CN108351344B - 基因组规模的t细胞活性阵列及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基因组规模的T细胞活性阵列(Genome‑Scale T Cell Activity Arrays,GS‑TCAA)、该阵列的制造方法、及使用该阵列鉴别免疫调节剂的方法。

Description

基因组规模的T细胞活性阵列及其使用方法

相关申请

本申请主张2015年10月14日提出申请的美国临时专利申请第62/241,466号的优先权利益，其全部内容并入本说明书中以为参考。

背景技术

共信号传导表面受体-配体途径(co-signaling surface receptor-ligandpathways)对于T细胞的活化和抑制是关键的，其密切地调控T细胞生物网络。在过去十年间，此领域已见证了靶向共信号传导分子和路径并对抗包括自身免疫疾病和各种癌症的众多疾病的免疫调节疗法的开发。最近靶向PD-1/B7-H1(PD-L1)途径的抗体的临床试验已获得成功并得到FDA的批准，这在广泛的晚期人类癌症中以最少的副作用获得了空前的临床结果(Brahmer,JR等,N Engl J Med 366(26):2455-2465,2012、Topalian,SL等,N Engl JMed 366(26):2443-2454,2012)。这一类型的治疗在疗效、毒性和持久性方面皆优于其它疗法，并对于肿瘤治疗显现了肿瘤部位T细胞免疫调节策略的优点(Sznol M和Chen L,ClinCancer Res 19(5):1021-1034,2013)。然而，虽然已获得令人振奋的反应，但一大部分的癌症患者对于抗PD-1疗法并无反应。因此，亟须确定其他哪些因子涉及先天性及获得性免疫抗性(Sznol M和Chen L,Clin Cancer Res 19(5):1021-1034,2013)，以及除了PD-1/B7-H1途径外，哪些额外机制负责免疫逃避。广泛地了解人类细胞表面分子如何调控T细胞反应将有助于鉴别新的免疫调节剂，且显现开发新免疫治疗剂的重要方向。

膜蛋白在细胞功能上发挥重要的作用。通讯为最重要的作用之一，其中细胞表面蛋白用作受体且能够在细胞之间转导信号或者介导内部和外部环境之间的相互作用。除作为细胞获得信息及传递信号的方式之外，膜蛋白也可以作为转运蛋白发挥功能并与物质跨细胞膜交换的控制相关。由于膜蛋白更易接近，因此作为治疗剂的靶标是特别令人感兴趣的。然而，对于大部分人类膜蛋白的免疫功能了解很少，而且没有完备的系统在基因组水平上分析T细胞活性。因此，对于能够鉴别具有药物潜力的新颖免疫调控性膜蛋白以便在抗肿瘤及自身免疫的免疫疗法方面增大成功率并充分地利用的组合物和方法仍存在持续且未被满足的需求。

发明内容

本发明至少部分地基于新的基因组规模T细胞活性阵列(GS-TCAA)的开发，其允许鉴别参与调控T细胞生物网络的人类细胞膜蛋白。GS-TCAA允许利用新的以细胞为基础的荧光报告系统在90％以上的所有人类膜基因中研究不同的T细胞活性，诸如增殖、抑制和衰竭。此种方法提供了关于人类细胞表面分子如何调控T细胞反应的广泛了解，并辅助鉴别新的免疫调节剂。利用该GS-TCAA，可通过鉴别自身免疫疾病和癌症中存在的未知共信号传导分子和途径来靶定、鉴别和开发其治疗。

因此，在一个方面中，本发明包括基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)，其包含含有多个孔的固体支持结构，其中多个孔的各孔含有：表达膜相关的抗CD3抗体或其抗原结合片段的第一细胞，其中该第一细胞用编码多个人类膜基因的cDNA文库以下述方式转染：允许在第一细胞上展示由多个人类膜基因之一编码的蛋白质；表达细胞表面上的受体和报告基因的第二细胞；其中受体与抗CD3抗体或其抗原结合片段之间的相互作用提供初级信号并刺激第二细胞系的活性，且其中报告基因的表达水平增高指示由多个人类膜基因之一编码的所展示的蛋白质用作刺激性共信号传导分子并刺激第二细胞系的活性；且其中报告基因的表达水平降低指示由多个人类膜基因之一编码的所展示的蛋白质用作抑制性共信号传导分子并抑制第二细胞系的活性。

在一些实施方式中，固体支持结构为多孔板。在其它实施方式中，多孔板选自由96孔板、384孔板和1536孔板组成的组。

在一些实施方式中，第一细胞为人293T细胞。在其它实施方式中，第一细胞为表达免疫相关衔接因子的人293T.2A细胞。在一些实施方式中，免疫相关衔接因子选自由DAP10、DAP12、FcRγ和CD3E组成的组。

在一些实施方式中，第二细胞为免疫细胞。在其它实施方式中，免疫细胞为髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)。在一些实施方式中，免疫细胞为T细胞。在一些实施方式中，T细胞选自由Jurkat细胞、初始T细胞、效应T细胞、衰竭T细胞、无能T细胞及调节性T细胞组成的组。

在一些实施方式中，报告基因包含于选自由细胞毒性相关报导构建体、细胞凋亡相关报导构建体和增殖相关报导构建体组成的组的DNA构建体中。在其它实施方式中，细胞毒性相关报导构建体为基于荧光的报导构建体。在一些实施方式中，细胞凋亡相关报导构建体为基于荧光的报导构建体。在一些实施方式中，基于荧光的报导构建体包含T细胞相关转录反应元件，其后有最小CMV启动子和GFP报告基因。在其它实施方式中，T细胞相关转录反应元件选自由NF-kb、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK及PI3K组成的组。在一些实施方式中，增殖相关报导构建体中的报告基因为细胞因子基因。在一些实施方式中，细胞因子选自由IFN-γ、TNF-α及IL-10组成的组。

在一些实施方式中，多个人类膜基因包括选自受体基因、免疫球蛋白基因、转运蛋白基因及信号基因的基因。在一些实施方式中，多个人类膜基因包含约1,000至7,000个基因。在其它实施方式中，多个人类膜基因包含约2,000至5,000个基因。在再其它的实施方式中，多个人类膜基因包含约4,000至7,000个基因。

在一些实施方式中，第二细胞的活性选自由细胞增殖、细胞抑制、细胞衰竭、细胞凋亡和细胞的细胞因子释放组成的组。

在一个方面中，本发明包括制备基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)的方法，该方法包括：提供含有多个孔的固体支持结构；在多个孔的各孔中培养表达膜相关的抗-CD3抗体或其抗原结合片段的第一细胞；用编码多个人类膜基因的cDNA文库以下述方式转染第一细胞：允许在第一细胞上展示由多个人类膜基因之一编码的蛋白质；以及在多个孔的各孔中共培养表达细胞表面上的受体和报告基因的第二细胞，从而制备基因组规模的T细胞活性阵列，其中受体与抗-CD3抗体或其抗原结合片段之间的相互作用提供初级信号并刺激第二细胞系的活性，以及其中报告基因表达水平的增高指示由多个人类膜基因之一编码的所展示的蛋白质用作刺激性共信号传导分子并刺激第二细胞系的活性，且其中报告基因表达水平的减低指示由多个人类膜基因之一编码的所展示的蛋白质用作抑制性共信号传导分子并抑制第二细胞系的活性。

在一些实施方式中，固体支持结构是多孔板。在一些实施方式中，多孔板选自由96孔板、384孔板及1536孔板组成的组。

在一些实施方式中，第一细胞是人293T细胞。在其它实施方式中，第一细胞是表达免疫相关衔接因子的人293T.2A细胞。在一些实施方式中，免疫相关衔接因子选自由DAP10、DAP12、FcRγ及CD3E组成的组。

在一些实施方式中，第二细胞是免疫细胞。在其它实施方式中，免疫细胞是髓源性抑制细胞(MDSC)。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，T细胞选自由Jurkat细胞、初始T细胞、效应T细胞、衰竭T细胞、无能T细胞及调节性T细胞组成的组。

在一些实施方式中，报告基因包含于选自由细胞毒性相关报导构建体、细胞凋亡相关报导构建体及增殖相关报导构建体组成的组的DNA构建体中。在其它实施方式中，细胞毒性相关报导构建体是基于荧光的报导构建体。在一些实施方式中，细胞凋亡相关报导构建体是基于荧光的报导构建体。在一些实施方式中，基于荧光的报导构建体包含T细胞相关转录反应元件，其后有最小CMV启动子及GFP报告基因。在其它实施方式中，T细胞相关转录反应元件选自由NF-kb、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK及PI3K组成的组。在一些实施方式中，增殖相关报导构建体中的报告基因为细胞因子基因。在一些实施方式中，细胞因子选自由IFN-γ、TNF-α及IL-10组成的组。

在一些实施方式中，多个人类膜基因包含选自受体基因、免疫球蛋白基因、转运蛋白基因及信号基因的基因。在一些实施方式中，多个人类膜基因包含约1,000至7,000个基因。在其它实施方式中，多个人类膜基因包含约2,000至5,000个基因。在再其它的实施方式中，多个人类膜基因包含约4,000至7,000个基因。

在一些实施方式中，第二细胞的活性选自由细胞增殖、细胞抑制、细胞衰竭、细胞凋亡和细胞的细胞因子释放组成的组。

本发明的一个方面提供鉴别免疫调节剂的方法，该方法包括：提供本文所述的基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)；允许在第一细胞中表达多个人类膜基因之一；共培养第一细胞与第二细胞；检测第二细胞中报告基因的表达水平；以及比较该报告基因的表达水平与对照第二细胞中的报告基因表达水平，其中该对照第二细胞与未用多个人类膜基因之一转染的对照第一细胞共培养；其中报告基因的表达水平增高指示由多个人类膜基因之一编码的所展示的蛋白质用作刺激性共信号传导分子并刺激第二细胞系的活性，且其中报告基因的表达水平减低指示由多个人类膜基因之一编码的所展示的蛋白质用作抑制性共信号传导分子并抑制第二细胞系的活性，从而鉴别免疫调节剂。

在一些实施方式中，免疫调节剂选自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2组成的组。在其它实施方式中，免疫调节剂选自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6及GP1BA组成的组。在其它实施方式中，免疫调节剂选自由FLT1、SEMA6a、SEC22b及GP1BA组成的组。

在一些实施方式中，该方法是自动化的。在其它实施方式中，该方法是使用机器人进行。在一些实施方式中，该方法使用机器人液体操作技术进行。在其它实施方式中，该方法使用自动化平板操作系统进行。

在一些实施方式中，该方法进一步包括进行选自由体外功能分析、体内分析、受体阵列分析、生物信息学分析、或其组合组成的组的分析。

在一些实施方式中，体外功能分析包括培养表达多个人类膜基因之一及膜相关抗-CD3抗体或其抗原结合片段的第二细胞与初级T细胞(primary T cell)；及进行选自由细胞增殖分析、细胞凋亡分析及细胞因子释放分析组成的组的体外功能分析。在一些实施方式中，初级T细胞为人类初级CD8细胞和/或人类初级CD4细胞。

在一些实施方式中，进行受体阵列分析以鉴别免疫调节剂的相互作用蛋白。在其它实施方式中，受体阵列包含含有多个孔的固体支持结构，其中多个孔的各孔含有：用编码多个受体基因的cDNA文库以下述方式转染的细胞：允许在细胞上展示由多个受体基因之一编码的受体；含有与标签(tag)融合的免疫调节剂的重组蛋白；对该标签特异性的荧光标记的抗体；其中可检测的荧光信号为免疫调节剂与受体相互作用的指示。

在一些实施方式中，标签选自由小鼠IgG2a Fc标签、人IgG1 Fc标签、FLAG标签及6×His标签组成的组。在一些实施方式中，免疫调节剂为免疫调节剂的全长蛋白质。在其它实施方式中，免疫调节剂为免疫调节剂的胞外结构域。

在一些实施方式中，体内分析包含将免疫调节剂施用于自身免疫疾病或癌症的动物模型。在一些实施方式中，动物模型为注射人黑色素瘤细胞及肿瘤反应性T细胞的NOD-scid IL2Rγ^null小鼠模型。在其它实施方式中，动物模型为人源化小鼠模型。在再另一实施方式中，人源化小鼠模型为免疫患者来源的异种移植(免疫-PDX)模型。

本发明的一个方面提供一种在需要的受试者中治疗自身免疫疾病或癌症的方法，包含对受试者施用有效量的通过本文所述的方法鉴别的免疫调节剂，从而治疗受试者的自身免疫疾病或癌症。

在一些实施方式中，免疫调节剂选自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2组成的组。在其它实施方式中，免疫调节剂选自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6及GP1BA组成的组。

本发明的另一方面特征在于在需要的受试者中治疗自身免疫疾病或癌症的方法，包含对受试者施用有效量的通过本文所述的方法鉴别的免疫调节剂的调控因子，从而治疗受试者的自身免疫疾病或癌症。

在一些实施方式中，免疫调节剂选自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2组成的组。在其它实施方式中，免疫调节剂选自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6及GP1BA组成的组。在一些实施方式中，免疫调节剂的调控因子增高免疫调控因子的表达水平和/或活性水平。在一些实施方式中，免疫调节剂的调控因子减低免疫调控因子的表达水平和/或活性水平。

本发明通过下述的附图及详细说明举例说明，其并不限制如权利要求中所述的本发明的范围。

附图说明

图1A图示描绘基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)的基本原理。简言之，稳定地表达膜相关抗人CD3抗体ScFv(293T.2A/m.抗-CD3)的293T.2A细胞刺激Jurkat/报告细胞中的T细胞活化并产生可检测的GFP信号。来自cDNA文库的单个膜基因的转染潜在地影响T细胞活性的结果。如果分子是无效的，GFP信号将保持相似。如果分子为刺激性的，将检测到较强的GFP信号。如果分子为抑制性的，将观察到较弱的GFP信号。图1B图示描绘膜相关抗人CD3抗体ScFv的构建体，其包含CD5L基因的信号肽序列，且侧邻抗CD3ScFv和膜附着序列。图1C图示描绘GFP报导构建体，其包含T细胞相关转录因子反应元件(TFRE)，接着是最小CMV启动子及GFP报告基因。

图2A描绘使用经m.抗-CD3构建体转染的293T.2A细胞及表达GFP报告子的Jurkat细胞检测对T细胞活性刺激性的膜基因的效能。简言之，293T.2A细胞用模拟构建体(ctr)、具有或不具有其他T细胞相关膜基因(例如：B7.2、B7-H1、B7-H3及B7-H4)的m.抗-CD3质粒转染，和然后与纯化的人T细胞或PBMC共培养。48小时后，显示出胸腺嘧啶核苷掺入所指示的T细胞增殖。图2B是描绘在具有或没有m.抗-CD3质粒转染的293T.2A细胞与Jurkat/NF-KbGFP细胞共培养时，在共培养12小时后只在具有m.抗-CD3的细胞中检测到GFP信号的图像。数据获自1536成像平板。

图3是描绘由GS-TCAA鉴别的对T细胞活性具有刺激性或抑制性功能的膜基因的一系列图像。简言之，293T.2A细胞用模拟构建体(ctr)、具有或不具有其他T细胞相关膜基因的m.抗-CD3质粒转染，和然后与Jurkat/NF-Kb GFP细胞共培养。在共培养后12小时，检测到GFP信号。数据获自1536成像平板。

图4描绘由GS-TCAA鉴别的对T细胞活性具有刺激性或抑制性功能的膜基因。简言之，293T.2A细胞用模拟构建体(ctr)、具有或不具有其他T细胞相关膜基因的m.抗-CD3质粒转染，和然后与Jurkat共培养。定量IFN-γ释放。

图5是描绘GS-TCAA命中的代表性分析的图示。用对T细胞活性有刺激性功能的膜基因转染的细胞具有高于对照的GFP读数，而用对T细胞活性有抑制性功能的膜基因转染的细胞导致较低的GFP读数。

图6是通过Oncomine数据库(Oncomine，Thermo Fisher)的分析描绘在各种类型的癌症中FLT1的差异表达的图示。

图7是通过Oncomine数据库(Oncomine，Thermo Fisher)分析描绘在各种类型的癌症中SEMA6a的差异表达的图示。

图8是描绘通过Oncomine数据库(Oncomine，Thermo Fisher)分析描绘在各种类型的癌症中SEC22b的差异表达的图示。

图9是描绘通过Oncomine数据库(Oncomine，Thermo Fisher)分析描绘在各种类型的癌症中GP1BA的差异表达的图示。

具体实施方式

本发明至少部分地基于新的基因组规模T细胞活性阵列(GS-TCAA)的开发，其可用以鉴别新的免疫调节剂，例如调控T细胞的免疫调节剂。GS-TCAA允许利用新的以细胞为基础的荧光报告系统在90％以上的所有人类膜基因中研究不同的T细胞活性，诸如增殖、抑制和衰竭。此种方法提供了关于人类细胞表面分子如何调控T细胞反应的广泛了解，并辅助鉴别新的免疫调节剂。利用该GS-TCAA，可通过鉴别自身免疫疾病及癌症中存在的未知的共信号传导分子及途径来靶定、鉴别和开发其治疗。

因此，在一个实施方式中，本发明提供基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)、以及制备基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)的方法。本发明的另一实施方式包括与使用基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)鉴别免疫调节剂相关的方法。在再其它的实施方式中，本发明包括通过对受试者施用免疫调节剂和/或免疫调节剂的调控因子治疗自身免疫疾病或癌症的方法及组合物。

I.定义

为可更容易地了解本发明，首先先对某些术语加以定义。

除非本文特别限定，否则本发明所使用的相关的科学及技术术语具有本领域普通技术人员通常所知的含意。术语应有明确的意义及范围，然而，在有任何潜在的不清楚时，本文提供的定义优先于任何辞典或外部定义。

在描述本发明的上下文(特别是下述权利要求的上下文)中所使用的术语"一个"、"一种"、"该"及类似者，除非本文特别指明或明显与上下文相抵触，将理解为涵盖单数及复数(即一个或多个)。术语"包括"、"具有"、"包含"及"含有"，除非另外指明，理解为开放式术语(亦即指"包含，但但不限于")。本文所叙述的数值的范围，除非本文有特别指明，旨在以简化的方法指出所叙述的或落于该范围中的各单独的数值，且各个单独的数值是如同其被个别记载地合并在说明书中。本文所提供的范围理解为在该范围中的所有数值的简述。例如，1至50的范围理解为包含来自于由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、3334、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任意数字、数字的组合，或者来自于由10至40、20至50、5至35等组成的组的子范围。

如本文所述，术语"孔"一般是指在容器中的有界限的区域，其可为离散的(例如，用于分离的样品)或与一个或多个其他有界限区域连通(例如，用于孔中一个或多个样品之间的流体连通)。例如，生长在基质上的细胞通常包含在孔(其也可含有用于活细胞的培养基)中。基质可含有任何适当的物质，例如塑料、玻璃等。塑料通常用于体外的细胞维持和/或生长。

"多孔板"为在阵列中含有多于一个孔的基质的实例。可用于本发明中的多孔板可为多种标准形式中的任何一种(例如，具有2、4、6、24、96、384或1536等的孔的平板)，但也可为非标准形式，如在以下更详细地说明的。

如本文使用，术语"细胞"包括原核及真核细胞。在一个实施方式中，适用于本发明的阵列及方法中的细胞为细菌细胞。在另一实施方式中，适用于本发明的阵列及方法中的细胞为真菌细胞，如酵母细胞。在另一实施方式中，适用于本发明的阵列及方法中的细胞为脊椎动物细胞，例如鸟类细胞或哺乳动物细胞。在优选的实施方式中，适用于本发明的阵列及方法中的细胞为哺乳动物细胞。

如本文使用，术语"免疫细胞"包括造血起源且在免疫反应中起作用的细胞。免疫细胞包括先天性免疫系统的细胞及适应性免疫系统的细胞。免疫细胞包括，例如，淋巴细胞，如B细胞及T细胞；自然杀伤细胞；及骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。

在一个实施方式中，免疫细胞为先天性免疫系统的细胞。"先天性免疫系统"为非特异性免疫系统，其控制身体对药剂的反应直至更特异性的适应性免疫系统可以产生特异性抗体和/或T细胞(Modlin等,N.Engl.J.Med.1999,340:1834-1835)。先天性免疫系统一般包括吞噬细胞(例如，嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)；释放炎性介质的细胞(例如：嗜碱性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞)；自然杀伤细胞(NK细胞)；及树突细胞(DC)。相反，"适应性"或"获得性免疫系统"在其反应中是非常特异性的。它被称为适应性系统，因为其是在个体生存期间随着对病原体感染的适应而发生。适应性免疫可响应于疫苗(抗原)或通过施用抗体而人为地获得，或可通过感染而自然地获得。

如本文使用，"抗原呈递细胞"是指在其表面上呈现与主要组织相容性复合体(MHCs)复合的外源抗原的细胞，其然后使用其T细胞受体被T细胞识别。抗原呈递细胞包括组成型表达MHC分子的细胞(例如，B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞和朗格汉斯细胞)以及其他非组成型表达MHC分子的抗原呈递细胞(例如，角质细胞、内皮细胞、星形细胞、纤维母细胞和少突细胞)。

如本文使用，术语"T细胞"(即，T淋巴细胞)意指包括来自于哺乳动物(例如，人)的T细胞谱系中的所有细胞，包括胸腺细胞、不成熟T细胞、成熟T细胞等。T细胞包括成熟T细胞，其表达CD4或CD8(但不同时表达两者)以及T细胞受体。在本文所述的各种T细胞群体可基于其细胞因子谱及其功能定义。

如本文使用，术语"初始T细胞"包括尚未暴露于同源抗原(cognate antigen)中且因而不是活化或记忆细胞的T细胞。初始T细胞并不循环而人初始T细胞为CD45RA⁺。如果初始T细胞识别抗原并依据(但不限定于)抗原的量、施用途径及施用时机接受另外的信号，它们可增殖及分化为各T细胞亚群，例如效应T细胞。

如本文使用，术语"效应T细胞"包括起到消除抗原的功能(例如，通过产生调节其他细胞的活化的细胞因子或通过细胞毒性活性)的T细胞。术语"效应T细胞"包括T辅助细胞(例如，Th1及Th2细胞)及细胞毒性T细胞。Th1细胞介导迟发型过敏反应及巨噬细胞活化，而Th2细胞对B细胞提供辅助且在过敏反应中是关键的(Mosmann和Coffman,1989,Annu.Rev.Immunol.7,145-173；Paul和Seder,1994,Cell 76,241-251；Arthur和Mason,1986,J.Exp.Med.163,774-786；Paliard等,1988,J.Immunol.141,849-855；Finkelman等,1988,J.Immunol.141,2335-2341)。

如本文使用，术语"调节性T细胞"包括产生低水平的IL-2、IL-4、IL-5和IL-12的T细胞。调节性T细胞产生TNFα、TGFβ、IFN-γ和IL-10，虽然是以比效应T细胞低的水平。虽然TGFβ为调节性T细胞产生的主要细胞因子，但该细胞因子以比Th1或Th2细胞低的水平产生，例如低于Th1或Th2细胞1个数量级。调节性T细胞可在CD4⁺CD25⁺细胞群体中发现(参见，例如，Waldmann和Cobbold.2001.Immunity.14:399)。调节性T细胞主动地抑制Th1、Th2或在培养物中用激活信号(例如，抗原和抗原呈递细胞或在MHC的情况中用模拟抗原的信号，如抗CD3抗体加抗CD28抗体)刺激的初始T细胞的增殖及细胞因子产生。

如本文使用，术语"衰竭T细胞是指功能障碍的T细胞，其以逐步的且渐进的T细胞功能的丧失为特征并可以在反应细胞的物理删除中达到顶点。衰竭T细胞可在慢性感染或癌症期间产生。例如，衰竭在受慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染期间明确地定义且通常是在抗原持续存在的条件下发展，该条件在许多重大公共卫生关注的慢性感染(包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒及人免疫缺陷病毒感染)后发生，以及发生在肿瘤过度生长期间发生(参见，例如John Wherry,Nature Immunology 12,492-499,2011)。

如本文使用，术语"无能T细胞"是指功能上失活且即使在存在充分的共刺激下接触抗原时不能启动生产反应的T细胞(参见，例如Macián F.等,Curr Opin Immunol.2004,16(2):209-16.)。T细胞失能是其中淋巴细胞在接触抗原后本质地功能上失活，但在低反应状态下仍维持存活延长的时间段的耐受机制。同时影响CD4⁺和CD8⁺细胞两者的T细胞失能的模型落入2个大类。一类(克隆无能)主要为生长停滞状态，而另一类(适应性耐受性或体内失能)代表的增殖和效应功能的更广泛的抑制(参见，例如，Schwartz RH.Annu RevImmunol.2003；21:305-34)。

如本文使用，术语"免疫调节剂"是指使用GS-TCAA鉴别的可调控免疫系统的任何分子。例如，通过本发明的阵列和方法鉴别的免疫调节剂是调控T细胞活性的分子。例如，免疫调节剂可提高T细胞活性或可降低T细胞活性。免疫调节剂可用于治疗自身免疫疾病和/或癌症。

如本文使用，术语"免疫调节剂的调控因子"是指可如上述调控免疫调节剂的表达和/或活性的任何药剂。免疫调节剂的调控因子可提高或降低免疫调节剂的表达和/或活性。在一个实施方式中，免疫调节剂的调控因子直接作用于免疫调节剂，例如其为结合免疫调节剂并活化或者抑制其功能的抗体。免疫调节剂的调控因子也可用于治疗自身免疫疾病和/或癌症。

如本文使用，术语"培养"是指在各种类的培养基上或培养基中细胞或生物体的体外增殖。应理解，培养物中生长的细胞的后代可能与亲代细胞不完全(即，在形态上、遗传上或表型上)相同。

如本文使用，术语"相互作用"意指包括分子间的可检测相互作用，例如可利用如基于荧光的检测方法、酵母双杂交分析法、染色质免疫沉淀法或共免疫沉淀法检测。术语"相互作用"也意指包括分子之间的"结合"相互作用。相互作用可为天然的蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸。

术语"转染"在本文用于指递送核酸、蛋白质或其他大分子至目标细胞，以使得核酸、蛋白质或其他大分子在细胞中表达或者使其具有生物功能。

术语"荧光的"是指能够显现"荧光"(或"光致发光")的任何物质或试剂，其是通过分子吸收具有较短波长的光子而触发的光发射。因此荧光依赖于"激发光源"，其不同于由荧光体放射的较长波长的荧光"发射"。荧光发射的检测需要只对发射光而非激发光有反应的检测器。

Ⅱ.基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)

在一个方面中，本发明特征为基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)。本发明的阵列包含含有多个孔的固体支持结构，其中该多个孔的各孔含有第一细胞及第二细胞。该第一细胞表达膜相关的抗CD3抗体或其抗原结合片段，并用编码多个人类膜基因的cDNA文库以允许在第一细胞上展示由该多个人类膜基因之一编码的蛋白质的方式转染。第二细胞在细胞表面上表达受体，该受体与存在于第一细胞上的抗CD3抗体或其抗原结合片段相互作用，并提供初级信号以刺激第二细胞的活性。另外，第二细胞表达报告基因，其中报告基因表达水平的增高指示由转染到第一细胞中的多个人类膜基因之一编码的所展示的蛋白质用作刺激性共信号传导分子并刺激该第二细胞系的活性；且其中报告基因表达水平的减低指示由多个人类膜基因之一编码的所展示的蛋白质用作抑制性共信号传导分子并抑制该第二细胞系的活性。

本发明使用的固体支持结构可为适于容纳且能使培养的细胞生长的任意支持物。用作固体支持物的合适材料包括但不限于：塑料、玻璃、聚合物、金属等。在一个实施方式中，固体支持物为多孔板。本发明中可使用的多孔板可为多种标准形式中的任一种，例如，4孔板、6孔板、24孔板、96孔板、384孔板及1536孔板。或者，本发明使用的多孔板可为非标准形式，例如：具有至少500个孔、至少1000个孔、至少1500个孔、或至少2000个孔的多孔板。

适用于本发明的阵列中的细胞包括所有类型的真核细胞及原核细胞。在优选的实施方式中，细胞为真核细胞，特别是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，在本发明的阵列中使用的细胞为遗传工程化的细胞，例如用至少一种异源核酸序列转化的细胞。这种核酸分子可编码T细胞受体、或任何人类膜蛋白。遗传工程化的细胞可包含超过一种的异源核酸序列。本文所述的核酸序列或分子可为DNA、RNA、或者DNA或RNA的杂合体或衍生物。用于本发明的阵列中的核酸分子可包含控制核酸分子表达的调控区域(例如，转录或翻译控制区域)、全长或部分编码区域及其组合。应理解，核酸分子的任何部分可经由下述产生：(1)自其天然环境中分离该分子；(2)利用重组DNA技术(例如，PCR扩增、克隆)；或(3)利用化学合成方法。基因包括与例如天然细胞表面受体基因相关的所有核酸序列，如控制由该基因编码的细胞表面受体的产生的调控区域(例如，但不限于，转录、翻译或翻译后控制区域)，以及编码区域本身。

核酸分子可包括编码蛋白质的天然核酸分子的功能相等物或能被蛋白质结合的天然核酸序列的功能相等物。天然核酸分子的功能相等物可包括，但不限于天然的等位基因变体及修饰的核酸分子，其中核苷酸已经在这样的分子中插入、删除、取代和/或反转而对这样的序列编码的产物的功能无不利影响。在一些实施方式中，核酸编码人类膜蛋白。在一些实施方式中，核酸是报告基因。

将异源核酸分子(例如，异源细胞表面受体编码核酸分子)转化到适用于本发明的阵列中的细胞中可通过基因可借以插入细胞中的任意方法完成。转化技术包括但不限于：转染、反转录病毒感染、电穿孔法、脂质粒转染法、细菌转移及球状质体(spheroplast)融合。转化至适用于本发明的阵列中的细胞的核酸分子可保持在染色体外载体上(瞬时转染)或可整合入细胞基因组中(稳定转染)。为获得稳定的细胞系，目的基因及适当的病毒转录启动子插入如质粒或反转录病毒的适当载体中，该载体含有赋予对生长抑制化合物(例如抗生素，如新霉素)的耐受性的选择标记。DNA构建体引入细胞中，且稳定地整合入宿主细胞系的基因组中以提供稳定的细胞系，其可在工程化细胞对其有耐受性的适当抗生素的存在下选择性地培养。或者，宿主细胞的瞬时转导可适当地使用腺病毒载体进行。载体DNA分子不整合入宿主的染色质中，而以染色体外分子存在，其视细胞类型而定，具有通常24至96小时的寿命。

本发明的核酸分子在细胞中的表达可以使用本领域技术人员所知的技术完成。简言之，核酸分子以使该核酸分子操作性地连接至转录控制序列的方式插入表达载体中，从而当基因转化入宿主细胞中时，能够实现该基因的组成性的或调控的表达。如本文使用，词语"重组分子"是指操作性地连接表达载体上的至少一个转录控制序列的基因。如本文使用，词语"表达载体"是指能够转化宿主细胞、在宿主细胞内复制和影响操作性连接的基因的表达的DNA或RNA载体。表达载体视其固有特性能够复制到高或低的拷贝数。转录控制序列(其可控制所产生的蛋白质的量)包括控制转录的起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列为控制转录起始的那些，如启动子及上游激活序列。

表达系统可以使用本领域技术人员已知的方法由操作性地连接至核酸序列的任何已知的控制元件建构。参见，例如，Sambrook等,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Labs Press，其整体已并于本文中以为参考。

在优选的实施方式中，多个人类膜基因以允许这些基因表达并各别地展示在细胞表面上的方式转染至第一细胞中。为此，可使用在实施例部分中所述的优化的反向转染方案。或者，基因的表达及各别展示可以通过任何已知的基因转移技术实现，包括但并不限于：反转录病毒转导、慢病毒转导、脂质体转染及CRISPR。

在本发明的固体支持结构中的第一细胞可为本领域已知适于转染及表达人类膜基因的任何标准细胞，例如人293T细胞。或者，第一细胞为中国仓鼠卵巢(Chinese HamsterOvary,CHO)细胞。第一细胞的另一实例为COS-7细胞。在优选的实施方式中，第一细胞为表达免疫相关衔接因子的人293T.2A细胞。免疫相关衔接因子的实例包括但并不限于：DAP10、DAP12、FcRγ和CD3E。本发明的第二细胞是免疫细胞，其活性在与在第一细胞上展示的蛋白质相互作用时调节。在一些实施方式中，在本发明的阵列中的第二细胞为免疫细胞，如T细胞的。示例性的T细胞包括但并不限于：Jurkat细胞、初始T细胞、效应T细胞、衰竭T细胞、无能T细胞及调节性T细胞。或者，第二细胞可为髓源性抑制细胞。

在一些实施方式中，本发明的阵列中的第二细胞经工程化以稳定地表达细胞分析传感器(cell assay sensor)或可检测的报告子，例如表达荧光蛋白或表达酶的报告基因，从而提供细胞分析读数。在一些实施方式中，报告基因包含在含有驱动报告基因表达的诱导性转录控制元件的构建体中。在一些实施方式中，报导构建体为细胞毒性相关报导构建体。在其它实施方式中，报导构建体为细胞凋亡相关报导构建体。在再其它的实施方式中，报导构建体为增殖相关报导构建体。

报告基因技术广泛用于监测与信号传导及基因表达有关的细胞事件。在本发明的情况中，术语报告基因用以指允许检测人类膜基因对细胞(例如，T细胞)活性的效应的基因，其具有可容易地与背景区分的可方便地测定的表型。报告基因构建体包含驱动报告基因表达的诱导性转录控制元件，例如使用T细胞相关的转录反应元件以表达绿色荧光蛋白(GFP)。示例性的T细胞相关的转录反应元件包括但并不限于：NF-κB、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK和PI3K。用于本发明的阵列中的合适报告基因包括但并不限于：酶、荧光蛋白、光蛋白、融合蛋白及表位标签。酶报告基因的实例包括但并不限于：β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶、荧光素酶及硝基还原酶。荧光蛋白的实例包括但并不限于：维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(例如，青色荧光蛋白及黄色荧光蛋白)。合适的光蛋白包括但并不限于水母素(aequorin)。或者，本发明的报告基因为细胞因子基因。示例性的细胞因子基因包括但并不限于：IFN-γ、TNF-α及IL10。

可根据本发明进行的报告基因分析的一个实例使用通过引入含有编码衍生自GFP或其任意变体的荧光蛋白(如EGFP、YEP、或BFP)的核苷酸序列的核酸分子而工程化的细胞(Shaner,N.C等,Nat.Methods,2005,2(12):905-9)，该核酸分子可操作地连接表达控制序列且在其控制下，例如T细胞相关转录反应元件，包括但并不限于：NF-κB、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK及PI3K。然后监测GFP或功能性GFP类似物的荧光发射作为测定T细胞活性的手段。该方法可用于检测及比较转染至第一细胞中的膜基因对于第二细胞总体活性的效应。

本发明的阵列还包含编码多个人类膜基因的cDNA文库。产生cDNA文库的方法是本领域中熟知的。简言之，在用于构建cDNA文库的典型方法中，首先自特定细胞分离mRNA并随后在连续操作步骤中以不同的酶和碱处理。同时，载体(例如，质粒pBR322)以使得合成的cDNA可能插入的方式处理。在cDNA和预处理载体的退火后，适当的宿主(例如，大肠杆菌K12株)以载体-cDNA构建体转化，并接种在适当的基质上并孵育。以此方式所获得的转化细胞的所有集落构成cDNA文库(Gubler等,Gene,25(2-3):263-269,1983)。在一些实施方式中，多个人类膜基因包含约1,000至7,000个基因、约2,000至5,000个基因、约4,000至7,000个基因或约100至5,000个基因。例如，多个人类膜基因包含至少500、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000个人类膜基因。在一些实施方式中，多个人类膜基因包含超过6,000个人类膜基因，其涵盖全部人类膜基因的超过90％。

本发明的阵列中所使用的膜基因代表全部范围的人类膜基因组。在一些实施方式中，膜基因为受体基因。在其它实施方式中，膜基因为信号基因。在再另一实施方式中，膜基因为免疫球蛋白基因。在一些实施方式中，膜基因为转运蛋白基因。

本发明的阵列允许筛选多种T细胞活性，包括但并不限于：细胞增殖、抑制、衰竭、细胞毒性、细胞凋亡和细胞因子的释放，其在T细胞上的T细胞受体与抗原呈递细胞上的抗原/MHC复合体或模拟MHC背景中的抗原的信号(例如，抗CD3抗体)相互作用时发生。如本文使用，T细胞的"活化"是指诱导T细胞中的信号转导途径从而导致T细胞增殖、T细胞分化和/或细胞产物(例如，细胞因子)的产生。

根据本发明，如本文所述，T细胞受体(TCR)特别指T细胞的抗原受体。本领域中公认，有多种在T细胞反应中重要的由T细胞表达的其他受体，包括但并不限于：CD3、CD4、CD8、CD28、CTLA-4、CD45、CD43及Thy-1。T细胞受体可由编码T细胞受体的天然存在的基因和/或转化到细胞中的异源核酸分子的表达而产生。类似地，如本文所述的膜蛋白可由天然存在的基因的表达和/或转化到细胞中的异源核酸分子的表达而在细胞中产生。

在本发明的阵列中，第一细胞(例如，用作抗原呈递细胞的人293T.2A细胞)与第二细胞(例如，T细胞)在可保持这些细胞为存活细胞并使其与其他细胞相互作用以激活信号转导途径的条件(例如，培养基、温度、氧、CO₂、孵育时间)下一起培养。因此，细胞可在任意适当的培养基中培养，该培养基含有细胞生长所需的组分，例如碳、氮及微量营养成分。适合此类细胞的培养基及生长条件的确定是本领域技术人员所熟知的。

Ⅲ.制备基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)的方法

本发明还提供制备基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)的方法。该方法包括提供含有多个孔的固体支持结构，其中多个孔的各孔含有第一细胞及第二细胞。第一细胞经转染以稳定地表达膜相关抗CD3抗体或其抗原结合片段。第二细胞在细胞表面上表达受体，其与展示于第一细胞上的抗CD3抗体或其抗原结合片段相互作用，并提供初级信号以刺激第二细胞的活性。本发明的方法还包括在多个孔的各孔中培养表达膜相关抗CD3抗体或其抗原结合片段的第一细胞；用编码多个人类膜基因的cDNA文库以允许在第一细胞上展示由多个人类膜基因之一编码的蛋白质的方式转染第一细胞；以及在多个孔的各孔中与表达在细胞表面上的受体和报告基因的第二细胞共培养。第二细胞表达报告基因，其中报告基因的表达水平增高指示由转染至第一细胞中的多个人类膜基因之一编码的展示的蛋白质用作刺激性共信号传导分子并刺激第二细胞的活性；且其中报告基因的表达水平减低指示由多个人类膜基因之一编码的展示的蛋白质用作抑制性共信号传导分子并抑制第二细胞的活性。

本发明的方法中所使用的固体支持结构可为如上所述的适于容纳并使培养的细胞生长的任何支持物。在一个实施方式中，固体支持物为多孔板。可用于本发明中的多孔板可为多种标准形式中的任一种，例如，4孔板、6孔板、24孔板、96孔板、384孔板及1536孔板。或者，本发明中使用的多孔板可为非标准形式，例如，具有至少500个孔、至少1000个孔、至少1500个孔或至少2000个孔的多孔板。

适合本发明的方法中使用的细胞包括上述的所有类型的真核及原核细胞。在优选的实施方式中，细胞为真核细胞，特别为哺乳动物细胞。在一些实施方式中，本发明的方法中所使用的细胞为遗传工程化的细胞，例如用至少一种异源核酸序列转化的细胞。这种核酸分子可编码T细胞受体、人类膜蛋白或报告体。这种核酸分子可以通过本领域中所知的任意分子生物学技术、或上述Ⅱ部分中所述的任意方法产生。

这种异源核酸分子(例如，异源膜蛋白编码核酸分子)转化至适用于本发明的方法中的细胞中可如上所述通过使得基因可插入细胞中的任意方法完成。在优选的实施方式中，多个人类膜基因转染至第一细胞中，其方式允许这些基因表达并各别展示在细胞表面上。为此，可使用实施例部分中所述的优化的反向转染方案。或者，基因的表达和各别展示可通过任意已知的基因转移技术达成，包括但并不限于反转录病毒转导、慢病毒转导、脂质体转染及CRISPR。

本发明的固体支持结构中的第一细胞可为本领域中已知适于转染及表达人类膜基因的任意标准细胞，例如人293T细胞。或者，第一细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。第一细胞的另一实例为COS-7细胞。在优选的实施方式中，第一细胞为人293T.2A细胞，其表达免疫相关衔接因子。免疫相关衔接因子的实例包括但并不限于DAP10、DAP12、FcRγ及CD3E。本发明的第二细胞为免疫细胞，其活性在与第一细胞上所展示的蛋白质相互作用时调节。在一些实施方式中，本发明的方法中的第二细胞为免疫细胞，例如T细胞。示例性T细胞包括但并不限于Jurkat细胞、初始T细胞、效应T细胞、衰竭T细胞、无能T细胞及调节性T细胞。或者，第二细胞可为髓源性抑制细胞。

在一些实施方式中，本发明的方法中的第二细胞经工程化以稳定地表达细胞分析传感器或可检测的报告体，例如表达荧光蛋白或表达酶的报告基因，从而提供细胞分析读数。在一些实施方式中，报告基因包含在含有驱使报告基因表达的诱导性转录控制元件的报导构建体中。在一些实施方式中，报导构建体为细胞毒性相关报导构建体。在其它实施方式中，报导构建体为细胞凋亡相关报导构建体。在再其它的实施方式中，报导构建体为增殖相关报导构建体。

用于检测人类膜基因对T细胞活性的效应的报告基因可以通过本领域已知的任何标准方法产生。如上所述，报告基因构建体包含驱动报告基因表达的诱导性转录控制元件，例如使用用于表达绿色荧光蛋白(GFP)的T细胞相关转录反应元件。示例性T细胞相关转录反应元件包括但并不限于：NF-κB、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK及PI3K。本发明的适当报告体包括但并不限于：酶、荧光蛋白、光蛋白、融合蛋白及表位标签。酶报告体的实例包括但并不限于：β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶、荧光素酶及硝基还原酶。荧光蛋白的实例包括但并不限于：维多利亚多管发光水母绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(例如，青色荧光蛋白及黄色荧光蛋白)。合适的光蛋白包括但并不限于水母素。或者，本发明的报告基因为细胞因子基因。示例性细胞因子包括但并不限于：IFN-γ、TNF-α及IL10。

在本发明的方法中，第一细胞(例如，作为抗原呈递细胞的人293T.2A细胞)与第二细胞(例如，T细胞)一起培养。术语"培养"是指在各种类的培养基上或培养基中细胞或生物体的体外增殖。应理解，培养物中生长的细胞的后代可能与亲本细胞不完全相同(例如，形态上、遗传上或表型上)。细胞在其中使得这些细胞可保持为活细胞并与其他细胞相互作用以激活信号转导途径的条件(例如培养基、温度、氧、CO₂、孵育时间)下培养。因此，可将细胞培养于含有细胞生长所需的组分如碳、氮及微量营养成分的任何适当培养基中。对于这些细胞适当的培养基及生长条件的确定是本领域技术人员所熟知的。

本发明方法中所使用的细胞可在各种培养基中培养。可商购的培养基如Ham’sF10^TM(Sigma)、最低必须培养基(Minimal Essential Meduim^TM)(MEM)(Sigma)、RPMI-1640^TM(Sigma)和Dulbecco改良Eagle氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagel’s Medium^TM)(Sigma)适用于细胞培养。另外，在Ham等,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655或第5,122,469号；国际专利WO 90/03430、WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中记载的任意培养基还可用作细胞的培养基，其整体教导并于本说明书中以为参考。此类培养基的任一种视需要可补充激素和/或其他生长因子(例如，胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(例如，氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺嘌呤核苷及胸腺嘧啶核苷)、抗生素(例如，庆大霉素药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同的能量源。任何其他必须的补充剂也可以如本领域技术人员所知的适当浓度而包含在内。培养条件如温度、pH等是先前用于选择用于表达的宿主细胞的那些，且为本领域技术人员所熟知。

Ⅳ.使用基因组规模T细胞活性阵列(GS-TCAA)的筛选分析

本发明还提供鉴别免疫调节剂的方法，该免疫调节剂在治疗自身免疫疾病和/或癌症方面有潜在治疗用途。该方法包括提供Ⅱ部分中所述的基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)，从而允许在第一细胞中表达多个人类膜基因之一；共培养第一细胞与第二细胞；测定第二细胞中报告基因的表达水平；以及比较该报告基因的表达水平与对照第二细胞中的报告基因表达水平，其中该对照第二细胞与未用多个人类膜基因之一转染的对照第一细胞共培养。报告基因的表达水平增高指示由多个人类膜基因之一编码的展示的蛋白质用作刺激性共信号传导分子并刺激第二细胞系的活性；且其中报告基因的表达水平减低指示由多个人类膜基因之一编码的展示的蛋白质用作抑制性共信号传导分子并抑制第二细胞系的活性。

最佳的T细胞活化需要通过TCR/CD3复合体的抗原特异性初级信号以及涉及次级信号传导的共同信号传导两者。在一个实施方式中，通过本发明的方法所鉴别的免疫调节剂调控免疫系统，特别是T细胞活性。例如，免疫调节剂可为调控T细胞活性的共信号传导分子。在一些实施方式中，免疫调节剂激活T细胞活性。在其它实施方式中，免疫调节剂抑制T细胞活性。在再其它的实施方式中，免疫调节剂可用于治疗自身免疫疾病和/或癌症。

在一些实施方式中，免疫调节剂选自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2组成的组，其中免疫调节剂增高或促进T细胞活性。或者，免疫调节剂选自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6及GP1BA组成的组，其中免疫调节剂对T细胞活性展现抑制性的效果。在一些实施方式中，免疫调节剂选自由FLT1、SEMA6a、SEC22b及GP1BA组成的组。

本发明提供宽泛的基于细胞的筛选方法，其适用于多种药物鉴别和发现方案，优选在高通量筛选方式中。自动化的高通量筛选描述在如：Burbaum等,1997,CurrentOpinion in Chemical Biology,1:72-78和Schullek等,1997,Analyt.Biochem.246:20-29中。在一些实施方式中，本发明的方法使用机器人进行，例如机器人液体操作系统。作为非限制性实例，在根据本发明的高通量筛选中，可以通过机器人Tecan Freedom EVO200型液体操作平台进行液体操作工作。筛选所需的其他设备(例如，培养箱、平孔清洗器、平孔操作系统、平孔阅读仪)可视需要时适应于自动化功能，或作为自动化模块商购。例如，整个分析中样品的移动可使用自动化平板操作系统(Matrix PlateMate Plus，Thermo Scientific)进行。

如本文所使用的"高通量筛选"是指用于同时筛选的多种候选药剂、样品或测试化合物的分析。此类分析的实例可包括使用微量滴定孔板，其是特别方便的，因为可使用少量试剂和样品同时进行大量分析。本发明的方法可容易地以包括但并不限于96孔、384孔、1536孔形式的多孔形式实施且是自动化的。

在一些实施方式中，本发明的分析可利用显微影成像以检测光谱(例如荧光)性质的变化在细胞上进行。在其它实施方式中，分析以多孔形式进行并使用微量滴定板阅读仪测定光谱特征。适用于本发明的方法中的仪器为可商购的，例如，来自于MolecularDevices(FLEXstation^TM微量滴定板阅读仪和流体转移系统或FLIPR^TM系统)、来自于Hamamatsu(FDSS 6000)、PerkinElmer Life and Analytical Sciences(CellLux^TM)，"VIPR"电压离子探针阅读仪(voltage ion probe reader)(Aurora,Bioscience Corp，美国加州)及InCell Imager(GE Healthcare Life Sciences)。在一些实施方式中，本发明的方法中所使用的GFP检测仪为InCell Imager。在其它实施方式中，本发明的方法中的成像分析使用Cellprolifer软件进行。

具有整合的液体操作的几种商业荧光成像系统是可商购的。它们包括但并不限于Perkin Elmer CellLux-Cellular Fluorescence Workstation及Hamamatsu的FDSS6000系统。各荧光体的激发/发射特性不同，因此仪器配置为检测各分析所选定的荧光体。对于各试验适当的荧光体及检测所选定的荧光体的仪器设置的选择为本领域技术人员所熟知的。

适用于本发明的方法中的细胞成像的设置可包括使用配备有计算机系统的显微镜。该计算机可包含用以接收用户的指令的适当软件，该指令是用户输入的一组参数字段的形式，或预先编程的指令的形式，例如预先编程用于各种不同的特定操作。软件任选地转换这些指令为用于控制系统部件的操作(例如，控制液体操作单元、机器人单元和/或激光器)的适当语言。计算机还可接收来自系统的其他部件(例如，检测器)的数据，并可翻译该数据，以人类可读的形式将其提供给用户，或依照使用者的任何规划，利用该数据启动另外的操作。这种设置的一个实例，来自Carl Zeiss的ATTO’s Attofluor^TMRatioVision^TM实时数字荧光分析仪，是用于分析活细胞和制备的样品中的荧光探针的完全集成的工作站(ATTO,Rockville,Md.)。

在根据本发明的方法及阵列鉴别出潜在的治疗性免疫调节剂之后，可继续进行体外功能分析和体内小鼠模型分析用于验证。在一些实施方式中，本发明的方法包括与选自由体外功能分析、体内分析、受体阵列分析、生物信息学分析或其组合的分析结合进行基因组规模的T细胞活性阵列。

适用于本发明的方法中的体外功能分析包括本领域中所知的任意标准T细胞分析，包括但并不限于：增殖分析、凋亡分析或细胞因子(例如，IFN-g、IL-2或IL-10)释放分析。在一些实施方式中，体外功能分析包括与初级T细胞培养表达多个人类膜基因之一和膜相关抗CD3抗体或其抗原结合片段的第二细胞，以及进行T细胞分析。适用于本发明的方法中的初级T细胞包括任意类型的初级细胞。示例性的初级细胞包括但并不限于人初级CD8细胞或人初级CD4细胞。

本发明的方法可与受体阵列技术组合进行。受体阵列分析技术为用于筛选目标蛋白的对应受体(counter-receptor)的完备的技术(Zhu Y等,Nat Commun,4:2043,2013；YaoS等,Immunity,34(5):729-740,2011)。简言之，受体阵列包含含有多个孔的固体支持结构，其中多个孔的各孔包含用编码受体蛋白的基因转染的细胞。目标基因(编码分泌蛋白)或目标基因的胞外结构域(编码跨膜蛋白，例如，免疫调节剂)是与标签基因(小鼠IgG2a Fc、人IgG1 Fc、FLAG或6xHIS)遗传融合，以制备如前所述的融合基因(Chapoval,AI.等,MolBiotechnol 21(3):259-264,2002)。在单个融合基因转染到293T细胞中之后，使用纯化的重组融合蛋白针对受体阵列进行筛选。针对标签的荧光标记的第二抗体应用于检测目标蛋白(例如根据本发明的方法鉴别的免疫调节剂)与转染的293T细胞的结合，并使用AppliedBiosystems 8200细胞检测系统进行筛选和通过CDS 8200软件进行分析。前述参考文献的整体内容并于本说明书中作为参考。

通过本发明的方法鉴别的免疫调节剂的治疗潜能可进一步体内测试，例如在免疫疾病或癌症的动物模型中。在一些实施方式中，体内分析包括将免疫调节剂施用于免疫疾病或癌症的动物模型。本发明的方法中适用的免疫疾病或癌症的动物模型包括本领域所知的任何类型的自身免疫疾病或癌症的动物模型，例如，注射有人黑色素瘤细胞和肿瘤反应性T细胞的NOD-scid IL2Rγ^null小鼠模型。在其它实施方式中，动物模型为小鼠模型。或者，动物模型为大鼠模型、兔模型或猴模型。在其它实施方式中，动物模型为人源化小鼠模型，例如免疫患者来源的异种移植(免疫PDX)模型。

本发明的方法还可与生物信息学分析结合进行。生物信息学方法可用以缩减与自身免疫疾病或癌症相关的基因。选择多个严格标准以鉴别在疾病进展期间显著变化且为疾病病因的潜在特征基因的基因。在一个实施方式中，建立分级系统以鉴别只在特定的自身免疫疾病或癌症中受到调控的特定基因。或者，可以选择在不同的自身免疫疾病或癌症中共有的基因。为此，可使用在实施例部分中所述的特定的选择标准。

Ⅴ.治疗的方法

在一个方面中，本发明提供在需要的受试者中治疗自身免疫疾病或癌症的方法。该方法包括对需要的受试者施用有效量的通过本发明的筛选方法所鉴别的免疫调节剂，如前所述，从而治疗受试者的自身免疫疾病或癌症。在其它实施方式中，对需要的受试者施用有效量的通过本发明的筛选方法所鉴别的免疫调节剂的调控因子，从而治疗受试者的自身免疫疾病或癌症。

在一些实施方式中，免疫调节剂选自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2组成的组。在其它实施方式中，免疫调节剂选自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6及GP1BA组成的组。

适用于本发明的方法中的免疫调节剂的调控因子包括可调控上述免疫调节剂的表达和/或活性水平的任意药剂。在一些实施方式中，免疫调节剂的调控因子增高免疫调控因子的表达水平和/或活性水平。在一些实施方式中，免疫调节剂的调控因子减低免疫调控因子的表达水平和/或活性水平。在一个实施方式中，免疫调节剂的调控因子结合至免疫调节剂，并激活或者抑制其功能。免疫调节剂的调控因子的实例包括但并不限于对免疫调节剂特异性的抗体或其抗原结合片段；对免疫调节剂特异性的小分子；和/或特异性地结合免疫调节剂的适体。在一些实施方式中，免疫调节剂的调控因子可用于治疗自身免疫疾病和/或癌症。

根据本发明的方法鉴别的免疫调节剂和/或该免疫调节剂的调控因子可以通过任意适当的方式施用，包括肠胃外施用(例如，注射、输注)，且可以皮下、腹膜内、肺内和鼻内施用，且如果需要局部治疗时，通过病灶内施用。肠胃外输注包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮内或皮下施用。另外，根据本发明的方法鉴别的免疫调节剂和/或该免疫调节剂的调控因子还适合地通过脉冲式输注(pulse infusion)施用，特别是利用递减的剂量。剂量可通过注射给予，例如静脉内或皮下注射。施用途径可根据各种因素选择，例如施用为短期的或长期的。还考虑其他的施用方法，包括局部，特别是经皮、经黏膜、直肠、口服或局部施用，例如经由接近预定部位设置的导管。注射，特别是静脉内注射，是感兴趣的。

在一些实施方式中，该方法包括施用治疗有效量的本文所述免疫调节剂于受试者。在一些实施方式中，该方法包括施用治疗有效量的免疫调节剂的调控因子于受试者。免疫调节剂或免疫调节剂的调控因子的治疗有效剂量为足以治疗受试者的疾病的量。如本文所述的免疫调节剂和/或免疫调节剂的调控因子的治疗有效剂量因受试者不同而稍变化，且取决于如受试者的年龄、体重和状况以及递送途径的因子。这样的剂量可依据本领域技术人员所知的过程确定。

可以用本发明的方法治疗的疾病包括但并不限于自身免疫疾病或癌症。"治疗"是指可给予患者益处的任何类型的治疗，例如患有疾病或有发生疾病的风险的患者。治疗包含为改善患者的状况(例如缓解一种或多种症状)、推迟疾病的发作或发展的目的而采取或避免采取的行动。

如本文所述，"自身免疫疾病"是指起因为身体对抗正常存在于体内的物质或组织的不正常的免疫反应的疾病，且包括但并不限于：类风湿性关节炎(RA)、青少年慢性关节炎(JCA)、甲状腺炎、移植物抗宿主病(GVHD)、硬皮症、糖尿病、格雷夫斯病、过敏症、与同种异体移植相关的急性或慢性免疫疾病，同种异体移植例如但不限于：肾脏移植、心脏移植、骨髓移植、肝脏移植、胰脏移植、小肠移植、肺脏移植及皮肤移植。

如本文所述，术语"癌症"是指由不受控的、异常的细胞生长所引起的一类疾病之一，该细胞可扩散至邻接组织或身体的其他部分。癌细胞可形成实体肿瘤，其中癌细胞聚集在一起，或作为离散的细胞存在，如在白血病中。适合于通过本发明的方法治疗的癌症的类型包括但并不限于肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、巨淋巴结增生症、子宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、肠胃道癌、肾脏癌、咽喉和下咽癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤的淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生不良综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体肿瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(waldenstrom's macroglobulinemia)和维尔姆氏瘤(wilms tumor)。

药物制剂

包含根据本发明的方法所鉴别的免疫调节剂和/或本发明的免疫调节剂的调控因子的药物制剂可以通过将具有所需纯度水平的蛋白质或核酸与任选的生理上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington药剂科学,第16版,Osol,A.编辑(1980年))混合来制备用于储存，其为水溶液、冷冻干燥或其他干燥制剂的形式。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂为在使用的剂量和浓度下对接受者无毒的，且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、组胺酸及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶蛋白或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如Tween^TM、Pluronics^TM或聚乙二醇(PEG)。

如所治疗的特定适应症所需的，本文的制剂还可含有超过一种活性化合物。例如，如果治疗自身免疫疾病，含免疫调节剂或免疫调控因子的调控因子的本发明制剂可与已知治疗自身免疫疾病的药物组合，如甲基强的松龙、丙酮化去炎松(kenalog)、美卓乐(medrol)、泼尼松龙、考的索(cortef)、氢化可的松(hydrocortisone)、可的松(cortisone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、倍他米松磷酸酯钠(celestonesoluspan)、乙酸甲泼尼皮(methylprednisolone acetate)、泼尼松龙口崩片(orapredODT)、泼尼松龙钠磷酸盐(veripred 20)、甲强龙(solu-medrol)或甲泼尼皮钠(methylprednisolone sodium)。如果治疗癌症，含免疫调节剂或免疫调控因子的调控因子的本发明制剂可与已知治疗癌症的药物组合，如醋酸阿比特龙(Abiraterone Acetate)、必除癌(ABITREXATE)(甲氨蝶呤(Methotrexate))、埃布尔杉(ABRAXANE)(白蛋白稳定的纳米颗粒紫杉醇制剂)、雅诗力(ADCETRIS)(Brentuximab Vedotin)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-Trastuzumab Emtansine)、亚德里亚霉素(ADRIAMYCIN)(盐酸多柔比星)、ADRUCIL(氟尿嘧啶(Fluorouracil))、马来酸阿法替尼(Afatinib Dimaleate)、癌伏妥(AFINITOR)(依维莫司)、乐得美(ALDARA)(咪喹莫特(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、爱宁达(ALIMTA)(培美曲塞二钠)、阿乐喜(ALOXI)(盐酸帕洛诺司琼)、瘤可宁(AMBOCHLORIN)(苯丁酸氮芥)、瘤可宁(AMBOCLORIN)(苯丁酸氮芥)、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿可达(AREDIA)(帕米磷酸二钠)、安美达锭(ARIMIDEX)(阿那曲唑)、阿诺新(AROMASIN)(依西美坦)、奈拉滨(ARRANON)(Nelarabine)、三氧化二砷、亚舍拉(ARZERRA)(奥法木单抗)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)天冬酰胺酶、阿瓦斯丁(AVASTIN)(贝伐单抗)、阿西替尼(Axitinib)、阿扎胞苷、盐酸苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀(Bexarotene)、百克沙(BEXXAR)(托西莫单抗和I¹³¹碘托西莫单抗复方制剂)、博来霉素、硼替佐米、伯舒替尼(BOSULIF)(博舒替尼(Bosutinib))、卡巴他赛(Cabazitaxel)、苹果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate)、坎帕斯(CAMPATH)(阿仑单抗)、抗癌妥(CAMPTOSAR)(盐酸伊立替康)、卡培他滨、卡铂、卡非佐米(Carfilzomib)、治先优(CEENU)(洛莫司汀)、红比霉素(CERUBIDINE)(盐酸柔红霉素)、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、CLAFEN(环磷酰胺)、氯法拉滨(Clofarabine)、卡博替尼(COMETRIQ)(苹果酸卡博替尼)、可美净(COSMEGEN)(更生霉素)、克唑替尼(Crizotinib)、环磷酰胺、好克癌(CYFOS)(异环磷酰胺)、阿糖胞苷、达拉菲尼、达卡巴嗪、达克金(DACOGEN)(地西他滨)、放线菌素D、达沙替尼、盐酸柔红霉素、地西他滨、地加瑞克(Degarelix)、地尼白介素-2(Denileukin Diftitox)、地诺单抗(Denosumab)、盐酸右雷佐生(Dexrazoxane Hydrochloride)、多西他赛、盐酸阿霉素、艾欣宜肤涤(EFUDEX)(氟尿嘧啶)、埃立特(ELITEK)(拉布立酶(Rasburicase))、表阿霉素(ELLENCE)(盐酸表柔比星)、益乐铂(ELOXATIN)(奥沙利铂)、艾曲波帕(Eltrombopag Olamine)、止敏吐(EMEND)(阿瑞匹坦(Aprepitant))、恩杂鲁胺(Enzalutamide)、盐酸表柔比星、爱必妥(ERBITUX)(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林(Eribulin Mesylate)、爱维德(ERIVEDGE)(维莫德吉(Vismodegib))、盐酸厄洛替尼、门冬酰胺酶(ERWINAZE)(菊欧文氏菌天门冬酰胺酶)、依托泊苷、依维莫司、易维特(EVISTA)(盐酸雷洛昔芬)、依西美坦、法乐通(FARESTON)(托瑞米芬)、法洛德(FASLODEX)(氟维司群)、复乳纳(FEMARA)(来曲唑)、非格司亭、福达华(FLUDARA)(磷酸氟达拉滨)、氟达拉滨氟磷酸酯、FLUOROPLEX(氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶、亚叶酸(Folinic acid)、服瘤停(FOLOTYN)(普拉曲沙(Pralatrexate))、氟维司群、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab Ozogamicin)、健择(GEMZAR)(盐酸吉西他滨)、妥复克(GILOTRIF)(二马来酸阿法替尼(Afatinib Dimaleate))、格列卫(GLEEVEC)(甲磺酸伊马替尼)、贺乐维(HALAVEN)(甲磺酸艾日布林)、赫赛汀(HERCEPTIN)(曲妥珠单抗)、癌康定(HYCAMTIN)(盐酸拓扑替康)、替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、普纳替尼(ICLUSIG)(盐酸普纳替尼(Ponatinib Hydrochloride))、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、咪喹莫特、抑癌特(INLYTA)(阿西替尼)、因治隆(INTRON A)(重组干扰素α-2b)、碘131托西莫单抗与托西莫单抗、伊匹单抗(Ipilimumab)、易瑞莎(IRESSA)(吉非替尼)、盐酸伊立替康、ISTODAX(罗米地辛(Romidepsin))、伊沙匹隆(Ixabepilone)、捷可卫(JAKAFI)(磷酸鲁索替尼)、去癌达(JEVTANA)(卡巴他塞(Cabazitaxel))、卡塞罗(Kadcyla)(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、雷洛西芬盐酸盐(KEOXIFENE)(盐酸雷洛西芬)、KEPIVANCE(帕利夫明(Palifermin))、KYPROLIS(卡非佐米(Carfilzomib))、二甲苯磺酸拉帕替尼(LapatinibDitosylate)、来那度胺、来曲唑、亚叶酸钙、乙酸亮丙瑞林、洛莫司汀、利普安(LUPRON)(乙酸亮丙瑞林)、马奇波(MARQIBO)(硫酸长春新碱脂质体)、丙卡巴肼(MATULANE)(盐酸甲基苄肼)、盐酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)、梅格施(MEGACE)(醋酸甲地孕酮)、乙酸甲地孕酮、MEKINIST(曲美替尼(Trametinib))、巯基嘌呤、美司钠、METHAZOLASTONE(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、丝裂霉素、MOZOBIL(普乐沙福(Plerixafor))、MUSTARGEN(盐酸氮芥)、密吐霉素(MUTAMYCIN)(丝裂霉素C)、MYLOSAR(阿扎胞苷)、麦罗塔(MYLOTARG)(吉妥珠单抗奥唑米星)、纳米颗粒紫杉醇(白蛋白稳定的纳米颗粒紫杉醇制剂)、诺维本(NAVELBINE)(酒石酸长春瑞滨)、奈拉滨、NEOSAR(环磷酰胺)、优保津(NEUPOGEN)(非格司亭)、蕾莎瓦(NEXAVAR)(甲苯磺酸索拉非尼)、尼罗替尼(Nilotinib)、诺瓦得士(NOLVADEX)(柠檬酸他莫昔芬)、恩沛板(NPLATE)(罗米司亭)、奥法木单抗、高三尖杉酯碱(Omacetaxine Mepesuccinate)、加帕酶(ONCASPAR)(培门冬酶)、ONTAK(地尼白介素(Denileukin Diftitox))、奥沙利铂、紫杉醇(Paclitaxel)、白蛋白稳定的纳米颗粒紫杉醇剂、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、帕米磷酸二钠、帕尼单抗、盐酸帕唑帕尼(Pazopanib Hydrochloride)、培门冬酶(Pegaspargase)、聚乙二醇干扰素α-2b、派乐能(PEG-INTRON)(聚乙二醇干扰素α-2b)、培美曲塞二钠、帕妥珠单抗、铂帝尔(PLATINOL)(顺铂)、铂帝尔-AQ(PLATINOL-AQ)(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、铂美特(POMALYST)(泊马度胺)、盐酸普纳替尼、普拉曲沙、泼尼松、盐酸甲基苄肼、普留净(PROLEUKIN)(阿地白介素)、普罗利亚(PROLIA)(地诺单抗)、PROMACTA(艾曲波帕(Eltrombopag Olamine))、普罗文奇(PROVENGE)(西普鲁塞(Sipuleucel)-T)、补利血素(PURINETHOL)(巯基嘌呤)、二氯化镭-223、盐酸雷洛昔芬、拉布立酶(Rasburicas)、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼(Regorafenib)、瑞复美(REVLIMID)(来那度胺)、RHEUMATREX(甲氨蝶呤)、利妥昔单抗、罗米地辛、罗米司亭、红比霉素(RUBIDOMYCIN)(盐酸多柔比星)、磷酸鲁索替尼、前列腺癌疫苗(西普鲁塞-T)、甲苯磺酸索拉非尼、柏莱(SPRYCEL)(达沙替尼)、瑞格非尼(STIVARGA)(瑞戈非尼)、舒尼替尼苹果酸盐、索坦(SUTENT)(苹果酸舒尼替尼)、SYLATRON(聚乙二醇干扰素α-2b)、昔诺韦(SYNOVIR)(沙利度胺)、SYNRIBO(高三尖杉酯碱)、泰伏乐(TAFINLAR)(达拉菲尼)、柠檬酸他莫昔芬、TARABINE PFS(阿糖胞苷)、特罗凯(TARCEVA)(盐酸埃罗替尼)、TARGRETIN(蓓萨罗丁)、泰息安(TASIGNA)(尼罗替尼)、泰素(TAXOL)(紫杉醇(Paclitaxel))、泰素帝(TAXOTERE)(多西他赛)、帝盟多(TEMODAR)(替莫唑胺)、替莫唑胺、替西罗莫司(Temsirolimus)、沙利度胺、TOPOSAR(依托泊苷)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、特癌适(TORISEL)(替西罗莫司)、托西莫单抗和I¹³¹碘托西莫单抗、TOTECT)(盐酸右雷佐生)、曲美替尼(Trametinib)、曲妥珠单抗、苯达莫司汀(TREANDA)(盐酸苯达莫司汀)、TRISENOX(三氧化二砷)、泰嘉锭(TYKERB)(拉帕替尼二甲苯磺酸盐)、凡德他尼、维克替比(vectibix)(帕尼单抗)、VelP、敏毕瘤(VELBAN)(硫酸长春花碱)、万珂(VELCADE)(硼替佐米)、VELSAR(硫酸长春碱)、维罗非尼、凡毕士(VEPESID)(依托泊苷)、VIADUR(乙酸亮丙瑞林)、委丹扎(VIDAZA)(阿扎胞苷)、硫酸长春花碱、硫酸长春新碱、酒石酸长春瑞滨、维莫德吉(Vismodegib)、VORAXAZE(谷卡匹酶(Glucarpidase))、伏立诺他、福退癌(VOTRIENT)(盐酸帕唑帕尼)、瘤可维(WELLCOVORIN)(亚叶酸钙)、截克瘤(XALKORI)(克唑替尼)、希罗达(XELODA)(卡培他滨)、癌骨瓦(XGEVA)(地诺塞麦)、镭治骨(XOFIGO)(二氯化镭²²³)、安可坦(XTANDI)(恩杂鲁胺)、益伏(YERVOY)(伊匹单抗)、柔癌捕(ZALTRAP)(阿柏西普(Ziv-Aflibercept))、泽波拉夫(ZELBORAF)(维罗非尼)、泽娃灵(ZEVALIN)(替伊莫单抗)、右丙亚胺(ZINECARD)(盐酸右雷佐生)、阿柏西普、唑来膦酸、容立莎(ZOLINZA)(伏立诺他)、择泰(ZOMETA)(唑来膦酸)和泽珂(ZYTIGA)(醋酸阿比特龙)。

活性成分还可包装在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，分别羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗乳液中。此类技术还公开在Remington’s Pharmaceutical Science,第16版,Osol,A.编辑(1980年)中。

用于体内施用的制剂必须为无菌的。这可容易地通过无菌的过滤膜过滤来达成。

一般而言，组合物的成分可单独供应或者一起混合在单位剂型中，例如作为在标示活性药剂量的密封容器如安瓿或小袋中的冷冻干燥的干燥粉末或无水浓缩物。在施用方式为输注时，组合物可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。在施用方式为注射时，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿以使成分可于施用前混合。在替代实施方式中，一种或多种的本发明的药物组合物以液体形式在标示药剂量及浓度的密封容器中提供。

可将活性剂并入适于肠胃外施用的药物组合物中，通常制备成可注射溶液。可注射溶液可以由在燧石或棕色小瓶、安瓿或预充注射器中的液体或冷冻干燥的剂型构成。液体或冷冻干燥的剂量可进一步包含缓冲剂(例如，L-组氨酸、琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾、氯化钠)、防冻剂(例如，蔗糖、海藻糖或乳糖)、膨胀剂(例如，甘露糖醇)、稳定剂(例如，L-甲硫氨酸、甘氨酸、精氨酸)、佐剂(透明质酸酶)。

本发明的组合物可呈各种形式。其中包括，例如，液体、半固体及固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射或可输注溶液)、微乳液、分散液、脂质体或悬浮液、处剂、丸剂、粉剂、脂质体及栓剂。优选的形式取决于施用方式及治疗用途。通常的施用方式包括肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)注射或口服施用。

包含本文所述的免疫调节剂或免疫调节剂的调控因子的药物组合物可配制用于施用至特定组织。例如，在一些实施方式中，可能希望将免疫调节剂或免疫调节剂的调控因子施用至各种器官的结缔组织和/或肿瘤部位。

在一个实施方式中，本文所述的治疗方法实施于人体上。在其它实施方式中，本文所述的方法不实施于小鼠或其它非人动物上。

以下实施例将更进一步说明本发明，其不意图以任何方式限制本发明。整个本申请中所引用的所有参考文献、专利及公开的专利申请的全部内容以及附图均并入本文以资参考。

实施例

实施例1.基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)的构建

为实施用于未来免疫疗法的靶标的全人类基因组检索，开发了基因组规模的T细胞活性阵列。使用Qiagen miniprep试剂盒制备覆盖90％的人类膜基因组的6402个人类膜cDNA，并定量和稀释用于构建GS-TCAA。

最佳的T细胞活化需要经由TCR/CD3复合体的抗原特异性初级信号和涉及次级信号传导的共同信号传导两者。为建立功能性T细胞分析，设计出刺激基线T细胞活化的基于293T细胞的人工抗原呈递细胞系，并使用荧光报告体作为T细胞活性的指示剂(图1A)。具体地，293T.2A细胞用于活性阵列。这些293T.2A细胞是工程化的293T细胞，其表达主要免疫相关衔接因子(DAP10/DAP12/FcRγ/CD3E)用于免疫相关膜基因的最佳表达。另外，293T.2A细胞进一步工程化以表达膜相关抗CD3抗体ScFv，其是连接在CD14GPI锚的OKT-3单株抗体的膜形式scfv(图1B)。这些293T.2A/m.抗CD3细胞同时作为抗原呈递细胞和表达个别膜基因的细胞。

含有在GFP报告体控制下的T细胞相关的转录因子反应元件(TFRE)(例如，NF-kb、NF-AT、AP-1或EGR2)的几个构建体设计用于此分析，且用作T细胞活性的指示剂(图1C)。例如，获得稳定地表达NF-KB-GFP的Jurkat细胞。这些细胞在与293T.2A细胞共培养时不产生可见的GFP信号。然而，在与表达膜抗-CD3抗体和免疫相关膜基因的293T.2A细胞共培养过夜后，观察到显著的GFP信号(图2A及2B)。除Jurkat细胞系外，还包括初级免疫细胞，包括初始或效应T细胞、衰竭、无能T细胞或Treg。

活性阵列的读出包括增殖相关报告体，包括细胞因子(IFN-γ、TNF-α或IL-10)和T细胞细胞毒性或细胞凋亡的基于荧光的信号检测。对于增殖分析，293T.2A/m.抗CD3细胞正好在T细胞共培养之前照射(10,000拉德)。经过约72小时后，1μL的CCK-8试剂(Dojindo)加载到平板的各孔中，然后进行2小时孵育，之后通过Envision平板阅读仪(Perkin Elmer)读取450nm的吸光度读数。对于细胞毒性分析，使用稳定地表达RFP的293T.2A/m.抗-CD3。简言之，GS-TCAA平板中的基因质粒反向转染至携带RFP的293T.2A/m.抗-CD3细胞中。在24小时后，平板中添加IncuCyte^TMKinetic Caspase-3/7细胞凋亡分析试剂(Essen Bioscience)加OKT3预活化或allo-PBMC活化的人PBMC。在共培养后的不同时间点的RFP及GFP信号通过InCell分析仪(GE)检测。对于T细胞凋亡分析，OKT3预活化或allo-PBMC活化的人PBMC用cellTrace紫染料(Thermo Fisher)标记，并在加载至平板中之前与IncuCyte^TMKineticCaspase-3/7细胞凋亡分析试剂(Essen Bioscience)混合。共培养后不同时间点的RFP和GFP信号以及Celltrace的紫信号通过InCell分析仪(GE)于检测。T细胞细胞毒性按照(％RFP+GFP+细胞/RFP+细胞)计算，且T细胞凋亡按照(％Celltrace紫+GFP+细胞/Celltrace紫+细胞)计算。

实施例2.基因组规模T细胞活性阵列的检测及筛选

为优化T细胞活性阵列的筛选系统，测试了1536孔板中293T.2A/m.抗-CD3细胞的转染效率，并确定在这些2细胞共培养系统中T细胞活性所需的最佳条件。此外，还使用inCell成像系统的GFP检测也针对活性阵列优化。

使用对于自动平板操作系统(Matrix PlateMate Plus，Thermo Scientific)优化的方案将基因克隆转移至Greiner 1536孔成像板中。各GS-TCAA集包含4个1536孔成像板。对于阵列筛选，使用优化的反向转染方案，以使得这些基因单独地展示在293T.2A/m.抗-CD3细胞的细胞表面上。cDNA文库质粒单独地微量制备，然后在OptiMEM中稀释(4μg/mL)并转移至384深孔板(VWR)中，各孔中有200μL质粒溶液。通过机器人液体操作系统(PlateMate，Thermo Scientific)将含各种基因的4个384孔板中的2μL质粒溶液转移至浅底1536孔板(Greiner)的各孔中以产生受体阵列平板。全人膜受体阵列包含4个1536孔板。除非特别指明，这些1536孔板进一步铝箔包覆并保存在-80℃下用于后续实验。

对于基因组规模的T细胞活性阵列的设置，将含4个1536孔板的一组人受体阵列由-80℃下取出，并放入温箱中直至溶液完全解冻。阵列板离心(600g，2分钟)，之后反向转染。简言之，1536孔的阵列板通过机器人分配器(Multidrop Combi，Thermo Scientific)分配每孔2μL的含lipofectamine 3000(7μLlipo/mL)的optiMEM，并通过超高速旋转振荡机快速振荡1分钟。所有平板储存在室温下20分钟，之后通过Multidrop加入293T.2A/m.抗-CD3细胞用于T细胞刺激(每孔4μL中的2000细胞)。其后，平板再次离心(1000g，4分钟)以去除在各孔中的气泡，然后于37℃下孵育。在转染24小时后，T细胞报告体细胞或初级T细胞(4000细胞)，如具有不同GFP报告体的工程化Jurkat细胞系，加载到阵列板中。在T细胞与基于293T的T细胞刺激体共培养后12小时，通过InCell图像分析仪(GE)进行平板成像。在使用Cellprofiler软件进行最佳成像分析之后，鉴别具有潜在调控功能的候选基因。例如，如果分子对T细胞活性的调节并非有效的，则GFP信号保持相似。如果分子用作T细胞活性的刺激性信号，则将检测到相对较强的GFP信号。或者，如果分子为抑制性的，将观察到弱得多的GFP信号。如图3所示，293T.2A/m.抗-CD3细胞单独刺激T细胞活化，并产生可检测的GFP信号(其可作为基线信号)。B7.1、B7.2、OX40L或4-1BBL的表达增高荧光信号，表明它们各起到T细胞活性的刺激性信号的作用。相反地，以B7-H1或B7-H4转染293T.2A/m.抗-CD3细胞导致减低的荧光信号，表明这些分子抑制T细胞活性。

或者，特定细胞因子的释放可用作报告体，并作为T细胞活性的指示剂。对于细胞因子检测，在共培养后24和48小时收集上清液并通过ELISA(eBoscience)定量。如图4所示，GJB1及FOLH1的表达刺激T细胞释放IFN-γ，而FLT1、SEMA6a、SEC22b及GP1BA的表达减少IFN-γ的释放。

对于阵列筛选，各T细胞报告体细胞以三重平板筛选，并计算各基因的平均值和依据阵列中GFP阳性目标的强度分级。用对Jurkat T细胞活性具有刺激性功能的膜基因转染的细胞具有比对照高的GFP读数，而用对T细胞活性具有抑制性功能的膜基因转染的细胞导致较低的GFP读数。所有GFP信号进行标准化并通过CellProfiler软件(Broad Institute)以各孔中的GFP阳性目标和总GFP强度两者进行定量。如图5所示，鉴别出数种对T细胞活性具有刺激性和抑制性功能的基因。来自这些GS-TCAA筛选的具有抑制性功能的在前候选者，如FLT1、SEMA6a、SEC22b和GP1Ba，汇集在一起以进一步验证。

实施例3.具有治疗癌症/自身免疫疾病潜能的新免疫调控基因的验证

为进一步验证从GS-TCAA研究所获得的候选基因的功能，进行初级人T细胞的体外功能分析。此外，使用生物信息学方式缩减与自身免疫疾病和/或癌症相关的基因。数种在前候选基因还在受体阵列系统中针对可能的对应受体鉴别进行筛选，并选择用于进行体内研究以在人源化小鼠疾病模型(包括人源化小鼠PDX模型)中测试对于癌症/自身免疫疾病的治疗潜能。

体外T细胞功能分析

经GS-TCAA分析鉴别的在前候选基因使用初级T细胞通过体外功能分析加以验证。293T.2A/m.抗-CD3细胞用候选基因转染，并与人初级CD8或CD4细胞共培养。如上所述，进行T细胞增殖、凋亡和细胞因子(例如，IFN-γ、IL-2或IL-10)释放的分析。

受体阵列技术(RAT)

为筛选未知的对应受体，根据之前所述(Zhu Y等,Nat Commun,4:2043,2013、YaoS等,Immunity,34(5):729-740,2011)进行受体阵列技术。简言之，目标基因(编码分泌蛋白质)或目标基因的胞外结构域(编码跨膜蛋白)与标签基因(小鼠IgG2a Fc、人IgG1 Fc、FLAG或6xHIS)遗传融合以制备如之前所述的融合基因(Chapoval,AI.等,Mol Biotechnol 21(3):259-264,2002)。在将单个融合基因转染于293T细胞中之后，纯化的重组融合蛋白用于针对受体阵列进行筛选。针对标签的荧光标记的第二抗体用于检测目标蛋白与转染的293T细胞的结合，并使用Applied Biosystems 8200细胞检测系统进行筛选和通过CDS 8200软件分析。

基于细胞的分析筛选大约90％的所有人类膜cDNA，其允许使用受体阵列的大规模筛选及筛选T细胞相关表面-分子相互作用。建立了用于基于细胞的高通量筛选的强力且稳定的系统，且用于超高通量受体-配体筛选的这一新型系统的开发利用机器人扩展并将受体阵列由原来的384孔板形式升级为1,536孔板形式。

利用自动化的Tecan Freedom EVO 200液体操作平台，在筛选1,536孔板形式时实现了试剂使用的4至5倍降低及更高的灵敏度。转染程序被优化并证明通过以1,536孔板形式用5ng的单个质粒和阳离子脂质体(lipofectamine)的混合物转染而实现所需蛋白质的高表达水平。典型地，在转染12小时后，各孔中50至70％的293T细胞表达所转染的质粒。当新质粒并入系统中时，质量控制实验通过在随机选定的具有特定单克隆抗体的孔中检测其表达而进行。这种优化和升级减少操作时间且在时间、成本及劳力上增高总体筛选4倍的筛选效率。

因此，通过使用受体阵列技术，得以鉴别通过T细胞活性阵列选择的候选基因的相互作用蛋白。相互作用蛋白的鉴别提供关于所鉴别的候选基因的免疫功能的进一步了解且有助于选择用于体内研究的候选者以在小鼠肿瘤模型中测试治疗潜能。

人类癌症的小鼠体内模型

产生对于在前的验证目标或在前候选者的重组蛋白特异性的抗体以在癌症模型中测试其治疗潜能。624人黑色素瘤(GP100⁺HLA^-A2⁺)细胞及肿瘤反应性T细胞注射于NOD-scid IL2Rγ^null小鼠中。这些小鼠接受几轮候选基因和/或候选基因的抗体的处理，并仔细监测肿瘤生长及在肿瘤部位的免疫细胞情况或效应子功能。

患者来源的异种移植物(PDX)

肿瘤微环境(TME)的异质性在从癌症患者收集的治疗前及治疗中肿瘤样本中与免疫组织化学分析(IHC)、多重免疫荧光(multiplex-IF)和质谱(CyTOF)分析结合来检验。这些技术的组合可用作鉴别人TME中的机制相互作用的工具。具体地，检验TME的免疫成分的差异，并比较在基线及在获得抵抗力时的样品。人源化的小鼠模型，称为免疫患者来源的异种移植(免疫-PDX)模型，被开发并可与这些分析平行地用于研究人TME。这些研究对于揭示疾病微环境中的反应、抗性和获得抵抗力的机制而言为必要的，其最终依据微环境的特定抗性机制而提供生物标志物开发及额外疗法的基础。

生物信息学方法

利用生物信息学方法缩减与自身免疫疾病和癌症相关的基因。选择多种严格标准以鉴别在疾病进展期间显著变化且对于疾病发生为潜在特征基因的基因。

在GS-TCAA及潜在候选基因的进一步功能验证后，设置分级系统以鉴别只在特定自身免疫疾病或癌症中调控的特定基因。或者，可选择在不同的自身免疫疾病或癌症中共同的基因。

例如，选择只编码跨膜和分泌蛋白质的基因，主要是由于这些分子易于用治疗性抗体或重组蛋白进一步操作。另外，这一选择允许使用GS-TCAA和受体阵列技术的组合以鉴别对应受体和功能。第二个标准是选择超过一种疾病共有的那些基因。使用其中上调基因存在于所关注的各目标疾病中时记入1点的分级系统。较高的数值表示基因是不同疾病所共有的。这显示不同的自身免疫疾病或癌症类型共同的基础机制。

依据选择标准来选择单独地与单一疾病相关的基因以鉴别特别地与一种特定疾病相关但不与其他自身免疫疾病或癌症类型相关的基因。然后，以至少2倍改变为截止值选择在特定疾病中上调或下调的基因。这主要是由于统计学的考虑。鉴别了具有可能与特定免疫功能相关的特定蛋白质结构域的基因列表，例如Ig超家族分子。在最初以这些标准鉴别特定基因后，使用受体阵列技术进行对这些目标的对应受体筛选，且免疫相关的功能研究确定这些分子及其对应受体是否为免疫调节的潜在靶标。

鉴别在自身免疫疾病中和在癌症微环境中上调的基因及蛋白质。使用大数据库，例如，NCBI、Oncomine、TCGA癌症数据库、耶鲁内部癌症数据库(Yale internal cancerdatabases)及人类蛋白质图谱(human protein Atlas)，还鉴别多种疾病中共有的差异表达的基因。然后，使用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)，鉴别与免疫系统、细胞因子/趋化因子信号传导、或干扰素信号传导及抗原呈递路径相关的基因，这些在自身免疫疾病和癌症的发生及发展上发挥关键作用。最后，依照其亚细胞定位将上调的、共有的疾病基因分类，并关注膜蛋白，因为它们更容易被治疗剂达到。对于某些基因，进行分析以确定跨膜基因是否为已知影响自身免疫疾病和癌症的免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，包括FcR样基因、HLA相关基因和共刺激分子(CD86、B7-H1，亦称CD274和CTLA4)。

为鉴别在自身免疫疾病中及在癌症微环境中下调的基因及蛋白质，通过使用公开和可访问的数据库的生物信息学分析采用类似的途径以鉴别在各种疾病中共有的基因。

从GS-TCAA筛选鉴别的对T细胞活性有抑制性功能的候选者，例如，FLT1、SEMA6a、SEC22b和GP1Ba，进一步分析其在各种类型的癌症中的表达水平。如图6至9所示，FLT1、SEMA6a、SEC22b和GP1Ba显示在不同类型的癌症中差异地调控。例如，SEC22b的表达在多种癌症(例如，肾癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、结肠直肠癌及肾上腺癌)中上调，而SEC22b特别地在肺癌中下调(图8)。这一生物信息学分析进一步证实GS-TCAA在鉴别免疫调节剂中的重要性，并显示这些免疫调节剂可用作治疗癌症和/或自身免疫疾病的潜在治疗靶标。

等同

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方式的多种等同。此类等同旨在包含于以下权利要求中。本申请全文中引用的所有参考文献、专利及公开的专利申请的内容并入本文中以资参考。

Claims (59)

1.一种基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)，包含：

含有多个孔的固体支持结构，其中所述多个孔的各孔含有：

第一细胞，其表达膜相关的抗CD3抗体或其抗原结合片段，其中所述第一细胞用编码多个人类膜基因的cDNA文库以允许在所述第一细胞中展示由所述多个人类膜基因之一编码的蛋白质的方式转染；

第二细胞，其表达细胞表面上的受体和报告基因；

其中所述受体与所述抗CD3抗体或其抗原结合片段之间的相互作用提供初级信号并刺激所述第二细胞系的活性；以及

其中所述报告基因的表达水平增高指示由所述多个人类膜基因之一编码的所述展示的蛋白质用作刺激性共信号传导分子并刺激所述第二细胞系的活性；且其中所述报告基因的表达水平减低指示由所述多个人类膜基因之一编码的所述展示的蛋白质用作抑制性共信号传导分子并抑制所述第二细胞系的活性。

2.如权利要求1所述的阵列，其中所述固体支持结构为多孔板。

3.如权利要求2所述的阵列，其中该多孔板选自由96孔板、384孔板和1536孔板组成的组。

4.如权利要求1所述的阵列，其中所述第一细胞为人293T细胞。

5.如权利要求1所述的阵列，其中所述第一细胞为人293T.2A细胞，其表达免疫相关衔接因子。

6.如权利要求5所述的阵列，其中所述免疫相关衔接因子选自由DAP10、DAP12、FcRγ和CD3E组成的组。

7.如权利要求1所述的阵列，其中所述第二细胞为免疫细胞。

8.如权利要求7所述的阵列，其中所述免疫细胞为髓源性抑制细胞(MDSC)。

9.如权利要求7所述的阵列，其中所述免疫细胞为T细胞。

10.如权利要求9所述的阵列，其中所述T细胞选自由Jurkat细胞、初始T细胞、效应T细胞、衰竭T细胞、无能T细胞和调节性T细胞组成的组。

11.如权利要求1所述的阵列，其中所述报告基因包含于选自由细胞毒性相关报导构建体、细胞凋亡相关报导构建体和增殖相关报导构建体组成的组的DNA构建体中。

12.如权利要求11所述的阵列，其中所述细胞毒性相关报导构建体为基于荧光的报导构建体。

13.如权利要求11所述的阵列，其中所述细胞凋亡相关报导构建体为基于荧光的报导构建体。

14.如权利要求12或13所述的阵列，其中所述基于荧光的报导构建体包含T细胞相关转录反应元件，其后有最小CMV启动子和GFP报告基因。

15.如权利要求14所述的阵列，其中T细胞相关转录反应元件选自由NF-kb、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK、及PI3K组成的组。

16.如权利要求11所述的阵列，其中所述增殖相关报导构建体中的报告基因为细胞因子基因。

17.如权利要求16所述的阵列，其中所述细胞因子选自由IFN-γ、TNF-α和IL-10组成的组。

18.如权利要求1所述的阵列，其中所述多个人类膜基因包括选自受体基因、免疫球蛋白基因、转运蛋白基因和信号基因的基因。

19.如权利要求1所述的阵列，其中所述多个人类膜基因包含1,000至7,000个基因。

20.如权利要求1所述的阵列，其中所述多个人类膜基因包含2,000至5,000个基因。

21.如权利要求1所述的阵列，其中所述多个人类膜基因包含4,000至7,000个基因。

22.如权利要求1所述的阵列，其中所述第二细胞的所述活性选自由细胞增殖、细胞抑制、细胞衰竭、细胞凋亡和细胞的细胞因子释放组成的组。

23.一种制备基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)的方法，该方法包括：

提供含有多个孔的固体支持结构；

在所述多个孔的各孔中培养表达膜相关的抗CD3抗体或其抗原结合片段的第一细胞；

用编码多个人类膜基因的cDNA文库以允许在所述第一细胞上展示由所述多个人类膜基因之一编码的蛋白质的方式转染所述第一细胞；和

在所述多个孔的各孔中共培养表达细胞表面上的受体和报告基因的第二细胞，从而制备基因组规模的T细胞活性阵列，

其中所述受体与所述抗CD3抗体或其抗原结合片段之间的相互作用提供初级信号并刺激所述第二细胞系的活性；以及

其中所述报告基因的表达水平增高指示由所述多个人类膜基因之一编码的所述展示的蛋白质用作刺激性共信号传导分子并刺激所述第二细胞系的活性；和其中所述报告基因的表达水平减低指示由所述多个人类膜基因之一编码的所述展示的蛋白质用作抑制性共信号传导分子并抑制所述第二细胞系的活性。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述固体支持结构为多孔板。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述多孔板选自由96孔板、384孔板和1536孔板组成的组。

26.如权利要求23所述的方法，其中所述第一细胞为人293T细胞。

27.如权利要求23所述的方法，其中所述第一细胞为人293T.2A细胞，其表达免疫相关衔接因子。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述免疫相关衔接因子选自由DAP10、DAP12、FcRγ和CD3E组成的组。

29.如权利要求23所述的方法，其中所述第二细胞为免疫细胞。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述免疫细胞为髓源性抑制细胞(MDSC)。

31.如权利要求29所述的方法，其中所述免疫细胞为T细胞。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述T细胞选自由Jurkat细胞、初始T细胞、效应T细胞、衰竭T细胞、无能T细胞及调节性T细胞组成的组。

33.如权利要求23所述的方法，其中所述报告基因包含于选自由细胞毒性相关报导构建体、细胞凋亡相关报导构建体和增殖相关报导构建体组成的组的DNA构建体中。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞毒性相关报导构建体为基于荧光的报导构建体。

35.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞凋亡相关报导构建体是基于荧光的报导构建体。

36.如权利要求34或35所述的阵列，其中所述基于荧光的报导构建体包含T细胞相关转录反应元件，其后有最小CMV启动子和GFP报告基因。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述T细胞相关转录反应元件选自由NF-κB、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK和PI3K组成的组。

38.如权利要求33所述的方法，其中所述增殖相关报导构建体中的报告基因为细胞因子基因。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述细胞因子选自由IFN-γ、TNF-α和IL-10组成的组。

40.一种鉴别免疫调节剂的方法，所述方法包括：

提供如权利要求1所述的基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)；

使在所述第一细胞中表达所述多个人类膜基因之一；

共培养所述第一细胞与所述第二细胞；

检测所述第二细胞中所述报告基因的表达水平；以及

比较所述报告基因的表达水平与对照第二细胞中所述报告基因的表达水平，其中所述对照第二细胞与未用所述多个人类膜基因之一转染的对照第一细胞共培养；

其中所述报告基因的表达水平增高指示由所述多个人类膜基因之一编码的所述展示的蛋白质用作刺激性共信号传导分子并刺激所述第二细胞系的活性；且其中所述报告基因的表达水平减低指示由所述多个人类膜基因之一编码的所述展示的蛋白质用作抑制性共信号传导分子并抑制所述第二细胞系的活性，从而鉴别所述免疫调节剂。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述免疫调节剂选自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL和B7.2组成的组。

42.如权利要求40所述的方法，其中所述免疫调节剂选自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6和GP1BA组成的组。

43.如权利要求40所述的方法，其中所述免疫调节剂选自由FLT1、SEMA6a、SEC22b和GP1BA组成的组。

44.如权利要求40所述的方法，其中所述方法是自动化的。

45.如权利要求40所述的方法，其中所述方法使用机器人进行。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述方法使用机器人液体操作技术进行。

47.如权利要求45所述的方法，其中所述方法使用自动化平板操作系统进行。

48.如权利要求40所述的方法，进一步包括进行选自由下列组成的组的分析：体外功能分析、体内分析、受体阵列分析、生物信息学分析或其组合。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述体外功能分析包括：

与初级T细胞一起培养表达所述多个人类膜基因之一和所述膜相关抗-CD3抗体或其抗原结合片段的第二细胞；以及

进行选自由增殖分析、细胞凋亡分析及细胞因子释放分析组成的组的体外功能分析。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述初级T细胞为人初级CD8细胞及/或人初级CD4细胞。

51.如权利要求48所述的方法，其中进行所述受体阵列分析以鉴别所述免疫调节剂的相互作用蛋白质。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述受体阵列包含：

含有多个孔的固体支持结构，其中所述多个孔的各孔含有：

用编码多个受体基因的cDNA文库以允许在所述细胞上展示由所述多个受体基因之一编码的受体的方式转染的细胞；

含有与标签融合的免疫调节剂的重组蛋白；

对所述标签特异性的荧光标记的抗体；

其中可检测的荧光信号为所述免疫调节剂与所述受体相互作用的指示。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述标签选自由IgG2a Fc标签、人IgG1 Fc标签、FLAG标签和6×His标签组成的组。

54.如权利要求52所述的方法，其中所述免疫调节剂为所述免疫调节剂的全长蛋白质。

55.如权利要求52所述的方法，其中所述免疫调节剂为所述免疫调节剂的胞外结构域。

56.如权利要求48所述的方法，其中所述体内分析包括对自身免疫疾病或癌症的动物模型施用所述免疫调节剂。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述动物模型为注射人黑色素瘤细胞和肿瘤反应性T细胞的NOD-scidIL2Rγ^null小鼠模型。

58.如权利要求56所述的方法，其中所述动物模型为人源化小鼠模型。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述人源化小鼠模型为免疫患者来源的异种移植(免疫-PDX)模型。

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