨酸选自i)序列SEQ IDNo.36、38或62的轻链的214位的残基Cys，和ii)序列SEQ ID No.35、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58和61的重链的223、229和232位的残基Cys。
一个替代方案由赖氨酸偶联组成。抗体可以含有例如许多赖氨酸残基，所述残基不与药物-接头中间体(D-L)或接头试剂反应。只有最具反应性的赖氨酸基团可以与胺反应性接头试剂反应。此外，只有最具反应性的半胱氨酸硫醇基团可以与硫醇反应性接头试剂反应。
当本发明的化合物与赖氨酸结合时，药物负载可以为每个细胞抗体1至80个药物(D)，但是优选的上限为40、20、10或8。ADC的组合物包括细胞结合试剂(例如抗体)的集合，所述细胞结合试剂与1至80个、1至40个、1至20个、1至10个或1至8个药物缀合。
根据本发明的式(I)的ADC可以为药学上可接受的盐的形式。
在本发明中，“药学上可接受的”是指可以在药物组合物的制剂中使用，通常是安全无毒的，既不是生物学上也不是其它方面不期望的，并且对于兽医用途以及人制药用途是可接受的。
化合物的“药学上可接受的盐”是指如本文所定义的药学上可接受的盐，并且其具有母体化合物的期望的药理活性。
药学上可接受的盐尤其包含：
(1)与药学上可接受的无机酸形成的药学上可接受的酸加成盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和类似的酸；与药学上可接受的有机酸形成的药学上可接受的酸加成盐，所述有机酸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、甲磺酸、硬脂酸、乳酸和类似的酸；和
(2)当母体化合物中存在的酸质子被金属离子替代时形成的药学上可接受的碱加成盐，所述金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子；或与药学上可接受的有机碱配位时形成的药学上可接受的碱加成盐，所述有机碱如赖氨酸、精氨酸等；或与药学上可接受的无机碱配位时形成的药学上可接受的碱加成盐，所述无机碱如氢氧化钠、碳酸钾(potash)、氢氧化钙和类似物。
可以使用常规的化学方法，由含有碱或酸官能团的本发明的化合物与相应的酸或碱制备这些盐。
IV-治疗
本发明还涉及一种用于治疗癌症的方法，其包括向需要其的人施用有效量的如上面所定义的式(I)的化合物。
癌症可以优选选自表达IGF-1R的癌症，所述癌症包括在其表面表达或过表达全部或部分的蛋白IGF-1R的肿瘤细胞。
更具体地，所述癌症为乳腺癌、结肠癌、食管癌、肝细胞癌、胃癌、神经胶质瘤、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、横纹肌肉瘤、肾癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、间皮瘤、平滑肌肉瘤和任何耐药的症候或癌症。
根据本发明的方法可用于治疗患者的癌症，具体是耐药的或难治性癌症。在一些实施方案中，患者具有难治性或耐药癌症，其中患者以前至少一次采用化学治疗剂治疗失败。
为了避免疑问，耐药的或难治性癌症，是指任何耐受的表达IGF-1R的癌症，即不仅指最初表达IGF-1R的耐受的癌症，而且还指最初不表达或不过表达IGF-1R，但当对前面的治疗已经变得耐受后即表达IGF-1R的癌症。
可治疗的其它具体类型的癌症包括但不限于难治性或耐药形式的癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤和其它癌症、细胞增殖性病症和肿瘤。
本发明的另一个目的为一种药物组合物，其包含如说明书中所描述的ADC。
更具体地，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的ADC和至少一种赋形剂和/或药学上可接受的载体。
在本说明书中，表述“药学上可接受的载体”或“赋形剂”旨在表示化合物或化合物的组合，其进入药物组合物中而不引起次级反应，并且其允许例如促进活性化合物的施用、增加活性化合物的寿命和/或在体内的功效、增加活性化合物在溶液中的溶解度或改善活性化合物的保存。这些药学上可接受的载体和赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且本领域技术人员将根据所选择的活性化合物的性质和施用模式改变所述载体和赋形剂。
活性成分可以以单位施用形式，与常规药物载体混合施用至动物或人类。合适的单位施用形式包括经由口服途径的形式，和经由胃肠外途径(皮下、皮内、肌内或静脉内)施用的形式。
作为用于口服施用的固体组合物，可以使用片剂、丸剂、粉末(硬的或软的明胶胶囊)或颗粒剂。在这些组合物中，在氩气流中，将本发明的活性成分与一种或多种惰性稀释剂如淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖或二氧化硅混合。这些组合物还可以包含除稀释剂以外的物质，例如一种或多种润滑剂如硬脂酸镁或滑石，着色剂，包衣(包衣片)或清漆(varnish)。
用于胃肠外施用的无菌组合物可以优选为水性或非水性溶液、混悬剂或乳剂。作为溶剂或载体，可以使用水、丙二醇、聚乙二醇、植物油具体是橄榄油、可注射的有机酯例如油酸乙酯或其它合适的有机溶剂。这些组合物还可以含有佐剂，具体是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。可以以多种方式进行灭菌，例如通过消毒过滤，通过向组合物中加入灭菌剂，通过辐射或通过加热。它们还可以被制备成固体无菌组合物的形式，可以在使用时将所述组合物溶解于无菌水或任何其它可注射的无菌介质中。
优选地，将通过全身途径，具体是通过静脉内途径、通过肌内、皮内、腹膜内或皮下途径或通过口服途径施用这些ADC。在一个更优选的方式中，将以连续的方式多次施用包含根据本发明的ADC的组合物。
因此，本发明还涉及一种试剂盒，其至少包含i)根据本发明的抗体-药物-缀合物和/或根据本发明的药物组合物，和ii)注射器或小瓶或安瓿，其中装有所述抗体-药物-缀合物和/或药物组合物。
可以根据在确立适合于患者的治疗时通常考虑的标准，确定它们的施用方式、剂量和最佳药物形式，例如根据患者的年龄或体重、他/她的整体病症的严重性、对治疗的耐受性和注意到的副作用。
本发明的其它特征和优点随着实施例和附图出现在本说明书的连续部分中，所述附图的说明表示如下。
附图说明
图1A和1B：在rhIGF1R ELISA中，采用第一IGF-1R抗体816C12(A)和810D10(B)获得的OD值的图示。使用Prism应用程序确定数据拟合和EC50确定。
图2A-2D：采用第一IGF-1R抗体816C12(2A)、第一IGF-1R抗体810D12(2B)、G11抗IGF-1R抗体(Roche Ventana)(2C)或AF-305(R&D system)抗IGF-1R抗体(2D)识别石蜡包埋肿瘤MCF-7的免疫组织化学(IHC)模式。
图3在MCF-7异种移植模型中抗IGF-1R ADC的体内活性。
图4A-4D：采用第一IGF-1R抗体816C12(4A)、第一IGF-1R抗体810D12(4B)、G11抗IGF-1R抗体(Roche Ventana)(4C)或AF-305(R&D system)抗IGF-1R抗体(4D)识别石蜡包埋肿瘤SBC-5的免疫组织化学(IHC)模式。
图5：在SBC-5异种移植模型中抗IGF-1R ADC的体内活性。
图6A-6C：通过FACS分析的抗体与人天然IGF-1R的结合。图6A表示在MCF-7细胞系中的滴定曲线。MFI表示荧光强度的平均值。图6B表示在MCF-7细胞系中鼠抗IGF-1R抗体和嵌合抗IGF-1R抗体的EC50。图6C表示在MCF-7细胞系中嵌合抗IGF-1R抗体的Bmax。
图7A-7B：使用转染细胞和未转染细胞进行的hIGF-1R识别的评价。图7A表示在IGF-1R+细胞系中一种嵌合抗IGF-1R Ab的滴定曲线。MFI表示荧光强度的平均值。图7B表示在人IGF-1R-细胞系中嵌合抗IGF-1R Ab的结合。
图8A-8B：使用转染细胞进行的Ab对IGF-1R和hIR的特异性的评价。图8A表示在hIR+转染细胞系中鼠抗IGF-1R Ab的结合。图8B表示在IR+细胞系中嵌合抗IGF-1R Ab的结合。MFI表示荧光强度的平均值。引入GRO5抗hIR Mab(Calbiochem)作为阳性对照。
图9：在IM-9细胞系中鼠抗IGF-1R Ab的结合。MFI表示荧光强度的平均值。引入GRO5抗hIR Mab作为阳性对照。
图10A-10C：猴IGF-1R的识别的评价。图10A表示在COS-7细胞系中嵌合抗IGF-1RAb的滴定曲线。MFI表示荧光强度的平均值。图10B表示在COS-7细胞系中鼠抗IGF-1R抗体和嵌合抗IGF-1R抗体的EC50。图10C表示在NIH 3T3转染细胞hIGF-1R+和COS-7细胞系中嵌合抗IGF-1R抗体的EC50。
图11：使用CM5传感芯片(sensorchip)在基于SPR技术的Biacore X100上获得的传感图(sensorgram)，所述CM5传感芯片用更多的11000RU的小鼠抗-Tag His抗体活化，所述抗体被化学接枝到羧甲基葡聚糖基质上。使用HBS-EP+作为运行和样本稀释缓冲液，在25℃以30μl/min的流速运行实验。该图显示了4张独立的传感图的叠加，在分析物的第一次注射开始时对准在x轴上，以及在该第一次注射之前定义的基线对准在y轴上。用菱形标记通过捕获基于人的重组可溶性IGF1R的序列获得的传感图。用三角形标记通过捕获基于食蟹猴的重组可溶性IGF-1R的序列获得的传感图。白色符号对应于空白周期(运行缓冲液的5次注射)，黑色符号对应于增加的浓度范围的c208F2(5、10、20、40和80nM)的注射。
图12：与IGF1相比，抗hIGF-1R抗体对受体磷酸化的固有作用的评价。
图13：通过鼠抗hIGF-1R的对IGF-1响应的IGF-1R磷酸化的抑制。
图14：在37℃孵育细胞后，抗IGF-1R抗体的细胞表面信号强度被下调。将MCF-7细胞与10μg/ml的Ab在4℃或37℃孵育4h。该图表示ΔMFI。
图15A-15B：抗体表面衰减(decay)。在37℃，在10、20、30、60和120分钟后评价细胞表面结合的抗体。图15A表示与在4℃测量的信号强度相比剩余IGF-1R的％。图15B表示使用Prism软件和使用指数衰减拟合的半衰期计算。
图16：抗hIGF-1R Ab被内化。将细胞与10μg/ml鼠Ab在37℃孵育0、30或60min。将细胞通透化(permeabilize)或不将细胞通透化，并与抗小鼠IgG-Alexa 488二抗孵育。膜对应于信号强度w/o通透化作用(permeabilization)。总计对应于细胞通透化后的信号强度，并且细胞质对应于内化的Ab。每个评价的抗体的名称标注于每张图的顶部。
图17A-17B：Ab内化的成像。图17A：MCF-7细胞，其在4℃与m208F2孵育20分钟、洗涤、然后在在37℃孵育(W)15min(X)、30min(Y)和60min(Z)。将细胞固定并通透化。使用抗小鼠IgG Alexa488和Lamp-1，使用兔抗Lamp-1抗体和抗兔IgG Alexa 555二抗显示m208F2Ab。图17B：将MCF-7细胞与抗hIGF-1R鼠抗体在37℃孵育30分钟，并如上所述进行染色。使用ImageJ软件的共定位高亮(highliter)插件确定共定位。
图18：溶酶体通路在抗体降解中的参与。
图19：酸性pH降低五种鼠抗IGF-1R抗体的结合能力。
图20A-20D：c208F2 Mab的第一人源化形式的结合特征。在人细胞系MCF-7(A)、猴细胞系COS-7(B)和表达人胰岛素受体的转染的鼠细胞系(C)中，评价hz208F2 mAb的结合性质。平行地评价鼠208F2 mAb和嵌合208F2 mAb的结合。使用抗hIR抗体克隆GRO5以验证hIR在转染的细胞系(D)中的表达。
图21：hz208F2抗体表面衰变。
图22：用CM5传感器芯片在25℃的温度用基于SPR的Biacore X100装置获得的传感图的叠加，所述CM5传感器芯片在两个流动池(flowcell)中用约12.000RU的小鼠抗TagHis单克隆抗体活化，所述抗体被化学接枝到羧甲基葡聚糖基质上，使用HBS-EP+作为运行缓冲液，流速为30μl/min。每张传感图(第一个用三角形标记，第二个用菱形标记)对应于一个完整的周期：
1-在一分钟期间，在第二流动池中注射重组h-IGF-1R的溶液(10μg/ml)。
2-对于第一张传感图：运行缓冲液的5次注射，每次90s
对于第二张传感图：增加的浓度范围的抗IGF-1R c208F2抗体溶液的五次注射，每次90s。
3-300s的延迟，用于确定解离动力学速率。
4-通过10mM甘氨酸，HCl pH 1.5缓冲液的45s的注射再生表面。
图23：以灰色显示传感图，所述传感图对应于用增加的浓度范围的抗IGF-1Rc208F2溶液获得的传感图减去空白传感图(HBS-EP+的5次注射)。以细黑线显示对应于1:1模型的理论传感图，所述理论传感图具有以下参数：kon＝(1.206±0.036)x 106M-1.s-1，koff＝(7.81±0.18)x 10-5s-1，Rmax＝307.6±0.3RU。在图上报告了c208F2的计算的浓度：仅最高浓度(24nM)被认为是常数)。
图24：解离常数对应于每种抗体运行的四个实验的平均值，并且对应于以pM单位表示的比例：koff/kon x 1012。误差条对应于标准误差(n＝4)。
图25：半衰期对应于每种抗体运行的四个实验的平均值，并且对应于以h单位表示的比例：Ln(2)/koff/3600。误差条对应于标准误差(n＝4)。
图26：与三种不同的化合物偶联的抗IGF-1R的细胞毒性。将五种嵌合抗体抗IGF-1R与E-13、G-13或F-63偶联。还将不相关的抗体c9G4与相同的化合物偶联。
图27A-27C：在MCF-7异种移植模型中，c208F2-E-13(图27A)、c208F2-G-13(图27B)和c208F2-F-63(图27C)的体内评价。
图28A-28B：在MCF-7异种移植模型中，c208F2-E-13(图28A)和c208F2-G-13(图28B)相比于ADC对照(c9G4-E13和c9G4-G-13)的体内评价。
图29A-29B：酸性pH降低人源化IGF-1R抗体hz208F2 H026/L024(A)和hz208F2(H077/L018(B))的结合能力。
图30：c208F2-G-13对正常细胞的细胞毒性的评价。
图31：与G-13偶联的hz208F2的人源化变体的细胞毒性。还将不相关的抗体c9G4与相同的化合物偶联。
图32：在MCF-7异种移植模型中，208F2-G-13的人源化形式与c208F2-G-13的体内评价。
图33A和33B：在MCF-7异种移植模型中，c208F2-G-13(33A)或hz208F2-4-G-13(33B)注射4次相比于注射一次的体内评价。
图34A和34B：在CaOV-3异种移植模型中，c208F2-E-13(34A)和c208F2-G-13(34B)的体内评价。
图35A-35D：4个传感图对应在CM5上捕获的可溶形式的h-IGF1R(30μg/ml)的捕获，所述CM5由超过12000RU的与羧甲基葡聚糖基质化学连接的抗聚组氨酸小鼠单克隆抗体活化。该注射之后以50μg/ml浓度使用的运行缓冲液(HBS-EP+)(A和C)或Hz208F2-4(B和C)作为Acl注射。该注射之后以50μg/ml浓度的Ac2Hz208F2-4(A和B)或也以50μg/ml的m810C12(C和D)注射。该实验在25℃以10μl/分钟的流速在Biacore X100上运行。
图36：在无Ac1(白色条)或在Acl存在下(黑色条)注射结束后20秒时Ac2的结合水平。
图37：在2+NCI-H2122异种移植模型中，缀合于G-13化合物的208F2抗体的体内活性。
图38：注射208F2-G-13前MCF7肿瘤中的IGF-1R和Ki67染色水平。
图39：注射208F2-G-13后MCF7肿瘤中的IGF-1R和Ki67染色水平。
具体实施方式
实施例
实施例1：第一IGF-1R抗体的产生和选择
如下所述的产生并选择Mab 816C12和810D12。
通过采用10μg的重组人IGF-1R蛋白(R and D Systems，391-GR)与弗氏佐剂皮下注射来免疫雌性Balb/C小鼠。每隔两周重复免疫接种3次。在佐剂存在下通过腹膜内注射进行第四次注射。
三天后，采用PEG 50％将脾细胞与SP2OAg14骨髓瘤细胞融合。在HAT代谢选择14天后，通过FACS使用人MCF7乳癌细胞测试杂交瘤上清液。只保留了结合MCF7的抗体。
然后通过有限稀释克隆感兴趣的抗体。克隆后8天，通过FACS使用MCF7细胞再次选择上清液。对每个杂交瘤保留三个阳性克隆。使用来自Southern Biotechnologies的SBA克隆分型系统HRP试剂盒(Cat：5300-05)确定分泌的抗体的分型。最后，一个克隆被扩增和冷冻。
然后使用杂交瘤上清液如rhIGF-1R或rmIGF-1R或rhIR ELISA进行816C12和810D12的进一步表征。在所有直接ELISA中，将感兴趣的蛋白固定(1μg/ml)到每个孔的底部。饱和后，将杂交瘤上清液加入孔中。在1小时的孵育期和洗涤步骤之后，山羊抗小鼠IgG-HRP标记的多克隆抗体的溶液用于检测，之后添加TMB底物。用1M H2SO4溶液终止反应，之后在450nm波长用分光光度计读取OD。数据见表7。
表7
对于816C12的第二IGF-1R抗体对rhIGF-1R包被的剂量反应曲线如图1所示，对于810D12的如图1B所示。使用Prism应用程序确定EC50值。
数据显示，816C12抗体仅识别rh IGF-1R，EC50为0.41nM，以及810D12抗体仅识别rhIGF-1R，EC50为0.51nM。它们均不与鼠形式的IGF-1R结合，也不和人IR结合。
实施例2：用本发明的第一IGF-1R抗体的分期与在MCF-7异种移植模型中靶向IGF- 1R的ADC活性的相关性的评价。
为了将肿瘤的分级与药理学相关联，肿瘤已经被分级(2.1节)，然后采用ADC来进行MCF-7异种移植模型的体内实验，所述ADC包含靶向IGF-1R的第二IGF-1R抗体部分(已知被内化)和由奥瑞司他汀组成的药物部分(2.2节)。
2.1：免疫组织化学检测MCF-7异种移植模型的IGF-1R的表达。
将来自MCF-7异种移植的组织切片脱蜡，再水化，并置于在98℃预热的沸腾浴中的Target Retrieval缓冲液1×(Dako S1699)中，在98℃下40分钟进行热诱导表位恢复，然后在Target Retrieval缓冲液中额外持续20分钟。在Tris缓冲盐水-0.05％吐温20(TBS-T)(Dako S3006)中洗涤3次后，使用过氧化物酶封闭试剂(Peroxidase Blocking Reagent，Dako K4007)封闭内源性过氧化物酶活性5分钟。用TBS-T洗涤切片，并用封闭试剂(UltraVblock-TA-125UB-LabVision)孵育5分钟，之后与816C12单克隆抗体(5μg/ml)或作为阴性对照的小鼠IgG1/κ(5μg/ml，X0931，Dako)在室温下孵育1小时。切片用TBS-T洗涤并与Envision(Dako)孵育30分钟。二氨基联苯胺用于棕色反应产物(Dako K3468)显色(development)。将玻片浸在苏木精中2分钟以复染(Dako S3309)。
第一IGF-1R抗体816C12和810D12对MCF-7的细胞膜进行差异性染色。在该IHC规程中，棕色反应产物与细胞膜的阳性染色相关，棕色反应产物的缺乏与阴性染色和未观察到细胞膜相关。使用膜算法，MCF-7肿瘤细胞染色评分为3+(图2A：816C12以及图2B：810D12)。使用G11抗体(Roche Ventana)或AF-305(R&D system)抗IGF-1R抗体，相同肿瘤切片评分为2+(分别为图2C和2D)。
2.2：在MCF-7异种移植模型中抗IGF-1R ADC的体内活性。
在MCF-7异种移植模型中，已经在体内评价了包含第二IGF-1R部分的抗IGF-1RADC。
所有动物规程均根据2010/63/UE保护用于科学目的动物的指令(Directive onthe protection of animals used for scientific purposes)的指南进行。方案经皮埃尔法布雷研究所(Pierre Fabre Institute)的动物伦理委员会(Animal EthicalCommittee)批准。将5百万个MCF-7细胞皮下注射入7周龄的Swiss/Nude小鼠。在细胞注射之前，将雌激素丸(Innovative Research of America)植入小鼠的左侧腹(left flank)，以释放MCF-7肿瘤体内生长所必需的雌激素。
MCF-7细胞植入二十天后，当肿瘤达到平均尺寸120-150mm3时，根据肿瘤尺寸和外表(aspect)将动物分成6只小鼠的组。抗IGF-1R ADC通过腹膜内注射接种，每4天6次注射周期(Q4d4)。每日监测动物的健康状态。每周用电子卡尺测量肿瘤体积两次，直到研究结束。肿瘤体积用下式计算：π/6×长×宽×高。根据动物重量每周评价毒性三次。使用Mann-Whitney检验在每次测量中进行统计学分析。
如预期的，对于分级3+的肿瘤而非分级2+的肿瘤，注射抗IGF-1R ADC显著抑制并且甚至诱导肿瘤生长的完全退化(图3)。
实施例3：用本发明的第一IGF-1R抗体的分期与在SBC-5异种移植模型中靶向IGF- 1R的ADC的活性的相关性的评价。
为了将肿瘤的分级与药理学相关联，肿瘤已经被分级(3.1节)，然后采用ADC来进行SBC-5异种移植模型的体内实验，所述ADC包含靶向IGF-1R的抗体部分和由奥瑞司他汀组成的药物部分(3.2节)。
3.1免疫组织化学检测SBC-5异种移植模型的IGF-1R的表达。
使用与之前实施例2的2.1节所述相同的方案分析IGF-1R水平。
当用816C12和810D12检测IGF-1R时，检测到低水平(1+)(图4A：816C12以及图4B：810D12)。当用G11抗体(Roche Ventana)或AF-305(R&D system)抗IGF-1R抗体检测IGF-1R时，来自相同肿瘤的切片被评分为3+(分别为图4C和4D)。
3.2：在SBC-5异种移植模型中抗IGF-1R ADC的体内活性。
已经在SBC-5异种移植模型中评价了体内抗IGF-1R ADC。
所有动物规程均根据2010/63/UE保护用于科学目的动物的指令的指南进行。方案经皮埃尔法布雷研究所的动物伦理委员会批准。将5百万个SBC-5细胞皮下注射入7周龄的无胸腺小鼠(Athymic mice)。细胞植入二十天后，当肿瘤达到平均尺寸150mm3时，根据肿瘤尺寸和外表将动物分成6只小鼠的组。抗IGF-1R ADC通过腹膜内注射接种，每4天6次注射周期(Q4d6)。每日监测动物的健康状态。每周用电子卡尺测量肿瘤体积两次，直到研究结束。肿瘤体积用下式计算：π/6×长×宽×高。根据动物重量每周评价毒性三次。使用Mann-Whitney检验在每次测量中进行统计学分析。
如预期的，对于分级1+的肿瘤而非分级3+的肿瘤，SBC-5肿瘤细胞的肿瘤进展不受包含第二IGF-1R抗体的抗IGF-1R ADC注射的影响(图5)。
实施例4：针对IGF-1R ECD的鼠第二IGF-1R抗体Ab的产生
为了产生针对人IGF-1受体(hIGF-1R)的人细胞外结构域(ECD)的鼠单克隆抗体(Mab)，将5只BALB/c小鼠用10μg的rhIGF-1R蛋白(R&D Systems，目录号391-GR)皮下免疫3次。作为替代方案，在一些动物中用10μg IGF-1R的鼠细胞外结构域(ECD)(R&D Systems，目录号6630-GR/Fc)进行三次额外的免疫。在完全弗氏佐剂(Sigma,St Louis,MD,美国)的存在下进行第一次免疫。加入不完全弗氏佐剂(Sigma)用于随后的免疫。在融合前三天，用10μg的rhIGF-1R蛋白增强被免疫的小鼠。然后，分别通过灌注脾脏，和通过切碎(mince)近端淋巴结节制备脾细胞和淋巴细胞，所述细胞从5只被免疫小鼠中的1只(在所有小鼠的血清滴定后选择)中收获，并将其与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞(ATCC,Rockville,MD,美国)融合。Kohler和Milstein描述了融合方案(Nature,256:495-497,1975)。然后，使融合的细胞经受HAT选择。通常，为了制备单克隆抗体或其功能片段(尤其是鼠源的)，能够特别地参考在手册“Antibodies”(Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor NY,第726页,1988)中描述的技术。在融合后约10天，筛选杂交细胞的群落。对于初次筛选，使用人乳腺MCF7肿瘤细胞(ATCC)和/或猴COS7细胞(非洲绿猴肾-SV40转化的)，通过FACS分析，评价杂交瘤上清液中针对IGF-1R ECD蛋白的Mab的分泌，所述猴COS7细胞在其细胞表面上表达猴IGF-1R。更精确地，对于通过流式细胞术的选择，在4℃将105个细胞(MCF7或COS7)铺板至96孔板的每个孔的PBS中，所述PBS含有1％BSA和0.01％叠氮化钠(FACS缓冲液)。在以2000rpm离心2min后，去除缓冲液，并加入待测的杂交瘤上清液。在4℃孵育20min后，将细胞洗涤两次，加入在FACS缓冲液中稀释的Alexa 488-缀合的山羊抗小鼠抗体1/500°(#A11017,Molecular Probes Inc.,Eugene,美国)，并在4℃孵育20分钟。在用FACS缓冲液的最终洗涤后，在以40μg/ml的终浓度向每个试管中加入碘化丙啶后，通过FACS(Facscalibur，Becton-Dickinson)分析细胞。含有单独的细胞的孔和含有与Alexa 488-缀合的二抗孵育的细胞的孔被包含作为阴性对照。在每个实验中使用同种型对照(Sigma,参考号M90351MG)。评价至少5000个细胞，以计算荧光强度的平均值(MFI)。
此外，进行内化分析，以仅选择内化的第二IGF-1R抗体Ab。对于该分析，在实验前，将MCF7肿瘤细胞系在不含酚红的RMPI 1640中培养3天，所述RMPI1640具有1％L-谷氨酰胺和10％FACS。然后，使用胰蛋白酶使细胞分散，并将100μl 4.105个细胞/ml的细胞悬浮液铺板至96多孔板的不含酚红的RPMI1640中，所述RPMI1640具有1％L-谷氨酰胺和5％FBS。在以2000rpm离心2min后，将细胞重新悬浮于50μl的杂交瘤上清液或对照抗体溶液(1μg/ml的阳性和同种型对照)中。在4℃孵育20min后，将细胞以2000rpm离心2min，并重新悬浮于冷的(4℃)或温的(37℃)完全培养介质中。然后，将细胞在37℃或在4℃孵育2小时。然后，用FACS缓冲液将细胞洗涤三次。将Alexa 488标记的山羊抗小鼠IgG抗体孵育20分钟，并将细胞洗涤三次，然后在碘化丙锭阴性细胞群体中进行FACS分析。
在FACS分析后，确定两个参数：(i)在4℃孵育的细胞表面上检测到的荧光信号，与在37℃与一种杂交瘤上清液孵育的细胞获得的荧光信号的差异，和(ii)细胞表面上剩余的IGF-1R的百分比。
剩余的hIGF 1R的百分比计算如下：剩余的IGF-1R％＝(MFI Ab 37℃/MFI Ab 4℃)x100。
此外，进行三次ELISA(在克隆之前或之后)，以研究第二IGF-1R抗体Ab对重组人(hIGF-1R)和鼠(mIGF-1R)蛋白的结合，以及对重组人胰岛素受体(hIR)蛋白的结合。分泌抗体的杂交瘤被保留，所述抗体显示结合至rh-和/或rm-IGF-1R且不结合至rhIR。简言之，用在PBS中的0.6μg/ml的rhIGF-1R蛋白(R&D Systems，目录号391-GR)，或1μg/ml的rmIGF-1R蛋白(R&D Systems，目录号6630-GR/Fc)，或1μg/ml的rhIR蛋白(R&D Systems，目录号1544-IR/CF)，将96孔ELISA板(Costar 3690,Corning,NY,美国)以100μl/孔在4℃包被过夜。然后，用含有0.5％明胶的PBS(#22151,Serva Electrophoresis GmbH,Heidelberg,德国)将板在37℃封闭2小时。当通过摇动板弃去饱和缓冲液后，将100μl的每种上清液稀释液加入至每个孔(未稀释的杂交瘤上清液或上清液系列稀释液)中，并在37℃孵育1h。在洗涤三次后，在37℃，加入在含有0.1％明胶和0.05％吐温20(w:w)的PBS中以1/5000稀释的100μl辣根过氧化物酶缀合的多克隆山羊抗小鼠IgG(#115-035-164,Jackson Immuno-ResearchLaboratories,Inc.,West Grove,PA,美国)，持续1小时。然后，将ELISA板洗涤3次，并加入TMB((#UP664782,Uptima,Interchim,法国)底物。在室温孵育10min后，使用1M硫酸终止反应，并测量450nm处的光密度。
通过有限的稀释扩增和克隆分泌感兴趣的第二IGF-1R抗体Ab的杂交瘤。一旦被同种型化，扩增和冷冻每个编码的一种克隆。在被称作CellLine(Integra Biosciences)的体外生产系统中生产每种感兴趣的第二IGF-1R抗体Ab，用于进一步的表征。
在IM9细胞(表达人IR的B淋巴母细胞)中，以及在hIGF-1R转染细胞中与未转染细胞中，进行解决(address)结合特异性的FACS分析的额外分析。
将对应于选择的第二IGF-1R抗体Ab的所有数据总结于表8中，并且证明了五种选择的第二IGF-1R抗体Ab强烈地识别在MCF-7乳腺癌细胞或转染细胞上表达的天然人IGF-1R。它们还识别COS-7细胞上的猴IGF-1R。这些第二IGF-1R抗体Ab不与在IM9细胞上高表达的人胰岛素受体交叉反应。必须注意，当直接被包被在ELISA板上时，这些第二IGF-1R抗体Ab很差地识别rhIGF-1R ECD蛋白。
实施例5：通过FACS分析的第二IGF-1R抗体Ab与人天然IGF-1R的结合
5种鼠第二IGF-1R抗体Ab是嵌合的。使用增加的抗体浓度，通过在人MCF-7乳腺癌细胞系(ATCC#HTB-22)中进行的FACS分析，评价鼠和嵌合第二IGF-1R抗体Ab的结合性质。为了这个目的，在FACS缓冲液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，将细胞(1x106个细胞/ml)与IGF-1R抗体在4℃孵育20 min。然后将它们洗涤3次，并在暗处与偶联有Alexa 488的合适的二抗在4℃孵育另外20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即在使用碘化丙啶(其将死细胞染色)鉴定的存活细胞上进行第二IGF-1R抗体Ab的结合。由每种抗体获得的信号强度的最大值被设计为Bmax，并以荧光强度的平均值(MFI)表示。使用非线性回归分析(GraphPadPrims 4.0)计算结合的EC50，其以摩尔浓度(M)表示。
每种鼠或嵌合第二IGF-1R抗体Ab的滴定曲线证明，产生的全部抗体都能够以典型的饱和模式(profile)识别天然的IGF-1R形式(图6A)。为了把第二IGF-1R抗体Ab分等级并比较鼠Ab和嵌合Ab的结合性质，使用非线性回归分析确定每种化合物的结合EC50。每种鼠Ab和其相应的嵌合形式的EC50的比较显示，2种形式显示相同的结合性质，表明第二IGF-1R抗体Ab嵌合不影响IGF-1R识别(图6B-C)。嵌合抗体的EC50和Bmax值总结于表9中。
表9
AC Bmax EC50
c208F2 981 6.7E-10
c212A11 991 6.7E-10
c214F8 1069 5.0E-10
c219D6 993 4.7E-10
c213B10 1103 4.4E-10
实施例6：通过使用IGF-1R或IR转染的细胞或IM9细胞的第二IGF-1R抗体Ab特异性 的确认，所述IM9细胞表达显著水平的IR
为了确认所产生的第二IGF-1R抗体Ab对IGF-1R与IR的特异性，通过FACS分析评价表达hIGF-1R或hIR的稳定的转染子。简言之，在FACS缓冲液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，将增加浓度的嵌合第二IGF-1R抗体Ab与细胞在4℃孵育20 min。然后将细胞洗涤3次，并与偶联有Alexa 488的合适的二抗孵育，然后在暗处在4℃孵育另外20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即在使用碘化丙啶(其将死细胞染色)鉴定的存活细胞上进行第二IGF-1R抗体Ab的结合。使用非线性回归分析(GraphPad Prims 4.0)计算结合的EC50，其以摩尔浓度(M)表示。
在hIGH-1R转染的细胞系(图7A)中与在未转染的细胞(图7B)中获得的滴定曲线验证了嵌合第二IGF-1R抗体Ab对人IGF-1R的结合特异性。EC50和Bmax值总结于表10中。
表10
Ac Bmax EC50(M)
c208F2 2008 3.2E-10
c212A11 2513 4.4E-10
c214F8 2094 2.7E-10
c219D6 2521 5.5E-10
c213B10 2029 3.3E-10
为了验证不存在鼠和嵌合第二IGF-1R抗体Ab对hIR的结合，使用了表达人IR(hIR)的稳定的细胞系。通过FACS分析进行鼠和嵌合第二IGF-1R抗体Ab对人细胞表面hIR的识别。在FACS缓冲液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，将增加浓度的鼠或嵌合Ab在hIR+转染的细胞系中在4℃孵育20分钟。然后将细胞洗涤3次，并与偶联有Alexa 488的合适的二抗孵育，然后在暗处在4℃孵育另外20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即在使用碘化丙啶(其将死细胞染色)鉴定的存活细胞上进行第二IGF-1R抗体Ab的结合。使用非线性回归分析(GraphPad Prims 4.0)计算结合的EC50，其以摩尔浓度(M)表示。使用抗hIR抗体克隆GRO5作为阳性对照。引入鼠和嵌合9G4抗体作为不相关的抗体。
使用市售的抗hIR抗体GRO5确认hIR在转染细胞的细胞表面上的高水平表达(图8A和8B)。即使使用高浓度的鼠第二IGF-1R抗体Ab(图8A)或嵌合第二IGF-1R抗体Ab(图8B)，也没有观察到在hIR+转染细胞的细胞表面上的结合。这些结果证明，鼠第二IGF-1R抗体Ab和嵌合第二IGF-1R抗体Ab都不识别hIR。
通过FACS分析，使用IM9细胞(表达hIR的B淋巴瘤细胞系)，还证明了这种hIGF-1R与IR的识别特异性(图9)。对于该FACS分析，方案与上面所描述的方案相同，并且使用鼠第二IGF-1R抗体Ab，以防止第二抗人Ab的交叉反应性(IM9细胞在其细胞表面上表达人Ig)。图9中呈现的结果再次证明，使用GRO5抗hIR抗体观察到预期的信号，而所评价的鼠第二IGF-1R抗体Ab没有一个在该细胞系中显示任何显著的结合信号。
实施例7：通过FACS和Biacore分析的第二IGF-1R抗体Ab抗体与猴天然IGF-1R的结 合
管理毒理学(regulatory toxicology)研究的第一先决条件之一是找到相关的动物种类，以评价所选择的化合物。由于本文所描述的一系列抗体不能识别鼠IGF-1R，因此用于毒理学评价的最可能的物种是非人灵长目动物(NHP)。
为了评价第二IGF-1R抗体Ab对猴IGF-1R的结合，使用增加的抗体浓度，在COS-7细胞系中通过FACS分析首先评价鼠和嵌合第二IGF-1R抗体Ab的结合。在FACS缓冲液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，将细胞(1x106个细胞/ml)与第二IGF-1R抗体Ab在4℃孵育20min。然后将细胞洗涤3次，并与偶联有Alexa 488的合适的二抗孵育，然后在暗处在4℃孵育另外20分钟，最后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即在使用碘化丙啶(其将死细胞染色)鉴定的存活细胞上评价第二IGF-1R抗体Ab的结合。使用非线性回归分析(GraphPad Prims 4.0)计算结合的EC50，其以摩尔浓度(M)表示。
在COS-7猴细胞系中获得的滴定曲线显示，所有第二IGF-1R抗体Ab特异性地识别在猴细胞系的表面上表达的IGF-1R(图5A)。每种鼠和嵌合第二IGF-1R抗体Ab的EC50的测定显示，该2种形式在它们对猴IGF-1R的结合性质方面较为符合(图10B)。这些结果表明，所有产生的第二IGF-1R抗体Ab都识别猴IGF-1R。
进行对COS-7细胞与对转染的IGF-1R细胞的结合EC50的比较，以验证对人IGF-1R与对猴IGF-1R的嵌合抗体识别的量级。图10C中显示的结果证明了所有第二IGF-1R抗体Ab对人IGF-1R和猴IGF-1R的类似的识别。
为了确认对另一种类型的猴的识别，用IGF-1R形式食蟹猴转染细胞，以产生可溶性猴IGF-1R ECD，并用嵌合第二IGF-1R抗体(c208F2)之一进行Biacore实验，以比较其对hIGF-1R或食蟹猴IGF-1R的结合性质。
使用由抗Tag His抗体活化的CM5传感器芯片(His捕获试剂盒GE Healthcare目录号28-9950-56)，在Biacore X100装置上运行识别实验。使用胺试剂盒化学，将超过11000RU的抗体化学接枝到羧甲基葡聚糖基质上。使用HBS-EP缓冲液(GE Healthcare)作为运行和样本稀释缓冲液，以30μl/min的流速在25℃进行实验。使用单周期动力学方案，定义208F2第二IGF-1R抗体的嵌合形式(c208F2)对hIGF-1R相比于对猕猴(Macaca)IGF-1R的结合的动力学参数。
在限定为捕获约160RU抗原的稀释度，将IGF-1R异四聚体的可溶性重组形式的溶液在第二流动池中注射1分钟，所述IGF-1R异四聚体由2α链和2β链的细胞外结构域组成，表达额外的C-末端10-His标签，基于人的序列(R&D Systems目录号305-GR-50)或食蟹猴之一的序列(自制(produced in house))。在捕获阶段后，在两个流动池中，注射运行缓冲液5次(每次注射90秒)，或注射增加范围的5个浓度c208F2(每次注射90秒)。在第五次注射结束时，使运行缓冲液经过(pass)以定义解离速率。
然后，在30s期间注射10mM甘氨酸，HCl pH 1.5缓冲液使表面再生。
计算的信号对应于流动池2的响应(具有捕获的IGF-1R)与流动池1的响应(没有任何IGF-1R分子)之间的差值(图11)。
对于每种IGF-1R分子(人或食蟹猴)，通过减去缓冲液的5次注射获得的信号(双参比)，校正由于增加的浓度范围的c208F2的注射而产生的信号。使用具有1:1模型的Biaevaluation软件分析所得的传感图。独立地(c208F2对每种IGF-1R的结合的2个动力学速率)或共同地(c208F2对人IGF-1R和食蟹猴IGF-1R的结合的相同动力学速率)评价动力学速率。通过低于0.05RU的Chi2/Rmax比例评价拟合的质量。
分别为每种IGF-1R定义的结合的动力学速率(参见表11)是接近的，并且具有相同动力学速率的两张传感图的拟合具有良好的质量。
c208F2抗体同样地识别重组人IGF-1R和食蟹猴IGF-1R，解离常数(KD)为约0.2nM。在本研究中定义的亲和力对应于约160RU的捕获的人IGF-1R和食蟹猴IGF-1R的水平的抗体的功能亲和力(亲合力(avidity))。
表11
IGF1R kon[1/M.s] koff[1/s] Kd[nM] Chi2/Rmax
人 1.52E+06 3.40E-04 0.23 0.045
食蟹猴 1.85E+06 3.10E-04 0.17 0.032
人和食蟹猴 1.52E+06 3.33E-04 0.22 0.039
实施例8：产生的第二IGF-1R抗体Ab对IGF-1R磷酸化的固有作用
众所周知，当抗体结合至酪氨酸激酶受体时，所述抗体可以诱导激动(agonistic)作用。由于我们不希望选择这样的激动剂抗体，因此使用嵌合第二IGF-1R抗体Ab研究hIGF-1R磷酸化的评价。
为了这个目的，将MCF-7细胞在无血清介质中孵育过夜。然后，在37℃将IGF-1(100nM)或待测试的第二IGF-1R抗体Ab加入(10μg/ml)持续10分钟。弃去介质，在裂解缓冲液(pH 7.5)中在4℃将细胞刮擦(scrape)90分钟，所述裂解缓冲液含有10mM Tris HCl缓冲液(pH 7.5)、15％NaCl(1M)、10％去污剂混合物(10mM Tris-HCl，10％Igepal裂解缓冲液)(Sigma Chemical Co.)、5％脱氧胆酸钠(Sigma Chemical Co.)、1蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)完全TM片(Roche)、1％磷酸酶抑制剂混合物II套(Calbiochem)。通过在4℃离心使裂解物澄清，在100℃加热5min，并保持在-20℃，或直接装载在4-12％SDS-PAGE凝胶上。在室温将一抗孵育2hr，然后在室温与连接HRP的二抗孵育1hr。在用ECL使蛋白显现之前，在TBST中洗涤膜。使用Image J软件将印迹定量。用GAPDH将含磷-(phospho-)蛋白值归一化。响应IGF-1的hIGF-1R的磷酸化被认为是100％的刺激。第二IGF-1R抗体Ab对hIGF-1R的磷酸化的作用被确定为由IGF-1诱导的磷酸化的％。
图12中描述的结果表示相比于IGF-1，响应嵌合第二IGF-1R抗体的pIGF-1R的3次独立实验的％的平均值+/-S.D.。如图所示，当MCF-7细胞与10μg抗IGF-1R Ab孵育时，没有检测到显著或微小(<10％)的hIGF-1R的磷酸化。
实施例9：通过鼠第二IGF-1R抗体Ab对响应IGF-1的IGF-1R磷酸化的抑制
为了表征所选择的第二IGF-1R抗体Ab，研究了它们抑制IGF1诱导的磷酸化的能力。为了这个目的，将MCF-7细胞在无血清介质中孵育过夜。然后，将细胞与鼠第二IGF-1R抗体孵育5分钟，然后在37℃加入IGF-1持续2分钟。弃去介质，在裂解缓冲液(pH 7.5)中在4℃将细胞刮擦90分钟，所述裂解缓冲液含有10mM Tris HCl缓冲液(pH 7.5)、15％NaCl(1M)、10％去污剂混合物(10mM Tris-HCl，10％Igepal裂解缓冲液)(Sigma Chemical Co.)、5％脱氧胆酸钠(Sigma Chemical Co.)、1蛋白酶抑制剂混合物完全TM片(Roche)、1％磷酸酶抑制剂混合物II套(Calbiochem)。通过在4℃离心使裂解物澄清，在100℃加热5min，并保持在-20℃，或直接装载在4-12％SDS-PAGE凝胶上。在室温将一抗孵育2h，然后在室温与连接HRP的二抗孵育1hr。在用ECL使蛋白显现之前，在TBST中洗涤膜。使用Image J软件将印迹定量。用GAPDH将含磷-蛋白值归一化。响应IGF-1的hIGF-1R的磷酸化被认为是100％的刺激。抗hIGF-1R Ab对hIGF-1R的磷酸化的作用被确定为由IGF-1诱导的磷酸化的％。
所有第二IGF-1R抗体Ab强烈抑制响应IGF-1的hIGF-1R磷酸化(降低>80％)(图13)。hIGF-1R的IGF1诱导的磷酸化的最佳抑制剂为m208F2、m212A11和m214F8Mab。
实施例10：通过FACS分析研究在结合所产生的第二IGF-1R抗体后IGF-1R的内化
将MCF-7细胞与10μg/ml嵌合抗体在4℃孵育20min。然后，将细胞洗涤，并在4℃或37℃孵育4h。使用二抗确定细胞表面结合的抗体的量。ΔMFI对应于内化的第二IGF-1R抗体Ab的量，所述ΔMFI被定义为4小时孵育时间后在4℃测量的MFI和在37℃测量的MFI之间的差值。ΔMFI呈现于图14和表12中。10μg/ml Ab的内化的百分比计算如下：100*(4℃的MFI–37℃的MFI)/4℃的MFI，并呈现于表12中。
表12
Ab 内化％ ΔMFI ΔMFI_EC50
c208F2 83 288 1.8E-10
c212A11 80 322 2.7E-10
c214F8 87 403 2.2E-10
c219D6 80 353 4.4E-10
c231B10 85 369 2.3E-10
为了确定第二IGF-1R抗体(其也识别猴IGF-1R)是否能够内化该受体，进行相同的内化实验。表13中总结的结果证明，所有经测试的抗体都能够介导猴IGF-1R内化。
表13
进一步评价细胞表面结合抗体减少的动力学。为了这个目的，将MCF-7细胞接种在96孔板中，并与10μg/ml鼠在4℃孵育20min。然后，洗涤细胞以去除未结合的抗体，并在37℃在介质中持续10、20、30、60或120min。在每个时间点，将细胞离心，然后用抗小鼠IgG-Alexa488二抗在冰上进行表面标记，以确定细胞表面上剩余的抗体的量。通过4℃的信号(剩余的IGF-1R的％)将每种鼠Ab和每个时间点的荧光强度归一化，并拟合为指数式衰减以确定半衰期(t 1/2)。t 1/2被认为是获得50％信号减少所需的时间。如图15所阐明，在前30min中所有鼠Ab的表面水平迅速下降，并且在孵育60min后降低几乎是最大的(图15A)。根据鼠Ab计算的半衰期为10至18min之间(图15B)。
为了验证细胞表面信号的降低是由于第二IGF-1R抗体Ab内化而不是由于受体脱落，将细胞与鼠Ab在37℃孵育0、30和60min(图16)。然后，将细胞固定，并通透化或不通透化，以确定细胞表面结合抗体(w/o通透化)和对应于细胞表面结合+内化第二IGF-1R抗体Ab(通透化的)的总抗体信号。内化的第二IGF-1R抗体Ab的量(细胞质)如下确定：通透化后的MFI-w/o通透化的MFI。该实验显示，细胞表面结合的第二IGF-1R抗体Ab的降低是由于细胞质Ab的增加，证明Ab被内化(图16)。此外，如通透化后信号的降低(总计)所示，Ab的降解在孵育1h后开始。
实施例11：通过共聚焦分析研究在结合所产生的第二IGF-1R抗体后IGF-1R的内化
为了进一步确认第二IGF-1R抗体Ab内化，进行共聚焦显微镜，以评价细胞运输(cellular trafficking)后抗体的亚细胞分布。将细胞与抗hIGF-1R Ab在37℃孵育，固定并通透化。因此，使用二抗Alexa-488和兔抗Lamp-1抗体将细胞染色，使用抗兔IgG Alexa555二抗显示所述兔抗Lamp-1抗体。在37℃孵育之前，鼠208F2Ab被定位于MCF-7细胞的膜上(图17A)。使用Image J软件的共定位高亮插件，没有注意到与溶酶体标记物lamp-1的共定位。在37℃孵育15min后，细胞表面结合的抗体显著降低。伴随细胞表面结合的抗体的降低，在囊泡中检测到细胞内抗体。很少观察到与lamp-1的共定位。在孵育30min后，几乎检测不到细胞表面结合的抗体。然而，Ab向溶酶体中的共定位增加。在孵育1h后，细胞内Ab染色降低，并且与lamp-1共定位的数量也降低。这种细胞表面结合的抗体的动力学及其细胞内累积与通过FACS的抗体表面衰变测量的动力学相关。此外，如已经用FACS研究所描述，通过共聚焦显微镜，鼠Ab的降解在孵育1h后开始。
还评价了所有其它第二IGF-1R鼠抗体Ab的内化和它们与Lamp-1的共定位(图17B)。在37℃孵育30min后，检测细胞内抗体，并且可以观察到与lamp-1的共定位，表明所有选择的抗IGF-1R抗体都被有效地内化至溶酶体中。
实施例12：使用溶酶体抑制剂巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)抑制第二IGF-1R抗 体Ab的降解
为了确认第二IGF-1R抗体Ab到达溶酶体(在其中它们被降解)，用巴佛洛霉素A1(一种溶酶体功能的有效抑制剂)处理细胞或不处理细胞。然后，将细胞与10μg/ml待测试的Ab在4℃孵育，洗涤并在37℃孵育2h。在细胞通透化后，使用抗小鼠IgG-Alexa 488Ab二抗检测内化的Ab。巴佛洛霉素A1的加入阻止了细胞内Ab的降解(图18)，表明Ab被有效地内化并在溶酶体中降解。
实施例13：pH对第二IGF-1R抗体Ab-IGF-1R结合的作用
由于第二IGF-1R抗体Ab基于其内化潜力被选择，并且上面显示在进入溶酶体区室之前其与早期胞内体共定位，所以有趣的方法在于选择抗体，其中根据pH环境调节所述抗体的Ab/hIGF-1R结合的稳定性，并且优选当pH环境变为酸性时优先与IGF-1R解离的抗体。事实上，早期胞内体与溶酶体之间的主要区别为它们的腔内pH：在胞内体区室中pH约为6，而在溶酶体区室中pH约为4.5。
众所周知，一旦在配体结合(IGF1)后被内化，hIGF-1R通过回收通路返回至细胞表面。
不通过理论连接，本文所描述的假设为，更倾向于在酸性pH下提前从它们的靶释放的抗体将可能有利于靶回收至膜，因此其可以被认为是ADC方法的更好的候选物。
为了研究产生的第二IGF-1R抗体Ab中的一些是否显示这样的性质，并将该性质与细胞毒活性相关联，在不同pH的缓冲液中进行鼠第二IGF-1R抗体Ab与MCF-7细胞系的结合。在从5至8范围的不同pH下，将增加浓度的鼠mAb在MCF-7细胞系中在4℃孵育20min。然后，将细胞洗涤3次，并在FACS缓冲液中与合适的二抗孵育，所述二抗与Alexa 488偶联。将细胞在4℃在黑暗中孵育另外20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即在使用碘化丙啶(其将死细胞染色)鉴定的存活的细胞上进行抗hIGF-1R抗体的结合。使用非线性回归分析(GraphPad Prims 4.0)计算结合的EC50，其以摩尔浓度(M)表示。如在图19中所阐明，所选择的所有鼠第二IGF-1R抗体Ab在酸性pH下显示较低的结合能力。
在不同pH的缓冲液中进行人源化第二IGF-1R抗体Ab与MCF-7细胞系的结合。在从5至8范围的不同pH下，将增加浓度的人源化mAb在MCF-7细胞系中在4℃孵育20min。然后，将细胞洗涤3次，并在FACS缓冲液中与合适的二抗孵育，所述二抗与Alexa 488偶联。将细胞在4℃在黑暗中孵育另外20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即在使用碘化丙啶(其将死细胞染色)鉴定存活的细胞上进行人源化第二IGF-1R抗体Ab的结合。使用非线性回归分析(GraphPad Prims 4.0)计算结合的EC50，其以摩尔浓度(M)表示。如在图29中所阐明，人源化第二IGF-1R抗体在酸性pH下显示较低的结合能力。
实施例14：208F2 Mab的人源化形式的评价
14.1人源化形式hz208F2 H026/L024(有时也被称作VH3/VL3或变体3)的结合和内化的评价
在MCF-7、COS-7和NIH 3T3IR+细胞系中评价c208F2 mAb的人源化形式的结合。在4℃，在每个细胞系中加入增加浓度的m208F2、c208F2或hz208F2 VH3VL3持续20min。然后，洗涤细胞，并使用相应的二抗显示测试的mAb的结合。为了验证人IR在转染细胞系中的表达，使用市售抗hIR抗体克隆GRO5，其识别模式在(图20D)中示例。
在MCF-7(图20A)细胞或猴COS-7(图20B)细胞中，人源化形式与鼠形式或嵌合形式的比较显示了测试的3种形式的紧密模式。人源化过程不改变抗体识别的特异性，在人胰岛素受体上不存在交叉反应性方面，其完全与鼠形式和嵌合形式可相比(图20C)。
在人细胞系MCF-7和猴细胞系COS-7中208F2的第一人源化形式的计算的EC50与用mAb 208F2的鼠形式或嵌合形式测定的EC50相似。
通过流式细胞术评价mAb hz208F2 H026/L024的内化能力。将MCF-7细胞与10μg/ml抗体在4℃孵育20min。然后，将细胞洗涤，并在4℃或37℃孵育4h。使用二抗确定细胞表面结合的抗体的量。ΔMFI对应于内化的Ab的量，所述ΔMFI被定义为4小时孵育时间后在4℃测量的MFI和在37℃测量的MFI之间的差值。ΔMFI呈现于图21和表14a中。10μg/ml Ab的内化的百分比计算如下：100*(4℃的MFI–37℃的MFI)/4℃的MFI，并呈现于表14a中。因此，人源化的hz208F2 H026/L024(下表中称为VH3/VL3)具有结合和内化性质，所述结合和内化性质与用相应的鼠208F2抗体和嵌合208F2抗体测量的结合和内化性质是相似的。
表14a
14.2随后的hz208F2人源化形式的结合的评价
第二IGF-1R抗体208F2被人源化，并评价十六种人源化变体(包括在12.1中所描述的第一形式)的结合性质。使用增加的抗体浓度，在人MCF-7乳腺腺癌细胞系和猴细胞系Cos-7中，通过FACS分析评价人源化变体的结合性质。为了这个目的，在FACS缓冲液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，将细胞(1x106个细胞/ml)与抗IGF-1R抗体在4℃孵育20min。然后将它们洗涤3次，并在暗处与偶联有Alexa 488的合适的二抗在4℃孵育另外20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即在使用碘化丙啶(其将死细胞染色)鉴定存活的细胞上进行抗IGF-1R抗体的结合。使用非线性回归分析(GraphPad Prims 4.0)计算结合的EC50，其以摩尔浓度(M)表示。
人源化变体的EC50显示，所有的人源化变体在人细胞系和猴细胞系中显示等同的结合性质。
人源化抗体的EC50总结于表14b中。
表14b
14.3另一种hz208F2人源化形式的内化的评价
将MCF-7细胞与10μg/ml人源化抗体在4℃孵育20min。然后，将细胞洗涤，并在4℃或37℃孵育4h。在FacsCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)上，使用二抗确定细胞表面结合的抗体的量。ΔMFI对应于内化的Ab的量，所述ΔMFI被定义为4小时孵育时间后在4℃测量的MFI和在37℃测量的MFI之间的差值。ΔMFI呈现于表14c中。10μg/ml Ab的内化的百分比计算如下：100*(4℃的MFI–37℃的MFI)/4℃的MFI。人源化第二IGF-1R抗体hz208F2H077/L018能够诱导IGF-1R的显著的内化。
表14c
ΔMFI 内化％
hz208F2 H077/L018 468 88
实施例15：五种嵌合抗IGF-1R抗体(c208F2、c213B10、c212A11、c214F8和c219D6) 和208F2抗体的人源化形式(H026/L024)与可溶性重组人IGF-1R结合的解离常数(KD)的定义
通过解离速率(koff)和结合速率(kon)之间的比例定义抗体与重组可溶性人-IGF-1R结合的解离常数(KD)。使用CM5传感器芯片，在Biacore X100装置中运行动力学实验，通过小鼠抗Tag His单克隆抗体活化所述CM5传感器芯片。使用胺试剂盒化学，将约12000RU的抗体化学接枝到羧甲基葡聚糖基质上。
使用HBS-EP+缓冲液(GE Healthcare)作为运行和样本稀释缓冲液，以30μl/min的流速在25℃进行实验。
使用单周期动力学方案，以定义由其两个C端10组氨酸标签捕获的抗IGF-1R抗体与可溶性重组人IGF-1R结合的动力学参数。
1-人IGF-1R异四聚体的可溶性重组形式的溶液：以10μg/ml的浓度，在一分钟期间，在第二流动池中注射表达额外的C-末端10-His标签的2α链和2β链的细胞外结构域(R&DSystems目录号305-GR-50)。在本研究实现的24个周期的每个周期中，捕获平均587RU(具有标准差24RU)的可溶性受体。
2-在捕获阶段后，在两个流动池中，注射运行缓冲液5次(每次注射90秒)，或注射增加范围的5个浓度的六种抗体之一(每次注射90秒)。在第五次注射结束时，在5分钟期间使运行缓冲液经过以定义解离速率。
3-然后，在45s期间注射10mM甘氨酸，HCl pH 1.5缓冲液使表面生成。
计算的信号对应于流动池2的响应(具有捕获的IGF-1R)与流动池1的响应(没有任何IGF-1R分子)之间的差值。
对于每种IGF-1R，通过减去缓冲液的5次注射获得的信号(双参比)，校正由于增加的浓度范围的一种抗体的注射而产生的信号，参见图22。
通过具有1:1模型的Biaevaluation软件分析所得的传感图。
对于每种第二IGF-1R抗体，使用两种不同的浓度范围运行四次实验：对于每个抗体运行，前两个实验为40、20、10、5和2.5nM，后两个实验为24、12、6、3和1.5nM。
对于在该实验中测试的6种第二IGF-1R抗体，当较高的浓度被定义为常数且计算其它四个浓度时，实验数据与具有显著的koff值的1:1模型拟合良好(参见图23)。
作为比例koff/kon计算的解离常数(KD)，和作为比例Ln(2)/koff计算的复合物的半衰期呈现在图24和25中。它们对应于对每种第二IGF-1R抗体运行的四次独立实验的平均值。误差条对应于数值的标准误差(n＝4)。
解离常数在10至100pM的范围内。c208F2抗体呈现对h-IGF-1R的较弱的亲和力(较高的解离常数值)(具有约75pM的KD)，并且其人源化形式至少与嵌合形式一样好(具有约60pM的KD)。其它四种第二IGF-1R嵌合抗体表现出对hIGF1-R的非常相似的亲和力(KD约为30pM)。亲和力的差异主要与复合物的解离速率或所得(resultant)半衰期相关。对于208F2，对于第二IGF-1R嵌合和人源化形式，复合物的半衰期为2至3小时。对于其它四种第二IGF-1R嵌合抗体，平均半衰期为7.0至9.4h。
这些非常慢的解离动力学与抗体的二价结构明显相关，所述二价结构能够通过它们的两个Fab臂同时结合至两个相邻的h-IGF-1R分子。在这种情况下，捕获的IGF-1R分子的水平可能对解离速率产生影响。本研究中定义的亲和力对应于约600RU的捕获的h-IGF-1R的水平的抗体的功能亲和力(或亲合力)。在上面所示的数据(表11)和实施例13中呈现的数值之间观察到的KD的3倍差异与hIGF-1R的捕获水平的变化相关(600RU相比于实施例7中的160RU)。
实施例16：本发明的药物的合成
在以下实施例中使用以下缩写：
aq. 水溶液
ee 对映体过量
equiv 当量
ESI 电喷雾电离
LC/MS 液相色谱与质谱联用
HPLC 高效液相色谱
NMR 核磁共振
sat. 饱和的
UV 紫外线
参考化合物1
(S)-2-((S)-2-((3-氨基丙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)
丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺双三氟乙酸
化合物1A：(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-3-丙酰基-1,3-噁唑烷-2-酮
在惰性气氛中，将(4R,5S)-4-甲基-5-苯基-1,3-噁唑烷-2-酮(5.8g,32.7mmol,1.00equiv)溶解于四氢呋喃(THF,120mL)中。将混合物冷却至-78℃，滴加入正丁基锂(14.4mL)。在-78℃搅拌30分钟之后，加入丙酰氯(5.7mL)。在-78℃持续搅拌30分钟，然后于环境温度过夜。将反应混合物浓缩，然后重新溶解于200mL水中。用碳酸氢钠饱和水溶液调节溶液的pH至7。用100mL乙酸乙酯(EtOAc)萃取该水相3次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩以获得6.8g(89％)黄色油形式的化合物1A。
化合物1B：(2S)-2-[(1R,2R)-1-羟基-2-甲基-3-[(4R,5S)-4-甲基-2-氧代-5-苯基-1,3-噁唑烷-3-基]-3-氧代丙基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
在惰性气氛中，将化合物1A(17.6g,75.45mmol,1.00equiv)溶解于二氯甲烷(DCM,286mL)中。用冰浴冷却该溶液。滴加入三乙胺(TEA,12.1mL,1.15equiv)和Bu2BOTf(78.3mL,1.04equiv)，同时保持反应混合物的温度在2℃以下。在0℃继续搅拌45分钟，之后将反应冷却至-78℃。滴加入(2S)-2-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(8.5g,42.66mmol,0.57equiv)在DCM(42mL)中的溶液。在-78℃继续搅拌2小时，然后在0℃1小时，最后在环境温度1小时。用72mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.2-7.4)和214mL甲醇中和反应，并冷却至0℃。滴加入30％过氧化氢在甲醇(257mL)中的溶液，同时保持温度在10℃以下。在0℃继续搅拌1小时。用142mL水中和反应，然后减压浓缩。用200mL EtOAc萃取所得的水溶液3次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和石油醚的混合物(EtOAc:PE＝1:8)纯化以获得13.16g(40％)无色油形式的化合物1B。
化合物1C：(2R,3R)-3-[(2S)-1-[(叔丁氧基)羰基]吡咯烷-2-基]-3-羟基-2-甲基丙酸
在过氧化氢(水中30％,15.7mL)的存在下，将化合物1B(13.16g,30.43mmol,1.00equiv)溶解于THF(460mL)中，然后用冰浴冷却。滴加入氢氧化锂(0.4mol/L,152.1mL)的水溶液，同时保持反应温度在4℃以下。在0℃搅拌反应混合物2.5小时。滴加入Na2SO3(1mol/L,167.3mL)的水溶液，同时保持温度在0℃。在环境温度搅拌反应混合物14小时，然后用150mL冷的碳酸氢钠饱和溶液中和并用50mL DCM洗涤3次。用1M KHSO4的水溶液调节水溶液的pH至2-3。用100mL EtOAc萃取该水溶液3次。将有机相合并，用饱和NaCl溶液洗涤一次，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩以获得7.31g(88％)无色油形式的化合物1C。
化合物1D：(2R,3R)-3-[(2S)-1-[(叔丁氧基)羰基]吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸
在惰性气氛中在碘甲烷(25.3mL)的存在下将化合物1C(7.31g,26.74mmol,1.00equiv)溶解于THF(135mL)中。用冰浴冷却反应介质，之后分批加入NaH(油中60％,4.28g)。在搅拌下在0℃放置反应3天，然后用100mL碳酸氢钠饱和水溶液中和，并用50mL乙醚洗涤3次。用1M KHSO4的水溶液调节水溶液的pH至3。用100mL EtOAc萃取该水溶液3次。将有机相合并，用100mL Na2S2O3(水中5％)洗涤一次，用NaCl饱和溶液洗涤一次，然后经硫酸钠干燥，过滤和浓缩以获得5.5g(72％)无色油形式的化合物1D。
化合物1E：N-甲氧基-N-甲基-2-苯基乙酰胺
将2–苯乙酸(16.2g,118.99mmol,1.00equiv)溶解于二甲基甲酰胺(DMF,130mL)中，然后冷却至-10℃。加入氰基磷酸二乙酯(DEPC,19.2mL)、甲氧基(甲基)胺盐酸盐(12.92g,133.20mmol,1.12equiv)和三乙胺(33.6mL)。在-10℃搅拌反应混合物30分钟，然后在环境温度2.5小时。然后，用1升EtOAc萃取两次。将有机相合并，用500mL NaHCO3(sat.)洗涤两次，用400mL水洗涤一次，然后经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:3)纯化，以获得20.2g(95％)黄色油形式的化合物1E。
化合物1F：2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙(ethan)-1-酮
在惰性气氛中，将四甲基乙二胺(TMEDA,27.2mL)溶解于THF(300mL)中，然后在滴加入n-BuLi(67.6mL,2.5M)之前冷却至-78℃。滴加入2–溴–1,3–噻唑(15.2mL)并在-78℃继续搅拌30分钟。滴加入溶解于THF(100mL)中的化合物1E(25g,139.50mmol,1.00equiv)。在-78℃继续搅拌30分钟，然后在-10℃2小时。用500mL KHSO4(sat.)中和反应，然后用1升EtOAc萃取3次。将有机相合并，用400mL水洗涤两次，用700mL NaCl(sat.)洗涤两次，然后经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:10)纯化以获得25g(88％)黄色油形式的化合物1F。
化合物1G：(1R)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙-1-醇
在惰性气氛中，将化合物1F(15g,73.8mmol,1.00equiv.)在乙醚(300mL)中的溶液滴加入(+)-B-二异松蒎基氯硼烷((+)–Ipc2BCl,110.8mL)中。在0℃搅拌反应混合物24小时，然后用300mL NaOH(水中10％)和H2O2(水中30％)的混合物(1:1)中和，最后用500mLEtOAc萃取三次。将有机相合并，用300mL K2CO3(sat.)洗涤两次，用500mL NaCl(sat.)洗涤一次，然后经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:20至1:2)纯化以获得6.3g(42％)白色固体形式的化合物1G。
化合物1H：2-[(1S)-1-叠氮-2-苯基乙基]-1,3-噻唑
在惰性气氛中，在三苯基膦(13g,49.56mmol,1.70equiv.)的存在下，将化合物1G(6g,29.23mmol,1.00equiv.)溶解于THF(150mL)中，然后冷却至0℃。滴加入偶氮二羧酸二乙酯(DEAD,7.6mL)，接着滴加入叠氮磷酸二苯酯(DPPA,11mL)，然后移走冷浴，搅拌下在环境温度放置溶液48小时。在减压下浓缩介质。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:30)纯化，以获得8g黄色油形式的部分纯化的化合物1H。化合物1H就这样用于以下步骤。
化合物1I：N-[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲酸叔丁酯
在惰性气氛中，在三苯基膦(6.5g,33.9mmol,1.20equiv)的存在下，将化合物1H(6.5g,28.2mmol,1.00equiv)溶解于THF(100mL)中，并加热至50℃持续2小时。然后加入氨(70mL)并继续加热3小时。将反应冷却，用500mL水中和，然后用500mL EtOAc萃取3次。将有机相合并，用500mL 1N HCl萃取两次。将水相合并，通过加入氢氧化钠溶液(水中10％)调节至pH 8-9，然后用500mL DCM萃取3次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩以获得4.8g(83％)黄色油形式的(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙-1-胺。然后用Boc基团((叔丁氧基)羰基)保护该化合物，以便能够将其纯化。在惰性气氛中，将其溶解于1,4-二氧六环(40mL)中，然后冷却至0℃。滴加入稀释于20mL 1,4-二氧六环中的(Boc)2O(10.26g,47.01mmol,2.00equiv)。移走冷浴，搅拌下在环境温度放置溶液过夜，然后用300mL水中和，并用500mL EtOAc萃取两次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:20，ee＝93％)纯化。然后，将其在己烷/丙酮混合物(～5-10/1,1g/10mL)中重结晶，以获得6g(84％)白色固体形式的化合物1I(ee>99％)。
化合物1J：(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-2-[[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲酰基]乙基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
在惰性气氛中，将化合物1I(3g,9.86mmol,1.00equiv)溶解于10mL DCM中。加入三氟乙酸(TFA,10mL)，搅拌下在环境温度放置溶液过夜，然后在减压下浓缩，以获得2.0g(64％)黄色油形式的(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙-1-胺；三氟乙酸。将该中间体重新溶解于20mL DCM中，然后加入化合物1D(1.8g,6.26mmol,1.05equiv)、DEPC(1.1g,6.75mmol,1.13equiv)和二异丙基乙胺(DIEA,1.64g,12.71mmol,2.13equiv)。在搅拌下在环境温度放置反应混合物过夜，然后减压下浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:3)纯化，以获得2.3g(81％)淡黄色固体形式的化合物1J。
化合物1K：(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺；三氟乙酸
在惰性气氛中，将化合物1J(2.25g,4.75mmol,1.00equiv)溶解于10mL DCM中。加入TFA(10mL)，并在搅拌下在环境温度将溶液放置过夜，然后减压下浓缩，以获得2.18g(94％)黄色油形式的化合物1K。
化合物1L：(2S,3S)-2-(苄基氨基)-3-甲基戊酸
在环境温度，将(2S,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸(98.4g,750mmol,1.00equiv)分批加入至2N氢氧化钠溶液(375mL)中。快速加入苯甲醛(79.7g,751.02mmol,1.00equiv)，将所得溶液搅拌30分钟。分小份加入硼氢化钠(10.9g,288.17mmol,0.38equiv)，同时保持温度在5至15℃。在环境温度继续搅拌4小时。用200mL水稀释反应混合物，然后用200mL EtOAc洗涤两次。用2N盐酸溶液调节水溶液的pH至7。通过过滤收集形成的沉淀，得到149.2g(90％)白色固体形式的化合物1L。
化合物1M：(2S,3S)-2-[苄基(甲基)氨基]-3-甲基戊酸
在惰性气氛中，在甲醛(水中36.5％,22.3g)的存在下，将化合物1L(25g,112.97mmol,1.00equiv)溶解于甲酸(31.2g)中。在90℃搅拌溶液3小时，然后减压下浓缩。将残余物在250mL丙酮中研磨，然后浓缩。用500mL丙酮重复研磨/蒸发操作两次，以获得21.6g(81％)白色固体形式的化合物1M。
化合物1N：(2S,3S)-2-[苄基(甲基)氨基]-3-甲基戊-1-醇
在惰性气氛中，在0℃，将LiAlH4(0.36g)悬浮于10mL THF中。分小份加入化合物1M(1.5g,6.37mmol,1.00equiv)，同时保持温度在0至10℃。在65℃搅拌反应混合物2小时，然后再次冷却至0℃，之后依次加入360μL水、1mL15％氢氧化钠和360μL水中和反应混合物。通过过滤去除沉淀出的铝盐。滤液经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:50)纯化，以获得820mg(58％)淡黄色油形式的化合物1N。
化合物1O：(2S,3S)-2-[苄基(甲基)氨基]-3-甲基戊醛
在惰性气氛中，将草酰基氯(0.4mL)溶解于DCM(15mL)中。将溶液冷却至-70℃，经15分钟滴加入二甲基亚砜(DMSO(0.5mL))在DCM(10mL)中的溶液。将反应混合物搅拌30分钟，之后经15分钟滴加入化合物1N(820mg,3.70mmol,1.00equiv)在DCM(10mL)中的溶液。在低温将反应混合物进一步搅拌30分钟，然后缓慢加入三乙胺(2.5mL)。在-50℃搅拌反应混合物1小时，然后移走冷浴，用25mL水中和反应，同时使温度返回到正常。用30mL NaCl饱和水溶液洗涤溶液一次，然后经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:200)纯化，以获得0.42g(52％)黄色油形式的化合物1O。
化合物1P：(2S,3S)-N-苄基-1,1-二甲氧基-N,3-二甲基戊-2-胺
在0℃，将化合物1O(4.7g,21.43mmol,1.00equiv)溶解于20mL甲醇中。滴加入浓硫酸(4.3mL)，在0℃继续搅拌30分钟。加入原甲酸三甲酯(21.4mL)，移走冷浴，在搅拌下在环境温度放置反应介质3小时。用200mL EtOAc稀释反应介质，依次用100mL 10％Na2CO3和200mL饱和NaCl洗涤，然后经硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩，以获得3.4g(60％)淡黄色油形式的化合物1P。
化合物1Q：[[1-(叔丁氧基)乙烯基]氧基](叔丁基)二甲基硅烷
在惰性气氛中，将二异丙基胺(20g,186.71m mol,1.08equiv)溶解于170mL THF中，并冷却至-78℃。滴加入nBuLi(2.4M,78.8mL)，在低温搅拌溶液30分钟(以获得LDA-二异丙基氨基锂)，然后加入乙酸叔丁酯(20g,172.18mmol,1.00equiv)。在-78℃搅拌反应混合物20分钟，然后加入六甲基磷酰胺(HMPA,25.8mL)，和叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl,28g,185.80mmol,1.08equiv)在35mL THF中的溶液。在低温继续搅拌另外20分钟，然后移走冷浴。减压下浓缩溶液。将残余物重新溶解于100mL水中，并用100mL PE萃取3次。将有机相合并，用500mL NaCl饱和水溶液洗涤一次，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物通过蒸馏纯化，以获得16.6g(83％)无色油形式的化合物1Q。
化合物1R：(3R,4S,5S)-4-[苄基(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯
在惰性气氛中，将化合物1P(2.0g,7.54mmol,1.00equiv)和化合物1Q(2.6g,11.28mmol,1.50equiv)溶解于33mL DCM中。将溶液冷却至0℃。滴加入DMF(1.2g)以及BF3·Et2O(2.1g)在7.5mL DCM中的溶液。在0℃继续搅拌24小时。将反应介质用30mL碳酸钠(10％)洗涤一次，用50mL NaCl饱和水溶液洗涤两次，然后经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100)纯化，以获得1.82g(91％)黄色油形式的化合物1R。
化合物1S：(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲基氨基)庚酸酯盐酸盐
在惰性气氛中，在Pd/C(0.12g)和浓盐酸(0.63mL)的存在下，将化合物1R(2.4g,6.87mmol,1.00equiv)溶解于35mL乙醇中。将氮气氛替换为氢气氛，搅拌下在环境温度放置反应介质18小时。将反应介质过滤和减压浓缩。将残余物在50mL己烷中研磨，移走上清液，之后将上清液减压下干燥，获得1.66g(82％)白色固体形式的化合物1S。
化合物1T：(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(苄氧基)羰基]氨基]-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯
在DIEA(38.3mL)和三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(PyBrOP,32.3g)的存在下，将(2S)-2-[[(苄氧基)羰基]氨基]-3-甲基丁酸(15g,0.40mmol,1.00equiv)溶解于300mL DCM中。在环境温度搅拌溶液30分钟，然后加入化合物1S(15.99g,0.42mmol,1.07equiv)。将反应介质搅拌2小时，然后浓缩。将残余物经反相(C18)用乙腈(ACN)和水的混合物(40分钟内30:70至100:0)纯化，以获得17g(58％)无色油形式的化合物1T。
化合物1U：(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯
在惰性气氛中，在Pd/C(0.05g)的存在下，将化合物1T(76mg,0.15mmol,1.00equiv)溶解于10mL乙醇中。将氮气氛替换为氢气氛，在环境温度搅拌反应2小时。将反应介质过滤，并减压浓缩，以获得64mg无色油形式的化合物1U。
化合物1V：(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸酯
在碳酸氢钠(12.78g,152mmol,3.00equiv)和9H-芴-9-基甲基氯甲酸酯(Fmoc-Cl,19.69g,76mmol,1.50equiv)的存在下，将化合物1U(18.19g,50.74mmol,1.00equiv)溶解于400mL 1,4-二氧六环/水混合物(1:1)中，然后在环境温度搅拌2小时。然后，将反应介质用500mL水稀释，并用200mL EtOAc萃取3次。将有机相合并，用200mL NaCl饱和水溶液洗涤一次,经硫酸钠干燥，过滤和浓缩，以获得40g淡黄色油形式的部分纯化的化合物1V。
化合物1W：(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基]-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸
在中性气氛中，将化合物1V(40g,68.88mmol,1.00equiv)溶解于600mL DCM中。加入TFA(300mL)。在环境温度搅拌溶液2小时，然后减压浓缩。将残余物在硅胶柱上用甲醇和DCM的混合物(1:10)纯化，以获得23.6g(65％)无色油形式的化合物1W。
化合物1X：9H-芴-9-基甲基N-[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-2-[[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲酰基]乙基]吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基]-2-甲基丙基]氨基甲酸酯
在化合物1K(2.18g,4.47mmol,1.00equiv)、DEPC(875mg,5.37mmol,1.20equiv)和DIEA(1.25g,9.67mmol,2.16equiv)的存在下，将化合物1W(2.53g,4.82mmol,1.08equiv)溶解于20mL DCM中。在搅拌下在环境温度放置反应混合物过夜，然后依次用50mL饱和KHSO4和100mL水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用甲醇和DCM的混合物(1:200至1:40)纯化，以获得2.8g(71％)淡黄色固体形式的化合物1X。
化合物1Y：(2S)-2-氨基-N-[(3R,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-2-[[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲酰基]乙基]吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N,3-二甲基丁酰胺
在哌啶(3mL)的存在下，将化合物1X(2.8g,3.18mmol,1.00equiv)溶解于乙腈(ACN,12mL)中，并在搅拌下在环境温度放置18小时。将反应用50mL水中和，然后用100mLDCM萃取两次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用甲醇和DCM的混合物(1:100至1:40)纯化，以获得1.2g(57％)黄色固体形式的化合物1Y。
化合物1ZA：(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]-3-甲基丁酸
在惰性气氛中，在碘甲烷(181mL)的存在下，将(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-甲基丁酸(63g,289.97mmol,1.00equiv)溶解于THF(1000mL)中。将溶液冷却至0℃，然后分小份加入氢化钠(116g,4.83mol,16.67equiv)。在0℃搅拌反应混合物1.5小时，然后移走冷浴并继续搅拌18小时。用200mL水中和反应，然后减压浓缩。用4升水稀释残余的水相，用200mL EtOAc洗涤一次，用1N盐酸溶液调节其pH至3到4。用1.2L EtOAc萃取所得的混合物3次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩，以获得60g(89％)黄色油形式的化合物1ZA。
化合物1ZB：(2S)-2-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]-3-甲基丁酸苄酯
在Li2CO3(15.8g,213.83mmol,1.05equiv)的存在下，将化合物1ZA(47g,203.21mmol,1.00equiv)溶解于DMF(600mL)中。将溶液冷却至0℃，然后滴加入溴苄(BnBr57.9g,338.53mmol,1.67equiv)。将反应混合物在搅拌下放置过夜，然后用400mL水中和并过滤。用500mL EtOAc萃取所得的溶液两次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:100至1:20)纯化，以获得22.5g(34％)黄色油形式的化合物1ZB。
化合物1ZC：(2S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酸苄酯盐酸盐
将化合物1ZB(22.5g,70.00mmol,1.00equiv)溶解于150mL DCM中。气态盐酸鼓泡。在环境温度搅拌反应1小时，然后减压浓缩，以获得17g(94％)黄色固体形式的化合物1ZC。
化合物1ZD：N-(3,3-二乙氧基丙基)氨基甲酸叔丁酯
在TEA(4.45g,43.98mmol,1.08equiv)的存在下，将3,3-二乙氧基戊-1-胺(6g,40.76mmol,1.00equiv)溶解于1,4-二氧六环(30mL)中，然后冷却至0℃。滴加入稀释于20mL1,4-二氧六环中的(Boc)2O(9.6g,43.99mmol,1.08equiv)。将溶液在0℃搅拌2小时，然后在环境温度过夜，然后用10mL水中和。用HCl(1％)调节pH至5。用50mL EtOAc萃取溶液3次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩，以获得8.21g(81％)淡黄色油形式的化合物1ZD。
化合物1ZE：N-(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯
将化合物1ZD(8.20g,33.15mmol,1.00equiv)溶解于18.75mL乙酸中，在搅拌下在环境温度放置过夜。然后，用30mL EtOAc萃取反应介质3次。将有机相合并，用30mL饱和NaCl溶液洗涤3次，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩，以获得5g(87％)暗红色油形式的化合物1ZE。
化合物1ZF：(2S)-2-[(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]丙基)(甲基)氨基]-3-甲基丁酸
在化合物1ZC(3.56g,13.81mmol,1.00equiv)和DIEA(9.16mL,4.00equiv)的存在下，将化合物1ZE(2.4g,13.86mmol,1.00equiv)溶解于50mL THF中。在环境温度搅拌反应混合物30分钟，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(5.87g,27.70mmol,2.00equiv)。继续搅拌过夜，然后用100mL水中和反应，并用50mL EtOAc萃取3次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:4)部分地纯化。在Pd/C(1.2g)的存在下，将所得的粗产品重新溶解于20mL甲醇中，并在标准温度和压力下氢化20分钟。将反应介质过滤，并减压浓缩，以获得200mg(5％)白色固体形式的化合物1ZF。
化合物1ZG：N-(3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-2-[[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲酰基]乙基(thyl)]吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4基](甲基)氨基甲酰基]-2-甲基丙基]氨基甲酰基]-2-甲基丙基](甲基)氨基]丙基)氨基甲酸叔丁酯
在化合物1ZF(26.2mg,0.09mmol,1.20equiv)、DIEA(37.7mL)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU,43.3mg,0.11mmol,1.50equiv)的存在下，将化合物1Y(50mg,0.08mmol,1.00equiv)溶解于2mL DMF中。在环境温度将反应在搅拌下放置过夜，然后用10mL水稀释，并用5mL EtOAc萃取3次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩，以获得100mg部分纯化的无色油形式的化合物1ZG。
在中性气氛中，将化合物1ZG(90mg,0.10mmol,1.00equiv)溶解于2mL DCM中，并用冰浴冷却溶液。加入TFA(1mL)，在环境温度搅拌反应2小时，然后减压浓缩。将残余物通过制备型HPLC(Pre-HPLC-001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在7分钟内18％至31％ACN，然后在2分钟内31％至100％ACN；Waters 2489UV检测器在254nm和220nm处)纯化。获得白色固体形式的化合物1，产率25％(23mg)。
LC/MS/UV(Atlantis T3柱,3μm,4.6×100mm；35℃；1mL/min,水中30％至60％ACN(在6分钟内20mM乙酸铵)；ESI(C44H73N7O6S,精确质量827.53)m/z：829(MH+),5.84min(93.7％,254nm)。
1H NMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体(rotamer))7.85-7.80(m,1H)；7.69-7.66(m,1H),7.40-7.10(m,5H),5.80-5.63(m,1H),4.80-4.65(m,2H),4.22-4.00(m,1H),3.89-0.74(m,58H)。
参考化合物2
(S)-2-((S)-2-(((2-氨基吡啶-4-基)甲基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺，三氟乙酸
化合物2A：(S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
在惰性气氛中，将化合物1D(2.5g,8.70mmol,1.00equiv)和(1S,2R)-2-氨基-1-苯基丙烷-1-醇(1.315g,8.70mmol,1.00equiv)溶解于DMF(35mL)中。将溶液冷却至0℃，然后滴加入DEPC(1.39mL)和TEA(1.82mL)。在0℃搅拌反应混合物2小时，然后在环境温度4小时。用200mL水稀释反应混合物，然后用50mL EtOAc萃取三次。将有机相合并，用50mL KHSO4(1mol/L)洗涤一次，用50mL NaHCO3(sat.)洗涤一次，用50mL NaCl(sat.)洗涤一次，然后经硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩，以获得3.6g(98％)黄色固体形式的化合物2A。
化合物2B：(2R,3R)-N-((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺2,2,2-三氟乙酸盐
在惰性气氛中，将化合物2A(2.7g,6.42mmol,1.00equiv)溶解于DCM(40mL)中，然后冷却至0℃。加入TFA(25mL)，在0℃搅拌溶液2小时。将反应混合物减压浓缩，以获得4.4g黄色油形式的化合物2B。
化合物2C：(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯
在惰性气氛中，将化合物2B(4.4g,10.13mmol,1.00equiv)和1W(5.31g,10.12mmol,1.00equiv)溶解于DCM(45mL)中。将溶液冷却至0℃，然后滴加入DEPC(1.62mL)和DIEA(8.4mL)。在0℃搅拌反应混合物2小时，然后在环境温度过夜。用100mL水稀释反应混合物，并用50mL DCM萃取三次。将有机相合并，用50mL KHSO4(1mol/L)洗涤一次，用50mLNaHCO3(sat.)洗涤一次，用50mL NaCl(sat.)洗涤一次，然后经硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩，以获得3.3g(39％)黄色固体形式的化合物2C。
化合物2D：(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺
在惰性气氛中，将化合物2C(300mg,0.36mmol,1.00eq.)溶解于ACN(2mL)和哌啶(0.5mL)中。在环境温度将溶液搅拌下放置过夜，然后减压蒸发至干。将残余物在硅胶柱上用DCM和MeOH的混合物(1:100)纯化，以获得150mg(68％)白色固体形式的化合物2D。
化合物2E：2-((叔丁氧基羰基)氨基)异烟酸甲酯
将2-氨基吡啶-4-羧酸甲酯(2g,13.14mmol,1.00equiv)溶解于叔丁醇(20mL)中，然后加入二碳酸二叔丁酯(4.02g,18.42mmol,1.40equiv)。在60℃将反应混合物搅拌过夜，然后通过加入1M NaHCO3水溶液(50mL)使反应终止。通过过滤回收固体，用50mL EtOH洗涤，然后经真空干燥，以获得2.5g(75％)白色固体形式的化合物2E。
化合物2F：(4-(羟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯
将化合物2E(2.5g,9.91mmol,1.00equiv)和CaCl2(1.65g)溶解于EtOH(30mL)中。将溶液冷却至0℃，然后逐渐加入NaBH4(1.13g,29.87mmol,3.01equiv)。在环境温度将溶液在搅拌下放置过夜，然后加入水(50mL)使反应终止。用20mL EtOAc萃取混合物三次。将有机相合并，用20mL NaCl(sat.)洗涤两次，然后经硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩，以获得2.0g(90％)无色固体形式的化合物2F。
化合物2G：(4-甲酰基吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯
将化合物2F(2.5g,11.15mmol,1.00equiv)溶解于DCE(25mL)中，然后加入19.4gMnO2(223.14mmol,20.02equiv)。在70℃将混合物在搅拌下放置过夜，然后通过过滤去除固体。将滤液蒸发至干，以获得1.4g(57％)白色固体形式的化合物2G。
化合物2H：(S)-2-(((2-((叔丁氧基羰基)氨基)吡啶-4-基)甲基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酸苄酯
在化合物1ZC(2.93g,11.37mmol,1.10equiv)、DIEA(5.39g,41.71mmol,4.03equiv)和NaBH(OAc)3(4.39g,20.71mmol,2.00equiv)的存在下，将化合物2G(2.3g,10.35mmol,1.00equiv)溶解于25mL THF中。在环境温度将反应混合物搅拌6小时，然后用60mL NaHCO3(sat.)中和，并用20mL AcOEt萃取3次。将有机相合并，用20mL NaCl(sat.)洗涤两次，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:15)纯化，以获得2.7g(61％)白色固体形式的化合物2H。
化合物2I：(S)-2-(((2-((叔丁氧基羰基)氨基)吡啶-4-基)甲基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酸
在Pd/C(250mg)的存在下，将化合物2H(500mg,1.17mmol,1.00equiv)溶解于10mLAcOEt和2mL甲醇中，在环境温度和大气压力下氢化3小时。将反应介质过滤，并减压浓缩，以获得254mg(64％)无色固体形式的化合物2I。
化合物2J：(4-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-仲丁基)-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-3,6-二异丙基-2,8-二甲基-4,7-二氧代-11-氧杂-2,5,8-三氮杂十二烷基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯
以相似于化合物1ZG的方式，在DMF(3mL)中，由胺2D(85.2mg,0.14mmol,1.50equiv)、酸2I(31.7mg,0.09mmol,1.00equiv)、HATU(42.9mg,0.11mmol,1.20equiv)和DIEA(36.7mg,0.28mmol,3.02equiv)制备化合物2J。蒸发至干之后，获得100mg白色固体形式的粗产物。
将化合物2J(100mg,0.11mmol,1.00equiv)溶解于2mL DCM和1mL TFA中。在环境温度将反应搅拌1小时，然后减压浓缩。将残余物(80mg)通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相；0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2489紫外检测器在254nm和220nm处)纯化。获得白色固体形式的化合物2，产率6％(6.3mg)。
LC/MS/UV(Ascentis Express C18柱,2.7μm,4.6×100mm；40℃；1.8mL/min,在6分钟内从10％至95％ACN在水中(0.05％TFA))；ESI(C45H73N7O7,精确质量823.56)m/z：824.5(MH+)和412.9(M.2H+/2,100％),3.21min(99.2％,210nm)。
1H NMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)7.81-7.79(m,1H)；7.39-7.29(m,5H)；6.61-6.59(m,2H)；4.84-4.52(m,1H)；4.32-4.02(m,1H)；3.90-2.98(m,10H)；2.90-2.78(m,1H)；2.55-0.81(m,39H)。
参考化合物3
((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基(吡啶-4-基甲基)氨基)丁酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯，三氟乙酸
化合物3A：(S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
在惰性气氛中，将化合物1D(3g,10.44mmol,1.00equiv)和(S)-2-氨基-3-苯基丙酸甲酯(2.25g,12.55mmol,1.20equiv)溶解于DMF(40mL)中。将溶液冷却至0℃，然后滴加入DEPC(1.67mL,1.05equiv)和TEA(3.64mL,2.50equiv)。在0℃搅拌反应混合物2小时，然后在环境温度过夜。用100mL水稀释反应混合物，然后用50mL EtOAc萃取三次。将有机相合并，用100mL KHSO4(1mol/L)洗涤一次，用100mL NaHCO3(sat.)洗涤一次，用100mL NaCl(sat.)洗涤一次，然后经硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩，以获得4g(85％)无色油形式的化合物3A。
化合物3B：(S)-2-((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯的2,2,2-三氟乙酸盐
在惰性气氛中，将化合物3A(5g,11.15mmol,1.00equiv)溶解于DCM(40mL)中。加入TFA(25mL)，并将溶液搅拌2小时。将反应混合物减压浓缩，以获得8g黄色油形式的化合物3B。
化合物3C：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯
在惰性气氛中，将化合物3B(8.03g,17.36mmol,1.00equiv)和1W(9.1g,17.34mmol,1.00equiv)溶解于DCM(80mL)中。将溶液冷却至0℃，然后滴加入DEPC(2.8mL)和DIEA(12mL)。在0℃将反应混合物搅拌2小时，然后在环境温度过夜。用200mL水稀释反应混合物，并用50mL DCM萃取三次。将有机相合并，用50mL KHSO4(1mol/L)洗涤一次，用50mLNaHCO3(sat.)洗涤一次，用50mL NaCl(sat.)洗涤一次，然后经硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩，以获得5g(34％)黄色固体形式的化合物3C。
化合物3D：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯
在惰性气氛中，将化合物3C(5.5g,6.43mmol,1.00equiv)溶解于四丁基氟化铵(TBAF,2.61g,9.98mmol,1.55equiv)的DMF(100mL)溶液中。在环境温度将溶液搅拌2小时，然后用100mL水稀释，并用50mL EtOAc萃取三次。将有机相合并，然后经硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩，以获得3.3g(81％)黄色固体形式的化合物3D。
化合物3E：(S)-3-甲基-2-(甲基(吡啶-4-基甲基)氨基)丁酸苄酯
在化合物1ZC(2.9g,11.25mmol,1.21equiv)和异丙醇钛(IV)(4.19mL,1.40equiv)的存在下，将吡啶-4-甲醛(1g,9.34mmol,1.00equiv)溶解于10mL 1,2-二氯乙烷(DCE)中。在环境温度将混合物搅拌30分钟，然后加入2.77g NaBH(OAc)3(13.07mmol,1.40equiv)。将反应介质在搅拌下放置过夜，然后用100mL水中和，并用50mL AcOEt将混合物萃取3次。将有机相合并，并蒸发至干。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:20)纯化，以获得1.3g(45％)无色油形式的化合物3E。
化合物3F：(S)-3-甲基-2-(甲基(吡啶-4-基甲基)氨基)丁酸
在Pd/C(300mg)的存在下，将化合物3E(800mg,2.56mmol,1.00equiv)溶解于30mLAcOEt中，并在环境温度和大气压力下氢化3小时。将反应介质过滤，并减压浓缩。将残余物在硅胶柱上用DCM和MeOH的混合物(100:1至5:1)纯化，以获得100mg(18％)白色固体形式的化合物3F。
将化合物3D(50mg,0.08mmol,1.00equiv)和3F(26.34mg,0.12mmol,1.50equiv)溶解于3mL DCM中。将溶液冷却至0℃，然后加入0.018mL DEPC和0.0392mL DIEA。在0℃将反应搅拌2小时，然后在环境温度过夜。将反应介质减压浓缩，并将残余物(70mg)通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2545紫外检测器在254nm和220nm处)纯化。获得白色固体形式的化合物3，产率27％(20mg)。
LC/MS/UV(Ascentis Express C18柱,2.7μm,4.6×100mm；40℃；1.5mL/min,在8分钟内10％至95％ACN在水中(0.05％TFA))；ESI(C46H72N6O8,精确质量836.5)m/z：837.5(MH+)和419.4(M.2H+/2(100％)),7.04min(90.0％,210nm)。
1H NMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)8.76-8.74(m,2H)；8.53-8.48(m,0.4H,NHCO不完全的交换)；8.29-8.15(m,0.8H,NHCO不完全的交换)；8.01(s,2H),7.31-7.22(m,5H),4.88-4.68(m,3H)；4.31-4.07(m,2H)；3.94-2.90(m,18H)；2.55-0.86(m,38H)。
参考化合物4
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基(吡啶-4-基甲基)氨基)丁酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸，三氟乙酸
将化合物3(100mg,0.11mmol,1.00equiv)溶解于水(5mL)、ACN(5mL)和哌啶(2.5mL)的混合物中。将反应混合物在搅拌下放置过夜，然后减压浓缩。将残余物通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2545紫外检测器在254nm和220nm处)纯化，以获得20mg(20％)白色固体形式的化合物4。
LC/MS/UV(Ascentis Express C18柱,2.7μm,4.6×100mm；40℃；1.5mL/min,在8分钟内10％至95％ACN在水中(0.05％TFA))；ESI(C45H70N6O8,精确质量822.5)m/z：823.5(MH+)和412.4(M.2H+/2,100％),6.84min(89.1％,210nm)。
1H NMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)8.79-8.78(m,2H)；8.09(m,2H)；7.30-7.21(m,5H)；4.80-4.80(m,1H),4.36-0.87(m,58H)。
参考化合物6
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-氨基丙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯，双三氟乙酸
化合物6A：(2S)-2-[(2R)-2-[(R)-[(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]丙基)(甲基)氨基]-3-甲基丁酰胺基]-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基]吡咯烷-2-基](甲氧基)甲基]丙酰胺基]-3-苯基丙酸甲酯
在0℃，在惰性气氛中，在羧酸1ZF(78.7mg,0.27mmol,1.10equiv)、DEPC(46μl)和DIEA(124μl)的存在下，将化合物3D(157.5mg,0.25mmol,1.00equiv)溶解于3mL DCM中。在低温将反应混合物搅拌2小时，然后移走冷浴，并继续搅拌4小时。然后减压浓缩，以获得200mg粗黄色油形式的化合物6A。其就这样用于以下步骤。
在惰性气氛中，在0℃将化合物6A(200mg,0.22mmol,1.00equiv)溶解于2mL DCM中。滴加入TFA(1mL)，移走冷浴。在环境温度将反应混合物搅拌1小时，然后减压浓缩。将残余物通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2489紫外检测器在254nm和220nm处)纯化，以获得60mg(26％，2个步骤的产率)白色固体形式的化合物6。
LC/MS/UV(Zorbax Eclipse Plus C8,3.5μm,4.6×150mm；1mL/min,40℃,在18分钟内30至80％甲醇在水中(0.1％H3PO4))；ESI(C43H74N6O8,精确质量802.56)m/z：804(MH+)；11.50min(91.5％,210nm)。
1H NMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)8.52(d,0.3H,NHCO不完全的交换)；8.25(d,0.5H,NHCO不完全的交换)；7.30–7.22(m,5H)；4.9–4.6(m,3H)；4.2–4.0(m,1H)；4.0–0.86(m,61H)。
参考化合物7
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-氨基丙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸，双三氟乙酸
将化合物6(70mg,0.08mmol,1.00equiv)溶解于水(5mL)、ACN(2.5mL)和哌啶(5mL)的混合物中。在环境温度将反应混合物在搅拌下放置过夜，然后减压浓缩。将残余物通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；UV Waters 2489紫外检测器在254nm和220nm处)纯化，以获得14.6mg(21％)白色固体形式的化合物7。
LC/MS/UV(Ascentis Express C18,2.7μm,4.6×100mm；1.5mL/min,40℃,在8分钟内0至80％甲醇在水中(0.05％TFA))；ESI(C42H72N6O8,精确质量788.54)m/z：790(MH+),5.71min(96.83％,210nm)。
1H NMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)8.42(d,0.3H,NHCO不完全的交换)；8.15(d,0.2H,NHCO不完全的交换)；7.31–7.21(m,5H)；4.9–4.6(m,3H)；4.25–4.0(m,1H)；4.0–0.86(m,59H)。
化合物11
(S)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基(4-(甲基氨基)苯乙基)氨基)丁酰胺基)丁酰胺，三氟乙酸
化合物11A：N-[4-(2-羟乙基)苯基]氨基甲酸叔丁酯
将二碳酸二叔丁酯(16.7g,77mmol,1.05eq.)加入至2-(4-氨基苯基)乙醇(10g,72.9mmol,1eq.)的THF(200mL)溶液中，并将反应在环境温度搅拌过夜。将混合物用EtOAc(200mL)稀释，用水(200mL)洗涤，然后用1M HCl(100mL)洗涤，然后用饱和NaHCO3水溶液(100mL)洗涤，然后用盐水(100mL)洗涤。将有机相用MgSO4干燥，然后减压蒸发至干。将粗产物用庚烷(150mL)研磨两次，并在真空中干燥，以得到为白色固体的化合物11A(14.7g，84％)。
化合物11B：N-[4-(2-氧代乙基)苯基]氨基甲酸叔丁酯
将化合物11A(2.5g,10.5mmol,1.00equiv)溶解于25mL DCM中，然后冷却至-78℃。滴加入DCM(10mL)中的戴斯-马丁高碘烷溶液(DMP,6.71g,15.8mmol,1.5equiv)。移走冷浴，在环境温度继续搅拌1小时。用60mL碳酸氢钠饱和水溶液和Na2S2O3饱和水溶液的50/50混合物中和反应。用30mL EtOAc萃取所得溶液3次。将有机相合并，用NaCl饱和水溶液洗涤两次，经无水硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩。残余物经硅胶纯化(EtOAc/PE 1/15)，以获得1.0g(40％)淡黄色固体形式的化合物11B。
化合物11C：(2S)-2-[[2-(4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]苯基)乙基](甲基)氨基]-3-甲基丁酸苄酯
在DIEA(6.4g,49.7mmol,4.0equiv)、醛11B(2.9g,12.3mmol,1.0equiv)和三乙酰氧基硼氢化钠(5.23g,49.7mmol,2.0equiv)的存在下，将化合物1ZC(3.5g,13.6mmol,1.1equiv)溶解于THF(30mL)中。在环境温度将反应混合物在搅拌下放置过夜，然后用60mL碳酸氢钠饱和溶液中和。用30mL EtOAc将所得的溶液萃取3次。将有机相合并，用NaCl饱和水溶液洗涤两次，经无水硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩。残余物经硅胶纯化(EtOAc/PE 1:20)，以获得3.7g(68％)黄色油形式的化合物11C。
化合物11D：(2S)-2-[[2-(4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]苯基)乙基](甲基)氨基]-3-甲基丁酸
在Pd/C(2g)的存在下，将化合物11C(2g,4.5mmol,1equiv)溶解于10mL甲醇中，并在标准温度和压力下氢化2小时。将反应介质过滤，并减压浓缩，以获得1.2g(75％)黄色油形式的化合物11D。
化合物11E：(2S)-2-[[2-(4-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]苯基)乙基](甲基)氨基]-3-甲基丁酸
在惰性气氛中，将化合物11D(1.2g,3.4mmol,1.00equiv)溶解于THF(20mL)中。用冰浴冷却反应介质，然后分批加入NaH(在油中的60％,549mg,13.7mmol,4.0equiv)，接着加入碘甲烷(4.9g,34mmol,10equiv)。在环境温度将反应在搅拌下放置过夜，然后用水中和，并用100mL EtOAc洗涤。用1N HCl调节水溶液的pH至6-7。用100mL EtOAc将该水溶液萃取3次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩，以获得800mg(64％)黄色固体形式的化合物11E。
化合物11F：N-[4-(2-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-2-[[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基甲酰基]乙基]吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4基](甲基)氨基甲酰基]-2-甲基丙基]氨基甲酰基]-2-甲基丙基](甲基)氨基]乙基)苯基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯
以相似于化合物6A的方式，由胺1Y(150mg,0.22mmol,1.2equiv)和酸11E(70mg,0.19mmol,1.0equiv)制备化合物11F。经硅胶(EtOAc/PE 1:1)纯化之后，获得100mg(52％)淡黄色固体形式的期望的产物。
以相同于化合物1的方式，由中间体11F(100mg,0.1mmol)制备化合物11。将残余物通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2489紫外检测器在254nm和220nm处)纯化。获得白色固体形式的化合物11，产率39％(39.7mg)。
LC/MS/UV(Eclipse Plus C8,3.5μm,4.6×150mm；1mL/min,40℃,在18分钟内50至95％甲醇在水中(0.05％TFA))；ESI(C50H77N7O6S,精确质量903.57)m/z：904.5(MH+),7.53min(93.68％,254nm)。
1H NMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)8.84(d,0.5H,NHCO不完全的交换)；8.7–8.5(m,0.9H,NHCO不完全的交换)；7.76–7.73(m,1H)；7.55-7.4(m,1H)；7.28–7.22(m,7H)；7.08–7.05(m,2H)；5.51–5.72(m,1H)；4.9–4.80(m,2H)；4.3–0.7(m,60H)。
化合物12
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基(4-(甲基氨基)苯乙基)氨基)丁酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯，三氟乙酸
以合成化合物1最后阶段的相同方式，由胺3D(118mg,0.19mmol)和酸11E(82mg,0.22mmol)经两步骤制备化合物12。将最终残余物通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2489紫外检测器在254nm和220nm处)纯化。获得白色固体形式的化合物12，产率7％(13.7mg)。
LC/MS/UV(Eclipse Plus C8,3.5μm,4.6×150mm；1mL/min,40℃,在18分钟内40至95％甲醇在水中(0.05％TFA))；ESI(C49H78N6O8,精确质量878.59)m/z：879.7(MH+),10.07min(90.6％,254nm)。
1H:NMR(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)7.40(se,2H)；7.38–7.22(m,7H)；4.95–4.7(m,3H)；4.2–4.0(m,1H)；3.9–0.86(m,62H)。
化合物13
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基(4-(甲基氨基)苯乙基)氨基)丁酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸，三氟乙酸
以相同于化合物7的方式，由化合物12(100mg,0.10mmol)制备化合物13。将残余物通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2489紫外检测器在254nm和220nm处)纯化。获得白色固体形式的化合物13，产率20％(20mg)。
LC/MS/UV(Ascentis Express C18,2.7μm,4.6×100mm；1.5mL/min,40℃,在8分钟内10至95％甲醇在水中(0.05％TFA))；ESI(C48H76N6O8,精确质量864.57)m/z：865.6(MH+),6.05min(90.9％,210nm)。
1H NMR:(300MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)7.32–7.19(m,9H)；4.9–4.65(m,3H)；4.2–4.0(m,1H)；3.9–0.86(m,59H)。
化合物14
(S)-2-((S)-2-((3-氨基苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺，三氟乙酸
化合物14A：(3-(羟甲基)苯基)氨基甲酸叔丁酯
将(3-氨基苯基)甲醇(3g,24.36mmol,1.00equiv)溶解于THF(60mL)中，然后加入二碳酸二叔丁酯(6.38g,29.23mmol,1.20equiv)。在环境温度将反应混合物在搅拌下放置过夜，然后加入200mL水稀释反应。用100mL AcOEt将产物萃取3次，然后将有机相重新合并，经硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩，以获得黄色油形式的粗产物(13.85g化合物14A)。
化合物14B：(3-甲酰基苯基)氨基甲酸叔丁酯
将化合物14A(13.8g,61.81mmol,1.00equiv)溶解于DCE(400mL)中，然后加入MnO2(54g,621.14mmol,10.05equiv)。在环境温度将混合物在搅拌下放置3天，然后通过过滤去除固体。将滤液蒸发至干，将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:30)纯化，以获得3g(22％)白色固体形式的化合物14B。
化合物14C：(S)-2-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酸苄酯
在化合物1ZC(1.16g,4.50mmol,1.00equiv)、DIEA(3mL)和NaBH(OAc)3(1.92g,9.06mmol,2.01equiv)的存在下，将化合物14B(1g,4.52mmol,1.00equiv)溶解于20mL THF中。在环境温度将反应混合物在搅拌下放置过夜，然后用100mL水中和，并用50mL AcOEt萃取3次。将有机相合并，经硫酸钠干燥，过滤和浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:50)纯化，以获得1.9g(99％)白色固体形式的化合物14C。
化合物14D：(S)-2-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酸
在Pd/C(400mg)的存在下，将化合物14C(1g,2.34mmol,1.00equiv)溶解于30mLAcOEt和4mL甲醇中，在环境温度和大气压力下氢化1小时。将反应介质过滤，并减压浓缩，以获得680mg(86％)白色固体形式的化合物14D。
化合物14E：(3-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-仲丁基)-3,6-二异丙基-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-2,8-二甲基-4,7-二氧代-11-氧杂-2,5,8-三氮杂十二烷基)苯基)氨基甲酸叔丁酯
以相同于化合物3的方式，在DCM(3mL)中，由胺1Y(100mg,0.15mmol,1.00equiv)、酸14D(102.27mg,0.30mmol,2.00equiv)、DEPC(0.053mL)和DIEA(0.046mL)合成化合物14E。将粗产物(80mg)在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:1)纯化，以获得100mg(67％)淡黄色固体形式的化合物14E。
以相同于化合物2的方式，由中间体14E(100mg,0.10mmol,1.00equiv)合成化合物14。将粗产物(80mg)通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2545紫外检测器在254nm和220nm处)纯化。获得白色固体形式的化合物14，产率10％(10mg)。
LC/MS/UV(Eclipse plus C8柱,3.5μm,4.6×150mm；40℃；1.0mL/min,在18分钟内40％至95％MeOH在水中(0.05％TFA))；ESI(C48H73N7O6S,精确质量875.5)m/z：876.5(MH+)和438.9(M.2H+/2,100％),11.35min(95.6％,210nm)。
1H NMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)8.92-8.86(m,0.4H,NH不完全的交换)；8.70-8.54(m,0.6H,NH不完全的交换)；7.88-7.78(m,1H)；7.60-7.50(m,1H)；7.45-6.97(m,9H)；5.80-5.65(m,1H)；4.85-4.70(m,1H)；4.40-0.80(m,56H)。
化合物15
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-氨基苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯，三氟乙酸
化合物15A：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((叔丁氧羰基)氨基)苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸甲酯
以相同于化合物3的方式，在DCM(5mL)中，由胺3D(200mg,0.32mmol,1.00equiv)、酸14D(212.6mg,0.63mmol,2.00equiv)、DEPC(0.1103mL)和DIEA(0.157mL,3.00equiv)合成化合物15A。将粗产物在硅胶柱上用EtOAc和PE的混合物(1:1)纯化，以获得200mg(67％)黄色固体形式的化合物15A。
化合物15：以相同于化合物2的方式，由中间体15A(200mg,0.21mmol,1.00equiv)合成化合物15。将粗产物通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2545紫外检测器在254nm和220nm处)纯化。获得白色固体形式的化合物15，产率19％(38.6mg)。
LC/MS/UV(Ascentis Express C18柱,2.7μm,4.6×100mm；40℃；1.5mL/min,在8分钟内10％至95％MeOH在水中(0.05％TFA))；ESI(C47H74N6O8,精确质量850.5)m/z：851.5(MH+)和426.4(M.2H+/2,100％),6.61min(91.1％,210nm)。
1H NMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)7.53-7.42(m,1H)；7.35-7.18(m,8H)；4.88-4.79(m,2H)；4.42-4.00(m,3H)；3.93-2.71(m,22H)；2.61-0.81(m,33H)。
化合物20
(S)-2-((S)-2-((4-氨基苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺，三氟乙酸
以相同于化合物1的方式，由胺1ZC和相应的醛制备化合物20。
在化合物20的制备中涉及的4-硝基苯甲醛是市售的。
通过还原硝基完成化合物20的合成。该合成如下进行：将(2S)-N-[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-[[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基]-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N,3-二甲基-2-[(2S)-3-甲基-2-[甲基[(4–硝基苯基)甲基]氨基]丁酰胺基]丁酰胺(40mg,0.05mmol,1.0equiv)溶解于15mL乙醇中。加入二水合的氯化锡(II)(317mg,1.4mmol,30equiv)，在环境温度将溶液在搅拌下放置3天。将反应用50mL水中和，然后用50mL EtOAc萃取三次。将有机相合并，经无水硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩，以获得粗品状态的化合物20(纯度：93.2％；量：21.6mg)。
将化合物通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2489紫外检测器在254nm和220nm处)纯化，以获得白色固体形式的对应的TFA盐。
1H NMR:(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)7.85–7.80(m,1H)；7.6–7.5(m,1H)；7.4–7.15(m,5H)；7.1–7.05(m,2H)；6.73–6.70(m,2H)；5.8–5.55(m,1H)；5.0–4.7(m,2H)；4.25–4.05(m,1H)；4.0–0.8(m,54H)。LC/MS/UV ESI:(C48H73N7O7S,精确质量875.53)m/z876(MH+),439[75％,(M.2H+)/2]；UV:RT＝4.83min(96.8％,254nm)。1H NMR(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)7.85–7.80(m,1H)；7.6–7.5(m,1H)；7.4–7.1(m,7H)；6.76–6.72(m,2H)；5.8–5.55(m,1H)；4.9–4.65(m,2H)；4.25–4.05(m,1H)；4.0–0.8(m,54H)。
化合物29
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-氨基苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸，三氟乙酸
将化合物15(100mg,0.10mmol,1.00equiv)溶解于水(5mL)、ACN(5mL)和哌啶(2.5mL)的混合物中。在环境温度将反应混合物在搅拌下放置过夜，然后减压浓缩。将残余物通过制备型HPLC(Pre–HPLC–001SHIMADZU,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×150mm；洗脱相：0.05％TFA缓冲的水/ACN；梯度在10分钟内20％至40％ACN，然后在2分钟内40％至100％ACN；Waters 2545紫外检测器在254nm和220nm处)纯化，以获得20mg(20％)白色固体形式的化合物29。
LC/MS/UV(Eclipse Plus C8柱,3.5μm,4.6×150mm；40℃；1.0mL/min,在18分钟内40％至95％MeOH在水中(0.05％TFA))；ESI(C46H72N6O8,精确质量836.54)m/z:837.5(MH+)和419.4(M.2H+/2,100％),10.61min(92.5％,210nm)。
1H NMR:(400MHz,CD3OD,ppm):δ(存在旋转异构体)7.38-7.15(m,6H)；7.00-6.99(m,3H)；4.85-4.68(m,2H)；4.37-3.38(m,11H)；3.31-2.70(m,8H)；2.60-0.82(m,35H)。
化合物61
(S)-2-((S)-2-((4-氨基苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺
化合物61A：N-(4-氨基苯乙基)-N-甲基-L-缬氨酸二盐酸盐
将化合物11D(962mg,2.75mmol)溶解于10mL市售可得的HCl在丙-2-醇中的溶液(5-6M)中，并在室温搅拌2小时。TLC分析表明起始原料被消耗完全。将溶剂减压蒸发，并用Et2O(2×10ml)研磨所得的黄色固体。将产物真空干燥，以得到为黄色固体的化合物61A(322mg,47％)。
化合物61：将羧酸61A(73mg,0.23mmol,1eq.)和胺1Y(150mg,0.23mmol,1eq.)溶解于干燥DMF(2ml)中。加入DIEA(158μl,0.90mmol,4eq.)和DECP(也称为DEPC)(51μl,0.34mmol,1.5eq.)，并在室温将反应搅拌4小时。LC-MS分析表明起始原料被消耗完全。将溶剂减压蒸发，并将残余物在硅胶上通过闪式色谱法(DCM/MeOH)纯化，以得到为淡黄色固体的化合物61(83mg,40％)。
1H NMR:(500MHz,DMSO-d6,ppm):δ(存在旋转异构体),8.86(d,0.5H,NHCO)；8.65(d,0.5H,NHCO),8.11-8.05(m,1H,NHCO),7.80(d,0.5H,噻唑),7.78(d,0.5H,噻唑),7.65(d,0.5H,噻唑),7.63(d,0.5H,噻唑),7.32–7.12(m,5H),6.83(d,J＝8.3Hz,2H),6.45(d,J＝8.3Hz,2H),5.56–5.49(m,0.5H),5.42–5.35(m,0.5H),4.78(s,2H,NH2),4.74–4.46(m,2H),4.01–0.66(m,57H)。
HPLC(Xbridge Shield C18,3.5μm,4.6×50mm；3.5ml/min,40℃,在2.25分钟内0至95％MeCN在水中(0.1％TFA)，然后95％MeCN持续0.5分钟,Tr＝1.31min(96.5％,220nm)。
m/z(Q-TOF ESI+)890.5558(2％,MH+,C49H76N7O6S要求890.5572),445.7834(100％,(MH2)2+,C49H77N7O6S要求445.7823)。
化合物62
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-氨基苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸甲酯
以相同于化合物61的方式，使用羧酸61A(69mg,0.21mmol,1eq.)、胺3D(135mg,0.21mmol,1eq.)、DIEA(75μl,0.43mmol,2eq.)和DECP(49μl,0.32mmol,1.5eq.)制备化合物62。将粗产物在硅胶上通过闪式色谱法(DCM/MeOH)纯化，以得到为黄色固体的化合物62(82mg,45％)。
1H NMR:(500MHz,DMSO-d6,ppm):δ(存在旋转异构体),8.50(d,J＝8.3,0.5H,NHCO)；8.27(d,J＝8.0,0.5H,NHCO),8.15-8.04(m,1H,NHCO),7.27–7.13(m,5H),6.86–6.79(m,2H),6.48–6.42(m,2H),4.78(s,2H,NH2),4.74–4.44(m,3H),4.01–3.72(m,1.5H),3.66(s,1.5H,CO2Me),3.63(s,1.5H,CO2Me),3.57-0.65(m,55.5H)。
HPLC(Xbridge Shield C18,3.5μm,4.6×50mm；3.5ml/min,40℃,在2.25分钟内0至95％MeCN在水中(0.1％TFA)，然后95％MeCN持续0.5分钟,Tr＝1.29min(95.3％,220nm)。
m/z(Q-TOF ESI+)865.5800(2％,MH+,C48H77N6O8要求865.5797),433.2937(100％,(MH2)2+,C48H78N6O8要求433.2935)。
化合物63
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-氨基苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸2,2,2-三氟乙酸盐
将化合物62(23mg,0.03mmol)溶解于水(1ml)和乙腈(1ml)的混合物中。加入哌啶(0.75ml)，并在室温将混合物搅拌5小时。TLC分析表明起始原料被完全消耗。将溶剂减压蒸发，并将残余物通过制备型HPLC(SunFire Prep柱C18 OBD,5μm,19×150mm；流动相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在10分钟内20％至40％MeCN，然后在2分钟内40％至100％MeCN；紫外检测器Waters2545在254nm和220nm处)纯化。获得为白色固体的化合物63(14mg,66％)。
1H NMR:(500MHz,DMSO-d6,ppm):δ(存在旋转异构体),12.7(s(br),1H,CO2H),9.58(m(br),1H)；9.04–8.89(m,1H),8.41(d,0.6H,NHCO),8.15(d,0.4H,NHCO),7.27–7.13(m,5H),7.13–6.99(m(br),2H),6.90–6.64(s(br),2H),4.77–3.40(m,10H),3.34–2.75(m,20H),2.34–1.94(m,4H),1.90–0.7(m,25H)。
HPLC(Xbridge Shield C18,3.5μm,4.6×50mm；3.5ml/min,40℃,在2.25分钟内0至95％MeCN在水中(0.1％TFA)，然后95％MeCN持续0.5分钟,Tr＝1.24min(100％,220nm)。
m/z(Q-TOF ESI+)851.5641(6％,MH+,C47H75N6O8要求851.5641),426.2854(100％,(MH2)2+,C47H76N6O8要求426.2857)。
实施例17：药物的抗增殖活性
方法：
细胞培养。将A549(非小细胞肺癌-ATCC CCL-185)和MDA-MB-231(乳腺腺癌–ATCCHTB-26)细胞分别培养于含有5％胎牛血清(FCS)的最低必需介质Eagle(MEM)和含有10％FCS的Dulbecco改良的Eagle介质(DMEM)中。将MCF7(乳腺导管癌–ATCC HTB-22)和SN-12C(肾癌–ATCC)细胞维持在含有10％FCS的RPMI1640介质中(对于MCF7细胞没有酚红)。所有的介质均补充有两性霉素(1.25μg/mL)和青霉素-链霉素(100U/100μg/mL)。在标准条件下在孵育器中在37℃、5％CO2和95％大气湿度下培养细胞。
对4种肿瘤细胞系的抗增殖活性。使用ATPlite增殖试验(Perkin Elmer，Villebonsur Yvette，法国)在4种细胞系的综合组中考察所选择的药物的抗增殖活性。在第0天将细胞接种于96孔板上(对于A549为103细胞/孔，对于MCF7、MDA-MB-231和SN12C为2.103)，其浓度能够保证细胞在72h药物处理期处于对数细胞生长期。在24h孵育期之后，将所有细胞用系列稀释的受试化合物处理(11μL 10X在1％DMSO中的溶液-6孔/条件)。为了避免化合物粘附到枪头(tip)上，在两个连续稀释之间更换枪头。然后，将细胞放置在37℃、5％CO2孵育器中。在第4天，通过计量(dose)活细胞释放的ATP评价细胞活力。与溶剂处理的细胞的数量相比，分析活细胞的数量。使用曲线拟合分析(具有S形剂量响应的非线性回归模型，可变斜率系数)确定EC50值，使用由GraphPad Software(GraphPad Software Inc.,CA,美国)提供的算法进行所述曲线拟合分析。
结果：
各种药物：
依据上述的方法，测试各种药物，以确定它们在MDA–MB–231细胞系中的抗增殖活性。测量的活性给出EC50<0.1μM的值。
选自上面示例药物的数个以下的示例阐明了它们完全显著的抗增殖性质：
实施例12：EC50＝5.80×10-10M；实施例13：EC50＝7.95×10-8M；实施例15：EC50＝1.70×10-10M；实施例27：EC50＝1.20×10-10M。
各种细胞系：
依据上面所描述的方法，在不同的细胞系(A549、MDA–MB–231、MCF-7、SN12C)中测试化合物15。测量的活性在所有测试的细胞系中给出了EC50<0.1μM的值。
EC50(M) A549 MDA-MB-231 MCF-7 SN12C
化合物15 1.45x10-10 1.70x10-10 7.15x10-10 2.18x10-10
对比实施例：
在下面对比实施例中研究了苯环上的取代(氨基与羧基)，显示包含氨基取代基的根据本发明的药物的改善的抗增殖活性。
实施例18：药物-接头部分的合成
化合物E-11
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-7,10-二异丙基-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,11-二甲基-6,9-二氧代-2-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-基)苯基)(甲基)氨基甲酸酯2,2,2-三氟乙酸盐
化合物E-11-1：(S)-2-氨基-5-脲基戊酸甲酯盐酸盐
在0℃，在搅拌下将乙酰氯(10mL)滴加至MeOH(120mL)中。在20分钟后，加入L-瓜氨酸(10g，57mmol，1.00eq.)，并将混合物加热回流过夜。减压蒸发溶剂，以获得15g(116％)为白色固体的化合物E-11-1。产物不经进一步干燥用于下一个步骤。
化合物E-11-2：(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸甲酯
在惰性气氛中，在0℃，将化合物E-11-1(13g,57.6mmol,1.1eq.)溶解于DMF(140mL)中。加入DIEA(30mL,173mmol,3.0eq.)、羟基苯并三唑(HOBt-10.59g,69.1mmol,1.2eq.)和Boc-L-缬氨酸羟基琥珀酰亚胺酯(Boc-Val-OSu-18.1g,57.6mmol,1.0eq.)。将反应混合物在环境温度搅拌过夜，然后减压蒸发溶剂。将残余物溶解于水(100mL)中，并用DCM(150mL)萃取两次。合并有机相，用Na2SO4干燥，并减压浓缩。将残余物在硅胶上纯化(DCM/MeOH)，以获得18.8g(84％)为白色固体的化合物E-11-2。
化合物E-11-3：(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺)-5-脲基戊酸
在0℃，将化合物E-11-2(18.8g,48.4mmol,1eq.)溶解于MeOH(200mL)中。加入1MNaOH溶液(72mL,72mmol,1.5eq.)，并将混合物在室温搅拌2小时。减压除去MeOH，并使用1MHCl将残余的水溶液酸化。将水相蒸发至干，并将残余物在硅胶上纯化(DCM/MeOH)，以获得18g(99％)为白色固体的化合物E-11-3。
化合物E-11-4：((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯
将化合物E-11-3(5g,13.4mmol,1eq.)溶解于干燥DCM(65ml)和干燥MeOH(35ml)的混合物中。加入(4-氨基苯基)甲醇(1.81g,14.7mmol,1.1eq.)和N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ-6.60g,26.7mmol,2eq.)，并将混合物在暗处搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并将残余物在硅胶上纯化(DCM/MeOH)，以获得5.2g(73％)为灰白色固体的化合物E-11-4。
化合物E-11-5：((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯
在惰性气氛中，在环境温度，将化合物E-11-4(1.1g,2.29mmol,1eq.)溶解于干燥DMF(5mL)中。加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(1.40g,4.59mmol,2eq.)，然后加入DIEA(600μl,3.44mmol,1.5eq.)，并将所得的黄色溶液搅拌过夜。减压蒸发DMF，并将残余物在硅胶上纯化(DCM/MeOH)，以获得1.27g(84％)为灰白色固体的化合物E-11-5。
化合物E-11-6：4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-7,10-二异丙基-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,11-二甲基-6,9-二氧代-2-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-基)苯基)(甲基)氨基甲酸酯2,2,2-三氟乙酸盐
将碳酸酯E-11-5(114mg,0.177mmol,1.2eq.)和苯胺11F(150mg,0.147mmol,1eq.)溶解于干燥DMF(4mL)中。加入HOBt(38mg,0.295mmol,2eq.)和DIEA(54μL,0.295mmol,2eq.)，并将混合物在室温搅拌过周末。减压蒸发DMF，并将残余物通过闪式色谱法在硅胶上纯化，用DCM洗脱。通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)将产物重新纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物E-11-6(89mg，39％)。
化合物E-11：
将化合物E-11-6(21mg,0.014mmol,1.0eq.)溶解于DCM(0.25mL)中，并加入TFA(40μL)。将溶液在室温搅拌2小时，然后，LC-MS分析表明起始材料完全消耗。将混合物短暂冷却(液氮浴)，同时加入DMF(0.5mL)，然后加入DIEA(100μL)以中和TFA。然后移除冷却浴，并加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(4mg,0.012mmol,1eq.)。将混合物在室温搅拌48小时，并通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFirePrep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)将产物纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物E-11(11mg,54％)。
m/z(Q-TOF MS ESI+)1524.8282(2％,MNa+,C79H115N13NaO14S要求1524.8299),751.9283(100％,(MH2)2+,C79H117N13O14S要求751.9276)。
化合物E-12
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐
化合物E-12-1：((S)-3-甲基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-1-((4-((((全氟苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-5-脲基戊烷-2-基)氨基)丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯
在惰性气氛中，在0℃，将化合物E-11-4(670mg,1.26mmol,1eq.)溶解于干燥DMF(6mL)中。加入双(全氟苯基)碳酸酯(991mg,2.51mmol,2eq.)，然后加入DIEA(329μl,1.89mmol,1.5eq.)，并将所得的无色溶液在室温搅拌30分钟。减压蒸发DMF，并将残余物在硅胶上纯化(DCM/MeOH)，以获得836mg(96％)为灰白色固体的化合物E-12-1。
化合物E-12-2：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐
在惰性气氛中，在0℃，将苯胺12(165mg,0.189mmol,1.0eq.)溶解于DMF(5mL)中。加入碳酸酯E-12-1(194mg,0.282mmol,1.5eq.)、HOBt(51mg,0.375mmol,2eq.)和DIEA(66μL,0.375mmol,2eq.)，并将混合物在室温搅拌8小时。减压蒸发溶剂，并通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)将残余物纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物E12-7(247mg,77％)。
化合物E-12-3：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯双(2,2,2-三氟乙酸盐)
将化合物E-12-2(5.6mg,4.04μmol,1.0eq.)溶解于TFA(100μL)中。在5分钟之后，加入2ml水，并将混合物冻干过夜，以获得为灰白色固体的化合物E-12-3(5.6mg,98％)。
化合物E-12：
将化合物E-12-3(5.6mg,4μmol,1.0eq.)溶解于乙腈(0.5mL)中，并加入DIEA(5μL,7eq.)，然后加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(2.5mg,8μmol,2eq.)。将混合物在室温搅拌6小时。在通过LC-MS控制反应后，加入200μL水，并通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)将所得的溶液纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物E-12(4.6mg,70％)。
m/z(Q-TOF MS ESI+)739.4389(100％,(MH2)2+,C78H118N12O16要求739.4389)。
化合物E-13
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸盐
化合物E-13-1：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸
在室温，将化合物E-12-2(185mg,0.123mmol,1.0eq.)溶解于水(5mL)和乙腈(5mL)的混合物中。加入哌啶(3.67mL,300eq.)，并将混合物在室温搅拌6小时。将溶剂减压蒸发至干，并将残余物用Et2O(60mL)研磨。将固体用Et2O(20ml)冲洗两次，并真空干燥，以获得为灰白色固体的化合物E-13-1(175mg,95％)。
化合物E-13-2：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸双(2,2,2-三氟乙酸盐)
将化合物E-13-1(175mg,0.128mmol,1.0eq.)溶解于TFA(200μL)中。在5分钟之后，加入水(1ml)和乙腈(1ml)，并将溶液冻干过夜，以获得为灰白色固体的化合物E-13-2(180mg,87％)。
化合物E-13：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸盐
将化合物E-13-2(80mg,0.058mmol,1.0eq.)溶解于乙腈(1.5mL)和DMF(0.4mL)的混合物中。加入DIEA(50μL,0.289mmol,5eq.)，然后加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(36mg,0.116mmol,2eq.)。将混合物在室温搅拌3小时。在通过LC-MS控制反应之后，减压蒸发溶剂，并通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFirePrep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)将残余物纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物E-13(32mg,35％)。
m/z(Q-TOF MS ESI-)1461.8336(100％,(M-H)-,C77H113N12O16要求1461.8403)。m/z(Q-TOF MS ESI+)1463.8565(2％,MH+,C77H115N12O16要求1463.8549),732.4317(100％,(MH2)2+,C77H116N12O16要求732.4311)。
化合物E-15
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐
化合物E-15-1：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐
根据与化合物E-11-6相同的方法，在DMF(2mL)中使用碳酸酯E-11-5(28mg,0.044mmol,1eq.)、苯胺15(42mg,0.044mmol,1eq.)、HOBt(3mg,0.022mmol,0.5eq.)和DIEA(15μL,0.087mmol,2eq.)制备化合物E-15-1。分离到为白色固体的化合物E-15-1(8.2mg,13％)。
化合物E-15-2：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯双(2,2,2-三氟乙酸盐)
将化合物E-15-1(8.2mg,5.58μmol,1.0eq.)溶解于TFA(200μL)中。在5分钟之后，加入水(1ml)，并将溶液冻干过夜，以获得为白色固体的化合物E-15-8(7.6mg,99％)。
化合物E-15：
根据与化合物E-12相同的方法，在乙腈(0.5mL)中使用胺E-15-2(7.6mg,5.55μmol,1eq.)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(2mg,6.65μmol,1.2eq.)和DIEA(5μL,0.028mmol,5eq.)制备化合物E-15。分离到为白色固体的化合物E-15(4.2mg,48％)。
m/z(Q-TOF MS ESI+)1471.8169(2％,MNa+,C76H112N12NaO16要求1471.8211),725.4223(100％,(MH2)2+,C76H114N12O16要求725.4232),483.9482(10％,(MH3)3+,C76H115N12O16要求483.9513)。
化合物F-13
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸盐
化合物F-13-1：N-(4-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)苯乙基)-N-甲基-L-缬氨酸苄酯
将化合物11C(250mg,0.567mmol,1eq.)溶解于THF(10ml)中，然后加入NaH(在矿物油中的60％混悬液，68mg，1.702mmol，3eq.)。将混合物搅拌5分钟，然后加入碘甲烷(106μL,1.702mmol,3eq.)。将反应在室温搅拌2小时，然后用水淬灭，并在EtOAc(100mL)和水(50mL)之间分离。将有机相用MgSO4干燥，并蒸发至干，以获得黄色油状物化合物F-13-1(250mg，97％)，其不作进一步纯化而使用。
化合物F-13-2：N-甲基-N-(4-(甲基氨基)苯乙基)-L-缬氨酸苄酯
将Boc-保护的苯胺F-13-1(250mg,0.550mmol,1eq)溶解于MeOH(5mL)中，然后加入1mL市售可得的HCl在iPrOH中的溶液(5-6M)。将溶液在室温搅拌2小时，然后减压蒸发至干。将所得的黄色油状物用Et2O研磨，以获得为黄色固体的化合物F-13-2(202mg，94％)。
化合物F-13-3：N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)-N-甲基-L-缬氨酸苄酯
将酸E-11-3(190mg,0.508mmol,1.5eq.)溶解于干燥DMF(1ml)中，然后加入DIEA(118μL,0.677mmol,2eq.)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP-264mg,0.508mmol,1.5eq.)和苯胺F-13-2(120mg,0.339mmol,1eq.)。将混合物在室温搅拌过夜，并减压蒸发溶剂。通过制备型HPLC(Waters600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters2487在220nm处)将残余物纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物F-13-3(140mg,45％)。
化合物F-13-4：N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)-N-甲基-L-缬氨酸
在Pd/C 10％(30mg)的存在下，将化合物F-13-3(116mg,0.163mmol,1eq.)溶解于MeOH(5ml)中，并在环境温度和大气压下氢化2小时。将反应介质过滤，并减压浓缩，以获得110mg(99％)为米色固体的化合物F-13-4。
化合物F-13-5：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐
将胺3D(89mg,0.140mmol,1eq.)和酸F-13-4(145mg,0.210mmol,1.5eq.)溶解于干燥DMF(4mL)中，并加入PyBOP(109mg,0.210mmol,1.5eq.)和DIEA(73μL,0.420mmol,3eq.)。将混合物在室温搅拌1小时，并蒸发溶剂。在EtOAc和水之间分离残余物，并将有机相用MgSO4干燥，过滤并减压蒸发。通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters2487在220nm处)将粗产物纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物F-13-5(140mg,73％)。
化合物F-13-6：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸盐
将化合物F-13-5(140mg,0.104mmol,1eq.)溶解于水(4mL)、乙腈(4mL)和哌啶(2mL)的混合物中，并在室温搅拌4小时。减压蒸发溶剂，并通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)将残余物纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物F-13-6(115mg,83％)。
化合物F-13：
根据与化合物E-11相同的方法制备化合物F-13，在DCM(0.5mL)和TFA(100μL,30eq.)中使用Boc-保护的胺F-13-6(55mg,0.041mmol,1.0eq.)，然后用DMF(1mL)稀释，用DIEA(320μL,45eq)淬灭，然后与2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(15mg,0.049mmol,1.2eq.)反应。在通过制备型HPLC纯化并冻干后，获得为白色固体的化合物F-13(14mg,24％)。
m/z(Q-TOF MS ESI+)1314.8067(2％,MH+,C69H108N11O14要求1314.8072),657.9067(100％,(MH2)2+,C69H109N11O14要求657.9072)。
化合物F-61
N-((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-7,10-二异丙基-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,11-二甲基-6,9-二氧代-2-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺2,2,2-三氟乙酸盐
化合物F-61-1：N-(4-氨基苯乙基)-N-甲基-L-缬氨酸苄酯二盐酸盐
将化合物11C(1.0g,2.27mmol,1eq.)溶解于8mL市售可得的HCl在iPrOH中的溶液(5-6M)中。将混合物在室温搅拌2小时，然后减压蒸发至干。将残余物用Et2O(30ml)研磨两次，并真空干燥，以获得为白色固体的化合物F-61-1(916mg,98％)。
化合物F-61-2：N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)-N-甲基-L-缬氨酸苄酯
将酸E-11-3(769mg,2.05mmol,1.5eq.)溶解于干燥DMF(2.5ml)中，然后加入DIEA(957μL,5.48mmol,4eq.)和PyBOP(1.07g,2.05mmol,1.5eq.)。加入苯胺F-61-1(566mg,1.369mmol,1eq.)，并将混合物在室温搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并将残余物在硅胶上纯化(DCM/MeOH)，以获得969mg(102％)为白色固体的化合物F-61-2。
化合物F-61-3：N-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)-N-甲基-L-缬氨酸
在Pd/C 10％(270mg)的存在下，将化合物F-61-2(969mg,1.28mmol,1eq.)溶解于MeOH(20ml)中，并在环境温度和大气压下氢化3小时。将反应介质过滤，并减压浓缩，并将残余物在硅胶上纯化(DCM/MeOH/AcOH)，以获得520mg(67％)为白色固体的化合物F-61-3。
化合物F-61-4：((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-7,10-二异丙基-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,11-二甲基-6,9-二氧代-2-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯2,2,2-三氟乙酸盐
将酸F-61-3(67.5mg,0.111mmol,1.5eq.)溶解于干燥DMF(2mL)中，并加入DECP(17μL,0.111mmol,1.5eq.)和DIEA(39μL,0.223mmol,3eq.)。在室温搅拌15分钟后，加入胺1Y(50mg,0.074mmol,1eq.)，并将溶液搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并通过制备型HPLC(Waters600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)将残余物纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物F61-4(28mg,28％)。
化合物F-61-5：(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-仲丁基)-7,10-二异丙基-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-5,11-二甲基-6,9-二氧代-2-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-基)苯基)-5-脲基戊酰胺双(2,2,2-三氟乙酸盐)
将化合物F-61-4(28mg,0.021mmol,1.0eq.)溶解于TFA(200μL)中。在5分钟之后，加入水(2ml)和乙腈(0.5ml)，并将溶液冻干过夜，以获得为无色油的化合物F-61-5(38mg,134％)。
化合物F-61：
将化合物F-61-5(28.3mg,0.020mmol,1eq.)溶解于乙腈(0.5mL)中，然后加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(9mg,0.029μmol,1.4eq.)和DIEA(25μL,0.143mmol,7eq.)。将混合物搅拌4.5小时，然后HPLC分析显示存在起始材料，但琥珀酰亚胺被完全消耗。因此，加入补充的2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(3mg,0.01μmol,0.5eq.)，并将反应搅拌1.5小时。HPLC分析显示起始材料被完全消耗。将溶剂蒸发至干，并将残余物用EtOAc/Et2O(80/20)的混合物研磨两次，以获得为灰白色固体的化合物F-61(19.4mg,70％)。
m/z(Q-TOF MS ESI+)1361.7725(2％,MNa+,C70H106N12NaO12S要求1361.7666),670.3961(100％,(MH2)2+,C70H108N12O12S要求670.3960)。
化合物F-62：
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐
化合物F-62-1：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐
以类似于化合物F-61-4的方式，在DMF(2mL)中，由胺3D(100mg,0.158mmol,0.9eq.)、酸F-61-3(108mg,0.178mmol,1eq.)、DECP(41μL,0.267mmol,1.5eq.)和DIEA(93μL,0.534mmol,3eq.)制备化合物F-62-1。在通过制备型HPLC纯化后，获得为白色固体的化合物F-62-1(93mg,39％)。
化合物F-62-2：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯双(2,2,2-三氟乙酸盐)
将化合物F-62-1(35mg,0.026mmol,1.0eq.)溶解于TFA(200μL)中。在10分钟之后，加入水(2ml)和乙腈(0.5ml)，并将溶液冻干过夜，以获得为白色固体的化合物F-62-2(34mg,105％)。
化合物F-62：
将胺F-62-2(34mg,5.55μmol,1eq.)溶解于乙腈(3mL)中。加入DIEA(5μL,0.028mmol,5eq.)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(2mg,6.65μmol,1.2eq.)。HPLC分析显示起始材料被完全消耗。将溶剂蒸发至干，并将残余物用EtOAc/Et2O(80/20)的混合物研磨。通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFire PrepC18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters2487在220nm处)将粗产物纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物F-62(5.5mg,13％)。
m/z(Q-TOF MS ESI+)1336.7859(2％,MNa+,C69H107N11NaO14要求1336.7891),657.9073(100％,(MH2)2+,C69H109N11O14要求657.9072)。
化合物F-63：
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸盐
化合物F-63-1：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸
将化合物F-62-1(157mg,0.118mmol,1eq.)溶解于水(4.5mL)、乙腈(4.5mL)和哌啶(3.5mL)的混合物中，并在室温搅拌5小时。将溶剂减压蒸发，并将残余物用Et2O(60mL)研磨。通过过滤收集固体，并将其用Et2O(10ml)冲洗两次，以获得为灰白色固体的化合物F-63-1(153mg,100％)。
化合物F-63-2：((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸双2,2,2-三氟乙酸盐
将化合物F-63-1(153mg,0.127mmol,1.0eq.)溶解于TFA(200μL)中。在10分钟之后，加入水(2ml)和乙腈(0.5ml)，并将溶液冻干过夜，以获得为白色固体的化合物F-63-2(34mg,105％)。
化合物F-63：
将胺F-63-2(100mg,0.082mmol,1eq.)溶解于乙腈(2mL)和DMF(0.5mL)的混合物中，并加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(45mg,0.147mmol,1.8eq.)和DIEA(71μL,0.409mmol,5eq.)。在室温搅拌4.5小时后，减压蒸发溶剂。通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)将粗产物纯化。将选择的级分合并和冻干，然后以得到为白色固体的化合物F-63(42mg,36％)。
m/z(Q-TOF MS ESI+)1300.7901(2％,MH+,C68H106N11O14要求1300.7915),650.8990(100％,(MH2)2+,C68H107N11O14要求650.8994)。
化合物G-12
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐
化合物G-12-1：N-(4-氨基苯乙基)-N-甲基-L-缬氨酸苄酯二盐酸盐
将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(200mg,0.947mmol,1eq.)溶解于草酰基氯(3mL)中。将溶液在室温搅拌5小时，然后减压蒸发至干。获得为米色固体的化合物G-12-1(217mg,100％)，并且其不经纯化而用于下一个步骤。
化合物G-12：
在0℃，将苯胺12(40mg,0.045mmol,1eq.)溶解于干燥DCM(1mL)中，并加入DIEA(8μL,0.045mmol,1eq.)。在搅拌30分钟后，引入化合物G-12-1(10mg,0.45mmol,1eq.)在干燥DCM(1mL)中的溶液，并将反应在0℃搅拌1小时。将混合物用DCM(25ml)稀释，并用水(20mL)洗涤两次，用盐水(10mL)洗涤一次。将有机相用Na2SO4干燥，过滤并减压蒸发，以获得为浅棕色固体的粗产物(54mg)。将其通过闪式色谱法在硅胶上纯化(DCM/MeOH)，然后通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度经15分钟5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)纯化。将分离的产物冻干，以获得白色固体(23mg)，将其通过制备型HPLC重新纯化，并将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物G-12(9mg,16％)。
m/z(Q-TOF MS ESI+)1094.6543(20％,MNa+,C59H89N7NaO11要求1094.6512),1072.6722(16％,MH+,C59H90N7O11要求1072.6693),536.8358(100％,(MH2)2+,C59H91N7O11要求536.8383)。
化合物G-13
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰胺基)苯乙基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸2,2,2-三氟乙酸盐
化合物G-13：
在0℃，将苯胺13(15mg,0.015mmol,1eq.)溶解于干燥DCM(1.5mL)中，并加入DIEA(8μL,0.046mmol,3eq.)。引入化合物G-12-1(3.5mg,0.046mmol,1eq.)在干燥DCM(0.5mL)中的溶液，并将反应在0℃搅拌1.5小时。减压蒸发溶剂，并通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)将粗产物纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物G-13(11.4mg,62％)。
m/z(Q-TOF MS ESI+)1058.6510(30％,MH+,C58H88N7O11要求1058.6536),529.8285(100％,(MH2)2+,C58H89N7O11要求529.8305)。
化合物G-15
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)苄基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐
化合物G-15：
在0℃，将苯胺15(40mg,0.047mmol,1eq.)溶解于干燥DCM(2mL)中，并加入DIEA(10μL,0.056mmol,1.2eq.)。引入化合物G-12-1(108mg,0.47mmol,10eq.)在干燥DCM(1mL)中的溶液，并将反应在0℃搅拌1.5小时。将混合物用DCM(10ml)稀释，并用水(5mL)洗涤两次。将有机相用MgSO4干燥，过滤并减压蒸发，以获得为米色固体的粗产物。通过制备型HPLC(Waters 600E,SunFire Prep C18 OBD柱,5μm,19×100mm；洗脱相：0.1％TFA缓冲的水/MeCN；梯度在15分钟内5％至100％MeCN；紫外检测器Waters 2487在220nm处)将其纯化。将选择的级分合并和冻干，以得到为白色固体的化合物G15(27mg,50％)。
m/z(Q-TOF MS ESI+)1066.6517(2％,MNa+,C57H85N7NaO11要求1066.6199),522.8224(100％,(MH2)2+,C57H87N7O11要求522.8226)。
实施例19：ADC的合成、纯化和表征
以下所描述的程序适用于嵌合IgG1形式和人源化IgG1形式。必须理解，对于任何其它形式，例如IgG2、IgG4等，本领域技术人员能够使用一般知识以改变该程序。
在37℃，用10mM硼酸盐缓冲液(pH 8.4)中的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)将第二IGF-1R抗体(1-5mg/ml)部分地还原2h，所述硼酸盐缓冲液含有150mM NaCl和2mM EDTA。典型地，使用2.5-3摩尔当量的TCEP，以分别靶向约4的药物-抗体比例(DAR)。在非还原条件下，通过SDS-PAGE分析确认部分抗体还原。在将接头-药物偶联至释放的链间半胱氨酸残基之前，允许将还原混合物冷却至室温。然后，用10mM硼酸盐缓冲液(pH 8.4)将抗体浓度调节至1mg/ml，所述硼酸盐缓冲液含有150mM NaCl和2mM EDTA，并从二甲基亚砜(DMSO)中的10mM溶液中加入相比于抗体5摩尔过量的药物。将最终的DMSO浓度调节至10％，以在偶联期间维持药物在水性介质中的溶解度。将反应在室温进行1h。通过加入1.5摩尔N-乙酰半胱氨酸每摩尔药物，并在室温孵育1小时，以淬灭药物过量。在4℃对含有150mM NaCl的25mM His缓冲液(pH 6.5)透析过夜后，通过使用本领域技术人员已知的方法纯化抗体-药物-缀合物，所述方法基于市售的色谱柱和超滤单元。首先，通过在S200(GE Life Sciences)或TSKG3000SW(Tosoh)柱上的尺寸排阻色谱法(SEC)，除去未偶联的药物和ADC聚集体。然后，通过在30或50kDa MWCO过滤单元上的超滤，或通过在蛋白A上的亲和色谱法，将纯化的ADC单体浓缩至2-3mg/ml。在0.2μm过滤器上无菌过滤后，将纯化的ADC储存于4℃。在还原条件和非还原条件下，通过SDS-PAGE进一步分析它们，以确认药物缀合，并通过在分析型S200或TSKG3000SWXL柱上的SEC进一步分析它们，以确定单体和聚集形式的含量。通过使用以IgG作为标准的二喹啉甲酸(BCA)分析，确定蛋白浓度。通过HIC和LC-MS估计每种纯化的ADC的DAR。典型地，聚集形式的含量低于5％，并且DAR为3.5至5。
实施例20：与不同药物偶联的IGF-1R抗体的细胞毒性评价
20.1嵌合第二IGF-1R抗体在MCF-7细胞中的评价
已显示五种第二IGF-1R抗体被快速内化至溶酶体中，并且在酸性环境中具有较低的结合能力。在这方面，那些第二IGF-1R Ab具有用作ADC的所有性质。因此，将五种嵌合抗IGF-1R抗体与三种不同的化合物(G-13；E-13和F-63)偶联。这些ADC的药物抗体比例约为4。为了评价非特异性细胞毒性，还将不相关的嵌合抗体c9G4与那些化合物以相同的DAR偶联。在完全培养介质中，将MCF-7细胞与增加浓度的每种ADC在37℃孵育6天。使用荧光细胞活力分析(CellTiter-Glo，Promega)评价细胞活力。使用Mithras读板器(BertholdTechnologies)读取荧光信号。与E-13、G-13或F-63偶联的不相关的嵌合抗体c9G4在MCF-7细胞中不显示细胞毒活性，或显示温和的细胞毒活性(图26)。相反，在将第二IGF-1R抗体与E-13、G-13或F-63偶联后获得的所有其它的ADC的加入显著降低MCF-7细胞活力。
20.2嵌合第二IGF-1R抗体在正常细胞中的评价
使用c208F2 mAb，在原代正常细胞(PromoCell GmbH)中评价IGF-1R的表达水平。为了这个目的，在FACS缓冲液(PBS,0.1％BSA,0.01％NaN3)中，将细胞(0.5x106个细胞/ml)与10μg/ml c208F2抗体在4℃孵育20min。然后将它们洗涤3次，并在暗处与偶联有Alexa488的合适的二抗在4℃孵育另外20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即在使用碘化丙啶(其将死细胞染色)鉴定存活的细胞上进行第二IGF-1R抗体的结合。相比于在MCF-7细胞中的IGF-1R表达(参见实施例5，表9)，在正常细胞中的表达水平(Bmax)是低的(表15)。
表15
正常细胞 Bmax
人主动脉内皮细胞(HAoEC) 21
人肺微血管内皮细胞(HPMEC) 33
人支气管平滑肌细胞(HBSMC) 26
人肾上皮细胞(HREpC) 110
人尿路上皮细胞(HUC) 181
在正常细胞中评价ADC c208F2-G-13的细胞毒性。在完全培养介质中，将细胞与增加浓度的c208F2-G-13在37℃孵育6天。使用荧光细胞活力分析(CellTiter-Glo，Promega)评价细胞活力。使用Mithras读板器(Berthold Technologies)读取荧光信号。在HBSMC、HPMEC、HAoEC和HREpC中，没有观察到较大的细胞毒性(图30)。在HUC中，仅在高浓度的c208F2-G-13处测量到较小的细胞毒性。
20.3 hz208F2的人源化变体的评价
将208F2的十六种人源化变体与化合物G-13偶联。这些ADC的药物抗体比例约为4。为了评价非特异性细胞毒性，还将不相关的嵌合抗体c9G4与那些化合物以相同的DAR偶联。还将嵌合抗体c208F2与G-13偶联。在完全培养介质中，将MCF-7细胞与增加浓度的每种ADC在37℃孵育6天。使用荧光细胞活力分析(CellTiter-Glo，Promega)评价细胞活力。使用Mithras读板器(Berthold Technologies)读取荧光信号。与G-13偶联的不相关的嵌合抗体c9G4在MCF-7细胞中不显示细胞毒活性，或显示温和的细胞毒活性(图31)。相反，在将抗IGF-1R抗体与G-13偶联后获得的所有其它的ADC的加入显著降低MCF-7细胞活力。十六种人源化变体诱导细胞毒性的能力至少等于甚至优于用嵌合形式c208F2-G-13测量的能力，如表16所示，并且在图31中用一种人源化变体所阐明。
表16
实施例21：在MCF-7异种移植模型中，与E-13、G-13或F-63化合物缀合的c208F2抗 体的体内活性。
为了确认与G-13、E-13或F-63化合物偶联的c208F2的体外功效可以在体内转化(translate)，已经在MCF-7异种移植模型中测试了它们。
所有动物规程均根据2010/63/UE保护用于科学目的动物的指令的指南进行。方案经皮埃尔法布雷研究所的动物伦理委员会批准。将5百万个MCF-7细胞皮下注射入7周龄的Swiss/Nude小鼠。在细胞注射之前，将雌激素丸(Innovative Research of America)植入小鼠的左侧腹，以释放MCF-7肿瘤体内生长所必需的雌激素。
在MCF-7细胞植入后二十天，当肿瘤达到120-150mm3的平均尺寸时，根据肿瘤尺寸和外观将动物分组，每组5只小鼠。通过腹膜内注射接种不同的处理。每天监测动物的健康状况。每周两次用电子卡尺测量肿瘤体积，直至研究结束。肿瘤体积用下式计算：π/6×长度×宽度×高度。每周三次称量动物的重量后，评价毒性。使用Mann-Whitney检验，在每次测量时进行统计分析。所有化合物均为腹膜内(i.p.)注射。在该实施例中，在D20和D27 2次注射7mg/kg剂量后，评价约DAR 4的与E-13、F-13或F-63偶联的c208F2 mAb的抗肿瘤活性(图27A、27B和27C)。平行地，以对应于7mg/kg的DAR约4的c208F2-E-13、c208F2-F-13和c208F2-F-63的剂量的等效剂量，注射加帽的(capped)药物部分E-13、F-13和F-63。
c208-E-13(图22A)、c208F2-G-13(图27B)或c208F2-F-63(图27C)的注射显著抑制甚至诱导完全的肿瘤生长消退(p<0.05对比于相应的加帽的药物)。没有注意到c208-E-13、c208F2-G-13和c208F2-F-63之间的统计学活性差异。加帽的药物对MCF-7肿瘤生长没有作用(p>0.05对比于对照组)。
如前面所描述，在MCF-7异种移植模型中，使用与E-13或G-13偶联的c208F2和与E-13或G-13偶联的不相关的抗体c9G4进行第二组实验。在D20和D27，将小鼠i.p.注射7mg/kg的每种ADC(图28A和28B)。
c9G4-E-13和c9G4-F-13的注射温和地且短暂地影响MCF-7异种移植肿瘤的生长。然而，该第二实验确认，c208-E-13或c208F2-G-13的注射诱导完全的肿瘤消退，因为D43显示这些ADC的高的抗肿瘤活性。
实施例22：在3+MCF-7异种移植模型中，与G-13化合物缀合的hz208F2抗体的体内 活性。
在MCF-7异种移植模型中，已经体内评价了与G-13化合物偶联的208F2的人源化形式。
所有动物规程均根据2010/63/UE保护用于科学目的动物的指令的指南进行。方案经皮埃尔法布雷研究所的动物伦理委员会批准。将5百万个MCF-7细胞皮下注射入7周龄的Swiss/Nude小鼠。在细胞注射之前，将雌激素丸(Innovative Research of America)植入小鼠的左侧腹，以释放MCF-7肿瘤体内生长所必需的雌激素。
在MCF-7细胞植入后二十天，当肿瘤达到120-150mm3的平均尺寸时，根据肿瘤尺寸和外观将动物分组，每组6只小鼠。通过作为4次注射方案的腹膜内注射接种不同的处理；每四天一次注射(Q4d4)。每天监测动物的健康状况。每周两次用电子卡尺测量肿瘤体积，直至研究结束。肿瘤体积用下式计算：π/6×长度×宽度×高度。每周三次称量动物的重量后，评价毒性。使用Mann-Whitney检验，在每次测量时进行统计分析。所有化合物均为腹膜内(i.p.)注射。在该实施例中，将偶联至G-13化合物的c208F2 mAb的抗肿瘤活性，与也偶联至G-13的不同的人源化形式作比较(图32)。在下表17中描述了经测试的人源化形式：
表17
人源化形式 对应的VH/VL hz形式的其它名称 对应的ADC
208F2_085hz0107(G1) H057/L018 n/a hz208F2(H057/L018)-G-13
208F2_085hz0119(G1) H070/L018 n/a hz208F2(H070/L018)-G-13
208F2_085hz0126(G1) H077/L018 hz208F2-4 hz208F2(H077/L018)-G-13
hz208F2(VH3VL3) H26/L024 n/a hz208F2(H026/L024)-G-13
c208-G-13或208F2人源化形式的注射显著抑制，甚至诱导完全的肿瘤生长消退(p<0.05对比于相应的对照)。没有观察到c208F2-G-13与经测试的人源化形式之间的统计学活性差异。
如前面所描述，在MCF-7异种移植模型中，使用与G-13偶联的c208F2或hz208F2-4进行第二组实验(分别地，图33A和33B)。小鼠每四天i.p.注射3mg/kg的每种ADC，注射4次(Q4d4)或仅一次。
在MCF异种移植模型中，当ADC被注射四次或仅一次时，观察到相同的强抗肿瘤活性。
实施例23：在2+CaOV-3异种移植模型中，与G-13或E-13化合物缀合的208F2抗体的 体内活性。
还在2+表达性肿瘤，CaOV-3异种移植模型中研究抗肿瘤活性，所述异种移植模型为卵巢癌细胞系。对于该计划，在D0，将小鼠皮下注射7×106个细胞。当肿瘤达到约120mm3(肿瘤细胞注射后19天)时，将动物分成具有可比较的肿瘤尺寸的5组，每组5只小鼠，并用与E-13或G-13偶联的c208F2和与E-13或G-13偶联的不相关的抗体c9G4腹膜内处理。将小鼠i.p.注射3mg/kg的每种ADC持续6个注射周期；每四天一次注射。跟踪观察小鼠的异种移植物生长速率。肿瘤体积通过下式计算：π/6×长度×宽度×高度。
相比于温和地且短暂地诱导生长减缓的c9G4-E-13，c9G4-G-13的注射不影响CaOV-3异种移植肿瘤的生长。同时，在第50天，c208F2-E-13或c208F2-G-13的注射分别诱导95％和77％的肿瘤生长抑制(图34A和34B)。
实施例24：评价第一(810D12或816C12)和第二(208F2)IGF-1R抗体之间的结合竞 争
实验的目的是确定小鼠单克隆抗体m810D12和m816C12两者是否不在且远离人源化抗体208F2(变体Hz208F2-4)的结合位点上结合可溶形式的h-IGF1R的区域。
该实验在基于表面等离子体共振技术的Biacore X100装置上运行。CM5传感器芯片用小鼠抗多聚组氨酸IgG1单克隆抗体活化，使用胺偶联化学将所述抗体化学连接到羧甲基葡聚糖基质上。典型地，分别在流动池1(FC1)和流动池2(FC2)上接枝12451RU和12257RU的抗体。传统的HBS-EP+缓冲液被用作运行缓冲液。该缓冲液也用于制备蛋白溶液。实验在25℃下以及以10μl/分钟的流速进行。
自制的IGF1R的可溶形式是由两条α链和两条β链的细胞外结构域组成的异源四聚体，在其C-末端以6个组氨酸序列结束。在1分钟内在FC2上注射蛋白，浓度为30μg/ml(约80nM)。抗体以50μg/ml(约330nM)的浓度注射。第一抗体溶液(图35B和35D)或运行缓冲液(图35A和35C)在90s内注入两流动池。然后将第二抗体溶液注射到两流动池上。在第一抗体结合后不存在第二抗体的结合，证明两种抗体结合抗原邻近的位点(图35B)。相反，在第一抗体结合后第二抗体结合，证明第二抗体的结合位点不在且远离第一抗体的结合位点(图35D)。在每个周期结束时，传感器芯片表面通过在30秒内注射甘氨酸、HCl 10mM pH 1.5缓冲液而再生。
在注射结束后20秒记录没有Ac1(图35A和35B)或具有Ac1(图35C和35D)的Ac2(箭头)的结合水平。数据在图36中的直方图上表示。
当三种抗体用作Ac2时，作为Ac1，Hz208F2-4完全阻断其自身的结合，但对两种小鼠单克隆抗体(m810D12和m816C12)的结合实际上没有影响。
结论：每种小鼠单克隆m810D12和m816C12的结合位点不在并且离Hz208F2-4抗体的结合位点足够远，以允许每种小鼠单克隆抗体与连接到Hz208F2-4抗体上的h-IGFIR结合。
实施例25：在2+NCI-H2122异种移植模型中缀合G-13化合物的208F2抗体的体内活 性。
还在第二2+表达性肿瘤、NCI-H2122异种移植模型中研究抗肿瘤活性，所述异种移植模型为非小细胞肺癌细胞系。对于该计划，在D0，将小鼠皮下注射7×106个细胞。当肿瘤达到约170mm3(肿瘤细胞注射后13天)时，将动物分成具有可比较的肿瘤尺寸的3组，每组6只小鼠，并用与G-13偶联的208F2腹膜内处理。将小鼠i.p.注射5mg/kg或10mg/kg的ADC持续4个注射周期；每七天一次注射。跟踪观察小鼠的异种移植物生长速率。肿瘤体积通过下式计算：π/6×长度×宽度×高度。
注射208F2-G-13在超过30天期间诱导肿瘤生长停滞(图37)。
实施例26：在3+MCF-7异种移植模型中，与G-13化合物缀合的hz208F2抗体的体内 活性和体外分析(使用m810D12或m816C12的增殖和靶向作用(taget commitment))。
在MCF-7异种移植模型中，已经在体内评价了与G-13化合物偶联的208F2的人源化形式，以验证其活性和靶向作用。
所有动物规程均根据2010/63/UE保护用于科学目的动物的指令的指南进行。方案经皮埃尔法布雷研究所的动物伦理委员会批准。将5百万个MCF-7细胞皮下注射入7周龄的Swiss/Nude小鼠。在细胞注射之前，将雌激素丸(Innovative Research of America)植入小鼠的左侧腹，以释放MCF-7肿瘤体内生长所必需的雌激素。
在MCF-7细胞植入后二十天，当肿瘤达到120-150mm3的平均尺寸时，根据肿瘤尺寸和根据抗肿瘤活性方面将动物分为i)2组，每组6只小鼠，以及ii)15组，每组3只小鼠，用于IHC研究(1组为T0，以及2x 7组用于对照和208F2-G-13)。通过腹膜内注射接种不同的处理，作为单次注射方案，对于208F2-G-13为3mg/kg。每天监测动物的健康状况。每周两次用电子卡尺测量肿瘤体积，直至研究结束。肿瘤体积用下式计算：π/6×长度×宽度×高度。每周三次称量动物的重量后，评价毒性。使用Mann-Whitney检验，在每次测量时进行统计分析。在T0(对应于随机化当天，在化合物注射之前)进行用于IHC分析的肿瘤去除，然后，208F2-G-13和对照的每个批次的3个肿瘤，在注射后6小时、4天、7天、14天和26天去除。将肿瘤用甲醛固定并石蜡包埋，然后使用Ki67抗体染色以跟踪增殖，使用m810D12或m816C12以追踪IGF-1R表达。
在随机化后从T0至14天验证对照组中的IGF-1R和Ki67表达，以验证肿瘤生长对IGF-1R表达和增殖的影响。无论测试的时间，IGF-1R和Ki67染色水平在肿瘤中保持稳定(图38)。随机化后从T0至14天IGF-1R评分为3+，增殖指数(Ki67)>80％。
然后在单次注射208F2-G-13后分析肿瘤(图39)。在小鼠中观察到的肿瘤生长抑制由肿瘤中Ki67表达的强降低显示，从T0的83％至单次注射后26天的13％(图39的A组)。在208F2-G-13单次注射26天后使用m816C12或m810D12跟踪IGF-1R的表达(图39B)。在4天至26天后，肿瘤中的IGF-1R水平显著降低，其中i)在208F2-G-13后导致了靶向作用，和ii)m816C12和m810D12追踪208F2-G-13活性的能力。
实施例27：用m810D12或m816C12进行的IGF-1R的发生率研究
在来自Superbiochips的肿瘤微阵列(TMA)上研究使用m810D12或m816C12在人类癌症中的IGF-1R发生率。如先前所述对载玻片进行染色，并使用Roche Ventana算法分析膜IGF-1R表达的核心(表18)。在正常组织(乳腺和肺)中未检测到IGF-1R，而在60％的乳癌，超过50％的肺鳞状细胞癌和30％的头和颈癌(喉癌、鳞状细胞癌)中发现高水平(3+)的IGF-1R。
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序列表
<110> 皮埃尔法布雷医药公司
<120> 用于治疗表达IGF-1R的癌症的新方法和组合物
<130> B371255D35463
<150> EP 15306707.9
<151> 2015-10-26
<160> 95
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 重链, CDR-H1
<400> 1
Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr Met
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 重链, CDR-H2
<400> 2
Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr
1 5
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 重链, CDR-H3
<400> 3
Val Thr Thr Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Arg Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 轻链, CDR-L1
<400> 4
Gln Asp Ile Thr Asn Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 轻链, CDR-L2
<400> 5
Tyr Thr Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 轻链, CDR-L3
<400> 6
Gln Gln Gly Tyr Ser Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 重链, 可变结构域
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Met Leu His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Thr Thr Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 轻链, 可变结构域
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 重链, 可变结构域
<400> 9
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggaca cacattcact agctatatgc tgcactgggt gaagcagaag 120
cctgggcagg gccttgagtg gcttggattt attaatcctt acaatgatgt tactaagtac 180
aatgagaact tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggagctca acagcctgac ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgt aactaccgcc 300
tactatggta acggccggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 轻链, 可变结构域
<400> 10
gatatccaga tgacacagac tacatcttcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattacc aattatttaa cctggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaagttct gatctactac acatcaagat tatactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggatcagat tattctctca ccattaacaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttattcgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 816C12 I-4894, 重链, CDR-H1
<400> 11
Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr Val
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 816C12 I-4894, 重链, CDR-H2
<400> 12
Ile Asn Pro His Asn Asp Val Thr
1 5
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 816C12 I-4894, 重链, CDR-H3
<400> 13
Val Ser Thr Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Arg Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 816C12 I-4894, 轻链, CDR-L1
<400> 14
Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
1 5
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 816C12 I-4894, 轻链, CDR-L2
<400> 15
Tyr Thr Ser
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 816C12 I-4894, 轻链, CDR-L3
<400> 16
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 17
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 816C12 I-4894, 重链, 可变结构域
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Leu His Trp Met Lys Arg Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro His Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Tyr Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Thr Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 816C12 I-4894, 轻链, 可变结构域
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 816C12 I-4894, 重链, 可变结构域
<400> 19
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggaca cacattcact agctatgttt tgcactggat gaagcggaag 120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctc acaatgatgt tactaagtac 180
aatgagaatt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatactccag cacagtctac 240
atggaggtca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtgt attactgtgt aagtaccgcc 300
tactatggta acggccggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 20
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 816C12 I-4894, 轻链, 可变结构域
<400> 20
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtctcatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttattt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有, 重链, CDR-H1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Thr可以被Ser取代
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Tyr可以被Phe取代
<400> 21
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有, 重链, CDR-H2
<400> 22
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有, 重链, CDR-H3
<400> 23
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有, 轻链, CDR-L1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Ser可以被Asn取代
<400> 24
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
1 5
<210> 25
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有, 轻链, CDR-L2
<400> 25
Tyr Thr Ser
1
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有, 轻链, CDR-L3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Thr可以被Ala取代
<400> 26
Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链, CDR-H1
<400> 27
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链, CDR-H1
<400> 28
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Phe
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链, CDR-L1
<400> 29
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链, CDR-L1
<400> 30
Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链, CDR-L3
<400> 31
Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链, CDR-L3
<400> 32
Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hz208F2 重链 H037, VH
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hz208F2 轻链 L018, VL
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hz208F2 重链 H037, 全长
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hz208F2 轻链 L018, 全长
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hz208F2 轻链 L021, VL
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hz208F2 轻链 L021, 全长
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hz208F2 重链 H047, VH
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hz208F2 重链 H047, 全长
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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<213> 人工序列
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<220>
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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420 425 430
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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275 280 285
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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65 70 75 80
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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<213> 人工序列
<220>
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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210
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> c214F8 重链, VH
<400> 65
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> c219D6 重链, VH
<400> 66
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Phe Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
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<210> 67
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> c213B10 重链, VH
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<223> c212A11 轻链, VL
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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260 265 270
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275 280 285
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Gly
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130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 83
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 恒定结构域 (VH) IgG1
<400> 83
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 84
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 恒定结构域 (VH) IgG4 (S228P)
<400> 84
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> κ结构域 (VL)
<400> 85
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 86
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人种系IGHV1-46*01
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 87
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人种系IGKV1-39*01
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人种系IGHJ4*01
<400> 88
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人种系IGKJ4*01
<400> 89
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 90
<211> 1367
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> IGF-1R
<400> 90
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20 25 30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35 40 45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50 55 60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65 70 75 80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85 90 95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100 105 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115 120 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130 135 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145 150 155 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
165 170 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys
180 185 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195 200 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210 215 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser
225 230 235 240
Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
245 250 255
Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu
260 265 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala
275 280 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290 295 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305 310 315 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325 330 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340 345 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355 360 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370 375 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385 390 395 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
405 410 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
420 425 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
435 440 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
450 455 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465 470 475 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr
485 490 495
Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500 505 510
Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys
515 520 525
Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys
530 535 540
Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys
545 550 555 560
Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln
565 570 575
Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp
580 585 590
His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala
595 600 605
Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser
610 615 620
Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn
625 630 635 640
Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr
645 650 655
Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys
660 665 670
Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys
675 680 685
Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys
690 695 700
Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys
705 710 715 720
Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu
725 730 735
Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser
740 745 750
Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro
755 760 765
Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn
770 775 780
Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg
785 790 795 800
Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser
805 810 815
Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp
820 825 830
Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile
835 840 845
Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met
850 855 860
Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val
865 870 875 880
Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu
885 890 895
Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly
900 905 910
Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr
915 920 925
Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Val
930 935 940
Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg
945 950 955 960
Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val
965 970 975
Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp
980 985 990
Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly
995 1000 1005
Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val Lys
1010 1015 1020
Asp Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala
1025 1030 1035
Ala Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val
1040 1045 1050
Met Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val
1055 1060 1065
Val Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr
1070 1075 1080
Arg Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Met
1085 1090 1095
Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile
1100 1105 1110
Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala
1115 1120 1125
Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val
1130 1135 1140
Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg
1145 1150 1155
Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu
1160 1165 1170
Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val
1175 1180 1185
Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp
1190 1195 1200
Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn
1205 1210 1215
Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp Lys
1220 1225 1230
Pro Asp Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys
1235 1240 1245
Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile
1250 1255 1260
Ser Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser
1265 1270 1275
Phe Tyr Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu
1280 1285 1290
Asp Leu Glu Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser
1295 1300 1305
Ala Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His Ser Gly His
1310 1315 1320
Lys Ala Glu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala
1325 1330 1335
Ser Phe Asp Glu Arg Gln Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg
1340 1345 1350
Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys
1355 1360 1365
<210> 91
<211> 932
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGF-1R ECD
<400> 91
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20 25 30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35 40 45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50 55 60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65 70 75 80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85 90 95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100 105 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115 120 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130 135 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145 150 155 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
165 170 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys
180 185 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195 200 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210 215 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser
225 230 235 240
Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
245 250 255
Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu
260 265 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala
275 280 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290 295 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305 310 315 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325 330 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340 345 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355 360 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370 375 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385 390 395 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
405 410 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
420 425 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
435 440 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
450 455 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465 470 475 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr
485 490 495
Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500 505 510
Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys
515 520 525
Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys
530 535 540
Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys
545 550 555 560
Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln
565 570 575
Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp
580 585 590
His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala
595 600 605
Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser
610 615 620
Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn
625 630 635 640
Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr
645 650 655
Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys
660 665 670
Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys
675 680 685
Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys
690 695 700
Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys
705 710 715 720
Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu
725 730 735
Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser
740 745 750
Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro
755 760 765
Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn
770 775 780
Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg
785 790 795 800
Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser
805 810 815
Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp
820 825 830
Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile
835 840 845
Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met
850 855 860
Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val
865 870 875 880
Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu
885 890 895
Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly
900 905 910
Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr
915 920 925
Gly Tyr Glu Asn
930
<210> 92
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGF-1R ECD N末端
<400> 92
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20 25 30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35 40 45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50 55 60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65 70 75 80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85 90 95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100 105 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115 120 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130 135 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145 150 155 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
165 170 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys
180 185 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195 200 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210 215 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser
225 230 235 240
Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
245 250 255
Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu
260 265 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala
275 280 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290 295 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305 310 315 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325 330 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340 345 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355 360 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370 375 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385 390 395 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
405 410 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
420 425 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
435 440 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
450 455 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465 470 475 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr
485 490 495
Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500 505 510
<210> 93
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四肽(接头)
<400> 93
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 94
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四肽(接头)
<400> 94
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 五肽(接头)
<400> 95
Pro Val Gly Val Val
1 5

Claims (15)

1.一种用于在具有IGF-1R(+)状态的受试者中治疗癌症的组合物，其特征在于，其包含下式(I)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)n
或其药学上可接受的盐，其中
Ab是第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其结合人IGF-1R并在其结合IGF-1R后内化；
L是接头；
D是药物部分；和
n是1至12；
以及其中，使用第一IGF-1R抗体，从受试者的生物样本确定所述受试者的IGF-1R(+)状态，所述第一IGF-1R抗体是：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQ IDNo.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中第一和第二抗体不结合相同的IGF-1R表位。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中第一IGF-1R抗体是：
i)抗体，其包含序列SEQ ID No.7或与序列SEQ ID No.7具有至少90％同源性的任何序列的重链可变结构域；和/或序列SEQ ID No.8或与序列SEQ ID No.8具有至少90％同源性的任何序列的轻链可变结构域；或者
ii)抗体，其包含序列SEQ ID No.17或与序列SEQ ID No.17具有至少90％同源性的任何序列的重链可变结构域；和/或序列SEQ ID No.18或与序列SEQ ID No.18具有至少90％同源性的任何序列的轻链可变结构域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中第一IGF-1R抗体是：
i)由2014年9月17日在巴黎巴斯德研究所CNCM提交的编号为I-4893的杂交瘤所分泌的抗体810D12；或者
ii)由2014年9月17日在巴黎巴斯德研究所CNCM提交的编号为I-4894的杂交瘤所分泌的抗体816C12。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中Ab是IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其选自：i)抗体，其包含序列SEQ ID No.21、22和23的三个重链CDR，和序列SEQ IDNo.24、25和26的三个轻链CDR；或者ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；或者iii)与i)的抗体结合IGF-1R的相同表位的抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中Ab是：
a)包含序列SEQ ID No.27、22和23的三个重链CDR和序列SEQ ID No.29、25和31的三个轻链CDR的抗体；
b)包含序列SEQ ID No.27、22和23的三个重链CDR和序列SEQ ID No.30、25和31的三个轻链CDR的抗体；
c)包含序列SEQ ID No.27、22和23的三个重链CDR和序列SEQ ID No.29、25和32的三个轻链CDR的抗体；或者
d)包含序列SEQ ID No.28、22和23的三个重链CDR和序列SEQ ID No.29、25和31的三个轻链CDR的抗体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中Ab是：
a)抗体，其包含重链可变结构域和序列SEQ ID No.29、25和31的三个轻链CDR，所述重链可变结构域的序列选自SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59或与SEQID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59具有至少80％同一性的任何序列；
b)抗体，其包含轻链可变结构域和序列SEQ ID No.27、22和23的三个重链CDR，所述轻链可变结构域的序列选自SEQ ID No.34、37和60或与SEQ ID No.34、37或60具有至少80％同一性的任何序列；或者
c)抗体，其包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域的序列选自SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59或与SEQ ID No.33、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59具有至少80％同一性的任何序列，所述轻链可变结构域的序列选自SEQ ID No.34、37和60或与SEQ ID No.34、37或60具有至少80％同一性的任何序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中Ab包含：
a)重链，所述重链的序列选自SEQ ID No.35、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58和61，或与SEQ ID No.35、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或61具有至少80％同一性的任何序列；和
b)轻链，所述轻链的序列选自SEQ ID No.36、38和62，或与SEQ ID No.36、38或62具有至少80％同一性的任何序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中Ab是i)抗体208F2、212A11、214F8、219D6和213B10，ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；或者iii)与i)的抗体结合IGF-1R的相同表位的抗体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中药物部分D选自烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、螯合剂、铁吸收刺激剂、环氧合酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、DNA抑制剂、DNA合成抑制剂、凋亡刺激剂、胸苷酸抑制剂、T细胞抑制剂、干扰素激动剂、核糖核苷三磷酸还原酶抑制剂、芳香酶抑制剂、雌激素受体拮抗剂、酪氨酸激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、紫杉烷、微管蛋白抑制剂、血管生成抑制剂、巨噬细胞刺激剂、神经激肽受体拮抗剂、大麻素受体激动剂、多巴胺受体激动剂、粒细胞刺激因子激动剂、促红细胞生成素受体激动剂、生长抑素受体激动剂、LHRH激动剂、钙增敏剂、VEGF受体拮抗剂、白细胞介素受体拮抗剂、破骨细胞抑制剂、自由基形成刺激剂、内皮素受体拮抗剂、长春花生物碱、抗激素或免疫调节剂或任何其它满足细胞毒性或毒素活性标准的药物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中药物部分D是奥瑞司他汀、多拉司他汀10或其衍生物。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中药物部分D为下式(II)：
其中：
R2为COOH、COOCH3或噻唑基；
R3为H或(C1-C6)烷基；
R9为H或(C1-C6)烷基；
m为1至8之间的整数；
波浪线表示与L连接的点。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中L为下式(III)的接头：
其中
L2为(C4-C10)环烷基-羰基、(C2-C6)烷基、(C2-C6)烷基-羰基，
W为氨基酸单元；w为0至5之间的整数；
Y为PAB-羰基，其中PAB为y为0或1；
星号表示与D连接的点；和
波浪线表示与Ab连接的点。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中抗体-药物缀合物具有下式：
或其药学上可接受的盐，
其中，Ab是i)抗体208F2、212A11、214F8、219D6和213B10，ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；或者iii)与i)的抗体结合IGF-1R的相同表位的抗体。
15.一种用于治疗表达IGF-1R的癌症的试剂盒，其至少包含：
a)第一IGF-1R，其由以下所组成：
i)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.1的CDR-H1、SEQ ID No.2的CDR-H2和SEQ ID No.3的CDR-H3的重链；和具有SEQ ID No.4的CDR-L1、SEQ ID No.5的CDR-L2和SEQ ID No.6的CDR-L3的轻链；或者
ii)抗体或其任何抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID No.11的CDR-H1、序列SEQ IDNo.12的CDR-H2和序列SEQ ID No.13的CDR-H3的重链；和具有序列SEQ ID No.14的CDR-L1、序列SEQ ID No.15的CDR-L2和序列SEQ ID No.16的CDR-L3的轻链；和
b)下式(I)的抗体-药物缀合物：
Ab-(L-D)n
(I)
或其药学上可接受的盐，
其中
Ab是能够结合人IGF-1R的第二IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其选自：i)抗体，其包含序列SEQ ID No.21、22和23的三个重链CDR，和序列SEQ ID No.24、25和26的三个轻链CDR；或者ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；或者iii)与i)的抗体结合IGF-1R的相同表位的抗体；
L是接头；
D是下式(II)的药物部分：
其中：
R2为COOH、COOCH3或噻唑基；
R3为H或(C1-C6)烷基；
R9为H或(C1-C6)烷基；
m为1至8之间的整数；
波浪线表示与L连接的点；以及
n是1至12。
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