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CN108367063A - 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其试剂盒和用途 - Google Patents

包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其试剂盒和用途 Download PDF

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CN108367063A
CN108367063A CN201680054602.2A CN201680054602A CN108367063A CN 108367063 A CN108367063 A CN 108367063A CN 201680054602 A CN201680054602 A CN 201680054602A CN 108367063 A CN108367063 A CN 108367063A
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马丁-蒙塔尔沃 L·P·霍达尔
R·E·伊斯图里斯
R·R·赖纳特
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Abstract

本发明涉及新的免疫原性组合物，其包括缀合的肺炎链球菌荚膜糖抗原(糖缀合物)、包括所述免疫原性组合物的试剂盒及其用途。本发明的免疫原性组合物将通常包括至少一种来自中未发现的肺炎链球菌血清型的糖缀合物。本发明还涉及使用所述新型免疫原性组合物对人类对象，特别是婴儿和老年人进行疫苗接种以抵抗肺炎球菌感染。

Description

包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其试剂盒和用途
发明领域
本发明涉及新的包含缀合荚膜糖抗原(糖缀合物)的免疫原性组合物、包括所述免疫原性组合物的试剂盒及其用途。本发明的免疫原性组合物通常将包含糖缀合物，其中所述糖源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的血清型。本发明还涉及使用所述新的免疫原性组合物及试剂盒，针对肺炎球菌感染而对人类对象(特别是婴儿和老人)进行疫苗接种。
发明背景
由肺炎球菌引起的感染是全世界发病和死亡的主要原因。肺炎、发热菌血症(febrile bacteraemia)和脑膜炎是侵入性肺炎球菌疾病的最常见的表现，而呼吸道内细菌的扩散可导致中耳感染、鼻窦炎或复发性支气管炎。与侵入性疾病相比，非侵入性的表现通常没那么严重，但是却更常见得多。
在欧洲和美国，肺炎球菌肺炎是最常见的社区获得性细菌性肺炎，据估算每年在每100,000成年人中影响约100人。发热菌血症和脑膜炎的相应数字分别为每100,000人15–19人和每100,000人1–2人。一或多种这些表现的风险在婴儿和老人、以及任何年龄的免疫受损的人中更高。即使是在经济发达地区，侵入性肺炎球菌疾病带来高死亡率；对于患有肺炎球菌肺炎的成人死亡率平均为10％–20％，而在高风险群体中死亡率可超过50％。肺炎目前是世界上肺炎球菌死亡最常见的原因。
肺炎球菌疾病的病原物，肺炎链球菌(肺炎球菌)，是有荚膜的革兰氏阳性球菌，被多糖荚膜所包围。此荚膜成分的差别使得其可从血清学上区分成约91种荚膜类型，其中的一些常常与肺炎球菌疾病相关，而其它的则很少。侵入性肺炎球菌感染包括肺炎、脑膜炎和发热菌血症；常见的非侵入性表现中有中耳炎、鼻窦炎和支气管炎。
肺炎球菌缀合物疫苗(PCV)是用于针对肺炎链球菌(S.pneumoniae,肺炎球菌)所引起的疾病进行保护的肺炎球菌疫苗。目前全球市场上有三种PCV疫苗可用：(在一些国家称作)(七价疫苗)、(十价疫苗)和PREVNAR(在一些国家称作PREVENAR)(十三价疫苗)。
近来，微生物对于基本抗生素产生的广泛抗性以及免疫受损人群数目的增加凸显了对于具有更广泛保护的肺炎球菌疫苗的需求。
具体而言，鉴于存在由PREVNAR中未包括的血清型和可能出现的非PREVNAR血清型引起的肺炎球菌疾病，需要解决对这些肺炎球菌疾病实现覆盖的尚未满足的医疗需求。在PREVNAR中的13种之外的引起疾病的具体血清型随着地区和人群而有变化，并且可由于获得抗生素抗性、肺炎球菌疫苗的引入以及未知来源的长期趋势而随着时间改变。对于能够用于针对额外的肺炎链球菌血清型在人类中且特别是在2岁以下的儿童中诱导免疫应答的免疫原性组合物是有需求的。
本发明的新免疫原性组合物的目标是针对PREVNAR中未包括的肺炎链球菌血清型提供适当的保护。在一方面，本发明的免疫原性组合物的目标是针对(七价疫苗)、和/或PREVNAR中未包括的肺炎链球菌血清型提供适当的保护，同时又保持针对目前所述疫苗覆盖的血清型的免疫应答。
抗原竞争(或干扰)的现象使得多价疫苗的开发复杂化。抗原干扰是指以下的观察：相对于当这样的抗原单独施用时观察到的免疫应答，施用多种抗原可导致对某些抗原的应答降低。当制造新抗原组合时，抗原干扰的发生是不可预测的。
本发明的免疫原性组合物、试剂盒和施用方案的目标是提供针对PREVNAR中未出现的肺炎链球菌血清型提供适当的保护，同时又保持针对目前所述疫苗覆盖的血清型的免疫应答和最小化免疫干扰的风险。
发明概述
为了满足这些和其他需求，本发明涉及新的免疫原性组合物、包括所述免疫原性组合物的试剂盒及其用途。以下条款描述了本发明的一些方面和实施方案。
本发明的一方面涉及免疫原性组合物，其包含选自以下的至少一种糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物、和来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物，其中所述组合物是1、2、3、4、5、6或7价肺炎球菌缀合物的组合物。
一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括：(a)第一免疫原性组合物，其包括所述免疫原性组合物；和(b)第二免疫原性组合物，其包括至少一种来自肺炎链球菌血清型的选自以下的血清型的糖缀合物：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F和33F。
另一方面，本发明提供所述免疫原性组合物用于同时、并行、伴随或依次施用。
本发明的一方面提供了所述免疫原性组合物用于疫苗接种计划。在一实施方案中，疫苗接种方案是单剂方案。在另一实施方案中，所述接种计划是多剂方案。
一方面，所述试剂盒用于同时、并行、伴随或依次施用第一和第二免疫原性组合物。
本发明的另一方面提供所述免疫原性组合物或所述试剂盒用作药物的用途。
本发明的一个方面，所述免疫原性组合物或所述试剂盒用作疫苗。
本发明的另一方面提供所述免疫原性组合物或所述试剂盒在预防、治疗或改善对象中的细菌感染、疾病或病症的方法中的用途。
本发明的另一方面，所述免疫原性组合物或所述试剂盒在预防对象中的细菌感染、疾病或病症的方法中的用途。
本发明的一个方面提供所述免疫原性组合物或所述试剂盒，通过全身或粘膜途径施用所述免疫原性组合物的手段在保护或治疗对肺炎球菌感染易感的人的方法中的用途。
附图说明
图1显示了肺炎链球菌血清型8(Pn-8)荚膜多糖的重复多糖结构。
图2显示了肺炎链球菌血清型10A(Pn-10A)荚膜多糖的重复多糖结构。
图3显示了肺炎链球菌血清型11A(Pn-11A)荚膜多糖的重复多糖结构。
图4显示了肺炎链球菌血清型12F(Pn-12F)荚膜多糖的重复多糖结构。
图5显示了肺炎链球菌血清型15B(Pn-15B)荚膜多糖的重复多糖结构。
图6显示了肺炎链球菌血清型22F(Pn-22F)荚膜多糖的重复多糖结构。
图7显示了肺炎链球菌血清型33F(Pn-33F)荚膜多糖的重复多糖结构。
图8显示了可用于制备Pn-33F糖缀合物的活化(A)和缀合(B)过程的代表性过程流程图。
图9显示了通过在TEMPO/NCS氧化反应中改变NCS的量对DO的影响。
图10显示了Pn-12F糖缀合物稳定性的评价。
图11交叉功能OPA反应。在OPA中，评估了来自接种了13价肺炎球菌缀合物疫苗的成人的59种血清的子集(US研究6115A1-004；ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00427895)中针对血清型9V、9A、9L、和9N的功能性抗体的存在。具有OPA阳性效价(即≥1:8)的样品的百分比在每组之上标出。几何平均效价(GMT)在X轴中于每组之下列出。
图12 66种匹配的之前/之后血清的交叉功能OPA反应。在OPA中，评估了来自接种了13价肺炎球菌缀合物疫苗的成人的匹配的接种前和接种后的血清组的66种血清的子集(研究6115A1-3005；ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00546572)中针对血清型9V、9A、9L、和9N的功能性抗体的存在。具有OPA阳性效价(即≥1:8)的样品的百分比在每组之上标出。几何平均效价(GMT)在X轴中于每组之下列出。
图13免疫前和免疫后的反向累积分布曲线(RCDC)–肺炎球菌血清型9V(Pn9V)。
来自接种了13价肺炎球菌缀合物疫苗的匹配的接种前和接种后的血清组(N＝66)的血清型9V的OPA反向累积分布曲线(研究6115A1-3005；ClinicalTrials.govIdentifier:NCT00546572)。该图代表了具有OPA阳性效价(即≥1:8)的血清的百分比。
图14免疫前和免疫后的反向累积分布曲线(RCDC)–肺炎球菌血清型9A(Pn9A)。
来自接种了13价肺炎球菌缀合物疫苗的匹配的接种前和接种后的血清组(N＝66)的血清型9A的OPA反向累积分布曲线(研究6115A1-3005；ClinicalTrials.govIdentifier:NCT00546572)。该图代表了具有OPA阳性效价(即≥1:8)的血清的百分比。
图15免疫前和免疫后的反向累积分布曲线(RCDC)–肺炎球菌血清型9L(Pn9L)。
来自接种了13价肺炎球菌缀合物疫苗的匹配的接种前和接种后的血清组(N＝66)的血清型9L的OPA反向累积分布曲线(研究6115A1-3005；ClinicalTrials.govIdentifier:NCT00546572)。该图代表了具有OPA阳性效价(即≥1:8)的血清的百分比。
图16免疫前和免疫后的反向累积分布曲线(RCDC)–肺炎球菌血清型9N(Pn9N)。
来自接种了13价肺炎球菌缀合物疫苗的匹配的接种前和接种后的血清组(N＝66)的血清型9N的OPA反向累积分布曲线(研究6115A1-3005；ClinicalTrials.govIdentifier:NCT00546572)。该图代表了具有OPA阳性效价(即≥1:8)的血清的百分比。
1.本发明的糖缀合物
本发明的免疫原性组合物通常将包含缀合的荚膜糖抗原(也称作糖缀合物)，其中所述糖源自肺炎链球菌的血清型。
如果组合物中2种或更多种糖的蛋白载体是相同的，那么所述糖可被缀合至蛋白载体的相同分子(载体分子上缀合有2个或更多个不同的糖)[参见例如WO2004/083251]。
但是在优选的实施方案中，所述糖各自单独缀合至不同的蛋白载体分子(每分子的蛋白载体仅仅缀合有一种类型的糖)。在所述实施方案中，所述荚膜糖被称作是单独缀合至载体蛋白。
为本发明的目的，术语“糖缀合物”表示荚膜糖共价连接至载体蛋白。在一实施方案中，荚膜糖直接连接至载体蛋白。在第二个实施方案中，细菌糖通过间隔物/接头连接至蛋白质。
1.1本发明的载体蛋白
本发明的糖缀合物的一种成分是糖缀合至其上的载体蛋白。术语“蛋白载体”或“载体蛋白”或“载体”在本文中可互换使用。载体蛋白应当顺应标准缀合过程。
在优选的实施方案中，糖缀合物的载体蛋白选自由以下组成的组：DT(白喉毒素)、TT(破伤风类毒素)或TT的片段C、CRM197(白喉毒素的非毒性但却具有免疫原性的等价变体)、其它DT突变体(如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等人(1973)J.Biol.Chem.218:3838-3844)、CRM9、CRM102、CRM103或CRM107；以及Nicholls和Youle在Genetically EngineeredToxins,Ed:Frankel,Maecel Dekker Inc.(1992)中描述的其它突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser和/或Ala 158缺失或突变为GIy以及美国专利号4,709,017和4,950,740中公开的其它突变；残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534中至少一个或多个的突变以及美国专利号5,917,017和6,455,673中公开的其它突变；或者美国专利号5,843,711中公开的片段，肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(ply)(Kuo等人(1995)Infect lmmun 63:2706-2713)包括以某方式去毒的ply，例如dPLY-GMBS(WO2004/081515、WO 2006/032499)或dPLY-formol、PhtX、包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(PhtA、PhtB、PhtD或PhtE的序列在WO 00/37105和WO 00/39299中公开)以及Pht蛋白的融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物、Pht A-E(WO01/98334、WO 03/054007、WO 2009/000826)、OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白)(其常提取自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组B(EP0372501))、PorB(来自脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis))、PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如，EP0594610B)或者其免疫学功能等价物、合成肽(EP0378881,EP0427347)、热休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO 91/01146)，包含多个来自各种病原体来源的抗原的人类CD4+T细胞表位的人造蛋白(Falugi等人(2001)Eur J Immunol 31:3816-3824)如N19蛋白(Baraldoi等人(2004)Infect lmmun 72:4884-4887)肺炎球菌表面蛋白PspA(WO 02/091998)、铁摄取蛋白(WO 01/72337)、难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)的毒素A或毒素B(WO 00/61761)、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(特别是其非毒性突变体(如在谷氨酸553处有取代的外毒素A(Douglas等人(1987)J.Bacteriol.169(11):4967-4971))。其它蛋白质，如卵白蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的纯蛋白衍生物(PPD)也可用作载体蛋白。其它适和的载体蛋白包括失活的细菌毒素如霍乱类毒素(例如，WO 2004/083251中描述的)、大肠杆菌(Escherichia coli)LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌的外毒素A。
在优选的实施方案中，糖缀合物的载体蛋白独立地选自以下组成的组：TT、DT、DT突变体(如CRM197)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)蛋白D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(特别是WO 01/98334和WO 03/054007中描述的那些)、经去毒的肺炎球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、难辨梭状芽孢杆菌(C.difficile)的毒素A或B以及PsaA。
在一实施方案中，本发明糖缀合物的载体蛋白是DT(白喉类毒素)。在另一实施方案中，本发明糖缀合物的载体蛋白是TT(破伤风类毒素)。
在另一实施方案中，本发明糖缀合物的载体蛋白是PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如，EP0594610B)。
在优选的实施方案中，本发明的荚膜糖缀合至CRM197蛋白。所述CRM197蛋白是白喉毒素的非毒性形式，但是免疫学上与白喉毒素不可区分。CRM197是由被非产毒素噬菌体β197tox-(通过产毒素β-棒状噬菌体的亚硝基胍诱变创建的)感染的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生的(Uchida等人(1971)Nature New Biology 233:8-11)。CRM197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量但是与其的差异在于结构基因中单个碱基的改变(鸟嘌呤变为腺嘌呤)。此单个碱基的改变在成熟蛋白质中引起氨基酸取代(用谷氨酸取代甘氨酸)并消除白喉毒素的毒性。CRM197蛋白对于糖而言是安全且有效的T-细胞依赖性载体。关于CRM197及其产生的进一步的细节可在例如美国专利号5,614,382中找到。
在一实施方案中，本发明的荚膜糖缀合至CRM197蛋白或者CRM197的A链(参见CN103495161)。在一实施方案中，本发明的荚膜糖缀合至通过遗传重组大肠杆菌表达而获得的CRM197的A链(参见CN103495161)。在一实施方案中，本发明的荚膜糖全都缀合至CRM197。在一实施方案中，本发明的荚膜糖全部都缀合至CRM197的A链。
因此，在常见的实施方案中，本发明的糖缀合物包含CRM197作为载体蛋白，其中所述荚膜多糖共价连接至CRM197。
1.2本发明的荚膜糖
遍及本说明书的术语“糖”可以是指多糖或寡糖并且包括二者。在常见的实施方案中，所述糖是多糖，特别是肺炎链球菌荚膜多糖。
荚膜多糖是本领域技术人员通过已知的标准技术制备的。
在本发明中，可从例如血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的肺炎链球菌来制备荚膜多糖。通常通过在培养基中(例如在基于大豆的培养基中)培养每种肺炎链球菌血清型来产生荚膜多糖，继而从细菌培养物中制备多糖。用于制备本发明的糖缀合物所使用的各多糖的肺炎链球菌菌株可获得自已建立的培养物收集或者临床样本。
生物体(每种肺炎链球菌血清型)的群体常常从种子小瓶规模放大至种子瓶并通过一个或多个体积增加的种子发酵罐传代直至达到生产规模的发酵体积。在生长循环结束时将细胞裂解，然后收获裂解液肉汤用于下游(纯化)加工(参见例如WO 2006/110381、WO2008/118752、和美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2008/0102498和2008/0286838)。
各多糖通常是通过离心、沉淀、超滤、和/或柱层析来进行纯化(参见例如WO 2006/110352和WO 2008/118752)。
如本文进一步描述的，纯化的多糖可被活化(例如，化学活化)以使得它们能够反应(例如，与eTEC间隔物)并继而并入到本发明糖缀合物中。
肺炎链球菌荚膜多糖包含重复寡糖单元(可含有达8个糖残基)。
在一实施方案中，本发明的荚膜糖可以是一个寡糖单元或者重复寡糖单元的短于天然长度的糖链。在一实施方案中，本发明的荚膜糖是相关血清型的一个重复寡糖单元。
在一实施方案中，本发明的荚膜糖可以是寡糖。寡糖具有低数目的重复单元(通常5-15个重复单元)并且通常源自合成或者是源自多糖的水解。
但是优选地，本发明的所有荚膜糖以及本发明的免疫原性组合物中的所有荚膜糖是多糖。高分子量荚膜多糖由于存在于抗原表面的表位能够诱导某些抗体免疫应答。优选考虑将高分子量荚膜多糖的分离和纯化用于本发明的缀合物、组合物和方法中。
在一些实施方案中，纯化的多糖在缀合前具有10kDa至4,000kDa的分子量。在其它此类实施方案中，所述多糖具有50kDa至4,000kDa的分子量。在另外的此类实施方案中，所述多糖具有如下的分子量：50kDa至3,500kDa；50kDa至3,000kDa；50kDa至2,500kDa；50kDa至2,000kDa；50kDa至1,750kDa；50kDa至1,500kDa；50kDa至1,250kDa；50kDa至1,000kDa；50kDa至750kDa；50kDa至500kDa；100kDa至4,000kDa；100kDa至3,500kDa；100kDa至3,000kDa；100kDa至2,500kDa；100kDa至2,250kDa；100kDa至2,000kDa；100kDa至1,750kDa；100kDa至1,500kDa；100kDa至1,250kDa；100kDa至1,000kDa；100kDa至750kDa；100kDa至500kDa；200kDa至4,000kDa；200kDa至3,500kDa；200kDa至3,000kDa；200kDa至2,500kDa；200kDa至2,000kDa；200kDa至2,000kDa；200kDa至1,750kDa；200kDa至1,500kDa；200kDa至1,250kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至750kDa；或者200kDa至500kDa。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
多糖在正常纯化过程中可被稍微减小大小。另外，如本文所述，多糖可在缀合前经历改变大小的技术(sizing technique)。可使用机械或化学改变大小。可用乙酸进行化学水解。可用高压均质剪切来进行机械改变大小。上述提到的分子量范围是指缀合之前(例如，活化之前)的纯化多糖。
在优选的实施方案中，纯化的多糖是来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F的荚膜多糖，其中所述荚膜多糖具有落入上述所述分子量范围之一之内的分子量。
如本文所用，术语多糖的或者载体蛋白-多糖缀合物的“分子量”是指通过大小排阻层析(SEC)组合多角度激光光散射检测器(MALLS)来计算的分子量。
在一些实施方案中，本发明的来自血清型9V、18C、11A、15B、22F和/或33F的肺炎球菌糖是O-乙酰化的。在一些实施方案中，本发明的来自血清型9V、11A、15B、22F和/或33F的肺炎球菌糖是O-乙酰化的。
本文所描述的纯化的多糖经化学活化，以便使糖能够与载体蛋白反应。这些肺炎球菌缀合物通过分别的过程制备并如本文所述配制到单剂的制剂中。
1.2.1来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎球菌多糖
可通过本领域技术人员已知的标准技术制备来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜糖(参见例如WO 2006/110381)。可通过使每种肺炎链球菌血清型在培养基中生长来产生荚膜多糖；在生长循环结束时，将细胞水解并接着收获裂解液肉汤用于下游(纯化)的加工。各多糖通常是通过离心、沉淀、超滤、和/或柱层析来进行纯化(参见例如WO 2006/110352和WO 2008/118752)。可如本文进一步描述的那样对纯化的多糖进行进一步的加工以制备本发明的糖缀合物。
在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和/或23F的纯化的多糖在缀合之前具有10kDa至4,000kDa的分子量。在其它此类实施方案中，所述多糖具有以下的分子量：50kDa至4,000kDa的分子量；50kDa至3,000kDa或者50kDa至2,000kDa。在另外的此类实施方案中，所述多糖具有50kDa至3,500kDa；50kDa至3,000kDa；50kDa至2,500kDa；50kDa至2,000kDa；50kDa至1,750kDa；50kDa至1,500kDa；50kDa至1,250kDa；50kDa至1,000kDa；50kDa至750kDa；50kDa至500kDa；100kDa至4,000kDa；100kDa至3,500kDa；100kDa至3,000kDa；100kDa至2,500kDa；100kDa至2,000kDa；100kDa至1,750kDa；100kDa至1,500kDa；100kDa至1,250kDa；100kDa至1,000kDa；100kDa至750kDa；100kDa至500kDa；200kDa至4,000kDa；200kDa至3,500kDa；200kDa至3,000kDa；200kDa至2,500kDa；200kDa至2,000kDa；200kDa至1,750kDa；200kDa至1,500kDa；200kDa至1,250kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至750kDa；或者200kDa至500kDa。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
多糖在正常纯化过程中大小可被稍微减小。另外，如本文所述，多糖可在缀合前经历改变大小的技术。上述提到的分子量范围是指在缀合前(例如，活化之前)在最终的改变大小步骤之后的纯化多糖。
在一些实施方案中，本发明的来自血清型9V和/或18C的肺炎球菌糖是O-乙酰化的。在一些实施方案中，本发明的来自血清型9V的肺炎球菌糖是O-乙酰化的并且本发明的来自血清型18C的肺炎球菌糖是脱-O-乙酰化的。
1.2.2肺炎球菌多糖血清型8
血清型8的多糖重复单元由线性四糖单元组成，其中有一个葡萄糖醛酸(GlcpA)、两个吡喃葡萄糖(Glcp)和一个吡喃半乳糖(Galp)(Jones等人(1957)The Journal of theAmerican Chemical Society.79(11):2787-2793)。所有四个单糖经1,4-键连接，如图1所示。
血清型8糖可使用本领域技术人员已知的分离过程而直接从细菌获得(参见例如美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340、和2008/0102498以及WO 2008/118752中公开的方法)。另外，它们可用合成方案来产生。
血清型8肺炎链球菌菌株可获得自已建立的培养物收集(如例如链球菌参考实验室(美国国家疾病控制与预防中心,Atlanta,GA))或者临床样本。
在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型8的纯化多糖在缀合前具有10kDa至2,000kDa的分子量。在一实施方案中，所述荚膜多糖具有50kDa至1,000kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有70kDa至900kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有100kDa至800kDa的分子量。
在另外的实施方案中，所述荚膜多糖具有如下分子量：100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；250kDa至600；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至600kDa；500kDa至600kDa；以及类似的期望分子量范围。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
多糖在正常纯化过程中大小可被稍微减小。另外，如本文所述，多糖可在缀合前经历改变大小的技术。以上提到的分子量范围是指在缀合前(例如，活化之前)在最终的改变大小步骤之后的纯化多糖。
1.2.3肺炎球菌多糖血清型10A
血清型10A的纯化多糖多糖重复单元由分枝的六糖重复单元组成，其中有两个呋喃半乳糖(Galf)、三个吡喃半乳糖(Galp)、一个N-乙酰半乳糖胺(GalpNAc)和骨架磷酸核糖醇(backbone phosphoribitol)(Jones,C.(2005)Carbohydrate Research 269(1):175-181)。在β-GalpNAc部分有两个分枝单糖(β-3-Galp和β-6-Galf)，如图2所示。
血清型10A糖可使用本领域技术人员已知的分离过程而直接从细菌获得(参见例如美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340、和2008/0102498以及WO 2008/118752中公开的方法)。另外，它们可用合成方案来产生。
血清型10A肺炎链球菌菌株可得自已建立的培养物收集(如例如链球菌参考实验室(美国国家疾病控制与预防中心，Atlanta,GA))或者临床样本。
在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型10A的纯化的多糖在缀合前具有10kDa至2,000kDa的分子量。在一实施方案中，所述荚膜多糖具有50kDa至1,000kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有70kDa至900kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有100kDa至800kDa的分子量。
在另外的实施方案中，所述荚膜多糖具有如下分子量：100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；250kDa至600kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至600kDa；500kDa至600kDa；以及类似的期望分子量范围。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
多糖在正常纯化过程中可被稍微减小大小。另外，如本文所述，多糖可在缀合前经历改变大小的技术。上文提到的分子量范围是指在缀合前(例如，活化之前)在最终的改变大小步骤之后的纯化多糖。
1.2.4肺炎球菌多糖血清型11A
血清型11A的纯化多糖重复单元由线性四糖骨架(两个吡喃半乳糖(Galp)和两个吡喃葡萄糖(Glcp))和悬垂的磷酸甘油组成(Richards等人(1988)Adv.Exp.Med.Biol.228:595-597)，如图3所示。所述多糖是在多个位置O-乙酰化的，并且基于文献中报道的数据(Calix等人(2011)J Bacteriol.193(19):5271-5278)，11A多糖中O-乙酰化的总量为约每个多糖重复单元2.6个O-酰基基团。
血清型11A糖可使用本领域技术人员已知的分离过程而直接得自细菌(参见例如美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340、和2008/0102498以及WO 2008/118752中公开的方法)。另外，它们可用合成方案来产生。
血清型11A肺炎链球菌菌株可得自已建立的培养物收集(如例如链球菌参考实验室(美国国家疾病控制与预防中心，Atlanta,GA))或者临床样本。
通过从肺炎链球菌水解物纯化的血清型11A多糖以及任选地将纯化的多糖改变大小而获得的分离的血清型11A荚膜多糖，可通过不同的属性来进行表征，所述属性包括例如分子量(MW)以及每mM所述血清型11A荚膜多糖的乙酸根(acetate)的mM数。
在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型11A的纯化多糖在缀合前具有10kDa至2,000kDa的分子量。在一实施方案中，所述荚膜多糖具有50kDa至1,000kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有70kDa至900kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有100kDa至800kDa的分子量。
在另外的实施方案中，所述荚膜多糖具有如下分子量：100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；100kDa至200kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；150kDa至300kDa；150kDa至200kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；250kDa至600kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至600kDa；500kDa至600kDa；以及类似的期望分子量范围。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
多糖在正常纯化过程中可被稍微减小大小。另外，如本文所述，多糖可在缀合前经历改变大小的技术。上文提到的分子量范围是指在缀合前(例如，活化之前)在最终的改变大小步骤之后的纯化多糖。
在一实施方案中，通过高压均质化来减小纯化的血清型11A多糖的大小。高压均质化通过将加工流泵送穿过尺寸足够小的流径而实现高剪切速率。通过使用更大的应用均质化压力而提高剪切速率，且可通过使原料流通过均质器反复循环而增加暴露时间。
所述高压均质化过程特别适于减小纯化的血清型11A多糖的大小，而又保留所述多糖的结构特征，如O-乙酰基基团的存在。
纯化的、分离的或活化的血清型11A荚膜多糖中或者血清型11A多糖-载体蛋白缀合物中O-乙酰基的存在表示为每mM的所述多糖中乙酸盐的mM数或者表示为每个多糖重复单元O-乙酰基基团的数目。
在优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型11A的纯化多糖对于每μmol的所述血清型11A荚膜多糖具有至少0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4或1.6μmol的乙酸根。
1.2.5肺炎球菌多糖血清型12F
血清型12F的纯化多糖重复单元由线性三糖骨架组成(一个N-乙酰基岩藻糖胺(FucpNAc)、一个N-乙酰基半乳糖胺(GalpNAc)、和一个N-乙酰基甘露糖醛酸(ManpNAcA))，其具有两个分枝：悬垂的α-吡喃半乳糖(Galp)连接在FucpNAc的C3以及α-Glcp-(1→2)-α-Glcp二糖分枝连接在ManpNAcA的C3(Leontein等人(1983)Carbohydrate Research 114(2):257-266.)，如图4所示。
肺炎链球菌菌株血清型12F可获得自已建立的培养物收集(如例如链球菌参考实验室(美国国家疾病控制与预防中心,Atlanta,GA))或者临床样本。
来自肺炎链球菌血清型12F的荚膜糖可通过本领域技术人员已知的标准技术来制备。通常通过使每种肺炎链球菌血清型在培养基中生长来生产荚膜多糖(例如，在基于大豆的培养基中)，继而从细菌培养物制备多糖。生物体(肺炎链球菌血清型12F)的群体常常从种子小瓶规模放大至种子瓶，并通过一个或多个体积增加的种子发酵罐传代直至达到生产规模的发酵体积。在生长循环结束时将细胞裂解并接着收获裂解液肉汤用于下游(纯化)的加工(参见例如WO 2006/110381和WO 2008/118752、美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2008/0102498和US2008/0286838)。多糖通常是通过离心、沉淀、超滤、和/或柱层析来进行纯化(参见例如WO 2006/110352和WO 2008/118752)。
如本文进一步描述的，来自血清型12F的纯化的多糖可被活化(例如，化学活化)以使得它们能够反应并继而并入到本发明糖缀合物中。
在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型12F的纯化多糖在缀合前具有10kDa至2,000kDa的分子量。在一实施方案中，所述荚膜多糖具有50kDa至1,000kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有50kDa至300kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有70kDa至300kDa的分子量。在另外的实施方案中，所述荚膜多糖具有如下的分子量：90kDa至250kDa；90kDa至150kDa；90kDa至120kDa；80kDa至120kDa；70kDa至100kDa；70kDa至110kDa；70kDa至120kDa；70kDa至130kDa；70kDa至140kDa；70kDa至150kDa；70kDa至160kDa；80kDa至110kDa；80kDa至120kDa；80kDa至130kDa；80kDa至140kDa；80kDa至150kDa；80kDa至160kDa；90kDa至110kDa；90kDa至120kDa；90kDa至130kDa；90kDa至140kDa；90kDa至150kDa；90kDa至160kDa；100kDa至120kDa；100kDa至130kDa；100kDa至140kDa；100kDa至150kDa；100kDa至160kDa；以及类似的期望分子量范围。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
多糖在正常纯化过程中可被稍微减小大小。另外，如本文所述，多糖可在缀合前经历改变大小的技术。上述提到的分子量范围是指在缀合前(例如，活化之前)在最终的改变大小步骤之后的纯化多糖。
1.2.6肺炎球菌多糖血清型15B
如图5所示，血清型15B的纯化多糖重复单元由分枝的三糖骨架(一个N-乙酰基葡萄糖胺(GlcpNAc)、一个吡喃半乳糖(Galp)、和一个吡喃葡萄糖(Glcp))组成，所述三糖骨架具有连接至GlcpNAc的C4羟基基团的αGalp-βGalp二糖分枝。磷酸甘油连接至所述二糖分枝中βGalp残基的C3羟基基团(Jones等人(2005)Carbohydrate Research 340(3):403-409)。来自血清型15C血清型的荚膜多糖具有与血清型15B相同的骨架结构但却缺少O-乙酰化。
血清型15B多糖可使用本领域技术人员已知的分离过程而直接从细菌获得(参见例如美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340、和2008/0102498以及WO 2008/118752中公开的方法)。它们可通过使用本领域技术人员已知的合成方案来产生。
血清型15B肺炎链球菌菌株可获得自已建立的培养物收集(如例如美国模式培养物保藏所(ATCC,Manassas,VA USA)(例如，保藏菌株号ATCC10354)或者链球菌参考实验室(美国国家疾病控制与预防中心,Atlanta,GA USA))或者来自临床样本。
细菌细胞在培养基中(优选在基于大豆的培养基中)生长。在生产肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的细菌细胞的发酵之后，将细菌细胞裂解以产生细胞裂解物。继而可使用本领域已知的纯化技术从细胞裂解物分离血清型15B的多糖，包括使用离心、深度过滤、沉淀、超滤、用活性炭处理、渗滤和/或柱层析(参见例如美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340、以及2008/0102498和WO2008/118752)。纯化的血清型15B荚膜多糖继而可用于制备免疫原性缀合物。
通过从肺炎链球菌水解物中纯化血清型15B多糖以及任选地将纯化的多糖改变大小而获得的分离的血清型15B荚膜多糖，可通过不同的参数进行表征，所述参数包括例如分子量(MW)、每mM所述血清型15B荚膜多糖的乙酸根的mM数以及每mM所述血清型15B荚膜多糖的甘油的mM数。
优选地，为了产生具有有利的过滤性特征和/或产量的血清型15B缀合物，在缀合至载体蛋白之前将多糖大小改变为目标分子量的范围。有利的是，纯化的血清型15B多糖的大小被减小而又保留该多糖结构的关键特征如例如O-乙酰基基团的存在。优选地，纯化的血清型15B多糖的大小是通过机械均质化来减小的。
在优选的实施方案中，通过高压均质化来减小纯化的血清型15B多糖的大小。高压均质化通过将加工流泵送穿过尺寸足够小的流径而实现高剪切速率。通过使用更大的应用均质化压力而提高剪切速率，且可通过使原料流通过均质器重循环而增加暴露时间。
所述高压均质化过程特别适于减小纯化的血清型15B多糖的大小，而又保留所述多糖的结构特征，如O-乙酰基基团的存在。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有如下的分子量：5kDa至500kDa、50kDa至500kDa、50kDa至450kDa、100kDa至400kDa、以及100kDa至350kDa。在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至350kDa的分子量。在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至300kDa的分子量。在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有150kDa至300kDa的分子量。在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有150kDa至350kDa的分子量。在另外的实施方案中，所述荚膜多糖具有如下分子量：100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；100kDa至200kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；150kDa至300kDa；150kDa至200kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；以及类似的期望分子量范围。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
血清型15B多糖是O-乙酰化的并且O-乙酰化的总量是每个多糖重复单元约0.8-0.9个O-乙酰基基团。多糖的O-乙酰化程度可通过本领域已知的任何方法来确定，例如，通过质子NMR(参见例如Lemercinier等人(1996)Carbohydrate Research 296:83-96；Jones等人(2002)J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233-1247；WO 2005/033148和WO00/56357)。另外常用的方法在Hestrin,S.(1949)J.Biol.Chem.180:249-261中描述。优选地，通过离子HPLC分析确定O-乙酰基基团的存在。
纯化的、分离的或活化的血清型15B荚膜多糖中或者血清型15B多糖-载体蛋白缀合物中O-乙酰基的存在表示为每mM所述多糖的乙酸根的mM数或者表示为每个多糖重复单元O-乙酰基基团的数目。
在优选的实施方案中，分离的血清型15B的夹膜多糖对于每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、或0.8mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖对于每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.5、0.6或0.7mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖对于每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖对于每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.7mM的乙酸根。
磷酸甘油侧链的存在(在通过用氢氟酸(HF)处理多糖而使其释放之后)是通过使用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)测量甘油而确定的。纯化的、分离的或活化的血清型15B多糖中或者血清型15B多糖-载体蛋白缀合物中存在的甘油表示为每mM血清型15B多糖的甘油的mM数。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖对于每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM的甘油。在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖对于每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.5、0.6或0.7mM的甘油。在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.7mM的甘油。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至350kDa的分子量以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至350kDa的分子量以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有150kDa至300kDa的分子量以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有150kDa至300kDa的分子量以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有150kDa至350kDa的分子量以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有150kDa至350kDa的分子量以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖对于每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根以及对于每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至350kDa的分子量以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根和每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有150kDa至300kDa的分子量以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根和每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型15B荚膜多糖具有150kDa至350kDa的分子量以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根和每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。
1.2.7肺炎球菌多糖血清型22F
如图6所示，血清型22F的多糖重复单元由分枝的五糖骨架(一个葡萄糖醛酸(GlcpA)、一个吡喃葡萄糖(Glcp)、一个呋喃半乳糖(Galf)和两个吡喃鼠李糖(Rhap))与连接至βRhap的C3羟基基团的αGlcp分枝组成(Richards等人(1989)Canadian Journal ofChemistry 67(6):1038-1050)。多糖重复单元中βRhap残基约80％的C2羟基基团是O-乙酰化的。
血清型22F多糖可使用本领域技术人员已知的分离过程而直接从细菌获得(参见例如美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340、和2008/0102498以及WO 2008/118752中公开的方法)。另外，它们可使用合成方案来产生。
血清型22F肺炎链球菌菌株可获得自已建立的培养物收集(如例如链球菌参考实验室(美国国家疾病控制与预防中心,Atlanta,GA))或者临床样本。
通过从肺炎链球菌水解物纯化血清型22F多糖以及任选地将纯化的多糖改变大小而获得的分离的血清型22F荚膜多糖，可通过不同的参数来进行表征，包括例如分子量(MW)以及每mM所述血清型22F荚膜多糖的乙酸根的mM数。
优选地，为了产生具有有利的过滤性特征和/或产量的血清型22F缀合物，在缀合至载体蛋白之前将多糖大小改变为目标分子量的范围。有利的是，纯化的血清型22F多糖的大小被减小而又保留该多糖结构的关键特征如例如O-乙酰基基团的存在。优选地，纯化的血清型22F多糖的大小是通过机械均质化来减小的。
在优选的实施方案中，通过高压均质化将纯化的多糖的大小减小。高压均质化通过将加工流泵送穿过尺寸足够小的流径而实现高剪切速率。通过使用更大的应用均质化压力而提高剪切速率，并且可通过使原料流通过均质器重循环而提高暴露时间。
所述高压均质化过程特别适宜用于减小纯化的血清型22F多糖的大小，而又保留该多糖的结构特征，如O-乙酰基基团的存在。
在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型22F的纯化多糖在缀合前具有10kDa至2,000kDa的分子量。在一实施方案中，所述荚膜多糖具有50kDa至1,000kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有70kDa至900kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有100kDa至800kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有200kDa至600kDa的分子量。在另一实施方案中，所述荚膜多糖具有400kDa至700kDa的分子量。
在另外的实施方案中，所述荚膜多糖具有如下分子量：100kDa至1,000kDa；100kDa至900kDa；100kDa至800kDa；100kDa至700kDa；100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；150kDa至1,000kDa；150kDa至900kDa；150kDa至800kDa；150kDa至700kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；150kDa至300kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至900kDa；200kDa至800kDa；200kDa至700kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；200kDa至300kDa；250kDa至1,000kDa；250kDa至900kDa；250kDa至800kDa；250kDa至700kDa；250kDa至600kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至1,000kDa；300kDa至900kDa；300kDa至800kDa；300kDa至700kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至1,000kDa；400kDa至900kDa；400kDa至800kDa；400kDa至700kDa；400kDa至600kDa；500kDa至600kDa；以及类似的期望分子量范围。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
多糖在正常纯化过程中大小可被稍微减小。另外，如上述所述，22F多糖可在缀合前经历改变大小的技术。上述提到的分子量范围是指在缀合前(例如，活化之前)在最终的改变大小步骤之后的纯化多糖。
多糖的O-乙酰化程度可通过本领域已知的任何方法来确定，例如，通过质子NMR(Lemercinier等人(1996)Carbohydrate Research 296:83-96；Jones等人(2002)J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233-1247；WO 2005/033148和WO 00/56357)。其他常用的方法在Hestrin,S.(1949)J.Biol.Chem.180:249-261中描述。优选地，通过离子HPLC分析确定O-乙酰基基团的存在。
纯化的、分离的或活化的血清型22F荚膜多糖中或者血清型22F多糖-载体蛋白缀合物中O-乙酰基的存在表示为每mM的所述多糖乙酸根的mM数或者表示为每个多糖重复单元O-乙酰基基团的数目。
在优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型22F的纯化多糖对于每μmol的所述血清型22F荚膜多糖具有至少0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4或1.6μmol的乙酸根。
1.2.8肺炎球菌多糖血清型33F
如图7所示，血清型33F的多糖重复单元由分枝的五糖骨架(两个吡喃半乳糖(Galp)、两个呋喃半乳糖(Galf)和一个吡喃葡萄糖(Glcp)与连接至骨架内αGalp残基的C2羟基基团的末端αGalp组成(Lemercinier等人(2006)Carbohydrate Research 341(1):68-74.)。文献中有报道骨架3-β-Galf残基的C2羟基基团是O-乙酰化的。
血清型33F多糖可使用本领域技术人员已知的分离过程而直接从细菌获得(参见例如美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340、和2008/0102498以及WO 2008/118752中公开的方法)。另外，它们可使用合成方案来产生。
血清型33F肺炎链球菌菌株可获得自已建立的培养物收集(如例如链球菌参考实验室(美国国家疾病控制与预防中心,Atlanta,GA))或者临床样本。
如本文进一步描述的，来自血清型33F的纯化的多糖可被活化(例如，化学活化)以使得它们能够反应并继而并入本发明的糖缀合物中。
通过从肺炎链球菌水解物纯化的血清型33F多糖以及任选地将纯化的多糖改变大小而获得的分离的血清型33F荚膜多糖，可通过不同的参数来进行表征，包括例如分子量以及每mM所述血清型33F荚膜多糖的乙酸根的mM数。
在一些实施方案中，来自肺炎链球菌血清型33F的纯化多糖在缀合前具有10kDa至2,000kDa的分子量。在其它此类实施方案中，所述糖具有50kDa至2,000kDa的分子量。在另外的此类实施方案中，所述糖具有如下的分子量：50kDa至1,750kDa；50kDa至1,500kDa；50kDa至1,250kDa；50kDa至1,000kDa；50kDa至750kDa；50kDa至500kDa；100kDa至2,000kDa；100kDa至1,750kDa；100kDa至1,500kDa；100kDa至1,250kDa；100kDa至1,000kDa；100kDa至750kDa；100kDa至500kDa；200kDa至2,000kDa；200kDa至1,750kDa；200kDa至1,500kDa；200kDa至1,250kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至750kDa；或者200kDa至500kDa。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
多糖在正常纯化过程中大小可被稍微减小。另外，如本文所述，多糖可在缀合前经历改变大小的技术。上述提到的分子量范围是指在缀合前(例如，活化之前)在最终的改变大小步骤之后的纯化多糖。
纯化的、分离的或活化的血清型33F荚膜多糖中或者血清型33F多糖-载体蛋白缀合物中O-乙酰基的存在表示为每mM的所述多糖的乙酸根的mM数或者表示为每个多糖重复单元的O-乙酰基基团的数目。
在优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型33F的纯化多糖对于每μmol的所述血清型33F荚膜多糖具有至少0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4或1.6μmol的乙酸根。
1.3本发明的糖缀合物
纯化的糖经化学活化以使得所述糖(即，活化的糖)能够与载体蛋白反应。一旦活化，每种荚膜糖单独缀合至载体蛋白以形成糖缀合物。在一实施方案中，每种荚膜糖缀合至相同的载体蛋白。糖的化学活化以及随后缀合至载体蛋白可通过本文公开的活化和缀合方法来完成。
1.3.1来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物
来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜多糖通过本领域技术人员已知的标准技术来制备(参见例如WO 2006/110381、WO 2008/118752、WO 2006/110352以及美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2008/0102498和2008/0286838)。
在一实施方案中，将所述多糖用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化以形成氰酸酯。继而将所述活化的多糖直接或者通过间隔物(接头)基团偶联至载体蛋白(优选CRM197)上的氨基基团。例如，所述间隔物可以是胱胺或半胱胺以给出硫醇化的多糖，其可经硫醚键偶联至载体，所述硫醚键是通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白反应后获得的(例如使用N-[γ-马来酰亚胺丁基氧]丁二酰亚胺酯(GMBS))或者与卤代乙酰化的载体蛋白反应后获得的(例如使用碘乙酰亚胺、N-琥珀酰亚胺溴乙酸酯(SBA；SIB)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SlAB)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(sulfo-SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)或者琥珀酰亚胺基3-[溴乙酰胺]丙酸酯(SBAP))。优选地，所述氰酸酯(任选由CDAP化学制备)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联并且氨基衍生的糖用碳化二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学经蛋白载体上的羧基缀合至载体蛋白(例如，CRM197)。此类缀合物在例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中描述。
其它适合的技术使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷(norborane)、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S--NHS、EDC、TSTU进行缀合。许多在国际专利申请公开号WO 98/42721中描述。缀合可涉及羰基接头，其可通过糖的自由羟基与1,1’-羰二咪唑(CDI)反应而形成(参见Bethell等人(1979)J.Biol.Chem.254:2572-2574；Hearn等人(1981)J.Chromatogr.218:509-518)随后与蛋白质反应以形成氨基甲酸酯键。这可涉及将异头端还原成伯羟基、任选地对伯羟基的保护/去保护、伯羟基与CDI反应以形成CDI氨基甲酸酯中间体、以及CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基基团偶联。
在优选的实施方案中，至少一种来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜多糖通过还原胺化缀合至载体蛋白(如美国专利申请公开号2006/0228380、2007/0231340、2007/0184071和2007/0184072、WO 2006/110381、WO 2008/079653、和WO 2008/143709中所述的)。在优选的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜多糖全部都是通过还原胺化缀合至载体蛋白。
还原胺化涉及两个步骤：(1)多糖的氧化，以及(2)所述活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物。在氧化之前，所述多糖任选是经水解的。可使用机械或化学水解。可用乙酸来进行化学水解。氧化步骤可涉及与高碘酸盐反应。对于本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸；该术语也包括偏高碘酸盐(IO4 -)和正高碘酸盐(IO6 5-)以及高碘酸的各种盐(例如，高碘酸钠和高碘酸钾)。
在一实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F或23F的荚膜多糖在偏高碘酸盐的存在下被氧化，优选是在高碘酸钠(NaIO4)的存在下被氧化。在另一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜多糖在正高碘酸盐的存在下被氧化，优选是在高碘酸的存在下被氧化。
在多糖的氧化步骤之后，所述多糖被认为是活化的且在以下被称作“活化的多糖”。所述活化的多糖和所述载体蛋白可以是冻干的(冷冻干燥)，无论是单独(分别冻干)或一起(共冻干)冻干的。在一实施方案中，所述活化的多糖和所述载体蛋白是共冻干的。在另一实施方案中，所述活化的多糖和所述载体蛋白是单独冻干的。
在一实施方案中，所述冻干在非还原糖的存在下进行，可能的非还原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和异麦芽糖醇(palatinit)。
缀合方法的第二个步骤是所述活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物(所谓的还原胺化)，其中使用还原剂。适合的还原剂包括氰基硼氢化物，如氰基硼氢化钠、硼烷吡啶、或硼氢化物交换树脂。在一实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。
在一实施方案中，在水溶剂中进行还原反应，在另一实施方案中，在非质子溶剂(aprotic solvent)中进行所述反应。在一实施方案中，在DMSO(二甲基亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行所述还原反应。所述DMSO或DMF溶剂可用于将冻干的所述活化的多糖和载体蛋白重构(reconstitute)。
在还原反应结束时，缀合物中可留有未反应的醛基，可使用适合的封闭剂来将这些封闭封闭。在一实施方案中，此封闭剂是硼氢化钠(NaBH4)。在缀合(还原以及任选存在的封闭)之后，可将糖缀合物纯化。糖缀合物可通过渗滤和/或离子交换层析和/或大小排阻层析来进行纯化。在一实施方案中，通过渗滤或离子交换层析或大小排阻层析来纯化所述糖缀合物。在一实施方案中，所述糖缀合物经无菌过滤。
在一些实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型9V和/或18C的糖缀合物包含糖，所述糖具有如下程度的O-乙酰化：10％至100％、20％至100％、30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、90％至100％、50％至90％、60％至90％、70％至90％或者80％至90％。在其它实施方案中，O-乙酰化程度为≥10％、≥20％、≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、或≥90％、或者约100％。
在一些实施方案中，本发明的所述来自肺炎链球菌血清型9V和/或18C的糖缀合物是O-乙酰化的。在一些实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型9V的糖缀合物是O-乙酰化的且来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是脱-O-乙酰化的。
1.3.2来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物
在一实施方案中，所述血清型22F糖缀合物是通过用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯而获得的。该活化的多糖可直接或者经间隔物(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基基团。例如，所述间隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化的多糖，所述多糖可经硫醚键偶联至载体，所述硫醚键是通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白反应后获得的(例如使用GMBS)或者与卤代乙酰化的载体蛋白反应后获得的(例如使用碘乙酰亚胺、SIB、SlAB、磺基-SIAB、SIA或者SBAP)。优选地，所述氰酸酯(任选由CDAP化学制备)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联并且氨基衍生的糖用碳化二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学经蛋白载体上的羧基基团缀合至载体蛋白。此类缀合物在例如WO 93/15760、WO95/08348和WO 96/129094中描述。
其它适合的技术使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S--NHS、EDC、TSTU进行缀合。许多在国际专利申请公开号WO 98/42721中描述。缀合可涉及羰基接头，其可通过糖的自由羟基与CDI反应形成(参见Bethell等人(1979)J.Biol.Chem.254:2572-2574；Hearn等人(1981)J.Chromatogr.218:509-518)随后是与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键。这可涉及将异头端还原成伯羟基、任选地对伯羟基保护/去保护、伯羟基与CDI反应以形成CDI氨基甲酸酯中间体、以及CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基基团偶联。
在优选的实施方案中，本发明的血清型22F的糖缀合物是使用还原胺化制备的。还原胺化涉及两个步骤：(1)多糖的氧化以从单个六糖单元中的邻位二醇产生醛的功能性，以及(2)所述活化的多糖和载体蛋白(例如CRM197)的还原以产生缀合物。
优选地，在氧化前，将所述血清型22F的多糖改变大小至目标分子量(MW)范围。有利的是，纯化的血清型22F多糖的大小被减小而又保留该多糖结构的关键特征，如例如O-乙酰基基团的存在。优选地，纯化的血清型22F多糖的大小是通过机械均质化来减小的(参见上述1.2.7节)。
在一实施方案中，通过包括以下步骤的方法将血清型多糖活化(氧化)：
(a)将分离的血清型22F多糖与氧化剂反应；以及
(b)通过添加猝灭剂使氧化反应猝灭，其导致了活化的血清型22F多糖。
在优选的实施方案中，所述氧化剂是高碘酸盐。为了本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸；该术语也包括偏高碘酸盐(IO4 -)和正高碘酸盐(IO6 5-)以及高碘酸的各种盐(例如，高碘酸钠和高碘酸钾)。在优选的实施方案中，所述氧化剂是高碘酸钠。在优选的实施方案中，用于氧化血清型22F多糖的高碘酸盐是偏高碘酸盐。在优选的实施方案中，用于氧化血清型22F多糖的高碘酸盐是偏高碘酸钠。
在一实施方案中，所述猝灭剂选自邻位二醇、1,2-氨基醇、氨基酸、谷胱甘肽、亚硫酸盐、硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐、或亚磷酸。
在一实施方案中，所述猝灭剂是式(I)的1,2-氨基醇：
其中R1选自H、甲基、乙基、丙基、或异丙基。
在一实施方案中，所述猝灭剂选自亚硫酸盐、硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐、或亚磷酸的钠盐和钾盐。
在一实施方案中，所述猝灭剂是氨基酸。在此类实施方案中，所述氨基酸可选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、和组氨酸。
在一实施方案中，所述猝灭剂是亚硫酸盐如硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐。
在一实施方案中，所述猝灭剂是包含两个邻位羟基(邻位二醇)的化合物，即两个羟基共价连接至两个临近的碳原子。
优选地，所述猝灭剂是式(II)的化合物：
其中R1和R2彼此独立地选自H、甲基、乙基、丙基、或异丙基。
在优选的实施方案中，所述猝灭剂是甘油、乙二醇、1,2-丙二醇(Propan-1,2-Diol)、1,2-丁二醇或2,3-丁二醇、或者抗坏血酸。在优选的实施方案中，所述猝灭剂是2,3-丁二醇。
在优选的实施方案中，所述分离的血清型22F多糖由包括以下步骤的方法活化：
(a)将分离的血清型22F多糖与高碘酸盐反应；和
(b)通过加入2,3-丁二醇而使氧化反应猝灭，导致活化的血清型22F多糖。
在多糖的氧化步骤之后，所述多糖被认为是活化的且在以下被称作“活化的多糖”。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型22F多糖经纯化。所述活化的血清型22F多糖根据本领域技术人员已知的方法来纯化，如凝胶渗透层析(GPC)、透析或超滤/渗滤。例如，所述活化的22F多糖通过浓缩以及用超滤装置渗滤来进行纯化。
在优选的实施方案中，活化的血清型22F多糖的氧化度为2至30、2至25、2至20、2至15、2至10、2至5、5至30、5至25、5至20、5至15、5至10、10至30、10至25、10至20、10至15、15至30、15至25、15至20、20至30、或20至25。在优选的实施方案中，活化的血清型22F多糖的氧化度为2至10、4至8、4至6、6至8、6至12、8至14、9至11、10至16、12至16、14至18、16至20、16至18、18至22、或18至20。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型22F多糖具有如下的分子量：25kDa至1,000kDa、100kDa至1,000kDa、300kDa至800kDa、300kDa至700kDa、300kDa至600kDa、400kDa至1,000kDa、400kDa至800kDa、400kDa至700kDa、或400kDa至600kDa。在一实施方案中，所述活化的血清型22F多糖具有300kDa至800kDa的分子量。在一实施方案中，所述活化的血清型22F多糖具有400kDa至600kDa的分子量。在优选的实施方案中，所述活化的血清型22F多糖具有400kDa至600kDa的分子量以及10至25、10至20、12至20或14至18的氧化度。在优选的实施方案中，所述活化的血清型22F多糖具有400kDa至600kDa的分子量以及10至20的氧化度。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型22F多糖每mM的血清型22F多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、或0.7、或约0.8mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述活化的血清型22F多糖每mM的血清型22F多糖包含至少0.5、0.6、或0.7mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述活化的血清型22F多糖每mM的血清型22F多糖包含至少0.6mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述活化的血清型22F多糖每mM的血清型22F多糖包含至少0.7mM的乙酸根。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型22F多糖具有400kDa至800kDa的分子量以及每mM的血清型22F多糖包含至少0.6mM的乙酸根。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型22F多糖具有400kDa至800kDa的分子量、12至20的氧化度以及每mM的血清型22F多糖包含至少0.6mM的乙酸根。
所述活化的多糖和/或所述载体蛋白可以是经过冻干(冷冻干燥)的，无论是单独冻干(分别冻干)还是一起(共冻干)冻干。
在一实施方案中，所述活化的血清型22F多糖是冻干的，任选地在糖的存在下冻干。在优选的实施方案中，所述糖选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和异麦芽糖醇。在优选的实施方案中，所述糖是蔗糖。在一实施方案中，所述冻干的活化的多糖继而与包含载体蛋白的溶液混合。
在另一实施方案中，所述活化的多糖和所述载体蛋白是经过共冻干的。在此类实施方案中，所述活化的血清型22F多糖与载体蛋白混合并任选地在糖的存在下冻干。在优选的实施方案中，所述糖选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和异麦芽糖醇。在优选的实施方案中，所述糖是蔗糖。所述共冻干的多糖和载体蛋白继而可在溶液中重悬并与还原剂反应。
缀合方法的第二个步骤是所述活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物(还原胺化)，其中使用还原剂。
所述活化的血清型22F多糖可通过包括以下步骤的方法缀合至载体蛋白：
(c)将所述活化的血清型22F多糖与载体蛋白混合；和
(d)将所述混合的活化的血清型22F多糖和载体蛋白与还原剂反应以形成血清型22F多糖-载体蛋白缀合物。
在一实施方案中，在水溶剂中进行还原反应。在另一实施方案中，在非质子溶剂中进行所述反应。在一实施方案中，在DMSO(二甲基亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行所述还原反应。所述DMSO或DMF溶剂可用于将已经被冻干的所述活化的多糖和载体蛋白重构。
活化的血清型22F多糖与蛋白载体通过在二甲基亚砜(DMSO)中的还原胺化而缀合，其相较于例如多糖的O-乙酰化水平可显著降低的水相中的还原胺化适于保存所述多糖的O-乙酰基含量。因此在优选的实施方案中，步骤(c)和步骤(d)在DMSO中进行。
在一实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、硼氢化钠或硼氢化锌(其中存在Bronsted或Lewis酸)、胺硼烷如硼烷吡啶、2-甲基吡啶硼烷、2,6-乙硼烷-甲醇、二甲基胺硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苄胺-BH3或5-乙基-2-甲基硼烷吡啶(PEMB)。在优选的实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。
在还原反应结束时，缀合物中可留有未反应的醛基，可用适合的封闭剂将这些封闭。在一实施方案中，此封闭剂是硼氢化钠(NaBH4)。
在血清型22F多糖缀合至载体蛋白之后，所述缀合物可通过本领域技术人员已知的多种技术来进行纯化(对多糖-蛋白缀合物的量进行富集)。这些技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流过滤沉淀/洗脱、柱层析(DEAE或疏水相互作用层析)、和深度过滤。
在一些实施方案中，本发明的血清型22F糖缀合物包含具有10kDa至2,000kDa的分子量的糖。在其它此类实施方案中，所述糖具有50kDa至1,000kDa的分子量。在其它此类实施方案中，所述糖具有70kDa至900kDa的分子量。在其它此类实施方案中，所述糖具有100kDa至800kDa的分子量。在其它此类实施方案中，所述糖具有200kDa至600kDa的分子量。在另外的此类实施方案中，所述糖具有如下的分子量：100kDa至1,000kDa；100kDa至900kDa；100kDa至800kDa；100kDa至700kDa；100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；150kDa至1,000kDa；150kDa至900kDa；150kDa至800kDa；150kDa至700kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；150kDa至300kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至900kDa；200kDa至800kDa；200kDa至700kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；200kDa至300kDa；250kDa至1,000kDa；250kDa至900kDa；250kDa至800kDa；250kDa至700kDa；250kDa至600kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至1000kDa；300kDa至900kDa；300kDa至800kDa；300kDa至700kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至1,000kDa；400kDa至900kDa；400kDa至800kDa；400kDa至700kDa；400kDa至600kDa；500kDa至600kDa。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。在一些此类实施方案中，所述血清型22F糖缀合物是使用还原胺化来制备的。
在一些实施方案中，本发明的血清型22F的糖缀合物具有如下的分子量：400kDa至15,000kDa；500kDa至10,000kDa；2,000kDa至10,000kDa；3,000kDa至8,000kDa；或者3,000kDa至5,000kDa。在其它实施方案中，所述血清型22F糖缀合物具有500kDa至10,000kDa的分子量。在其它实施方案中，所述血清型22F糖缀合物具有1,000kDa至8,000kDa的分子量。在其它的实施方案中，所述血清型22F糖缀合物具有2,000kDa至8,000kDa的分子量或者3,000kDa至7,000kDa的分子量。在另外的实施方案中，本发明的血清型22F的糖缀合物具有如下的分子量：200kDa至20,000kDa；200kDa至15,000kDa；200kDa至10,000kDa；200kDa至7,500kDa；200kDa至5,000kDa；200kDa至3,000kDa；200kDa至1,000kDa；500kDa至20,000kDa；500kDa至15,000kDa；500kDa至12,500kDa；500kDa至10,000kDa；500kDa至7,500kDa；500kDa至6,000kDa；500kDa至5,000kDa；500kDa至4,000kDa；500kDa至3,000kDa；500kDa至2,000kDa；500kDa至1,500kDa；500kDa至1,000kDa；750kDa至20,000kDa；750kDa至15,000kDa；750kDa至12,500kDa；750kDa至10,000kDa；750kDa至7,500kDa；750kDa至6,000kDa；750kDa至5,000kDa；750kDa至4,000kDa；750kDa至3,000kDa；750kDa至2,000kDa；750kDa至1,500kDa；1,000kDa至15,000kDa；1,000kDa至12,500kDa；1,000kDa至10,000kDa；1,000kDa至7,500kDa；1,000kDa至6,000kDa；1,000kDa至5,000kDa；1,000kDa至4,000kDa；1,000kDa至2,500kDa；2,000kDa至15,000kDa；2,000kDa至12,500kDa；2,000kDa至10,000kDa；2,000kDa至7,500kDa；2,000kDa至6,000kDa；2,000kDa至5,000kDa；2,000kDa至4,000kDa；或者2,000kDa至3,000kDa。
在另外的实施方案中，本发明的血清型22F的糖缀合物具有如下的分子量：3,000kDa至20,000kDa；3,000kDa至15,000kDa；3,000kDa至10,000kDa；3,000kDa至7,500kDa；3,000kDa至5,000kDa；4,000kDa至20,000kDa；4,000kDa至15,000kDa；4,000kDa至12,500kDa；4,000kDa至10,000kDa；4,000kDa至7,500kDa；4,000kDa至6,000kDa；或者4,000kDa至5,000kDa。
在另外的实施方案中，本发明的血清型22F的糖缀合物具有如下的分子量：5,000kDa至20,000kDa；5,000kDa至15,000kDa；5,000kDa至10,000kDa；5,000kDa至7,500kDa；6,000kDa至20,000kDa；6,000kDa至15,000kDa；6,000kDa至12,500kDa；6,000kDa至10,000kDa；或者6,000kDa至7,500kDa。
糖缀合物的分子量是通过SEC-MALLS测量的。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
在优选的实施方案中，本发明的血清型22F的糖缀合物每mM的血清型22F多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、或0.7或约0.8mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述糖缀合物每mM的血清型22F多糖包含至少0.5、0.6、或0.7mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述糖缀合物每mM的血清型22F多糖包含至少0.6mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述糖缀合物每mM的血清型22F多糖包含至少0.7mM的乙酸根。
在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、或0.95。在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.7。在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.9。
在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、或0.95。在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.7。在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM血清型22F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.9。
对本发明的血清型22F的糖缀合物进行表征的另一个方式是，通过载体蛋白(例如CRM197)中与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可表征为缀合的赖氨酸的范围(缀合度)。载体蛋白的赖氨酸修饰的证据(由于与多糖的共价键)，可通过使用本领域技术人员已知的常规方法进行的氨基酸分析来获得。缀合导致回收的赖氨酸残基的数目与用于产生缀合物材料的CRM197蛋白起始材料相比降低。在优选的实施方案中，本发明血清型22F的糖缀合物的缀合度为2至15、2至13、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、3至15、3至13、3至10、3至8、3至6、3至5、3至4、5至15、5至10、8至15、8至12、10至15、或者10至12。在一实施方案中，本发明血清型22F的糖缀合物的缀合度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、或约15。在优选的实施方案中，本发明血清型22F的糖缀合物的缀合度为4至7。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
本发明的血清型22F的糖缀合物还可通过糖与载体蛋白的比例(重量/重量)来进行表征。在一些实施方案中，所述糖缀合物中血清型22F多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.5至3.0(例如，约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、或约3.0)。在其它实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.5至2.0、0.5至1.5、0.8至1.2、0.5至1.0、1.0至1.5、或1.0至2.0。在另外的实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.8至1.2。在优选的实施方案中，所述缀合物中血清型22F荚膜多糖与载体蛋白的比例为0.9至1.1。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
本发明的血清型22F糖缀合物和免疫原性组合物可含有未共价缀合至载体蛋白但却存在于糖缀合物的组合物中的游离糖。所述游离糖可非共价地与糖缀合物相关联(即非共价地结合至、吸附至、或包埋在糖缀合物中/与糖缀合物包埋)。
在优选的实施方案中，所述血清型22F糖缀合物包含相较于血清型22F多糖的总量低于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、或15％的游离血清型22F多糖。在优选的实施方案中，所述血清型22F糖缀合物包含相较于血清型22F多糖的总量低于约40％的游离血清型22F多糖。在优选的实施方案中，所述血清型22F糖缀合物包含相较于血清型22F多糖的总量低于约25％的游离血清型22F多糖。在优选的实施方案中，所述血清型22F糖缀合物包含相较于血清型22F多糖的总量低于约20％的游离血清型22F多糖。在优选的实施方案中，所述血清型22F糖缀合物包含相较于血清型22F多糖的总量低于约15％的游离血清型22F多糖。
血清型22F糖缀合物也可通过其分子大小分布(Kd)来进行表征。大小排阻层析介质(CL-4B)可用于确定缀合物的相对分子大小分布。在重力进料柱(gravity fed column)中使用大小排阻层析(SEC)来描述缀合物的分子大小分布。大分子从介质洗脱物中的孔排出，比小分子要快得多。级分收集器(fraction collector)被用于收集柱洗脱物。通过糖测定法对级分进行比色测试。为了确定Kd，将柱进行校准以建立分子完全排出的级分(V0)，(Kd＝0)，以及代表最大滞留的级分(Vi)，(Kd＝1)。达到指定样品属性的级分(Ve)通过表达式Kd＝(Ve-V0)/(Vi-V0)而与Kd相关。
在优选的实施方案中，至少30％的血清型22F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少40％的糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％的血清型22F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少60％的血清型22F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，50％至80％的血清型22F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，65％至80％的血清型22F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
1.3.3来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物
在一实施方案中，血清型33F糖缀合物是通过用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯而获得的。该活化的多糖可直接或者经间隔物(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基基团。例如，所述间隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化的多糖，其可经硫醚键偶联至载体，所述硫醚键是通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白反应后获得的(例如使用GMBS)或者与卤代乙酰化的载体蛋白反应后获得的(例如使用碘乙酰亚胺、SIB、SlAB、sulfo-SIAB、SIA或者SBAP)。优选地，所述氰酸酯(任选地由CDAP化学制备)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联并且氨基衍生的糖用碳化二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学经蛋白载体上的羧基缀合至载体蛋白。此类缀合物在例如WO 93/15760、WO95/08348和WO96/129094中描述。
其它适合的技术使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、对硝基苯甲酸、N-羟基丁二酰亚胺、S--NHS、EDC、TSTU进行缀合。许多在国际专利申请公开号WO 98/42721中描述。缀合可涉及羰基接头，其可通过糖的自由羟基与CDI反应而形成(参见Bethell等人(1979)J.Biol.Chem.254:2572-2574；Hearn等人(1981)J.Chromatogr.218:509-518)随后是与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键。这可涉及将异头端还原成伯羟基、任选地对伯羟基保护/去保护、伯羟基与CDI反应以形成CDI氨基甲酸酯中间体、以及所述CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基基团偶联。
在某些实施方案中，本发明血清型33F糖缀合物是使用还原胺化来制备的。在此种实施方案中，本发明血清型33F糖缀合物可用还原胺化在水相(RAC/水)中制备。水相中的还原胺化已经成功地应用于产生肺炎球菌缀合物疫苗(参见例如WO 2006/110381)。但优选地当使用还原胺化时，经在DMSO中的还原胺化(RAC/DMSO)来制备血清型33F糖缀合物。考虑到使用RAC/水方法时与保持O-乙酰基功能性相关的挑战，优选在DMSO中还原胺化。RAC/DMSO已被成功应用于产生肺炎球菌缀合物疫苗(参见例如WO2006/110381)。
在优选的实施方案中，本发明血清型33F糖缀合物用eTEC缀合来制备(下述称作“血清型33F eTEC连接的糖缀合物”)，如实施例1、2和3以及WO 2014/027302中所描述的。所述33F糖缀合物包含通过一或多个eTEC间隔物而共价缀合至载体蛋白的糖，其中所述糖通过氨基甲酸酯键共价缀合至eTEC间隔物，并且其中所述载体蛋白通过酰胺键共价缀合至eTEC间隔物。所述eTEC连接的本发明糖缀合物可由通式(III)表示：
其中构成eTEC间隔物的原子被包含在中间的框中。
所述eTEC间隔物包括7个线性原子(即，–C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-)并在糖和载体蛋白之间提供稳定的硫醚键和酰胺键。eTEC连接的糖缀合物的合成涉及糖的活化的羟基基团与硫代烷基胺试剂(例如，胱胺或半胱氨酸胺或其盐)的氨基基团的反应，使糖形成氨基甲酸酯键以提供硫醇化的糖。通过与还原剂的反应而实现了一或多个游离巯基基团的产生，以提供活化的硫醇化糖。活化的硫醇化糖的游离巯基基团与活化的载体蛋白(其在含有胺的残基上具有一或多个α-卤乙酰胺基团)反应，产生硫醚键以形成缀合物，其中所述载体蛋白通过酰胺键而附着至eTEC间隔物。
在本发明的血清型33F糖缀合物中，所述糖可以是多糖或寡糖。所述载体蛋白可选自本文所描述的或者本领域技术人员已知的任何适合的载体。在常见的实施方案中，所述糖是多糖。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。在一些此类实施方案中，所述eTEC连接的糖缀合物包含肺炎链球菌血清型33F荚膜多糖。
在特别优选的实施方案中，所述eTEC连接的糖缀合物包含Pn-33F荚膜多糖，其通过eTEC间隔物共价缀合至CRM197(血清型33F eTEC连接的糖缀合物)。
在一些实施方案中，本发明的血清型33F的糖缀合物包含具有10kDa至2,000kDa的分子量的糖。在其它此类实施方案中，所述糖具有50kDa至2,000kDa的分子量。在另外的此类实施方案中，所述糖具有50kDa至1,750kDa的分子量；50kDa至1,500kDa；50kDa至1,250kDa；50kDa至1,000kDa；50kDa至750kDa；50kDa至500kDa；100kDa至2,000kDa；100kDa至1,750kDa；100kDa至1,500kDa；100kDa至1,250kDa；100kDa至1,000kDa；100kDa至750kDa；100kDa至500kDa；200kDa至2,000kDa；200kDa至1,750kDa；200kDa至1,500kDa；200kDa至1,250kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至750kDa；或者200kDa至500kDa。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
在一些实施方案中，本发明的血清型33F糖缀合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型33F糖缀合物具有500kDa至10,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型33F糖缀合物具有200kDa至10,000kDa的分子量。在其它的实施方案中，血清型33F糖缀合物具有1,000kDa至3,000kDa的分子量。
在另外的实施方案中，本发明的血清型33F糖缀合物具有如下分子量：200kDa至20,000kDa；200kDa至15,000kDa；200kDa至10,000kDa；200kDa至7,500kDa；200kDa至5,000kDa；200kDa至3,000kDa；200kDa至1,000kDa；500kDa至20,000kDa；500kDa至15,000kDa；500kDa至12,500kDa；500kDa至10,000kDa；500kDa至7,500kDa；500kDa至6,000kDa；500kDa至5,000kDa；500kDa至4,000kDa；500kDa至3,000kDa；500kDa至2,000kDa；500kDa至1,500kDa；500kDa至1,000kDa；750kDa至20,000kDa；750kDa至15,000kDa；750kDa至12,500kDa；750kDa至10,000kDa；750kDa至7,500kDa；750kDa至6,000kDa；750kDa至5,000kDa；750kDa至4,000kDa；750kDa至3,000kDa；750kDa至2,000kDa；750kDa至1,500kDa；1,000kDa至15,000kDa；1,000kDa至12,500kDa；1,000kDa至10,000kDa；1,000kDa至7,500kDa；1,000kDa至6,000kDa；1,000kDa至5,000kDa；1,000kDa至4,000kDa；1,000kDa至2,500kDa；2,000kDa至15,000kDa；2,000kDa至12,500kDa；2,000kDa至10,000kDa；2,000kDa至7,500kDa；2,000kDa至6,000kDa；2,000kDa至5,000kDa；2,000kDa至4,000kDa；2,000kDa至3,000kDa；3,000kDa至20,000kDa；3,000kDa至15,000kDa；3,000kDa至12,500kDa；3,000kDa至10,000kDa；3,000kDa至9,000kDa；3,000kDa至8,000kDa；3,000kDa至7,000kDa；3,000kDa至6,000kDa；3,000kDa至5,000kDa；或者3,000kDa至4,000kDa。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
对本发明的血清型33F的糖缀合物进行表征的另一个方式是，通过载体蛋白(例如CRM197)中与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可表征为缀合的赖氨酸残基的范围(缀合度)。
在优选的实施方案中，本发明的血清型33F的糖缀合物的缀合度为2至20、4至16、2至15、2至13、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、3至15、3至13、3至10、3至8、3至6、3至5、3至4、5至15、5至10、8至15、8至12、10至15、或者10至12。在一实施方案中，本发明的血清型33F的糖缀合物的缀合度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、或约20。在优选的实施方案中，本发明的血清型33F的糖缀合物的缀合度为4至16。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
在优选的实施方案中，所述载体蛋白包含CRM197，其含有39个赖氨酸残基。在一些此类实施方案中，所述CRM197在39个赖氨酸残基中可包含4至16个共价连接至糖的赖氨酸残基。表述此参数的另一种方式是约10％至约41％的CRM197赖氨酸共价连接至糖。在另一个此种实施方案中，所述CRM197在39个赖氨酸残基中可包含2至20个共价连接至糖的赖氨酸残基。表述此参数的另一种方式是约5％至约50％的CRM197的赖氨酸共价连接至糖。在一些实施方案中，所述CRM197在39个赖氨酸残基中可包含约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、或约16个共价连接至糖的赖氨酸残基。
在常见的实施方案中，所述载体蛋白通过载体蛋白上的赖氨酸残基的一或多个ε-氨基基团的酰胺键共价缀合至eTEC间隔物。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白包含2至20个共价缀合至糖的赖氨酸残基。在其它此类实施方案中，所述载体蛋白包含4至16个共价缀合至糖的赖氨酸残基。
本发明的血清型33F糖缀合物还可通过糖与载体蛋白的比例(重量/重量)来进行表征。在一些实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.2至4.0(例如，约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9或约4.0)。在其它实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为1.0至2.5。在另外的实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.4至1.7。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
糖链附着至载体蛋白上赖氨酸的频率是表征本发明的血清型33F糖缀合物的另一个参数。例如，在一些实施方案中，所述多糖的每4个糖重复单元出现至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在另一实施方案中，所述多糖的每10个糖重复单元出现至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在另一实施方案中，所述多糖的每15个糖重复单元出现至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在另外的实施方案中，所述多糖的每25个糖重复单元出现至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。
在常见的实施方案中，所述载体蛋白为CRM197并且所述多糖的每4、10、15或25个糖重复单元出现至少一个CRM197和多糖之间的经eTEC间隔物的共价键。
在其它实施方案中，所述缀合物每5至10个糖重复单元、每2至7个糖重复单元、每3至8个糖重复单元、每4至9个糖重复单元、每6至11个糖重复单元、每7至12个糖重复单元、每8至13个糖重复单元、每9至14个糖重复单元、每10至15个糖重复单元、每2至6个糖重复单元、每3至7个糖重复单元、每4至8个糖重复单元、每6至10个糖重复单元、每7至11个糖重复单元、每8至12个糖重复单元、每9至13个糖重复单元、每10至14个糖重复单元、每10至20个糖重复单元、每4至25个糖重复单元或者每2至25个糖重复单元包含至少一个载体蛋白和糖之间的共价键。在常见的实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
在另一实施方案中，多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个糖重复单元出现至少一个载体蛋白和糖之间的键。在一实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
缀合过程中的一个重要考虑因素是形成这样的条件，所述条件允许各成分的潜在的敏感型非糖取代官能团(如可形成部分糖表位的O-酰基、磷酸酯或甘油磷酸酯侧链)得以保留。
在一实施方案中，本发明的血清型33F糖缀合物包含具有10％至100％的O-乙酰化程度的糖。在一些此类实施方案中，所述糖具有50％至100％的O-乙酰化程度。在其它此类实施方案中，所述糖具有75％至100％的O-乙酰化程度。在另外的实施方案中，所述糖具有大于或等于70％(≥70％)的O-乙酰化程度。
在优选的实施方案中，本发明的血清型33F糖缀合物包含每mM血清型33F荚膜多糖至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述糖缀合物包含每mM血清型33F荚膜多糖至少0.5、0.6、或0.7mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述糖缀合物包含每mM血清型33F荚膜多糖至少0.6mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述糖缀合物包含每mM血清型33F荚膜多糖至少0.7mM的乙酸根。在优选的实施方案中，通过离子HPLC分析确定O-乙酰基基团的存在。
在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、或0.95。在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.7。在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.9。
在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、或0.95。在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.7。在优选的实施方案中，糖缀合物中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM血清型33F多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.9。
本发明的血清型33F糖缀合物和免疫原性组合物可含有未共价缀合至载体蛋白但却存在于糖缀合物的组合物中的游离糖。所述游离糖可非共价地与糖缀合物相关联(也即非共价地结合至、吸附至、或包埋在糖缀合物中或与糖缀合物包埋)。
在一些实施方案中，本发明的血清型33F糖缀合物包含相较于血清型33F多糖的总量低于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％的游离血清型33F多糖。优选地，血清型33F的糖缀合物包含低于15％的游离糖、更优选低于10％的游离糖、以及更优选低于5％的游离糖。在优选的实施方案中，所述血清型33F糖缀合物包含相较于血清型33F多糖的总量低于约25％的游离血清型33F多糖。在优选的实施方案中，所述血清型33F糖缀合物包含相较于血清型33F多糖的总量低于约20％的游离血清型33F多糖。在优选的实施方案中，所述血清型33F糖缀合物包含相较于血清型33F多糖的总量低于约15％的游离血清型33F多糖。
在某些优选的实施方案中，本发明提供了血清型33F糖缀合物，其具有以下一或多种特征(单独或组合)：所述多糖具有50kDa至2,000kDa的分子量；所述糖缀合物具有500kDa至10,000kDa的分子量；所述载体蛋白包含2至20个共价连接至糖的赖氨酸残基；所述糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.2至4.0；所述糖缀合物的多糖的每4、10、15或25个糖重复单元包含至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键；所述糖具有75％至100％的O-乙酰化程度；所述缀合物相对于总多糖包含低于约15％的游离多糖；所述载体蛋白为CRM197。
所述血清型33F糖缀合物也可通过其分子大小分布(Kd)来进行表征。大小排阻层析介质(CL-4B)可用于确定缀合物的相对分子大小分布，如上述所述。
在一实施方案中，至少15％的本发明的血清型33F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在一实施方案中，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、或90％的本发明的血清型33F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
在优选的实施方案中，至少35％的本发明的血清型33F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％的本发明的血清型33F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少60％的本发明的血清型33F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少70％的本发明的血清型33F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
在优选的实施方案中，40％至90％的血清型33F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，50％至90％的血清型33F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，65％至80％的血清型33F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
1.3.4来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物
在一实施方案中，血清型15B糖缀合物是通过用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯而获得的。所述活化的多糖可直接或者经间隔物(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基基团。例如，所述间隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化的多糖，其可经硫醚键偶联至载体，所述硫醚键是通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白反应后获得的(例如使用GMBS)或者与卤代乙酰化(haloacetylate)的载体蛋白反应后获得的(例如使用碘乙酰亚胺、SIB、SlAB、sulfo-SIAB、SIA或者SBAP)。优选地，所述氰酸酯(任选地由CDAP化学制备)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联并且氨基衍生的糖用碳化二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学经蛋白载体上的羧基而缀合至载体蛋白。此类缀合物在例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中描述。
其它适合的技术使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、对硝基苯甲酸、N-羟基丁二酰亚胺、S--NHS、EDC、TSTU进行缀合。许多在国际专利申请公开号WO 98/42721中有描述。缀合中可涉及羰基接头，其可通过糖的自由羟基与CDI反应而形成(参见Bethell等人(1979)J.Biol.Chem.254:2572-2574；Hearn等人(1981)J.Chromatogr.218:509-518)随后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键。这可涉及将异头端还原成伯羟基(primary hydroxylgroup)、任选地对伯羟基保护/去保护、伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间体、以及CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基基团偶联。
在优选的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物是使用还原胺化来制备的。还原胺化涉及两个步骤：(1)多糖的氧化以从单个六糖单元中的邻位二醇产生醛的功能性，(2)所述活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物。
优选地，在氧化前，将所述血清型15B的多糖改变大小至目标分子量(MW)的范围。有利的是，纯化的血清型15B多糖的大小被减小而又保留该多糖结构的关键特征如例如O-乙酰基基团的存在。优选地，纯化的血清型15B多糖的大小是通过机械均质化来减小的(参见上述1.2.6节)。
氧化步骤可涉及与高碘酸盐反应。对于本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸；该术语也包括偏高碘酸盐(IO4 -)和正高碘酸盐(IO6 5-)以及各种高碘酸的盐(例如，高碘酸钠和高碘酸钾)。在优选的实施方案中，用于氧化血清型15B荚膜多糖的高碘酸盐是偏高碘酸盐。在优选的实施方案中，用于氧化血清型15B荚膜多糖的高碘酸盐是偏高碘酸钠。
在优选的实施方案中，所述多糖与0.01至10.0、0.05至5.0、0.1至1.0、0.5至1.0、0.7至0.8、0.05至0.5、0.1至0.3摩尔当量(molar equivalent)的氧化剂反应。在优选的实施方案中，所述多糖与约0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95摩尔当量的氧化剂反应。在优选的实施方案中，所述多糖与约0.15摩尔当量的氧化剂反应。在优选的实施方案中，所述多糖与约0.25摩尔当量的氧化剂反应。在优选的实施方案中，所述多糖与约0.5摩尔当量的氧化剂反应。在优选的实施方案中，所述多糖与约0.6摩尔当量的氧化剂反应。在优选的实施方案中，所述多糖与约0.7摩尔当量的氧化剂反应。
在优选的实施方案中，反应持续时间为1小时至50小时、10小时至30小时、15小时至20小时、15小时至17小时、或约16小时。
在优选的实施方案中，反应的温度保持在15℃至45℃、15℃至30℃、20℃至25℃。在优选的实施方案中，反应的温度保持在约23℃。
在优选的实施方案中，氧化反应在选自以下的缓冲液中进行：磷酸钠、磷酸钾、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、或Bis-Tris。在优选的实施方案中，所述缓冲液是磷酸钾。
在优选的实施方案中，所述缓冲液具有如下浓度：1mM至500mM、1mM至300mM、或50mM至200mM。在优选的实施方案中，所述缓冲液具有约100mM的浓度。
在优选的实施方案中，氧化反应在如下的pH进行：4.0至8.0、5.0至7.0、或5.5至6.5。在优选的实施方案中，pH为约6.0。
在优选的实施方案中，通过将0.5mg/mL至5mg/mL的分离的血清型15B荚膜多糖与0.2-0.3摩尔当量的高碘酸盐在20℃至25℃的温度反应而获得所述活化的血清型15B荚膜多糖。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖经纯化。所述活化的血清型15B荚膜多糖根据本领域技术人员已知的方法来纯化，如凝胶渗透层析(GPC)、透析或超滤/渗滤。例如，所述活化的荚膜多糖通过浓缩以及用超滤装置渗滤来进行纯化。
在优选的实施方案中，活化的血清型15B的荚膜多糖的氧化度为2至20、2至15、2至10、2至5、5至20、5至15、5至10、10至20、10至15、或15至20。在优选的实施方案中，活化的血清型15B的荚膜多糖的氧化度为2至10、4至8、4至6、6至8、6至12、8至12、9至11、10至16、12至16、14至18、16至20、16至18、或18至20。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖具有如下的分子量：5kDa至500kDa、50kDa至500kDa、50kDa至450kDa、100kDa至400kDa、100kDa至350kDa。在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至350kDa的分子量。在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至300kDa的分子量。在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至250kDa的分子量。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖包含每mM的所述血清型15B荚膜多糖至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、或0.8mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖包含每mM的所述血清型15B荚膜多糖至少0.5、0.6、或0.7mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖包含每mM的所述血清型15B荚膜多糖至少0.6mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖包含每mM的所述血清型15B荚膜多糖至少0.7mM的乙酸根。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖包含每mM的所述血清型15B荚膜多糖至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、或0.8mM的甘油。在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖包含每mM的所述血清型15B荚膜多糖至少0.5、0.6、或0.7mM的甘油。在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖包含每mM的所述血清型15B荚膜多糖至少0.6mM的甘油。在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖包含每mM的所述血清型15B荚膜多糖至少0.7mM的甘油。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至250kDa的分子量并且每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至250kDa的分子量并且每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖包含每mM的所述血清型15B荚膜多糖至少0.6mM乙酸根以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖至少0.6mM的甘油。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖具有100kDa至250kDa的分子量并且每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根以及每mM的所述血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。
在一实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖经过冻干，任选地是在糖的存在下。在优选的实施方案中，所述糖选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和异麦芽糖醇。在优选的实施方案中，所述糖是蔗糖。所述冻干的活化的荚膜多糖继而可与包含载体蛋白的溶液混合。
在另一实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖与载体蛋白混合并任选地在糖的存在下冻干。在优选的实施方案中，所述糖选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和异麦芽糖醇。在优选的实施方案中，所述糖是蔗糖。所述共冻干的多糖和载体蛋白继而可在溶液中重悬并与还原剂反应。
所述活化的血清型15B荚膜多糖可通过包含以下步骤的方法缀合至载体蛋白：
(a)将所述活化的血清型15B荚膜多糖与载体蛋白混合，和
(b)将所述混合的活化的血清型15B荚膜多糖和载体蛋白与还原剂反应以形成血清型15B荚膜多糖-载体蛋白缀合物。
活化的血清型15B荚膜多糖与蛋白载体通过在二甲基亚砜(DMSO)中的还原胺化而缀合，DMSO与例如水相中的还原胺化(其中多糖的O-乙酰化水平显著降低)相比适于保存所述多糖的O-乙酰基含量。在优选的实施方案中，步骤(a)和步骤(b)在DMSO中进行。
在优选的实施方案中，步骤(a)包括将冻干的血清型15B荚膜多糖溶解在包含载体蛋白和DMSO的溶液中。在优选的实施方案中，步骤(a)包括将共冻干的血清型15B荚膜多糖和载体蛋白溶于DMSO中。
当在水成溶液中进行步骤(a)和(b)时，步骤(a)和(b)是在缓冲液中进行的，所述缓冲液优选选自PBS、MES、HEPES、Bis-tris、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、Bicine、或HEPB，于6.0至8.5、7.0至8.0、或7.0至7.5的pH。在优选的实施方案中，所述缓冲液为PBS。在优选的实施方案中，所述pH为约7.3。
在优选的实施方案中，步骤(b)中活化的血清型15B的荚膜多糖的浓度为0.1mg/mL至10mg/mL、0.5mg/mL至5mg/mL、或0.5mg/mL至2mg/mL。在优选的实施方案中，步骤(b)中活化的血清型15B的荚膜多糖的浓度为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0mg/mL。
在优选的实施方案中，活化的血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的初始输入比例(重量对重量)为5:1至0.1:1、2:1至0.1:1、2:1至1:1、1.5:1至1:1、0.1:1至1:1、0.3:1至1:1、或0.6:1至1:1。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的初始输入比例为约0.6:1至1:1。在另一优选实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的初始输入比例为约0.6:1至1.5:1。此种初始输入比例特别适于在糖缀合物中获得低水平的游离多糖。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的初始输入比例为约0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1。
在一实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、硼氢化钠或硼氢化锌其中存在Bronsted或Lewis酸、胺硼烷如硼烷吡啶、2-甲基吡啶硼烷、2,6-乙硼烷-甲醇、二甲基胺硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苄胺-BH3或5-乙基-2-甲基硼烷吡啶(PEMB)。在优选的实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。在优选的实施方案中，所述还原剂是2-甲基吡啶硼烷钠。
在优选的实施方案中，步骤(b)中使用的还原剂的量为约0.1至10.0摩尔当量、0.5至5.0摩尔当量、或1.0至2.0摩尔当量。在优选的实施方案中，步骤(b)中使用的还原剂的量为约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8,1.9、或2.0摩尔当量。
在优选的实施方案中，步骤(b)的持续时间为1小时至60小时、10小时至50小时、40小时至50小时、或42小时至46小时。在优选的实施方案中，步骤(b)的持续时间为约44小时。
在优选的实施方案中，步骤(b)中的反应的温度保持在10℃至40℃、15℃至30℃、或20℃至26℃。在优选的实施方案中，步骤(b)中的反应的温度保持在约23℃。
在优选的实施方案中，用于制备包含共价连接至载体蛋白的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的糖缀合物的方法，还包括通过添加NaBH4而将未反应的醛封闭(猝灭)的步骤(步骤(c))。
在优选的实施方案中，步骤(c)中使用的NaBH4的量为0.1至10摩尔当量、0.5至5.0摩尔当量、或1.0至3.0摩尔当量。在优选的实施方案中，步骤(c)中使用的NaBH4的量为约2摩尔当量。
在优选的实施方案中，步骤(c)的持续时间为0.1小时至10小时、0.5小时至5小时、或2小时至4小时。在优选的实施方案中，步骤(c)的持续时间为约3小时。
在优选的实施方案中，步骤(c)中的反应的温度保持在15℃至45℃、15℃至30℃、或20℃至26℃。在优选的实施方案中，步骤(c)中的反应的温度保持在约23℃。
在优选的实施方案中，缀合步骤的产率超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％。在优选的实施方案中，缀合步骤(步骤b)的产率超过60％。在优选的实施方案中，缀合步骤(步骤b)的产率超过70％。产率为缀合物中血清型15B多糖的量x100)/缀合步骤中使用的活化的多糖的量。
在优选的实施方案中，用于制备包含共价连接至载体蛋白的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的糖缀合物的方法包括以下步骤：
(a)通过高压均质化将纯化的血清型15B多糖改变大小；
(b)将改变大小的血清型15B多糖与氧化剂反应；
(c)将所述活化的血清型15B多糖与载体蛋白混合；
(d)将所述混合的活化的血清型15B多糖和载体蛋白与还原剂反应以形成血清型15B多糖-载体蛋白缀合物；和
(e)通过添加NaBH4而将未反应的醛封闭(猝灭)。
在优选的实施方案中，上述方法的缀合步骤(步骤d)的产率超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％。在优选的实施方案中，缀合步骤(步骤d)的产率超过60％。在优选的实施方案中，缀合步骤(步骤d)的产率超过70％。产率为缀合物中血清型15B多糖的量x100)/缀合步骤中使用的活化的多糖的量。
在血清型15B荚膜多糖缀合至载体蛋白之后，可通过许多本领域技术人员已知的技术来纯化多糖-蛋白质缀合物(对多糖-蛋白质缀合物的量进行富集)。这些技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流过滤、沉淀/洗脱、柱层析(DEAE或疏水相互作用层析)、和深度过滤。
在一实施方案中，所述载体蛋白如1.1节所定义。在一实施方案中，所述载体蛋白选自由以下组成的组：DT(白喉毒素)、TT(破伤风类毒素)、CRM197、其它DT突变体、PD(流感嗜血杆菌蛋白D)、或者其免疫学功能等价物。在一实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
在一些实施方案中，本发明的血清型15B糖缀合物是缀合至载体蛋白的(例如，CRM197)并且包含具有5kDa至1,500kDa的分子量的糖。在其它此类实施方案中，所述糖具有10kDa至1,500kDa的分子量。在另外的此类实施方案中，所述糖具有如下的分子量：50kDa至1,500kDa；50kDa至1,250kDa；50kDa至1,000kDa；50kDa至750kDa；50kDa至500kDa；50kDa至250kDa；100kDa至1,500kDa；100kDa至1,250kDa；100kDa至1,000kDa；100kDa至750kDa；100kDa至500kDa；100kDa至250kDa；200kDa至1,500kDa；200kDa至1,250kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至750kDa；或者200kDa至500kDa；或者200kDa至400kDa。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。在一些实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。在一些实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物具有1,000kDa至20,000kDa的分子量。在优选的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物具有如下的分子量：3,000kDa至20,000kDa、5,000kDa至10,000kDa、5,000kDa至20,000kDa、8,000kDa至20,000kDa、8,000kDa至16,000kDa或者10,000kDa至16,000kDa。
在另外的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物具有如下分子量：约1,000kDa、约1,500kDa、约2,000kDa、约2,500kDa、约3,000kDa、约3,500kDa、约4,000kDa、约4,500kDa、约5,000kDa、约5,500kDa、约6,000kDa、约6,500kDa、约7,000kDa、约7,500kDa、约8,000kDa、约8,500kDa、约9,000kDa、约9,500kDa、约10,000kDa、约10,500kDa、约11,000kDa、约11,500kDa、约12,000kDa、约12,500kDa、约13,000kDa、约13,500kDa、约14,000kDa、约14,500kDa、约15,000kDa、约15,500kDa、约16,000kDa、约16,500kDa、约17,000kDa、约17,500kDa、约18,000kDa、约18,500kDa、约19,000kDa、约19,500kDa、或约20,000kDa。
在另外的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物具有1,000kDa至20,000kDa的分子量；1,000kDa至15,000kDa；1,000kDa至10,000kDa；1,000kDa至7,500kDa；1,000kDa至5,000kDa；1,000kDa至4,000kDa；1,000kDa至3,000kDa；2,000kDa至20,000kDa；2,000kDa至15,000kDa；2,000kDa至12,500kDa；2,000kDa至10,000kDa；2,000kDa至7,500kDa；2,000kDa至6,000kDa；2,000kDa至5,000kDa；2,000kDa至4,000kDa；或者2,000kDa至3,000kDa。
在另外的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物具有如下的分子量：3,000kDa至20,000kDa；3,000kDa至15,000kDa；3,000kDa至10,000kDa；3,000kDa至7,500kDa；3,000kDa至5,000kDa；3,000kDa至4,000kDa；4,000kDa至20,000kDa；4,000kDa至15,000kDa；4,000kDa至12,500kDa；4,000kDa至10,000kDa；4,000kDa至7,500kDa；4,000kDa至6,000kDa；或4,000kDa至5,000kDa。在另外的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物具有如下的分子量：5,000kDa至20,000kDa；5,000kDa至15,000kDa；5,000kDa至10,000kDa；5,000kDa至7,500kDa；6,000kDa至20,000kDa；6,000kDa至15,000kDa；6,000kDa至12,500kDa；6,000kDa至10,000kDa；或6,000kDa至7,500kDa。
糖缀合物的分子量是通过SEC-MALLS测量的。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。在一实施方案中，所述血清型15B糖缀合物是使用还原胺化来制备的。
本发明的血清型15B的糖缀合物还可通过糖与载体蛋白的比例(重量/重量)来进行表征。在优选的实施方案中，所述缀合物中血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的比例(重量对重量)为0.5至3.0(例如，约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0)。在优选的实施方案中，所述缀合物中血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的比例为0.4至2。在优选的实施方案中，所述缀合物中血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的比例为0.5至2.0、0.5至1.5、0.5至1.0、1.0至1.5、1.0至2.0。在优选的实施方案中，所述缀合物中血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的比例为0.7至0.9。
本发明的血清型15B糖缀合物和免疫原性组合物可含有未共价缀合至载体蛋白但却存在于糖缀合物的组合物中的游离糖。所述游离糖可非共价地与糖缀合物相关联(即非共价地结合至、吸附至、或包埋在糖缀合物中或与糖缀合物包埋)。
在优选的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物包含相较于血清型15B荚膜多糖的总量低于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、或15％的游离血清型15B荚膜多糖。在优选的实施方案中，本发明的血清型15B糖缀合物包含相较于血清型15B荚膜多糖的总量低于约25％的游离的血清型15B荚膜多糖。在优选的实施方案中，本发明的血清型15B糖缀合物包含相较于血清型15B荚膜多糖的总量低于约20％的游离的血清型15B荚膜多糖。在优选的实施方案中，本发明的血清型15B糖缀合物包含相较于血清型15B荚膜多糖的总量低于约15％的游离的血清型15B荚膜多糖。
所述血清型15B糖缀合物也可通过其分子大小分布(Kd)来进行表征。大小排阻层析介质(CL-4B)可用于确定缀合物的相对分子大小分布，如上述所述。
在优选的实施方案中，至少20％的本发明的血清型15B糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少30％的免疫原性缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少40％的本发明的血清型15B糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％本发明的血清型15糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少60％的本发明的血清型15B糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少70％的本发明的血清型15B糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
在优选的实施方案中，40％至90％的血清型15B糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，50％至90％的血清型15B糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，65％至80％的血清型15B糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
在优选的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、或0.8mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述糖缀合物每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.5、0.6、或0.7的mM乙酸根。在优选的实施方案中，所述糖缀合物每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根。在优选的实施方案中，所述糖缀合物每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.7的mM乙酸根。在优选的实施方案中，通过离子HPLC分析确定O-乙酰基基团的存在。
在优选的实施方案中，血清型15B糖缀合物中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、或0.95。在优选的实施方案中，血清型15B糖缀合物每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.7。在优选的实施方案中，血清型15B糖缀合物中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.9。在优选的实施方案中，通过离子HPLC分析确定O-乙酰基基团的存在。
在优选的实施方案中，血清型15B糖缀合物中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、或0.95。在优选的实施方案中，血清型15B糖缀合物中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.7。在优选的实施方案中，血清型15B糖缀合物中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM的血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.9。在优选的实施方案中，通过离子HPLC分析确定O-乙酰基基团的存在。
在优选的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、或0.8mM的甘油。在优选的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.5、0.6、或0.7mM的甘油。在优选的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的甘油。在优选的实施方案中，本发明的血清型15B的糖缀合物每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.7mM的甘油。
对本发明的血清型15B的糖缀合物进行表征的另一个方式是，通过载体蛋白(例如CRM197)中与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可表征为缀合赖氨酸残基的范围(缀合度)。载体蛋白的赖氨酸修饰(由于共价连接至多糖)的证据，可通过使用本领域技术人员已知的常规方法进行氨基酸分析获得。缀合导致回收的赖氨酸残基的数目与用于产生缀合物材料的CRM197蛋白起始材料相比降低。
在优选的实施方案中，本发明的血清型15B糖缀合物的缀合度为2至15、2至13、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、3至15、3至13、3至10、3至8、3至6、3至5、3至4、5至15、5至10、8至15、8至12、10至15、或者10至12。在一实施方案中，本发明的血清型15B糖缀合物的缀合度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、或约15。在优选的实施方案中，本发明的血清型15B糖缀合物的缀合度为2至5。
1.3.5来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物
在本发明的来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物中，所述糖选自由多糖和寡糖组成的组，并且所述载体蛋白选自本文描述的或本领域技术人员已知的任何适合的载体。在一些优选的实施方案中，所述糖是来自血清型12F肺炎链球菌的多糖。
在一实施方案中，来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物是使用CDAP制备的。用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)将所述多糖活化以形成氰酸酯。所述活化的多糖继而直接地或经间隔物(接头)基团偶联至载体蛋白(优选CRM197)上的氨基基团。例如，所述间隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化的多糖，其可经硫醚键偶联至载体，所述硫醚键是通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白反应后获得的(例如使用GMBS)或者与卤代乙酰化的载体蛋白反应后获得的(例如使用碘乙酰亚胺、SIB、SlAB、sulfo-SIAB、SIA或者SBAP)。优选地，所述氰酸酯(任选地由CDAP化学制备)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联并且氨基衍生的糖用碳化二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学经蛋白载体上的羧基而缀合至载体蛋白(例如，CRM197)。
其它适合的技术使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、对硝基苯甲酸、N-羟基丁二酰亚胺、S--NHS、EDC、TSTU进行缀合。许多在国际专利申请公开号WO 98/42721中描述。缀合可涉及羰基接头，其可通过糖的自由羟基与CDI反应而形成(参见Bethell等人(1979)J.Biol.Chem.254:2572-2574；Hearn等人(1981)J.Chromatogr.218:509-518)随后是与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键。这可涉及将异头端还原成伯羟基、任选地对伯羟基保护/去保护、伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间体、以及CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基基团偶联。
在一实施方案中，血清型12F肺炎链球菌的荚膜多糖通过还原胺化缀合至载体蛋白。还原胺化涉及两个步骤：(1)多糖的氧化以从单个六糖单元中的邻位二醇产生醛的功能性，(2)所述活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物。
在氧化之前，所述血清型12F多糖任选地是经水解的(改变大小)。可使用机械或化学水解。可用乙酸来进行化学水解。
在一实施方案中，所述氧化剂是高碘酸盐。术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸(参见下述)。
在优选的实施方案中，所述氧化剂是2,2,6,6-四甲基-1-氧基哌啶(TEMPO)自由基并且N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)作为共氧化剂。在此种实施方案中，使用2,2,6,6-四甲基-1-氧基哌啶(TEMPO)自由基并使用N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)作为共氧化剂(下述称作“TEMPO/NCS氧化”)将糖的伯醇氧化成醛以制备所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物，如实施例7中和WO 2014/097099中所描述的。因此在一方面，所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物可通过包括以下步骤的方法来获得：a)将12F糖与2,2,6,6-四甲基-1-氧基哌啶(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)在水溶剂中反应，以产生活化的糖；和b)将所述活化的糖与包含一或多个胺基团的载体蛋白反应(下述称作“TEMPO/NCS-还原胺化”)。在一方面，通过所述方法获得来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物。在一实施方案中，活化的12F糖的氧化度范围是：从1至50、从1至40、从1至30、从1至20、从1至10、从1至5、从3至40、从3至30、从3至20、从3至10、从4至40、从4至30、从4至20、从4至10、从5至30、从5至25、从5至20、从5至10、从6至50、从6至40、从6至30、从6至20、从6至15、从6至14、从6至13、从6至12、从6至11、从6至10、从7至40、从7至30、从7至20、从7至15、从7至14、从7至13、从7至12、从7至11、从7至10、从8至40、从8至30、从8至20、从8至15、从8至14、从8至13、从8至13、从8至12、从8至11、从8至10、从9至40、从9至30、从9至20、从9至15、从10至40、从10至30、从10至20、或从10至15。在另外的方面，活化的糖的氧化度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40。优选地，所述载体蛋白为CRM197。
在一实施方案中，在步骤a)之前，将12F糖水解成分子量范围从100kDa至400kDa。例如，在一方面，分子量范围是从100kDa至350kDa、从100kDa至300kDa、从100kDa至250kDa、从100kDa至200kDa、从100kDa至150kDa、从200kDa至400kDa、从200kDa至350kDa、从200kDa至300kDa、从200kDa至250kDa、从300kDa至400kDa、或者从300kDa至350kDa。
在另外的方面，所述方法还包括在步骤b)之前纯化所述活化的多糖。在另外的方面，所述方法还包括在步骤b)之后添加还原剂的步骤。在一方面，所述还原剂为NaCNBH3。在另外的方面，所述方法还包括在添加NaCNBH3之后添加NaBH4的步骤。在另外的方面，所述方法包括在添加NaBH4之后纯化的步骤。
在另一方面，本公开提供了可以通过上述所公开的方法生产的或者获得的来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物。例如，在一方面本公开提供了来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物，其包含缀合至载体蛋白的糖，可以通过包括以下步骤的方法生产的或者获得：a)将糖与2,2,6,6-四甲基-1-氧基哌啶(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)在水溶剂中反应以产生活化的糖；和b)将所述活化的糖于包含一或多个胺基团的载体蛋白反应。
在一实施方案中，本发明来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物具有约50kDa至约20,000kDa的分子量。在另一实施方案中，所述糖缀合物具有约200kDa至约10,000kDa的分子量。在另一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物具有约500kDa至约5,000kDa的分子量。在一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物具有约1,000kDa至约3,000kDa的分子量。在其它实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物具有如下分子量：约600kDa至约2,800kDa；约700kDa至约2,700kDa；约1,000kDa至约2,000kDa；约1,800kDa至约2,500kDa；约1,100kDa至约2,200kDa；约1,900kDa至约2,700kDa；约1,200kDa至约2,400kDa；约1,700kDa至约2,600kDa；约1,300kDa至约2,600kDa；约1,600kDa至约3,000kDa。
在另外的实施方案中，本发明的血清型12F的糖缀合物具有如下分子量：1,000kDa至20,000kDa；1,000kDa至15,000kDa；1,000kDa至10,000kDa；1,000kDa至7,500kDa；1,000kDa至5,000kDa；1,000kDa至4,000kDa；1,000kDa至3,000kDa；2,000kDa至20,000kDa；2,000kDa至15,000kDa；2,000kDa至12,500kDa；2,000kDa至10,000kDa；2,000kDa至7,500kDa；2,000kDa至6,000kDa；2,000kDa至5,000kDa；2,000kDa至4,000kDa；或者2,000kDa至3,000kDa。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。在一些此类实施方案中，血清型12F糖缀合物是通过TEMPO/NCS-还原胺化缀合至载体蛋白的。
对本发明的血清型12F的糖缀合物进行表征的另一个方式是，通过载体蛋白(例如CRM197)中与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可以表征为缀合赖氨酸残基的范围(缀合度)。
在优选的实施方案中，本发明的血清型12F的糖缀合物的缀合度为2至20、4至16、4至15、2至15、2至13、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、3至15、3至13、3至10、3至8、3至6、3至5、3至4、5至15、5至10、8至15、8至12、10至15、或者10至12。在一实施方案中，本发明的血清型12F的糖缀合物的缀合度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20。
缀合至糖的载体蛋白中赖氨酸残基的数目也可表示为摩尔比例。例如，对于其中CRM197的4至15个赖氨酸残基共价连接至糖的糖缀合物，糖缀合物中缀合的赖氨酸对CRM197的摩尔比例为约10:1至约40:1。在免疫原性组合物中，其中CRM197的2至20个赖氨酸残基共价连接至糖，糖缀合物中缀合的赖氨酸对CRM197的摩尔比例为约5:1至约50:1。在一实施方案中，在本发明的来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物中，缀合的赖氨酸对载体蛋白的摩尔比例为约10:1至约25:1。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。在一些实施方案中，所述CRM197可包含39个赖氨酸残基中的约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16个赖氨酸残基共价连接至糖。在一些此类实施方案中，血清型12F糖缀合物是通过TEMPO/NCS-还原胺化缀合至载体蛋白的。
在一实施方案中，在来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.2至4(例如，约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9或约4.0)。在另一实施方案中，在来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为1.1至1.7。在其它实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.8至1.8(例如，约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7或约1.8)。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。在一些此类实施方案中，血清型12F糖缀合物是通过TEMPO/NCS-还原胺化缀合至载体蛋白的。
糖链附着至载体蛋白上赖氨酸的频率是表征本公开的血清型12F糖缀合物的另一个参数。例如，在一实施方案中，多糖的每100个糖重复单元有至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在一实施方案中，多糖的每50个糖重复单元有至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在一实施方案中，多糖的每25个糖重复单元有至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在另一实施方案中，多糖的每4个糖重复单元有至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在另一实施方案中，多糖的每10个糖重复单元有至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在另外的实施方案中，多糖的每15个糖重复单元有至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在常见的实施方案中，所述载体蛋白为CRM197并且多糖的每4、10、15或25个糖重复单元就会有少一个CRM197与多糖之间的共价键。
在其它实施方案中，对于每5至10个糖重复单元、每2至7个糖重复单元、每3至8个糖重复单元、每4至9个糖重复单元、每6至11个糖重复单元、每7至12个糖重复单元、每8至13个糖重复单元、每9至14个糖重复单元、每10至15个糖重复单元、每2至6个糖重复单元、每3至7个糖重复单元、每4至8个糖重复单元、每6至10个糖重复单元、每7至11个糖重复单元、每8至12个糖重复单元、每9至13个糖重复单元、每10至14个糖重复单元、每10至20个糖重复单元、每4至25个糖重复单元或者每2至25个糖重复单元，缀合物就包含至少一个载体蛋白和糖之间的共价键。在常见的实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
在另一实施方案中，对于多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个糖重复单元，就出现至少一个CRM197与糖之间的键。在一些此类实施方案中，血清型12F糖缀合物是通过TEMPO/NCS-还原胺化缀合至载体蛋白的。
在一实施方案中，本发明的来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物在多糖的每25个糖重复单元包含至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在另一实施方案中，在多糖的每4个糖重复单元出现至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在另一实施方案中，在多糖的每10个糖重复单元出现至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在另外的实施方案中，在多糖的每15个糖重复单元出现至少一个载体蛋白和多糖之间的共价键。在一些此类实施方案中，血清型12F糖缀合物是通过TEMPO/NCS-还原胺化缀合至载体蛋白的。
本发明的血清型12F糖缀合物和免疫原性组合物可含有未共价缀合至载体蛋白但却存在于糖缀合物的组合物中的游离糖。所述游离糖可非共价地与糖缀合物相关联(即非共价地结合至、吸附至、或包埋在糖缀合物中或与糖缀合物包埋)。
在一些实施方案中，本发明的血清型12F的糖缀合物包含相较于血清型12F多糖的总量低于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％的游离血清型12F多糖。在一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物包含相较于血清型12F多糖的总量低于约50％的游离血清型12F多糖。在一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物包含相较于血清型12F多糖的总量低于约45％的游离血清型12F多糖。在另一实施方案中，所述糖缀合物包含相较于血清型12F多糖的总量低于约30％的游离血清型12F多糖。在另一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物包含相较于血清型12F多糖的总量低于约20％的游离血清型12F多糖。在另外的实施方案中，所述糖缀合物包含相较于血清型12F多糖的总量低于约10％的游离血清型12F多糖。在另一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物包含相较于血清型12F多糖的总量低于约5％的游离血清型12F多糖。在一些此类实施方案中，血清型12F糖缀合物是通过TEMPO/NCS-还原胺化缀合至载体蛋白的。
在一些实施方案中，本发明的血清型12F糖缀合物包含具有10kDa至2,000kDa的分子量的糖。在其它此类实施方案中，所述糖具有50kDa至2,000kDa的分子量。在另外的此类实施方案中，所述糖具有如下的分子量：50kDa至1,750kDa；50kDa至1,500kDa；50kDa至1,250kDa；50kDa至1,000kDa；50kDa至750kDa；50kDa至500kDa；100kDa至2,000kDa；100kDa至1,750kDa；100kDa至1,500kDa；100kDa至1,250kDa；100kDa至1,000kDa；100kDa至750kDa；100kDa至500kDa；200kDa至2,000kDa；200kDa至1,750kDa；200kDa至1,500kDa；200kDa至1,250kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至750kDa；或者200kDa至500kDa；或者200kDa至400kDa。在一些此类实施方案中，血清型12F糖缀合物是通过TEMPO/NCS-还原胺化缀合至载体蛋白的。
所述血清型12F糖缀合物也可通过其分子大小分布(Kd)来进行表征。大小排阻层析介质(CL-4B)可用于确定缀合物的相对分子大小分布，如上述所述。
在优选的实施方案中，至少35％的本发明的血清型12F的糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％的本发明的血清型12F的糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少60％的本发明的血清型12F的糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少70％的本发明的血清型12F的糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
在优选的实施方案中，40％至90％的血清型12F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，50％至90％的血清型12F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，65％至80％的血清型12F糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
1.3.6来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物
在一实施方案中，血清型10A糖缀合物是通过用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯而获得的。该活化的多糖可直接或者经间隔物(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基基团。例如，所述间隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化的多糖，其可经硫醚键而偶联至载体，所述硫醚键是通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白反应后获得的(例如使用GMBS)或者与卤代乙酰化的载体蛋白反应后获得的(例如使用碘乙酰亚胺、SIB、SlAB、sulfo-SIAB、SIA或者SBAP)。优选地，所述氰酸酯(任选由CDAP化学制备)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联并且氨基衍生的糖用碳化二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学经蛋白载体上的羧基而缀合至载体蛋白。此类缀合物在例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO96/129094中描述。
其它适合的技术使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、对硝基苯甲酸、N-羟基丁二酰亚胺、S--NHS、EDC、TSTU进行缀合。许多在国际专利申请公开号WO 98/42721中描述。缀合可涉及羰基接头，其可通过糖的自由羟基与CDI反应而形成(参见Bethell等人(1979)J.Biol.Chem.254:2572-2574；Hearn等人(1981)J.Chromatogr.218:509-518)随后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键。这可涉及将异头端还原成伯羟基、任选地对伯羟基保护/去保护、伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间体、以及CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基基团偶联。
在优选的实施方案中，本发明的血清型10A糖缀合物是使用还原胺化来制备的。还原胺化涉及两个步骤：(1)多糖的氧化以从单个六糖单元中的邻位二醇产生醛的功能性，和(2)所述活化多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物。
在氧化之前，所述血清型10A多糖任选地是经水解的(改变大小)。可使用机械或化学水解。可用乙酸来进行化学水解。
在一实施方案中，通过包括以下步骤的方法将血清型多糖活化(氧化)：
(a)将分离的血清型10A多糖与氧化剂反应；以及
(b)通过添加猝灭剂使氧化反应猝灭，导致了活化的血清型10A多糖。
在优选的实施方案中，所述氧化剂为高碘酸盐。对于本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸，该术语也包括偏高碘酸盐(IO4 -)和正高碘酸盐(IO6 5-)以及各种高碘酸的盐(例如，高碘酸钠和高碘酸钾)。在优选的实施方案中，所述氧化剂是高碘酸钠。在优选的实施方案中，用于氧化血清型10A多糖的高碘酸盐是偏高碘酸盐。在优选的实施方案中用于氧化血清型10A多糖的高碘酸盐是偏高碘酸钠。
在一实施方案中，所述猝灭剂选自邻位二醇、1,2-氨基醇、氨基酸、谷胱甘肽、亚硫酸盐、硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐、或亚磷酸。
在一实施方案中，所述猝灭剂是式(I)的1,2-氨基醇：
其中R1选自H、甲基、乙基、丙基、或异丙基。
在一实施方案中，所述猝灭剂选自亚硫酸、硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐、或亚磷酸的钠盐和钾盐。
在一实施方案中，所述猝灭剂是氨基酸。在此类实施方案中，所述氨基酸可选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、和组氨酸。
在一实施方案中，所述猝灭剂是亚硫酸盐如硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐。
在一实施方案中，所述猝灭剂是包含两个邻位羟基(邻位二醇)的化合物，即两个羟基共价连接至两个临近的碳原子。
优选地，所述猝灭剂是式(II)的化合物：
其中R1和R2彼此独立地选自H、甲基、乙基、丙基、或异丙基。
在优选的实施方案中，所述猝灭剂是甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,2-丁二醇或2,3-丁二醇、或者抗坏血酸。在优选的实施方案中，所述猝灭剂是2,3-丁二醇。
在优选的实施方案中，分离的血清型10A多糖通过包括以下步骤的方法活化：
(a)将分离的血清型10A多糖与高碘酸盐反应；以及
(b)通过加入2,3-丁二醇使氧化反应猝灭，导致活化的血清型10A多糖。
在多糖的氧化步骤之后，所述多糖被认为是活化的并且在下述中称作“活化的多糖”。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型10A多糖经过纯化。所述活化的血清型10A多糖根据本领域技术人员已知的方法来纯化，如凝胶渗透层析(GPC)、透析或超滤/渗滤。例如，所述活化的10A多糖通过浓缩以及用超滤装置渗滤来进行纯化。
在优选的实施方案中，活化的血清型10A多糖的氧化度为2至30、2至25、2至20、2至15、2至10、2至5、5至30、5至25、5至20、5至15、5至10、10至30、10至25、10至20、10至15、15至30、15至25、15至20、20至30、或20至25。在优选的实施方案中，活化的血清型10A多糖的氧化度为2至10、4至8、4至6、6至8、6至12、8至14、9至11、10至16、12至16、14至18、16至20、16至18、18至22、或18至20。
在优选的实施方案中，所述活化的血清型10A多糖具有如下的分子量：50kDa至400kDa、50kDa至350kDa、50kDa至300kDa、50kDa至250kDa、50kDa至200kDa、100kDa至300kDa、100kDa至250kDa、或100kDa至200kDa。在优选的实施方案中，所述活化的血清型10A多糖具有50kDa至300kDa的分子量。在优选的实施方案中，所述活化的血清型10A多糖具有100kDa至200kDa的分子量。在优选的实施方案中，所述活化的血清型10A多糖具有100kDa至200kDa的分子量以及5至20、5至15、8至14、8至12、或9至11的氧化度。在优选的实施方案中，所述活化的血清型10A多糖具有100kDa至200kDa的分子量以及9至11的氧化度。
所述活化的多糖和/或所述载体蛋白可以是冻干(冷冻干燥)的，无论是经过单独(分离冻干)或一起(共冻干)冻干。
在一实施方案中，所述活化的血清型10A多糖经过冻干，任选地是在糖的存在下。在优选的实施方案中，所述糖选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和异麦芽糖醇。在优选的实施方案中，所述糖是蔗糖。在一实施方案中，所述冻干的活化多糖继而与包含载体蛋白的溶液混合。
在另一实施方案中，所述活化的多糖和所述载体蛋白是共冻干的。在此类实施方案中，所述活化的血清型10A多糖与载体蛋白混合并任选地在糖的存在下冻干。在优选的实施方案中，所述糖选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和异麦芽糖醇。在优选的实施方案中，所述糖是蔗糖。所述共冻干的多糖和载体蛋白继而可在溶液中重悬并与还原剂反应。
缀合方法的第二个步骤是所述活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物(还原胺化)，其中使用还原剂。
活化的血清型10A多糖可通过包含以下步骤的方法缀合至载体蛋白：
(c)将所述活化的血清型10A多糖与载体蛋白混合；和
(d)将所述混合的活化的血清型10A多糖和载体蛋白与还原剂反应以形成血清型10A多糖-载体蛋白缀合物。
在一实施方案中，在水溶剂中进行还原反应。在另一实施方案中，在非质子溶剂中进行所述反应。在一实施方案中，在DMSO(二甲基亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行所述还原反应。所述DMSO或DMF溶剂可用于将冻干的所述活化的多糖和载体蛋白重构。
在一实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、硼氢化钠或硼氢化锌(其中存在Bronsted或Lewis酸)、胺硼烷如硼烷吡啶、2-甲基吡啶硼烷、2,6-乙硼烷-甲醇、二甲基胺硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苄胺-BH3或5-乙基-2-甲基硼烷吡啶(PEMB)。在优选的实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。
在还原反应结束时，缀合物中可留有未反应的醛基，可用适合的封闭剂来将这些封闭。在一实施方案中，此封闭剂是硼氢化钠(NaBH4)。
在血清型10A多糖缀合至载体蛋白之后，所述糖缀合物可通过本领域技术人员已知的多种技术来进行纯化(对多糖-蛋白质缀合物的量进行富集)。这些技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流过滤沉淀/洗脱、柱层析(DEAE或疏水相互作用层析)、和深度过滤。
在一些实施方案中，本发明的血清型10A糖缀合物包含具有10kDa至2,000kDa的分子量的糖。在其它此类实施方案中所述糖具有50kDa至2,000kDa的分子量。在另外的此类实施方案中所述糖具有如下的分子量：50kDa至1,750kDa；50kDa至1,500kDa；50kDa至1,250kDa；50kDa至1,000kDa；50kDa至750kDa；50kDa至500kDa；100kDa至2,000kDa；100kDa至1,750kDa；100kDa至1,500kDa；100kDa至1,250kDa；100kDa至1,000kDa；100kDa至750kDa；100kDa至500kDa；200kDa至2,000kDa；200kDa至1,750kDa；200kDa至1,500kDa；200kDa至1,250kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至750kDa；或者200kDa至500kDa；或者200kDa至400kDa。在一些此类实施方案中，血清型10A糖缀合物是使用还原胺化来制备的。
在一些实施方案中，本发明血清型10A糖缀合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型10A糖缀合物具有50kDa至15,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型10A糖缀合物具有如下的分子量：500kDa至15,000kDa；500kDa至10,000kDa；2,000kDa至10,000kDa；或者3,000kDa至8,000kDa。在其它实施方案中，血清型10A糖缀合物具有1,000kDa至10,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型10A糖缀合物具有1000kDa至8,000kDa的分子量。在其它的实施方案中，所述血清型10A糖缀合物具有2,000kDa至8,000kDa或3,000kDa至7,000kDa的分子量。在另外的实施方案中，本发明血清型10A糖缀合物具有如下的分子量：200kDa至20,000kDa；200kDa至15,000kDa；200kDa至10,000kDa；200kDa至7,500kDa；200kDa至5,000kDa；200kDa至3,000kDa；200kDa至1,000kDa；500kDa至20,000kDa；500kDa至15,000kDa；500kDa至12,500kDa；500kDa至10,000kDa；500kDa至7,500kDa；500kDa至6,000kDa；500kDa至5,000kDa；500kDa至4,000kDa；500kDa至3,000kDa；500kDa至2,000kDa；500kDa至1,500kDa；500kDa至1,000kDa；750kDa至20,000kDa；750kDa至15,000kDa；750kDa至12,500kDa；750kDa至10,000kDa；750kDa至7,500kDa；750kDa至6,000kDa；750kDa至5,000kDa；750kDa至4,000kDa；750kDa至3,000kDa；750kDa至2,000kDa；750kDa至1,500kDa；1,000kDa至15,000kDa；1,000kDa至12,500kDa；1,000kDa至10,000kDa；1,000kDa至7,500kDa；1,000kDa至6,000kDa；1,000kDa至5,000kDa；1,000kDa至4,000kDa；1,000kDa至2,500kDa；2,000kDa至15,000kDa；2,000kDa至12,500kDa；2,000kDa至10,000kDa；2,000kDa至7,500kDa；2,000kDa至6,000kDa；2,000kDa至5,000kDa；2,000kDa至4,000kDa；或者2,000kDa至3,000kDa。
在另外的实施方案中，本发明血清型10A糖缀合物具有如下的分子量：3,000kDa至20,000kDa；3,000kDa至15,000kDa；3,000kDa至10,000kDa；3,000kDa至7,500kDa；3,000kDa至5,000kDa；4,000kDa至20,000kDa；4,000kDa至15,000kDa；4,000kDa至12,500kDa；4,000kDa至10,000kDa；4,000kDa至7,500kDa；4,000kDa至6,000kDa；或者4,000kDa至5,000kDa。在另外的实施方案中，本发明血清型10A糖缀合物具有如下的分子量：5,000kDa至20,000kDa；5,000kDa至15,000kDa；5,000kDa至10,000kDa、或5,000kDa至7,500kDa。在另外的实施方案中，本发明血清型10A糖缀合物具有如下的分子量：6,000kDa至20,000kDa；6,000kDa至15,000kDa；6,000kDa至10,000kDa或6,000kDa至7,500kDa。在另外的实施方案中，本发明血清型10A糖缀合物具有如下的分子量：7,000kDa至20,000kDa；7,000kDa至15,000kDa；7,000kDa至10,000kDa或7,000kDa至8,000kDa。在另外的实施方案中，本发明血清型10A糖缀合物具有如下的分子量：8,000kDa至20,000kDa；8,000kDa至15,000kDa；或者8,000kDa至10,000kDa。
任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。糖缀合物的分子量是通过SEC-MALLS测量的。
对本发明的血清型10A糖缀合物进行表征的另一个方式是，通过载体蛋白(例如CRM197)中与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可表征为缀合赖氨酸残基的范围(缀合度)。载体蛋白的赖氨酸修饰(由于共价连接至多糖)的证据，可通过使用本领域技术人员已知的常规方法进行的氨基酸分析来获得。缀合导致回收的赖氨酸残基的数目与用于产生缀合物材料的CRM197蛋白起始材料相比降低。
在优选的实施方案中，本发明的血清型10A的糖缀合物的缀合度为2至15、2至13、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、3至15、3至13、3至10、3至8、3至6、3至5、3至4、5至15、5至10、8至15、8至12、10至15、或者10至12。在优选的实施方案中，本发明的血清型10A的糖缀合物的缀合度为6至8。在优选的实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
本发明的血清型10A糖缀合物还可通过糖与载体蛋白的比例(重量/重量)来进行表征。在一些实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.5至3.0(例如，约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、或约3.0)。在优选的实施方案中，所述缀合物中血清型10A糖与载体蛋白的比例为0.5至2.0、0.5至1.5、0.5至1.0、1.0至1.5或1.0至2.0。在优选的实施方案中，所述缀合物中血清型10A多糖与载体蛋白的比例为0.8至1.4。在优选的实施方案中，所述缀合物中血清型10A荚膜多糖与载体蛋白的比例为0.8至1.2(例如，约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、或约1.2)。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
本发明的血清型10A糖缀合物和免疫原性组合物可含有未共价缀合至载体蛋白但却存在于糖缀合物的组合物中的游离糖。所述游离糖可非共价地与糖缀合物相关联(即非共价地结合至、吸附至、或包埋在糖缀合物中或与糖缀合物包埋)。
在一些实施方案中，本发明血清型10A糖缀合物相对于10A糖的总量，包含低于约50％的游离糖、低于约45％的游离糖、低于约40％的游离糖、低于约35％的游离糖、低于约30％的游离糖、低于约25％的游离糖、低于约20％的游离糖、低于约15％的游离糖、低于约10％的游离糖、或低于约5％的游离糖。优选地，血清型10A糖缀合物包含低于15％的游离糖、更优选低于10％的游离糖、以及更优选低于5％的游离糖。
血清型10A糖缀合物也可通过其分子大小分布(Kd)来进行表征。大小排阻层析介质(CL-4B)可用于确定缀合物的相对分子大小分布，如上述所述。
在优选的实施方案中，至少30％的本发明的血清型10A糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少40％的本发明的血清型10A糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％的本发明的血清型10A糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少60％的血清型10A糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，50％至80％的本发明的血清型10A糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
1.3.7来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物
在一实施方案中，血清型11A糖缀合物是通过用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯而获得的。所述活化的多糖可直接或者经间隔物(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基基团。例如，所述间隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化的多糖，其可经硫醚键而偶联至载体，所述硫醚键是通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白反应后获得的(例如使用GMBS)或者与卤代乙酰化的载体蛋白反应后获得的(例如使用碘乙酰亚胺、SIB、SlAB、sulfo-SIAB、SIA或者SBAP)。优选地，所述氰酸酯(任选由CDAP化学制备)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联并且氨基衍生的糖用碳化二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学经蛋白载体上的羧基而缀合至载体蛋白。此类缀合物在例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中有描述。
其它适合的技术使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、对硝基苯甲酸、N-羟基丁二酰亚胺、S--NHS、EDC、TSTU进行缀合。许多在国际专利申请公开号WO 98/42721中有描述。缀合可涉及羰基接头，其可通过糖的自由羟基与CDI反应而形成(参见Bethell等人(1979)J.Biol.Chem.254:2572-2574；Hearn等人(1981)J.Chromatogr.218:509-518)随后是与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键。这可涉及将异头端还原成伯羟基、任选地对伯羟基保护/去保护、伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间体、以及CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基基团偶联。
在优选的实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物是使用还原胺化来制备的。还原胺化涉及两个步骤：(1)多糖的氧化以从单个六糖单元中的邻位二醇产生醛的功能性，和(2)活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物。
在氧化之前，所述血清型11A多糖任选地是经水解的以降低其粘性。可使用机械或化学水解。可用乙酸来进行化学水解。可使用高压均质剪切来进行机械大小改变。
氧化步骤可涉及与高碘酸盐反应。对于本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸；该术语也包括偏高碘酸盐(IO4 -)和正高碘酸盐(IO6 5-)以及各种高碘酸的盐(例如，高碘酸钠和高碘酸钾)。在一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型11A的荚膜多糖在偏高碘酸盐的存在下被氧化，优选是在高碘酸钠(NaIO4)的存在下被氧化。在另一实施方案中，所述来自血清型11A的荚膜多糖在正高碘酸盐的存在下被氧化，优选是在高碘酸的存在下被氧化。
在多糖的氧化步骤之后，所述多糖被认为是活化的且在下述被称作“活化的多糖”。所述活化的多糖可以是纯化的以及经冻干(冷冻干燥)的。
所述活化的多糖和所述载体蛋白可以是冻干(冷冻干燥)的，无论是经过单独(分离冻干)或是一起(共冻干)冻干。在一实施方案中，所述活化的多糖和所述载体蛋白是共冻干的。在另一实施方案中，所述活化的多糖和所述载体蛋白是单独冻干的。
在一实施方案中，所述冷冻干燥在非还原糖的存在下进行，可能的非还原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和异麦芽糖醇。.
缀合方法的第二个步骤是所述活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物(还原胺化)，其中使用还原剂。适合的还原剂包括氰基硼氢化物，如氰基硼氢化钠、硼烷吡啶、或硼氢化物交换树脂。在一实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。
在一实施方案中，在水溶剂中进行还原反应。在另一实施方案中，在非质子溶剂中进行所述反应。在一实施方案中，在DMSO(二甲基亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行所述还原反应。所述DMSO或DMF溶剂可用于将冻干的所述活化的多糖和载体蛋白重构。
在一实施方案中，在还原反应中使用0.1至3.0、0.15至2.0、0.2至2.0、或0.5至1.5摩尔当量的氰基硼氢化钠。在一实施方案中，在还原反应中使用约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.9或3.0摩尔当量的氰基硼氢化钠。
在一实施方案中，所述还原剂是三乙酰氧基硼氢化钠，在另外的实施方案中，在还原反应中使用1.0至6.0、2.0至5.0、或约3.0摩尔当量的三乙酰氧基硼氢化钠。
在还原反应结束时，缀合物中可能留有未反应的醛基，可用适合的封闭剂来将这些封闭。在一实施方案中，此封闭剂是硼氢化钠(NaBH4)。在一实施方案中，通过将还原反应与0.5至5.0摩尔当量的NaBH4(例如约1、1.5、2、2.5或3摩尔当量的NaBH4)混合而实现封闭。
在缀合(还原以及任选存在的封闭)之后，可将糖缀合物纯化。糖缀合物可通过渗滤和/或离子交换层析和/或大小排阻层析来进行纯化。在一实施方案中，通过渗滤或离子交换层析或大小排阻层析来纯化所述糖缀合物。
在一实施方案中，所述糖缀合物经无菌过滤。
在一些实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物是缀合至载体蛋白的(例如，CRM197)，并且包含具有10kDa至2,000kDa的分子量的糖。在其它此类实施方案中，所述糖具有50kDa至2,000kDa的分子量。在另外的此类实施方案中，所述糖具有如下的分子量：50kDa至1,750kDa；50kDa至1,500kDa；50kDa至1,250kDa；50kDa至1,000kDa；50kDa至750kDa；50kDa至500kDa；50kDa至400kDa；50kDa至300kDa；50kDa至200kDa；50kDa至100kDa；100kDa至2,000kDa；100kDa至1,750kDa；100kDa至1,500kDa；100kDa至1,250kDa；100kDa至1,000kDa；100kDa至750kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；100kDa至200kDa；200kDa至2,000kDa；200kDa至1,750kDa；200kDa至1,500kDa；200kDa至1,250kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至750kDa；或者200kDa至500kDa；200kDa至400kDa或200kDa至300kDa。
在一些实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型11A糖缀合物具有50kDa至15,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型11A糖缀合物具有500kDa至10,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型11A糖缀合物具有200kDa至10,000kDa的分子量。在其它的实施方案中，血清型11A糖缀合物具有1,000kDa至8,000kDa或2,000kDa至8,000kDa的分子量。
在另外的实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物具有如下的分子量：200kDa至20,000kDa；200kDa至17,500kDa；200kDa至15,000kDa；200kDa至10,000kDa；200kDa至7,500kDa；200kDa至5,000kDa；200kDa至3,000kDa；200kDa至2,000kDa；200kDa至1,000kDa；500kDa至20,000kDa；500kDa至17,500kDa；500kDa至15,000kDa；500kDa至12,500kDa；500kDa至10,000kDa；500kDa至7,500kDa；500kDa至6,000kDa；500kDa至5,000kDa；500kDa至4,000kDa；500kDa至3,000kDa；500kDa至2,000kDa；500kDa至1,500kDa；500kDa至1,000kDa；700kDa至20,000kDa；700kDa至17,500kDa；700kDa至15,000kDa；700kDa至12,500kDa；700kDa至10,000kDa；700kDa至7,500kDa；700kDa至6,000kDa；700kDa至5,000kDa；700kDa至4,500kDa；700kDa至4,000kDa；700kDa至3,500kDa；700kDa至3,000kDa；700kDa至2,000kDa；700kDa至1,500kDa；1,000kDa至20,000kDa；1,000kDa至17,500kDa；1,000kDa至15,000kDa；1,000kDa至12,500kDa；1,000kDa至10,000kDa；1,000kDa至7,500kDa；1,000kDa至6,000kDa；1,000kDa至5,000kDa；1,000kDa至4,000kDa；1,000kDa至2,500kDa；2,000kDa至20,000kDa；2,000kDa至17,500kDa；2,000kDa至15,000kDa；2,000kDa至12,500kDa；2,000kDa至10,000kDa；2,000kDa至7,500kDa；2,000kDa至6,000kDa；2,000kDa至5,000kDa；2,000kDa至4,000kDa；或者2,000kDa至3,000kDa。
在另外的实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物具有如下的分子量：3,000kDa至20,000kDa；3,000kDa至17,500kDa；3,000kDa至15,000kDa；3,000kDa至10,000kDa；3,000kDa至7,500kDa；3,000kDa至5,000kDa；4,000kDa至20,000kDa；4,000kDa至17,500kDa；4,000kDa至15,000kDa；4,000kDa至12,500kDa；4,000kDa至10,000kDa；4,000kDa至7,500kDa；4,000kDa至6,000kDa；或者4,000kDa至5,000kDa。在另外的实施方案中，本发明血清型11A糖缀合物具有如下的分子量：5,000kDa至20,000kDa；5,000kDa至17,500kDa；5,000kDa至15,000kDa；5,000kDa至10,000kDa或5,000kDa至7,500kDa。
在一实施方案中，所述血清型11A糖缀合物是使用还原胺化来制备的。
在优选的实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物每mM的血清型11A多糖包含至少0.3、0.5、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4、3.8、4.2、4.6或5mM的乙酸根。在优选的实施方案中，血清型11A糖缀合物每mM的血清型11A多糖包含至少1.8、2.2或2.6mM的乙酸根。在一实施方案中，所述糖缀合物每mM的血清型11A多糖包含至少0.6mM的乙酸根。在优选的实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物每mM的血清型11A多糖包含至少0.6、1、1.4、1.8、2.2、2.6、3、3.4、3.8、4.2或4.6mM的乙酸根以及低于约5mM的乙酸根。在一实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物每mM的血清型11A多糖包含至少0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、或3.0mM的乙酸根以及低于约3.4mM的乙酸根。在一实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物每mM的血清型11A多糖包含至少0.6、1、1.4、1.8、2.2、2.6、或约3.0mM的乙酸根以及低于约3.3mM的乙酸根。任何上述数字都视为本公开的实施方案。
在优选的实施方案中，血清型11A糖缀合物中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、或0.95。在优选的实施方案中，血清型11A糖缀合物中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.7。在优选的实施方案中，血清型11A糖缀合物中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数与所述分离的多糖中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.9。在优选的实施方案中，通过离子HPLC分析确定O-乙酰基基团的存在。
在优选的实施方案中，血清型11A糖缀合物中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、或0.95。在优选的实施方案中，血清型11A糖缀合物中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.7。在优选的实施方案中，血清型11A糖缀合物中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数与所述活化的多糖中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM数之间的比例为至少0.9。在优选的实施方案中，通过离子HPLC分析确定O-乙酰基基团的存在。
在优选的实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物每mM的血清型11A多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mM的甘油。在优选的实施方案中，血清型11A糖缀合物每mM的血清型11A多糖包含至少0.2、0.3、或0.4mM的甘油。在优选的实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物每mM的血清型11A多糖包含至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mM的甘油以及低于约1.0mM的甘油。在优选的实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物每mM的血清型11A多糖包含至少0.3、0.4、0.5、0.6、或0.7mM的甘油以及低于约0.8mM的甘油。任何上述数字都视为本公开的实施方案。
对本发明的血清型11A糖缀合物进行表征的另一个方式是，通过载体蛋白(例如CRM197)中与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可表征为缀合赖氨酸残基的范围(缀合度)。
载体蛋白的赖氨酸修饰(由于与多糖的共价键)的证据可通过使用本领域技术人员已知的常规方法的氨基酸分析来获得。缀合导致回收的赖氨酸残基的数目与用于产生缀合物材料的CRM197蛋白起始材料相比降低。
在优选的实施方案中，本发明的血清型11A的糖缀合物的缀合度为1至15、1至13、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、2至15、2至13、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、5至15、5至10、8至15、8至12、10至15、或者10至12。在一实施方案中，本发明的血清型11A的糖缀合物的缀合度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。在优选的实施方案中，本发明的血清型11A的糖缀合物的缀合度为1至6或2至5。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
本发明的血清型11A糖缀合物还可通过糖与载体蛋白的比例(重量/重量)来进行表征。在一些实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.2至4(例如，约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9或约4.0)。在其它实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.7至2.5、0.8至2.0、0.7至2.0、0.8至1.5、0.7至1.5,0.7至1.4、0.8至1.4、0.7至1.45、或0.8至1.45。在另外的实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.8至1.6(例如，约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5或约1.6)。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。在一实施方案中，所述血清型11A糖缀合物是使用还原胺化来制备的。
本发明的血清型11A糖缀合物和免疫原性组合物可含有未共价缀合至载体蛋白但却存在于糖缀合物的组合物中的游离糖。所述游离糖可非共价地与糖缀合物相关联(即非共价地结合至、吸附至、或包埋在糖缀合物中或与糖缀合物包埋)。
在一些实施方案中，本发明的血清型11A糖缀合物包含相较于血清型11A荚膜多糖的总量低于约50％的游离血清型11A荚膜多糖、低于约45％的游离糖、低于约40％的游离糖、低于约35％的游离糖、低于约30％的游离糖、低于约25％的游离糖、低于约20％的游离糖、低于约15％的游离糖、低于约10％的游离糖、或低于约5％的游离血清型11A荚膜多糖。优选地，血清型11A的糖缀合物包含低于15％的游离糖、更优选低于10％的游离糖、以及更优选低于5％的游离糖。
血清型11A糖缀合物也可通过其分子大小分布(Kd)来进行表征。大小排阻层析介质(CL-4B)可用于确定缀合物的相对分子大小分布，如上述所述。
在优选的实施方案中，至少30％的本发明的血清型11A糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％的本发明的血清型11A糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少60％的本发明的血清型11A糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少65％的本发明的血清型11A糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
1.3.8来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物
在一实施方案中，血清型8糖缀合物是通过用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯而获得的。所述活化的多糖可直接或者经间隔物(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基基团。例如，所述间隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化的多糖，其可经硫醚键偶联至载体，所述硫醚键是通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白反应后获得的(例如使用GMBS)或者与卤代乙酰化的载体蛋白反应后获得的(例如使用碘乙酰亚胺、SIB、SlAB、sulfo-SIAB、SIA或者SBAP)。优选地，所述氰酸酯(任选由CDAP化学制备)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联并且氨基衍生的糖用碳化二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学经蛋白载体上的羧基而缀合至载体蛋白。此类缀合物在例如WO 93/15760、WO95/08348和WO96/129094中有描述。
其它适合的技术使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷、对硝基苯甲酸、N-羟基丁二酰亚胺、S--NHS、EDC、TSTU。许多在国际专利申请公开号WO 98/42721中有描述。缀合中可涉及羰基接头，其可通过糖的自由羟基与CDI反应而形成(参见Bethell等人(1979)J.Biol.Chem.254:2572-2574；Hearn等人(1981)J.Chromatogr.218:509-518)随后是与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键。这可涉及将异头端还原成伯羟基、任选地对伯羟基保护/去保护、伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间体、以及CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基基团偶联。
在优选的实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物是使用还原胺化来制备的。还原胺化涉及两个步骤：(1)多糖的氧化以从单个六糖单元中的邻位二醇产生醛的功能性，(2)所述活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物。
在氧化之前，所述血清型8多糖任选是经水解的以降低其粘性。可使用机械或化学水解。可用乙酸来进行化学水解。
氧化步骤可涉及与高碘酸盐反应。对于本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸；所述术语也包括偏高碘酸盐(IO4 -)和正高碘酸盐(IO6 5-)以及各种高碘酸的盐(例如，高碘酸钠和高碘酸钾)。在一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型8的荚膜多糖在偏高碘酸盐的存在下被氧化，优选是在高碘酸钠(NaIO4)的存在下被氧化。在另一实施方案中，所述来自血清型8的荚膜多糖在正高碘酸盐的存在下被氧化，优选是在高碘酸的存在下被氧化。
在多糖的氧化步骤之后，所述多糖被认为是活化的且在以下被称作“活化的多糖”。所述活化的多糖可以是纯化的以及经冻干(冷冻干燥)的。
所述活化的多糖和所述载体蛋白可以是经过冻干(冷冻干燥)的，无论是单独(分离冻干)或是一起(共冻干)冻干。在一实施方案中，所述活化的多糖和所述载体蛋白是经过共冻干的。在另一实施方案中，所述活化的多糖和所述载体蛋白是独立冻干的。
在一实施方案中，所述冻干是在非还原性糖的存在下发生的，可能的非还原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和异麦芽糖醇。
缀合方法的第二个步骤是所述活化的多糖与载体蛋白的还原以形成缀合物(还原胺化)，其中使用还原剂。适合的还原剂包括氰基硼氢化物，如氰基硼氢化钠、硼烷吡啶、或硼氢化物交换树脂。在一实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。
在一实施方案中，在水溶剂中进行还原反应。在另一实施方案中，在非质子溶剂中进行所述反应。在一实施方案中，在DMSO(二甲基亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行所述还原反应。所述DMSO或DMF溶剂可用于将冻干的所述活化的多糖和载体蛋白重构。
在一实施方案中，还原反应中使用了0.1至3.0、0.15至2.0、0.2至1.0、或0.25至0.5摩尔当量的氰基硼氢化钠。在一实施方案中，还原反应中使用了约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.9、或3.0摩尔当量的氰基硼氢化钠。
在一实施方案中，所述还原剂是三乙酰氧基硼氢化钠。在另一实施方案中，还原反应中使用了1.0至6.0摩尔当量、2.0至5.0摩尔当量或约3.0摩尔当量的三乙酰氧基硼氢化钠。
在还原反应结束时，缀合物中可留有未反应的醛基基团，可用适宜的封闭剂来将这些封闭。在一实施方案中，此封闭剂是硼氢化钠(NaBH4)。在一实施方案中，通过将还原反应与0.5至5.0摩尔当量的NaBH4(例如约1.0、1.5、2.0、2.5或3.0摩尔当量的NaBH4)混合而实现封闭。
在缀合(还原以及任选存在的封闭)之后，可将糖缀合物纯化。糖缀合物可通过渗滤和/或离子交换层析和/或大小排阻层析来进行纯化。在一实施方案中，通过渗滤或离子交换层析或大小排阻层析来纯化所述糖缀合物。
在一实施方案中，所述糖缀合物经无菌过滤。
在一些实施方案中，本发明的血清型8糖缀合物是缀合至载体蛋白的(例如，CRM197)，并且包含具有10kDa至2,000kDa的分子量的糖。在其它此类实施方案中，所述糖具有50kDa至2,000kDa的分子量。在另外的此类实施方案中，所述糖具有如下的分子量：50kDa至1,750kDa；50kDa至1,500kDa；50kDa至1,250kDa；50kDa至1,000kDa；50kDa至750kDa；50kDa至500kDa；100kDa至2,000kDa；100kDa至1,750kDa；100kDa至1,500kDa；100kDa至1,250kDa；100kDa至1,000kDa；100kDa至750kDa；100kDa至500kDa；200kDa至2,000kDa；200kDa至1,750kDa；200kDa至1,500kDa；200kDa至1,250kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至750kDa；或者200kDa至500kDa；或者200kDa至400kDa。在一实施方案中，所述血清型8糖缀合物是使用还原胺化来制备的。
在一些实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型8糖缀合物具有50kDa至15,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型8糖缀合物具有500kDa至10,000kDa的分子量。在其它实施方案中，血清型8糖缀合物具有200kDa至10,000kDa的分子量。在其它的实施方案中，所述血清型8糖缀合物具有1,000kDa至8,000kDa或2,000kDa至8,000kDa的分子量。
在另外的实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物具有如下的分子量：200kDa至20,000kDa；200kDa至15,000kDa；200kDa至10,000kDa；200kDa至7,500kDa；200kDa至5,000kDa；200kDa至3,000kDa；200kDa至1,000kDa；500kDa至20,000kDa；500kDa至15,000kDa；500kDa至12,500kDa；500kDa至10,000kDa；500kDa至7,500kDa；500kDa至6,000kDa；500kDa至5,000kDa；500kDa至4,000kDa；500kDa至3,000kDa；500kDa至2,000kDa；500kDa至1,500kDa；500kDa至1,000kDa；750kDa至20,000kDa；750kDa至15,000kDa；750kDa至12,500kDa；750kDa至10,000kDa；750kDa至7,500kDa；750kDa至6,000kDa；750kDa至5,000kDa；750kDa至4,000kDa；750kDa至3,000kDa；750kDa至2,000kDa；750kDa至1,500kDa；1,000kDa至15,000kDa；1,000kDa至12,500kDa；1,000kDa至10,000kDa；1,000kDa至7,500kDa；1,000kDa至6,000kDa；1,000kDa至5,000kDa；1,000kDa至4,000kDa；1,000kDa至2,500kDa；2,000kDa至15,000kDa；2,000kDa至12,500kDa；2,000kDa至10,000kDa；2,000kDa至7,500kDa；2,000kDa至6,000kDa；2,000kDa至5,000kDa；2,000kDa至4,000kDa；或者2,000kDa至3,000kDa。
在另外的实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物具有如下的分子量：3,000kDa至20,000kDa；3,000kDa至15,000kDa；3,000kDa至10,000kDa；3,000kDa至7,500kDa；3,000kDa至5,000kDa；4,000kDa至20,000kDa；4,000kDa至15,000kDa；4,000kDa至12,500kDa；4,000kDa至10,000kDa；4,000kDa至7,500kDa；4,000kDa至6,000kDa；或者4,000kDa至5,000kDa。在另外的实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物具有如下的分子量：5,000kDa至20,000kDa；5,000kDa至15,000kDa；5,000kDa至10,000kDa或5,000kDa至7,500kDa。在另外的实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物具有如下的分子量：6,000kDa至20,000kDa；6,000kDa至15,000kDa；6,000kDa至10,000kDa或6,000kDa至7,500kDa。
在另外的实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物具有如下的分子量：7,000kDa至20,000kDa；7,000kDa至15,000kDa；7,000kDa至10,000kDa或7,000kDa至8,000kDa。在另外的实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物具有如下的分子量：8,000kDa至20,000kDa；8,000kDa至15,000kDa；或者8,000kDa至10,000kDa。
在一实施方案中，所述血清型8糖缀合物是使用还原胺化来制备的。
对本发明的血清型8的糖缀合物进行表征的另一个方式是，通过载体蛋白(例如CRM197)中与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可表征为缀合赖氨酸残基的范围(缀合度)。
载体蛋白赖氨酸修饰(由于与多糖的共价键)的证据，可通过使用本领域技术人员已知的常规方法进行的氨基酸分析来获得。在常见的实施方案中，所述载体蛋白通过载体蛋白上赖氨酸残基的一或多个ε-氨基基团的酰胺键而共价缀合至活化的多糖。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白包含2至20个共价缀合至糖的赖氨酸残基。在其它此类实施方案中，所述载体蛋白包含4至16个或6-14个共价缀合至糖的赖氨酸残基。
在优选的实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物的缀合度为2至20、2至15、2至13、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、3至15、3至13、3至10、3至8、3至6、3至5、3至4、5至15、5至10、8至15、8至12、10至15、或者10至12。在一实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物的缀合度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。在优选的实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物的缀合度为4至16或6至14。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。
在优选的实施方案中，所述载体蛋白包含CRM197，其含有39个赖氨酸残基。在一些此类实施方案中，所述CRM197可包含39个赖氨酸残基中的4至16或6至14个赖氨酸残基共价连接至糖。表述此参数的另一方式是，约10％至约41％、或约15％至约36％的CRM197赖氨酸共价连接至糖。在另一个此种实施方案中，所述CRM197可包含39个赖氨酸残基中的2至20个赖氨酸残基共价连接至糖。表述此参数的另一方式是，约5％至约50％的CRM197赖氨酸共价连接至糖。在一些此类实施方案中，所述CRM197可包含39个赖氨酸残基中的约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16个赖氨酸残基共价连接至糖。
本发明的血清型8的糖缀合物还可通过糖与载体蛋白的比例(重量/重量)来进行表征。在一些实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.2至4.0(例如，约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9或约4.0)。在其它实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.7至2.5。在另外的实施方案中，糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.8至1.5(例如，约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4或约1.5)。在一些此类实施方案中，所述载体蛋白为CRM197。在一实施方案中，所述血清型8糖缀合物是使用还原胺化来制备的。
本发明的血清型8糖缀合物和免疫原性组合物可含有未共价缀合至载体蛋白但却存在于糖缀合物的组合物中的游离糖。所述游离糖可非共价地与糖缀合物相关联(即非共价地结合至、吸附至、或包埋在糖缀合物中或与糖缀合物包埋)。
在一些实施方案中，本发明的血清型8的糖缀合物相对于血清型8糖的总量，包含低于约50％的游离糖、低于约45％的游离糖、低于约40％的游离糖、低于约35％的游离糖、低于约30％的游离糖、低于约25％的游离糖、低于约20％的游离糖、低于约15％的游离糖、低于约10％的游离糖、或低于约5％的游离糖。优选地，血清型8糖缀合物包含低于15％的游离糖、更优选低于10％的游离糖、以及更优选低于5％的游离糖。
所述血清型8糖缀合物也可通过其分子大小分布(Kd)来进行表征。大小排阻层析介质(CL-4B)可用于确定缀合物的相对分子大小分布。在重力自流进料柱中使用大小排阻层析(SEC)来描述(profile)缀合物的分子大小分布。大分子从介质洗脱物中的孔排出比小分子要快得多。级分收集器被用于收集柱洗脱物。通过糖测定法对级分进行比色测试。为了确定Kd，将柱进行校准以建立分子完全排出的级分(V0)，(Kd＝0)，以及代表最大滞留的级分(Vi)，(Kd＝1)。达到指定样品属性的级分(Ve)通过表达式Kd＝(Ve-V0)/(Vi-V0)而与Kd相关。
在优选的实施方案中，至少40％的本发明的血清型8的糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％的本发明的血清型8的糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少60％的本发明的血清型8的糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，至少70％的本发明的血清型8的糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
在优选的实施方案中，40％至90％的血清型8糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，50％至90％的血清型8糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。在优选的实施方案中，65％至80％的血清型8糖缀合物在CL-4B柱中具有低于或等于0.3的Kd。
2.本发明的免疫原性组合物
在一实施方案中，免疫原性组合物的肺炎链球菌荚膜糖的数目可从1种血清型(或“v”，价)到7种不同血清型(7v)。在一实施方案中，有1种血清型。在一实施方案中，有2种不同的血清型。在一实施方案中，有3种不同的血清型。在一实施方案中，有4种不同的血清型。在一实施方案中，有5种不同的血清型。在一实施方案中，有6种不同的血清型。在一实施方案中，有7种不同的血清型。如上所述，荚膜糖缀合至载体蛋白以形成糖缀合物。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种选自以下组成的组的糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)、来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物(如上述1.3.2节的糖缀合物)、来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物(如上述1.3.3节的糖缀合物)、来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物(如上述1.3.5节的糖缀合物)、来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物(如上述1.3.6节的糖缀合物)、来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物(如上述1.3.7节的糖缀合物)、和来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物(如上述1.3.8节的糖缀合物)。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物，如上述1.3.4节的糖缀合物。在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物，如上述1.3.2节中所公开的那些。在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物，如上述1.3.3节所公开的那些。在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物，如上述1.3.5节所公开的那些。在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物，如上述1.3.6节所公开的那些。在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物，如上述1.3.7节所公开的那些。在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物，如上述1.3.8节所公开的那些。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含两种肺炎链球菌血清型中每一种的至少一种糖缀合物，所述两种肺炎链球菌血清型选自：15B和22F、15B和33F、15B和12F、15B和10A、15B和11A、15B和8、22F和33F、22F和12F、22F和10A、22F和11A、22F和8、33F和12F、33F和10A、33F和11A、33F和8、12F和10A、12F和11A、12F和8、10A和11A、10A和8、和11A和8。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含三种肺炎链球菌血清型中每一种的至少一种糖缀合物，所述三种肺炎链球菌血清型选自：
15B和22F和33F，
15B和22F和12F，
15B和22F和10A，
15B和22F和11A，
15B和22F和8，
15B和33F和12F，
15B和33F和10A，
15B和33F和11A，
15B和33F和8，
15B和12F和10A，
15B和12F和11A，
15B和12F和8，
15B和10A和11A，
15B和10A和8，
15B和11A和8，
22F和33F和12F，
22F和33F和10A，
22F和33F和11A，
22F和33F和8，
22F和12F和10A，
22F和12F和11A，
22F和12F和8，
22F和10A和11A，
22F和10A和8，
22F和11A和8，
33F和12F和10A，
33F和12F和11A，
33F和12F和8，
33F和10A和11A，
33F和10A和8，
33F和11A和8，
12F和10A和11A，
12F和10A和8，
12F和11A和8或
10A和11A和8。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含四种肺炎链球菌血清型中每一种的至少一种糖缀合物，所述四种肺炎链球菌血清型选自：
15B和22F和33F和12F，
15B和22F和33F和10A，
15B和22F和33F和11A，
15B和22F和33F和8，
15B和22F和12F和10A，
15B和22F和12F和11A，
15B和22F和12F和8，
15B和22F和10A和11A，
15B和22F和10A和8，
15B和22F和11A和8，
15B和33F和12F和10A，
15B和33F和12F和11A，
15B和33F和12F和8，
15B和33F和10A和11A，
15B和33F和10A和8，
15B和33F和11A和8，
15B和12F和10A和11A，
15B和12F和10A和8，
15B和12F和11A和8，
15B和10A和11A和8，
22F和33F和12F和10A，
22F和33F和12F和11A，
22F和33F和12F和8，
22F和33F和10A和11A，
22F和33F和10A和8，
22F和33F和11A和8，
22F和12F和10A和11A，
22F和12F和10A和8，
22F和12F和11A和8，
22F和10A和11A和8，
33F和12F和10A和11A，
33F和12F和10A和8，
33F和12F和11A和8，
33F和10A和11A和8或
12F和10A和11A和8。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含五种肺炎链球菌疫苗血清型中每一种的至少一种糖缀合物，所述五种肺炎链球菌血清型选自：
15B和22F和33F和12F和10A，
15B和22F和33F和12F和11A，
15B和22F和33F和12F和8，
15B和22F和33F和10A和11A，
15B和22F和33F和10A和8，
15B和22F和33F和11A和8，
15B和22F和12F和10A和11A，
15B和22F和12F和10A和8，
15B和22F和12F和11A和8，
15B和22F和10A和11A和8，
15B和33F和12F和10A和11A，
15B和33F和12F和10A和8，
15B和33F和12F和11A和8，
15B和33F和10A和11A和8，
15B和12F和10A和11A和8，
22F和33F和12F和10A和11A，
22F和33F和12F和10A和8，
22F和33F和12F和11A和8，
22F和33F和10A和11A和8，
22F和12F和10A和11A和8或
33F和12F和10A和11A和8。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含六种肺炎链球菌疫苗血清型中每一种的至少一种糖缀合物，所述六种肺炎链球菌血清型选自：
15B和22F和33F和12F和10A和11A，
15B和22F和33F和12F和10A和8，
15B和22F和33F和12F和11A和8，
15B和22F和33F和10A和11A和8，
15B和22F和12F和10A和11A和8，
15B和33F和12F和10A和11A和8或
22F和33F和12F和10A和11A和8。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含七种肺炎链球菌血清型中每一种的至少一种糖缀合物，所述七种肺炎链球菌血清型选自：15B和22F和33F和12F和10A和11A和8。
在一实施方案中，本节所定义的任何免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型15B、22F、33F、12F、10A、11A和/或8的糖缀合物，都如上述1.3.2至1.3.8节所公开的。
优选地，上述免疫原性组合物的所有糖缀合物都单独缀合至载体蛋白。
在任何上述免疫原性组合物的实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述免疫原性组合物的实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述免疫原性组合物的实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述免疫原性组合物的实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述免疫原性组合物的实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述免疫原性组合物的实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述免疫原性组合物的实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物是缀合至CRM197的。
在任何上述免疫原性组合物的实施方案中，所有来自肺炎链球菌的糖缀合物都是单独缀合至CRM197的。
在任何上述免疫原性组合物的另一实施方案中，所有来自肺炎链球菌的糖缀合物都是单独缀合至PD的。在另一实施方案中，所有来自肺炎链球菌的糖缀合物都是单独缀合至TT的。在另一实施方案中，所有来自肺炎链球菌的糖缀合物都是单独缀合至DT的。
在任何上述免疫原性组合物的另一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型22F、33F、15B、12F、10A、11A和/或8的糖缀合物都是单独缀合至DT的。在另一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型22F、33F、15B、12F、10A、11A和/或8的糖缀合物都是单独缀合至TT的。在另一实施方案中，所述来自肺炎链球菌血清型22F、33F、15B、12F、10A、11A和/或8的糖缀合物都是单独缀合至PD的。
在任何上述免疫原性组合物的另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至DT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至TT的。在另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至TT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至DT的。在另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至PD的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至DT的。在另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至PD的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至TT的。在另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至TT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至PD的。在另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至DT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至PD的。
在任何上述免疫原性组合物的另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至CRM197的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至DT的。在另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至CRM197的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至TT的。在另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至CRM197的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至PD的。在另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至DT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至CRM197的。在另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至TT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至CRM197的。在另一实施方案中，至少一种糖缀合物是单独缀合至PD的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至CRM197的。
在一实施方案中，上述免疫原性组合物包括1至7种不同的肺炎链球菌血清型。在一实施方案中，上述免疫原性组合物是1、2、3、4、5、6或7价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述免疫原性组合物是6价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述免疫原性组合物是7价肺炎球菌缀合物的组合物。
1.在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物，如上述1.3.4节中所公开糖缀合物。
2.在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物在上述的1点之外，还包含至少一种来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物，如上述1.3.2节中所公开的那些。
3.在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物在上述的1或2点之外，还包含至少一种来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物，如上述1.3.3节中所公开的那些。
4.在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物在上述的1、2或3点之外，还包含至少一种来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物，如上述1.3.5节中所公开的那些。
5.在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物在上述的1、2、3或4点之外，还包含至少一种来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物，如上述1.3.6节中所公开的那些。
6.在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物在上述的1、2、3、4或5点之外，还包含至少一种来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物，如上述1.3.7节中所公开的那些。
7.在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物在上述的1、2、3、4、5或6点之外，还包含至少一种来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物，如上述1.3.8节中所公开的那些。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括来自血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的缀合的肺炎链球菌糖。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物的糖缀合物由来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的糖缀合物组成。
优选地，本发明的免疫原性组合物(例如，上述第1-7点中的任何一个)的所有糖缀合物都是单独缀合至载体蛋白的。
在任意上述第1-7点中的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任意上述第2-7点中的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任意上述第3-7点中的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任意上述第4-7点中的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任意上述第5-7点中的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任意上述第6-7点中的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物是缀合至CRM197的。在上述第7点中的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物是缀合至CRM197的。
在一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的糖缀合物是单独缀合至CRM197的。
在一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的糖缀合物是单独缀合至PD的。在一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的糖缀合物是单独缀合至TT的。在一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的糖缀合物是单独缀合至DT的。
在一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至DT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至TT的。在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至TT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至DT的。在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至PD的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至DT的。在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至PD的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至TT的。在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至TT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至PD的。在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至DT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至PD的。
在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至CRM197的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至DT的。在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至CRM197的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至TT的。在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至CRM197的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至PD的。在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至DT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至CRM197的。在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至TT的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至CRM197的。在另一实施方案中，上述第1-7点的免疫原性组合物的至少一种糖缀合物是单独缀合至PD的，且来自肺炎链球菌的其他糖缀合物是单独缀合至CRM197的。
在一实施方案中，上述免疫原性组合物是1、2、3、4、5、6或7价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述免疫原性组合物是6价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述免疫原性组合物是7价肺炎球菌缀合物的组合物。
在荚膜多糖缀合至载体蛋白之后，通过各种技术将糖缀合物纯化(对多糖-蛋白质缀合物的量进行富集)。这些技术包括浓缩/渗滤操作、沉淀/洗脱、柱层析、和深度过滤(参见例如美国专利申请公开号2007/0184072或WO 2008/079653)。在各个糖缀合物被纯化以后，将它们混合以配制本发明的免疫原性组合物。
在一实施方案中，上述免疫原性组合物的剂量如下述第5部分所公开。
在一实施方案中，上述免疫原性组合物进一步包括来自其他病原体的抗原，特别是来自如下述第6部分所公开的细菌和/或病毒的抗原。
在一实施方案中，上述免疫原性组合物还包括一或多种如下述第6部分所公开的佐剂。
在一实施方案中，上述免疫原性组合物如下述第8部分所公开的进行配制。
3.可与本发明的免疫原性组合物组合使用的免疫原性组合物
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物(例如上述第2节中的任一个)与第二免疫原性组合物组合使用。
在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物包括至少一种糖缀合物，其来自肺炎链球菌血清型的选自以下血清型组成的组：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F和33F。
在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物包括至少一种糖缀合物，其来自肺炎链球菌血清型的选自以下血清型组成的组：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。
1.在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物包含至少一种来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
2.在另一实施方案中，所述第二免疫原性组合物除了上述第1点之外，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
3.在另一实施方案中，所述第二免疫原性组合物除了上述第1或第2点之外，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型6A和19A的糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
4.在另一实施方案中，所述第二免疫原性组合物除了上述第1、2或第3点之外，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
5.在另一实施方案中，所述第二免疫原性组合物除了上述第1、2、3或第4点之外，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物(如上述1.3.2节的糖缀合物)。
6.在另一实施方案中，所述第二免疫原性组合物除了上述第1、2、4、4或第5点之外，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物(如上述1.3.3节的糖缀合物)。
优选地，上述第二免疫原性组合物的所有糖缀合物都是单独缀合至载体蛋白的。
在任何上述第二免疫原性组合物的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述第二免疫原性组合物的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述第二免疫原性组合物的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型6A和19A的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述第二免疫原性组合物的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述第二免疫原性组合物的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述第二免疫原性组合物的实施方案中，来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
在一实施方案中，任何上述第二免疫原性组合物的糖缀合物均是单独缀合至CRM197的。
在一实施方案中，来自任何上述第二免疫原性组合物的肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物是单独缀合至PD的。
在一实施方案中，来自任何上述第二免疫原性组合物的肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT的。
在一实施方案中，来自任何上述第二免疫原性组合物的肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT的。
在一实施方案中，来自任何上述第二免疫原性组合物的肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物是单独缀合至PD的，来自任何上述第二免疫原性组合物的肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT的，来自任何上述第二免疫原性组合物的肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT的。
在一实施方案中，来自任何上述第二免疫原性组合物的肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物是单独缀合至PD的，来自任何上述第二免疫原性组合物的肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT的，来自任何上述第二免疫原性组合物的肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT的，来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物是缀合至CRM197的，来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物包括7-15种不同的肺炎链球菌血清型。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物包括来自7、8、9、10、11、12、13、14或15种不同血清型的糖缀合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物包括10至15种不同血清型的糖缀合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是7、8、9、10、11、12、13、14或15价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是10价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是11价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是12价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是13价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是14价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是15价肺炎球菌缀合物的组合物。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是7价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述7种缀合物由来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F单独缀合至CRM197的7种糖缀合物组成。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是10价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述10种缀合物由以下组成：来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F单独缀合至PD的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型18C缀合至TT的糖缀合物，和来自肺炎链球菌血清型19F缀合至DT的糖缀合物。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是11价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述11种缀合物由以下组成：来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F单独缀合至PD的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型18C缀合至TT的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型19F缀合至DT的糖缀合物，和来自肺炎链球菌血清型22F缀合至CRM197的糖缀合物。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是11价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述11种缀合物由以下组成：来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F单独缀合至PD的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型18C缀合至TT的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型19F缀合至DT的糖缀合物，和来自肺炎链球菌血清型33F缀合至CRM197的糖缀合物。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是12价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述12种缀合物由以下组成：来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F单独缀合至PD的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型18C缀合至TT的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型19F缀合至DT的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型22F缀合至CRM197的糖缀合物，和来自肺炎链球菌血清型33F缀合至CRM197的糖缀合物。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是13价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述13种缀合物由来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F单独缀合至CRM197的糖缀合物组成。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是14价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述14种缀合物由来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和22F单独缀合至CRM197的糖缀合物组成。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是14价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述14种缀合物由来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和33F单独缀合至CRM197的糖缀合物组成。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是15价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述15种缀合物由来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F和33F单独缀合至CRM197的糖缀合物组成。
在一实施方案中，上述第二免疫原性的剂量如下述第5节所公开的。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物进一步包括来自其他病原体的抗原，特别是来自如下述第6节所公开的细菌和/或病毒的抗原。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物还包括一或多种如下述第7节所公开的佐剂。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物由下述第8节所公开的进行配制。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物(如上述第2节的任一)与(在一些国家为)(七价疫苗)、(十价疫苗)和/或PREVNAR(在一些国家为PREVENAR)(十三价疫苗)组合使用。
4.本发明的试剂盒
一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括：(a)如上述第2节所定义的第一免疫原性组合物；和(b)第二免疫原性组合物，其包括来自肺炎链球菌血清型的选自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F，22F和33F的至少一种糖缀合物。
一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括：(a)如上述第2节所定义的第一免疫原性组合物；和(b)第二免疫原性组合物，其包括来自肺炎链球菌血清型的选自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的至少一种糖缀合物。
一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括：(a)如上述第2节所定义的第一免疫原性组合物；和(b)如上述第3节所定义的第二免疫原性组合物。
1.在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物(试剂盒的部分(b))包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
2.在另外的实施方案中，所述第二免疫原性组合物除了上述第1点之外，包含来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的至少一种糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
3.在另外的实施方案中，所述第二免疫原性组合物除了上述第1或第2点之外，包含来自肺炎链球菌血清型6A和19A的至少一种糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
4.在另外的实施方案中，所述第二免疫原性组合物除了上述第1、2或第3点之外，包含来自肺炎链球菌血清型3的至少一种糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
5.在另外的实施方案中，所述第二免疫原性组合物除了上述第1、2、3或第4点之外，包含来自肺炎链球菌血清型22F的至少一种糖缀合物(如上述1.3.2节的糖缀合物)。
6.在另外的实施方案中，所述第二免疫原性组合物除了上述第1、2、4、4或第5点之外，包含来自肺炎链球菌血清型33F的至少一种糖缀合物(如上述1.3.3节的糖缀合物)。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物(试剂盒的部分(b))包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物(如上述1.3.1节的糖缀合物)。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F和22F的糖缀合物(如上述1.3.1和1.3.2节的糖缀合物)。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F和33F的糖缀合物(如上述1.3.1和1.3.3节的糖缀合物)。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F、22F和33F的糖缀合物(如上述1.3.1、1.3.2和1.3.3节的糖缀合物)。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和22F的糖缀合物(如上述1.3.1和1.3.2节的糖缀合物)。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和33F的糖缀合物(如上述1.3.1和1.3.3节的糖缀合物)。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F，22F和33F的糖缀合物(如上述1.3.1、1.3.2和1.3.3节的糖缀合物)。
优选地，试剂盒的第二免疫原性组合物的所有糖缀合物都是单独缀合至载体蛋白的。
在任何上述试剂盒的实施方案中，来自肺炎链球菌的血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述试剂盒的实施方案，来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述试剂盒的实施方案，来自肺炎链球菌血清型6A和19A的糖缀合物是缀合至CRM197的。在任何上述试剂盒的实施方案，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物是缀合至CRM197的。
在一实施方案中，任何上述试剂盒的糖缀合物均是单独缀合至CRM197的。
在另外的实施方案中，来自任何上述试剂盒的肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物都是单独缀合至PD的。
在一实施方案中，来自任何上述试剂盒的肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT的。
在一实施方案中，来自任何上述试剂盒的肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT的。
在一实施方案中，来自任何上述试剂盒的肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物均是单独缀合至PD的，来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT的，以及来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT的。
在一实施方案中，来自任何上述试剂盒的肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物均是单独缀合至PD的，来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT的，来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT的，来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物是缀合至CRM197的，以及来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物包括7-15种不同的肺炎链球菌血清型。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物包括来自7、8、9、10、11、12、13、14或15种不同血清型的糖缀合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物包括10至15种不同血清型的糖缀合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是7、8、9、10、11、12、13、14或15价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是10价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是11价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是12价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是13价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是14价肺炎球菌缀合物的组合物。在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是15价肺炎球菌缀合物的组合物。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是7价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述7种缀合物由来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F单独缀合至CRM197的7种糖缀合物组成。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是10价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述10种缀合物由以下组成：来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F单独缀合至PD的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型18C缀合至TT的糖缀合物，和来自肺炎链球菌血清型19F缀合至DT的糖缀合物。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是11价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述11种缀合物由以下组成：来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F单独缀合至PD的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型18C缀合至TT的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型19F缀合至DT的糖缀合物，和来自肺炎链球菌血清型22F缀合至CRM197的糖缀合物。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是11价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述11种缀合物由以下组成：来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F单独缀合至PD的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型18C缀合至TT的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型19F缀合至DT的糖缀合物，和来自肺炎链球菌血清型33F缀合至CRM197的糖缀合物。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是12价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述12种缀合物由以下组成：来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F单独缀合至PD的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型18C缀合至TT的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型19F缀合至DT的糖缀合物，来自肺炎链球菌血清型22F缀合至CRM197的糖缀合物，和来自肺炎链球菌血清型33F缀合至CRM197的糖缀合物。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是13价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述13种缀合物由来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F单独缀合至CRM197的糖缀合物组成。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是14价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述14种缀合物由来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和22F单独缀合至CRM197的糖缀合物组成。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是14价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述14种缀合物由来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和33F单独缀合至CRM197的糖缀合物组成。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物是15价肺炎链球菌缀合物的组合物，其中所述15种缀合物由来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F和33F单独缀合至CRM197的糖缀合物组成。
在一实施方案中，上述第二免疫原性的剂量如下述第5节所公开的。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物进一步包括来自其他病原体的抗原，特别是来自如下述第6节所公开的细菌和/或病毒的抗原。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物还包括一或多种如下述第7节所公开的佐剂。
在一实施方案中，上述第二免疫原性组合物如下述第8节所公开的继续配制。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物(如上述第2节的任一)与(在一些国家为)(七价疫苗)、(十价疫苗)和/或PREVNAR(在一些国家为PREVENAR)(十三价疫苗)组合使用。
在本发明的一方面，所述试剂盒采取两个容器的形式。因此，在本发明的一个实施方案中，试剂盒的每种免疫原性组合物(即，第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物)包括在单独的容器中。
在一实施方案中，试剂盒的第一免疫原性组合物(试剂盒的(a)部分)包括在容器中，所述容器选自由以下组成的组：小瓶、注射器、烧瓶、发酵罐、生物反应器、袋、广口瓶(jar)、安瓿、药筒和一次性笔(disposable pen)。在某些实施例中，所述容器被硅化。
在一实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物(试剂盒的(b)部分)包括在容器中，所述容器选自由以下组成的组：小瓶、注射器、烧瓶、发酵罐、生物反应器、袋、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。在某些实施例中，所述容器被硅化。
在一实施方案中，所述容器由玻璃、金属(例如钢、不锈钢、铝等)和/或聚合物(例如热塑性塑料、弹性体、热塑性弹性体)制成。在实施例中，所述容器由玻璃制成。
在一实施方案中，试剂盒的第一和第二免疫原性组合物包括在注射器或一次性笔中。在一实施方案中，试剂盒的第一和第二免疫原性组合物包括在注射器中。在某些实施例中，所述注射器被硅化。在某些实施例中，所述硅化注射器由玻璃制成。
在一实施方案中，试剂盒的第一和第二免疫原性组合物临时混合用于同时施用。
在一实施方案中，所述第一和第二免疫原性组合物为液体形式，优选包括在两个容器中。在一实施方案中，所述第一容器和第二容器是双腔注射器中的分开的腔室，使得当被驱动时，第一容器中的液体被引入到第二容器中。然后所得的混合物可离开注射器。两种免疫原性组合物保持分离直到准备好混合。
在一实施方案中，试剂盒的第一和/或第二免疫原性组合物是冻干形式的。
在一实施方案中，试剂盒的第一免疫原性组合物是冻干形式的，且第二免疫原性组合物是液体形式的。在另外的实施方案中，试剂盒的第二免疫原性组合物是冻干形式的，且第一免疫原性组合物是液体形式的。在所述实施方案中，冻干的免疫原性组合物可与液体免疫原性组合物临时重构用于同时施用两种免疫原性组合物。
在所述实施方案中，试剂盒包括两个容器，一个容器包括用于重构的液体材料，且第二个容器包括冻干材料。在一实施方案中，所述第二容器被密封。在一实施方案中，液体材料经由第一针引入到第二容器中，从而将冻干的材料重构成液体形式。然后将所得到的混合物取出，放入容器(例如注射器)中以施用于患者。在一实施方案中，通过第一针进行取出步骤。在另外的实施方案中，通过第二针进行取出步骤。在一实施方案中，用于取出步骤的针是与用于患者注射的相同的针。在另外的实施方案中，用于取出步骤的针是不同于用于患者注射的针。
在一实施方案中，所述第二容器是小瓶。在另外的实施方案中，第一容器和第二容器是双腔注射器中的分开的腔室，使得当被驱动时，液体材料从第一容器引入到第二容器中。将得到的混合物以液体形式离开注射器。在优选的实施方案中，冻干和液体材料保持分离直到准备好混合。
在一实施方案中，试剂盒包括预填充的注射器和小瓶。在一实施方案中，注射器包括单次剂量的第一免疫原性组合物，并且小瓶包括单剂的第二免疫原性组合物。在一实施方案中，所述注射器包括单剂的第二免疫原性组合物，并且小瓶包括单剂的第一免疫原性组合物。在另外的实施方案中，所述注射器和小瓶包括多剂。
5.免疫原性组合物的剂量
每剂中糖缀合物的量选择为这样的量：其在典型的疫苗接种者中诱导免疫保护应答而没有显著的不良副作用。此量将会根据所采用的是哪种具体免疫原以及其如何提供而改变。
5.1糖缀合物的量
免疫原性组合物中特定糖缀合物的量可基于该缀合物(缀合的和未缀合的)的总多糖而进行计算。例如，具有20％游离多糖的糖缀合物在100μg的多糖剂量中，将具有约80μg的缀合多糖和约20μg的未缀合多糖。糖缀合物的量可根据肺炎球菌血清型而改变。糖的浓度可通过糖醛酸测定来确定。
免疫原性组合物中不同多糖成分的“免疫原性量”可有偏差，且各自可包含约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约15μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、或约100μg的任何特定多糖抗原。
一般而言，每剂对于给定的血清型将包含0.1μg至100μg的多糖、特别是0.5μg至20μg、更特别是1.0μg至10μg、以及更特别是2.0μg至5.0μg。任意上述范围内的任何整数都被认为是本公开的实施方案。
在一实施方案中，每剂对于每种特定糖缀合物包含约1.0μg、约1.2μg、约1.4μg、约1.6μg、约1.8μg、约2.0μg、约2.2μg、约2.4μg、约2.6μg、约2.8μg、约3.0μg、约3.2μg、约3.4μg、约3.6μg、约3.8μg、约4.0μg、约4.2μg、约4.4μg、约4.6μg、约4.8μg、约5.0μg、约5.2μg、约5.4μg、约5.6μg、约5.8μg、或约6.0μg的多糖。
在一实施方案中，对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和/或33F的糖缀合物，每剂包含约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg、或约3.0μg的多糖。
在一实施方案中，对于来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的糖缀合物，每剂包含约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2.0μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg、或约3.0μg的多糖。
在一实施方案中，对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物，每剂包含约2.0μg、约2.2μg、约2.4μg、约2.6μg、约2.8μg、约3.0μg、约3.2μg、约3.4μg、约3.6μg、约3.8μg、约4.0μg、约4.2μg、约4.4μg、约4.6μg、约4.8μg、约5.0、约5.2μg、约5.4μg、约5.6μg、约5.8μg、或约6.0μg的多糖。
在一实施方案中，每剂对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和/或33F的每种糖缀合物包含约1.5μg至约3.0μg的多糖，以及对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物包含约3.0μg至约6.0μg的多糖。
在一实施方案中，每剂对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和/或33F的每种糖缀合物包含约2.0μg至约2.5μg的多糖，以及对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物包含约4.0μg至约4.8μg的多糖。
在一实施方案中，每剂对于来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和/或33F的每种糖缀合物包含约2.2μg的多糖，以及对于来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物包含约4.4μg的多糖。
在一实施方案中，每剂对于来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的每种糖缀合物包含约1.5μg至约3.0μg的多糖。
在一实施方案中，每剂对于来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的每种糖缀合物包含约2.0μg至约2.5μg的多糖。
在一实施方案中，每剂对于来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的每种糖缀合物包含约2.2μg的多糖。
5.2载体的量
一般而言，本发明的免疫原性组合物的每剂包含1μg至150μg的载体蛋白、特别是10μg至100μg的载体蛋白、更特别是15μg至50μg的载体蛋白、以及更特别是16μg至40μg的载体蛋白。在一实施方案中，所述载体蛋白是CRM197。
在一实施方案中，每剂包含约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约11μg、约12μg、约13μg、约14μg、约15μg、约16μg、约17μg、约18μg、约19μg、约20μg、约21μg、约22μg、约23μg、约24μg、约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg、约47μg、约48μg、约49μg、约50μg、约51μg、约52μg、约53μg、约54μg、约55μg、约56μg、约57μg、约58μg、约59μg、约60μg、约61μg、约62μg、约63μg、约64μg、约65μg、约66μg、约67μg、约68μg、约69μg、约70μg、约71μg、约72μg、约73μg、约74μg、或约75μg的载体蛋白。在一实施方案中，所述载体蛋白是CRM197。
在一实施方案中，每剂包含约10μg、约11μg、约12μg、约13μg、约14μg、约15μg、约16μg、约17μg、约18μg、约19μg、约20μg、约21μg、约22μg、约23μg、约24μg、约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、或约30μg的载体蛋白。在一实施方案中，所述载体蛋白是CRM197。
6.另外的抗原
本公开的免疫原性组合物包含缀合的肺炎链球菌糖抗原(糖缀合物)。它们还可包括来自其它病原体的抗原，特别是来自细菌和/或病毒。
在一实施方案中，本公开的免疫原性组合物包含至少一个抗原，其选自由以下组成的组：白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)、百日咳抗原(P)、非细胞的百日咳抗原(Pa)、乙肝病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、甲肝病毒(HAV)抗原、缀合的流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)b型荚膜糖(Hib)、以及灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。
在一实施方案中，本公开的免疫原性组合物包含D-T-Pa。在一实施方案中，本公开的免疫原性组合物包含D-T-Pa-Hib、D-T-Pa-IPV或D-T-Pa-HBsAg。在一实施方案中，本公开的免疫原性组合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV或D-T-Pa-HBsAg-Hib。在一实施方案中，本公开的免疫原性组合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib。
百日咳抗原：百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)引起百日咳。疫苗中的百日咳抗原是细胞的(完整细胞，以灭活的百日咳博德特菌细胞的形式)或非细胞的。细胞百日咳抗原的制备有很好的记载(例如，其可通过对百日咳博德特菌的I期培养物进行热失活而获得)。然而，本发明优选使用非细胞抗原。当使用非细胞抗原时，优选使用一种、两种或(优选)三种的以下抗原：(1)经去毒的百日咳毒素(百日咳类毒素，或PT)；(2)丝状血凝素(FHA)；(3)百日咳杆菌粘附素(也已知为69千道尔顿的外膜蛋白)。FHA和百日咳杆菌粘附素在根据本发明使用之前可用甲醛处理。PT优选通过用甲醛和/或戊二醛处理而经去毒。非细胞的百日咳抗原优选被吸附至一或多种铝盐佐剂上。作为备选，它们可以未吸附的状态来添加。当添加百日咳杆菌粘附素时，其优选已经吸附至氢氧化铝佐剂上。PT和FHA可被吸附至氢氧化铝或者磷酸铝佐剂上。最优选将PT、FHA和百日咳博德特菌粘附素全都吸附至氢氧化铝。
灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗：脊髓灰质炎病毒引起脊髓灰质炎。本发明优选的实施方案使用IPV，而不是用口服脊髓灰质炎病毒疫苗。在施用于患者之前，脊髓灰质炎病毒必须经过失活，且这可通过用甲醛处理来完成。脊髓灰质炎可由三种类型的脊髓灰质炎病毒中的一种引起。所述三种类型是类似的并且引起相同的症状，但是它们在抗原上是不同的并且被一种类型感染并不会保护不受其它类型的感染。因此在本发明中优选使用三种脊髓灰质炎病毒抗原：1型脊髓灰质炎病毒(例如，Mahoney株)、2型脊髓灰质炎病毒(例如，MEF-1株)、和3型脊髓灰质炎病毒(例如，Saukett株)。所述病毒优选经过单独培养、纯化、和灭活，并且继而再组合来提供大量的三价混合物用于与本发明使用。
白喉类毒素：白喉棒状杆菌引起白喉。白喉毒素可经过处理(例如，使用福尔马林或甲醛)以去除毒性而又保留在注射后诱导特异性抗毒素抗体的能力。这些白喉类毒素在白喉疫苗中使用。优选的白喉类毒素是通过甲醛处理制备的那些。可通过使白喉棒状杆菌在生长培养基中生长，随后再用甲醛处理、超滤以及沉淀来获得白喉类毒素。经类毒素化的材料可继而通过包括除菌过滤和/或透析的方法来进行处理。优选将白喉类毒素吸附至氢氧化铝佐剂上。
破伤风类毒素：破伤风梭菌(Clostridium tetani)引起破伤风。破伤风毒素可经过处理以提供保护性的类毒素。所述类毒素在破伤风疫苗中使用。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理制备的那些。可通过使破伤风梭菌在生长培养基中生长，随后再通过甲醛处理、超滤和沉淀来获得破伤风类毒素。继而可通过包括除菌过滤和/或透析的方法处理所述材料。
甲肝病毒抗原：甲肝病毒(HAV)是引起病毒性肝炎的一种已知物质。优选的HAV组分是基于灭活病毒的，并且灭活可通过福尔马林处理来完成。
乙肝病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的一种已知物质。衣壳的主要组分是已知为HBV表面抗原的蛋白质(或者更常见为HBsAg)，其通常是具有～24kDa的分子量的226-氨基酸的多肽。现存的乙肝疫苗都含有HBsAg，并且当此抗原被施用至正常疫苗接种者时，其刺激抗-HBsAg抗体的产生以防止HBV感染。
对于疫苗制备，已经以两种方式制备了HBsAg：从慢性乙肝载体的血浆中纯化特定形式的抗原或者通过重组DNA方法表达蛋白质(例如，在酵母细胞中重组表达)。与天然HBsAg(即血浆纯化的产物)不同，酵母表达的HBsAg通常是非糖基化的，并且这是与本发明使用的最优选的HBsAg形式。
缀合的流感嗜血杆菌b型抗原：流感嗜血杆菌b型(Hib)引起细菌脑膜炎。Hib疫苗通常是基于荚膜糖抗原，其制备已有很好的文献记载。Hib糖可缀合至载体蛋白以增强其免疫原性，特别是在儿童中。典型的载体蛋白有破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、流感嗜血杆菌蛋白D、以及来自血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物。缀合物的糖部分可包含全长磷酸多核糖基核糖醇(PRP，如从Hib细菌制备的)、和/或全长PRP的片段。Hib缀合物可吸附至或不吸附至铝盐佐剂。
在一实施方案中，本公开的免疫原性组合物还包含缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y荚膜糖(MenY)、和/或缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C荚膜糖(MenC)。
在一实施方案中，本公开的免疫原性组合物还包含缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A荚膜糖(MenA)、缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组W135荚膜糖(MenW135)、缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y荚膜糖(MenY)、和/或缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C荚膜糖(MenC)。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组W135荚膜糖(MenW135)、缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y荚膜糖(MenY)、和/或缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C荚膜糖(MenC)。
本发明的一方面提供如上述第4部分定义的试剂盒，其中任何上述的另外抗原是所述第一免疫原性组合物的一部分(试剂盒的(a)部分)。
本发明的一方面提供如上述第4部分定义的试剂盒，其中任何上述的另外抗原是所述第二免疫原性组合物的一部分(试剂盒的(b)部分)。
本发明的一方面提供如上述第4部分定义的试剂盒，其中任何上述的另外抗原是所述第一免疫原性组合物的一部分(试剂盒的(a)部分)并且任何上述的另外抗原是所述第二免疫原性组合物的一部分(试剂盒的(b)部分)。
7.佐剂
在一些实施方案中，本文公开的免疫原性组合物还可包含至少一种、两种或三种佐剂。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或者混合物。抗原可主要作为递送系统、主要作为免疫调节剂、或者同时拥有这两种强特征。适合的佐剂包括适于哺乳动物包括人类使用的那些。
可用于人类的适合的递送系统类型佐剂的已知实例包括但不限于：铝(例如，磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、水包油乳剂如MF59(4.3％w/v角鲨烯,0.5％w/v聚山梨醇酯80(80),0.5％w/v山梨糖醇酐三油酸酯(Span 85))、油包水乳剂如MontanideTM、和聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒子或纳米粒子。
在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含铝盐(铝)作为佐剂(例如，磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)。在优选的实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含磷酸铝或氢氧化铝作为佐剂。在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含0.1mg/mL至1mg/mL或者0.2mg/mL至0.3mg/mL的磷酸铝形式的元素铝。在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含约0.25mg/mL的磷酸铝形式的元素铝。
可用于人类的适合的免疫调节类型的佐剂的已知实例包括但不限于，来自Aquilla树的树皮的皂苷提取物(QS21、Quil A)、TLR4激动剂如MPL(单磷酸脂质A)、3DMPL(3-O-去乙酰基的MPL)或GLA-AQ、LT/CT突变体、细胞因子如各种白细胞介素(例如，IL-2、IL-12)或GM-CS以及类似的。
可用于人类的具有递送和免疫调节特征的适合的免疫调节类型佐剂的已知实例包括但不限于，ISCOMS(参见例如，等人(1998)J.Leukocyte Biol.64:713；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 00/48630、WO 98/36772、WO 00/41720、WO 2006/134423和WO2007/026190)或者GLA-EM，其是TLR4激动剂和水包油乳剂的组合。
对于兽医应用(包括但不限于动物实验)，可使用弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称作nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酸酰氧基)-乙胺(CGP19835A，称作MTP-PE)、和RIBITM，其含有提取自细菌的三种组分：单磷酸脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)在2％角鲨烯/80乳剂中。
用于增强本文所公开的肺炎球菌疫苗的效果的另外的示例性佐剂包括但不限于：(1)水包油乳剂制剂(有或没有其它具体的免疫刺激剂如胞壁酰肽(参见下述)或细菌细胞壁组分)，如例如(a)SAF，含有10％的角鲨烷、0.4％的80、5％的普流尼克-阻断的聚合物L121，和thr-MDP(经微流化成亚微米乳剂或经涡旋以产生较大颗粒大小的乳剂)，和(b)RIBITM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)含有2％的角鲨烯，0.2％的80，以及一或多种细菌细胞壁组分如单磷酸脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DETOXTM)；(2)皂苷佐剂，如可使用QS21、STIMULONTM(Cambridge Bioscience,Worcester,MA)、(Isconova,Sweden)、或(Commonwealth Serum Laboratories,Australia)或则由其所产生的颗粒如ISCOM(免疫刺激复合物)，所述ISCOMS可缺少额外的去污剂(例如，WO 00/07621)；(3)弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)；(4)细胞因子，如白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(例如，WO 99/44636))、干扰素(例如，γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酸脂质A(MPL)或者3-O-去乙酰基的MPL(3dMPL)(参见例如，GB-2220221、EP0689454)，任选地当与肺炎球菌糖一起使用时基本上缺乏铝(参见例如，WO 00/56358)；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合(参见例如，EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧乙烯醚或者聚氧乙烯酯(参见例如，WO 99/52549)；(8)聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂与辛苯昔醇(例如，WO 01/21207)组合或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种额外的非离子表面活性剂如辛苯昔醇(例如，WO01/21152)组合；(9)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)(例如，WO 00/62800)；(10)免疫刺激剂和金属盐颗粒(参见例如，WO 00/23105)；(11)皂苷和水包油乳剂(例如，WO 99/11241)；(12)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IM2(任选地+固醇)(例如，WO 98/57659)；(13)作为免疫刺激剂增强组合物效力的其它物质。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酸酰氧基)-乙胺MTP-PE)，等等。
在本发明的实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物包含CpG寡核苷酸作为佐剂。本文所用的CpG寡核苷酸是指免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)，并且因此这些术语可互换使用除非另有说明。免疫刺激CpG寡脱氧核苷酸含有一或多种免疫刺激性CpG基序，其是未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸，任选地在某些优选的碱基环境中。CpG免疫刺激性基序的甲基化状态一般是指二核苷酸中的胞嘧啶残基。含有至少一种未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其含有5'未甲基化的胞嘧啶通过磷酸键连接至3'鸟嘌呤，并且其通过结合至Toll样受体9(TLR-9)而活化免疫系统。在另一实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多种甲基化的CpG二核苷酸，其将会通过TLR9而活化免疫系统但却不如未甲基化的CpG基序那么强。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多个回文结构，其依次可包含CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已经在很多已授权的专利中、已公开的专利申请中、以及其它出版物中有描述，包括美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068。
在本发明的实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物包含WO 2010/125480的第3页22行至第12页36行中所描述的任何CpG寡核苷酸。
已经鉴别了不同类的CpG免疫刺激性寡核苷酸。这些被称作A、B、C和P类，并且在WO2010/125480的第3页22行至第12页36行中有更详细的描述。本发明的方法包含使用这些不同类的CpG免疫刺激性寡核苷酸。
在本发明的实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物包含A类CpG寡核苷酸。优选地，本发明的“A类”CpG寡核苷酸具有如下核酸序列：5’GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3’(SEQID NO:1)。A类寡核苷酸的一些非限制性实例包括:5’G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3’(SEQ ID NO:2)；其中“*”指代硫代磷酸酯键以及“_”指代磷酸二酯键。
在本发明的实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物包含B类CpG寡核苷酸。在一个实施方案中，用于本发明的CpG寡核苷酸是至少由下式所表示的B类CpG寡核苷酸：5'X1X2CGX3X4 3’，其中X1、X2、X3和X4是核苷酸。在一个实施方案中，X2是腺嘌呤、鸟嘌呤、或胸腺嘧啶。在另一实施方案中，X3是胞嘧啶、腺嘌呤、或胸腺嘧啶。
本发明的B类CpG寡核苷酸序列是在上述广泛描述的以及在WO 96/02555、WO 98/18810和美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116和6,339,068中公开的那些。示例性的序列包括但不限于这些所述申请和专利中公开的那些。
在一实施方案中，本发明的"B类"CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：
5’TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’(SEQ ID NO:3)，或
5’TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’(SEQ ID NO:4)，或
5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO:5)，或
5’TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO:6)，或
5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3’(SEQ ID NO:7)。
在任何这些序列中，所有的键可全都是硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，在任何这些序列中，一或多个键可以是磷酸二酯，优选地在CpG基序的“C”和“G”之间从而产生半软的CpG寡核苷酸。在任何这些序列中，乙基-尿苷或者卤素可取代5'T；卤素取代的实例包括但不限于溴-尿苷或碘-尿苷取代。
B类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO:8)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO:9)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’(SEQ ID NO:10)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’(SEQ ID NO:11)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A3’(SEQ ID NO:12)。
其中“*”代表硫代磷酸酯键。
在本发明的实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物包含C类CpG寡核苷酸。在一实施方案中，本发明的“C类”CpG寡核苷酸具有以下的核酸序列：
5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:13)，或
5’TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:14)，或
5’TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:15)，或
5’TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:16)，或
5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:17)，或
5’TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:18)，或
5’TCGACGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:19)，或
5’TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3’(SEQ ID NO:20)，或
5’TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:21)，或
5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:22)，或
5’TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3’(SEQ ID NO:23)，或
5’TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3’(SEQ ID NO:24)，或
5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3’(SEQ ID NO:25)。
在任何这些序列中，所有的键可都是硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，在任何这些序列中，一或多个键可以是磷酸二酯，优选地在CpG基序的“C”和“G”之间从而产生半软的CpG寡核苷酸。
C类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：
5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:26)，或
5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:27)，或
5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:28)，或
5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:29)，或
5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:30)，或
5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:31)，或
5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:32)，或
5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:33)，或
5’T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:34)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:35)，或
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:36)，或
5’T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:37)，或
5’T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3’(SEQ ID NO:38)。
其中“*”是指硫代磷酸酯键以及“_”指代磷酸二酯键。
在任何这些序列中，乙基-尿苷或者卤素可取代5'T；卤素取代的实例包括但不限于溴-尿苷或碘-尿苷取代。
在本发明的实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物包含P类CpG寡核苷酸。在一实施方案中，用于本发明的CpG寡核苷酸是P类CpG寡核苷酸，其含有5'TLR活化结构域和至少两个回文结构区，一个回文结构区是长度至少6个核苷酸的5'回文结构区并且直接或者通过间隔物连接至至少长度为8个核苷酸的3'回文结构区，其中所述寡核苷酸包括至少一个YpR二核苷酸。在一实施方案中，所述寡核苷酸不是T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO:27)。在一个实施方案中，所述P类CpG寡核苷酸包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，所述TLR活化结构域是TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT、或TTTT。在另一实施方案中，所述TLR活化结构域是在5'回文结构区内的。在另一实施方案中，所述TLR活化结构域是在紧邻所述5'回文结构区的5'端。
在一实施方案中，本发明的“P类”CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：
5’TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO:39)。
在所述序列中，所有的键可全都是硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，一或多个键可以是磷酸二酯，优选地在CpG基序的“C”和“G”之间从而产生半软的CpG寡核苷酸。在任何这些序列中，乙基-尿苷或者卤素可取代5'T；卤素取代的实例包括但不限于溴-尿苷或碘-尿苷取代。
P类寡核苷酸的非限制性实例包括：
5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO:40)。
其中“*”是指硫代磷酸酯键且“_”指代磷酸二酯键。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯键。在另外的实施方案中，寡核苷酸的所有的核苷酸之间的键都是硫代磷酸酯键。在另外的实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯-样键(phosphodiester-like linkage)。在另外的实施方案中，所述磷酸二酯-样键是磷酸二酯键。在另外的实施方案中，亲酯基团缀合至所述寡核苷酸。在一实施方案中，所述亲酯基团是胆固醇。
在一实施方案中，本文公开的CpG寡核苷酸的所有核苷酸之间的键都是磷酸二酯键(“软”寡核苷酸，如WO 2007/026190中所公开的)。在另一实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸赋予对降解的抗性(例如，经稳定)。“经稳定的寡核苷酸”是指对于体内降解(例如，通过核酸外切酶或核酸内切酶)相对有抗性的寡核苷酸。可通过骨架修饰来实现核酸的稳定。具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸提供最大的活性且防止寡核苷酸被细胞内的核酸外切酶或核酸内切酶所降解。
所述免疫刺激性寡核苷酸可具有嵌合骨架，其具有磷酸二酯和硫代磷酸酯键的组合。对于本发明的目的，嵌合骨架是指经部分稳定的骨架，其中至少一个核苷酸之间的键是磷酸二酯或者磷酸二酯-样，并且其中至少另一个核苷酸之间的键是经稳定的核苷酸之间的键，其中所述至少一个磷酸二酯或磷酸二酯-样键和所述至少一个经稳定的键是不同的。当所述磷酸二酯键优选位于CpG基序之内时，此类分子称作“半软”，如WO 2007/026190中所述。
其它经修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、和/或对-乙氧基键的组合。
可如WO 2007/026190中所述合成混合的骨架修饰的ODN。
所述CpG寡核苷酸的大小(即沿寡核苷酸长度的核苷酸残基的数目)也可有助于寡核苷酸的刺激活化性。为了促进细胞的摄入，本发明的CpG寡核苷酸优选具有6个核苷酸残基的最小长度。任何超过6个核苷酸大小的寡核苷酸(即使数kb长)在存在足够的免疫刺激性基序时都能够诱导免疫应答，因为更长的寡核苷酸在细胞内降解。在某些实施方案中，所述CpG寡核苷酸长度为6至100个核苷酸，优选长度为8至30个核苷酸。在重要的实施方案中，本发明的核酸和寡核苷酸不是质粒或者表达载体。
在一实施方案中，本文公开的CpG寡核苷酸包含取代或者修饰，如在WO 2007/026190的134至147段中所描述的碱基和/或糖中。
在一实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸是经化学修饰的。化学修饰的实例是本领域技术人员已知的并且在例如Uhlmann等人(1990)Chem.Rev.90:543；S.Agrawal,Ed.,Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke等人(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36:107-129；和Hunziker等人(1995)Mod.Synth.Methods 7:331-417中描述。本发明的寡核苷酸可具有一个或多个修饰，其中每个修饰位于特定的磷酸二酯核苷酸间的桥处和/或位于特定的β-D-核糖单元处和/或位于特定的天然核苷酸碱基位置处(相较于由天然DNA或RNA组成的相同序列的寡核苷酸)。
在本发明的一些实施方案中，含有CpG的核酸可根据本领域技术人员已知的方法简单地与免疫原性载体混合(参见例如，WO 03/024480)。
在本发明特定的实施方案中，本文公开的任何免疫原性组合物包含2μg至100mg的CpG寡核苷酸、优选0.1mg至50mg的CpG寡核苷酸、优选0.2mg至10mg的CpG寡核苷酸、优选0.3mg至5mg CpG的寡核苷酸、优选0.3mg至5mg CpG寡核苷酸、更优选0.5至2mg的CpG寡核苷酸、更优选0.75至1.5mg的CpG寡核苷酸。在优选的实施方案中，本文公开的任何免疫原性组合物包含约1mg的CpG寡核苷酸。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物(例如上述第2节所定义的)包括如上定义的佐剂，优选铝盐(明矾)(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)。在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括磷酸铝或氢氧化铝作为佐剂。
在一实施方案中，可与本发明的免疫原性组合物组合使用的免疫原性组合物(例如上述第3节所定义的)包括如上定义的佐剂，优选铝盐(明矾)(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)。在一实施方案中，所述免疫原性组合物包括磷酸铝或氢氧化铝作为佐剂。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中仅第一免疫原性组合物(试剂盒的(a)部分)包括如上所定义的佐剂。
本发明的一方面提供了如上述第4节所定义的试剂盒，其中仅第二免疫原性组合物(试剂盒的(b)部分)包括如上定义的佐剂。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中免疫原性组合物(试剂盒的(a)和(b)部分)均包括如上定义的佐剂。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中免疫原性组合物(试剂盒的(a)和(b)部分)均包括佐剂，其选自由以下组成的组：磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中免疫原性组合物(试剂盒的(a)和(b)部分)均包括磷酸铝作为佐剂。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中免疫原性组合物(试剂盒的(a)和(b)部分)均包括氢氧化铝作为佐剂。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中免疫原性组合物(试剂盒的(a)和(b)部分)均包括硫酸铝作为佐剂。
8.制剂
本文公开的免疫原性组合物可配制为液体的形式(即溶液或者悬液)或者冻干的形式。液体制剂可有利地直接从其包装的形式施用，并因而对于注射是理想的，无需在水介质中进行重构(否则为如冻干的组合物所需要的那样)。
本文公开的免疫原性组合物的制剂可使用本领域识别的方法来实现。例如，各肺炎球菌缀合物可与生理学可接受的载体配制以制备组合物。此类载体的实例包括但不限于：水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)和右旋糖溶液。
本公开提供了这样的免疫原性组合物，其包含本文公开的糖缀合物的任何组合以及药学上可接受的赋形剂、载体、或稀释剂。
在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物是液体的形式，优选是水成液体的形式。
本公开的免疫原性组合物可包括以下的一或多种：缓冲液、盐、二价阳离子、非离子去污剂、冷冻防护剂如糖、和抗氧化剂如自由基清除剂或螯合剂、或者其任意组合。
在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含缓冲液。在一实施方案中，所述缓冲液具有约3.5至约7.5的pKa。在一些实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。在某些实施方案中，所述缓冲液是终浓度1mM至10mM的琥珀酸盐。在一个特定的实施方案中，琥珀酸盐缓冲液的终浓度为约5mM。
在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含盐。在一些实施方案中，所述盐选自由以下组成的组：氯化镁、氯化钾、氯化钠以及其组合。在一个特定的实施方案中，所述盐是氯化钠。在一个特定的实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含150mM的氯化钠。
在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含表面活性剂。在一实施方案中，所述表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯20(TWEENTM20)、聚山梨醇酯40(TWEENTM40)、聚山梨醇酯60(TWEENTM60)、聚山梨醇酯65(TWEENTM65)、聚山梨醇酯80(TWEENTM80)、聚山梨醇酯85(TWEENTM85)、TRITONTM N-101、TRITONTM X-100、辛苯昔醇40(oxtoxynol)、壬苯聚醇-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15，Solutol H 15)、聚氧乙烯-35-蓖麻醇酸酯( EL)、大豆卵磷脂和泊洛沙姆。在一个特定的实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。在一些所述实施方案中，制剂中聚山梨醇酯80的终浓度为至少0.0001％至10％重量比重量(w/w)聚山梨醇酯80。在一些所述实施方案中，制剂中聚山梨醇酯80的终浓度为至少0.001％至1％重量比重量(w/w)聚山梨醇酯80。在一些所述实施方案中，制剂中聚山梨醇酯80的终浓度为至少0.01％至1％重量比重量(w/w)聚山梨醇酯80。在其它实施方案中，制剂中聚山梨醇酯80的终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、或0.1％(w/w)聚山梨醇酯80。在另外的实施方案中，制剂中聚山梨醇酯80的终浓度为1％(w/w)聚山梨醇酯80。
在某些实施方案中，本文公开的免疫原性组合物具有5.5至7.5的pH、更优选5.6至7.0的pH、更优选5.8至6.0的pH。
在一个实施方案中，本发明提供了容器，其中填充有本文所公开的任何免疫原性组合物。在一个实施方案中，所述容器选自由以下组成的组：小瓶、注射器、烧瓶、发酵器、生物反应器、袋、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。在某些实施方案中，所述容器经硅化。
在一实施方案中，本发明的容器由玻璃、金属(例如，钢、不锈钢、铝等)和/或聚合物(例如，热塑塑料、弹性体、热塑弹性体)制成。在一实施方案中，本发明的容器由玻璃制成。
在一个实施方案中，本发明提供了填充有本文公开的任何免疫原性组合物的注射器。在某些实施方案中，所述注射器经硅化和/或由玻璃制成。
本文公开的免疫原性组合物用于注射的典型剂量具有0.1mL至2mL的体积、更优选0.2mL至1mL、更优选约0.5mL的体积。
因此上述所定义的容器或注射填充有0.1mL至2mL、更优选0.2mL至1mL、更优选约0.5mL体积的本文所定义的任何免疫原性组合物。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物(例如上述第2节所定义的)如上所述配制。
在一实施方案中，可与本发明的免疫原性组合物组合使用的免疫原性组合物(例如上述第3节所定义的)如上所述配制。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中免疫原性组合物(试剂盒的(a)和(b)部分)均如上所述进行配制。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中免疫原性组合物(试剂盒的(a)和(b)部分)均以液体形式配制。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中免疫原性组合物(试剂盒的(a)和(b)部分)均以冻干形式配制。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中第一免疫原性组合物(试剂盒的(a)部分)为液体形式，且第二免疫原性组合物(试剂盒的(b)部分)为冻干形式。
本发明的一方面提供如上述第4节所定义的试剂盒，其中第一免疫原性组合物(试剂盒的(a)部分)为冻干形式，且第二免疫原性组合物(试剂盒的(b)部分)为液体形式。
9.本发明免疫原性组合物和试剂盒的用途
在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物和试剂盒被用于药物用途。
如本文所描述的免疫原性组合物和试剂盒可用于各种治疗或预防方法，以用于预防、治疗或缓解对象中的细菌感染、疾病或病症(condition)。具体而言，本文所述的免疫原性组合物和试剂盒可用于预防、治疗或缓解对象中的肺炎链球菌感染、疾病或病症。
因而在一方面，本发明提供了用于在对象在预防、治疗或缓解与肺炎链球菌相关的感染、疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本文描述的免疫原性组合物。
在一些此类实施方案中，所述感染、疾病或病症选自由以下组成的组：肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、脓毒症、脓胸、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝织炎、软组织感染和脑脓肿。
在一实施方案中，本发明提供了在对象中诱导针对肺炎链球菌的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。
在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物被用作疫苗。在此类实施方案中，如本文所描述的免疫原性组合物和试剂盒可用于预防肺炎链球菌在对象中的感染。因而在一方面，本发明提供了在对象中预防肺炎链球菌感染的方法，其包括向对象施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。在一些此类实施方案中，所述感染选自由以下组成的组：肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、脓毒症、脓胸、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝织炎、软组织感染和脑脓肿。在一方面，待接种疫苗的对象是哺乳动物，如人、猫、绵羊、猪、马、牛或狗。
在一方面，本文公开的免疫原性组合物用于在对象中预防、治疗或缓解与肺炎链球菌相关的感染、疾病或病症的方法中。在一些此类实施方案中，所述感染、疾病或病症选自由以下组成的组：肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、脓毒症、脓胸、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝织炎、软组织感染和脑脓肿。
在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物和试剂盒被用作疫苗。在此类实施方案中，如本文所描述的免疫原性组合物和试剂盒可用于预防肺炎链球菌在对象中的感染。因而在一方面，本文公开的免疫原性组合物和试剂盒用在对象中预防肺炎链球菌感染的方法中。在一些此类实施方案中，所述感染选自由以下组成的组：肺炎、鼻窦炎、中耳炎、急性中耳炎、脑膜炎、菌血症、脓毒症、脓胸、结膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂窝织炎、软组织感染和脑脓肿。在一方面，待接种疫苗的对象是哺乳动物，如人类、猫、绵羊、猪、马、牛或狗。
本发明的免疫原性组合物可用于保护或者治疗易受肺炎球菌感染的人，其中是通过经全身性或粘膜途径施用免疫原性组合物的手段。在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物是通过肌肉内、腹膜内、皮内或皮下途径施用的。在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物是通过肌肉内、腹膜内、皮内或皮下注射施用的。在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物是通过肌肉内或皮下注射来施用的。
在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，当施用至对象时，能够诱导抗体的形成，所述抗体能够结合肺炎链球菌血清型15B、15A和/或15C(以标准ELISA测定测量)。在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，当施用至对象时，能够诱导抗体的形成，所述抗体能够结合肺炎链球菌血清型15B和15C(以标准ELISA测定测量)。
在ELISA(酶联免疫吸附测定)方法中，将已吸附至固体支持物上的多糖与来自免疫接种的对象的血清的抗体温育。使用酶缀合的次级检测抗体来检测所结合的抗体。
在一实施方案中，所述标准ELISA测定是标准化的(WHO)ELISA测定，如WHO在“Training manual for Enzyme linked immunosorbent assay for the quantitationof Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG(Pn PS ELISA)”(可通过http://www.vaccine.uab.edu/ELISA％20protocol.pdf获取；最近获取于2014年3月31日)中所定义的。
所述ELISA测量人类血清中存在的类型特异性IgG抗肺炎链球菌荚膜多糖(PS)抗体。当人类血清的稀释被加入到类型特异性的荚膜PS-涂敷的微量滴定平板时，特异于荚膜PS的抗体结合至微量滴定平板。使用山羊抗人IgG碱性磷酸酶标记的抗体(随后是对-硝基苯磷酸酯底物)来检测结合至平板的抗体。染色终产物的光密度与血清中存在的抗荚膜PS抗体的量成比例。
在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物能够在人类中引出IgG抗体，所述IgG抗体能够以至少0.05、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4或0.5μg/ml的浓度(以ELISA测定测量)结合肺炎链球菌血清型15B多糖。
在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物能够在人类中引出IgG抗体，所述IgG抗体能够以至少0.05、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4或0.5μg/ml的浓度(以ELISA测定测量)结合肺炎链球菌血清型15C多糖。
在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物能够在人类中引出IgG抗体，所述IgG抗体能够以至少0.05、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4或0.5μg/ml的浓度(以ELISA测定测量)结合肺炎链球菌血清型15B和15C多糖。
在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，当施用至对象时，能够诱导抗体的形成，所述抗体在本文公开的调理吞噬测定中(如实施例12的OPA测定)能够杀伤肺炎链球菌血清型15B。
在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，当在本文公开的OPA测定中进行测试时(如实施例12的OPA测定)，具有比未缀合的天然肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖所获得的OPA效价要更高的OPA效价。
在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，当施用至对象时，能够诱导抗体的形成，所述抗体在本文公开的调理吞噬测定中(如实施例12的OPA测定)能够杀伤肺炎链球菌血清型15C。在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，当在本文公开的OPA测定中进行测试时(如实施例12的OPA测定)，具有比未缀合的天然肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖所获得的OPA效价要更高的OPA效价。
所述肺炎球菌调理吞噬测定(OPA)，其测量在功能性抗体和补体的存在下吞噬效应细胞对肺炎链球菌细胞的杀伤，而被认为是评价肺炎球菌疫苗效果的重要替代。
可通过将肺炎链球菌细胞、热灭活的待测人血清、分化的HL-60细胞(巨噬细胞)以及外源补体来源(例如，幼兔补体)的混合一起温育来进行调理吞噬测定(OPA)。调理吞噬在温育期间进行并且包被有抗体和补体的细菌细胞经调理吞噬而被杀伤。逃避了调理吞噬的存活细菌的菌落形成单位(cfu)是通过将测定混合物铺板确定的。所述OPA效价定义为相对于无测试血清的对照孔导致细菌计数有50％降低的倒数稀释。所述OPA效价是从涵盖50％杀伤截断值的两个稀释内推出来的。
在这些杀伤类型的OPA中，1:8或更高的终末点效价被视为阳性结果。
在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本发明的免疫原性组合物经调理吞噬杀伤测定法(OPA)确定，能够在至少50％的对象中引起针对肺炎链球菌血清型15B的至少1:8的效价。在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，能够在至少60％、70％、80％、90％、或至少93％的对象中引起针对肺炎链球菌血清型15B的至少1:8的效价(经调理吞噬杀伤测定(OPA)确定)。
在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，能够在至少50％的对象中引起针对肺炎链球菌血清型15C的至少1:8的效价(经调理吞噬杀伤测定(OPA)确定)。在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，能够在至少60％、70％、80％、90％、或至少95％的对象中引起针对肺炎链球菌血清型15C的至少1:8的效价(经调理吞噬杀伤测定(OPA)确定)。
在另外的方面，本公开提供了在对象中治疗或预防与肺炎链球菌血清型15A、15B和/或15C相关的肺炎链球菌感染、疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：施用治疗或预防有效量的本公开的任何免疫原性组合物，所述组合物包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)。在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，当施用至对象时，诱导抗体的形成，所述抗体能够结合至肺炎链球菌血清型15B、15A和/或15C。在一实施方案中，包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的免疫原性组合物，当施用至对象时，诱导抗体的形成，所述抗体在本文公开的调理吞噬测定中(如实施例12的OPA测定)能够杀伤肺炎链球菌血清型15B、15C和/或15A。
本公开的一个实施方案提供了保护对象以免受肺炎链球菌血清型15C感染的方法、或者预防肺炎链球菌血清型15C感染的方法、或者降低与肺炎链球菌血清型15C引起的感染相关的至少一种症状的严重性或者延缓其发作的方法，所述方法包括向对象施用免疫原性量的含有至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的任何本公开的免疫原性组合物。本公开的一个实施方案提供了用于在对象中治疗或预防与肺炎链球菌血清型15A、15B和/或15C(优选15B和/或15C、更优选15B)相关的肺炎链球菌感染、疾病或病症的方法，所述方法包括以下步骤：向所述对象施用治疗或预防有效量的包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的任何本公开的免疫原性组合物。另一实施方案提供了在对象中治疗或预防与肺炎链球菌血清型15A、15B和/或15C(优选15B和/或15C、更优选15B)相关的肺炎链球菌感染、疾病或病症的方法，所述方法包括从包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的任何本公开的免疫原性组合物产生多克隆或单克隆抗体制备物，并使用所述抗体制备物赋予对象被动免疫。
在一个实施方案中，本公开涉及包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的任何免疫原性组合物用于制备药物的用途，所述药物用于保护对象免受肺炎链球菌感染、和/或预防肺炎链球菌感染、和/或降低与肺炎链球菌引起的感染相关的至少一种症状的严重性或者延缓其发作、和/或保护对象免受肺炎链球菌血清型15A、15B和/或15C(优选15B和/或15C、更优选15B)的感染、和/或预防肺炎链球菌血清型15A、15B和/或15C(优选15B和/或15C、更优选15B)的感染、和/或降低与肺炎链球菌血清型15A、15B和/或15C(优选15B和/或15C、更优选15B)引起的感染相关的至少一种症状的严重性或者延缓其发作。
在一个实施方案中，本公开涉及包含至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物(如上述1.3.4节的糖缀合物)的本公开的任何免疫原性组合物的用途，所述用途是用于保护对象免受肺炎链球菌感染、和/或预防肺炎链球菌感染、和/或降低与肺炎链球菌引起的感染相关的至少一种症状的严重性或者延缓其发作、和/或保护对象免受肺炎链球菌血清型15A、15B和/或15C(优选15B和/或15C、更优选15B)的感染、和/或预防肺炎链球菌血清型15A、15B和/或15C(优选15B和/或15C、更优选15B)的感染、和/或降低与肺炎链球菌血清型15A、15B和/或15C(优选15B和/或15C、更优选15B)引起的感染相关的至少一种症状的严重性或者延缓其发作。
10.用本发明免疫原性组合物和试剂盒治疗的对象
如本文所公开的，如本文所描述的免疫原性组合物可用于各种治疗或预防方法以用来预防、治疗或缓解对象中的细菌感染、疾病或病症。
在优选的实施方案中，所述对象是人。在最优选的实施方案中，所述对象是新生的(即年龄小于3个月)、婴儿(即年龄3个月至1岁)、或者幼儿(即年龄1岁至4岁)。
在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物被用作疫苗。
在此种实施方案中，待接种疫苗对象的年龄可小于1岁。例如，待接种疫苗对象的年龄可以是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个月大。在一实施方案中，待接种疫苗对象的年龄是约2、约4或约6个月大。在另外的实施方案中，待接种疫苗对象的年龄可以低于2岁。例如，待接种疫苗对象的年龄可以是约12至约15个月大。在某些情形中，需要少至一剂的本发明的免疫原性组合物，但是在一些情况下，可提供第二、第三或第四剂(参见下述第11节)。
在本发明的实施方案中，待接种疫苗的对象为50岁或更年长的成年人、更优选55岁或更年长的成年人。在一实施方案中，待接种疫苗的对象是65岁或更年长的成年任、70岁或更年长的成年人、75岁或更年长的成年人、或者80岁或更年长的成年人。
在一实施方案中，待接种疫苗的对象是免疫受损个体，特别是人类。免疫受损个体一般定义为这样的人，其对于感染性介质的攻击展现出减弱或降低的产生正常体液或细胞防护的能力。
在本发明的实施方案中，待接种疫苗的免疫受损对象患有这样的疾病或病症，其削弱免疫系统并导致不足以防护或治疗肺炎球菌疾病的抗体应答。
在一实施方案中，所述疾病是原发性免疫缺陷病症。优选地，所述原发性免疫缺陷病症选自由以下组成的组：组合T-细胞和B-细胞免疫缺陷、抗体缺陷、定义明确的综合征、免疫失调疾病、巨噬细胞病症、先天性免疫缺陷、自身炎症性病症、和补体缺陷。在一实施方案中，所述原发性免疫缺陷病症选自WO 2010/125480的24页11行至25页19行公开中的一个。
在本发明特定的实施方案中，待接种疫苗的免疫受损对象患有疾病，所述疾病选自由以下组成的组：HIV感染、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、癌症、慢性心脏病或慢性肺病、充血性心力衰竭、糖尿病、慢性肝脏疾病、酗酒、肝硬化、脊髓液漏、心肌病、慢性支气管炎、肺气肿、慢性梗阻性肺病(COPD)、脾机能失调(如镰状细胞病)、脾功能缺乏(无脾)、血液恶性肿瘤、白血病、多发性骨髓瘤、何杰金病、淋巴瘤、肾衰竭、肾病综合征和哮喘。
在本发明实施方案中，待接种疫苗的免疫受损对象患有营养不良。
在本发明特定的实施方案中，待接种疫苗的免疫受损对象在接受降低机体对感染的抗性的药物或者治疗。在一实施方案中，所述药物选自WO 2010/125480的26页33行至26页4行中的一个。
在本发明特定实施方案中，待接种疫苗的免疫受损对象是吸烟者。
在本发明特定的实施方案中，待接种疫苗的免疫受损对象具有低于5x 109个细胞/升、或低于4x 109个细胞/升、或低于3x 109个细胞/升、或低于2x 109个细胞/升、或低于1x 109个细胞/升、或低于0.5x 109个细胞/升、或低于0.3x 109个细胞/升、或低于0.1x 109个细胞/升的白血细胞计数(白血球计数)。
白血细胞计数(白血球计数)：血液中白血细胞(WBC)的数目。所述WBC通常是作为CBC(全部血球计数)的一部分进行测量的。白血细胞是血液中与感染作斗争的细胞并且与已知为红血球的红色(携氧)血细胞不同。有不同类型的白血细胞，包括中性白细胞(多形核白细胞；PMN)、杆状核细胞(稍微未成熟的中性白细胞)、T-型淋巴细胞(T-细胞)、B-型淋巴细胞(B-细胞)、单核细胞、嗜酸性粒细胞、以及嗜碱性粒细胞。所有类型的白血细胞在白血细胞计数中都有体现。白血细胞计数的正常范围通常在每立方毫米血液4,300至10,800个细胞之间。这也可称作白血球计数并且可表示为4.3-10.8x 109个细胞/升的国际单位。
在本发明特定的实施方案中，待接种疫苗的免疫受损对象患有中性白细胞减少症。在本发明特定的实施方案中，待接种疫苗的免疫受损对象具有低于2x 109个细胞/升、或低于1x 109个细胞/升、或低于0.5x 109个细胞/升、或低于0.1x 109个细胞/升、或低于0.05x 109个细胞/升的中性白细胞计数。
低白血细胞计数或者说“中性白细胞减少症”是这样的病症，其特征在于循环血液中异常低水平的中性白细胞。中性白细胞是辅助预防感染以及与感染作斗争的具体种类的白血细胞。癌症患者经历中性白细胞减少症的最常见原因是化疗的副作用。化疗诱导的中性白细胞减少症增加了患者感染的风险并使癌症治疗中断。
在本发明特定的实施方案中，待接种疫苗的免疫受损对象具有低于500/mm3的CD4+细胞计数、或者低于300/mm3的CD4+细胞计数、或者低于200/mm3的CD4+细胞计数、或者低于100/mm3的CD4+细胞计数、低于75/mm3的CD4+细胞计数、或者低于50/mm3的CD4+细胞计数。
CD4细胞测试通常报道为mm3中细胞的数目。正常的CD4计数在500至1,600之间，而CD8计数在375至1,100之间。CD4计数在具有HIV的人中显著降低。
在本发明的实施方案中，本文公开的任何免疫受损对象是人类男性或者人类女性。
11.免疫方案
在某些情形中，需要少至一剂的本发明的免疫原性组合物，但是在某些情况下，如较强免疫缺陷或免疫不成熟的情况下，则可提供第二、第三、或第四剂。在初始疫苗接种之后，对象可接受一次或若干次充分间隔的加强免疫。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物进行疫苗接种的方案为单剂。在特定实施方案中，所述单剂方案用于年龄至少2岁的健康人。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物进行疫苗接种的方案为多剂方案。多剂方案经常用于例如免疫缺陷(例如人类老年人或人类免疫受损个体)或免疫不成熟(例如人类新生儿(即三个月以下)、婴儿(即3个月至一岁)或幼儿(即一岁到四岁))。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂，之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂，之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂，之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂，之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂，之间间隔约1个月，或者一系列的2剂，之间间隔约2个月。
在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。
在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下所组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的3剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。
在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的4剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约4个月，随后是在第一剂量之后的约10个月至约13个月的第四剂。在外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3或4个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月或2个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂，或一系列的3剂，其中各剂之间间隔约2个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。
在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：在一岁中至少一剂(例如，1、2、或3剂)，随后是至少一幼儿剂。
在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2或3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，从年龄2个月开始，随后是年龄12-18个月的幼儿剂。在一实施方案中，所述多剂方案由以下所组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，从年龄2个月开始，随后是在年龄12-15个月的幼儿剂。在另一实施方案中，所述多剂方案由以下所组成：一系列的2剂，其中各剂之间间隔约2个月，从年龄2个月开始，随后是在年龄12-18个月的幼儿剂。
在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：在年龄2、4、6、和12-15个月时的4-剂系列疫苗。
在一实施方案中，在第0天提供首剂并在约2至约24周的间隔范围内提供一或多次加强剂，优选4-8周的给药间隔。
在一实施方案中，在第0天提供首剂并在约3个月后提供加强。
在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。
在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的5剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1个月。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的6、7或8剂，其中各剂之间间隔约2个月。
本发明的一方面涉及本发明的任何免疫原性组合物，用于与第二免疫原性组合物同时、并行、伴随或依次施用。本发明的一方面涉及本文公开的任何试剂盒，用于同时、并行、伴随或依次施用。
“同时施用”是指以单一剂量单元形式施用治疗有效剂量的第一和第二免疫原性组合物。
“并行施用”是指通过相同的进入部位，但以分开的单位剂量单元形式，在短时间内施用治疗有效剂量的第一和第二免疫原性组合物。并行施用是基本上同时通过相同的进入部位、但是以分开的剂量单元形式施用两种免疫原性组合物。第一和第二免疫原性组合物的并行施用经常发生在相同的医师诊所访问期间。
“伴随施用”是指在不同的解剖部位、以分开的单位剂型在相互短时间内施用治疗有效剂量的第一和第二免疫原性组合物。伴随施用是基本上同时但是在不同的解剖部位以分开的剂量单元形式施用两种免疫原性组合物。第一和第二免疫原性组合物的伴随施用经常发生在相同的医师诊所访问期间。
“依次施用”是指单独施用治疗有效剂量的第一或第二免疫原性组合物，随后在至少约1个月的时间间隔后施用治疗有效剂量的其余免疫原性组合物。例如，在一实施方案中，第一免疫原性组合物以单一剂量单元形式施用，并且然后在至少约1个月的间隔后，以分开的单一剂量单元形式施用第二免疫原性组合物。在备选实施方案中，第二免疫原性组合物以单一剂量单元形式施用，并且然后在至少约1个月的间隔后，以分开的单一剂量单元形式施用第一免疫原性组合物。第一和第二免疫原性组合物的依次施用通常发生在不同的医师诊所访问期间。
在本发明的一方面，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)与第二免疫原性组合物同时、并行、伴随或依次施用。在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物是上述第3节公开的任何免疫原性组合物。
因此，本发明的一方面涉及根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)用于与第二免疫原性组合物同时、并行、伴随或依次施用。在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物是上述第3节公开的任何免疫原性组合物。
在一些情况下，需要少至一剂的每种免疫原性组合物，但是在某些情况下，可给予一或每种免疫原性组合物的第二、第三或第四剂。初次接种疫苗后，对象可充分间隔地接受一或几次加强免疫。
在一实施方案中，本发明涉及用于与第二免疫原性组合物同时施用的根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)。在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物是上述第3节公开的任何免疫原性组合物。
在一实施方案中，所述同时施用的疫苗接种方案是单一剂。在特定实施方案中，所述单一剂方案适用于至少2岁的健康人。
在一实施方案中，所述同时施用的疫苗接种的方案为多剂方案。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1个月至约6个月)。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1、2、3、4、5或6个月)。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1个月)，或者一系列的2剂(之间间隔约2个月)。
在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的3剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的4剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约4个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3或4个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月或2个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂，或一系列的3剂，其中各剂之间间隔约2个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。
在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：在一岁至少一剂(例如，1、2或3剂)，随后是至少一个幼儿剂。
在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2或3剂，其中从年龄2个月开始，各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，随后是年龄12-18个月的幼儿剂。在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中从年龄2个月开始，各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，随后是年龄12-15个月的幼儿剂。在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂，其中从年龄2个月开始，各剂之间间隔约2个月，随后是年龄12-18个月的幼儿剂。
在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：在年龄2、4、6、和12-15个月时的4-剂系列疫苗。
在一实施方案中，在第0天提供首剂并在约2至约24周的间隔范围内提供一或多次加强剂，优选4-8周的给药间隔。
在一实施方案中，在第0天提供首剂并在约3个月后提供加强。
在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在一实施方案中，本发明涉及用于与第二免疫原性组合物伴随施用的根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)。在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物是上述第3节公开的任何免疫原性组合物。
在一实施方案中，所述伴随施用的疫苗接种方案是单剂(虽然通过分开的单位剂量单元形式施用第一和第二免疫原性组合物，但为定义免疫方案的目的其被认为是单剂)。在特定实施方案中，所述单剂方案适用于至少2岁的健康人。
在一实施方案中，所述伴随施用的疫苗接种的方案为多剂方案(虽然通过分开的单位剂量单元形式施用第一和第二免疫原性组合物，但是为定义免疫方案的目的其被认为是单剂)。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2剂(，之间间隔约1个月至约6个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1、2、3、4、5或6个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1个月)，或者一系列的2剂(之间间隔约2个月)。
在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的3剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下所组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的4剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约4个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3或4个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月或2个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂，或一系列的3剂，其中各剂之间间隔约2个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。
在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：在一岁至少一剂(例如，1、2或3剂)，随后是至少一个幼儿剂。
在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2或3剂，其中从年龄2个月开始，各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿剂量。在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的3剂，其中从年龄2个月开始，各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月大的幼儿剂。在另外的实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂，其中从年龄2个月开始，各剂之间间隔约2个月，并且随后是年龄12-18个月的幼儿剂。
在一实施方案中，所述多剂方案由以下组成：在年龄2、4、6、和12-15个月时的4-剂系列疫苗。
在一实施方案中，在第0天提供首剂并在约2至约24周的间隔范围提供一或多次加强剂，优选4-8周的给药间隔。
在一实施方案中，在第0天提供首剂以及在约3个月后提供加强。
在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的5、6、7或8剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于与第二免疫原性组合物并行施用的根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)。在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物是上述第3节公开的任何免疫原性组合物。
在一实施方案中，所述并行施用的疫苗接种方案是单剂(虽然通过分开的单位剂量单元形式施用第一和第二免疫原性组合物，但是为定义免疫方案的目的被认为是单剂)。在特定实施方案中，所述单剂方案适用于至少2岁的健康人。
在一实施方案中，所述并行施用的疫苗接种的方案为多剂方案，具体而言是用于上述伴随施用所公开的任何多剂方案。
在一实施方案中，本发明涉及用于与第二免疫原性组合物依次施用的根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)。在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物是上述第3节公开的任何免疫原性组合物。
在一实施方案中，首先施用根据本发明的第一免疫原性组合物，并且然后施用第二免疫原性组合物。在另外的实施方案中，首先施用第二免疫原性组合物，并且然后施用根据本发明的第一免疫原性组合物。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的2、3、4、5、6、7或8剂组成。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的2、3或4剂组成。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的2剂组成。在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1个月至约6个月)。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1、2、3、4、5或6个月)。在特定实施方案中，所述多剂方案由以下组成：一系列的2剂(之间间隔约1个月)，或者一系列的2剂(之间间隔约2个月)。
在所述2-剂方案的实施方案中，首先施用根据本发明的第一免疫原性组合物，并且然后施用第二免疫原性组合物。在另外的实施方案中，首先施用第二免疫原性组合物，并且然后施用根据本发明的第一免疫原性组合物。
在所述2-剂方案的实施方案中，第一和第二剂在一岁内施用。在所述2-剂方案的实施方案中，第一剂在一岁内施用，并且第二剂为幼儿剂。在一实施方案中，所述幼儿剂在12-18个月时施用。在一实施方案中，所述幼儿剂在12-15个月时施用。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的3剂组成。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的3剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在所述3-剂方案的实施方案中，第一和第二剂在一岁内施用，第三剂是幼儿剂。在一实施方案中，从2个月大开始，第一和第二剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿剂。在一实施方案中，从2个月大开始，第一和第二剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，随后是年龄12-15个月的幼儿剂。
在所述3-剂方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为前两剂施用，并且第二免疫原性组合物作为第三剂施用。
在所述3-剂方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物作为前两剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第三剂施用。
在所述3-剂方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第一剂施用，第二免疫原性组合物作为第二剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第三剂施用。
在所述3-剂方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一剂施用，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第二剂施用，并且第二免疫原性组合物作为第三剂施用。
在所述3-剂方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第一剂施用，并且第二免疫原性组合物作为第二和第三剂施用。
在所述3-剂方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第二剂和第三剂施用。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的4剂组成。
在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的4剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在所述4-剂方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月至约4个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1、2、3或4个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月到2个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3剂，其中各剂之间间隔约1个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂，或一系列的3剂，其中各剂之间间隔约2个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂。
在另外的实施方案中，所述方案由一系列的2剂组成，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月，随后是在第一剂之后的约10个月至约13个月的第三剂和在第三剂之后约1个月至约2个月的第四剂。
在所述4-剂方案的实施方案中，第一和第二剂在一岁内施用，且第三和第四剂为幼儿剂。
在所述4-剂方案的实施方案中，第一、第二和第三剂在一岁内施用，且第四剂为幼儿剂。
在一实施方案中，所述4-剂方案由一系列的3剂组成，其中从2个月大开始，各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，随后是在年龄12-18个月的幼儿剂。在一实施方案中，所述方案由一系列的3剂组成，其中从2个月大开始，各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，随后是在年龄12-15个月的幼儿剂。
在一实施方案中，多剂方案由2、4、6和12-15个月的4-剂系列疫苗组成。
在所述4-剂方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为前三剂施用，并且第二免疫原性组合物作为第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物作为前三个剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第一剂和第二剂施用，且第二免疫原性组合物作为第三剂和第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一剂和第二剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第三剂和第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第一剂和第二剂施用，第二免疫原性组合物作为第三剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一剂和第二剂施用，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第三剂施用，且第二免疫原性组合物作为第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第一剂施用，且第二免疫原性组合物作为第二、第三和第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第二、第三和第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第一剂施用，第二免疫原性组合物作为第二剂施用，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第三剂施用，且第二免疫原性组合物作为第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一剂施用，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第二剂施用，第二免疫原性组合物作为第三剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第一剂施用，第二免疫原性组合物作为第二剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第三剂和第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一剂施用，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第二剂施用，并且第二免疫原性组合物作为第三和第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第一剂施用，第二免疫原性组合物作为第二和第三剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第四剂施用。
在所述4-剂方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一剂施用，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第二和第三剂施用，并且第二免疫原性组合物作为第四剂施用。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的5剂组成。
在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的5剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在所述5-剂方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂由约1个月至约3个月的间隔分开，随后是在第一剂之后约10个月至约13个月的第五剂。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月，随后是在第一剂之后约10个月至约13个月的第五剂。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4剂，其中各剂由约1个月的间隔所分开，随后是在第一剂之后约10个月至约13个月的第五剂，或一系列的4剂，其中各剂之间间隔约2个月，随后是在第一剂之后约10个月至约13个月的第五剂。
在另外的实施方案中，所述方案由一系列的3剂组成，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月，随后是在第一剂之后约10个月至约13个月的第四剂和在第四剂之后约1个月至约2个月的第五剂。
在所述5-剂方案的实施方案中，第一、第二和第三剂在一岁内施用，并且第四和第五剂为幼儿剂。
在所述5-剂方案的实施方案中，第一、第二、第三和第四剂在一岁内施用，并且第五剂为幼儿剂。在一实施方案中，所述5-剂方案由一系列的4剂组成，其中从2个月大开始，各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天，并且随后是年龄12-18个月的幼儿剂。在一实施方案中，所述方案由一系列的4剂组成，其中从2个月大开始，各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，随后是年龄12-15个月的幼儿剂。
在所述5-剂方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(如上述第2节的那些，在下表指定为第一IC)和第二免疫原性组合物(如上述第3节中公开的，在下表指定为第二IC)按以下顺序施用：
上表中提供用于不同剂的第一和第二免疫原性组合物(分别指定为第一IC和第二IC)的施用顺序，例如方案编号1被解读为：在所述5-剂方案的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一、第二、第三和第四剂施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物作为第五剂施用。
在优选实施方案中，第一和第二免疫原性组合物的施用顺序依照方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、20或21。
在一实施方案中，所述依次剂的疫苗接种方案由一系列的6剂组成。
在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6剂，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的6剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在所述6-剂方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月，随后是第一剂之后约10个月至约13个月的第六剂。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5剂，其中各剂之间间隔约1个月，随后是第一剂之后约10个月至约13个月的第六剂，或一系列的5剂，其中各剂之间间隔约2个月，随后是第一剂之后约10个月至约13个月的第六剂。
在所述6-剂方案的实施方案中，第一、第二、第三、第四和第五剂在一岁内施用，并且第六剂为幼儿剂。在一实施方案中，所述6-剂方案由一系列的5剂组成，其中从2个月大开始，各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，并且随后是在年龄12-18个月的幼儿剂。在一实施方案中，所述方案由一系列的5剂组成，其中从2个月大开始，各剂之间间隔约1个月至约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿剂。
在所述6-剂方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(如上述第2节的那些)和第二免疫原性组合物(如上述第3节中公开的)按5剂方案提供的30个方案中的任何一个(参见上表，方案1至30)的顺序施用，然后是第六剂。在一实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第六剂施用。在另外的实施方案中，第二免疫原组合物作为第六剂施用。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的7剂组成。
在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7剂，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的7剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在所述7-剂方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6剂，其中各剂由约1个月的间隔所分开，随后是第一剂之后约10个月至约13个月的第七剂。
在所述7-剂方案的实施方案中，第一、第二、第三、第四、第五和第六剂在一岁内施用，并且第七剂为幼儿剂。在一实施方案中，所述7-剂方案由一系列的6剂组成，其中从2个月大开始，各剂之间间隔约1个月(各剂之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿剂。在一实施方案中，所述方案由一系列的6剂组成，其中从2个月大开始，各剂之间间隔约1个月(各剂之间间隔例如28-56天)，随后是年龄12-15个月的幼儿剂。
在所述7-剂方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(如上述第2节的那些)和第二免疫原性组合物(如上述第3节中公开的)按6剂方案提供的方案中的任何一个(参见上文)的顺序施用，然后是第七剂。在一实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第七剂施用。在另外的实施方案中，第二免疫原组合物作为第七剂施用。
在一实施方案中，所述依次剂的疫苗接种方案由一系列的8剂组成。
在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8剂，其中各剂之间间隔约1个月至约12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8剂，其中各剂之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8剂，其中各剂之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8剂，其中各剂之间间隔约1个月至约2个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8剂，其中各剂之间间隔约1个月，或者一系列的8剂，其中各剂之间间隔约2个月。
在所述8-剂方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7剂，其中各剂之间间隔约1个月，随后是第一剂之后约10个月至约13个月的第八剂。
在所述8-剂方案的实施方案中，第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七剂在一岁内施用，并且第八剂为幼儿剂。在一实施方案中，所述8-剂方案由一系列的7剂组成，其中从2个月大开始，各剂之间间隔约1个月(各剂之间间隔例如28-56天)，随后是年龄12-18个月的幼儿剂。在一实施方案中，所述方案由一系列的7剂组成，其中从2个月大开始，各剂之间间隔约1个月(各剂之间间隔例如28-56天)，随后是年龄12-15个月的幼儿剂。
在所述8-剂方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(如上述第2节的那些)和第二免疫原性组合物(如上述第3节中公开的)按7剂方案提供的方案中的任何一个(参见上文)的顺序施用，然后是第八剂。在一实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物作为第八剂施用。在另外的实施方案中，第二免疫原组合物作为第八剂施用。
在一实施方案中，本发明涉及以下的依次施用：
(a)根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)，以及
(b)根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的)与第二免疫原性组合物的伴随施用。
在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物是上述第3节公开的任何免疫原性组合物。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的2次施用组成。在一实施方案中，疫苗接种方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1个月至约6个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1、2、3、4、5或6个月)。在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1个月至约2个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1个月)，或者一系列的2次施用(之间间隔约2个月)。
在所述方案的实施方案中，首先施用根据本发明的第一免疫原性组合物，并且然后伴随施用根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物。在另外的实施方案中，首先伴随施用根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物，然后施用根据本发明的第一免疫原性组合物。
在所述2次-施用方案的实施方案中，第一和第二施用在一岁内施用。在所述2-施用方案的实施方案中，第一施用在一岁内施用，并且第二施用为幼儿施用。在一实施方案中，所述幼儿施用在12-18个月的年龄施用。在一实施方案中，所述幼儿施用在12-15个月的年龄施用。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的3次施用组成。在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用(之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中每次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述3次-施用方案的实施方案中，第一和第二施用在一岁内施用，并且第三施用是幼儿施用。在一实施方案中，从2个月的年龄开始，第一和第二施用由约1个月至约2个月的间隔分开(施用之间间隔例如28-56天)，并且第三施用是年龄12-18个月的幼儿施用。在一实施方案中，从2个月的年龄开始，第一和第二施用由约1个月至约2个月的间隔分开(施用之间间隔例如28-56天)，并且第三施用是年龄12-15个月的幼儿施用。
在所述3次-施用方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第一和第二施用，并且伴随施用本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物施用于第三施用。
在所述3次-施用方案的另外的实施方案中，伴随施用根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物施用于第一和第二施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第三施用。
在所述3次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第一施用，伴随施用本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物施用于第二施用，且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第三施用。
在所述3次-施用方案的另外的实施方案中，伴随施用本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物施用于第一施用，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第二施用，并且伴随施用本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物施用于第三施用。
在所述3次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第一施用，并且伴随施用本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物施用于第二和第三施用。
在所述3次-施用方案的另外的实施方案中，伴随施用本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物施用于第一施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第二和第三施用。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的4次施用组成。
在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用(每次施用之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中每次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述4次-施用方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中每次施用之间间隔约1个月至约4个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中每次施用由约1、2、3或4个月的间隔分开，随后是第一施用之后的约10个月至约13个月的第四施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中每次施用由约1个月到2个月的间隔分开，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用，或一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用。
在所述4次-施用方案的实施方案中，第一、第二和第三施用在一岁内施用，并且第四施用为幼儿施用。在一实施方案中，所述4次-施用方案由一系列的3次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(施用之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿施用。在一实施方案中，所述方案由一系列的3次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(施用之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在一实施方案中，所述4-施用方案由2、4、6和12-15个月的一系列的施用组成。
在所述4次-施用方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第一、第二和第三施用，并且本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一、第二和第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第一施用和第二施用，并且本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第三施用和第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用和第二施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第三施用和第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第一施用和第二施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用和第二施用，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第一施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第二、第三和第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第二、第三和第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第一施用，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第二施用，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第二施用，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第一施用，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第二施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第三和第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第二施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第三和第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第一施用，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第二和第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第二和第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第四施用。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的5次施用组成。
在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用(其之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中每次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中每次施用由约1个月至约3个月的间隔分开，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第五施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第五施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第五施用，或一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第五施用。
在所述5次-施用方案的实施方案中，第一、第二、第三和第四施用在一岁内施用，并且第五施用为幼儿剂。在一实施方案中，所述5-次施用方案由一系列的4次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿施用。在一实施方案中，所述方案由一系列的4次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在所述5次-施用方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(在下表指定为第一IC)和根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物(在下表指定为第一IC/第二IC)的伴随施用按以下顺序施用：
上表中提供用于不同剂的根据本发明的第一免疫原性组合物(在下表指定为第一IC)和根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物(在下表指定为第一IC/第二IC)的伴随施用的施用顺序，例如方案编号1被解读为：在所述5次-施用方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一、第二、第三和第四施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第五施用。
在优选实施方案中，施用顺序依照方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、22或23。
在一实施方案中，所述依次剂的疫苗接种方案由一系列的6次施用组成。
在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用(其之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用，其中每次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在特定实施方案中，所述方案由以下所组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述6次-施用方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第六施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第六施用，或一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第六施用。
在所述6次-施用方案的实施方案中，第一、第二、第三、第四和第五施用在一岁内施用，并且第六施用为幼儿施用。在一实施方案中，所述6次-施用方案由一系列的5次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(施用之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月大的幼儿施用。在一实施方案中，所述方案由一系列的5次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(施用之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在所述6次-施用方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(如上述第2节的那些)和根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用按5次-施用方案提供的30个方案中的任何一个(参见上表，方案1至30)的顺序施用，然后是第六施用。在一实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第六施用。在另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第六施用。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的7次施用组成。
在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用(其之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中每次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述7次-施用方案的实施方案中，所述方案由以下所组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第七施用。
在所述7次-施用方案的实施方案中，第一、第二、第三、第四、第五和第六施用在一岁内施用，并且第七施用为幼儿施用。在一实施方案中，所述7次-施用方案由一系列的6次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月(施用之间例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿施用。在一实施方案中，所述方案由一系列的6次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月(施用之间例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在所述7次-施用方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(如上述第2节的那些)和本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用按6次-施用方案提供的方案中的任何一个(参见上文)的顺序施用，然后是第七施用。在一实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第七施用。在另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第七施用。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的8次施用组成。
在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用(其之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用，其中每次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述8次-施用方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第八施用。
在所述8次-施用方案的实施方案中，第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七施用在一岁内施用，并且第八施用为幼儿施用。在一实施方案中，所述8次-施用方案由一系列的7次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月(施用之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿施用。在一实施方案中，所述方案由一系列的7次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月(施用之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在所述8次-施用方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(如上述第2节的那些)和根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用按7次-施用方案提供的方案中的任何一个(参见上文)的顺序施用，然后是第八施用。在一实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第八施用。在另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第八施用。
在一实施方案中，在上述公开的施用方案中，伴随施用由并行施用替代。
在一实施方案中，本发明涉及以下的依次施用：
(a)第二免疫原性组合物(例如上述第3节)，和
(b)根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用。
在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物是上述第3节公开的任何免疫原性组合物。
在一实施方案中，施用方案是任一上述公开的依次施用根据本发明的第一免疫原性组合物和伴随施用根据本发明的第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物(PCT公开文本第152页底部至第164页)的方案，其中在所述方案中以(a)施用所述第二免疫原性组合物替代(a)施用第一免疫原性组合物。
在一实施方案中，在上述公开的任一施用方案中，伴随施用由并行施用替代。
因此，在一实施方案中，本发明涉及以下的依次施用：
(a)第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)，和
(b)根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的)与所述第二免疫原性组合物的伴随施用。
在一实施方案中，所述第二免疫原性组合物是上述第3节公开的任何免疫原性组合物。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的2次施用组成。在一实施方案中，疫苗接种方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1个月至约6个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1、2、3、4、5或6个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2次施用(由约1个月至约2个月的间隔分开)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的2次施用(之间间隔约1个月)，或者一系列的2次施用(之间间隔约2个月)。
在所述方案的实施方案中，首先施用第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)，并且然后伴随施用根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和第二免疫原性组合物。在另外的实施方案中，首先伴随施用根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物，并且然后施用第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)。
在所述2次-施用方案的实施方案中，第一和第二施用在一岁内施用。在所述2次-施用方案的实施方案中，第一施用在一岁内施用，并且第二施用为幼儿施用。在一实施方案中，所述幼儿施用在12-18个月时施用。在一实施方案中，所述幼儿施用在12-15个月时施用。
在一实施方案中，在上述公开的任一2次-施用方案中，伴随施用由并行施用替代。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的3次-施用组成。在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用(之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，首先2次施用(由约1个月至约2个月的间隔所分开)，然后是第一施用之后约10个月至13个月的第三施用。
在所述3次-施用方案的实施方案中，第一和第二施用在一岁内施用，并且第三施用是幼儿施用。在一实施方案中，从2个月大开始，第一和第二施用由约1个月至约2个月的间隔分开(施用之间例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿施用。在一实施方案中，从2个月大开始，第一和第二施用由约1个月至约2个月的间隔分开(施用之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在所述方案的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第二施用。
在所述3次-施用方案的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一和第二施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第三施用。
在所述3次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一和第二施用，并且第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第三施用。
在所述3次-施用方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一施用，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)的伴随施用施用于第二施用，并且第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第三施用。
在所述3-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)的伴随施用施用于第一施用，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第二施用，并且本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)的伴随施用施用于第三施用。
在所述3次-施用方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)的伴随施用施用于第二和第三施用。
在所述3次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)的伴随施用施用于第一施用，并且第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第二和第三施用。
因此在所述3次-施用方案的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)(在下表指定为第二IC)和根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)(在下表指定为第一IC/第二IC)的伴随施用按以下顺序施用：
上表提供了施用第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)(在下表指定为第二IC)和本发明的第一免疫原性组合物和所述第二免疫原性组合物(在下表指定为第一IC/第二IC)的伴随施用，用于不同的剂，例如方案编号1被解读为：在所述3-施用方案的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一和第二剂施用，且根据本发明的第一免疫原性组合物和所述第二免疫原性组合物的伴随施用作为第三剂施用。
在优选实施方案中，施用顺序依照方案1。
在一实施方案中，在上述公开的任一3次-施用方案中，伴随施用由并行施用替代。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的4次施用组成。
在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用(其之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述4次-施用方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中每次施用之间间隔约1个月至约4个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中每次施用由约1、2、3或4个月的间隔分开，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用，或一系列的3次施用，其中各次施用之间间隔约2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用。
在所述4次-施用方案的实施方案中，第一、第二和第三施用在一岁内施用，并且第四施用为幼儿施用。在一实施方案中，所述4次-施用方案由一系列的3次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(施用之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿施用。在一实施方案中，所述方案由一系列的3次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(施用之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在一实施方案中，所述4次-施用方案由2、4、6和12-15个月的一系列的施用组成。
在所述4次-施用方案的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一、第二和第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一、第二和第三施用，并且第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一施用和第二施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第三施用和第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用和第二施用，并且第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第三施用和第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一施用和第二施用，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第三施用，并且第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用和第二施用，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第二、第三和第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用，并且第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第二、第三和第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一施用，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第二施用，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第二施用，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第三施用，并且第二免疫原性组合物施用于第四施用。
在所述4次-施用方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一施用，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第二施用，并且第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第三施用和第四施用。
在所述4-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第二施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第三和第四施用。
在所述4-施用方案的另外的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第一施用，根据根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第二和第三施用，并且第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第四施用。
在所述4-施用方案的另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第一施用，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)施用于第二和第三施用，并且根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第四施用。
因此在所述4次-施用方案的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)(在下表指定为第二IC)和根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物(在下表指定为第一IC/第二IC)的伴随施用按以下顺序施用：
上表提供了第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)(在下表指定为第二IC)和根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物(在下表指定为第一IC/第二IC)伴随施用用于不同的剂的施用顺序，例如方案编号1被解读为：在所述3次-施用方案的实施方案中，第二免疫原性组合物作为第一、第二和第三剂施用，且根据本发明的第一免疫原性组合物和所述第二免疫原性组合物的伴随施用作为第四剂施用。
在优选实施方案中，施用顺序依照方案1、3或5。
在一实施方案中，在上述公开的任一4次-施用方案中，伴随施用由并行施用替代。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的5次施用组成。
在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用(其之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中每次施用由约1、2、3、4、5或6个月的间隔所分开。在一实施方案中，所述方案由以下所组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各剂之间间隔约1个月至约3个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第五施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月，随后是第一剂之后约10个月至约13个月的第五施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的4次施用，其中各剂之间间隔约1个月，随后是在第一施用之后约10个月至约13个月的第五施用，或一系列的4次施用，其中各次施用之间间隔约2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第五施用。
在所述5次-施用方案的实施方案中，第一、第二、第三和第四施用在一岁内施用，并且第五施用为幼儿剂。在一实施方案中，所述5次-施用方案由一系列的4次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿施用。在一实施方案中，所述方案由一系列的4次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(各剂之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在所述5次-施用方案的实施方案中，第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)(在下表指定为第二IC)和根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物(在下表指定为第一IC/第二IC)的伴随施用按以下顺序施用：
上表提供了第二免疫原性组合物(例如上述第3节的那些)(在下表指定为第二IC)和根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物(在下表指定为第一IC/第二IC)的伴随施用用于不同的剂的施用顺序，例如方案编号1被解读为：在所述5次-施用方案的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物和所述第二免疫原性组合物的伴随施用作为第一、第二、第三和第四剂施用，且第二免疫原性组合物作为第五剂施用。
在优选实施方案中，施用顺序依照方案16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28或30。
在一实施方案中，在上述公开的任一5次-施用方案中，伴随施用由并行施用替代。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的6次施用组成。
在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用(之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述6次-施用方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第六施用。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第六施用，或一系列的5次施用，其中各次施用之间间隔约2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第六施用。
在所述6次-施用方案的实施方案中，第一、第二、第三、第四和第五施用在一岁内施用，并且第六施用为幼儿施用。在一实施方案中，所述6次-施用方案由一系列的5次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(施用之间间隔例如28-56天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿施用。在一实施方案中，所述方案由一系列的5次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月到约2个月(施用之间例如28-56天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在所述6次-施用方案的实施方案中，第二免疫原性组合物(如上述第3节的那些)和根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用按5次-施用方案提供的30个方案中的任意(参见上表，方案1至30)的顺序施用，然后是第六施用。在一实施方案中，第二免疫原性组合物(如上述第3节的那些)施用于第六施用。在另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第六施用。
在一实施方案中，在上述公开的任意6次-施用方案中，伴随施用由并行施用替代。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的7次施用组成。
在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用(之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述7次-施用方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的6次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第七施用。
在所述7次-施用方案的实施方案中，第一、第二、第三、第四、第五和第六施用在一岁内施用，并且第七施用为幼儿施用。在一实施方案中，所述7次-施用方案由一系列的6次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月(施用之间间隔例如28-40天)，随后是在年龄12-18个月大的幼儿施用。在一实施方案中，所述方案由一系列的6次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月(施用之间间隔例如28-40天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在所述7次-施用方案的实施方案中，第二免疫原性组合物(如上述第3节的那些)和根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用按6次-施用方案提供的方案中的任何一个(参见上文)的顺序施用，然后是第七施用。在一实施方案中，第二免疫原性组合物施用于第七施用。在另外的实施方案中，本发明的第一免疫原性组合物和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第七施用。
在一实施方案中，在上述公开的任意7次-施用方案中，伴随施用由并行施用替代。
在一实施方案中，所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的8次施用组成。
在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用(之间间隔约1个月至约12个月)。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约1个月至约6个月。在特定实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约1、2、3、4、5或6个月。在一实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约1个月到约2个月。在另外的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，或者一系列的8次施用，其中各次施用之间间隔约2个月。
在所述8次-施用方案的实施方案中，所述方案由以下组成：一系列的7次施用，其中各次施用之间间隔约1个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第八施用。
在所述8次-施用方案的实施方案中，第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七施用在一岁内施用，并且第八施用为幼儿施用。在一实施方案中，所述8次-施用方案由一系列的7次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月(施用之间间隔例如28-40天)，并且随后是年龄12-18个月的幼儿施用。在一实施方案中，所述方案由一系列的7次施用组成，其中从2个月大开始，各次施用之间间隔约1个月(施用之间间隔例如28-40天)，并且随后是年龄12-15个月的幼儿施用。
在所述8次-施用方案的实施方案中，第二免疫原性组合物(如上述第3节的那些)和根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用按7次-施用方案提供的方案中的任意(参见上文)顺序施用，然后是第八剂。在一实施方案中，第二免疫原性组合物施用于第八剂。在另外的实施方案中，根据本发明的第一免疫原性组合物(例如上述第2节的那些)和所述第二免疫原性组合物的伴随施用施用于第八剂。
在一实施方案中，在上述公开的任一8-施用方案中，伴随施用由并行施用替代。
在一实施方案中，本文公开的免疫原性组合物通过肌内或皮下注射施用。
在一实施方案中，免疫原性组合物通过肌内注射施用于大腿或手臂。在一实施方案中，注射部位是大腿前外侧肌肉或三角肌。
在一实施方案中，免疫原性组合物通过皮下注射施用于大腿或手臂。在一实施方案中，注射部位是大腿前外侧肌上的脂肪组织或三头肌上的脂肪组织。
在伴随施用的情况下，第一注射可在一个大腿进行，且第二注射可在另一个大腿进行(优选在大腿前外侧肌肉中)。或者，第一注射可在一个手臂进行，且第二注射可在另一个手臂进行(优选在三角肌中)。第一注射也可在大腿进行，且第二注射在手臂进行，或者第一注射在手臂进行，且第二注射在大腿进行。
在一方面，本发明涉及本发明的试剂盒(例如上述第4节的试剂盒)，用于任何上述公开的免疫方案中。
以下编号的段阐述了本发明的特定实施方案：
1.免疫原性组合物，其包括至少一种选自以下组成的组的糖缀合物：来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物和来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物，其中所述组合物是1、2、3、4、5、6或7价肺炎球菌缀合物的组合物。
2.段1的免疫原性组合物，其中所述组合物包括至少一种来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物。
3.段1-2中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包括至少一种来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物。
4.段1-3中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包括至少一种来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物。
5.段1-4中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包括至少一种来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物。
6.段1-5中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包括至少一种来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物。
7.段1-6中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包括至少一种来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物。
8.段1-7中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包括至少一种来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物。
9.段1-8中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包括来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物和来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物，其中所述组合物是7价肺炎球菌缀合物的组合物。
10.段1-9中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖缀合物是单独缀合至CRM197的。
11.段1-9中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖缀合物是单独缀合至PD的。
12.段1-9中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖缀合物是单独缀合至TT的。
13.段1-9中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖缀合物是单独缀合至DT的。
14.段1-13中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物具有1,000kDa至20,000kDa的分子量。
15.段1-14中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物具有10,000kDa至16,000kDa的分子量。
16.段1-15中任一项的免疫原性组合物，其中血清型15B糖缀合物中血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.5至3。
17.段1-16中任一项的免疫原性组合物，其中血清型15B糖缀合物中血清型15B荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.7至0.9。
18.段1-17中任一项的免疫原性组合物，其中与血清型15B荚膜多糖的总量相比，所述血清型15B糖缀合物包括小于约50％的游离血清型15B荚膜多糖。
19.段1-18中任一项的免疫原性组合物，其中在CL-4B柱中至少40％的血清型15B糖缀合物具有低于或等于0.3的Kd。
20.段1-19中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物包括每mM的血清型15B荚膜多糖至少0.1mM乙酸盐。
21.段1-20中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物每mM的血清型15B荚膜多糖包括至少0.7mM乙酸根。
22.段1-21中任一项的免疫原性组合物，其中血清型15B糖缀合物中每mM血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM与在分离的多糖中每mM血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM的比例为至少0.6。
23.段1-22中任一项的免疫原性组合物，其中血清型15B糖缀合物每中mM血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM与活化的多糖中每mM血清型15B荚膜多糖的乙酸根mM之比为至少0.6。
24.段1-23中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物每mM血清型15B荚膜多糖包括至少0.1mM甘油。
25.段1-24中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物每mM血清型15B荚膜多糖包括至少0.5mM甘油。
26.段1-25中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物每mM血清型15B荚膜多糖包括至少0.7mM甘油。
27.段1-26中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物的缀合度为2至15。
28.段1-27中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物包括分子量为10kDa至1,500kDa的糖。
29.段1-28中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物的载体蛋白是CRM197。
30.段1-29中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型15B糖缀合物使用还原胺化来制备。
31.段1或3-30中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型22F糖缀合物具有400kDa至15,000kDa的分子量。
32.段1或3-31中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型22F糖缀合物具有1,000kDa至8,000kDa的分子量。
33.段1或3-32中任一项的免疫原性组合物，其中血清型22F糖缀合物中血清型22F荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.5至3。
34.段1或3-33中任一项的免疫原性组合物，其中血清型22F糖缀合物中血清型22F荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.9至1.1。
35.段1或3-34中任一项的免疫原性组合物，其中与血清型22F荚膜多糖的总量相比，所述血清型22F糖缀合物包括小于约50％的游离血清型22F荚膜多糖。
36.段1或3-35中任一项的免疫原性组合物，其中在CL-4B柱中至少30％的血清型22F糖缀合物具有低于或等于0.3的Kd。
37.段1或3-36中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型22F糖缀合物每mM血清型22F荚膜多糖包括至少0.1mM乙酸根。
38.段1或3-37中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型22F糖缀合物每mM血清型22F荚膜多糖包括至少0.7mM乙酸根。
39.段1或3-38中任一项的免疫原性组合物，其中血清型22F糖缀合物中每mM血清型22F荚膜多糖的乙酸根mM与分离的多糖中每mM血清型22F荚膜多糖的乙酸根mM的比例为至少0.6。
40.段1或3-39中任一项的免疫原性组合物，其中血清型22F糖缀合物中每mM血清型22F荚膜多糖的乙酸根mM与活化的多糖中每mM血清型22F荚膜多糖的乙酸根mM的比例为至少0.6。
41.段1或3-40中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型22F糖缀合物的缀合度为2至15。
42.段1或3-41中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型22F糖缀合物包括分子量为10kDa至2,000kDa的糖。
43.段1或3-42中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型22F糖缀合物的载体蛋白是CRM197。
44.段1或3-43中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型22F糖缀合物使用还原胺化来制备。
45.段1或4-44中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。
46.段1或4-45中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物具有1,000kDa至5,000kDa的分子量。
47.段1或4-46中任一项的免疫原性组合物，其中血清型33F糖缀合物中血清型33F荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.2至4。
48.段1或4-47中任一项的免疫原性组合物，其中血清型33F糖缀合物中血清型33F荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.4至1.7。
49.段1或4-48中任一项的免疫原性组合物，其中与血清型33F荚膜多糖的总量相比，所述血清型33F糖缀合物包含小于约40％的游离血清型33F荚膜多糖。
50.段1或4-49中任一项的免疫原性组合物，其中在CL-4B柱中至少35％的血清型33F糖缀合物具有低于或等于0.3的Kd。
51.段1或4-50中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物每mM血清型33F荚膜多糖包括至少0.1mM乙酸根。
52.段1或4-51中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物每mM血清型33F荚膜多糖包括至少0.7mM乙酸根。
53.段1或4-52中任一项的免疫原性组合物，其中血清型33F糖缀合物中每mM血清型33F荚膜多糖的乙酸根mM与分离的多糖中每mM血清型33F荚膜多糖的乙酸根mM的比例为至少0.6。
54.段1或4-53中任一项的免疫原性组合物，其中血清型33F糖缀合物中每mM血清型33F荚膜多糖的乙酸根mM与活化的多糖中每mM血清型33F荚膜多糖的乙酸根mM的比例为至少0.6。
55.段1或4-54中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物的缀合度为2至20。
56.段1或4-55中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物包括分子量为10kDa至2,000kDa的糖。
57.段1或4-56中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物对于每2至25个糖重复单元在载体蛋白和糖之间包括至少一个共价键。
58.段1或4-57中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物的载体蛋白是CRM197。
59.段1或4-58中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物使用还原胺化制备。
60.段1或4-59中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物使用eTEC缀合制备。
61.段60的免疫原性组合物，其中所述血清型33F糖缀合物由通式(III)表示：
其中包含eTEC间隔区的原子被包括在中央框中。
62.段1或5-61中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型12F糖缀合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。
63.段1或5-62中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型12F糖缀合物具有500kDa至5,000kDa的分子量。
64.段1或5-63中任一项的免疫原性组合物，其中血清型12F糖缀合物中血清型12F荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.2至4。
65.段1或5-64中任一项的免疫原性组合物，其中血清型12F糖缀合物中血清型12F荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.8至1.8。
66.段1或5-65中任一项的免疫原性组合物，其中与血清型12F荚膜多糖的总量相比，所述血清型22F糖缀合物包含小于约50％的游离血清型12F荚膜多糖。
67.段1或5-66中任一项的免疫原性组合物，其中在CL-4B柱中至少35％的血清型12F糖缀合物具有低于或等于0.3的Kd。
68.段1或5-67中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型12F糖缀合物的缀合度为2至20。
69.段1或5-68中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型12F糖缀合物包括分子量为10kDa至2,000kDa的糖。
70.段1或5-69中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型12F糖缀合物对于每2至25个糖重复单元在载体蛋白与糖之间包括至少一个共价键。
71.段1或5-70中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型12F糖缀合物的载体蛋白是CRM197。
72.段1或5-71中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型12F糖缀合物使用还原胺化来制备。
73.段1或5-72中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型12F糖缀合物使用TEMPO/NCS-还原胺化制备。
74.段1或6-73中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型10A糖缀合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。
75.段1或6-74中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型10A糖缀合物具有1,000kDa至10,000kDa的分子量。
76.段1或6-75中任一项的免疫原性组合物，其中血清型10A糖缀合物中血清型10A荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.5至3。
77.段1或6-76中任一项的免疫原性组合物，其中血清型10A糖缀合物中血清型10A荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.8至1.2。
78.段1或6-77中任一项的免疫原性组合物，其中与血清型10A荚膜多糖的总量相比，所述血清型10A糖缀合物包含小于约50％的游离血清型10A荚膜多糖。
79.段1或6-78中任一项的免疫原性组合物，其中在CL-4B柱中至少30％的血清型10A糖缀合物具有低于或等于0.3的Kd。
80.段1或6-79中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型10A糖缀合物的缀合度为2至15。
81.段1或6-80中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型10A糖缀合物包括分子量为10kDa至2,000kDa的糖。
82.段1或6-81中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型10A糖缀合物的载体蛋白是CRM197。
83.段1或6-82中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型10A糖缀合物使用还原胺化来制备。
84.段1或7-83中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型11A糖缀合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。
85.段1或7-84中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型11A糖缀合物具有500kDa至20,000kDa的分子量。
86.段1或7-85中任一项的免疫原性组合物，其中血清型11A糖缀合物中血清型11A荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.2至4。
87.段1或7-86中任一项的免疫原性组合物，其中血清型11A糖缀合物中血清型11A荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.8至1.6。
88.段1或7-87中任一项的免疫原性组合物，其中与血清型11A荚膜多糖的总量相比，所述血清型11A糖缀合物包含小于约50％的游离血清型11A荚膜多糖。
89.段1或7-88中任一项的免疫原性组合物，其中在CL-4B柱中至少30％血清型11A糖缀合物具有低于或等于0.3的Kd。
90.段1或7-89中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型11A糖缀合物每mM血清型11A荚膜多糖包括至少0.3mM乙酸根。
91.段1或7-90中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型11A糖缀合物每mM血清型11A荚膜多糖包括至少1.8mM乙酸根。
92.段1或7-91中任一项的免疫原性组合物，其中血清型11A糖缀合物中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM与分离的多糖中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM的比例至少为0.6。
93.段1或7-92中任一项的免疫原性组合物，其中血清型11A糖缀合物中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM与活化的多糖中每mM血清型11A荚膜多糖的乙酸根mM的比例至少为0.6。
94.段1或7-93中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型11A糖缀合物每mM血清型11A荚膜多糖包括至少0.1mM甘油。
95.段1或7-94中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型11A糖缀合物每mM血清型11A荚膜多糖包括至少0.4mM甘油。
96.段1或7-95中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型11A糖缀合物的缀合度为1至15。
97.段1或7-96中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型11A糖缀合物包括分子量为10kDa至2,000kDa的糖。
98.段1或7-97中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型11A糖缀合物的载体蛋白是CRM197。
99.段1或7-98中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型11A糖缀合物使用还原胺化来制备。
100.段1或8-99中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型8糖缀合物具有50kDa至20,000kDa的分子量。
101.段1或8-100中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型8糖缀合物具有1,000kDa至15,000kDa的分子量。
102.段1或8-101中任一项的免疫原性组合物，其中血清型8糖缀合物中血清型8荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.2至4。
103.段1或8-102中任一项的免疫原性组合物，其中血清型8糖缀合物中血清型8荚膜多糖与载体蛋白的比例(w/w)为0.8至1.5。
104.段1或8-103中任一项的免疫原性组合物，其中与血清型8荚膜多糖的总量相比，所述血清型8糖缀合物包含小于约50％的游离血清型8荚膜多糖。
105.段1或8-104中任一项的免疫原性组合物，其中在CL-4B柱中至少30％的血清型8糖缀合物具有低于或等于0.3的Kd。
106.段1或8-105中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型8糖缀合物的缀合度为2至20。
107.段1或8-106中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型8糖缀合物包括分子量为10kDa至2,000kDa的糖。
108.段1或8-107中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型8糖缀合物的载体蛋白是CRM197。
109.段1或8-108中任一项的免疫原性组合物，其中所述血清型8糖缀合物使用还原胺化来制备。
110.段1-109中任一项的免疫原性组合物，其中每剂所述免疫原性组合物包括0.1μg至100μg每种血清型的多糖。
111.段1-110中任一项的免疫原性组合物，其中每剂所述免疫原性组合物包括1.0μg至10μg每种血清型的多糖。
112.段1-111中任一项的免疫原性组合物，其中对于每种血清型糖缀合物每剂所述免疫原性组合物包括约1.0μg、约1.2μg、约1.4μg、约1.6μg、约1.8μg、2.0μg、约2.2μg、约2.4μg、约2.6μg、约2.8μg、约3.0μg、约3.2μg、约3.4μg、约3.6μg、约3.8μg、约4.0μg、约4.2μg、约4.4μg、约4.6μg、约4.8μg、约5.0μg、约5.2μg、约5.4μg、约5.6μg、约5.8μg或约6.0μg多糖。
113.段1-112中任一项的免疫原性组合物，其中对于来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和/或33F(如果存在的话)的每种糖缀合物，每剂所述免疫原性组合物包括约1.5μg至约3.0μg的多糖。
114.段1-113中任一项的免疫原性组合物，其中每剂所述免疫原性组合物包括10μg至150μg载体蛋白。
115.段1-114中任一项的免疫原性组合物，其中每剂所述免疫原性组合物包括约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约11μg、约12μg、约13μg、约14μg、约15μg、约16μg、约17μg、约18μg、约19μg、约20μg、约21μg、约22μg、约23μg、约24约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg、约47μg、约48μg、约49μg约50μg、约51μg、约52μg、约53μg、约54μg、约55μg、约56μg、约57μg、约58μg、约59μg、约60μg、约61μg、约62μg、约63μg、约64μg、约65μg、约66μg、约67μg、约68μg、约69μg、约70μg、约71μg、约72μg、约73μg、约74μg或约75μg载体蛋白。
116.段1-115中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括来自其他病原体的至少一种抗原。
117.段1-116中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包括至少一种抗体，其选自由以下组成的组：白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)、百日咳抗原(P)、非细胞的百日咳抗原(Pa)、乙肝病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、甲肝病毒(HAV)抗原、缀合的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)b型荚膜糖(Hib)、以及灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。
118.段1-117中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括D、T和Pa。
119.段1-117中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括D、T、Pa和Hib。
120.段1-117中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括D、T、Pa和IPV。
121.段1-117中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括D、T、Pa和HBsAg。
122.段1-117中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括D、T、Pa、HBsAg和IPV。
123.段1-117中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括D、T、Pa、HBsAg和Hib。
124.段1-117中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括D、T、Pa、HBsAg、IPV和Hib。
125.段1-124中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y荚膜糖(MenY)。
126.段1-125中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C荚膜糖(MenC)。
127.段1-126中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A荚膜糖(MenA)。
128.段1-127中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组W135荚膜糖(MenW135)。
129.段1-128中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y荚膜糖(MenY)和缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C荚膜糖(MenC)。
130.段1-124中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组W135荚膜糖(MenW135)、缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y荚膜糖(MenY)和/或缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C荚膜糖(MenC)。
131.段1-124中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包括缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A荚膜糖(MenA)、缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组W135荚膜糖(MenW135)、缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组Y荚膜糖(MenY)和/或缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C荚膜糖(MenC)。
132.段1-131中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括至少一种佐剂。
133.段1-132中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括至少一种佐剂，其选自由以下组成的组：磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝、磷酸钙、脂质体、水包油乳剂、MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v聚山梨醇酯80(Tween 80)、0.5％w/v山梨糖醇酐三油酸酯)、油包水乳剂、MONTANIDETM、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒子和聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)纳米粒子。
134.段1-131中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括至少一种佐剂，其选自由以下组成的组：磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。
135.段1-131中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括磷酸铝作为佐剂。
136.段1-131中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括硫酸铝作为佐剂。
137.段1-131中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括氢氧化铝作为佐剂。
138.段1-131中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包括0.1mg/mL至1mg/mL的磷酸铝形式的元素铝作为佐剂。
139.段1-131中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包括0.2mg/mL至0.3mg/mL的磷酸铝形式的元素铝作为佐剂。
140.段1-131中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包括约0.25mg/mL的磷酸铝形式的元素铝作为佐剂。
141.段1-140中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包括CpG寡核苷酸。
142.段1-141中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物以液体形式配制。
143.段1-141中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物以冻干形式配制。
144.段1-142中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物配制成水性液体形式。
145.段1-144中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包括一或多种的缓冲液、盐、二价阳离子、非离子去污剂、冷冻防护剂如糖、和抗氧化剂如自由基清除剂或螯合剂、或者其任意组合。
146.段1-145中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包括缓冲液。
147.段146的免疫原性组合物，其中所述缓冲液具有约3.5至约7.5的pKa。
148.段146-147中任一项的免疫原性组合物，其中所述缓冲液是磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。
149.段146-148中任一项的免疫原性组合物，其中所述缓冲液是终浓度1.0mM至10mM的琥珀酸盐。
150.段146-149中任一项的免疫原性组合物，其中所述缓冲液是终浓度5.0mM的琥珀酸盐。
151.段1-150中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包括盐。
152.段151的免疫原性组合物，其中所述盐选自由以下组成的组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。
153.段151-152中任一项的免疫原性组合物，其中所述盐是氯化钠。
154.段151-153中任一项的免疫原性组合物，其中所述盐是浓度为约150mM的氯化钠。
155.段1-154中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包括表面活性剂。
156.段155的免疫原性组合物，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85、Triton N-101、Triton X-100、辛苯昔醇40、壬苯聚醇-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧乙烯-660羟基硬脂酸酯、聚氧乙烯-35-蓖麻醇酸酯、大豆卵磷脂和泊洛沙姆。
157.段155-156中任一项的免疫原性组合物，其中所述表面活性剂选自组：山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85和泊洛沙姆。
158.段155-157中任一项的免疫原性组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。
159.段155-158中任一项的免疫原性组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80，其终浓度为至少0.0001％至10％重量/重量(w/w)。
160.段155-159中任一项的免疫原性组合物，其中表面活性剂是聚山梨醇酯80，其终浓度为至少0.001％至1％重量/重量(w/w)。
161.段155-160中任一项的免疫原性组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80，其终浓度为至少0.01％至1％重量/重量(w/w)。
162.段155-161中任一项的免疫原性组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80，其终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％重量/重量(w/w)。
163.段1-162中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有5.5至7.5的pH。
164.段1-163中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有5.6至7.0的pH。
165.段1-164中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有5.8至6.0的pH。
166.试剂盒，其包括：(a)第一免疫原性组合物，其包括段1-165中任一项的所述免疫原性组合物；和(b)第二免疫原性组合物，其包括至少一种选自由以下血清型组成的组的来自肺炎链球菌血清型的糖缀合物：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F和33F。
167.段166的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物。
168.段166的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物。
169.段166的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物。
170.段166的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物。
171.段166的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F和22F的糖缀合物。
172.段166的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F和33F的糖缀合物。
173.段166的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F、22F和33F的糖缀合物。
174.段166的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和22F的糖缀合物。
175.段166的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和33F的糖缀合物。
176.段166的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F和33F的糖缀合物。
177.段166-176中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
178.段166-177中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
179.段166-178中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型6A和19A的糖缀合物是缀合至CRM197的。
180.段166-179中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物是缀合至CRM197的。
181.段166-180中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
182.段166-181中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
183.段166-182中任一项的试剂盒，其中所述糖缀合物都是单独缀合至CRM197的。
184.段166-176中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的糖缀合物是单独缀合至PD的。
185.段166-176或184中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT的。
186.段166-176或184-185中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT的。
187.段166-176或184-186中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物是单独缀合至PD的，所述来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT的，且所述来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT的。
188.段184-187中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
189.段184-188中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
190.段166-189中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是7、8、9、10、11、12、13、14或15价肺炎球菌缀合物的组合物。
191.段166-190中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是10、11、12、13、14或15价肺炎球菌缀合物的组合物。
192.段166-191中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是13价肺炎球菌缀合物的组合物。
193.段166-191中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是11价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述11种缀合物由以下组成：单独缀合至PD的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的糖缀合物，缀合至TT的来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物，缀合至DT的来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物和缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物。
194.段166-191中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是11价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述11种缀合物由以下组成：单独缀合至PD的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的糖缀合物，缀合至TT的来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物，缀合至DT的来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物和缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物。
195.段166-191中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是12价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述12种缀合物由以下组成：单独缀合至PD的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的糖缀合物，缀合至TT的来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物，缀合至DT的来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物，缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物和缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型33F糖缀合物。
196.段166-192中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是13价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述13种缀合物由单独缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物组成。
197.段166-191中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是14价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述14种缀合物由单独缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和22F的糖缀合物组成。
198.段166-191中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是14价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述14种缀合物由单独缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和33F的糖缀合物组成。
199.段166-191中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是15价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述15种缀合物由单独缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F和33F的糖缀合物组成。
200.段166-199中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物的糖缀合物全部通过还原胺化缀合至载体蛋白。
201.段166-200中任一项的试剂盒，其中每剂所述第二免疫原性组合物包括1.0μg至10μg的每种血清型的多糖。
202.段166-201中任一项的试剂盒，其中每剂所述第二免疫原性组合物包括10μg至150μg载体蛋白。
203.段166-202中任一项的试剂盒，其中每剂所述第二免疫原性组合物包括约15μg、约16μg、约17μg、约18μg、约19μg、约20μg、约21μg、约22μg、约23μg、约24约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg、约47μg、约48μg、约49μg或约50μg载体蛋白。
204.段166-203中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物还包括至少一种来自其他病原体的抗原。
205.段166-204中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物还包括至少一种佐剂。
206.段166-204中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物还包括至少一种佐剂，其选自由以下组成的组：磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。
207.段166-204中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物还包括磷酸铝作为佐剂。
208.段166-204中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物还包括0.2mg/mL至0.3mg/mL的磷酸铝形式的元素铝作为佐剂。
209.段166-204中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物还包括约0.25mg/mL的磷酸铝形式的元素铝作为佐剂。
210.段166-209中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物还包括缓冲液。
211.段210的试剂盒，其中所述缓冲液具有约3.5至约7.5的pKa。
212.段210-211中任一项的试剂盒，其中所述缓冲液是磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。
213.段212的试剂盒，其中所述缓冲液是终浓度为约5.0mM的琥珀酸盐。
214.段166-213中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物还包括盐。
215.段214的试剂盒，其中所述盐选自由以下组成的组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。
216.段166-215中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包括终浓度为150mM的氯化钠。
217.段166-216中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物还包括表面活性剂。
218.段217的试剂盒，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。
219.段218的试剂盒，其中所述聚山梨醇酯80的终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、或0.1％(w/w)。
220.段166-219中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物具有5.8至6.0的pH。
221.段166-220中任一项的试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物和所述第二免疫原性组合物在分开的容器中。
222.段166-221中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二免疫原性组合物以液体形式配制。
223.段166-221中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二免疫原性组合物以冻干形式配制。
224.段166-221中任一项的试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物呈液体形式，并且所述第二免疫原性组合物呈冻干形式。
225.段166-221中任一项的试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物呈冻干形式，并且所述第二免疫原性组合物呈液体形式。
226.段1-165中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物与第二免疫原性组合物同时、并行、伴随或依次施用。
227.段1-165中任一项的免疫原性组合物，用于与第二免疫原性组合物同时、并行、伴随或依次施用。
228.段1-165中任一项的免疫原性组合物，用于与上述第3节中公开的任何免疫原性组合物同时、并行、伴随或依次施用。
229.段226-228中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括至少一种来自肺炎链球菌血清型选自由以下血清型组成的组的糖缀合物：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F和33F。
230.段229的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物。
231.段229的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物。
232.段229的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物。
233.段229的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物。
234.段229的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F和22F的糖缀合物。
235.段229的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F和33F的糖缀合物。
236.段229的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F、22F和33F的糖缀合物。
237.段229的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和22F的糖缀合物。
238.段229的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和33F的糖缀合物。
239.段229的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F和33F的糖缀合物。
240.段229-239中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
241.段229-240中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
242.段229-241中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型6A和19A的糖缀合物是缀合至CRM197的。
243.段229-242中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物是缀合至CRM197的。
244.段229-243中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
245.段229-244中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
246.段229-246中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖结合物都是单独缀合至CRM197的。
247.段229-239中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的糖缀合物是单独缀合至PD的。
248.段229-239或247中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT的。
249.段229-239或247-248中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT的。
250.段229-239或247-249中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物是单独缀合至PD的，所述来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT的，且所述来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT的。
251.段247-250中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物缀合至CRM197。
252.段247-251中任一项的免疫原性组合物，其中所述来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物是缀合至CRM197的。
253.段226-252中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是7、8、9、10、11、12、13、14或15价肺炎球菌缀合物的组合物。
254.段226-253中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是10、11、12、13、14或15价肺炎球菌缀合物的组合物。
255.段226-254中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是13、14或15价的肺炎球菌缀合物的组合物。
256.段226-255中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是13价肺炎球菌缀合物的组合物。
257.段226-254中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是11价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述11种缀合物由以下组成：单独缀合至PD的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的糖缀合物，缀合至TT的来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物，缀合至DT的来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物和缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物。
258.段226-254中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是11价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述11种缀合物由以下组成：单独缀合至PD的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的糖缀合物，缀合至TT的来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物，缀合至DT的来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物和缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物。
259.段226-254中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是12价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述12种缀合物由以下组成：单独缀合至PD的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的糖缀合物，缀合至TT的来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物，缀合至DT的来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物，缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物和缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物。
260.段226-256中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是13价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述13种缀合物由单独缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物组成。
261.段226-255中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是14价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述14种缀合物由单独缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和22F的糖缀合物组成。
262.段226-255中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是14价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述14种缀合物由单独缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和33F的糖缀合物组成。
263.段226-255中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物是15价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述15种缀合物由单独缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F和33F的糖缀合物组成。
264.段229-263中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物的糖缀合物全部通过还原胺化缀合至载体蛋白。
265.段229-264中任一项的免疫原性组合物，其中每剂所述第二免疫原性组合物包括1.0μg至10μg每种血清型的多糖。
266.段229-265中任一项的免疫原性组合物，其中每剂所述第二免疫原性组合物包括10μg至150μg载体蛋白。
267.段229-266中任一项的免疫原性组合物，其中每剂所述第二免疫原性组合物包括约15μg、约16μg、约17μg、约18μg、约19μg、约20μg、约21μg、约22μg、约23μg、约24约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg，约47μg，约48μg，约49μg或约50μg载体蛋白。
268.段229-267中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物还包括至少一种来自其他病原体的抗原。
269.段229-268中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物还包括至少一种佐剂。
270.段229-268中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物还包括至少一种佐剂，其选自由以下组成的组：磷酸铝，硫酸铝和氢氧化铝。
271.段229-268中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物还包括磷酸铝作为佐剂。
272.段229-268中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物还包括0.2mg/mL至0.3mg/mL的磷酸铝形式的元素铝作为佐剂。
273.段229-268中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物还包括约0.25mg/mL的磷酸铝形式的元素铝作为佐剂。
274.段229-273中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物还包括缓冲液。
275.段229-274中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括具有约3.5至约7.5的pKa的缓冲液。
276.段274-275中任一个的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物的所述缓冲液是磷酸盐、琥珀酸盐，组氨酸或柠檬酸盐。
277.段274-276中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物的所述缓冲液是终浓度为约5.0mM的琥珀酸盐。。
278.段229-277中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物还包括盐。
279.段229-278中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物的所述盐选自由以下组成的组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。
280.段229-179中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物包括终浓度为150mM的氯化钠。
281.段229-280中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物还包括表面活性剂。
282.段281的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物的所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。
283.段281-282中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物中聚山梨醇酯80的最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％(w/w)。
284.段229-283中任一项的免疫原性组合物，其中所述第二免疫原性组合物具有5.8至6.0的pH。
285.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案是单剂方案。
286.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案是多剂方案。
287.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的2剂组成。
288.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种，其中所述疫苗接种方案由约1至约6个月的间隔分开的一系列的2剂组成。
289.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案由约1个月至约2个月的间隔分开的一系列的2剂组成。
290.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的3剂组成。
291.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案由约1至约6个月的间隔分开的一系列的3剂组成。
292.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案由约1个月至约2个月的间隔分开的一系列的3剂组成。
293.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月至约4个月的一系列的3剂和随后在第一剂之后约10个月至约13个月的第四剂组成。
294.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案由约1个月至约2个月的间隔分开的一系列的3剂和随后在第一剂量之后约10个月至约13个月的第四剂组成。
295.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案由从2个月大开始的约1个月至约2个月的间隔分开的一系列的2或3剂和随后12-18个月大的幼儿剂组成。
296.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于接种疫苗的用途，其中所述疫苗接种方案由从2个月大开始的约2个月的间隔分开的一系列的2剂和随后12-18个月大的幼儿剂组成。
297.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案由在2、4、6和12-15个月大时施用的4剂疫苗组成。
298.段1-165中任一项的免疫原性组合物用于疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种方案由在第0天提供的首剂和在约2至约24周的间隔范围提供一或多次加强剂组成。
299.段166-225中任一项的试剂盒用于同时、并行、伴随或依次施用第一和第二免疫原性组合物。
300.段226-284中任一项的免疫原性组合物或段299的试剂盒用于同时施用第一和第二免疫原性组合物的方法中的用途。
301.段300的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述同时施用的疫苗接种方案是单剂。
302.段300的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述同时施用的疫苗接种方案是多剂方案。
303.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的2剂组成。
304.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的2剂组成。
305.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的3剂组成。
306.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的3剂组成。
307.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的3剂和随后第一剂之后约10个月至约13个月的第四剂组成。
308.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由约1、2、3或4个月的间隔分开的一系列的3剂和随后第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂组成。
309.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由一岁的至少一剂(例如1、2或3剂)和随后的至少一幼儿剂组成。
310.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由从2个月大开始的约1个月至约2个月的间隔(剂之间间隔例如28-56天)分开的一系列的2或3剂和随后12-18个月大的幼儿剂组成。
311.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由在2、4、6和12-15个月龄时施用的4剂系列的疫苗组成。
312.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由在第0天提供的首剂和在约2至约24周的间隔范围(优选4-8周的给药间隔)提供的一或多次加强剂组成。
313.段302的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由在第0天提供的首剂和在约3个月后提供的加强剂组成。
314.段226-284中任一项的免疫原性组合物或段299的试剂盒用于伴随施用第一和第二免疫原性组合物的方法中的用途。
315.段314的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述伴随施用的疫苗接种方案是单剂。
316.段314的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述伴随施用的疫苗接种方案是多剂方案。
317.段226-284中任一项的免疫原性组合物或段299的试剂盒用于并行施用第一和第二免疫原性组合物的方法中的用途。
318.段317的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述并行施用的疫苗接种方案是单剂。
319.段317的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述并行施用的疫苗接种方案是多剂方案。
320.段316或319的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的2剂组成。
321.段316或319的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的2剂组成。
322.段315或318的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的3剂组成。
323.段316或319的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的3剂组成。
324.段316或319的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约4个月的一系列的3剂和随后在第一剂之后约10个月至约13个月的第四剂组成。
325.段316或319的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的3剂和随后在第一剂之后的约10个月至约13个月的第四剂组成。
326.段316或319所述的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由一岁内的至少一个剂(例如1、2或3剂)和随后的至少一个幼儿剂组成。
327.段316或319的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由从2个月大开始的约1个月至约2个月的间隔(剂量之间例如28-56天)分开的一系列的2或3剂和随后12-18个月大的幼儿剂组成。
328.段316或319的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由在2、4、6和12-15个月龄时施用的4剂系列的疫苗组成。
329.段316或319的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由在第0天提供的首剂和在约2至约24周的间隔范围(优选4-8周的给药间隔)提供的一或多次加强剂组成。
330.段316或319的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由在第0天提供的首剂和在约3个月后提供的加强剂组成。
331.段226-284中任一项的免疫原性组合物或段299的试剂盒用于依次施用第一和第二免疫原性组合物的方法中的用途。
332.段331的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的2、3、4、5、6、7或8剂组成。
333.段331或332的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的2、3或4剂组成。
334.段331-333中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中首先施用第一免疫原性组合物，且然后施用第二免疫原性组合物。
335.段331-333中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中首先施用第二免疫原性组合物，且然后施用第一免疫原性组合物。
336.段331-335中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的2剂组成。
337.段331-335中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的2剂组成。
338.段331-338中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一和第二剂量在一岁内施用。
339.段331-338中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一剂在一岁内施用，且所述第二剂为幼儿剂。
340.段339的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述幼儿剂在12-18个月大时施用。
341.段332或333的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的3剂组成。
342.段341的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的3剂组成。
343.段341的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的3剂组成。
344.段341-343中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一和第二剂在一岁内施用，且第三剂是幼儿剂。
345.段341-344中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一和第二剂从2个月大开始且之间间隔约1个月至约2个月(例如剂量之间间隔28-56天)且第三剂是12-18个月大的幼儿剂。
346.段341-345中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物施用于第一剂和第二剂，且第二免疫原性组合物施用于第三剂。
347.段341-345中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一剂和第二剂，且第一免疫原性组合物施用于第三剂。
348.段341-345中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一剂，第二免疫原性组合物施用于第二剂，且第一免疫原性组合物施用于第三剂。
349.段341-345中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一剂，第一免疫原性组合物施用于第二剂，且第二免疫原性组合物施用于第三剂。
350.段341-345中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一剂，且第二免疫原性组合物施用于第二和第三剂。
351.段341-345中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一剂，并且第一免疫原性组合物施用于第二和第三剂。
352.段332或333的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的4剂组成。
353.段352的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一、第二和第三剂之间间隔约1个月至约4个月，随后是第一剂之后约10个月至约13个月的第四剂。
354.段352或353所述的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一、第二和第三剂之间间隔约1个月至约2个月，随后是第一剂之后约10个月至约13个月的第四剂。
355.段352-354中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一、第二和第三剂量在一岁内施用，第四剂为幼儿剂。
356.段352-355中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一、第二和第三剂从2个月大开始且之间间隔约1个月至约2个月(例如各剂之间间隔28-56天)且第四剂是12-18个月大的幼儿剂。
357.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一、第二和第三剂，且第二免疫原性组合物施用于第四剂。
358.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一、第二和第三剂，且第一免疫原性组合物施用于第四剂。
359.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一和第二剂，且第二免疫原性组合物施用于第三和第四剂。
360.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一和第二剂，且第一免疫原性组合物施用于第三和第四剂。
361.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一和第二剂，第二免疫原性组合物施用于第三剂，且第一免疫原性组合物施用于第四剂。
362.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一和第二剂，第一免疫原性组合物施用于第三剂，且第二免疫原性组合物施用于第四剂。
363.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一剂，且第二免疫原性组合物施用于第二、第三和第四剂。
364.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一剂，且第一免疫原性组合物施用于第二、第三和第四剂。
365.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一剂，第二免疫原性组合物施用于第二剂，第一免疫原性组合物施用于第三剂，且第二免疫原性组合物施用于第四剂。
366.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一剂，第一免疫原性组合物施用于第二剂，第二免疫原性组合物施用于第三剂并且第一免疫原性组合物施用于第四剂。
367.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一剂，第二免疫原性组合物施用于第二剂并且第一免疫原性组合物施用于第三和第四剂。
368.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一剂，第一免疫原性组合物施用于第二剂，且第二免疫原性组合物施用于第三和第四剂。
369.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一剂，第二免疫原性组合物施用于第二和第三剂，且第一免疫原性组合物施用于第四剂。
370.段352-356中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一剂，第一免疫原性组合物施用于第二和第三剂，且第二免疫原性组合物施用于第四剂。
371.段331-332中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的5剂组成。
372.段371所述的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月至约3个月的一系列的4剂和随后在第一剂量之后约10个月至约13个月的第五剂组成。
373.段371-372中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一、第二、第三和第四剂在一岁内施用，且第五剂为幼儿剂。
374.段371-372中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物(第一IC)和第二免疫原性组合物(第二IC)根据以下任意方案施用。
375.段331-332中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的6剂组成。
376.段375所述的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的5剂和随后第一剂之后约10个月至约13个月的第六剂组成。
377.段375-376中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一、第二、第三、第四和第五剂在一岁内施用，且第六剂为幼儿剂。
378.段375-377中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物根据段374的任意方案施用，随后施用第六剂。
379.段378中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第六剂。
380.段378中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中根据本发明的第二免疫原性组合物施用于第六剂。
381.段331-332中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的7剂组成。
382.段381的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月的一系列的6剂和随后在第一剂之后约10个月至约13个月的第七剂组成。
383.段381-382中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一、第二、第三、第四、第五和第六剂在一岁内施用，并且第七剂为幼儿剂。
384.段381-383中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物根据段379或380的任意方案施用，随后施用第七剂。
385.段384的免疫原性组合物或试剂盒，其中根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第七剂。
386.段384的免疫原性组合物或试剂盒，其中根据本发明的第二免疫原性组合物施用于第七剂。
387.段331-332中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的8剂组成。
388.段387所述的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月的一系列的7剂和随后在第一剂之后约10个月至约13个月的第八剂组成。
389.段387-388中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七剂在一岁内施用，且第七剂为幼儿剂。
390.段387-389中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物和第二免疫原性组合物根据段385或386的任意方案施用，随后施用第八剂。
391.段390中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中根据本发明的第一免疫原性组合物施用于第八剂。
392.段390中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中根据本发明的第二免疫原性组合物施用于第八剂。
393.段331-333中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由依次施用以下组成：
(a)第一免疫原性组合物，和
(b)所述第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用。
394.段393的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列2次施用组成。
395.段393-395中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的2次施用组成。
396.段393-396中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中首先施用第一免疫原性组合物，且然后施用伴随施用或并行施用。
397.段393-396中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中首先施用伴随施用或并行施用，且然后施用第一免疫原性组合物。
398.段393-398中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一和第二施用在一岁内施用。
399.段393-398中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一施用在一岁内施用，且所述第二施用为幼儿施用。
400.段399的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述幼儿施用在12-18个月大时施用。
401.段393的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的3次施用组成。
402.段401的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的3次施用组成。
403.段401-402中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一和第二施用在一岁内施用，且所述第三施用为幼儿施用。
404.段401-403中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一和第二施用从2个月大开始且之间间隔约1个月至约2个月(例如各剂之间间隔28-56天)且第三施用是12-18个月大的幼儿施用。
405.段401-404中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一和第二施用，并且伴随施用或并行施用施用于第三施用。
406.段401-404中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一和第二施用，并且第一免疫原性组合物施用于第三施用。
407.段401-404中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一施用，伴随施用或并行施用施用于第二施用，并且第一免疫原性组合物施用于第三施用。
408.段401-404中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，第一免疫原性组合物施用于第二施用，并且伴随施用或并行施用施用于第三施用。
409.段401-404中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一施用，且伴随施用或并行施用施用于第二和第三施用。
410.段401-404中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，并且第一免疫原性组合物施用于第二和第三施用。
411.段393的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的4次施用组成。
412.段411的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二和第三施用之间间隔约1个月至约4个月，随后是在第一施用后约10个月至约13个月的第四施用。
413.段411的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二和第三施用之间间隔约1个月至约2个月，随后是在第一施用后约10个月至约13个月的第四施用。
414.段411-413中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二和第三施用在一岁内施用，且第四次施用为幼儿施用。
415.段411-414中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二和第三施用从2个月大开始且之间间隔约1个月至约2个月(例如剂量之间的28-56天)且第四施用是12-18个月大的幼儿剂量。
416.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一、第二和第三施用，且伴随施用或并行施用施用于第四施用。
417.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一、第二和第三施用，且第一次免疫原性组合物施用于第四施用。
418.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一和第二施用，且伴随施用或并行施用施用于第三和第四施用。
419.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一和第二施用，且第一免疫原性组合物施用于第三和第四施用。
420.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一和第二施用，伴随施用或并行施用施用于第三施用，且第一免疫原性组合物施用于第四施用。
421.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一和第二施用，第一次免疫原性组合物施用于第三施用，且伴随施用或并行施用施用于第四施用。
422.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一施用，并且伴随施用或并行施用施用于第二、第三和第四施用。
423.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，且第一免疫原性组合物施用于第二、第三和第四施用。
424.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一施用，伴随施用或并行施用施用于第二施用，第一免疫原性组合物施用于第三施用，且伴随施用或并行施用施用于第四施用。
425.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，第一免疫原性组合物施用于第二施用，伴随施用或并行施用施用于第三施用，且第一免疫原性组合物施用于第四施用。
426.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一施用，伴随施用或并行施用施用于第二施用，且第一免疫原性组合物施用于第三和第四施用。
427.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，第一免疫原性组合物施用于第二施用，且伴随施用或并行施用施用于第三和第四施用。
428.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一施用，伴随施用或并行施用施用于第二和第三施用，且第一免疫原性组合物施用于第四施用。
429.段411-415中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，第一免疫原性组合物施用于第二和第三施用，且伴随施用或并行施用施用于第四施用。
430.段393的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的5次施用组成。
431.段430的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案由间隔约1个月至约3个月的一系列的4次施用和随后在第一施用之后约10个月至约13个月的第五施用组成。
432.段430-431中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二、第三和第四施用在一岁内施用，且第五次施用是幼儿剂。
433.段430-432中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物(第一IC)和所述第一免疫原性组合物与所述第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用(第一IC/第二IC)根据以下任一方案施用：
434.段393的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的6次施用组成。
435.段434的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的5次施用和随后在第一施用之后的约10个月至约13个月的第六施用组成。
436.段434-435中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二、第三、第四和第五施用在一岁内施用，且第六施用为幼儿施用。
437.段434-436中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物和第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用根据段433的任意方案施用，然后施用第六施用。
438.段437中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第六施用。
439.段437中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用施用于第六施用。
440.段393的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的7次施用组成。
441.段440的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案由间隔约1个月的一系列的6次施用和随后第一施用之后约10个月至约13个月的第七施用组成。
442.段440-441中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二、第三、第四、第五和第六施用在一岁内施用，且第七施用为幼儿施用。
443.段440-442中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物和第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用根据段438或439的任意方案施用，随后施用第七施用。
444.段443的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第七施用。
445.第443段的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随或并行施用第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物施用于第七施用。
446.段393的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的8次施用组成。
447.段446的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述免疫接种方案由间隔约1个月的一系列的7次施用和随后第一施用之后约10个月至约13个月的第八施用组成。
448.段446-447中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七施用在一岁内施用，且第七施用为幼儿施用。
449.段446-448中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物和第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用根据段444或445的任意方案施用，随后施用第八施用。
450.段449的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第八施用。
451.段449的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用施用于第八施用。
452.段331-333中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由依次施用以下组成：
(a)第二免疫原性组合物，和
(b)第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用。
453.段452的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案是根据段394-451的任一方案，其中在所述方案中以(a)施用所述第二免疫原性组合物替代(a)施用第一免疫原性组合物。
454.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用作药物的用途。
455.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用作疫苗的用途。
456.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用于预防、治疗或改善对象中的细菌感染、疾病或病症的方法中的用途。
457.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用于预防对象中的细菌感染、疾病或病症的方法中的用途。
458.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用于通过全身或粘膜途径施用所述免疫原性组合物以防止或治疗易感肺炎球菌感染的人的方法。
459.段458的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述免疫原性组合物通过肌肉内、腹膜内、皮内或皮下途径施用。
460.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用作疫苗的用途，其中待接种的对象是小于1岁的人类。
461.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用作疫苗的用途，其中待接种的对象是小于2岁的人类。
462.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用作疫苗的用途，其中待接种疫苗的对象是50岁或更年长的人类。
463.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用作疫苗的用途，其中待接种的对象是免疫受损的人类。
464.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用于单剂方案的用途。
465.段1-165中任一项的免疫原性组合物或者段166-225中任一项的试剂盒用于多剂方案的用途。
466.段465的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的2剂组成。
467.段465的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的3剂组成。
468.段465的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由间隔约1个月至约2个月的一系列的3剂和随后在第一剂量后约10个月至约13个月的第四剂组成。
469.段465的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由一岁内的至少一剂和至少一个幼儿剂组成。
470.段465的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由从2个月大开始的间隔约1个月至约2个月的一系列的2或3剂和随后在12-18个月大的幼儿剂组成。
471.段465的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述多剂方案由在2、4、6和12-15个月龄时施用的4剂系列的疫苗组成。
472.段331-333中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由依次施用以下组成：
(a)第二免疫原性组合物，和
(b)第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用。
473.段472的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的2次施用组成。
474.段472-473中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的2次施用组成。
475.段472-474中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中首先施用第二免疫原性组合物，且然后伴随施用或并行施用。
476.段472-474中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中首先施用伴随施用或并行施用，且然后施用第二免疫原性组合物。
477.段472-476中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一和第二施用在一岁内施用。
478.段472-476中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一施用在一岁内施用，且第二施用为幼儿施用。
479.段478的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述幼儿施用在12-18个月大施用。
480.段472的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的3次施用组成。
481.段480的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案由间隔约1个月至约12个月的一系列的3次施用组成。
482.段480-481中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一和第二施用在一岁内施用，且所述第三施用是幼儿施用。
483.段480-482中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一和第二施用从2个月大开始由间隔约1个月至约2个月(例如施用之间的28-56天)，且第三施用是12-18个月大的幼儿施用。
484.段480-483中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一和第二施用，并且伴随施用或并行施用施用于第三施用。
485.段480-483中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一和第二施用，且第二次免疫原性组合物施用于第三施用。
486.段480-483中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一施用，伴随施用或并行施用施用于第二施用，且第二免疫原性组合物施用于第三施用。
487.第480-483段中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，第二免疫原性组合物施用于第二施用，且伴随施用或并行施用施用于第三施用。
488.段480-483中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物施用于第一施用，并且伴随施用或并行施用施用于第二和第三施用。
489.段480-483中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，且第二免疫原性组合物施用于第二和第三施用。
490.段472的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的4次施用组成。
491.段490的免疫原性组合物或试剂盒，所述第一、第二和第三施用之间间隔约1个月至约4个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用。
492.段490的免疫原性组合物或试剂盒，所述第一、第二和第三施用之间间隔约1个月至约2个月，随后是第一施用之后约10个月至约13个月的第四施用。
493.段490-492中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一、第二和第三施用在一岁内施用，并且所述第四施用为幼儿施用。
494.段490-493中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一、第二和第三施用从2个月大开始且间隔约1个月至约2个月(例如施用之间的28-56天)且第四施用是12-18个月大的幼儿施用。
495.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一、第二和第三施用，并且伴随施用或并行施用施用于第四施用。
496.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一、第二和第三施用，且第二免疫原性组合物施用于第四施用。
497.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一和第二施用，且伴随施用或并行施用施用于第三和第四施用。
498.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一和第二施用，且第二免疫原性组合物施用于第三和第四施用。
499.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一和第二施用，伴随施用或并行施用施用于第三施用，且第二免疫原性组合物施用于第四施用。
500.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一和第二施用，第二免疫原性组合物施用于第三施用，且伴随施用或并行施用施用于第四施用。
501.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一施用，并且伴随施用或并行施用施用于第二，第三和第四施用。
502.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述伴随施用或并行施用在所述第一施用，且所述第二免疫原性组合物施用于第二、第三和第四施用。
503.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一施用，伴随施用或并行施用施用于第二施用，第二免疫原性组合物施用于第三施用，且伴随施用或者并行施用施用于第四施用。
504.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，第二免疫原性组合物施用于第二施用，伴随施用或并行施用施用于第三施用，且第二免疫原性组合物施用于第四施用。
505.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物施用于第一施用，伴随施用或并行施用施用于第二施用，且第二免疫原性组合物施用于第三和第四施用。
506.段490-494任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，第二免疫原性组合物施用于第二施用，且伴随施用或并行施用施用于第三和第四施用。
507.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第一施用，伴随施用或并行施用施用于第二和第三施用，且第二免疫原性组合物施用于第四施用。
508.段490-494中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中伴随施用或并行施用施用于第一施用，第二免疫原性组合物施用于第二和第三施用，且伴随施用或并行施用施用于第四施用。
509.段472的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的5次施用组成。
510.段509的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案由间隔约1个月至约3个月的一系列的4次施用和随后第一剂之后约10个月至约13个月的第五施用组成。
511.段509-510中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二、第三和第四施用在一岁内施用，且第五施用是幼儿剂。
512.段509-511中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物(第二IC)和第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物(第一IC/第二IC)的伴随施用或并行施用根据以下任意方案施用：
513.段472的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的6次施用组成。
514.段513的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案由各次施用之间间隔约1个月至约2个月的一系列的5次施用和随后是第一剂之后约10个月至约13个月的第六施用组成。
515.段513-514中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二、第三、第四和第五施用在一岁内施用，且第六施用为幼儿施用。
516.段513-515中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物和第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用根据段512的任意方案施用，随后是第六施用。
517.段516中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物施用于第六施用。
518.段516中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用施用于第六施用。
519.段472的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的7次施用组成。
520.段519的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由之间间隔约1个月的一系列的6次施用和随后第一剂之后约10个月至约13个月的第七施用组成。
521.段519-520中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二、第三、第四、第五和第六施用在一岁内施用，并且第七施用为幼儿施用。
522.段519-521中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物和第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用根据段517或518的任意方案施用，随后是第七施用。
523.段522的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物作为第七施用施用。
524.段522的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用作为第七施用施用。
525.段472的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由一系列的8次施用组成。
526.段525的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述疫苗接种方案由各次施用之间间隔约1个月的一系列的7次施用和随后第一剂量之后约10个月至约13个月的第八施用组成。
527.段525-526中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七施用在一岁内施用，且第七施用为幼儿施用。
528.段525-527中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物和第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用根据段523或524的任意方案施用，随后是第八施用。
529.段528的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物作为第八施用施用。
530.段528的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物与第二免疫原性组合物的伴随施用或并行施用施用于第八施用。
531.段352的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一和第二剂在一岁内施用，且第三和第四剂为幼儿剂。
532.段352的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案由各剂之间间隔约1个月至2个月的一系列的2剂和随后在第一剂量之后约10个月至约13个月的第三剂和第三剂后约1个月至约2个月的第四剂组成。
533.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物施用于第一、第二和第三剂，且第二免疫原性组合物施用于第四剂。
534.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物作为第一、第二和第三剂施用，且第一免疫原性组合物作为第四剂施用。
535.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物作为第一和第二剂施用，且第二免疫原性组合物作为第三和第四剂施用。
536.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物作为第一和第二剂施用，且第一免疫原性组合物作为第三和第四剂施用。
537.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物作为第一和第二剂施用，第二免疫原性组合物作为第三剂施用，且第一免疫原性组合物作为第四剂施用。
538.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物作为第一和第二剂施用，第一免疫原性组合物作为第三剂施用，且第二免疫原性组合物作为第四剂施用。
539.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物作为第一剂施用，且第二免疫原性组合物作为第二、第三和第四剂施用。
540.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物作为第一剂施用，且第一免疫原性组合物作为第二、第三和第四剂施用。
541.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物作为第一剂施用，第二免疫原性组合物作为第二剂施用，第一免疫原性组合物作为第三剂施用，且第二免疫原性组合物作为第四剂施用。
542.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物作为第一剂施用，第一免疫原性组合物作为第二剂施用，第二免疫原性组合物作为第三剂施用，并且第一免疫原性组合物作为第四剂施用。
543.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物作为第一剂施用，第二免疫原性组合物作为第二剂施用，且第一免疫原性组合物作为第三和第四剂施用。
544.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物作为第一剂施用，第一免疫原性组合物作为第二剂施用，且第二免疫原性组合物作为第三和第四剂施用。
545.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第一免疫原性组合物作为第一剂施用，第二免疫原性组合物作为第二和第三剂施用，且第一免疫原性组合物作为第四剂施用。
546.段531-532中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中第二免疫原性组合物作为第一剂施用，第一免疫原性组合物作为第二和第三剂施用，且第二免疫原性组合物作为第四剂施用。
547.段371的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一、第二和第三剂在一岁内施用，且第四和第五剂为幼儿剂。
548.段371的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述方案由各剂之间间隔约1个月至2个月的一系列的3剂和随后在第一剂之后约10个月至约13个月的第四剂和第四剂后约1个月至约2个月的第五剂量组成。
549.段547-548中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物(第一IC)和第二免疫原性组合物(第二IC)根据以下任意方案施用：
550.段547-548中任一项的免疫原性组合物或试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物(第一IC)和第二免疫原性组合物(第二IC)根据以下任意方案施用：
如本文所用，术语“约”是指在数值的统计学有意义范围内，如所提到的浓度范围、时间范围、分子量、温度或pH。此种范围是在一定数量级之内，通常是给定数值或范围的20％之内、更通常是在10％之内、以及更通常是在5％之内或1％之内。有时，此种范围可在实验误差之内，所述实验误差在用于测量和/或确定给定数值和范围的标准方法中是常见的。术语“大约”所涵盖的允许差异将取决于研究的特定体系，并且是本领域技术人员能够轻易确定的。在本申请中无论何时提到范围，所述范围内的每个整数也都被视为是本公开的实施方案。
发明人意图本文的术语“包含”、“包括”以及“含有”任选在每个实例中分别可替换为术语“基本上由……组成”、“由……组成”。
本文中可互换使用的“免疫原性量”、“免疫有效量”、“治疗有效量”、“预防有效量”或“剂量”通常是指足以引起免疫应答，无论细胞(T细胞)还是体液(B细胞或抗体)应答或二者的抗原或免疫原性组合物的量，如通过本领域技术人员已知的标准测定法测量的。
本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请通过援引并入本文。
本发明通过所附的实施例来进行说明。除非是另有细节描述，下文的实施例是使用标准技术来进行的，其对于本领域技术人员而言是熟知的以及常规的。实施例是用于说明，而非对本发明进行限制。
实施例
实施例1:制备eTEC连接的糖缀合物的一般方法
糖的活化以及用胱氨二盐酸盐硫醇化
在无水二甲基亚砜(DMSO)中重构糖。该溶液的水分含量通过Karl Fischer(KF)分析来确定并对其进行调节以达到0.1％至0.4％(通常0.2％)的水分含量。
为了起始活化，在DMSO中以100mg/mL的浓度新鲜制备了1,1’-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)或1,1’-羰二咪唑(CDI)的溶液。用各种量的CDT/CDI(1-10摩尔当量)来活化糖，并使该反应在23±2℃进行1小时。活化水平可通过HPLC确定。胱氨二盐酸盐是在无水DMSO中以50mg/mL的浓度新鲜制备的。所述活化的糖与1摩尔当量(mol.eq.)的胱氨二盐酸盐反应。或者，所述活化的糖与1摩尔当量的盐酸半胱胺反应。使硫醇化反应在23±2℃进行21±2小时，以产生硫醇化的糖。硫醇化水平通过CDT/CDI的添加量来确定。
通过添加100mM的四硼酸钠(pH 9.0)溶液来使活化反应溶液中残余的CDT/CDI猝灭。进行计算以确定所添加的四硼酸盐的量并将最终的水分含量调节为至总水分的1-2％。
活化的硫醇化糖的还原和纯化
通过添加预冷却的0.9％盐水中的5mM的琥珀酸钠(pH 6.0)来将硫醇化的糖反应混合物稀释10倍，并经5μm的过滤器过滤。用40倍渗析体积(diavolume)的WFI来进行硫醇化糖的渗滤。在用10％体积的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 6.0)稀释之后，向滞留物添加1-5摩尔当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液。使此还原反应在5±3℃进行20±2小时。活化的硫醇化糖的纯化优选是通过用预冷却的10mM磷酸二氢钠(pH 4.3)超滤/渗滤来进行。或者，硫醇化的糖是通过标准大小排阻层析(SEC)程序或者或离子交换层析方法来纯化的。取活化的硫醇化糖滞留物试样来确定糖浓度和进行硫醇含量(Ellman)测定。
活化的硫醇化糖的备选还原和纯化
作为上述纯化过程的备选，活化的硫醇化糖也可如下进行纯化。
将5-10摩尔当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液添加至硫醇化的糖反应混合物，并在23±2℃进行3±1小时。然后通过添加预冷却的0.9％盐水中的5mM的琥珀酸钠(pH 6.0)将所述反应混合物稀释，并经5μm的过滤器过滤。用40倍透析体积10mM磷酸二氢钠(pH 4.3)来进行硫醇化糖的渗滤。取活化的硫醇化糖滞留物的试样来确定糖浓度和进行硫醇含量(Ellman)测定。
溴乙酰化的载体蛋白的活化和纯化
通过与溴乙酰剂如溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)、溴化溴乙酰、或其它适合的试剂反应将载体蛋白的自由氨基基团溴乙酰化。
在活化前，首先将载体蛋白(在0.1M磷酸钠中，pH 8.0±0.2)保存在8±3℃,约pH7。将溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)作为二甲基亚砜(DMSO)原液(20mg/mL)以0.25–0.5BAANS:蛋白质(w/w)的比率添加至蛋白质溶液中。在5±3℃将反应轻柔混合30–60分钟。纯化所得的溴乙酰化的(活化的)蛋白，例如，通过使用10kDa的MWCO膜使用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)进行超滤/渗滤来纯化。纯化之后，通过Lowry蛋白测定评估溴乙酰化的载体蛋白的蛋白质浓度。
通过离子交换液相层析联合抑制电导检测(离子层析)由总溴测定法确定活化的程度。在测定样品制剂中将所述活化的溴乙酰化蛋白上结合的溴从蛋白质上切下，并与可存在的任何游离溴一起进行定量。通过在碱性2-巯基乙醇中加热样品而将蛋白质上任何残留的共价结合的溴通过转化为离子溴从而将其释放。
溴乙酰化的CRM197的活化和纯化
用10mM磷酸盐缓冲的0.9％NaCl pH 7(PBS)将CRM197稀释至5mg/mL，并继而用1M原液制备0.1M NaHCO3,pH 7.0。使用20mg/mL DMSO的BAANS原液以1:0.35(w:w)的CRM197:BAANS比例添加了BAANS。将反应混合物在3℃至11℃温育30分钟至1小时，继而使用10KMWCO膜和10mM磷酸钠/0.9％NaCl,pH 7.0通过超滤/渗滤进行纯化。通过Lowry测定法将纯化的活化CRM197进行测定来确定蛋白质浓度，并继而用PBS稀释至5mg/mL。将蔗糖加至5％质量/体积作为低温防护剂并将所述活化的蛋白质冷冻且储存在-25℃直至用于缀合。
CRM197的赖氨酸残基的溴乙酰化是非常一致的，导致39个可用赖氨酸中15-25个赖氨酸的活化。该反应产生了高产率的活化蛋白质。
活化的硫醇化糖缀合至溴乙酰化的载体蛋白
在开始缀合反应之前，将反应容器预先冷却至5℃。随后添加了溴乙酰化的载体蛋白和活化的硫醇化糖，并以150-200rpm的搅拌速度混合。糖/蛋白质的添加比例为0.9±0.1。用1M NaOH溶液将反应pH调节为8.0±0.1。使缀合反应在5℃进行20±2小时。
残基反应官能团的封闭
通过与2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸(作为封闭试剂)在5℃反应3小时使载体蛋白上未反应的溴乙酰化的残基猝灭。通过与4摩尔当量的碘乙酰胺(IAA)在5℃反应20小时将残余的游离巯基封闭。
eTEC连接的糖缀合物的纯化
将缀合反应(IAA封闭之后的)混合物经0.45μm过滤器过滤。针对5mM的琥珀酸盐-0.9％盐水,pH 6.0来进行糖缀合物的超滤/渗滤。继而将糖缀合物滞留物经0.2μm过滤器过滤。取糖缀合物的试样用于测定。剩余的糖缀合物储存在5℃。
实施例2:Pn-33F eTEC缀合物的制备
活化方法
Pn33F多糖的活化
将Pn-33F多糖与500mM的1,2,4-三唑(WFI中)混合以获得10克三唑每克多糖。在无水冰-乙醇浴中将混合物外壳冷冻(shell-frozen)，并继而冻干至干燥。将冻干的33F多糖在无水二甲基亚砜(DMSO)中重构。通过Karl Fischer(KF)分析确定了该冻干的33F/DMSO溶液的水分含量。通过将WFI添加至33F/DMSO溶液调节该水分含量达到0.2％的水分含量。
为了起始活化，在DMSO溶液中将1,1’-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)新鲜制备为100mg/mL。在硫醇化步骤之前用各种量的CDT活化Pn33F多糖。CDT活化在23±2℃进行1小时。通过HPLC(A220/A205)来确定活化水平。加入四硼酸钠溶液(100mM,pH 9.0)以将活化反应溶液中的任何残余CDT猝灭。进行计算以确定所添加的四硼酸盐的量，并使最终的水分含量为总水分的1.2％。使反应在23±2℃进行1小时。
活化的Pn-33F多糖的硫醇化
在无水DMSO中新鲜制备了胱胺-二盐酸盐，并将1摩尔当量的胱氨二盐酸盐添加至所述活化的多糖反应溶液。使反应在23±2℃进行21±3小时。通过添加至预冷却的5mM琥珀酸钠(0.9％盐水中,pH 6.0)中将硫醇化的糖溶液稀释十倍。经稀释的反应溶液通过5μm过滤器进行过滤。用100K MWCO超滤膜盒使用注射用水(WFI)进行硫醇化Pn-33F多糖的渗滤。
活化的硫醇化Pn-33F多糖的还原和纯化
在用10％体积的0.1M磷酸钠缓冲液,pH 6.0稀释后，向滞留物添加了三(2-羧乙基)膦(TCEP)的溶液(5摩尔当量)。使此还原反应在23±2℃进行2±1小时。用100K MWCO超滤膜盒进行硫醇化33F多糖的渗滤。针对预冷却的10mM磷酸钠,pH 4.3进行渗滤。取硫醇化的33F多糖滞留物用于糖浓度和硫醇(Ellman)测定。
活化的硫醇化Pn-33F多糖的替代还原和纯化
作为上述所述纯化过程的替代，33F活化的硫醇化糖也如下进行纯化。
向硫醇化的糖反应混合物加入了三(2-羧乙基)膦(TCEP)的溶液(5摩尔当量)，并使其在23±2℃进行3±1小时。继而通过加入预冷却的5mM琥珀酸钠(0.9％盐水中，pH 6.0)将反应混合物稀释了五倍，并通过5μm过滤器过滤。使用40倍透析体积的预冷却的10mM磷酸二氢钠(pH 4.3)与100K MWCO超滤膜盒来进行硫醇化的糖的渗滤。取硫醇化33F多糖滞留物用于糖浓度和硫醇(Ellman)测定。活化过程的流程图在图8(A)中给出。
缀合过程
硫醇化的Pn33F多糖缀合至溴乙酰化的CRM197
通过溴乙酰化分别将CRM197载体蛋白活化，如实施例1中所述，并继而与所述活化的Pn-33F多糖反应以进行缀合反应。在开始缀合反应之前，将反应容器预冷却至5℃。在反应器中将溴乙酰化的CRM197和硫醇化的33F多糖混合(150-200rpm的搅拌速度)。糖/蛋白的添加比例为0.9±0.1。将反应pH调节为8.0-9.0。使缀合反应在5℃进行20±2小时。
溴乙酰化的CRM197和硫醇化的Pn33F多糖上反应基团的封闭
CRM197蛋白上未反应的溴乙酰化残基通过与2摩尔当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸在5℃反应3小时进行封闭，随后是通过与4摩尔当量的碘乙酰胺(IAA)在5℃反应20小时将硫醇化的33F-多糖的任何残余游离巯基封闭。
eTEC-连接的Pn-33F糖缀合物的纯化
经0.45μm或5μm过滤器来过滤缀合溶液。用300K MWCO超滤膜盒进行33F糖缀合物的渗滤。针对5mM琥珀酸盐-0.9％盐水,pH 6.0进行渗滤。继而经0.22μm过滤器将Pn-33F糖缀合物300K滞留物过滤，并储存在5℃。缀合过程的流程图在图8(B)中给出。
结果
若干批次Pn-33F eTEC糖缀合物的反应参数和表征数据在表1中示出。用胱氨二盐酸盐进行CDT活化-硫醇化产生的糖缀合物具有63％至90％糖产率和<1％至13％的游离糖。
表1.Pn33F eTEC缀合物的实验参数和表征数据
N/A＝不可提供
Pn-33F eTEC糖缀合物(至CRM197)的OPA效价
在标准条件下确定了小鼠中Pn-33F的OPA效价(类似于下述对于10A和22F缀合物所描述的OPA过程)。在四周和七周的OPA效价(GMT,95％CI)于表2中示出，证明了血清型33FPn糖缀合物在鼠免疫原性模型中引起了OPA效价。
表2.Pn-33F OPA效价(GMT,95％CI)
33F Pn缀合物 0.001μg 0.01μg 0.1μg
第4周 4(4,5) 37(17,82) 414(234,734)
第7周 8(5,13) 131(54,314) 17567(9469,32593)
实施例3:另外的Pn-33F eTEC缀合物的制备
使用实施例2中描述的方法产生了另外的Pn-33F eTEC缀合物。这些另外批次的Pn-33F eTEC糖缀合物的反应参数和表征数据在表3中给出。
表3.另外的Pn33F eTEC缀合物的实验参数和表征数据
LOQ＝定量极限；N/A＝不可提供
如上述以及表3中所述，使用上述的eTEC缀合获得了若干Pn-33F缀合物。eTEC化学使得可制备具有高产率、低％游离糖和高缀合度(缀合的赖氨酸)的缀合物。另外，使用eTEC缀合方法可保持超过80％的乙酰基功能性。
实施例4:Pn-33F eTEC糖缀合物稳定性的评估:％游离糖趋势
将缀合物批次33F-2B的试样(参见表1)分配至聚丙烯管中并分别储存在4℃、25℃、和37℃，以及监测％游离糖的趋势。数据(％的游离糖)显示在表4中。如此表中所示，％游离糖没有显著的变化。
表4.在4℃、25℃和37℃Pn-33F eTEC糖缀合物的％游离糖稳定性
wk＝周；M＝月；N/A＝不可提供
另一缀合物批次(批次33F-3C)的加速稳定性也在37℃进行了达1个月。如表5中所示，％游离糖在37℃下长达1个月没有显著的变化。
表5.Pn-33F eTEC糖缀合物在37℃的％游离糖稳定性
为了进一步确定eTEC缀合物的稳定性，将储存在4℃的另外缀合物批次(33F-3C和33F-5E(参见表1))监测了长达约一年时间，以监测％游离糖的潜在趋势。如表6中所示，对于储存在4℃的缀合物长达约一年的延长时间里，％游离糖的水平没有显著的变化。
表6.Pn-33F eTEC糖缀合物在4℃的％游离糖稳定性结果
M＝月；N/A＝不可提供
在各个温度监测的游离糖趋势(实时的以及加速的)证明了由33F eTEC化学产生的血清型33F缀合物稳定且没有可注意到的降解。
实施例5:Pn-8缀合至CRM197的制备
Pn-8RAC/DMSO糖缀合物的制备
将冷冻的多糖解冻并转移至反应容器。将2M乙酸和WFI(注射用水)添加至多糖溶液，以达到约2.5g/L的最终多糖浓度以及0.2M的最终乙酸浓度。
多糖的水解
天然多糖在活化之前是经化学水解的。将经稀释的多糖溶液加热至70℃，并继而保持在此温度3.5小时。
多糖的氧化
通过添加高碘酸钠溶液起始了多糖的氧化并将反应保持在23℃进行20小时。
活化的多糖的纯化
使用超滤盒将所述活化的多糖浓缩。针对20倍透析体积的WFI进行了渗滤。
冻干
将所述活化的多糖与蔗糖混合成每克活化多糖25克蔗糖的比例。将含有所述活化的糖和蔗糖的瓶子在乙醇浴中外壳冷冻并冻干。
活化的多糖缀合至CRM197并封闭
在DMSO中将冻干的活化多糖重构至2mg/mL。将DMSO添加至冻干的CRM197进行重构。将重构的CRM197添加至重构的活化多糖。继而通过将氰基硼氢化钠添加至反应混合物来起始缀合，并在23℃温育24小时。通过添加2MEq的硼氢化钠来将缀合反应终止。此封闭反应在23℃进行3小时。
缀合物的纯化
继而将缀合物溶液稀释至冰冷的5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH 6.0)中，过滤，用300K纤维素膜浓缩至2-4g/L，并针对5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH6.0)进行了第一阶段的渗滤。通过用5mM琥珀酸盐-0.9％盐水,pH 6.0缓冲液渗滤来完成最终的纯化步骤。在完成渗滤之后，通过0.22μm过滤器将纯化的缀合物转移至收集罐。
单价批量缀合物的稀释
用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH 6)将缀合物进一步稀释,至0.5mg/mL的目标糖浓度。完成最终的0.22μm过滤步骤以制备用于制剂的单价批量缀合物(MBC)产物。
使用上述所述方法通过改变不同的参数(例如，糖-蛋白质添加比例、反应浓度和氰基硼氢化钠的Meq)获得了若干缀合物。代表性的CRM197Pn-8糖缀合物的表征在表7中给出。
表7.Pn8-CRM197缀合物的表征
在标准条件下在小鼠中确定了血清型8-CRM197缀合物在小鼠中的调理吞噬活性(OPA)效价(类似于以下所描述的用于10A和22F缀合物的OPA过程)。四周不同剂量的OPA效价(几何平均效价(GMT),95％置信区间(CI))在表8和9(两个分别的实验)中示出，证明血清型8缀合物(实施例1-9；也参见表7中这些缀合物的表征数据)在鼠免疫原性模型中引起了OPA效价。
如表8中所示，显示出血清型8缀合物具有显著更高的抗体效价(与具有低抗体效价的未缀合多糖的对照相比)。
表8.血清型8-CRM197缀合物的免疫原性
表9.血清型8-CRM197缀合物的免疫原性
由上述还原胺化过程制备的缀合物所产生的整体数据证明了，其可制备具有良好缀合产率、低％游离糖以及良好稳定性的缀合物。另外，所制备的缀合物在鼠免疫原性模型中引起了良好的OPA效价。
实施例6:血清型10A多糖–CRM197缀合物的制备
分离的肺炎链球菌血清型10A多糖的制备
血清型10A荚膜多糖可使用本领域技术人员已知的分离过程而直接从细菌获得(参见例如美国专利申请公开号2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340、和2008/0102498以及WO 2008/118752中公开的方法)。肺炎链球菌血清型10A在种子瓶中生长，并继而被转移至种子发酵罐。一旦达到目标光密度，将细胞转移至生产发酵罐。通过添加N-月桂酰肌氨酸将发酵液灭活并通过超滤和渗滤来纯化。
分离的肺炎链球菌血清型10A荚膜多糖的氧化
将计算体积的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)和注射用水(WFI)添加至多糖溶液，以实现2.5g/L的最终多糖浓度以及25mM磷酸钾缓冲液的最终浓度(如果所需的pH被调节至约6.0)。继而将稀释的多糖冷却至5℃。通过添加0.25摩尔当量(MEq)的高碘酸钠溶液来起始氧化。氧化反应时间为在5℃约4小时。用1MEq的2,3-丁二醇在5℃连续搅拌1-2小时来使氧化反应猝灭。
在达到目标反应时间之后，使用30K MWCO Millipore超滤盒将所述活化的多糖浓缩。继而针对20倍的透析体积的WFI进行渗滤。将纯化的活化多糖储存在5℃。通过(i)SEC-MALLS的分子量和(ii)氧化度等等来对纯化的活化多糖进行表征。
活化的肺炎链球菌血清型10A多糖与CRM197的缀合
缀合过程由以下步骤组成：
a.与蔗糖赋形剂混合，并冻干；
b.冻干多糖和CRM197的重构；
c.活化的多糖缀合至CRM197并封闭；和
d.缀合物的纯化
a.与蔗糖混合
以每克活化的多糖25g蔗糖的比例将所述活化的多糖与蔗糖混合。继而将该瓶混合的混合物冻干。在冻干之后，将含有冻干的活化多糖的瓶储存在-20℃。
b.冻干的活化多糖和CRM197蛋白的重溶
将冻干的活化多糖在无水二甲基亚砜(DMSO)中重溶。在多糖完全溶解后，将相同量的DMSO添加至计算好的CRM197进行重溶。
c.活化的多糖缀合至CRM197并封闭
在缀合反应器中将重溶的CRM197(DMSO中)添加至重溶的活化多糖。最终的多糖浓度为1g/L。通过添加1.2MEq的氰基硼氢化钠至反应混合物来进行缀合。将反应在23℃温育24小时。通过添加2MEq的硼氢化钠来完成缀合反应的终止。封闭反应在23℃温育3小时。
通过添加2MEq的硼氢化钠来完成缀合反应的终止。此封闭反应在23℃进行3小时。
d.缀合物的纯化
继而将缀合物溶液稀释至5×(体积)冷却的5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH 6.0)，并使用5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH6.0)进行20×的渗滤。在起始的渗滤完成后，将缀合物滞留物转移穿过0.22μm的过滤器。用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH 6)将缀合物进一步稀释，并在最终的0.22μm过滤步骤后将其储存在2-8℃。
使用上述所述方法通过改变不同的参数(例如，糖-蛋白质添加比例、反应浓度和氰基硼氢化钠的Meq)获得了若干缀合物。由上述化学使得产生了血清型10A缀合物，在各个温度监测的游离糖趋势(实时的以及加速的)证明了其稳定且没有可注意的降解。代表性的CRM197Pn-10A糖缀合物的表征在表10中给出。
表10.Pn-10A-CRM197缀合物的表征
在标准条件下确定了血清型10A-CRM197缀合物在小鼠中的调理吞噬活性(OPA)效价。在第0周经皮下途径用0.001μg、0.01μg、或0.1μg的测试缀合物来免疫多组30只6-7周大的雌性Swiss Webster小鼠。在第3周用相同剂量的缀合物对小鼠进行加强免疫，并然后在第4周取血。在第4周血清样品上进行了血清型特异性OPA。
调理吞噬活性(OPA)测定用于测量特异于肺炎链球菌血清型10A的鼠血清中的功能性抗体。将测试血清设定于测定反应中，所述反应测量荚膜多糖特异性的免疫球蛋白调理细菌、触发补体沉积、由此促进吞噬作用以及由巨噬细胞杀伤细菌的能力。所述OPA效价定义为导致细菌计数相对于无测试血清的对照孔降低50％的稀释度的倒数。所述OPA效价是从涵盖此50％杀伤截断值的两个稀释度推算的。
OPA过程是基于Hu等人(2005)Clin Diagn Lab Immunol12(2):287-295中所述的方法，外加以下修改。测试血清经2.5倍系列稀释并被加入到微量滴定测定平板。活的血清型10A目标菌株被添加至孔中并将平板在37℃摇动30分钟。将分化的HL-60细胞(巨噬细胞)和幼兔血清(3-4周大,12.5％终浓度)添加至孔，并将平板在37℃摇动60分钟。为了使反应终止，将80μL的0.9％NaCl添加至所有孔，混合，并将10μL的试样转移至含有200μL水的 HTS HV过滤器平板的孔中。将液体在真空下过滤穿过平板，并将150μL的培养基添加至每个孔并过滤。继而将过滤平板在37℃,5％CO2温育过夜并接着用Destain溶液(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)固定。接着将平板用考马斯亮蓝染色并脱色一次。将菌落显像并在Cellular TechnologyLimited(CTL)(Shaker Heights,OH) Analyzer上计数。将原始菌落计数用作绘制杀伤曲线并计算OPA效价。
四周不同剂量的OPA效价(几何平均效价(GMT)，95％置信区间(CI))在表11中示出，证明了血清型10A缀合物(实施例1-3；也参见表10中这些缀合物的表征数据)在鼠免疫原性模型中引起了OPA效价。如表11中所示，显示出血清型10A缀合物与未缀合多糖的对照相比(具有低OPA应答)具有显著更高的OPA效价。
表11.血清型10A-CRM197缀合物的免疫原性
实施例7:Pn血清型-12F使用TEMPO/NCS的缀合
为了改善血清型12F-CRM197糖缀合物的稳定性，探索了另外的化学，其中使用2,2,6,6-四甲基-1-氧基哌啶自由基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)作为共氧化剂以将伯醇氧化成醛基。GC/MS分析显示氧化的位点不同于高碘酸盐-介导的氧化。在TEMPO-NCS氧化的情形中，α-D-Glcp和2-Glcp被氧化，而当使用高碘酸盐时α-D-Galp是主要的氧化位点(参见图4)。如本文进一步详细描述的，TEMPO以催化量使用(≤0.1摩尔当量)并且通过改变所使用的NCS的量来实现期望的氧化度(DO)。随后合成了若干缀合物并进行了表征。总的来说，血清型12F糖缀合物的产生在若干个阶段进行，如下:
a)血清型12F多糖水解为分子量50kDa至500kDa
b)用TEMPO/NCS活化血清型12F多糖；
c)纯化所述活化的多糖；
d)将活化的血清型12F缀合至CRM197蛋白；和
e)纯化血清型12F-CRM197缀合物。
血清型12F的水解和氧化
多糖的水解通常在酸性条件下加热进行，以获得在期望范围100kDa至350kDa内的平均分子量。典型的实验描述如下。
水解
将血清型12F多糖溶液添加至封套的反应容器。向其中加入所需体积的0.30M乙酸和注射用水(WFI)以保持～0.1M的乙酸浓度。使用1N NaOH或冰乙酸将溶液的pH调节至3.2±0.3。将反应混合物的温度提高至70±5℃。将反应混合物在70±5℃搅拌90-120分钟。将反应混合物冷却至23±2℃并通过加入1M NaOH溶液来进行中和(pH 7.0)。通过针对WFI使用30K MWCO膜的超滤/渗滤来将经水解的多糖纯化。将溶液经0.22μm过滤器过滤并储存在2至8℃直至氧化。通过SEC-MALLS来分析经水解的多糖的分子量，以确保分子量满足100kDa至350kDa的目标范围。
部分氧化
在一个实验中，使用微射流匀浆机(microfluidiser)通过压力匀浆来对血清型12F多糖进行机械调整大小，以将分子量降低至约100kDa至500kDa。将经调整大小的多糖以4.0mg/mL的浓度添加至反应容器，并与碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液(0.5MNaHCO3/0.05M Na2CO3缓冲液,pH 8.6)以1:1v/v的比例混合。向经过搅拌的混合物加入≤0.1摩尔当量的TEMPO。通过加入0.6至1.0摩尔当量的NCS来起始反应。将反应混合物在室温搅拌2小时，之后通过渗滤(其中以WFI使用30K超滤膜)纯化所述活化的多糖。收集纯化的多糖并通过醛(使用3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)测定)和多糖(使用蒽酮测定)的定量测量来确定氧化度(DO)。
在另一实验里，所述血清型12F多糖经水解以将分子量降低至约100kDa至500kDa的分子量。将血清型12F多糖添加至反应容器并与0.5M NaHCO3/0.05M Na2CO3缓冲液(pH8.6)以1:1v/v的比例混合。向经过搅拌的混合物加入0.6-1.0摩尔当量的NCS(溶于WFI)。通过加入约0.1摩尔当量TEMPO(溶于WFI)来起始活化。将反应混合物在室温搅拌2小时，之后通过渗滤(其中以WFI使用30K超滤膜)纯化所述活化的多糖。将纯化的活化多糖经0.2μm过滤器过滤并储存在4℃待用。
在pH 6.5、7.0、7.5和8.0的磷酸钠缓冲液中也成功地进行了TEMPO/NCS介导的氧化。在一些活化实验中，使用伯醇如正丙醇来使试剂猝灭，以避免糖过氧化。在另一组实验中，经化学水解的多糖直接经氧化，而没有超滤/渗滤纯化步骤。
血清型12F经氧化的多糖的缀合
在一个实验中，将所述纯化的经氧化的血清型12F多糖添加至反应容器，随后添加0.5M磷酸钠缓冲液(pH 6.5)至0.1M的最终缓冲液浓度。向此溶液加入此前冻干的CRM197并彻底混合以获得均质化的溶液。用稀释的HCl或1N NaOH溶液将pH调节至6.8。随后加入1.5摩尔当量的NaCNBH3。将反应混合物在室温(23℃)搅拌24小时以及在37℃搅拌2.5天。继而用1X 0.9％盐水稀释反应混合物，并用2摩尔当量的硼氢化钠将未反应的醛基“封闭”。封闭反应时间为3小时。
在另一实验里，经纯化的活化血清型12F添加至反应容器，随后添加0.5M磷酸钠缓冲液(pH 6.5)至0.1M的最终缓冲浓度。向此溶液加入此前冻干的CRM197并彻底混合以获得均质化的溶液。用稀释的HCl或1N NaOH溶液将pH调节至6.8。随后加入3摩尔当量的NaCNBH3。将反应混合物在23℃搅拌24小时以及在37℃搅拌48小时。继而用1X0.9％盐水稀释反应混合物并搅拌，用1摩尔当量的硼氢化钠(NaBH4)将未反应的醛基“封闭”。封闭反应时间为3小时.
在另一实验里，将经纯化的活化血清型12F添加至反应容器并与CRM197溶液混合。将混合物冻干并将粉末溶解在0.1M的磷酸钠缓冲液(pH6.8)中至5mg/mL的最终糖浓度。如果需要，用稀释的HCl或1N NaOH溶液将pH调节至6.8。随后加入3摩尔当量的NaCNBH3。将反应混合物在23℃搅拌24小时以及在37℃搅拌48小时。继而用1X0.9％盐水稀释反应混合物，用1摩尔当量的硼氢化钠(NaBH4)将未反应的醛基“封闭”。封闭反应时间为3小时。
缀合物纯化
用5μm过滤器将封闭的反应混合物过滤，并继而用100K MWCO超滤膜进行纯化。首先用10mM琥珀酸盐/0.9％盐水,pH 6.0缓冲液将缀合物渗滤。继而将纯化的缀合物经0.45/0.22μm过滤器过滤以获得批量缀合物。
氧化程度
使用TEMPO/NCS体系实现了血清型12F多糖中伯醇的成功氧化。通过调节NCS共氧化剂的量，而将经水解的血清型12F多糖氧化至各种氧化度(DO)水平。通过不同NCS的量使用不同的多糖批次和分子量对DO的影响在图9中示出。通常氧化反应在2小时内完成，因为2小时后没有观察到显著的DO变化。
使用TEMPO/NCS氧化的多糖生成并表征了若干血清型12F缀合物。结果总结于表12。
表12.肺炎球菌血清型12F-CRM197缀合物
实施例8:使用TEMPO/NCS氧化方法的Pn-血清型12F-CRM197缀合物的免疫原性
在标准条件下确定了小鼠中血清型12F-CRM197缀合物的调理吞噬活性(OPA)效价。第4周和第7周的OPA效价(几何平均效价(GMT)，95％置信区间(CI))在表13中示出，证明了血清型12F-CRM197缀合物(批次12F-97B；也参见表12中此缀合物的表征数据)在鼠免疫原性模型中引起了OPA效价。由TEMPO-NCS所产生的缀合物比高碘酸盐氧化所产生的对照缀合物(171B)更具有免疫原性。
表13.血清型12F-CRM197缀合物的免疫原性
缀合物样品/剂量 0.001μg 0.01μg 0.1μg
高碘酸盐氧化(171B)对照 4 16 172
TEMPO/NCS氧化(12F-97B) 40 417 880
实施例9:Pn-12F糖缀合物稳定性的评估
由高碘酸盐氧化产生的缀合物对比由TEMPO/NCS氧化产生的缀合物的稳定性比较(在25℃)(参见图10)，证明了由Pn-12F多糖的氧化产生的缀合物相对更稳定。如图10中所示，在由Pn-12F多糖的高碘酸盐氧化(在25℃)所产生的糖缀合物中观察到游离糖随着时间而增加。相反，用Pn-12F多糖的TEMPO/NCS氧化所制备的糖缀合物在类似条件下游离糖没有显示出明显的趋势。
实施例10:血清型15B多糖–CRM197缀合物的制备
分离的肺炎链球菌血清型15B多糖的制备
血清型15B荚膜多糖可使用本领域技术人员已知的分离过程直接从细菌获得。使肺炎链球菌血清型15B在种子瓶中生长，并继而转移至种子发酵罐。一旦达到了目标光密度，将细胞转移至生产发酵罐。通过加入N-月桂酰肌氨酸将发酵液灭活并通过超滤和渗滤来纯化。
使用PANDA匀浆机(GEANiro Soavi,Parma,Italy)通过高压均质化来将纯化的肺炎链球菌血清型15B多糖改变大小，以产生分离的肺炎链球菌血清型15B多糖。
优选地，由上述方法获得的分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖，其每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根，并且具有50kDa至500kDa、优选150kDa至350kDa的分子量。
分离的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的氧化
通过依次加入计算量的500mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)和WFI，以给出2.0g/L的最终多糖浓度，从而在100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)中进行多糖的氧化。如果需要，将反应pH调节至约pH 6.0。在pH调节之后，将反应温度调节至23℃。通过添加约0.25摩尔当量的高碘酸钠来起始氧化。氧化反应在23℃约16小时期间进行。
用10K MWCO超滤盒进行所述活化的多糖浓缩和渗滤。针对20倍的透析体积的WFI进行渗滤。继而将纯化的活化多糖储存在5℃。通过(i)由比色测定确定的糖浓度；(ii)由比色测定确定的醛浓度；(iii)氧化度(iv)由SEC-MALLS确定的分子量，和(v)O-乙酰基和甘油的存在等对纯化的活化多糖进行了表征。
SEC-MALLS被用于确定多糖的以及多糖-蛋白质缀合物的分子量。SEC用于通过流体力学体积来分离多糖。折射率(RI)和多角度激光光散射(MALLS)检测器被用于确定分子量。当光与物质相互作用时，其散射并且散射的光的量与物质的浓度、dn/dc的平方(特定的折射率增长)、以及摩尔质量相关。基于来自MALLS检测器的散射光信号以及来自RI探测器的浓度信号的读数计算分子量的测定。
所述活化的多糖的氧化度(DO＝糖重复单元的摩尔数/醛的摩尔数)如下进行测定：
糖重复单元的摩尔数通过各种比色方法来确定，例如使用蒽酮法。首先通过硫酸和热的作用而使多糖断裂成单糖。蒽酮试剂与六糖反应以形成黄绿色的复合物，其吸光度通过分光光度计在625nm读取。在该测定的范围内，吸光度与所存在的六糖的量直接成比例。
使用MBTH比色法，也同时确定了醛的摩尔数。MBTH测定涉及醛基(来自给定样品)与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH测定试剂)反应而形成的嗪化合物。过量的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氧化形成活性阳离子。活性阳离子与嗪反应形成蓝色发色团。所形成的发色团继而在650nm进行分光光度计读数。
优选地，由上述方法获得的所述活化的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖，其每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根，并且具有50kDa至500kDa、优选150kDa至350kDa的分子量。
活化的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖与CRM197的缀合
缀合过程由以下步骤组成：
a)与蔗糖赋形剂混合并冻干；
b)冻干的活化多糖和CRM197的重构；
c)活化的多糖缀合至CRM197并封闭；和
d)缀合物的纯化
a)与蔗糖赋形剂混合，并冻干
所述活化的多糖以每克活化的多糖25克蔗糖的比例与蔗糖混合。继而将该瓶混合的混合物冻干。冻干之后，将含有冻干的活化多糖的瓶储存在-20℃。将计算量的CRM197蛋白分别外壳冷冻和冻干。冻干的CRM197储存在-20℃。
b)冻干的活化多糖和CRM197蛋白的重构
将冻干的活化多糖在无水二甲基亚砜(DMSO)中重构。在完成多糖的溶解之后，将等量的无水DMSO添加至冻干的CRM197进行重构。
c)缀合和封闭
重构的活化多糖与重构的CRM197在反应容器中组合(添加比例0.8:1)，随后在与氰基硼氢化钠缀合之前彻底混合以获得澄清的溶液。反应溶液中的最终多糖浓度为约1g/L。通过加入1.0-1.5MEq的氰基硼氢化钠至反应混合物来起始缀合，并将其在23℃温育40-48小时。通过加入2MEq的硼氢化钠(NaBH4)以封闭未反应的醛基使得缀合反应终止。此封闭反应在23℃持续3小时。
d)缀合物的纯化
用冷却的5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH 6.0)将缀合物溶液稀释为1:10，以备用于通过使用100-300K MWCO膜的切向流动过滤进行纯化。将稀释的缀合物溶液穿过5μm过滤器，并使用5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH 6.0)作为介质进行了渗滤。在完成渗滤之后，将缀合物滞留物转移穿过0.22μm过滤器。
用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH 6)将缀合物进一步稀释至约0.5mg/mL的目标糖浓度。完成最终的0.22μm过滤步骤以获得糖缀合物。
优选地，由上述方法获得的缀合物其每mM的血清型15B荚膜多糖包含至少0.6mM的乙酸根，并具有3,000kDa至20,000kDa的分子量以及具有2至6的缀合度。
实施例11:包含共价连接至CRM197的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的糖缀合物的 表征
通过实施例10的过程制备缀合物1。用类似的过程但是使用不同量的氧化剂制备了缀合物2和3。缀合物4通过类似的过程制备，除了其中纯化的血清型15B荚膜多糖未经大小调整并被活化为较低的DO(较高的氧化水平)并且缀合在水成介质中进行。缀合物5通过类似的过程制备，除了其中纯化的血清型15B荚膜多糖是通过化学水解进行大小调整并且缀合在水成介质中进行。缀合物6和7通过类似的过程制备，除了其中纯化的血清型15B荚膜多糖未经大小调整。
所获得的缀合物经表征并且结果总结于表14。
表14.肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖-CRM197缀合物
N/A＝不可提供
通过使用氢氧化铝凝胶来结合蛋白质以及共价结合的糖以通过离心去除的过程测量游离多糖的百分比。将样品与磷酸盐缓冲氢氧化铝凝胶混合并离心。结合的糖与凝胶一起沉淀，且游离糖保留在上清中。通过适当的比色测定将所得的上清与对照样品进行定量，以确定游离糖的百分比，并确认充分地去除了蛋白质以及回收了糖。
对于氨基酸分析，首先使用6N盐酸(HCl)在真空和加热下(160℃ 15分钟)水解将多糖-蛋白质样品水解成单个组分如游离的氨基酸。在水解后，使用氨基酸分析仪来分析样品。单个氨基酸通过离子交换层析分离(使用温度和流速改变的柠檬酸钠缓冲液的梯度步骤)。分离之后，使用柱后茚三酮偶联检测系统定量确定每种氨基酸残基的量。在此系统中，在柱后反应器系统内将茚三酮与柱洗脱物混合，并将混合物放入光度计。茚三酮与洗脱的氨基酸的反应产生了在约570nm处吸收的紫色化合物。此吸光度是所存在的α-氨基的量的线性对应(函数)，并且此反应提供了对具有α-氨基的所有有机化合物的定量比色测定。在与亚氨基酸如脯氨酸和羟基脯氨酸(不具有游离的氨基)的反应中，生成亮黄色的化合物并且在440nm处监测。使用570nm和440nm波长的输出来计算每种氨基酸的峰面积。
产率计算如下：(缀合物中多糖的量×100)/活化的多糖的量。
使用水成介质产生的缀合物(4和5)证明了O-乙酰基水平的显著降低。在DMSO溶剂中产生的缀合物(使用天然多糖无MW大小调整(6和7))，并未证明O-乙酰基水平的降低。然而，在低可滤性特征之外，缀合物的产率很差。在DMSO中产生的缀合物(使用经高压均质化大小调整的多糖(1、2和3))，具有高产率以及较好的可滤性特征和对O-乙酰基水平的显著保持。这些缀合物也具有很低水平的游离多糖。
实施例12:使用Pn-血清型15B-CRM197缀合物的调理吞噬活性(OPA)测定
本发明肺炎链球菌血清型15B缀合物的免疫原性可使用以下描述的OPA测定进行评估。
在第0周经皮下途径用0.001μg、0.01μg、或0.1μg的测试缀合物来免疫多组30只6-7周大的雌性Swiss Webster小鼠。在第3周用相同剂量的缀合物对小鼠进行加强免疫，并在第4周取血。在第4周血清样品上进行了血清型特异性OPA。
OPA用于测量特异于肺炎链球菌血清型15B的鼠血清中的功能性抗体。将测试血清设定于测定反应中，所述反应测量荚膜多糖特异性的免疫球蛋白对调理细菌、触发补体沉积、由此促进吞噬作用以及由巨噬细胞杀伤细菌的能力。所述OPA效价定义为导致细菌计数相对于无测试血清的对照孔降低50％的稀释度的倒数。所述OPA效价是从涵盖此50％杀伤截断值的两个稀释度推算的。
OPA过程是基于Hu等人(2005)Clin Diagn Lab Immunol12(2):287-295中所述的方法，外加以下修改。测试血清经2.5倍系列稀释并被加入到微量滴定测定平板。活的血清型15B目标菌株被添加至孔并将平板在37℃摇动30分钟。将分化的HL-60细胞(巨噬细胞)和幼兔血清(3-4周大,6.25％终浓度)添加至孔，并将平板在37℃摇动45分钟。为了使反应终止，将80μL的0.9％NaCl添加至所有孔，混合，并将10μL的试样转移至含有200μL水的 HTS HV过滤器平板的孔中。将液体在真空下过滤穿过平板，并将150μL的培养基添加至每个孔并过滤。继而将过滤平板在37℃,5％CO2温育过夜并接着用Destain溶液(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)固定。接着将平板用考马斯亮蓝染色并脱色一次。将菌落显像并在Cellular Technology Limited(CTL)(Shaker Heights,OH) Analyzer上计数。将原始菌落计数用于绘制杀伤曲线并计算OPA效价。
缀合物1和2的免疫原性已根据上述提到的测定进行了测试。一个另外的缀合物以及未缀合的天然肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖(未缀合的PS)也在相同的测定中进行了测试：
通过在水成溶液中的还原胺化将天然的(即未经大小调整的)血清型15B荚膜多糖缀合至CRM197制备缀合物9。
结果在表15中示出。
表15.使用血清型15B-CRM197缀合物的动物测试的OPA效价
如上表15中所示，当施用于小鼠时，缀合物1和2产生抗体，该抗体能够调理肺炎链球菌血清型15B、触发补体沉积、由此促进吞噬作用以及由巨噬细胞杀伤细菌。另外，虽然其分子量较低，它们还展现出与未经大小调整的缀合物9相比类似水平的免疫原性。
实施例13:血清型22F多糖–CRM197缀合物的制备
分离的肺炎链球菌血清型22F多糖的制备
使肺炎链球菌血清型22F在种子瓶中生长，并继而转移至种子发酵罐。一旦达到了目标光密度，将细胞转移至生产发酵罐。通过加入N-月桂酰肌氨酸将发酵液灭活并通过超滤和渗滤来纯化。
使用PANDA匀浆机(GEA Niro Soavi,Parma,Italy)通过高压均质化来将纯化的肺炎链球菌血清型22F多糖改变大小，以产生分离的肺炎链球菌血清型22F多糖。
分离的肺炎链球菌血清型22F荚膜多糖的氧化
通过顺次加入计算量的500mM磷酸钾缓冲液(pH 5.8)和WFI，以给出2.0g/L的最终多糖浓度，从而在100mM磷酸钾缓冲液(pH 5.8)中进行多糖的氧化。如果需要，将反应pH调节至约pH 5.8。在pH调节之后，将反应温度降低至5℃。通过添加约0.10摩尔当量(MEq)的高碘酸钠来起始氧化。目标氧化反应时间为5℃ 16小时。
用2MEq的2,3-丁二醇在5℃连续搅拌1-2小时来使氧化反应猝灭。
用100K MWCO超滤盒进行所述活化的多糖的浓缩和渗滤。针对35倍透析体积的WFI进行渗滤。继而将纯化的活化多糖储存在5℃。通过(i)由SEC-MALLS确定的分子量；(ii)O-乙酰基的存在；以及(iii)氧化度等对纯化的活化多糖进行了表征。
SEC-MALLS被用于确定多糖的以及多糖-蛋白质缀合物的分子量。SEC用于通过流体力学体积来分离多糖。折射率(RI)和多角度激光光散射(MALLS)检测器被用于确定分子量。当光与物质相互作用时，其会散射并且散射的光的量与物质的浓度、dn/dc的平方(特定的折射率增长)、以及摩尔质量相关。基于来自MALLS检测器的散射光信号以及来自RI探测器的浓度信号的读数计算分子量测定。
所述活化多糖的氧化度(DO＝糖重复单元的摩尔数/醛的摩尔数)如下进行测定：
糖重复单元的摩尔数通过各种比色方法来确定，例如使用蒽酮法。首先通过硫酸和热的作用而使多糖断裂成单糖。蒽酮试剂与六糖反应以形成黄绿色的复合物，其吸光度通过分光光度计在625nm读取。在该测定的范围内，吸光度与所存在的六糖的量直接成比例。
使用MBTH比色法，也同时确定了醛的摩尔数。MBTH测定涉及醛基(来自给定样品)与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH测定试剂)反应而形成嗪化合物。过量的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙氧化形成活性阳离子。活性阳离子与嗪反应形成蓝色发色团。所形成的发色团继而在650nm进行分光光度计读数。
活化的肺炎链球菌血清型22F多糖与CRM197的缀合
缀合过程由以下步骤组成:
a.与蔗糖赋形剂混合，并冻干；
b.冻干多糖和CRM197的重构；
c.活化多糖缀合至CRM197并封闭；和
d.缀合物的纯化
a.与蔗糖混合并冻干
所述活化的多糖以每克活化的多糖25克蔗糖的比例与蔗糖(50％w/v在WFI中)混合。继而将该瓶混合的混合物冻干。冻干之后，将含有冻干的活化多糖的瓶储存在-20℃。将计算量的CRM197蛋白(目标S/P添加比例＝1)分别外壳冷冻并冻干。冻干的CRM197储存在-20℃。
b.冻干的活化多糖和CRM197蛋白的重构
将冻干的活化多糖在无水二甲基亚砜(DMSO)中重构。在完成多糖的溶解之后，将等量的无水DMSO添加至冻干的CRM197进行重构。
c.活化多糖缀合至CRM197并封闭
重构的CRM197(DMSO中)在缀合反应容器中与重构的活化多糖结合。反应溶液中的最终多糖浓度为1g/L。通过加入1.5MEq的氰基硼氢化钠至反应混合物来起始缀合，并将反应在23℃温育20小时。通过加入2MEq的硼氢化钠终止缀合反应。此封闭反应在23℃持续3小时。
d.缀合物的纯化
用冷却的5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH 6.0)将缀合物溶液稀释为1:5，以备用于通过使用100-300K MWCO膜的切向流动过滤进行纯化，并使用5mM琥珀酸盐-0.9％盐水(pH6.0)作为介质进行了20×渗滤。在完成渗滤之后，将缀合物滞留物进一步稀释、经0.22μm过滤器过滤并储存在2-8℃。
使用以上描述的方法通过改变不同的参数(例如，糖-蛋白质添加比例、反应浓度和氰基硼氢化钠的Meq)获得了若干缀合物。代表性的CRM197Pn-22F糖缀合物的表征在表16中给出。
表16.肺炎球菌血清型22F-CRM197缀合物
N/A＝不可提供
最终缀合物中的％O-乙酰基(保留的)水平是从缀合物的O-乙酰基含量(O-乙酰基μmol/血清型22F糖重复单元μmol)相对于多糖的O-乙酰基含量(O-乙酰基μmol/血清型22F糖重复单元μmol)的比例来计算的。
上述所获得的缀合物的免疫原性可使用下文所述的调理吞噬测定(OPA)来进行评估。
在第0周经皮下途径用0.001μg、0.005μg、或0.01μg的测试缀合物来免疫多组30只6-7周大的雌性Swiss Webster小鼠。在第3周用相同剂的缀合物对小鼠进行加强免疫，并在第4周取血。在第4周血清样品上进行了血清型特异性OPA。
调理吞噬活性(OPA)测定用于测量特异于肺炎链球菌血清型22F的鼠血清中的功能性抗体。将测试血清设定于测定反应中，所述反应中测量荚膜多糖特异性的免疫球蛋白调理细菌、触发补体沉积、由此促进吞噬作用以及由巨噬细胞杀伤细菌的能力。所述OPA效价定义为导致细菌计数相对于无测试血清的对照孔降低50％的稀释度的倒数。所述OPA效价是从涵盖此50％杀伤截断值的两个稀释度推算的。
OPA过程是基于Hu等人(2005)Clin Diagn Lab Immunol12(2):287-295中所述的方法，外加以下修改。测试血清经2.5倍系列稀释并被加入到微量滴定测定平板。活的血清型22F目标菌株被添加至孔并将平板在25℃摇动30分钟。将分化的HL-60细胞(巨噬细胞)和幼兔血清(3-4周大，12.5％终浓度)添加至孔，并将平板在37℃摇动45分钟。为了使反应终止，将80μL的0.9％NaCl添加至所有孔，混合，并将10μL的试样转移至含有200μL水的 HTS HV过滤器平板的孔中。将液体在真空下过滤穿过平板，并将150μL的培养基添加至每个孔并过滤。继而将过滤平板在37℃，5％CO2温育过夜并接着用Destain溶液(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)固定。接着将平板用考马斯亮蓝染色并脱色一次。将菌落显像并在Cellular Technology Limited(CTL)(Shaker Heights,OH) Analyzer上计数。将原始菌落计数用于绘制杀伤曲线并计算OPA效价。
血清型22F-CRM197缀合物的调理吞噬活性(OPA)效价如上所述进行确定。四周不同剂量的OPA效价(几何平均效价(GMT)，95％置信区间(CI))在表17和18中示出(两个分别的实验)，证明了血清型22F缀合物(批次1-7；也参见表16中这些缀合物的表征数据)在鼠免疫原性模型中引起了OPA效价。
表17.血清型22F-CRM197缀合物的免疫原性
表18.血清型22F-CRM197缀合物的免疫原性
实施例14:Pn-11A缀合至CRM197的制备
Pn-11A RAC糖缀合物的制备
将冷冻的经大小调整的多糖(储存于去离子水中或25mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)中)在5℃解冻。
多糖的氧化
通过添加500mM的磷酸钾缓冲液(pH6.0)和WFI以给出2.0g/L的最终多糖浓度，从而在100mM的磷酸钾缓冲液(pH 6.0)中进行多糖氧化。氧化反应在23℃进行。通过添加高碘酸钠起始氧化。搅拌速率范围为100-140rpm。
活化的11A多糖的纯化
使用超滤盒进行所述活化的多糖的浓缩和渗滤。针对20倍透析体积的WFI进行渗滤。在0.22μm过滤后，将纯化的活化多糖储存在5℃。
缀合方法描述
所述缀合过程由以下步骤组成：
a.CRM197蛋白的外壳冷冻以及冻干；
b.所述活化的多糖和CRM197的重构；
c.活化的多糖缀合至CRM197；和
d.缀合物的纯化和稀释。
a.CRM197蛋白的外壳冷冻以及冻干
CRM197蛋白经外壳冷冻并冻干。
b.活化的多糖和CRM197蛋白的重构
活化的多糖溶液(～10g/L)被充入反应器中，随后加入计算量的0.5N磷酸钠缓冲液(pH7.2)。经搅拌，添加冻干的CRM197并将反应混合物搅拌2-4小时以便达到CRM197的完全溶解。
c.缀合和封闭
通过加入氰基硼氢化物起始缀合。将反应混合物在23℃温育72-96小时。通过加入0.5X WFI以及随后2MEq的硼氢化钠来将缀合反应终止。将此封闭反应在23℃保持3-4小时。
d.缀合物的稀释和初步纯化
用0.15N磷酸钠缓冲液(pH8.0)将缀合物溶液稀释为1:5(反应体积)，以备用于通过切向流动过滤(TFF)来纯化。在稀释器皿中将稀释的缀合物混合并接着穿过5μm的过滤器。继而将经过滤的缀合物溶液浓缩至1-2g/L。进行了两步的渗滤过程。在第一步中，用30×(渗滤体积)的0.15N磷酸钠缓冲液(pH 8.0)进行TFF，随后是20×的5mM琥珀酸盐-0.9％NaCl(pH6.0)。在初始渗滤完成后，将缀合物滞留物转移穿过0.45μm过滤器至收集罐中。
缀合物的最终渗滤
最终的纯化步骤是以5mM琥珀酸盐-0.9％NaCl,pH6.0介质使用再生纤维素膜20×渗滤。
单价批量缀合物(MBC)的稀释
用5mM琥珀酸盐/0.9％盐水(pH6)将缀合物进一步稀释至约0.5mg/mL的目标糖浓度。完成最终的0.22μm过滤步骤以制备单价批量缀合物(MBC)产物用于制剂。
使用上述方法通过改变不同的参数(例如糖-蛋白质添加比例、反应浓度和氰基硼氢化钠的Meq)获得了若干缀合物。代表性的CRM197Pn-11A糖缀合物的表征在表19中给出(批次1至5)。
使用RAC/DMSO制备Pn-11A糖缀合物
如上所述制备并纯化氧化的多糖(参见Pn-11ARAC糖缀合物的制备)。
在DMSO中通过还原胺化缀合(RAC/DMSO)。
11A经RAC/DMSO缀合由以下步骤组成：
a.与蔗糖混合、外壳冷冻并冻干；
b.冻干的多糖和CRM197的重构；
c.活化的多糖缀合至CRM197；和
d.缀合物的纯化和稀释。
a.与蔗糖混合、外壳冷冻并冻干
从调整大小的多糖制备的活化的多糖，以每克活化的多糖25克蔗糖的比例与蔗糖(50％w/v于WFI中)混合。将组分混合并继而将外壳冷冻瓶的混合的混合物冻干。分别将CRM197蛋白外壳冷冻和冻干。
b.冻干的活化多糖和CRM197蛋白的重构
冻干的活化多糖以2mg/mL的浓度在DMSO中重构。在多糖完全溶解后，将DMSO添加至冻干的CRM197用于重构。
c.缀合和封闭
重构的CRM197(DMSO中)在缀合反应容器与重构的活化多糖组合。反应溶液中的最终多糖浓度为1g/L。通过将氰基硼氢化物添加至反应混合物来起始缀合，并在23℃温育22小时。通过添加2MEq的硼氢化钠来终止缀合反应。将此封闭反应在23℃保持3-4小时。
d.缀合物的纯化和稀释
使用上述类似的方法来将缀合物溶液纯化和稀释。
使用上述方法通过改变不同的参数(例如糖-蛋白质添加比例、反应浓度和氰基硼氢化钠的Meq)获得了若干缀合物。通过上述方法获得的代表性CRM197Pn-11A糖缀合物的表征在表19中给出(批次6至8)。
表19.肺炎球菌血清型11A-CRM197缀合物
N/A＝不可提供
*甘油通过氢氟酸(HF)从多糖释放之后，通过高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)来定量
由上述还原胺化过程制备的缀合物所产生的整体数据证明了，其可制备具有良好缀合产率、低％游离糖以及良好稳定性的缀合物。
上述所获得的缀合物的免疫原性使用下述的调理吞噬测定(OPA)来进行评估。
在第0周经皮下途径用0.001μg、0.005μg、0.01μg、或0.1μg的测试缀合物免疫多组30只6-7周大的雌性Swiss Webster小鼠。在第3周用相同剂量的缀合物对小鼠进行加强免疫，并在第4周取血。在第4周的血清样品上进行了血清型特异性OPA。
调理吞噬活性(OPA)测定用于测量特异于肺炎链球菌血清型11A的鼠血清中的功能性抗体。将测试血清设定于测定反应中，所述反应中测量荚膜多糖特异性的免疫球蛋白调理细菌、触发补体沉积、从而促进吞噬作用以及由巨噬细胞杀伤细菌的能力。所述OPA效价定义为导致细菌计数相对于无测试血清的对照孔降低50％的稀释度的倒数。所述OPA效价是从涵盖此50％杀伤截断值的两个稀释度推算的。
OPA过程是基于Hu等人(2005)Clin Diagn Lab Immunol12(2):287-295中所述的方法，外加以下修改。测试血清经2.5倍系列稀释并被加入到微量滴定测定平板。活的血清型22F目标菌株被添加至孔并将平板在25℃摇动30分钟。将分化的HL-60细胞(巨噬细胞)和幼兔血清(3-4周大，12.5％终浓度)添加至孔，并将平板在37℃摇动60分钟。为了使反应终止，将80μL的0.9％NaCl添加至所有孔，混合，并将10μL的试样转移至含有200μL水的 HTS HV过滤器平板的孔中。将液体在真空下过滤穿过平板，并将150μL的培养基添加至每个孔并过滤。继而将过滤平板在37℃，5％CO2温育过夜并接着用Destain溶液(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)固定。然后将平板用考马斯亮蓝染色并脱色一次。将菌落显像并在Cellular Technology Limited(CTL)(Shaker Heights,OH) Analyzer上计数。将原始菌落计数用于作杀伤曲线并计算OPA效价。
血清型11A-CRM197缀合物在小鼠中的调理吞噬活性(OPA)效价如上述所述进行确定。四周不同剂量的OPA效价(几何平均效价(GMT)，95％置信区间(CI))在表20中示出，证明了血清型11A缀合物(批次2-4和8；也参见表19中这些缀合物的表征数据)在鼠免疫原性模型中引起了OPA效价。
表20.血清型11A-CRM197缀合物的免疫原性
实施例15:16-价肺炎球菌缀合物疫苗的制剂
配制了16-价的缀合物组合物，其包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的糖缀合物(16vPnC)，是全都单独缀合至CRM197的。
来自血清型15B、22F和33F的肺炎链球菌糖缀合物如上述所公开的那样产生，且来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌糖缀合物如WO 2006/110381中公开的那样产生。
基于批次体积和批量糖浓度计算了批量浓缩物所需的体积。通过添加所需体积的NaCl/琥珀酸盐缓冲液(pH 5.8)以获得琥珀酸盐5.0mM和150mM NaCl的最终目标缓冲液浓度，从而制备了所配制的批量疫苗。聚山梨醇酯80达到最终浓度0.02％且添加16种肺炎球菌缀合物。将制剂经0.2μm Millipore PES膜过滤，随后添加AlPO4。将制剂混合以使得可结合并且实现均质性。
继而将制剂填充至玻璃注射器以递送0.5mL的剂量体积。
最终的剂量形式由以下组成(对于0.5mL的剂量)：来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的每种糖缀合物(单独缀合至CRM197)2.2μg、来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物4.4μg、5mM琥珀酸盐缓冲液pH 5.8、0.02％PS80、150mM NaCl和0.25mg/mL铝(作为AlPO4)。对于0.5mL的剂量，CRM197的含量为约38μg。
实施例16:20-价肺炎球菌缀合物疫苗的制剂
配制了20-价的缀合物组合物，其包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的糖缀合物(20vPnC)，是全都单独缀合至CRM197的。
来自血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的肺炎链球菌糖缀合物如上述所公开的那样产生，且来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌糖缀合物如WO 2006/110381中公开的那样产生。
基于批次体积和批量糖浓度计算了批量浓缩物所需的体积。通过添加所需体积的NaCl/琥珀酸盐缓冲液(pH 5.8)以获得琥珀酸盐5.0mM和150mMNaCl的最终目标缓冲液浓度，从而制备了所配制的批量疫苗。聚山梨醇酯80达最终浓度0.02％且添加20种肺炎球菌缀合物。将制剂经0.2μm Millipore PES膜过滤，随后添加AlPO4。将制剂充分混合以使得缀合物结合至铝。
继而将制剂填充至玻璃注射器，以递送0.5mL的剂量体积。
最终的剂量形式由以下组成(对于0.5mL的剂量)：来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的每种糖缀合物(单独缀合至CRM197)2.2μg、来自肺炎链球菌血清型6B的糖缀合物4.4μg、5mM 琥珀酸盐缓冲液pH5.8、0.02％PS80、150mM NaCl和0.25mg/mL铝(作为AlPO4)。对于0.5mL的剂量，CRM197的含量为约46μg。
实施例17:16-价免疫原性组合物的免疫原性
在兔中评估了所述16-价免疫原性组合物(参见实施例15)的免疫原性，其中使用多重直接Luminex免疫测定(dLIA)来测量血清中的血清型特异性IgG浓度以及血清型特异性OPA。
在第0周，以建议的人类临床剂量(2.2μg的缀合物，除了血清型6B为4.4μg外；外加0.1mg的铝作为AlPO4)经肌肉内途径免疫多组10只2.5kg至3.5kg的新西兰白兔。以相同剂量的缀合物疫苗在第2周对所述兔进行加强，并继而在第4周取血。对第0周和第4周的血清样品进行血清型特异性dLIA和OPA。
为了将特异于每种肺炎球菌多糖(PnPS)的总多糖结合抗体(IgG)进行定量，在两个直接Luminex免疫测定(dLIA；13-重dLIA，PREVNAR血清型以及7-重dLIA，另外的血清型)中评估了兔血清。所述13-重测定测量特异于13-价肺炎球菌缀合物(PnC)疫苗中包含的13种血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、和23F)的抗-PnPS抗体，且所述7-重测定测量针对另外的血清型(15B、22F、33F)的抗PnPS抗体。每种测定含有13种或7种波谱不同的偶联至PnPS缀合物的磁微球(PnPS-PLL缀合物:PnPS缀合至聚-L-赖氨酸)的组合。
简言之，参考标准、对照和测试血清首先用两种Pn吸附剂进行预吸附；CWPS1(含有C-多糖的来自PnA的细胞壁多糖)和CWPS2(CWP来自非荚膜肺炎链球菌血清型2)以封闭非特异性抗体结合PnPS包被的抗原。在预吸附之后，将PnPS-偶联的微球与适当稀释的参考标准血清、对照或兔测试血清温育。温育之后，将每种混合物洗涤并加入R-藻红蛋白-缀合的山羊抗-兔IgG次级抗体。用Bio-plex读数器测量荧光信号(表示为中位荧光强度(MFI))，并与所结合的PnPS-特异性IgG的量相关联。测试血清的数值报道为(Units/mL，U/mL)。
如上所述进行血清型特异性OPA。OPA效价是导致菌落形成单位(CFU)的数字与无血清对照(定义为背景CFU)相比降低50％的最高血清稀释度的倒数。所述效价是从涵盖此50％杀伤截断值的两个稀释度推算的。
表21. 16vPnC总IgG浓度和OPA效价
结果显示出在以16vPnC两次免疫之后血清型特异性IgG和功能性OPA抗体应答的显著提高(表21)。血清IgG水平在基线之上提高了超过2-log。类似地，引起了强功能性OPA抗体应答，其具有基线之上最少22倍的OPA GMT提高。免疫前血清(第0周)对于大多数的16vPn血清型都显示了不可检测水平的PnPS-特异性IgG和功能性OPA抗体，只有血清型14和33F例外。这些血清型存在低水平的OPA效价，但是这些基线应答并未对疫苗接种后的抗体应答产生不利影响。
实施例18:20-价免疫原性组合物的免疫原性
在兔中评估了所述20-价免疫原性组合物(如实施例16制备)的免疫原性，其中使用多重直接Luminex免疫测定(dLIA)来测量血清中的血清型特异性IgG浓度以及血清型特异性OPA。
在第0周，以建议的人类临床剂量(2.2μg的缀合物，除了血清型6B为4.4μg外；外加0.1mg的铝作为AlPO4)经肌肉内途径免疫多组10只2.5kg至3.5kg的新西兰白兔。以相同剂量的缀合物疫苗在第2周对所述兔进行加强，并继而在第4周取血。对第0周和第4周的血清样品进行血清型特异性dLIA和OPA。
为了将特异于每种肺炎球菌多糖(PnPS)的总多糖结合抗体(IgG)进行定量，在两个直接Luminex免疫测定(dLIA；13-重dLIA，PREVNAR血清型以及7-重dLIA，另外的血清型)中评估了兔血清。所述13-重测定测量特异于13-价肺炎球菌缀合物(PnC)疫苗中包括的13种血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、和23F)的抗-PnPS抗体，且所述7-重测定测量针对另外的血清型(15B、22F、33F)的抗PnPS抗体。每种测定含有13种或7种波谱不同的偶联至PnPS缀合物的磁微球(PnPS-PLL缀合物：PnPS缀合至聚-L-赖氨酸)的组合。
简言之，参考标准、对照和测试血清首先用两种Pn吸附剂进行预吸附；CWPS1(含有C-多糖的来自PnA的细胞壁多糖)和CWPS2(CWP来自非荚膜肺炎链球菌血清型2)以封闭非特异性抗体结合PnPS包被的抗原。在预吸附之后，将PnPS-偶联的微球与适当稀释的参考标准血清、对照或兔测试血清温育。温育之后，将每种混合物洗涤并加入R-藻红蛋白-缀合的山羊抗-兔IgG次级抗体。用Bio-Plex读数器测量荧光信号(表示为中位荧光强度(MFI))，并与所结合的PnPS-特异性IgG的量相关联。测试血清的数值报道为(Units/mL，U/mL)。
如上所述进行血清型特异性OPA。OPA效价是导致菌落形成单位(CFU)的数字与无血清对照(定义为背景CFU)相比降低50％的最高血清稀释度的倒数。所述效价是从涵盖此50％杀伤截断值的两个稀释度推算的。
用20vPnC免疫的兔也证明了针对16v和20v制剂中共有的血清型以及针对另外四种血清型(8、10A、11A、和12F)的总IgG和功能性OPA抗体效价的显著提高(表22)。在两次免疫后诱导出了20种血清型中血清IgG水平2-log的提高。由疫苗所引起的OPA GMT至少在基线之上27倍。对于血清型14和33F，免疫前血清中低水平的OPA效价在20vPnC疫苗接种后也类似地观察到，但是仍未改变疫苗接种后抗体的强应答。
所述16vPnC和20vPnC制剂引起了强体液应答，其既特异于肺炎球菌多糖又与细菌的功能性杀伤相关(参见表21和22)。总而言之，实施例17和18中所示的研究证明了16vPnC和20vPnC制剂的良好免疫原性。
表22. 20vPnC总IgG浓度和OPA效价
表22. 20vPnC总IgG浓度和OPA效价
10A 0.13 54 31-94 433 5 1129 732-1741 236
11A 0.13 178 125-254 1423 7 10483 6373-17241 1434
12F 0.08 31 15-63 408 4 828 608-1127 191
缩写:GMC，几何平均浓度；CI，置信区间；LCI，下限置信区间；UCI，上限置信区间。
实施例19:肺炎链球菌的血清组9内的交叉反应调理吞噬免疫应答的评估
所述肺炎球菌调理吞噬测定(OPA)，其测量在功能性抗体和补体的存在下吞噬效应细胞对肺炎链球菌细胞的杀伤，它被认为是评价肺炎球菌疫苗效果的重要替代。
材料与方法
从接种了13-价肺炎球菌缀合物疫苗(13v PnC)的成人随机选择两个免疫血清子集，在OPA测定中测试了血清型9V、9A、9L和9N。所述血清分别收集自美国临床试验6115A1-004(N＝59，疫苗接种后)和6115A1-3005(N＝66，匹配的疫苗接种之前和之后)。
研究6115A1-3005(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00546572)是3期、随机的、活性对照的、经修改的双盲试验，其用于在研究登记前至少5年接受过1剂的23vPS的70岁或者更年长的能走动的老年人中评估Prevnar相较于23-价肺炎球菌多糖疫苗(23vPS)的安全性、耐受性和免疫原性(参见:http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00546572；2014年3月31日登录)。
研究6115A1-004(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00427895)是随机化的主动对照型改良双盲3期临床试验，其用于在未接受23vPS的60至64岁的成人中评估13-价肺炎球菌缀合物疫苗(13vPnC)相较于23-价肺炎球菌多糖疫苗(23vPS)的安全性、耐受性和免疫原性，以及用于在未接受23vPS的18至59岁成人中评估13vPnC的安全性、耐受性和免疫原性(参见:http://clinicaltrials.gov/show/NCT00427895；2014年3月31日登录)。
这些研究中测试的13-价肺炎球菌缀合物疫苗(13vPnC)含有来自肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、和23F的缀合物，单独缀合至白喉交叉反应材料197(CRM197)载体蛋白。
OPA用于测量人血清中针对肺炎链球菌血清型9V、9N、9A和/或9L的功能性抗体。将测试血清设定于测定反应中，其中测量荚膜多糖特异性的免疫球蛋白调理细菌、触发补体沉积、从而促进吞噬作用以及由巨噬细胞杀伤细菌的能力。所述OPA效价定义为导致细菌计数相对于无测试血清的对照孔降低50％的稀释度的倒数。所述OPA效价是从涵盖此50％杀伤截断值的两个稀释度推算的。
OPA过程是基于Hu等人(2005)Clin Diagn Lab Immunol12(2):287-295中所述的方法。测试热灭活的血清经2.5倍的系列稀释，并与目标细菌一起被添加至测定平板并摇动温育30分钟。继而将分化的HL-60细胞(巨噬细胞)和幼兔血清(3-4周大，Arkansas，12.5％终浓度)以约200:1的效应物对目标比添加至孔，并在37℃摇动温育。为了使反应终止，将80μL的0.9％NaCl添加至所有孔，混合，并将10μL的试样转移至含有200μL水的 HTS HV过滤器平板的孔中。将液体在真空下过滤穿过平板，并将150μL的培养基添加至每个孔并过滤。继而将过滤平板在37℃，5％CO2温育过夜并接着用Destain溶液(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)固定。然后将平板用考马斯亮蓝染色并脱色一次。将菌落显像并在Cellular Technology Limited(CTL)(Shaker Heights,OH) Analyzer上计数。
统计分析：计算了Pearson双尾相关。
结果-9V、9A、9L和9N中的OPA应答
在各个微菌落调理吞噬测定(mcOPA)中，分别评估了来自以13vPnC针对血清型9A、9L和9N进行免疫的成人的免疫血清的交叉功能应答，以及对血清型9V的内源功能性应答。测试了从接种了13v PnC的成人随机选择两个免疫血清子集。血清分别收集自美国临床试验6115A1-004(N＝59,疫苗接种后)和6115A1-3005(N＝66,匹配的疫苗接种之前和之后)。
研究6115A1-004中的对象此前未接受任何肺炎球菌疫苗接种并接受了单剂的13vPnC作为研究方案的一部分。来自研究6115A1-004的免疫血清对所有血清组显示出相似百分比的应答者，对于9V、9A、9L和9N分别是98.3％、98.3％、100％和93.2％(图11)，支持来自6115A1-3005的结果(图12)。在血清型9V与9A之间(Pearson相关ρ＝0.5456,p<0.0001)或者与9L之间(ρ＝0.7353,p<0.0001)观察到相对良好的OPA效价关联，但与9N之间却不是(ρ＝0.1217,p<0.3627)。
研究6115A1-3005中的对象在参与研究之前至少5年曾经接受过1剂的23vPS，并接受了单剂的13vPnC作为研究方案的一部分。对来自用13vPnC免疫的成人(研究6115A1-3005)的匹配的疫苗接种之前和之后血清组(N＝66)评估了血清型9V的内源应答OPA以及抗-9V抗体对血清型9A、9L和9N的交叉反应性OPA。如图12中所示，在OPA测定中检测到了对9V(84％)、9A(66％)、9L(82％)和9N(86％)相对高的免疫性(百分比应答者)，这可能是由于他们此前曾用23vPS免疫，其包括来自血清型9V和9N的未缀合多糖。然而，在用13vPnC疫苗(其仅含有来自血清组9的血清型9V缀合物)接种后，所有四种血清型的百分比应答者提高到了95％或更高。效价值的倍数提升在表23中示出并且在血清型之间类似也表明交叉反应性。
表23.匹配的疫苗接种之前和之后OPA效价倍数提升,13vPnC
对OPA效价分布的更全面的分析在图13至16中的反向累积分布曲线(RCDC)中示出。所述RCDC显示出疫苗接种后对于血清型9V、9A、9L，以及程度较低的9N血清型特异性免疫应答的提高。还使用Pearson相关分析了9V/9A、9V/9L、和9V/9N之间单独匹配的效价倍数提升/样品的相关性。在血清型9V与9A之间(Pearson相关ρ＝0.8720，p<0.0001)或者与9N之间(ρ＝0.5801，p<0.0001)观察到效价倍数提升相对良好的相关，但是与9L之间程度较低(ρ＝0.1804，p<0.1640)。
结论
基于这些数据，所述13vPnC疫苗通过针对血清型9A、9L、和9N的额外的防护而可提供更广泛的血清型覆盖。
实施例20:血清型15B和血清型15C之间的交叉功能OPA应答
肺炎球菌血清组15包括4种结构上相关的血清型：15A、15B、15C、和15F。血清型15B和15C通过基因分型技术不能区分并且具有相似的荚膜多糖(PS)成分，除了15B-PS是15C-PS的O-乙酰化变体。为了理解针对血清型15B的抗荚膜PS抗体是否在功能上与血清型15C交叉反应，用16vPnC(参见实施例15)和20vPnC(参见实施例16)免疫10只兔子，16vPnC和20vPnC均包含免疫原性缀合物作为其配方一部分，，所述免疫原性缀合物包含供价连接至CRM197的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖。在OPA测定中针对血清型15B和15C目标肺炎球菌菌株测试了疫苗接种之前和之后的血清。
对于每组的10只兔子，在用血清型15B缀合物免疫之后100％对血清型15B具有OPA应答。对于这些相同的样品，100％也对血清型15C具有OPA应答(表24和表25)。在15C OPA中的疫苗接种前血清中观测到低OPA效价。然而，疫苗接种后血清与疫苗接种前相比GMT OPA效价提高了超过10倍，证明了本发明的免疫原性缀合物诱导抗体的形成，该抗体能够在OPA中杀伤血清型15B和15C肺炎链球菌。
表24.在用16vPnC疫苗接种之前和之后的兔子血清中针对血清型15B和15C菌株的OPA效价
表25.在用20vPnC疫苗接种之前和之后的兔子血清中针对血清型15B和15C菌株的OPA效价
*由于杀伤曲线不佳而不能确定效价
实施例21. 7价肺炎球菌缀合物疫苗的制剂
配制了7-价的缀合物组合物，其包含来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的糖缀合物(7vPnC)，是均单独缀合至CRM197的。
来自血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的肺炎链球菌的糖缀合物如上述所公开的那样产生。
基于批次体积和批量糖浓度计算了批量浓缩物所需的体积。通过添加所需体积的NaCl/琥珀酸盐缓冲液(pH 5.8)以获得琥珀酸盐5.0mM和150mM NaCl的最终目标缓冲液浓度，从而制备了所配制的批量疫苗。聚山梨醇酯80的最终浓度至0.02％且添加7种肺炎球菌缀合物。将制剂经0.2μm Millipore PES膜过滤，随后添加AlPO4。将制剂充分混合以获得缀合物与铝的最大结合。
继而将制剂填充至玻璃注射器，以递送0.5mL的剂量体积。
最终的剂量形式由以下组成(对于0.5mL的剂量)：来自肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的糖缀合物(单独缀合至CRM197)每种2.2μg、5.0mM琥珀酸盐缓冲液pH 5.8、0.02％(w/w)PS80、150mM NaCl和0.25mg/mL铝(作为AlPO4)。
说明书中提到的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请援引加入本文，其在相同程度上如同每个单个出版物或专利申请都具体地和单独地表示援引加入。
虽然出于清楚理解的目的，通过说明以及实例的方式对上述发明进行了某些细节描述，但是依然可以在所附权利要求的范围内实现一些改变和修改。
序列表
<110> 辉瑞公司
<120> 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其试剂盒和用途
<130> PC72217A
<150> US 62/194,965
<151> 2015-07-21
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-Class oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-Class oligonucleotide
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tcgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23
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<223> P class CpG oligonucleotide
<400> 40
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23

Claims (27)

1.试剂盒，包括：(a)第一免疫原性组合物，其包含至少一种糖缀合物，所述至少一种糖缀合物选自：来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物和来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物，其中所述组合物是1、2、3、4、5、6或7价肺炎球菌缀合物的组合物；和(b)第二免疫原性组合物，其包含至少一种来自肺炎链球菌血清型的糖缀合物，所述血清型选自：血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，所述第一和第二免疫原性组合物用于同时、并行、伴随或依次施用。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型15B的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型22F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型33F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型12F的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型10A的糖缀合物、来自肺炎链球菌血清型11A的糖缀合物和来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物，其中所述组合物是7价肺炎球菌缀合物的组合物。
3.权利要求1-2中任一项的试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物的所述糖缀合物是单独缀合至CRM197。
4.权利要求1-3中任一项的试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物进一步包含至少一种佐剂。
5.权利要求1-4中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物。
6.权利要求1-4中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物。
7.权利要求1-4中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物包含来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物。
8.权利要求5-7中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖缀合物是缀合至CRM197。
9.权利要求6-7中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型1、5和7F的糖缀合物是缀合至CRM197。
10.权利要求7的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型3、6A和19A的糖缀合物是缀合至CRM197。
11.权利要求7的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物是缀合至CRM197。
12.权利要求6-7中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的糖缀合物是单独缀合至PD。
13.权利要求6-7中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT。
14.权利要求6-7中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT。
15.权利要求6-7中任一项的试剂盒，其中所述来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和/或23F的糖缀合物是单独缀合至PD，所述来自肺炎链球菌血清型18C的糖缀合物是缀合至TT，并且所述来自肺炎链球菌血清型19F的糖缀合物是缀合至DT。
16.权利要求1-15中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是7、8、9、10、11、12、13、14或15价肺炎球菌缀合物的组合物。
17.权利要求1-16中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物是13价肺炎球菌缀合物的组合物，其中所述13种缀合物由单独缀合至CRM197的来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的糖缀合物组成。
18.权利要求1-17中任一项的试剂盒，其中所述第二免疫原性组合物进一步包含至少一种佐剂。
19.权利要求1-18中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二免疫原性组合物用于同时施用。
20.权利要求1-18中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二免疫原性组合物用于伴随施用的方法中。
21.权利要求1-18中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二免疫原性组合物用于并行施用的方法中。
22.权利要求19-21中任一项的试剂盒，其中所述同时、伴随或并行施用的疫苗接种方案是多剂方案。
23.权利要求22的试剂盒，其中所述多剂方案由一岁内的至少一剂(例如1、2或3剂)和随后幼儿期的至少一剂组成。
24.权利要求1-18中任一项的试剂盒，所述第一和第二免疫原性组合物用于依次施用的方法中。
25.权利要求24的试剂盒，其中所述依次施用的疫苗接种方案由一系列的2、3、4、5、6、7或8剂组成。
26.权利要求24-25中任一项的试剂盒，其中所述疫苗接种方案由如下依次施用组成：
(a)施用所述第一免疫原性组合物，和
(b)将所述第一免疫原性组合物与所述第二免疫原性组合物伴随施用或并行施用。
27.权利要求24-25中任一项的试剂盒，其中所述疫苗接种方案由如下依次施用组成：
(a)施用所述第二免疫原性组合物，和
(b)将所述第一免疫原性组合物与所述第二免疫原性组合物伴随施用或并行施用。
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