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CN117321417A - 确定治疗性细胞组合物的效力的方法 - Google Patents

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CN117321417A
CN117321417A CN202280036193.9A CN202280036193A CN117321417A CN 117321417 A CN117321417 A CN 117321417A CN 202280036193 A CN202280036193 A CN 202280036193A CN 117321417 A CN117321417 A CN 117321417A
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Juno Therapeutics Inc
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Abstract

本公开文本涉及确定与细胞疗法结合的治疗性细胞组合物的效力的方法。所述治疗性细胞组合物的细胞可以表达重组受体或其他转基因受体，所述重组受体如嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，所述其他转基因受体如T细胞受体(TCR)。所述方法提供了用于鉴定包括相对效力在内的治疗性细胞组合物的效力的测定。

Description

确定治疗性细胞组合物的效力的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月22日提交的美国临时申请63/164,527的优先权，将所述临时申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2022年3月21日创建的名为73504_2023040_SEQLIST.TXT的文件提供，其大小为84,579字节。将电子格式的序列表的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本涉及确定用于与细胞疗法结合使用的治疗性细胞组合物的效力的方法。所述治疗性细胞组合物的细胞可以表达重组受体或其他转基因受体，所述重组受体如嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，所述其他转基因受体如T细胞受体(TCR)。所述方法提供了用于确定包括相对效力在内的治疗性细胞组合物的效力的测定。
背景技术
多种免疫疗法和/或细胞疗法可用于治疗疾病和病症。例如，过继细胞疗法(包括涉及施用表达对目的疾病或障碍具有特异性的嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))和/或其他重组抗原受体的细胞的那些过继细胞疗法，以及其他过继免疫细胞疗法和过继T细胞疗法)在癌症或者其他疾病或障碍的治疗中可以是有益的。需要用于表征有效的治疗性细胞组合物(如与离体产生组合物的方法结合)以及用细胞疗法治疗受试者的改进的方法。本文提供了解决此类需要的方法。
发明内容
本文提供了一种确定治疗性细胞组合物的效力的方法，所述方法包括进行多个孵育，所述多个孵育中的每一个包括将治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂一起培养，所述治疗性组合物包含经工程化以表达重组受体的细胞，其中所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合刺激所述细胞的重组受体依赖性活性；并且所述多个孵育中的每一个包括不同逐步调整比率的所述治疗性细胞组合物的细胞与所述重组受体刺激剂；测量来自所述多个孵育中的每一个的重组受体依赖性活性；以及基于从所述多个孵育中的每一个测量的所述重组受体依赖性活性，确定导致特定重组受体依赖性活性，例如半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率。在一些任何所提供的实施方案中，所述方法进一步包括通过将导致所述治疗性细胞组合物的特定受体依赖性活性(例如，半最大重组受体依赖性活性)的逐步调整比率与导致参考标准品的特定受体依赖性活性(例如，半最大重组受体依赖性活性)的逐步调整比率进行比较来确定所述治疗性细胞组合物的相对效力。
本文还提供了一种确定治疗性细胞组合物的效力的方法，所述方法包括进行多个孵育，所述多个孵育中的每一个包括将治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂一起培养，所述治疗性组合物包含经工程化以表达重组受体的细胞，其中：所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合刺激所述细胞的重组受体依赖性活性；并且所述多个孵育中的每一个包括不同逐步调整比率的所述治疗性细胞组合物的细胞与所述重组受体刺激剂；测量来自所述多个孵育中的每一个的重组受体依赖性活性；以及通过将所述治疗性细胞组合物的特定重组受体依赖性活性(例如，所述治疗性细胞组合物的半最大重组受体依赖性活性)与参考标准品的特定重组受体依赖性活性(例如，半最大重组受体依赖性活性)进行比较来确定所述治疗性细胞组合物的相对效力。
在一些任何所提供的实施方案中，所述多个孵育中的每一个包括将所述治疗性组合物的恒定数量的细胞与不同量的所述重组受体刺激剂一起培养以生成多个不同的逐步调整比率。在一些任何所提供的实施方案中，所述多个孵育中的每一个包括将恒定量的结合分子(例如，重组受体刺激剂)与所述治疗性组合物的不同数量的细胞一起培养以生成多个不同的逐步调整比率。
在一些任何所提供的实施方案中，对两种或更多种，任选地3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种治疗性细胞组合物进行所述多个孵育。在一些任何所提供的实施方案中，所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自包含相同的重组受体。在一些任何所提供的实施方案中，所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自包含不同的重组受体。在一些任何所提供的实施方案中，所述两种或更多种治疗性细胞组合物中的至少一种包含与其他治疗性组合物不同的重组受体。
在一些任何所提供的实施方案中，所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自使用相同的制造过程来制造。在一些任何所提供的实施方案中，所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自使用不同的制造过程来制造。在一些任何所提供的实施方案中，所述两种或更多种治疗性细胞组合物中的至少一种使用与用于制造其他治疗性细胞组合物的制造过程不同的制造过程来制造。
在一些任何所提供的实施方案中，所述两种或更多种治疗性细胞组合物由来自单个受试者的细胞产生。在一些任何所提供的实施方案中，所述两种或更多种治疗性细胞组合物由来自不同受试者的细胞产生。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者是健康受试者或患有疾病或病症的受试者。
在一些任何所提供的实施方案中，所述不同受试者中的每一个患有相同的疾病或病症。在一些任何所提供的实施方案中，所述不同受试者中的每一个将要用相同的治疗性细胞组合物治疗以治疗所述受试者的疾病或病症。
在一些任何所提供的实施方案中，所述多个孵育是至少三个孵育。在一些任何所提供的实施方案中，所述多个孵育是至少五个孵育。在一些任何所提供的实施方案中，所述多个孵育是至少七个孵育。在一些任何所提供的实施方案中，所述多个孵育是至少十个孵育。
在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体依赖性活性包括以下中的一种或多种：细胞因子表达、细胞溶解活性、受体上调、受体下调、增殖、基因上调、基因下调或细胞健康。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞因子表达或产生。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞因子表达或产生，其中所述细胞因子是TNF-α、IFN-γ(IFNg)或IL-2。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞溶解活性。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体依赖性活性包括或者是受体下调。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体依赖性活性包括或者是增殖。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体依赖性活性包括或者是基因上调。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体依赖性活性包括或者是基因下调。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞健康。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞健康，其中所述细胞健康包括细胞死亡、细胞直径、活细胞浓度和细胞计数中的一种或多种。
在一些任何所提供的实施方案中，将在所述多个孵育中的每一个测量的所述重组受体依赖性活性相对于针对所述治疗性细胞组合物测量的最大受体依赖性活性归一化。
在一些任何所提供的实施方案中，所述参考标准品是包含导致特定(例如，半最大)重组受体依赖性活性的经验证的逐步调整比率的治疗性细胞组合物、可商购获得的治疗性细胞组合物、使用与用于制造所述治疗性细胞组合物的制造过程相同的制造过程制造的治疗性细胞组合物、使用与用于制造所述治疗性细胞组合物的制造过程不同的制造过程制造的治疗性细胞组合物、包含与所述治疗性细胞组合物相同的重组受体的治疗性细胞组合物、包含与所述治疗性细胞组合物不同的重组受体的治疗性细胞组合物、从相同受试者制造的治疗性细胞组合物、或从不同受试者制造的治疗性细胞组合物。
在一些任何所提供的实施方案中，所述参考标准品是所述两种或更多种治疗性组合物中的一种。
在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体刺激剂包括所述重组受体的靶抗原或其胞外结构域结合部分，任选地重组抗原。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体刺激剂包括所述抗原的胞外结构域结合部分，并且所述胞外结构域结合部分包含由所述重组受体识别的表位。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体刺激剂包括对所述重组受体的胞外结构域(例如，胞外结构域上的表位)具有特异性的抗体。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体刺激剂是对所述重组受体的胞外抗原结合结构域具有特异性的抗独特型抗体。
在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体刺激剂固定或附接至固体支持物上。在一些任何所提供的实施方案中，所述固体支持物是器皿的表面，任选地是微孔板的孔，在其中进行所述多个孵育。在一些任何所提供的实施方案中，所述固体支持物是珠。
在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体刺激剂是抗原表达细胞，任选地其中所述细胞是克隆、来自细胞系的细胞、或取自受试者的原代细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述抗原表达细胞是细胞系。在一些任何所提供的实施方案中，所述细胞系是肿瘤细胞系。在一些任何所提供的实施方案中，所述抗原表达细胞是已经任选地通过转导被引入以表达所述重组受体的抗原的细胞。
在一些任何所提供的实施方案中，所述逐步调整比率达到所述参考标准品的重组受体依赖性活性的线性剂量反应范围。在一些任何所提供的实施方案中，所述逐步调整比率包括所述参考标准品的较低渐近线(最小)重组受体依赖性活性和较高渐近线(最大)重组受体依赖性活性。
在一些任何所提供的实施方案中，所述治疗性细胞组合物包含从生物样品富集或纯化的单细胞亚型或任选地通过混合从生物样品富集或纯化的细胞亚型获得的混合细胞亚型群体。在一些任何所提供的实施方案中，所述生物样品包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单个核细胞(PBMC)样品、未分级细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
在一些任何所提供的实施方案中，所述治疗性细胞组合物包含原代细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述治疗性细胞组合物包含来自待治疗的受试者的自体细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述治疗性细胞组合物包含同种异体细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述治疗性细胞组合物包含CD3+、CD4+和/或CD8+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述治疗性细胞组合物包含或者是CD4+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述治疗性细胞组合物包含或者是CD8+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些任何所提供的实施方案中，所述治疗性细胞组合物包含CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在一些任何所提供的实施方案中，所述多个孵育在烧瓶、管或多孔板中进行。在一些任何所提供的实施方案中，所述多个孵育各自在多孔板的孔中单独进行。在一些任何所提供的实施方案中，所述多孔板是96孔板、48孔板、12孔板或6孔板。
在一些任何所提供的实施方案中，所述方法进一步包括基于导致特定(例如，半最大)重组受体依赖性活性的逐步调整比率，确定用于向有需要的受试者施用的所述治疗性组合物的细胞的剂量。在一些任何所提供的实施方案中，所述方法进一步包括基于所述相对效力，确定用于向有需要的受试者施用的所述治疗性组合物的细胞的剂量。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有疾病或病症。在一些任何所提供的实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
在一些任何所提供的实施方案中，所述方法进一步包括基于所述相对效力，确定产生最佳治疗性细胞组合物效力的制造过程，其中所述最佳治疗性细胞组合物效力与完全和/或持久反应和/或降低的毒性相关。
在一些任何所提供的实施方案中，所述方法进一步包括基于所述相对效力，确定产生具有降低的或低的效力差异的治疗性细胞组合物的制造过程，其中所述降低的或低的差异是与不同制造过程中的差异进行比较来确定的。
附图说明
图1A-图1B示出了三种不同供体在不同靶标与效应细胞比率(T:E)下的细胞因子分泌反应曲线。图1A示出了原始值细胞因子分泌曲线，以及图1B示出了通过较高渐近线(Vmax)归一化的相同分泌曲线。
具体实施方式
本文提供了用于评估或确定用于包括工程化T细胞疗法在内的细胞疗法的治疗性细胞组合物(例如，治疗性细胞组合物)的效力的方法，如用于与监测用于产生细胞疗法和用于确定治疗疾病和病症(包括各种癌症)的剂量的离体过程结合使用。所提供的实施方案涉及含有工程化T细胞的治疗性T细胞组合物，所述工程化T细胞如经工程化以表达重组蛋白如表达重组受体的那些，所述重组受体被设计用于识别和/或特异性结合与所述疾病或病症相关的分子并在与此类分子结合后引起应答，如针对此类分子的免疫应答。受体可包括嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)；和其他转基因抗原受体，包括转基因T细胞受体(TCR)。
本发明确定治疗性细胞组合物的效力的方法典型地使用对治疗性细胞组合物的工程化细胞的最大抗原刺激。例如，各种现有方法测量细胞的抗原特异性活性，例如在最大刺激后治疗性细胞组合物的细胞因子表达、受体上调或下调。然后比较所有测试的治疗性细胞组合物的所测量的响应于刺激的活性，以确定哪种治疗性细胞组合物具有最大活性，例如重组受体依赖性活性。具有最高活性的治疗性细胞组合物可以被认为是最有效的治疗性细胞组合物。
在许多情况下，使用饱和水平的抗原可能不是生理上相关的。此外，使用饱和水平的抗原不能捕获治疗性细胞组合物对重组受体刺激的敏感性。例如，目前的测定不能区分重组受体对引发可检测活性应答所需的刺激(例如，抗原的量或浓度)的敏感性。最大抗原刺激也不允许阐明重组受体对不同刺激的活性，例如重组受体依赖性活性。简言之，目前评估治疗性细胞组合物的效力的方法提供了治疗性细胞组合物效力的一维视图，并且进一步缺乏建立可以捕获治疗性细胞组合物的敏感性(例如，行为、活性)的量度的能力。
本文提供的方法被设计为更全面地评估治疗性细胞组合物的敏感性(例如，行为、活性)。本文提供的方法被设计为提供治疗性细胞组合物效力的更生物学上相关的量度。在一些实施方案中，根据本文所述的方法确定的治疗性细胞组合物的效力可以与治疗性细胞组合物的安全性和功效更紧密地相关。在一些实施方案中，根据本文所述的方法确定的治疗性细胞组合物的效力可以提供改进的制造控制和/或可变性的量度，这进而可以允许所制造的治疗性细胞组合物的稳定性和活性(例如，重组受体依赖性活性)的改进的评估。
所提供的方法涉及用于比较治疗性细胞组合物如何响应于抗原的直接方式。与比较针对单个靶抗原刺激(在许多情况下是最大可能刺激)的活性的现有方法不同，所提供的方法逐步调整靶标(例如，抗原或抗体表达细胞)与效应细胞(治疗性组合物的细胞)的比率。例如，可以通过在测定中保持恒定数量的效应细胞并通过改变靶标表达细胞的数量来控制此比率。例如，通过所提供的方法，可以确定达到特定受体依赖性活性所需的靶标表达细胞的数量和/或靶标(例如，抗原或抗体)的量。在一些实施方案中，靶标是重组受体的抗原。因此，在一些情况下，靶标表达细胞是抗原表达细胞。在一些实施方案中，特定受体依赖性活性是最大活性的50％。在一些实施方案中，特定受体依赖性活性是最大受体依赖性活性的10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或90％。在一些实施方案中，特定受体依赖性活性是如本文所公开的范围。在一些实施方案中，所提供的方法允许比较治疗性细胞组合物。例如，治疗性细胞组合物可以通过本文提供的方法和例如如本文所述确定的相对效力来评估。
重要的是，不了解是否有可能比较不同治疗性细胞组合物之间的活性。特别地，比较治疗性细胞组合物的能力是未知的，因为人们认为治疗性细胞组合物具有不同的敏感性特征(例如，对重组受体特异性刺激的应答)，例如不同的最小和最大应答。如由于以下方面的差异，因此影响治疗性细胞组合物的变量比其他药物产品(如生物制剂)大得多：从中衍生或获得细胞的供体、细胞(如分化状态)、特定重组受体(例如，CAR)的抗原结合能力、特定重组受体的细胞内信号传导组分、表达重组受体(例如，CAR)的组合物中细胞的百分比或频率、用于产生治疗性组合物的过程以及其他因素。例如，如图1A所示，来自不同供体的治疗性组合物展现出对抗原刺激的不同应答，如反应曲线所示。因此，此结果将表明，比较治疗性细胞组合物可能是不可能做到的。本文发现，通过将活性相对于反应曲线的较高渐近线(例如，最大刺激)归一化，可以比较治疗性细胞组合物的敏感性。所提供的方法使得测量不同细胞产物之间的敏感性成为可能，所述不同细胞产物包括可能变化的那些，如由于通过不同方法产生、表达不同抗原受体、从不同供体产生和其他变量而变化。现有方法评估最大刺激下的活性，部分原因是它被认为是解释潜在差异的唯一方法。
在一些实施方案中，本文提供的方法减少或消除可变性的来源。例如，本文提供的方法对于可能由于供体异质性和/或每天采样或测试而出现的可变性是稳健的。在一些情况下，消除可变性(如由于供体异质性和/或采样或测试引起的可变性)允许比较治疗性细胞组合物。
本文提供的方法包括测定形式，所述测定形式包括一系列孵育，其中培养不同逐步调整比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。在所提供的方面，重组受体刺激剂是通过重组受体的细胞内信号传导区域诱导或能够诱导信号的药剂。例如，重组受体刺激剂可以包括重组受体的抗原，如纯化的抗原或重组抗原、抗原表达细胞或对重组受体的胞外抗原结合结构域(例如scFv)具有特异性的抗独特型抗体。在一些实施方案中，本文提供的方法(包括测定形式)被设计为通过测量或确定刺激治疗性细胞组合物的工程化细胞的重组受体依赖性活性所需的重组受体刺激剂(例如如在第I-B节中所述)的量或浓度来测量治疗性细胞组合物的敏感性。例如，本文提供的方法可以确定用于刺激治疗性细胞组合物的可定量和可检测活性(例如，重组受体依赖性活性)的抗原的水平(例如，量、浓度)。在一些实施方案中，敏感性的测量包括通过重组受体刺激剂与重组受体跨多个逐步调整比率的结合刺激的重组受体依赖性活性的测量。所述方法评估不同逐步调整比率下重组受体依赖性活性的能力允许确定、估计和/或外推治疗性细胞组合物针对重组受体特异性刺激的一般活性或行为。
本文提供的方法包括这样的测定，所述测定允许通过测量在一系列受控孵育中表达重组受体(例如，本文所述的重组受体)的治疗性细胞组合物的细胞响应于重组受体的刺激的活性来评估治疗性细胞组合物的效力。例如，一系列孵育可以包括将表达重组受体的治疗性细胞组合物的工程化细胞与重组受体刺激剂(例如如本文(例如，第I-B节)所述)(当与重组受体结合时，其刺激由细胞表达的重组受体的活性，例如重组受体依赖性活性)以不同的逐步调整比率一起培养，其中每个孵育是不同的逐步调整比率。在一些实施方案中，进行为或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个孵育，每个孵育含有不同比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。在一些实施方案中，进行为或至少3个孵育，每个孵育含有不同逐步调整比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。在一些实施方案中，进行为或至少6个孵育，每个孵育含有不同逐步调整比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。在一些实施方案中，进行为或至少10个孵育，每个孵育含有不同逐步调整比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。
在一些实施方案中，将治疗性组合物的恒定数量的细胞与不同量的重组受体刺激剂一起培养以生成一系列(例如，多个)不同的逐步调整比率。可替代地，在一些实施方案中，可以将恒定量或浓度的重组受体刺激剂(例如，如在第I-B节中所述)与治疗性细胞组合物的不同数量的细胞一起孵育，以生成一系列(例如，多个)不同的逐步调整比率。不论如何实现不同的逐步调整比率(例如，通过改变治疗性细胞组合物的细胞总数量或重组受体刺激剂的量)，使用一系列(例如，多个)逐步调整比率允许跨一定范围的刺激条件评估重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，测量范围可用于提取、估计和/或确定特定治疗性细胞组合物的工程化细胞如何响应于不同水平的重组受体刺激。
可以从根据本文所述的方法产生的所测量的重组受体依赖性活性确定、提取、外推、估计和/或推断任何数量的量度。量度的非限制性例子包括逐步调整比率(在所述逐步调整比率下发生最大、最小和半最大(50％)重组受体依赖性活性)、逐步调整比率(在所述逐步调整比率下发生最大重组受体依赖性活性的特定百分比(例如，10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或90％))、以及涵盖一定范围的重组受体依赖性活性(例如，最大重组受体依赖性活性的10％-90％、20％-80％、30％-70％、40％-60％)的逐步调整比率。在一些实施方案中，对所测量的治疗性细胞组合物的重组受体依赖性活性进行曲线拟合以生成重组受体依赖性活性曲线。在一些实施方案中，曲线类似于剂量反应曲线。在一些实施方案中，从曲线外推和/或估计重组受体依赖性活性的量度和/或如下比率，在所述比率下发生特定重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性曲线可用于外推治疗性细胞组合物和/或重组受体刺激剂的如下值或量度，在所述值或量度下发生特定重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，例如当治疗性细胞组合物细胞计数保持恒定并且重组受体刺激剂的量变化时，使用重组受体刺激剂的量(例如，在纯化的或重组靶标的情况下的质量(以皮克计)或在靶标表达细胞的情况下的细胞数量)或浓度(例如，在纯化的或重组靶标的情况下以质量/体积计(例如，以pg/ml计)或在靶标表达细胞的情况下每单位体积的细胞数量(例如，个细胞/mL))来确定如下最大值、最小值、半最大值和范围，在所述最大值、最小值、半最大值和范围下发生重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，例如当治疗性细胞组合物细胞计数变化并且重组受体刺激剂的量保持恒定时，使用治疗性细胞组合物的细胞数量(例如，计数、总数)来确定如下最大值、最小值、半最大值和范围，在所述最大值、最小值、半最大值和范围下发生重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，使用一个或多个来确定如下逐步调整比率最大值、最小值、半最大值和范围，在所述最大值、最小值、半最大值和范围下发生重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，使用重组受体刺激剂的量或浓度来确定半最大重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，使用治疗性细胞组合物的细胞的量(例如，计数)来确定半最大重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，使用逐步调整比率来确定半最大重组受体依赖性活性。这些示例性量度以及未列出的其他量度提供了治疗性细胞组合物的定量描述，其可用于确定治疗性细胞组合物的效力和/或相对效力(例如，相对于如本文(例如，第I-D节)所述的参考标准品的效力)。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力表示为基于重组受体依赖性活性确定的逐步调整比率的值或量度、治疗性细胞组合物的细胞的量和/或重组受体刺激剂的量或浓度。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力是如下逐步调整比率的值或量度、治疗性细胞组合物的细胞的量和/或重组受体刺激剂的量或浓度，在所述逐步调整比率的值或量度、治疗性细胞组合物的细胞的量和/或重组受体刺激剂的量或浓度下发生重组受体依赖性活性的半最大值(例如，最大活性的50％)。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力是如下逐步调整比率，在如下逐步调整比率下发生重组受体依赖性活性的半最大值(例如，最大活性的50％)。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力是重组受体刺激剂的如下浓度，在所述浓度下发生重组受体依赖性活性的半最大值。在一些实施方案中，根据所测量的重组受体依赖性活性，重组受体依赖性活性的半最大值反映了如下逐步调整比率、重组受体刺激剂的浓度和/或细胞计数，在所述逐步调整比率、重组受体刺激剂的浓度和/或细胞计数下发生治疗性细胞组合物的50％有效刺激(ES50)。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力是相对效力。例如，可以将逐步调整比率(在所述逐步调整比率下测量出治疗性细胞组合物的半最大重组受体依赖性活性)与逐步调整比率(在所述逐步调整比率下测量出参考标准品的半最大重组受体依赖性活性)进行比较。应当理解，如果适用，可以使用重组受体刺激剂的浓度或量或细胞计数来代替逐步调整比率。在一些实施方案中，参考标准品是具有如下已知和/或经验证的逐步调整比率的治疗性细胞组合物，在所述已知和/或经验证的逐步调整比率下发生半最大重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，参考标准品是可商购获得的治疗性细胞组合物，例如使用如本文所述的方法已经确定了其逐步调整比率(在所述逐步调整比率下发生半最大重组受体依赖性活性)。在一些实施方案中，参考标准品是不同的治疗性细胞组合物，例如使用如本文所述的方法已经确定了其逐步调整比率(在所述逐步调整比率下发生半最大重组受体依赖性活性)。在一些实施方案中，不同的治疗性细胞组合物含有表达重组受体的细胞，所述重组受体与测试治疗性细胞组合物结合相同抗原但是具有不同受体结构。在一些实施方案中，不同的治疗性细胞组合物含有表达与测试治疗性细胞组合物相同的重组受体的细胞，但是所述治疗性细胞组合物是使用与用于制造测试治疗性细胞组合物的过程不同的过程制造的。在一些实施方案中，相对效力是通过将导致测试治疗性细胞组合物的半最大值的逐步调整比率除以导致参考标准品的半最大值的逐步调整比率而确定的比率。在一些实施方案中，相对效力是通过将导致测试治疗性细胞组合物的半最大值的逐步调整比率除以导致参考标准品的半最大值的逐步调整比率并且乘以100而确定的百分比。
在一些情况下，将治疗性细胞组合物的重组受体依赖性活性归一化可用于确定是否可以比较两种或更多种治疗性细胞组合物的重组受体依赖性活性。例如，如果确定了两种或更多种治疗性组合物的重组受体依赖性活性，并且所测试的每种治疗性细胞组合物的最大和/或最小重组受体依赖性活性不同，则将每种组合物的重组受体依赖性活性相对于其自身的最大值归一化可以允许比较重组受体依赖性活性的适当性的评估。
在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性相对于测量的最大重组受体依赖性活性值归一化。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于测量的最大重组受体依赖性活性归一化。在一些实施方案中，当重组受体依赖性活性曲线被归一化时，最大活性值是曲线的较高渐近线的平均值。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性相对于其各自的最大值归一化有助于测试治疗性细胞组合物与参考标准品之间的比较。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性相对于其各自的最大值归一化有助于计算相对效力。
在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性相对于其各自的最大值归一化允许进行并行线测试。在一些实施方案中，并行线测试的结果指示比较治疗性细胞组合物和参考标准品的能力。
本文提供的用于评估治疗性细胞组合物的效力的方法(包括测定)允许比较不同的治疗性细胞组合物(包括参考标准品)。比较治疗性细胞组合物的能力提供了这样一种方法，所述方法不仅用于鉴定具有改进、最佳和/或一致效力的治疗性细胞组合物，而且用于：鉴定用于进一步开发和/或分析的候选治疗性细胞组合物；鉴定产生具有改进或最佳效力的治疗性细胞组合物的制造过程和程序；鉴定产生具有一致效力的治疗性细胞组合物和/或估计有制造程序固有的可变性的制造程序或过程；确定待施用于有需要的受试者的治疗性细胞组合物的剂量，例如，将产生临床反应而不产生毒性的剂量；和/或比较同种异体治疗性细胞组合物与自体治疗性细胞组合物的效力。本文提供的方法被设计为与相对效力形式相容，所述相对效力形式对于测试治疗性组合物或参考标准品是否来自不同的供体(例如，受试者)、制造过程和/或治疗性产品是不可知的。
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本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.细胞效力测定
本文提供了使用包括多个孵育的测定评估治疗性细胞组合物的效力的方法，所述治疗性细胞组合物例如含有经工程化以表达重组受体(例如，CAR)的T细胞(例如，CD3+、CD4+、CD8+T细胞)的治疗性T细胞组合物(例如如在第I-A节中所述)，其中所述多个孵育中的每一个包括将含有经工程化以表达重组受体的细胞的治疗性细胞组合物的细胞与如例如在第I-B节中所述的重组受体刺激剂(例如抗原、抗原表达细胞或抗体(例如抗独特型抗体))一起培养，所述重组受体刺激剂被重组受体识别或能够被重组受体结合以刺激所述细胞的重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是响应于其重组受体的刺激而引发的细胞的活性。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是这样的活性，例如像细胞因子表达、细胞溶解活性、受体上调或下调、基因上调或下调、细胞溶解活性、增殖活性和/或细胞健康的量度，例如，如第I-C节中所述。在一些实施方案中，多个孵育中的每一个含有不同逐步调整比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。在一些实施方案中，多个孵育中的每一个包括将治疗性组合物的恒定数量的细胞与不同量的重组受体刺激剂一起培养以生成多个不同的逐步调整比率。在一些实施方案中，多个孵育中的每一个包括将治疗性组合物的不同数量的细胞与恒定量或浓度的重组受体刺激剂一起培养以生成多个不同的逐步调整比率。在一些实施方案中，进行为或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个孵育，每个孵育含有不同比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。在一些实施方案中，进行为或至少3个孵育，每个孵育含有不同比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。在一些实施方案中，进行为或至少6个孵育，每个孵育含有不同比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。在一些实施方案中，进行为或至少10个孵育，每个孵育含有不同比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。在一些实施方案中，测量来自多个孵育中的每一个的重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，如第I-C节中所述，例如通过荧光、流式细胞术、ELISA测量来自多个孵育中的每一个的重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性的测量值通过曲线拟合以产生重组受体依赖性活性曲线，例如如上所述。在一些实施方案中，基于从多个孵育中的每一个测量的重组受体依赖性活性，确定导致半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率。在一些实施方案中，从重组受体依赖性活性曲线推断、外推或估计导致半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于测量的最大重组受体依赖性活性归一化。在一些实施方案中，导致半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率是治疗性细胞组合物的效力。在一些实施方案中，如果适用的话，可以报告重组受体刺激剂的浓度或量或者细胞计数来代替逐步调整比率。
在一些实施方案中，将导致半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率与导致参考标准品的半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率进行比较。例如，将导致半最大重组受体依赖性活性的治疗性细胞组合物的逐步调整比率除以导致参考标准品的半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率(例如根据本文所述的方法确定的)以产生相对效力。在一些实施方案中，将相对效力表示为比率。在一些实施方案中，将相对效力表示为百分比。
本文提供的用于确定效力的方法可以重复地进行。例如，测定可以进行2、3、4、5次或更多次。在一些实施方案中，使用重复实验来确认测定的准确度和/或精确度，包括所测量的重组受体依赖性活性和/或所确定的效力和/或相对效力的一致性。在一些实施方案中，通过一式两份或一式三份地对特定治疗性细胞组合物进行测定来进行单一测定。在一些实施方案中，一式两份地进行测定。在一些实施方案中，一式三份地进行测定。在例如一式两份或一式三份地进行测定的一些情况下，使用来自每个重复实验的所测量的重组受体依赖性活性提供重组受体依赖性活性的统计量度。例如，在一些情况下，确定重组受体依赖性活性的每个量度的平均值、中值、标准差和/或方差。在一些实施方案中，确定重组受体依赖性活性的每个量度的平均值。在一些实施方案中，确定重组受体依赖性活性的每个量度的标准差。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性的平均量度使用数学模型进行拟合以产生重组受体依赖性活性曲线。在一些实施方案中，将曲线相对于平均最大值归一化。在一些实施方案中，导致半最大重组受体依赖性活性的平均逐步调整比率是治疗性细胞组合物的效力。在一些实施方案中，如果适用的话，可以报告重组受体刺激剂的平均浓度或量或者细胞计数来代替逐步调整比率。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力是相对效力，其通过取得导致半最大重组受体依赖性活性的平均逐步调整比率并且将平均逐步调整比率与导致参考标准品的半最大重组受体依赖性活性的单一或平均逐步调整比率进行比较来确定。在一些实施方案中，相对效力是治疗性细胞组合物的平均效力除以参考标准品的单一或平均效力。在一些实施方案中，将相对效力表示为比率。在一些实施方案中，将相对效力表示为百分比。
本文提供的测定可以在适合于多个孵育的任何一种或多种器皿中进行。在一些实施方案中，测定在烧瓶中进行。在一些实施方案中，测定在管(例如，微量离心管、PCR管、管)中进行。在一些实施方案中，测定在多孔板中进行。例如，多孔板是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。在特定实施方案中，测定在12孔板中执行或进行。
培养治疗性细胞组合物和重组受体刺激剂一起孵育的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间和/或药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子)。设想多个孵育的持续时间至少与待检测(例如，测量)的潜在重组受体依赖性活性的最小时间量相当。例如，准确测量细胞因子表达所需的时间量可能比测量基因表达所需的时间量更长。进一步设想在一种类型的活性(例如，细胞因子表达)内，待测量的特定细胞因子与另一种相比可能存在时间差异。在一些实施方案中，多个孵育进行为、约或至少1、2或3天。在一些实施方案中，多个孵育进行为、约或至少1或2天。在一些实施方案中，多个孵育进行为、约或至少24、36、48、60或72小时。在一些实施方案中，多个孵育进行为、约或至少24或48小时。在一些实施方案中，多个孵育进行为或约24小时与为或约72小时之间。在一些实施方案中，多个孵育进行为或约24小时与为或约48小时之间。在一些实施方案中，多个孵育进行为、约或至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟。在一些实施方案中，多个孵育进行为、约或至少30分钟。在一些实施方案中，多个孵育进行为、约或至少60分钟。在一些实施方案中，多个孵育进行为或约在10与60分钟、20与60分钟、30与60分钟、40与60分钟、50与60分钟之间。
在一些实施方案中，多个孵育在从约25℃至约38℃，如从约30℃至约37℃，例如为或约37℃±2℃的温度下进行。在一些实施方案中，多个孵育用从约2.5％至约7.5％，如从约4％至约6％，例如为或约5％±0.5％的CO2水平进行。在一些实施方案中，多个孵育在为或约37℃的温度和/或在为或约5％的CO2水平下进行。
A.治疗性细胞组合物
本文提供的方法涉及评估例如通过任何过程制造的治疗性细胞组合物(例如，治疗性T细胞组合物)的效力。在一些实施方案中，本文提供的方法可用于评估根据本文(例如，第II节)所述的过程制造的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，可以根据本文提供的方法评估通过任何过程制造的多种治疗性细胞组合物的效力和/或相对效力。在一些实施方案中，所评估的多种治疗性细胞组合物是通过相同的制造过程产生的。在一些实施方案中，多种治疗性细胞组合物是通过相同的制造过程制造的，但是包含不同的重组受体。在一些实施方案中，靶标是重组受体的抗原。因此，在一些情况下，靶标表达细胞是抗原表达细胞。在一些实施方案中，不同的重组受体全部结合相同的靶标，例如靶抗原。在一些实施方案中，不同的重组受体结合不同的靶标，例如靶抗原。在一些实施方案中，所评估的多种治疗性细胞组合物是通过不同的制造过程产生的。在一些实施方案中，多种治疗性细胞组合物是通过不同的制造过程制造的，但是包含相同的重组受体。在一些实施方案中，多种治疗性细胞组合物是通过不同的制造过程制造的并且包含不同的重组受体。在一些实施方案中，不同的重组受体全部结合相同的抗原。在一些实施方案中，多种治疗性细胞组合物是从单个受试者制造的。在一些实施方案中，多种治疗性细胞组合物是从不同受试者制造的。在一些实施方案中，受试者是健康供体。在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症，例如癌症。本文提供的方法能够允许比较治疗性细胞组合物(包括作为治疗性细胞组合物的参考标准品)之间的效力和/或相对效力，而不论制造方法如何。
在一些实施方案中，与从一个或多个输入群体(如从单个生物样品获得、选择或富集的输入群体)产生或生成含有工程化T细胞的治疗性细胞组合物的过程(参见例如，第II-A节)相结合来产生或制造治疗性细胞组合物。在某些实施方案中，治疗性细胞组合物含有表达重组受体(例如，CAR、TCR)的细胞。在特定实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞适合于作为疗法(例如，自体细胞疗法、同种异体细胞疗法)施用于受试者。本文提供的方法可用于评估用于细胞疗法的治疗性细胞组合物的效力和/或相对效力。
在一些实施方案中，用于生成或产生工程化T细胞的治疗性细胞组合物的过程包括以下步骤中的一些或所有：收集或获得生物样品；从生物样品分离、选择或富集输入细胞；低温冷冻并储存然后解冻输入细胞；选择并刺激目的输入细胞，例如，T细胞，例如，CD3+、CD4+、CD8+T细胞；基因工程化所刺激的细胞以表达或含有重组多核苷酸，例如编码重组受体(如CAR)的多核苷酸；在输出组合物中配制所培育的细胞；以及低温冷冻并储存所配制的输出细胞，直至释放所述细胞以用于输注和或施用于受试者。在一些实施方案中，制造治疗性细胞组合物的方法不包括在所述过程期间扩增细胞或增加细胞数量的步骤，所述步骤如通过在生物反应器中在一定条件下培育细胞来进行，在所述条件下细胞扩增，例如扩增至以下阈值量：与输入群体相比，细胞的量、水平或浓度为至少2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍。在一些实施方案中，制造治疗性细胞组合物的方法包括在所述过程期间扩增细胞或增加细胞数量的步骤，所述步骤如通过在生物反应器中在一定条件下孵育或培育细胞来进行，在所述条件下细胞扩增，例如扩增至以下阈值量：与输入群体相比，细胞的量、水平或浓度为至少2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍。在一些实施方案中，将细胞基因工程化是或包括用病毒载体转导细胞的步骤，所述步骤如通过以下方式来进行：在病毒颗粒的存在下旋转接种细胞，然后在静态条件下在病毒颗粒的存在下孵育所述细胞。例如，参见第II-C节。
在某些实施方案中，用于生成工程化细胞的过程从起始刺激到收集、收获或配制细胞的总持续时间为、为约或小于36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时。在一些实施方案中，用于生成工程化细胞的所提供过程从开始刺激到收集、收获或配制细胞的总持续时间为在或在约36小时与120小时之间、48小时与96小时之间或48小时与72小时之间，包含端值。在特定实施方案中，如从开始孵育到收获、收集或配制细胞所测量的，完成所提供过程的时间量为、为约或为小于48小时、72小时或96小时。在特定实施方案中，如从起始孵育到收获、收集或配制细胞所测量的完成所提供过程的时间量为48小时±6小时、72小时±6小时或96小时±6小时。
在一些实施方案中，整个制造过程用经富集T细胞(例如，CD3+、CD4+和CD8+T细胞)的单一群体来进行。在某些实施方案中，制造过程用经富集T细胞的两种或更多种输入群体来进行，所述两种或更多种输入群体在所述过程之前和/或期间被组合以生成或产生经富集T细胞的单一治疗性细胞组合物(例如，含有CD4+和CD8+T细胞的治疗性细胞组合物)。在一些实施方案中，经富集T细胞是或包含工程化T细胞，例如，经转导以表达重组受体的T细胞。
在一些实施方案中，如从自生物样品分离、富集和/或选择输入细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)到收集、配制和/或低温保护治疗性细胞组合物的工程化细胞的时间所测量的，完成所提供过程所需的持续时间或时间量为、为约或为小于48小时、72小时、96小时、120小时、4天、5天、7天或10天。在一些实施方案中，如从自生物样品分离、富集和/或选择输入细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)到收集、配制和/或低温保护工程化细胞的时间所测量的，完成所提供过程所需的持续时间或时间量为、为约4至5天。在一些实施方案中，如从自生物样品分离、富集和/或选择输入细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)到收集、配制和/或低温保护工程化细胞的时间所测量的，完成所提供过程所需的持续时间或时间量为或为约5天。在一些实施方案中，如从自生物样品分离、富集和/或选择输入细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)到收集、配制和/或低温保护工程化细胞的时间所测量的，完成所提供过程所需的持续时间或时间量为、为小于5天。在一些实施方案中，如从自生物样品分离、富集和/或选择输入细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)到收集、配制和/或低温保护工程化细胞的时间所测量的，完成所提供过程所需的持续时间或时间量为或为约4天。在一些实施方案中，在刺激前不对分离、选择或富集的细胞进行低温保护，并且如从分离、富集和/或选择输入细胞到收集、配制和/或低温保护工程化细胞的时间所测量的，完成所提供过程所需的持续时间或时间量为、为约或为小于48小时、72小时、96小时或120小时。
在某些实施方案中，治疗性细胞组合物是从自生物样品分离、富集或选择的细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞或CD3+T细胞)的群体制造的。在一些方面，从自受试者收集生物样品时到产生或生成治疗性细胞组合物的时间在如与其他方法或过程相比缩短的时间量内。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％、至少95％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，治疗性细胞组合物中至少50％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，治疗性细胞组合物中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的CD3+T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物中至少50％的CD3+T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，治疗性细胞组合物中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％的CD4+T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，治疗性细胞组合物中至少50％的CD4+T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％的CD8+T细胞表达重组受体。在某些实施方案中，治疗性细胞组合物中至少50％的CD8+T细胞表达重组受体。
在特定实施方案中，治疗性细胞组合物的大多数细胞是幼稚样、中央记忆和/或效应记忆细胞。在特定实施方案中，治疗性细胞组合物的大多数细胞是幼稚样或中央记忆细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的大多数细胞对CCR7或CD27表达中的一种或多种呈阳性。在某些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞具有比从替代性过程(如涉及扩增的过程)生成的输出群体更大份额的幼稚样或中央记忆细胞。
在某些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞具有低份额和/或频率的被耗竭的和/或衰老的细胞。在特定实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的被耗竭的和/或衰老的细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是被耗竭的和/或衰老的。在某些实施方案中，治疗性细胞组合物中小于25％的细胞是被耗竭的和/或衰老的。在某些实施方案中，输出群体中小于10％的细胞是被耗竭的和/或衰老的。在特定实施方案中，细胞具有低份额。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞具有低份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞具有低份额和/或频率的CD27-CCR7-细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在某些实施方案中，治疗性细胞组合物中小于25％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在某些实施方案中，治疗性细胞组合物中小于10％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在实施方案中，治疗性细胞组合物中小于5％的细胞是CD27-CCR7-细胞。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)中的一种或两种呈阳性的细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性的细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞对于CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。在各种实施方案中，治疗性细胞组合物中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD4+CAR+细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD8+CAR+细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。
在某些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞具有高份额和/或频率的CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞是CD27+CCR7+细胞。在各种实施方案中，治疗性细胞组合物中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD4+CAR+细胞是CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD8+CAR+细胞是CD27+CCR7+细胞。
在某些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞具有低份额和/或频率的对CCR7表达(例如，表面表达)呈阴性并且对CD45RA表达(例如，表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞具有低份额和/或频率的CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，治疗性细胞组合物中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在一些实施方案中，输出群体(例如，治疗性细胞组合物)中小于25％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出群体(例如，治疗性细胞组合物)中小于10％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在某些实施方案中，治疗性细胞组合物中小于5％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。
在一些实施方案中，治疗性细胞制造过程不同，使得可以例如通过比较不同制造的治疗性细胞组合物的效力来比较替代性制造过程。例如，在一些实施方案中，替代性过程可以含有用于扩增细胞的步骤。在一些实施方案中，替代性过程可以不含有用于扩增细胞的步骤。在一些实施方案中，替代性过程包括用于细胞选择和刺激的单独步骤。在一些实施方案中，替代性过程包括用于细胞选择和刺激的单一步骤。在一些实施方案中，替代性过程可以在一个或多个特定方面有所不同，但在其他方面含有与所提供方法相关的过程的类似或相同的特征、方面、步骤、阶段、试剂和/或条件。在一些实施方案中，替代性过程在手段方面的不同之处包括但不限于以下中的一种或多种：包括不同的试剂和/或培养基配制品；在孵育、转导、转染和/或培育期间血清的存在；输入群体的不同的细胞组成，例如，CD4+与CD8+T细胞的比率；不同的刺激条件和/或不同的刺激试剂；不同的刺激试剂与细胞的比率；不同的转导载体和/或方法；不同的孵育、转导和/或转染细胞的时间安排或顺序；在孵育或转导期间存在的一种或多种重组细胞因子的不存在或差异(例如，不同的细胞因子或不同浓度)；或者不同的收获或收集细胞的时间安排。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞经工程化以表达重组受体，如CAR或TCR(参见例如，第III部分)，所述重组受体与配体(如与疾病或病症相关(例如与肿瘤或癌症的细胞相关或在肿瘤或癌症细胞上表达)的配体)特异性结合。在一些实施方案中，重组受体含有与抗原特异性结合的胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，重组受体是CAR，其含有与抗原特异性结合的胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，配体(如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
示例性重组受体(包括CAR和重组TCR)以及将受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，基因工程化抗原受体包括CAR，如美国专利号7,446,190中所述的，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的工程化细胞含有与肿瘤抗原结合的重组受体(例如，CAR)。在一些实施方案中，重组受体特异性识别和/或靶向与癌症相关和/或存在于通用标签上的抗原。在一些实施方案中，由重组受体识别或靶向的抗原是B细胞成熟抗原(BCMA)、ROR1、碳酸酐酶9(CAIX)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、肾母细胞瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、任选前述任何一种的人抗原；病原体特有的抗原。在一些实施方案中，由重组受体识别和/或靶向的抗原选自：Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch4、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)、肝配蛋白B2、β聚糖(TGFBR3)、CD43、CD44、CSF1R、CX3CR1、CXCL16、δ1、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、HLA-A2、IFNaR2、IL1R1、IL1R2、IL6R和淀粉样前体蛋白(APP)。
在一些实施方案中，由重组受体识别和/或靶向的抗原是B细胞成熟抗原(BCMA)。靶向或特异性结合BCMA的示例性抗原结合结构域和含有此类抗原结合结构域的CAR是已知的，参见例如，WO 2016/090320、WO 2016090327、WO 2010104949A2和WO 2017173256。在一些实施方案中，抗原结合结构域是含有源自对BCMA具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL的scFv。在一些实施方案中，结合BCMA的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090327和WO 2016/090320中所述的抗体或抗体片段的VH和VL。
如上所述，测定可以包括多个孵育，其中每个孵育是含有不同逐步调整比率的治疗性细胞组合物的工程化细胞与能够刺激工程化细胞的重组受体以刺激重组受体依赖性活性的重组受体刺激剂(或反之亦然)的培养物。凭经验确定治疗性细胞组合物的细胞和受体刺激剂的精确范围或量以在测定中实现逐步调整应答在熟练技术人员的水平内。例如，数量或量将取决于测定的特定形式，如进行测定的器皿的大小。应当理解，与在具有较大表面积的器皿中相比，当在具有较小表面积的器皿中进行测定时，量将更少。典型地，细胞的量是其中细胞呈次汇合(如不超过25％汇合或50％汇合)的量。此外，可以根据所采用的特定抗原和靶细胞凭经验确定特定的比率范围。例如，所选择的比率是这样的比率，其包括跨参考标准品的多个逐步调整量的重组受体依赖性活性的线性剂量反应增加。在一些实施方案中，选择比率以还包括受体依赖性活性的较低渐近线和受体依赖性活性的较高渐近线，其分别表示参考标准品的最小和最大反应。
在一些实施方案中，改变治疗性细胞组合物的工程化细胞的数量，同时保持结合分子的量或浓度恒定以生成不同的比率。在一些实施方案中，在各个孵育中治疗性细胞组合物的细胞数量从为或约1x104至约1x106个细胞、约1x104至约9x105个细胞、约1x104至约8x105个细胞、约1x104至约7x105个细胞、约1x104至约6x105个细胞、约1x104至约5x105个细胞、约1x104至约4x105个细胞、约1x104至约3x105个细胞、约1x104至约2x105个细胞、约1x104至约1x105个细胞、约1x104至约9x104个细胞、约1x104至约8x104个细胞、约1x104至约7x104个细胞、约1x104至约6x104个细胞、约1x104至约5x104个细胞、约1x104至约4x104个细胞、约1x104至约3x104个细胞、约1x104至约2x104个细胞逐步调整。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞数量从为或约1x104至约1x105个细胞、1x104至约8x104个细胞、1x104至约6x104个细胞、1x104至约4x104个细胞、1x104至约2x104个细胞逐步调整。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞数量从为或约10,000至为或约1,000,000个细胞逐步调整。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞数量从为或约10,000至为或约500,000个细胞逐步调整。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞数量从为或约10,000至为或约250,000个细胞逐步调整。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞数量从为或约10,000至为或约200,000个细胞逐步调整。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞数量从为或约10,000至为或约150,000个细胞逐步调整。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞数量从为或约10,000至为或约100,000个细胞逐步调整。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞数量从为或约10,000至为或约50,000个细胞逐步调整。在一些实施方案中，前述任一种中的治疗性细胞组合物的细胞数量是细胞总数、活细胞总数、CAR+细胞总数、CD8+细胞总数、CD4+细胞总数、CD3+细胞总数、CD8+/CAR+细胞总数、CD4+/CAR+细胞总数或CD3+/CAR+细胞总数。
在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞数量保持恒定，并且逐步调整重组受体刺激剂的量。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是在约1x104至约1x106个细胞、约1x104至约9x105个细胞、约1x104至约8x105个细胞、约1x104至约7x105个细胞、约1x104至约6x105个细胞、约1x104至约5x105个细胞、约1x104至约4x105个细胞、约1x104至约3x105个细胞、约1x104至约2x105个细胞、约1x104至约1x105个细胞、约1x104至约9x104个细胞、约1x104至约8x104个细胞、约1x104至约7x104个细胞、约1x104至约6x104个细胞、约1x104至约5x104个细胞、约1x104至约4x104个细胞、约1x104至约3x104个细胞、约1x104至约2x104个细胞之间的量。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是从为或约1x104至约1x105个细胞、1x104至约8x104个细胞、1x104至约6x104个细胞、1x104至约4x104个细胞、1x104至约2x104个细胞的量。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是从为或约10,000至为或约1,000,000个细胞的量。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是从为或约10,000至为或约500,000个细胞的量。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是从为或约10,000至为或约250,000个细胞的量。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是从为或约10,000至为或约150,000个细胞的量。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是从为或约10,000至为或约100,000个细胞的量。在一些实施方案中，在多个孵育中在各个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是从为或约10,000至为或约50,000个细胞的量。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是为或约5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000个细胞。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是为或约5,000、10,000、20,000、30,000、40,000或50,000个细胞。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是为或约20,000、30,000、40,000或50,000个细胞。在一些实施方案中，在多个孵育中治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是为或约50,000个细胞。在一些实施方案中，前述任一种中的治疗性细胞组合物的细胞的恒定数量是细胞总数、活细胞总数、CAR+细胞总数、CD8+细胞总数、CD4+细胞总数、CD3+细胞总数、CD8+/CAR+细胞总数、CD4+/CAR+细胞总数或CD3+/CAR+细胞总数。
B.重组受体刺激剂
本文提供的评估效力的方法包括刺激治疗性细胞组合物的工程化细胞的重组受体(例如，CAR、TCR)的手段。设想可以使用适合于刺激重组受体的任何手段，所述手段也能够被定量和递送，如以产生不同比率的治疗性细胞组合物的细胞与刺激手段。在一些实施方案中，刺激重组受体的手段是通过重组受体刺激剂来实现的，所述重组受体刺激剂能够结合重组受体并刺激通过重组受体的细胞内信号以产生重组受体依赖性活性，如在第I-C节中所述。示例性重组受体刺激剂包括重组受体的抗原(例如，纯化的或重组抗原)、抗体(如抗独特型抗体)和抗原表达细胞。
如上所述，在一些实施方案中，不同逐步调整比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂的多个孵育可以通过以下方式来实现：将治疗性细胞组合物的恒定数量的细胞(例如，活的、CAR+、CD4+、CD8+、CD3+、CD4+/CAR+、CD8+/CAR+、CD3+/CAR+细胞)与变化或逐步调整量(例如，浓度、质量)的重组受体刺激剂一起培养。在一些实施方案中，重组受体刺激剂的量或浓度在多个孵育中变化或逐步调整如下倍数：为或约10,000倍、5,000倍、1,000倍、1,500倍、500倍、250倍、200倍、150倍、100倍、75倍、50倍、25倍或10倍。在一些实施方案中，重组受体刺激剂的量或浓度在多个孵育中变化或逐步调整如下倍数：在为或约10,000至100倍、5,000至100倍或1,000至100倍之间。在一些实施方案中，重组受体刺激剂的量或浓度在多个孵育中变化如下倍数：为或约5,000倍、1,000倍、1,500倍或500倍。在一些实施方案中，重组受体刺激剂的量或浓度在多个孵育中变化或逐步调整如下倍数：为或约5,000倍。在一些实施方案中，重组受体刺激剂的量或浓度在多个孵育中变化或逐步调整如下倍数：为或约1,000倍。在一些实施方案中，重组受体刺激剂的量或浓度在多个孵育中变化或逐步调整如下倍数：为或约500倍。
1.结合分子与表面固定化
在特定实施方案中，重组受体刺激剂由能够被重组受体结合的结合分子(或靶标)构成。在一些实施方案中，将结合分子固定在表面支持物上。在所提供的实施方案中，结合分子可以是重组受体的抗原或抗原的一部分(例如，抗原的胞外部分)或对重组受体具有特异性的抗体(例如，抗独特型抗体)。例如，结合分子(例如，抗原或其结合部分、或抗独特型抗体)可以固定或结合到表面支持物，如非细胞颗粒，其中使治疗性组合物的重组受体表达细胞(例如，CAR-T细胞)，例如逐步调整量的细胞，与表面支持物接触。在一些实施方案中，本文所述的颗粒(例如，珠颗粒)提供了固体支持物或基质，结合分子(例如，抗原或其结合部分、或抗独特型抗体)可以以允许结合分子与细胞之间的相互作用(特别是结合分子与细胞表面上表达的重组受体(例如，CAR)之间的结合)的方式结合或附接至所述固体支持物或基质上。在特定实施方案中，缀合或附接的结合分子与细胞之间的相互作用介导对重组受体的刺激，包括如所述的一种或多种重组受体依赖性活性，如激活、扩增、细胞因子产生、细胞毒性活性或其他活性，参见例如第I.C节。
在某些实施方案中，表面支持物是结合分子(例如，抗原或其结合部分、或抗独特型抗体)固定或附接的颗粒(例如，珠颗粒)。在一些实施方案中，表面支持物是固体支持物。在一些例子中，固体支持物是珠，并且抗原或部分固定在珠上。在一些实施方案中，固体支持物是孔或板(例如，细胞培养板)的表面。在一些实施方案中，表面支持物是可溶性寡聚体颗粒，并且抗原固定在可溶性寡聚体颗粒的表面上。用于固定或附接用于识别或结合重组受体的药剂(例如，结合分子)的表面支持物的例子可以在公开的国际申请WO 2019/027850中找到，将其出于所有目的通过引用并入。
在特定实施方案中，表面支持物是颗粒，其可以包括胶体颗粒、微球体、纳米颗粒、珠(如磁珠)等。在一些实施方案中，颗粒或珠是生物相容的，即无毒的。在某些实施方案中，颗粒或珠对培养的细胞(例如培养的T细胞)而言是无毒的。在特定实施方案中，颗粒是单分散的。在某些实施方案中，“单分散的”涵盖具有如下尺寸分散的颗粒(例如珠颗粒)，所述尺寸分散具有小于5％的标准差，例如直径具有小于5％的标准差。
在一些实施方案中，颗粒或珠是生物相容的，即由适合于生物学用途的材料构成。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)对培养的细胞(例如培养的T细胞)而言是无毒的。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)可以是能以允许结合分子与细胞之间相互作用的方式附接结合分子的任何颗粒。在某些实施方案中，颗粒(例如珠)可以是可以被修饰(例如表面官能化)以允许结合分子附接至颗粒表面的任何颗粒。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)由玻璃、二氧化硅、羟基羧酸的聚酯、二羧酸的聚酸酐、或羟基羧酸和二羧酸的共聚物构成。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)可以由以下构成或至少部分由以下构成：直链或支链的、经取代的或未取代的、饱和的或不饱和的、线性的或交联的链烷基(alkanyl)、卤代烷基、硫代烷基、氨基烷基、芳基、芳烷基、烯基、芳烯基、杂芳基、或烷氧基羟基酸的聚酯；或者直链的或支链的、经取代的或未取代的、饱和的或不饱和的、线性的或交联的链烷基、卤代烷基、硫代烷基、氨基烷基、芳基、芳烷基、烯基、芳烯基、杂芳基或烷氧基二羧酸的聚酸酐。此外，颗粒(例如珠)可以是量子点，或由量子点构成，如量子点聚苯乙烯颗粒(例如珠)。也可以采用包括酯和酸酐键的混合物(例如，乙醇酸和癸二酸的共聚物)的颗粒(例如珠)。例如，颗粒(例如，珠)可包含包括以下的材料：聚乙醇酸聚合物(PGA)、聚乳酸聚合物(PLA)、聚癸二酸聚合物(PSA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)、[rho]聚(乳酸-共-癸二酸)共聚物(PLSA)、聚(乙醇酸-共-癸二酸)共聚物(PGSA)等。可构成颗粒(例如，珠)的其他聚合物包括己内酯、碳酸酯、酰胺、氨基酸、原酸酯、缩醛、氰基丙烯酸酯和可降解氨基甲酸乙酯的聚合物或共聚物，以及这些与直链或支链、经取代或未取代的链烷基、卤代烷基、硫代烷基、氨基烷基、烯基或芳族羟基酸或二羧酸的共聚物。此外，具有反应性侧链基团的在生物学上重要的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸、或它们的对映异构体可以被包括在具有任何上述材料的共聚物中，以提供用于与结合分子(如多肽抗原或抗体)缀合的反应性基团。
在一些实施方案中，颗粒是这样的珠，所述珠具有大于0.001μm、大于0.01μm、大于0.05μm、大于0.1μm、大于0.2μm、大于0.3μm、大于0.4μm、大于0.5μm、大于0.6μm、大于0.7μm、大于0.8μm、大于0.9μm、大于1μm、大于2μm、大于3μm、大于4μm、大于5μm、大于6μm、大于7μm、大于8μm、大于9μm、大于10μm、大于20μm、大于30μm、大于40μm、大于50μm、大于100μm、大于500μm、和/或大于1,000μm的直径。在一些实施方案中，颗粒或珠具有在或在约0.001μm与1,000μm之间、0.01μm与100μm之间、0.1μm与10μm之间、0.1μm与100μm之间、0.1μm与10μm之间、0.001μm与0.01μm之间、0.01μm与0.1μm之间、0.1μm与1μm之间、1μm与10μm之间、1μm与2μm之间、2μm与3μm之间、3μm与4μm之间、4μm与5μm之间、1μm与5μm之间、和/或5μm与10μm之间(每个都包含端值)的直径。在某些实施方案中，颗粒或珠具有1μm和10μm(每个都包含端值)的平均直径。在某些实施方案中，颗粒(例如，珠)具有为或约1μm的直径。在特定实施方案中，颗粒(例如，珠)具有为或约2.8μm的平均直径。在一些实施方案中，颗粒(例如，珠)具有为或约4.8μm的直径。
可以生产或商业地获得在本文所述的方法中使用的颗粒(例如珠颗粒)。颗粒(例如珠)，包括生产颗粒(例如珠)的方法，在本领域中是熟知的。参见例如，美国专利号6,074,884；5,834,121；5,395,688；5,356,713；5,318,797；5,283,079；5,232,782；5,091,206；4,774,265；4,654,267；4,554,088；4,490,436；4,452,773；美国专利申请公开号20100207051；以及Sharpe,Pau T.,Methods of Cell Separation,Elsevier,1988。可商购获得的颗粒(例如，珠)(例如，珠颗粒)包括但不限于ProMagTM(PolySciences,Inc.)；COMPELTM(PolySciences,Inc.)；(PolySciences,Inc.)，包括Plus(PolySciences,Inc.)和Maxi(Bang Laboratories,Inc.)；M-PVA(CehmagenBiopolymer Technologie AG)；SiMAG(Chemicell GmbH)；beadMAG(Chemicell GmbH)；(Cortex Biochem)；(Invitrogen)，包括M-280绵羊抗兔IgG(Invitrogen)、FlowCompTM(例如，FlowCompTMHumanCD3，Invitrogen)、M-450(例如，M-450Tosylactivated，Invitrogen)、UntouchedTM(例如，UntouchedTM人CD8 T细胞，Invitrogen)、和结合、扩增和/或激活T细胞的(例如，用于T细胞扩增和激活的人T-激活因子CD3/CD28，Invitrogen)；M(Merk Chimie SAS)；EM(Merk Chimie SAS)；MACSiBeadsTM颗粒(例如，抗生物素MACSiBead颗粒，Miltenyi Biotec，目录号130-091-147)；磁珠(IBA BioTAGnology)；磁珠(IBA BioTAGnology)；(Micormod PartikeltechnologieGmbH)(Micromod Partikeltechnologie)；MagneSilTM(Promega GmbH)；MGP(Roche Applied Science Inc.)；PierceTM蛋白质G磁珠(Thermo Fisher ScientificInc.)；PierceTM蛋白质A磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTM蛋白质A/G磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTMNHS激活的磁珠(Thermo Fisher ScientificInc.)；PierceTM蛋白质L磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTM抗HA磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTM抗c-Myc磁珠(Thermo Fisher ScientificInc.)；PierceTM谷胱甘肽磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；PierceTM链霉亲和素磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；MagnaBindTM磁珠(Thermo Fisher ScientificInc.)；Sera-MagTM磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；抗M2磁珠(Sigma-Aldrich)；SPHEROTM磁性颗粒(Spherotech Inc.)；和HisPurTM Ni-NTA磁珠(ThermoFisher Scientific Inc.)。
在某些实施方案中，抗原或其胞外结构域部分经由共价化学键与颗粒(例如，珠)结合。在特定实施方案中，抗原或其胞外结构域部分的氨基酸的反应基团或部分通过直接化学反应直接缀合至颗粒表面上的反应基团或部分。在某些实施方案中，抗原或其胞外结合部分的氨基酸羧基(例如，C末端羧基)、羟基、硫醇或胺基团(如氨基酸侧链基团)通过直接化学反应直接缀合至在颗粒表面上的PLA或PGA聚合物的羟基或羧基，树状聚合物的末端胺或羧基，或者磷脂的羟基、羧基或磷酸基团。在一些实施方案中，缀合部分与结合分子和颗粒两者均缀合(例如，共价结合)，从而将它们连接在一起。
在某些实施方案中，颗粒的表面包含允许结合分子(例如，多肽抗原或抗体)的附接(例如，共价、非共价)的化学部分和/或官能团。在特定实施方案中，颗粒表面含有暴露的官能团。合适的表面暴露的官能团包括但不限于羧基、氨基、羟基、硫酸基团、甲苯磺酰基、环氧基和氯甲基。在一些实施方案中，结合分子是多肽，并且与表面暴露的官能团缀合。在一些实施方案中，表面暴露的官能团必须被激活，即它必须经历化学反应以产生能够直接结合多肽的中间体产物。例如，可以用上述药剂激活多肽分子的羧基，以生成能够与颗粒的表面暴露的氨基直接结合的中间体酯。在其他例子中，可以利用磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)化学使表面支持物(例如，珠)表面上的游离胺基团与抗原肽和蛋白质、或者抗原肽或蛋白质融合蛋白共价结合。在仍其他特定实施方案中，多肽结合分子在表面暴露的官能团处共价附接至颗粒(例如，珠颗粒)，所述表面暴露的官能团在形成共价附接之前不需要通过药剂激活。此类官能团的例子包括但不限于甲苯磺酰基、环氧基和氯甲基。
在一些实施方案中，在与抗原肽或蛋白质结合的配体与附接至表面支持物(例如，珠)的抗配体之间的非共价键可以将抗原与支持物(例如，珠)缀合。在一些实施方案中，可以将生物素连接酶识别序列标签与抗原肽或蛋白质的C末端连接，并且这种标签可以通过生物素连接酶生物素化。然后，生物素可以用作配体，以将抗原肽或蛋白质与抗生物素蛋白或链霉亲和素非共价地缀合，所述抗生物素蛋白或链霉亲和素作为抗配体被吸附或以其他方式结合至载体表面。可替代地，如果如本文所述将结合分子(例如，抗原)与带有Fc区的免疫球蛋白结构域融合，那么Fc结构域可以充当配体，并且与表面支持物(例如，珠)表面共价或非共价地结合的蛋白A可以用作抗配体以将抗原肽或蛋白质非共价缀合至载体。可用于将结合分子(例如，抗原或抗独特型抗体)非共价缀合至表面支持物(例如，珠)的其他手段是本领域熟知的，包括金属离子螯合技术(例如，使用结合分子(例如，抗原)的C末端处的聚His标签和Ni包被的表面支持物)，并且这些方法可以代替本文所述的那些方法。
在一些实施方案中，结合分子(例如，抗原或抗独特型抗体)通过接头与颗粒缀合。在某些实施方案中，接头可以包括但不限于多种双功能蛋白偶联剂，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲酸酯、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基二亚胺代己二酸酯HCL)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)。具体的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫键。
a.抗原
在一些实施方案中，重组受体刺激剂是或包括抗原，例如重组抗原或其片段。例如，重组受体刺激剂可以是固定或结合至表面支持物(如微孔板、固体颗粒(例如，珠)或寡聚体颗粒)的抗原，例如，如上所述。在一些实施方案中，抗原是在与疾病相关的细胞(例如癌细胞和/或肿瘤细胞)的表面上表达的多肽或多肽的变体或片段。应当理解，抗原是被重组受体的胞外结构域识别或结合的抗原。熟练技术人员可以确定足以刺激重组受体的抗原和抗原形式(例如，在固体表面上表达或固定的细胞)。
在一些实施方案中，抗原是或包括αvβ6整联蛋白(avb6整联蛋白)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签缔合的抗原、和/或生物素化的分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是或包含多肽抗原的由重组受体(例如，CAR)识别或结合的一部分。在特定实施方案中，抗原的部分是含有由重组受体(例如，CAR)识别或结合的表位的区域。在某些实施方案中，多肽抗原的部分含有由重组受体和或CAR识别或结合的多肽的为、约或至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个、300个、400个或500个氨基酸(在一些情况下连续氨基酸)。在某些实施方案中，多肽部分包含由重组受体和/或CAR识别的表位的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗原或部分是多肽变体，所述多肽变体含有与由重组受体和/或CAR结合和/或识别的多肽为、约或至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％氨基酸序列同一性。
在某些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的胞外结构域对BCMA具有特异性或者与BCMA结合，并且抗原是BCMA或者是BCMA的胞外结构域部分。在一些实施方案中，BCMA多肽是哺乳动物BCMA多肽。在特定实施方案中，BCMA多肽是人BCMA多肽。在一些实施方案中，BCMA抗原是或包含BCMA的胞外结构域或其部分，所述胞外结构域或其部分包含由抗原受体(例如，CAR)识别的表位。在某些实施方案中，BCMA抗原是或包含具有与SEQ ID NO:13具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的多肽，或所述多肽的含有SEQ ID NO:13的至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个、至少170个、或至少180个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，BCMA抗原是或包括SEQ ID NO:13所示的序列、或其部分，所述序列或其部分是或含有由抗原受体(例如，CAR)识别的表位。
在某些实施方案中，重组受体(例如CAR)的胞外结构域对ROR1具有特异性或者与ROR1结合，并且抗原是ROR1或者是ROR1的胞外结构域部分。在某些实施方案中，ROR1多肽是哺乳动物的。在特定实施方案中，ROR1多肽是人的。在一些实施方案中，抗原是ROR1的胞外结构域或其部分，所述胞外结构域或其部分包含由抗原受体(例如，CAR)识别的表位。在一些实施方案中，抗原是具有与SEQ ID NO:19具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的多肽，或所述多肽的含有SEQ ID NO:19的至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个、至少170个、或至少180个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，ROR1抗原包含SEQ ID NO:19所示的序列或其部分，所述序列或其部分包含由抗原受体(例如，CAR)识别的表位。
在某些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的胞外结构域对CD22具有特异性或者与CD22结合，并且抗原是CD22或者是CD22的胞外结构域部分。在某些实施方案中，CD22多肽是哺乳动物的。在特定实施方案中，CD22多肽是人的。在一些实施方案中，抗原是CD22的胞外结构域或其部分，所述胞外结构域或其部分包含由抗原受体(例如，CAR)识别的表位。在一些实施方案中，抗原是具有与SEQ ID NO:14具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的多肽，或所述多肽的含有SEQ ID NO:14的至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个、至少170个、或至少180个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，CD22抗原包含SEQ ID NO:14所示的序列或其部分，所述序列或其部分包含由抗原受体(例如，CAR)识别的表位。
在某些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的胞外结构域对CD19具有特异性或者与CD19结合，并且抗原是CD19或者是CD19的胞外结构域部分。在某些实施方案中，CD19多肽是哺乳动物的。在特定实施方案中，CD19多肽是人的。在一些实施方案中，抗原是CD19的胞外结构域或其部分，所述胞外结构域或其部分包含由抗原受体(例如，CAR)识别的表位。在一些实施方案中，抗原是具有与SEQ ID NO:15具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的多肽，或所述多肽的含有SEQ ID NO:15的至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个、至少170个、或至少180个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，CD19抗原包含SEQ ID NO:15所示的序列或其部分，所述序列或其部分包含由抗原受体(例如，CAR)识别的表位。
在一些实施方案中，抗原或其部分可以被形式化为由重组受体(如抗原受体(例如，CAR))识别和/或结合的包含两个或更多个多肽抗原或其部分或变体的多聚体(例如，二聚体)。在一些实施方案中，多肽抗原或其部分是相同的。在某些实施方案中，多肽抗原直接或间接地连接至区域或结构域(例如，多聚化结构域)，所述区域或结构域通过结构域或区域之间的互补相互作用促进或稳定两个或更多个多肽抗原之间的相互作用。在一些实施方案中，将多肽抗原提供为多聚体(例如，二聚体)提供了抗原或其胞外结构域部分与抗原受体(例如，CAR)的抗原结合结构域之间的多价相互作用，这在一些方面可以增加相互作用的亲合力。在一些实施方案中，增加的亲合力可能有利于通过缀合至珠的抗原或其胞外结构域部分对抗原受体(例如，CAR)的刺激或激动剂活性。
在一些实施方案中，将多肽直接或间接地连接至多聚化结构域。示例性的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区、和相容的蛋白质间相互作用结构域。例如，多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，例如像来自IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA、IgE、IgD和IgM及其修饰的形式的Fc结构域或其部分。在特定实施方案中，将多肽抗原直接或间接地连接至Fc结构域。在一些实施方案中，多肽是包含多肽抗原或其部分和Fc结构域的融合多肽。
在特定实施方案中，抗原或其胞外结构域部分是包含Fc结构域的融合多肽。在一些实施方案中，Fc结构域由IgG、IgA或IgD同种型的重链的第二和第三恒定结构域(即CH2和CH3结构域)(例如IgG、IgA和IgD同种型的CH2或CH3)构成。在一些实施方案中，Fc结构域由IgM或IgE同种型的三个重链恒定结构域(即，CH2、CH3和CH4结构域)构成。在一些实施方案中，Fc结构域可还包括铰链序列或其部分。在某些方面，Fc结构域含有免疫球蛋白分子的铰链结构域的部分或全部以及CH2和CH3结构域。在一些情况下，Fc结构域可以形成通过一个或多个二硫键接合的两条多肽链的二聚体。在一些实施方案中，Fc结构域源自合适的哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊或猴子)的免疫球蛋白(例如IgG、IgA、IgM或IgE)。在一些实施方案中，Fc结构域包含IgG的CH2和CH3结构域。在某些实施方案中，Fc结构域与多肽抗原的C末端融合。在特定实施方案中，Fc结构域与多肽抗原的N末端融合。
在一些实施方案中，Fc结构域是IgG Fc结构域或其部分或变体。在一些实施方案中，Fc结构域是人IgG Fc结构域或其部分或变体，所述人IgG Fc结构域或其部分或变体包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，Fc结构域是野生型人IgG Fc结构域或其部分或变体。在特定实施方案中，Fc结构域是野生型人IgG1 Fc结构域的变体。
在一些实施方案中，融合多肽包含变体Fc结构域。在某些实施方案中，变体人IgGFc结构域含有降低、减少和/或减损Fc结构域与轻链之间配对的突变(例如取代、缺失或插入)。在一些实施方案中，变体人IgG Fc结构域含有降低Fc结构域与Fc受体之间的结合亲和力的突变。在特定实施方案中，变体人IgG Fc结构域含有降低、减少和/或减损Fc结构域与Fc受体之间的相互作用或相互作用概率或可能性的突变。在一些实施方案中，变体人IgGFc结构域含有降低Fc结构域与补体系统的蛋白质之间的结合亲和力的突变。在特定实施方案中，变体人IgG Fc结构域含有降低、减少和/或减损Fc结构域与补体系统的蛋白质之间的相互作用或相互作用概率或可能性的突变。
在一些实施方案中，抗原或其部分与变体人IgG1 Fc结构域连接。在一些实施方案中，变体人IgG Fc结构域在Fc结构域的铰链区中含有胱氨酸至丝氨酸的取代。在一些实施方案中，变体人IgG Fc结构域在Fc结构域的铰链区中含有亮氨酸至丙氨酸的取代。在特定实施方案中，变体人IgG Fc结构域在铰链区中含有甘氨酸至丙氨酸的取代。在某些实施方案中，变体人IgG Fc结构域在Fc结构域的CH2区中含有丙氨酸至丝氨酸的取代。在一些实施方案中，变体人IgG Fc结构域在Fc结构域的CH2区中包含脯氨酸至丝氨酸的取代。在一些实施方案中，变体人IgG Fc结构域包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原或其胞外结构域部分作为包含Fc结构域的融合多肽提供，其中Fc结构域存在于融合多肽的C末端处。
在一些实施方案中，抗原和多聚化结构域(如Fc结构域)通过接头(如氨基酸接头)连接。在某些实施方案中，抗原与氨基酸接头的N末端融合，并且多聚化结构域(如Fc结构域)与接头的C末端融合。尽管氨基酸接头可以是任何长度并且含有氨基酸的任何组合，但是接头长度可相对较短(例如十个或更少的氨基酸)以降低所连接结构域之间的相互作用。还可以调整接头的氨基酸组成以降低具有大侧链的氨基酸或可能引入二级结构的氨基酸的数量。合适的氨基酸接头包括但不限于长度为至多3个、4个、5个、6个、7个、10个、15个、20个或25个氨基酸的那些。代表性氨基酸接头序列包括GGGGS(SEQ ID NO:22)，以及包含2个、3个、4个或5个拷贝的GGGGS(SEQ ID NO:22)的接头。
在一些实施方案中，抗原作为与Fc结构域融合的BCMA(例如，人BCMA)(BCMA-Fc)的胞外结构域提供。在特定实施方案中，BCMA-Fc抗原含有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的全部或部分、或展现出与SEQ ID NO:18至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性并且包含由抗原受体(例如，CAR)识别的表位的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原作为与Fc结构域融合的ROR1(例如，人ROR1)(ROR1-Fc)的胞外结构域提供。在某些实施方案中，ROR-1-Fc抗原含有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的全部或部分、或展现出与SEQ ID NO:20至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性并且包含由抗原受体(例如，CAR)识别的表位的氨基酸序列。
在特定实施方案中，抗原作为与Fc结构域融合的CD22(例如，人CD22)(CD22-Fc)的胞外结构域提供。在某些实施方案中，CD22-Fc抗原含有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的全部或部分、或展现出与SEQ ID NO:21至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性并且包含由抗原受体(例如，CAR)识别的表位的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原的Fc融合物或其胞外结合结构域作为二聚体连接或附接至表面支持物，所述二聚体由两个含有多肽抗原或其部分和Fc结构域的Fc融合多肽形成。在一些实施方案中，所得的多肽抗原-Fc融合蛋白(例如，BCMA-Fc、ROR1-Fc、CD22-Fc或CD19-Fc)可以在例如用表达载体转化的宿主细胞中表达，从而可以通过在Fc部分之间形成的链间二硫键发生Fc结构域之间的组装，以产生二聚体(如二价)多肽抗原融合蛋白。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞系。用于重组表达蛋白质的哺乳动物细胞的例子包括HEK293细胞或CHO细胞或其衍生物。在一些方面，编码Fc融合蛋白的核酸还包括用于从细胞分泌的信号肽。在示例性实施方案中，信号肽是CD33(例如，SEQ ID NO:12所示)。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的细胞表达CAR，所述CAR结合或识别可以与抗体或其片段或变体融合的通用标签。在特定实施方案中，表达此类CAR的细胞能够特异性地识别和杀伤已经由与通用标签融合的抗体结合的靶细胞(例如肿瘤细胞)。一个例子包括但不限于这样的抗FITC CAR表达T细胞，当各种人癌细胞被癌症反应性FITC标记的抗体结合时，所述抗FITC CAR表达T细胞可以结合和/或识别那些人癌细胞。因此，在一些实施方案中，与通用标签结合的相同CAR可用于治疗不同的癌症，条件是存在识别癌症相关抗原的含有通用标签的可用抗体。在特定实施方案中，颗粒(例如，珠颗粒)包含表面暴露的结合分子，所述表面暴露的结合分子包括能够由重组受体(例如，CAR)结合或识别的通用标签结合分子。在某些实施方案中，结合分子是由抗原受体(例如，CAR)结合或识别的通用标签或其部分。特定的实施方案设想可以与抗体或其抗原结合片段或变体融合的、不阻止抗体与其各自的靶标结合的任何多肽结构域均适合用作通用标签。在一些实施方案中，颗粒与包含通用标签或其部分的结合分子结合，所述通用标签或其部分选自：FITC、链霉亲和素、生物素、组氨酸、二硝基苯酚、多甲藻素叶绿素蛋白复合物、绿色荧光蛋白、PE、HRP、棕榈酰化、亚硝基化、碱性磷酸酶(alkalanine phosphatase)、葡萄糖氧化酶和麦芽糖结合蛋白。
b.抗体
在一些方面，结合分子是特异性识别重组受体(例如，CAR)的抗体或其抗原结合片段。在这些方面的一些实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性识别重组受体(例如，CAR)的胞外部分(例如，特异性结合重组受体的胞外部分上的表位)。
在一些方面，结合分子是特异性识别重组受体(例如重组受体，例如CAR，如第III节中所述)的抗独特型抗体或其抗原结合片段(“抗ID”)。特别地，抗独特型抗体靶向另一种抗体的抗原结合位点，如CAR的胞外抗原结合结构域的scFv。在一些实施方案中，抗ID能够与重组受体结合以刺激重组受体依赖性活性。针对抗原特异性CAR的示例性抗独特型抗体是已知的。这些包括但不限于针对CD22定向CAR的抗独特型抗体，参见例如，PCT公开号WO2013188864；针对CD19定向CAR的抗独特型抗体，参见例如，PCT公开号WO 2018/023100；针对GPRC5D定向CAR的抗独特型抗体，参见例如，PCT申请号PCT/US2020/063497；和针对BCMA定向CAR的抗独特型抗体，参见例如，PCT申请号PCT/US2020/063492。如上所述，抗独特型抗体可以固定或附接至表面支持物(例如，珠)，以用作针对表达由抗独特型抗体靶向的重组受体(例如，CAR)的细胞的重组受体刺激剂。
本文的术语“抗体”是以最广义使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括抗原结合的片段(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
术语“抗独特型抗体”是指特异性地识别、特异性地靶向和/或特异性地结合抗体的独特位(如抗原结合片段)的抗体(包括其抗原结合片段)。抗体的独特位可以包括但不必限于在抗体的一个或多个互补决定区(CDR)、抗体的可变区、和/或此类可变区和/或此类CDR的局部部分或部分、和/或前述的任何组合内的残基。CDR可以是选自以下中的一个或多个：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。抗体的可变区可以是重链可变区、轻链可变区、或重链可变区和轻链可变区的组合。抗体的重链可变区和/或轻链可变区的部分片段或部分可以是如下片段，所述片段包括在抗体的重链可变区或轻链可变区内的2个或更多个、5个或更多个、或10个或更多个连续氨基酸，例如从约2至约100、从约5至约100、从约10至约100、从约2至约50、从约5至约50、或从约10至约50个连续氨基酸；独特位可以包括多个不连续的氨基酸延伸段。抗体的重链可变区和轻链可变区的部分片段可以是如下片段，所述片段包括在可变区内的2个或更多个、5个或更多个、或10个或更多个连续氨基酸，例如从约2至约100、从约5至约100、从约10至约100、从约2至约50、从约5至约50、或从约10至约50个连续氨基酸，并且在一些实施方案中含有一个或多个CDR或CDR片段。CDR片段可以是在CDR内的连续或非连续的2个或更多个、或5个或更多个氨基酸。因此，抗体的独特位可以是在抗体的重链可变区或轻链可变区内的、含有一个或多个CDR或一个或多个CDR片段的从约2至约100、从约5至约100、从约10至约100、从约2至约50、从约5至约50、或从约10至约50个连续氨基酸。在另一个实施方案中，独特位可以是位于抗体的可变区(例如，CDR位点)的单个氨基酸。
在一些实施方案中，独特位是抗体的可变部分内的任何单一抗原决定簇或表位。在一些情况下，它可以与抗体的实际抗原结合位点重叠，并且在一些情况下，它可以包含在抗体的抗原结合位点之外的可变区序列。在一些实施方案中，抗体的单独独特位的集合被称为此类抗体的“独特型”。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在本领域中是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中已知是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variabledomains:an automatic modeling and analysis tool,”J MolBiol,2001年6月8日；309(3):657-70(“Aho”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对的，而Chothia方案是基于结构信息的。Kabat和Chothia方案的编号基于最常见的抗体区序列长度，其中通过插入字母例如“30a”提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。
下表1列出了分别通过Kabat、Chothia和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如FR-L1位于CDR-L1与CDR-L2之间，依此类推。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。
表1.根据各种编号方案的CDR边界。
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2)涵盖如由任何上述方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这样的CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何上述方案所定义的。在一些实施方案中，规定了指定的CDR序列。
同样，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2)涵盖如由任何已知方案所定义的一个(或特定的)框架区。在一些情况下，规定了用于鉴定特定的CDR、FR或者FR或CDR的方案，如通过Kabat、Chothia或Contact方法定义的CDR。在其他情形中，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些方面，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是这样的抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基都源自非人CDR并且所有或基本上所有框架区(FR)氨基酸残基都源自人FR。在一些实施方案中，非人抗体(例如鼠抗体)的人源化形式是嵌合抗体，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在某些实施方案中，人源化抗体是来自非人物种的抗体，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(FR)。在一些实施方案中，人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。(参见例如，Queen的美国专利号5,585,089和Winter的美国专利号5,225,539)。此类嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。
在某些实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的重链可变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所需特异性、亲和力和/或能力的小鼠、大鼠、兔、或非人灵长类动物)的重链可变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。在一些实施方案中，编码人可变重链和可变轻链的核酸序列被改变为由编码非人抗体序列(供体序列)中的相应CDR的序列替代人(受体)序列的一个或多个CDR序列。在一些实施方案中，人受体序列可以包含源自不同基因的FR。在特定实施方案中，人源化抗体将含有至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的高变环对应，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。在一些实施方案中，人源化抗体任选地也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见例如，Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如，Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利号6,982,321和7,087,409，将其通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文提供人源化抗独特型抗体。
在特定实施方案中，抗体(例如，抗独特型抗体)是人源化的。在某些实施方案中，抗体通过任何合适的已知方法进行人源化。例如，在一些实施方案中，人源化抗体可以在其中引入一个或多个非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。在特定的实施方案中，人源化基本上可以通过按照Winter和同事的方法来进行(Jones等人(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等人(1988)Nature332:323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 239:1534-1536)，如通过用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中显著少于完整的人可变结构域用非人物种的相应序列取代。在某些实施方案中，人源化抗体是这样的人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
随后可以通过将所提供的可变重链和可变轻链序列连接至人恒定重链区和恒定轻链区来获得编码全长抗体的序列。合适的人恒定轻链序列包括κ和λ恒定轻链序列。合适的人恒定重链序列包括IgG1、IgG2和编码具有呈现的免疫刺激特性的IgG1突变体的序列。此类突变体可能具有降低的激活补体和/或抗体依赖性细胞毒性的能力，并描述于美国专利号5,624,821、WO 99/58572、美国专利号6,737,056中。合适的恒定重链还包括IgG1，其包含取代E233P、L234V、L235A、A327G、A330S、P331S和残基236的缺失。在另一个实施方案中，全长抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM、IgY或IgW序列。
合适的人供体序列可以通过以下方法来确定：将由小鼠供体序列编码的肽序列与由一组人序列编码的肽序列，优选地与人种系免疫球蛋白基因或成熟抗体基因编码的序列进行序列比较。具有高序列同源性，优选具有确定的最高同源性的人序列可以充当用于人源化过程的受体序列。
除了将人CDR交换为小鼠CDR之外，还可以在人供体序列中进行进一步的操作以获得编码具有优化特性(如抗原的亲和力)的人源化抗体的序列。
此外，改变的人受体抗体可变结构域序列也可以被提供为编码对应于非人供体序列的轻链可变区的位置4、35、38、43、44、46、58、62、64、65、66、67、68、69、73、85、98和重链可变区的位置2、4、36、39、43、45、69、70、74、75、76、78、92的一个或多个氨基酸(根据Kabat编号系统)(Carter和Presta，美国专利号6,407,213)。
在特定实施方案中，通常希望抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。在一些实施方案中，为了达到此目的，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型是一般可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。可以获得说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些展示容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过这种方式，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到希望的抗体特征，如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。通常，高变区残基直接且最实质地参与对抗原结合的影响。
在特定实施方案中，用于制备人源化抗体的人轻链和重链二者可变结构域的选择对于降低抗原性可能是重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，用啮齿动物抗体的可变结构域序列对已知人可变结构域序列的整个文库进行筛选。然后接受与啮齿动物最接近的人序列作为人源化抗体的人框架。参见例如，Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196:901。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体。参见例如，Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；Presta等人(1993)J.Immunol.,151:2623。
所提供的抗体包括人抗体。“人抗体”是具有与人或人细胞或者利用人抗体库或其他人抗体编码序列(包括人抗体文库)的非人来源产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。所述术语不包括包含非人抗原结合区的非人抗体的人源化形式，如所有或基本上所有CDR都是非人的那些。
人抗体可以通过将免疫原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已经被修饰以响应于抗原激发产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其替代内源免疫球蛋白基因座或者其存在于在染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因动物中，通常内源免疫球蛋白基因座已经失活。人抗体也可以来源于含有源自人库的抗体编码序列的人抗体文库，包括噬菌体展示和无细胞文库。
所提供的抗体包括单克隆抗体，包括单克隆抗体片段。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体的群体(即，构成所述群体的单独抗体是相同的，但含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的产生期间产生的可能变体除外，此类变体通常以少量存在)获得或在所述群体内的抗体。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一表位。所述术语不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于从杂交瘤生成、重组DNA方法、噬菌体展示和其他抗体展示方法。
2.靶标表达细胞
在一些实施方案中，重组受体刺激剂是表达由抗原受体识别的靶标的细胞，即重组受体刺激剂是靶标表达细胞。在一些实施方案中，靶标是重组受体的抗原，因此在一些情况下，靶标表达细胞是抗原表达细胞。在一些实施方案中，重组受体刺激剂是抗原表达细胞，如表达如上所述的抗原的细胞。
在某些实施方案中，细胞(例如，靶标表达细胞，如抗原表达细胞)对于受试者是外源的、异源的和/或自体的。在一些实施方案中，细胞对于受试者是外源的。
在某些实施方案中，靶标表达细胞表达由重组受体结合和/或识别的靶标。在一些实施方案中，靶标是抗体，并且靶标表达细胞表达抗体。在一些实施方案中，靶标表达细胞是肿瘤细胞。在特定实施方案中，靶标表达细胞是原代细胞。
在一些实施方案中，靶标是由重组受体识别的抗原，并且靶标表达细胞是抗原表达细胞。在某些实施方案中，抗原表达细胞表达由重组受体结合和/或识别的抗原。在一些实施方案中，抗原表达细胞是肿瘤细胞。在特定实施方案中，抗原表达细胞是原代细胞。在一些实施方案中，细胞系是永生细胞系。在特定实施方案中，抗原表达细胞是癌性细胞和/或肿瘤细胞。在一些实施方案中，抗原表达细胞源自癌细胞和/或肿瘤细胞，例如，人癌细胞和/或人肿瘤细胞。在一些实施方案中，抗原表达细胞是来自癌细胞系，任选地人癌细胞系的细胞。在一些实施方案中，抗原表达细胞是来自肿瘤细胞系，任选地人肿瘤细胞系的细胞。
在特定实施方案中，抗原表达细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，抗原表达细胞是循环肿瘤细胞，例如，肿瘤性免疫细胞，如肿瘤性B细胞(或源自肿瘤性B细胞的细胞)。
在特定实施方案中，抗原表达细胞表达整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原IB(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、胎儿乙酰胆碱受体、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-AIA1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-Al、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(KG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)或其组合。在一些实施方案中，抗原表达细胞表达病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签缔合的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在特定实施方案中，抗原表达细胞表达一种或多种与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任一种。在某些实施方案中，抗原表达细胞表达CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b、CD30或其组合。在一些实施方案中，抗原表达细胞表达CD19，例如人CD19。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特有的或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。在某些实施方案中，抗原表达细胞是或源自肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是癌性的。在特定实施方案中，肿瘤细胞是非癌性的。在一些实施方案中，肿瘤细胞是或源自循环B细胞，如能够在体内形成肿瘤的循环B细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是或源自作为肿瘤性、致瘤性或癌性B细胞的循环B细胞。
在某些实施方案中，肿瘤细胞是或源自人癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞源自以下癌症的细胞：AIDS相关癌症、乳腺癌、消化道/胃肠道癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、结肠癌、结直肠癌、食管癌、胆囊癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌瘤、肝癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌、胃(胃的)癌、内分泌系统癌、肾上腺皮质癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、甲状腺癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、肾(肾细胞)癌、阴茎癌、前列腺癌、移行细胞肾盂和输尿管癌、睾丸癌、尿道癌、肾母细胞瘤或其他儿童肾肿瘤、胚细胞癌、中枢神经系统癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、卵巢胚细胞瘤、妇科癌症、宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、卵巢上皮癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、头颈癌、下咽癌、喉癌、唇和口腔癌、转移性鳞颈癌(metastatic squamous neck cancer)、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、肌肉骨骼癌、骨癌、尤因氏肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、神经系统癌、脑肿瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎瘤、中枢神经系统胚细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脊髓肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤、神经母细胞瘤、呼吸系统癌、胸腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮肤癌、卡波西肉瘤、黑色素瘤或梅克尔细胞癌、或其任何等效的人癌症。
在特定实施方案中，肿瘤细胞源自非血液学癌症，例如，实体瘤。在某些实施方案中，肿瘤细胞源自血液学癌症。在某些实施方案中，肿瘤细胞源自作为B细胞恶性肿瘤或血液学恶性肿瘤的癌症。在特定实施方案中，肿瘤细胞源自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、急性髓性白血病(AML)或骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤(MM))或其任何等效的人癌症。在一些实施方案中，抗原表达细胞是肿瘤性、癌性和/或致瘤性B细胞。多种肿瘤细胞系是已知的和可用的，并且可以根据由特定重组受体(例如，CAR)识别的抗原进行选择。
许多肿瘤细胞系中的任一种是已知的和可用的。表达特定肿瘤抗原的肿瘤细胞系是已知的或肿瘤抗原的表面表达可以由熟练技术人员使用多种技术中的任一种(如通过流式细胞术)容易地确定或测量。示例性肿瘤细胞系包括但不限于淋巴瘤细胞(Raji；Daudi；Jeko-1；BJAB；Ramos；NCI-H929；BCBL-1；DOHH-2、SC-1、WSU-NHL、JVM-2、Rec-1、SP-53、RL、Granta 519、NCEP-1、CL-01)；白血病细胞(BALL-1、RCH-ACV、SUP-B15)；宫颈癌细胞(33A；CaSki；HeLa)；肺癌细胞(NCI-H358；A549、H1355、H1975、Calu-1、H1650和H727)；乳腺癌细胞(Hs-578T；ZR-75-1；MCF-7；MCF-7/HER2；MCF10A；MDA-MB-231；SKBR-3、BT-474、MDA-MB-231)；卵巢癌细胞(ES-2；SKOV-3；OVCAR3；HEY1B)；多发性骨髓瘤细胞(U266、NCI-H929、RPMI-8226、OPM2、LP-1、L363、MM.1S、MM.1R、MC/CAR、JJN3、KMS11、AMO-1、EJM；MOLP-8)。例如，示例性CD19表达细胞系包括但不限于Raji、Daudi和BJAB；示例性CD20表达细胞系包括Daudi、Ramos和Raji；示例性CD22表达细胞系包括但不限于Ramos、Raji、A549、H727和H1650；示例性Her2表达细胞系包括SKOV3、BT-474和SKBR-3；示例性BCMA表达细胞系包括但不限于RPMI-8226、NCI-H929、MM1S、MM1R和KMS11；示例性GPRC5D表达细胞系包括但不限于AMO-1、EJM、NCI-H929、MM.1S、MM1.R、MOLP-8和OPM-2；示例性ROR1表达细胞系包括但不限于A549、MDA-MB-231、H1975、BALL-1和RCH-ACV。
在一些实施方案中，靶标表达细胞系是已经转导以表达重组受体的靶标的细胞系。在一些实施方案中，靶标是肿瘤抗原。在特定实施方案中，抗原表达细胞系是已经转导以表达肿瘤抗原的细胞系。此细胞系可以是哺乳动物细胞系，包括但不限于人细胞系。在一些实施方案中，人细胞系可以是K562、U937、721.221、T2和C1R细胞。例如，可以向K562慢性髓性白血病细胞系引入编码肿瘤抗原的核酸。在一些实施方案中，可以将细胞系用编码目的肿瘤抗原的质粒载体或信使RNA(mRNA)工程化。在一些实施方案中，引入可以通过基于慢病毒的转导。在一些实施方案中，细胞系(例如，K562细胞)稳定表达编码肿瘤抗原的外源核酸。在一些实施方案中，可以将外源核酸整合到细胞系(例如，K562细胞)的基因组中。在一些实施方案中，可以将外源核酸整合到细胞系(例如，K562细胞)的基因组中的特定基因座处。在一些实施方案中，可以将外源核酸整合到细胞系(例如，K562细胞)的基因组中的基因组安全港(genomic safe harbour，GSH)处。GSH是支持外源核酸的稳定整合和表达同时使与宿主细胞基因组的不希望的相互作用的风险最小化的位点(参见例如，Sadelain等人,Nat Rev Cancer.(2011)12(1):51-8)。已经鉴定了几种用于将外源核酸稳定整合到人细胞中的安全GSH，包括AAVS1，AAV病毒在19号染色体上的天然存在的整合位点；CCR5基因，一种趋化因子受体基因，也称为HIV-1共受体；和小鼠Rosa26基因座的人直系同源物(参见例如，Papapetrou和Schambach Mol Ther.(2016)24(4):678-684)。
在一些实施方案中，与固定量的表达重组受体的治疗性组合物的细胞(效应细胞)相比，靶标表达细胞在多个孵育中以不同的比率变化或逐步调整。在一些实施方案中，逐步调整量为从100:1至0.001比率的靶标表达靶细胞与效应T细胞(T:E)，如逐步调整量为从50:1至0.050的T:E比率、从25:1至0.025的T:E比率、从12:1至0.012:1的T:E比率、从10:1至0.010的T:E比率或从5:1至0.5的T:E比率。在一些实施方案中，比率为或为约从12:1至0.012:1的T:E比率。具体的比率范围可以根据具体的靶标和所采用的靶细胞凭经验确定。例如，所选择的比率是这样的比率，其包括跨多个逐步调整量的重组受体依赖性活性的线性剂量反应增加。在一些实施方案中，选择比率以还包括受体依赖性活性的较低渐近线和受体依赖性活性的较高渐近线，其分别表示最小和最大反应。
例如，靶标是重组受体的抗原。在一些实施方案中，与固定量的表达重组受体的治疗性组合物的细胞(效应细胞)相比，抗原表达细胞在多个孵育中以不同的比率变化或逐步调整。在一些实施方案中，逐步调整量为从100:1至0.001比率的抗原表达靶细胞与效应T细胞(T:E)，如逐步调整量为从50:1至0.050的T:E比率、从25:1至0.025的T:E比率、从12:1至0.012:1的T:E比率、从10:1至0.010的T:E比率或从5:1至0.5的T:E比率。在一些实施方案中，比率为或为约从12:1至0.012:1的T:E比率。具体的比率范围可以根据具体的抗原和所采用的靶细胞凭经验确定。例如，所选择的比率是这样的比率，其包括跨多个逐步调整量的重组受体依赖性活性的线性剂量反应增加。在一些实施方案中，选择比率以还包括受体依赖性活性的较低渐近线和受体依赖性活性的较高渐近线，其分别表示最小和最大反应。
C.测量重组受体依赖性活性
本文提供的用于评估效力的方法包括测量治疗性细胞组合物响应于对治疗性细胞组合物的工程化细胞的重组受体的刺激的活性。如上所述，所提供的测定允许测量来自多个孵育条件的响应于重组受体刺激剂(如在第I-B节中所述)的重组受体依赖性活性，其中每个孵育包括不同逐步调整比率的治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂。
在特定实施方案中，设想重组受体依赖性活性(例如，CAR依赖性活性)是在表达重组受体的工程化细胞中发生的、不在和/或不能在不表达重组受体的细胞中发生的活性。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是依赖于重组受体的活性或存在的活性。重组受体依赖性活性可以是直接或间接受重组受体的表达和/或存在影响或者受重组受体的活性的变化(如受体刺激)的影响的任何细胞过程。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性可以包括但不限于细胞过程如细胞分裂、DNA复制、转录、蛋白质合成、膜转运、蛋白质转位和/或分泌，或者它可以是免疫细胞功能，例如细胞溶解活性。在某些实施方案中，重组受体依赖性活性可以通过CAR受体的确认、细胞内信号传导分子的磷酸化、蛋白质的降解、蛋白质的转录、翻译、转位、和/或因子(如蛋白质、或生长因子、细胞因子)的产生和分泌的变化来测量。在某些实施方案中，重组受体是CAR。在某些实施方案中，重组受体是TCR。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性(例如，CAR依赖性活性)是在用重组受体刺激剂刺激治疗性细胞组合物后的因子的测量值，例如量或浓度、或者量或浓度的变化。在某些实施方案中，因子可以是蛋白质、磷酸化蛋白质、经切割的蛋白质、转位的蛋白质、活性确认中的蛋白质、多核苷酸、RNA多核苷酸、mRNA和/或shRNA。在一些实施方案中，测量值可以包括但不限于激酶活性、蛋白酶活性、磷酸酶活性的增加或减少、cAMP产生、ATP代谢、转位(例如蛋白质的核定位)、转录活性的增加、翻译活性的增加、可溶性因子的产生和/或分泌、细胞摄取、泛素化和/或蛋白质降解。
在一些实施方案中，因子是被分泌的可溶性因子，如激素、生长因子、趋化因子和/或细胞因子。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性(例如，CAR依赖性活性)是对用重组受体刺激剂刺激的反应。在某些实施方案中，将细胞在存在能够刺激重组受体依赖性活性的重组受体刺激剂的情况下孵育，并且活性是或包括对刺激的反应的至少一个方面。反应可以包括但不限于细胞内信号传导事件(如受体分子活性增加、一种或多种激酶的激酶活性增加、一种或多种基因的转录增加、一种或多种蛋白质的蛋白质合成增加)、和/或细胞内信号传导分子(例如，蛋白质的激酶活性增加)。在一些实施方案中，反应(例如，重组受体依赖性活性)与免疫活性相关，并且可以包括但不限于可溶性因子(例如，细胞因子)产生和/或分泌、抗体产生增加、和/或细胞溶解活性增加。
在一些实施方案中，通过测量、检测或定量对刺激物(例如，重组受体刺激剂)的重组受体依赖性活性(即至少一种因刺激物(例如，重组受体刺激剂)而启动、触发、支持、延长和/或引起的活性)来评估重组受体依赖性活性。在某些实施方案中，将治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂一起培养，其中重组受体刺激剂与重组受体的相互作用或结合刺激(如诱导)表达重组受体的细胞所特有的重组受体依赖性活性。在某些实施方案中，重组受体依赖性活性发生在表达重组受体的细胞中，但不发生在不表达受体的细胞中或仅在不表达受体的细胞中最低程度地发生。在特定实施方案中，重组受体是CAR。在一些实施方案中，活性是CAR依赖性活性。
通过重组受体刺激剂刺激工程化细胞(例如，免疫细胞或T细胞)的重组受体的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子)。在一些实施方案中，通过是否产生或分泌可溶性因子(例如细胞因子或趋化因子)来确定重组受体依赖性活性。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是表达重组受体的细胞所特有的。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是表达重组受体的细胞所特有的，并且不会发生在缺乏重组受体表达的细胞中。在某些实施方案中，重组受体是CAR，并且活性是CAR依赖性活性。在特定实施方案中，在重组受体依赖性活性存在于表达重组受体的细胞中的相同条件下，所述活性不存在于缺乏重组受体表达的细胞中。在某些实施方案中，在相同条件下，CAR依赖性活性比CAR细胞的CAR依赖性活性少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％、或约99％。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是表达重组受体(例如，CAR)的细胞所特有的，并且所述活性是通过用对表达重组受体的治疗性细胞组合物的细胞具有特异性的重组受体刺激剂刺激产生的。在一些实施方案中，重组受体是CAR，并且CAR特异性刺激刺激、触发、启动、诱导和/或延长CAR+细胞的活性，但是不刺激、触发、启动、诱导和/或延长CAR-细胞的活性。在一些实施方案中，在通过CAR特异性刺激物刺激后，CAR依赖性活性在CAR-细胞中比在CAR+细胞中少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％、或约99％。
在某些实施方案中，活性是通过对重组受体具有特异性的重组受体刺激剂(如在第I-B节中所述)刺激的重组受体依赖性(例如，CAR依赖性)活性。在一些实施方案中，重组受体刺激剂(例如，CAR特异性药剂)包括由重组受体(例如，CAR)结合和/或识别的抗原或其表位。在一些实施方案中，重组受体刺激剂包括与重组受体结合的抗体(例如，抗独特型抗体(抗ID))或其活性片段、变体或部分。在某些实施方案中，重组受体刺激剂是在其表面上表达抗原的细胞。在某些实施方案中，重组受体刺激剂是在其表面上表达抗体的细胞。在一些实施方案中，细胞来自细胞系，如在第I-B-2节中所述。在一些实施方案中，细胞系是肿瘤细胞系。在一些实施方案中，细胞表达肿瘤抗原。
在一些实施方案中，在含有表达重组受体(例如，CAR)的细胞的治疗性细胞组合物中测量重组受体依赖性活性，并且将测量值与一个或多个对照进行比较。在某些实施方案中，对照是未受刺激的相似或相同的细胞组合物。例如，在一些实施方案中，在与重组受体刺激剂一起孵育之后或期间在细胞组合物中测量重组受体依赖性活性，并且将所得的测量值与来自未与重组受体刺激剂一起孵育的相似或相同细胞组合物的活性的对照测量值进行比较。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物和对照细胞组合物两者均含有表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，对照是从不含有表达重组受体的细胞(例如，CAR+细胞)的相似细胞组合物取得的。因此，在一些实施方案中，使含有重组受体表达细胞的治疗性细胞组合物和不含有重组受体表达细胞的对照细胞组合物与重组受体刺激剂接触。在某些实施方案中，对照是来自任何刺激之前取得的表达重组受体的相同细胞组合物的测量值。在某些实施方案中，获得对照测量值以确定背景信号，并且从活性的测量值中减去对照测量值。在一些实施方案中，将在细胞组合物中的活性的测量值除以对照测量值，以获得活性与对照水平的比率的值。在一些实施方案中，将所有重组受体依赖性活性测量值相对于对照测量值(例如，其中不将重组受体刺激剂与治疗性细胞组合物的细胞一起培养)调整或归一化。在一些实施方案中，将测量值相对于对照条件调整或归一化提供了重组受体依赖性活性的更准确量度。
在特定实施方案中，重组受体依赖性活性是或包括可溶性因子的产生和/或分泌。在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)依赖性活性是或包括可溶性因子的产生和/或分泌。在某些实施方案中，可溶性因子是细胞因子或趋化因子。
用于测量可溶性因子的产生或分泌的合适技术在本领域中是已知的。可溶性因子的产生和/或分泌可以通过测定因子的胞外量的浓度或量，或测定编码因子的基因的转录活性的量来测量。合适的技术包括但不限于以下测定：如免疫测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定、mRNA表达水平测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、流式细胞术测定、表面等离子体共振(SPR)、化学发光测定、侧向流动免疫测定、抑制测定或亲合力测定、蛋白质微阵列、高效液相色谱(HPLC)、MesoScale Discovery(MSD)电化学发光和基于珠的多重免疫测定(MIA)。在一些实施方案中，合适的技术可以使用特异性地结合可溶性因子的可检测结合试剂。
在特定实施方案中，通过ELISA(酶联免疫吸附测定)来测量可溶性因子(例如，细胞因子)的测量值。ELISA是设计用于检测和定量物质如肽、细胞因子、抗体和激素的一种基于板的测定技术。在ELISA中，必须将可溶性因子固定在固体表面上，然后与跟酶连接的抗体复合。经由与底物一起孵育以产生可检测的信号评估缀合的酶活性来完成检测。在一些实施方案中，用ELISA测定来测量重组受体依赖性活性。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是可溶性因子(例如，细胞因子)的分泌或产生。在某些实施方案中，通过能够与重组受体结合以刺激重组受体依赖性活性(例如，CAR依赖性活性)的重组受体刺激剂，在含有重组受体表达细胞(例如，CAR表达细胞)的治疗性细胞组合物中刺激产生或分泌。在一些实施方案中，重组受体刺激剂包括对重组受体具有特异性的抗原或其表位；是表达抗原的细胞；或者包括结合和/或识别重组受体的抗体或其部分或变体；或其组合(参见例如，以上第I-B节)。在某些实施方案中，重组受体刺激剂是重组蛋白，所述重组蛋白包含由重组受体结合或识别的抗原或其表位。
在某些实施方案中，重组受体依赖性活性是可溶性因子产生和/或分泌，其通过将含有表达重组受体(例如，CAR)的细胞的治疗性细胞组合物与重组受体刺激剂(如第I-B节中所述)一起孵育来测量。在某些实施方案中，可溶性因子是细胞因子或趋化因子。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物中含有重组受体表达细胞的细胞在存在重组受体刺激剂的情况下孵育一定的时间量，并且在孵育期间在一个或多个时间点处测量可溶性因子的产生和/或分泌。在一些实施方案中，将细胞与重组受体刺激剂一起孵育长达或约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约48小时，或孵育在1小时与4小时之间、在1小时与12小时之间、在12小时与24小时之间(每个都包含端值)的持续时间，或孵育超过24小时，并且检测可溶性因子(例如，细胞因子)的量。
在一些实施方案中，重组受体刺激剂是颗粒(例如，珠)，所述颗粒附接或固定有由重组受体识别的抗原或其部分，或附接或固定有对重组受体的胞外结构域(例如，胞外抗原结合结构域(例如，scFv))具有特异性的抗体(例如，抗独特型抗体)。在一些实施方案中，将重组受体(例如，CAR)和治疗性细胞组合物的恒定数量的细胞与颗粒以治疗性细胞组合物的细胞与颗粒的多个比率一起孵育，所述多个比率如包括为或约1:100、1:75、1:50、1:40、1:30、1:20、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1，或任何前述值之间的范围，如在1:1与1:10或1:0.2至1:12之间的比率，每个都包含端值。在一些实施方案中，多个比率包括本文提供的任何或所有比率。在一些实施方案中，重组受体刺激剂是表达由重组受体识别的抗原的细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAR，并且将治疗性细胞组合物的逐步调整数量的细胞与恒定数量的此类颗粒以治疗性细胞组合物的细胞与颗粒的多个比率一起孵育，所述多个比率如为或约1:100、1:75、1:50、1:40、1:30、1:20、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1，或任何前述值之间的范围，如在1:1与1:10或1:0.2至1:12之间的比率，每个都包含端值。在一些实施方案中，多个比率包括本文提供的任何或所有比率。
在一些实施方案中，重组受体刺激剂是表达由重组受体识别的靶标(例如，抗原或抗体)的细胞。在一些实施方案中，将重组受体(例如，CAR)和治疗性细胞组合物的恒定数量的细胞与所述细胞以治疗性细胞组合物的细胞与表达靶标(例如，抗原或抗体)的细胞的多个比率一起孵育，所述多个比率包括为或约1:100、1:75、1:50、1:40、1:30、1:20、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1，或任何前述值之间的范围，如在1:1与1:10或1:0.2至1:12之间的比率，每个都包含端值。在一些实施方案中，多个比率包括本文提供的任何或所有比率。在一些实施方案中，重组受体是CAR，并且将治疗性细胞组合物的逐步调整数量的细胞与恒定数量的表达靶标(例如，抗原或抗体)的细胞以治疗性细胞组合物的细胞与表达抗原的细胞的多个比率一起孵育，所述多个比率包括为或约1:100、1:75、1:50、1:40、1:30、1:20、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2或1:0.1，或任何前述值之间的范围，如在1:1与1:10或1:0.2至1:12之间的比率，每个都包含端值。在一些实施方案中，多个比率包括本文提供的任何或所有比率。
在一些实施方案，将细胞组合物的在约1x102个与约1x104个之间、在约1x103个与约1x105个之间、在约1x104个与约1x106个之间、在约1x105个与约1x107个之间、在约1x106个与约1x108个之间、在约1x107个与约1x109个之间、和在约1x108个与约1x1010个之间的细胞(每个都包含端值)与恒定量或浓度的重组受体刺激剂一起孵育。
在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物的细胞在一定体积的细胞培养基中与重组受体刺激剂一起孵育。应当理解，精确的体积可以凭经验确定，并且随着在其中进行测定的器皿(例如，多孔板)的表面积变化。在某些实施方案中，将细胞在至少或约1μL、至少或约10μL、至少或约25μL、至少或约50μL、至少或约100μL、至少或约500μL、至少或约1mL、至少或约1.5mL、至少或约2mL、至少或约2.5mL、至少或约5mL、至少或约10mL、至少或约20mL、至少或约25mL、至少或约50mL、至少或约100mL、或大于100mL的体积中与重组受体刺激剂一起孵育。在某些实施方案中，将细胞在落入在约1μL与约100μL之间、在约100μL与约500μL之间、在约500μL与约1mL之间、在约500μL与约1mL之间、在约1mL与约10mL之间、在约10mL与约50mL之间、或在约10mL与约100mL之间(每个都包含端值)的体积中与重组受体刺激剂一起孵育。在某些实施方案中，将细胞在约100μL与约1mL之间(包含端值)的体积中与重组受体刺激剂一起孵育。在特定实施方案中，将细胞在约500μL的体积中与重组受体刺激剂一起孵育。在一些实施方案中，多孔板是6孔板，并且体积是为或约1mL至为或约3mL。在一些实施方案中，多孔板是12孔板，并且体积是为或约1mL至为或约2mL。在一些实施方案中，多孔板是24孔板，并且体积是为或约0.5mL至为或约1mL。在一些实施方案中，多孔板是48孔板，并且体积是为或约0.2mL至为或约0.4mL。在一些实施方案中，多孔板是96孔板，并且体积是为或约0.1mL至为或约0.2mL。
在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物的恒定数量的细胞与浓度在约1fmol与约1pmol之间、在约1pmol与约1nmol之间、在约1nmol与约1μmol之间、在约1μmol与约1mmol之间、或在约1mmol与1mol之间(每个都包含端值)变化的重组受体刺激剂一起孵育。在特定实施方案中，将治疗性细胞组合物的恒定数量的细胞与浓度在约1fM与约1pM之间、在约1pM与约1nM之间、在约1nM与约1μM之间、在约1μM与约1mM之间、或在约1mM与1mol之间(每个都包含端值)变化的重组受体刺激剂一起孵育。示例性单位包括但不限于pg/mL、pg/(mL/hr)、pg(mL x细胞)、pg/(mL x hr x细胞)、和pg/(mL x hr x 106个细胞)。
在某些实施方案中，对于所测试的多个比率中的每一个，重组受体依赖性活性(例如，CAR依赖性活性)的测量值是在孵育期间或结束时的时间点的治疗性细胞组合物中可溶性因子的量或浓度、或相对量或浓度。在特定实施方案中，将测量值减去对照测量值或相对于对照测量值归一化。在一些实施方案中，对照测量值是在孵育之前取得的来自相同细胞组合物的测量值。在特定实施方案中，对照测量值是从未与结合分子一起孵育的相同对照细胞组合物取得的测量值。在某些实施方案中，对照是在与结合分子孵育期间的相同时间点从不含有重组受体阳性细胞的细胞组合物取得的测量值。
在一些实施方案中，测量值是如与对照相比的量或浓度的归一化比率。在特定实施方案中，测量值是每时间量(例如，每分钟或每小时)的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是每个细胞或每设定或参考数量的细胞(例如，每100个细胞、每103个细胞、每104个细胞、每105个细胞、每106个细胞等)的可溶性因子的量或浓度。在某些实施方案中，测量值是每时间量、每个细胞或每参考数量的细胞的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是每个表达重组受体的细胞的可溶性因子的量或浓度。在某些实施方案中，测量值是每时间量(例如，每分钟或每小时)治疗性细胞组合物的每个表达重组受体的细胞(CAR+细胞)的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是每时间量每重组受体或重组受体刺激剂的量或浓度的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是每个细胞或每设定或参考数量的细胞每重组受体刺激剂的量或浓度的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是每时间量、每重组受体或重组受体刺激剂的量或浓度、每个细胞或每参考数量的细胞的可溶性因子的量或浓度。在一些实施方案中，测量值是每重组受体或重组受体刺激剂的量或浓度、每个表达重组受体的细胞的可溶性因子的量或浓度。在某些实施方案中，测量值是每时间量、每重组受体或重组受体刺激剂的量或浓度、每治疗性细胞组合物的CAR+细胞的量的可溶性因子的量或浓度。
在特定实施方案中，重组受体或CAR依赖性活性是两种或更多种可溶性因子的产生或分泌。在某些实施方案中，重组受体依赖性活性或CAR依赖性活性是两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或超过十种可溶性因子的产生或分泌。在一些实施方案中，将两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或超过十种可溶性因子的测量值合并成算术平均值或几何平均值。在某些测量中，重组受体依赖性活性的测量值是两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或超过十种可溶性因子的分泌或复合值。
在特定实施方案中，将重组受体依赖性活性的测量值例如通过对数变换进行变换。在某些实施方案中，将重组受体活性的测量值通过常用对数(log10(x))、自然对数(ln(x))或二元对数(log2(x))进行变换。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性的测量值是两种或更多种可溶性因子的产生或分泌的测量值的复合值。在一些实施方案中，在合并成复合测量值之前，将可溶性因子的产生或分泌的两个或更多个测量值进行变换。在特定实施方案中，在相对于参考测量值归一化之前，将重组受体依赖性活性的测量值进行变换。在某些实施方案中，在相对于参考测量值归一化之前，将重组受体依赖性活性的测量值进行变换。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性的归一化是相对于从多个孵育测量的最大重组受体依赖性活性进行的。
在某些实施方案中，可溶性因子是细胞因子。细胞因子是在细胞通讯中广泛发挥作用的一大组小的信号传导分子。细胞因子最常与各种免疫调节分子(包括白介素、趋化因子和干扰素)相关。可替代地，细胞因子可以通过它们的结构来表征，其被分类为四个家族：包括IL-2亚家族、IFN亚家族和IL-10亚家族的四α螺旋家族；IL-1家族、IL-17家族、和包括转化生长因子β家族成员的半胱氨酸结细胞因子。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是包括白介素、干扰素和趋化因子的一种或多种可溶性因子的产生或分泌。在特定实施方案中，重组受体依赖性活性(例如，CAR依赖性活性)是IL-2家族成员、IFN亚家族成员、IL-10亚家族成员；IL-1家族成员、IL-17家族成员、半胱氨酸结细胞因子和/或转化生长因子β家族的成员中的一种或多种的产生或分泌。
在特定实施方案中，重组受体依赖性活性或CAR依赖性活性是IL-1、IL-1β、IL-2、sIL-2Ra、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL 27、IL-33、IL-35、TNF、TNFα、CXCL2、CCL2、CCL3、CCL5、CCL17、CCL24、PGD2、LTB4、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1a、MIP-1b、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5中的一种或多种的产生和/或分泌。在某些实施方案中，CAR依赖性活性是Th17细胞因子的产生或分泌。在一些实施方案中，Th17细胞因子是GMCSF。在一些实施方案中，CAR依赖性活性包括Th2细胞因子的产生或分泌，其中所述Th2细胞因子是IL-4、IL-5、IL-10或IL-13。
在某些实施方案中，重组受体依赖性活性或CAR依赖性活性是促炎细胞因子的产生或分泌。促炎性细胞因子在启动炎性应答中起作用并且调节针对介导先天免疫应答的病原体的宿主防御。促炎性细胞因子包括但不限于白介素(IL)、白介素-l-β(IL-1)、白介素-3(IL-3)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-13(IL-13)、肿瘤坏死因子(TNF)、CXC-趋化因子配体2(CXCL2)、CC-趋化因子配体2(CCL2)、CC-趋化因子配体3(CCL3)、CC-趋化因子配体5(CCL5)、CC-趋化因子配体17(CCL17)、CC-趋化因子配体24(CCL24)、前列腺素D2(PGD2)和白三烯B4(LTB4)以及IL-33。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性或CAR依赖性活性是白介素和/或TNF家族成员的产生和/或分泌。在特定实施方案中，重组受体依赖性活性或CAR依赖性活性是IL-1、IL-6、IL-8、和IL-18、TNF-α或其组合的产生和/或分泌。
在特定实施方案中，重组受体活性(例如，CAR依赖性活性)是IL-2、IFN-γ、TNF-α或其组合的分泌。在一些实施方案中，重组受体活性(例如，CAR依赖性活性)是IL-2的分泌。在一些实施方案中，重组受体活性(例如，CAR依赖性活性)是IFN-γ的分泌。在一些实施方案中，重组受体活性(例如，CAR依赖性活性)是TNF-α的分泌。
在特定实施方案中，重组受体依赖性活性是治疗性细胞组合物的细胞溶解(细胞毒性)活性。在一些实施方案中，通过以下方式评估重组受体依赖性细胞溶解活性：将表达重组受体的细胞或含有表达重组受体的细胞的细胞组合物暴露于变化量的表达由重组受体结合和/或识别的抗原和/或表位的靶细胞、与变化量的表达由重组受体结合和/或识别的抗原和/或表位的靶细胞一起孵育、和/或与变化量的表达由重组受体结合和/或识别的抗原和/或表位的靶细胞接触。可以通过直接或间接测量随时间的靶细胞数量来测量细胞溶解活性。例如，可以在与重组受体表达细胞孵育之前将靶细胞与可检测标记(可检测的然后靶细胞被裂解的这样的标记、或在存活靶细胞中是可检测的可检测标记)一起孵育。这些读数提供直接或间接的靶细胞数量和/或靶细胞死亡，并且可以在测定期间的不同时间点进行测量。靶细胞数量的减少和/或靶细胞死亡的增加指示细胞的细胞溶解活性。用于进行细胞溶解测定的合适的方法在本领域中是已知的，并且包括但不限于铬-51释放测定、非放射性铬测定、使用荧光染料(如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)、PKH-2和PKH-26)的流式细胞术测定。
在某些实施方案中，重组受体(例如，CAR)依赖性细胞溶解活性是通过将含有表达重组受体的细胞的细胞组合物与表达由重组受体结合或识别的抗原或其表位的靶细胞一起孵育来测量的。在某些实施方案中，重组受体是CAR。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物的细胞与表达抗原的细胞以如下比率一起孵育，所述比率包括10:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、或约1:10，或在10:1与1:1之间、在3:1与1:3之间、或在1:1与1:10之间的比率(每个都包含端值)。在一些实施方案中，将细胞组合物的细胞与靶细胞以治疗性细胞组合物的CAR+细胞与靶细胞的如下比率一起孵育，所述比率包括约10:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、或约1:10，或在10:1与1:1之间、在3:1与1:3之间、或在1:1与1:10之间的比率(每个都包含端值)。
在某些实施方案中，将治疗性细胞组合物的细胞与靶细胞一起孵育长达或约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约8小时、约12小时、约18小时、约24小时、约48小时、或大于48小时。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物的恒定数量的细胞与表达抗原的细胞一起孵育约18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时。在一些实施方案，将治疗性细胞组合物的在约1x102个与约1x104个之间、在约1x103个与约1x105个之间、在约1x104个与约1x106个之间、在约1x105个与约1x107个之间、在约1x106个与约1x108个之间、在约1x107个与约1x109个之间、或在约1x108个与约1x1010个之间的细胞(每个都包含端值)与变化数量的抗原表达细胞一起孵育以生成多个比率。在某些实施方案，将治疗性细胞组合物的在约1x102个与约1x104个之间、在约1x103个与约1x105个之间、在约1x104个与约1x106个之间、在约1x105个与约1x107个之间、在约1x106个与约1x108个之间、在约1x107个与约1x109个之间、或在约1x108个与约1x1010个之间的CAR+细胞(每个都包含端值)的恒定量的细胞与变化数量的抗原表达细胞一起孵育以生成多个比率。
在一些实施方案中，将活性的测量值与对照进行比较。在某些实施方案中，对照是未与细胞组合物一起孵育的抗原表达细胞的培养物。在一些实施方案中，对照是来自以相同比率与抗原表达细胞一起孵育的不含有CAR+细胞的对照细胞组合物的测量值。
在某些实施方案中，对于每个所测试的比率，细胞溶解活性测定的测量值是在孵育期间或结束时的时间点存活的抗原表达细胞的数量。在某些实施方案中，测量值是在孵育期间释放的靶细胞死亡标记(例如铬-51)的量。在一些实施方案中，测量值是通过从单独孵育的对照的靶细胞的量减去在给定时间点在共孵育中的靶细胞的量确定的靶细胞死亡的量。在一些实施方案中，测量值是与靶细胞的起始量相比在一定时间点保持的靶细胞的百分比。在特定实施方案中，测量值是在一定时间量内被杀伤的细胞的量。在某些实施方案中，测量值是每个在细胞组合物中的细胞的被杀伤的细胞的量。在一些实施方案中，测量值是每个细胞的被杀伤的细胞的量，或每设定或参考数量的细胞的被杀伤的细胞的量，例如但不限于组合物的每100个细胞、每103个细胞、每104个细胞、每105个细胞、每106个细胞、每107个细胞、每108个细胞、每109个细胞、或每1010个细胞的被杀伤的靶细胞的量。在特定实施方案中，测量值是细胞组合物中每个CAR+细胞或其参考或设定数量的被杀伤的细胞的量。在某些实施方案中，测量值是在一定时间量内细胞组合物的每个细胞的被杀伤的细胞的量。在特定实施方案中，测量值是在一定时间量内治疗性细胞组合物的每个CAR+细胞的被杀伤的细胞的量。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是治疗性细胞组合物的细胞中的基因的上调。在一些实施方案中，通过以下方式来评估重组受体依赖性基因上调活性：将表达重组受体的细胞或含有表达重组受体的细胞的细胞组合物暴露于变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂、与变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂一起孵育、和/或与变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂接触。可以通过直接或间接随时间的数量来测量基因活性的上调。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是治疗性细胞组合物的细胞中的基因的下调。在一些实施方案中，通过以下方式来评估重组受体依赖性基因下调活性：将表达重组受体的细胞或含有表达重组受体的细胞的细胞组合物暴露于变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂、与变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂一起孵育、和/或与变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂接触。可以通过直接或间接随时间的数量来测量基因活性的下调。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是治疗性细胞组合物的细胞中的受体的上调。在一些实施方案中，通过以下方式来评估重组受体依赖性受体上调活性：将表达重组受体的细胞或含有表达重组受体的细胞的细胞组合物暴露于变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂、与变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂一起孵育、和/或与变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂接触。可以通过直接或间接随时间的数量来测量受体活性的上调。
在一些实施方案中，重组受体依赖性活性是治疗性细胞组合物的细胞中的受体的下调。在一些实施方案中，通过以下方式来评估重组受体依赖性受体下调活性：将表达重组受体的细胞或含有表达重组受体的细胞的细胞组合物暴露于变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂、与变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂一起孵育、和/或与变化量的结合并刺激重组受体的重组受体刺激剂接触。可以通过直接或间接随时间的数量来测量受体活性的下调。
在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性的测量值使用数学模型进行拟合以产生重组受体依赖性活性曲线。在一些情况下，曲线拟合可以允许推断或外推治疗性细胞组合物的行为，例如重组受体依赖性活性。设想可以使用本领域已知的任何方法来进行曲线拟合。在一些实施方案中，曲线是S形的。在一些实施方案中，基于从多个孵育中的每一个测量的重组受体依赖性活性，确定导致半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率。在一些实施方案中，从重组受体依赖性活性曲线推断、外推或估计导致半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于测量的最大重组受体依赖性活性归一化。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于曲线的较高渐近线，任选地较高渐近线的一系列值归一化。
在一些实施方案中，包括如本文所述的测定的方法可以一式两份地或一式三份地或更多份地进行，以验证重组受体依赖性活性的测量值。在例如一式两份地、一式三份地或更多份地进行测定的一些情况下，使用来自每个重复实验的所测量的重组受体依赖性活性提供重组受体依赖性活性的描述性统计量度。例如，在一些情况下，对于所测试的多个比率中的每一个，确定重组受体依赖性活性的每个量度的平均值(例如，算术平均值)、中值、标准差和/或方差。在一些实施方案中，确定重组受体依赖性活性的每个量度的平均值。在一些实施方案中，确定重组受体依赖性活性的每个量度的标准差。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性的平均量度使用数学模型进行拟合以产生或估计重组受体依赖性活性曲线。在一些实施方案中，将曲线相对于平均最大值归一化。在一些实施方案中，将曲线相对于较高渐近线，任选地较高渐近线的一系列值的平均值归一化。
本文所述的量度可以关于参考标准品(如本文(例如，第I-D-1节)所述的参考标准品)使用。
D.确定治疗性细胞组合物的效力
本文提供的方法允许确定治疗性细胞组合物的效力。设想本文所述的测定可用于评估治疗性细胞组合物的效力，所述治疗性细胞组合物是通过诸如本文(例如，第II节)所述的那些的过程以及允许制造的治疗性细胞组合物的细胞在包括多个孵育的测定中培养的任何其他制造过程制造的，其中每个孵育包括将不同比率的治疗性组合物的细胞与能够刺激治疗性细胞组合物的重组受体依赖性活性的重组受体刺激剂一起培养。在一些实施方案中，可以根据本文提供的方法评估1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种治疗性细胞组合物。
通过以所测试的多个比率中的每一个取得重组受体依赖性活性的测量值，可以确定治疗性细胞组合物的效力。在一些实施方案中，测量值是通过在一式两份、一式三份或更多份重复实验中取算术平均值或中值确定的复合值。在一些实施方案中，可以确定测量值的标准差和/或方差。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物响应于重组受体刺激剂的重组受体依赖性活性的一个或多个测量值(包括复合测量值)可用于确定治疗性细胞组合物的效力。在一些实施方案中，重组受体依赖性活性可以是如第I-C节中所述的任一种。在一些实施方案中，重组受体刺激剂可以是如第I-B节中所述的任一种。
在一些实施方案中，以不同比率的多个孵育产生可以应用曲线拟合方法的多个测量值。在一些实施方案中，多个测量值包括复合测量值(例如，平均值或中值)。例如，可以将重组受体依赖性活性测量值用曲线(例如，S形)拟合，以允许推断、外推或估计治疗性细胞组合物的行为(例如，敏感性)。在一些实施方案中，针对测量值拟合的曲线可以用于估计在测定期间未直接检查的治疗性组合物的行为(例如，敏感性)。例如，曲线可用于估计较低渐近线；最小值；重组受体依赖性活性的检测损失；最大值的指定百分比(例如，10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、或90％)；半最大值(例如，50％重组受体依赖性活性)；最大重组受体依赖性活性(即，如下所述的最大活性)的10％-90％、20％-80％、30％-70％或40％-60％的范围；较高渐近线；以及最大值和比率(在所述比率下发生所述值或范围中的每一个)。
设想可以使用任何量度(半最大值处的比率、范围、最大值、最小值、渐近线及其复合量度)来确定治疗性细胞组合物的效力。在一些实施方案中，效力是相对效力。
1.效力
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力被定义为如下比率，在所述比率下发生一个或多个或一系列重组受体依赖性活性测量值。在一些实施方案中，一个或多个或一系列测量值是复合测量值，如从重复实验确定的平均值或中值。在一些实施方案中，从测量的重组受体依赖性活性的重组受体依赖性活性曲线确定测量值和比率。在一些实施方案中，将测量的重组受体依赖性活性相对于针对治疗性组合物测量的最大活性归一化。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于针对治疗性细胞组合物测量的最大重组受体依赖性活性归一化。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于针对治疗性细胞组合物测量的重组受体依赖性活性的较高渐近线，任选地跨渐近线的测量值的平均值归一化。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力是如下比率范围，在所述比率范围内发生10％-90％重组受体依赖性活性，或反之亦然。在一些实施方案中，比率范围(在所述比率范围内发生10％-90％重组受体依赖性活性)是从重组受体依赖性活性曲线估计的。在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性量度或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值范围的范围为0.1-0.9或10％-90％。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力是如下比率范围，在所述比率范围内发生20％-80％重组受体依赖性活性，或反之亦然。在一些实施方案中，比率范围(在所述比率范围内发生20％-80％重组受体依赖性活性)是从重组受体依赖性活性曲线估计的。在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性量度或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值范围的范围为0.2-0.8或20％-80％。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力是如下比率范围，在所述比率范围内发生30％-70％重组受体依赖性活性，或反之亦然。在一些实施方案中，比率范围(在所述比率范围内发生30％-70％重组受体依赖性活性)是从重组受体依赖性活性曲线估计的。在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性量度或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值范围的范围为0.3-0.7或30％-70％。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力是如下比率范围，在所述比率范围内发生40％-60％重组受体依赖性活性，或反之亦然。在一些实施方案中，比率范围(在所述比率范围内发生40％-60％重组受体依赖性活性)是从重组受体依赖性活性曲线估计的。在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性量度或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值范围的范围为0.4-0.6或40％-60％。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的效力是如下比率，在所述比率下发生半最大重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，从重组受体依赖性活性曲线估计半最大值和比率(在所述比率下发生半最大值)。在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性量度或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，半最大重组受体依赖性活性值为0.5或50％。
在一些实施方案中，例如当重组受体依赖性活性曲线通过S形进行拟合时，确定曲线的线性部分。在一些实施方案中，效力是来自曲线的线性部分的测量值和相应的比率。在一些实施方案中，从曲线的线性部分确定半最大值测量值和比率。
2.相对效力
本文提供的方法允许确定治疗性细胞组合物相对于不同的治疗性细胞组合物(例如，参考标准品)的效力。这种类型的效力可以被称为相对效力。例如，可以将根据本文提供的方法评估的治疗性细胞组合物与例如根据本文提供的方法评估的不同的治疗性细胞组合物(例如，参考标准品，例如如下所述)进行比较，以确定治疗性细胞组合物的效力如何彼此相互关联。这提供了一个优点，因为可以比较多种治疗性细胞组合物以确定哪种组合物具有最高效力或最佳效力。在一些实施方案中，最佳效力是可以在受试者中引发治疗效果(例如，持久反应、无进展存活)的效力。在一些实施方案中，最佳效力是在受试者中不导致毒性的效力。在一些实施方案中，最佳效力是可以在受试者中引发治疗效果(例如，持久反应、无进展存活)并且不导致毒性的效力。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的相对效力被定义为对于治疗性细胞组合物的一个或多个比率(在所述一个或多个比率下发生一个或多个或一系列重组受体依赖性活性测量值)与对于参考标准品的一个或多个比率(在所述一个或多个比率下发生一个或多个或一系列重组受体依赖性活性测量值)进行比较。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物和参考标准品中的一种或两种的一个或多个或一系列测量值是复合测量值，如从重复实验确定的平均值或中值。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物和参考标准品的测量值和比率是分别从组合物的测量的重组受体依赖性活性的重组受体依赖性曲线确定的。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物和参考标准品的测量的重组受体依赖性活性分别相对于针对治疗性组合物和参考标准品测量的最大活性归一化。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线分别相对于针对治疗性细胞组合物和参考标准品测量的最大重组受体依赖性活性归一化。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线分别相对于针对治疗性细胞组合物和参考标准品测量的重组受体依赖性活性的较高渐近线，任选地跨渐近线的测量值的平均值归一化。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的相对效力是比率范围(在所述比率范围内发生10％-90％重组受体依赖性活性，或反之亦然)与对于参考标准品的范围(在所述范围内发生10％-90％重组受体依赖性活性，或反之亦然)进行比较。在一些实施方案中，对于治疗性细胞组合物和参考标准品的比率范围(在所述比率范围下发生10％-90％重组受体依赖性活性)是分别从治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线估计的。在一些实施方案中，例如当治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性量度或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值范围的范围为0.1-0.9或10％-90％。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的相对效力是比率范围(在所述比率范围内发生20％-80％重组受体依赖性活性，或反之亦然)与对于参考标准品的范围(在所述范围内发生20％-80％重组受体依赖性活性，或反之亦然)进行比较。在一些实施方案中，对于治疗性细胞组合物和参考标准品的比率范围(在所述比率范围下发生20％-80％重组受体依赖性活性)是分别从治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线估计的。在一些实施方案中，例如当治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性量度或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值范围的范围为0.2-0.8或20％-80％。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的相对效力是比率范围(在所述比率范围内发生30％-70％重组受体依赖性活性，或反之亦然)与对于参考标准品的范围(在所述范围内发生30％-70％重组受体依赖性活性，或反之亦然)进行比较。在一些实施方案中，对于治疗性细胞组合物和参考标准品的比率范围(在所述比率范围下发生30％-70％重组受体依赖性活性)是分别从治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线估计的。在一些实施方案中，例如当治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性量度或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值范围的范围为0.3-0.7或30％-70％。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的相对效力是比率范围(在所述比率范围内发生40％-60％重组受体依赖性活性，或反之亦然)与对于参考标准品的范围(在所述范围内发生40％-60％重组受体依赖性活性，或反之亦然)进行比较。在一些实施方案中，对于治疗性细胞组合物和参考标准品的比率范围(在所述比率范围下发生40％-60％重组受体依赖性活性)是分别从治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线估计的。在一些实施方案中，例如当治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性量度或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，重组受体依赖性活性值范围的范围为0.4-0.6或40％-60％。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物的相对效力是比率(在所述比率下发生半最大重组受体依赖性活性)与对于参考标准品的比率(在所述比率下发生半最大重组受体依赖性活性)进行比较。在一些实施方案中，对于治疗性细胞组合物和参考标准品的半最大值和比率(在所述比率下发生半最大值)是分别从治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线估计的。在一些实施方案中，例如当治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性量度或重组受体依赖性活性曲线被归一化时，半最大重组受体依赖性活性值为0.5或50％。
在一些实施方案中，例如当治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线通过S形进行拟合时，确定曲线的线性部分。在一些实施方案中，相对效力是来自治疗性细胞组合物的曲线的线性部分的测量值和相应比率与来自参考标准品的曲线的线性部分的测量值和相应比率的比较。在一些实施方案中，治疗性细胞组合物和参考标准品的半最大值测量值和比率是从曲线的线性部分确定的。
在一些实施方案中，治疗性细胞组合物和参考组合物的测量值(如上文所述)之间的比较是除法。例如，将对于治疗性细胞组合物的比率(在所述比率下发生半最大重组受体依赖性活性)除以对于参考标准品的比率(在所述比率下发生半最大重组受体依赖性活性)。在一些实施方案中，将相对效力表示为比率。在一些实施方案中，将相对效力表示为百分比。
在一些实施方案中，例如当治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线通过S形进行拟合并且如上所述归一化时，相对效力是曲线之间的差值。在一些实施方案中，针对归一化曲线的线性部分测量曲线之间的差值。在一些实施方案中，可以使用治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线(例如，S形曲线)的归一化来直接比较治疗性细胞组合物和参考标准品的重组受体依赖性活性曲线。
a.参考标准品
特定实施方案设想可以将治疗性细胞组合物的重组受体依赖性活性(例如，CAR+依赖性活性)的测量值与参考标准品的参考测量值(即参考量度)进行比较，以例如确定相对效力。在特定实施方案中，参考测量值是参考标准品的重组受体依赖性活性的预定测量值或其值。在一些实施方案中，根据本文公开的方法评估参考标准品的重组受体依赖性活性。在一些实施方案中，参考标准品是已经验证了其导致重组受体依赖性活性的逐步调整比率的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，参考标准品是这样的治疗性细胞组合物，已经验证了其导致重组受体依赖性活性的逐步调整比率，并且已经对所测量的活性进行曲线(例如，S形)拟合以生成重组受体依赖性活性曲线。在一些实施方案中，将参考标准品的重组受体依赖性活性曲线归一化。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于最大测量的重组受体依赖性活性归一化。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于重组受体依赖性活性曲线的较高渐近线归一化。在一些实施方案中，将重组受体依赖性活性曲线相对于在重组受体依赖性活性曲线的较高渐近线上计算的平均值归一化。在一些实施方案中，参考标准品是包含导致半最大重组受体依赖性活性的经验证的逐步调整比率的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，从重组受体依赖性活性曲线确定导致半最大重组受体依赖性活性的经验证的逐步调整比率。
在一些实施方案中，参考标准品是可商购获得的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，参考标准品是使用与用于制造和其进行比较的治疗性细胞组合物的制造过程相同的制造过程制造的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，参考标准品是使用与用于制造和其进行比较的治疗性细胞组合物的制造过程不同的制造过程制造的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，参考标准品是包含与和其进行比较的治疗性细胞组合物相同的重组受体的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，参考标准品是包含与和其进行比较的治疗性细胞组合物不同的重组受体的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，参考标准品是这样的治疗性细胞组合物，其是与和其进行比较的治疗性细胞组合物从相同受试者制造的。在一些实施方案中，参考标准品是这样的治疗性细胞组合物，其是与和其进行比较的治疗性细胞组合物从不同受试者制造的。在一些实施方案中，参考标准品是源自健康受试者的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，参考标准品源自患有疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，参考标准品源自患有癌症的受试者。在一些实施方案中，参考标准品可以是上述那些的一种或多种的组合。
在一些实施方案中，已经将参考标准品施用于受试者。在特定实施方案中，观察到并确定参考标准品施用于受试者在施用于受试者后导致可接受的安全性特征。在特定实施方案中，参考标准品的施用未导致任何严重毒性。在某些实施方案中，参考标准品的施用未导致任何严重的神经毒性。在特定实施方案中，参考标准品是与4级或更低等级、3级或更低等级、2级或更低等级、1级或更低等级、或0级得分的神经毒性相关的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，参考标准品与可接受的安全性特征相关。在特定实施方案中，可接受的安全性特征是不存在观察到的1级或更高等级、观察到的2级或更高等级、观察到的3级或更高等级、或4级或更高等级的神经毒性。在某些实施方案中，参考标准品与不存在观察到的3级或更高等级的神经毒性的可接受的安全性特征相关。在特定实施方案中，参考标准品与不存在观察到的3级或更高等级的神经毒性的可接受的安全性特征相关。
在某些实施方案中，已经观察到或确定参考标准品在施用于受试者后导致所希望的功效。在某些实施方案中，如同被施用参考标准品的受试者一样，受试者患有表达抗原或与抗原相关的疾病或病症。在特定实施方案中，已经观察到或确定参考标准品导致完全反应(CR)。在特定实施方案中，已经观察到或确定参考标准品导致持续反应。II.用于生成工程化T细胞的方法
在一些实施方案中，本文提供的治疗性细胞组合物的效力的方法可以与生成表达重组蛋白例如重组受体(如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))的工程化细胞(如工程化CD4+T细胞和/或工程化CD8+T细胞)的治疗性组合物(例如，输出组合物)结合使用。在一些实施方案中，本文提供的过程与制造、生成或产生细胞疗法结合使用，并且可以与另外的加工步骤，如分离(isolation)、分开(separation)、选择、激活或刺激、转导、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制细胞的步骤结合使用。在一些实施方案中，生成或产生工程化细胞，例如工程化CD4+T细胞和/或工程化CD8+T细胞的过程包括以下中的一项或多项：从受试者分离细胞、制备细胞、加工细胞、在刺激条件下孵育细胞和/或工程化(例如转导)细胞。在一些实施方案中，所述过程包括以如下顺序进行的加工步骤：首先从生物样品中分离，如选择或分开输入细胞，例如原代细胞；在刺激条件下，孵育输入细胞，用载体颗粒，例如病毒载体颗粒对所述输入细胞进行工程化，以例如通过转导或转染将重组多核苷酸引入所述细胞中；培育所述工程化细胞(例如转导的细胞)，如以扩增所述细胞；以及收集、收获所述细胞的全部或一部分，和/或用其填充容器，以将所述细胞配制为输出组合物。在一些实施方案中，CD4+和CD8+T细胞被彼此独立地制造于例如单独的输入组合物中，但制造过程包括相同的加工步骤。在一些实施方案中，CD4+和CD8+T细胞被一起制造于例如同一输入组合物中。在一些实施方案中，在低温保存之前或之后将所生成的输出组合物(例如，治疗性细胞组合物)的细胞重新引入同一受试者体内。在一些实施方案中，工程化细胞的输出组合物(例如，治疗性细胞组合物)适合于在疗法(例如，自体细胞疗法、同种异体细胞疗法)中使用。示例性制造方法描述于公开的国际专利申请公开号WO 2019/089855中，其内容通过引用以其整体并入本文。
A.样品和细胞制备
在特定实施方案中，所提供的方法与从生物样品中分离、选择和/或富集细胞以生成富集细胞(例如，T细胞)的一种或多种输入组合物结合使用。在一些实施方案中，所提供的方法包括从生物样品中分离细胞或其组合物，所述生物样品如获得自或源自受试者的那些生物样品，所述受试者如患有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被施用细胞疗法的受试者。在一些方面，受试者是人，如作为需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中分离、加工和/或工程化细胞以用于所述过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自其的加工的样品。
在一些方面，样品是血液或血液来源的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单个核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自其的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞以例如去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或培养基中以用于后续的加工步骤。在一些实施方案中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通式”离心机(例如，Cobe2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面中，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并且将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、选择和/或富集、和/或用于转导和工程化的孵育之前或之后，和/或在培育和/或收获工程化细胞之后，冷冻(例如，低温保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。在一些实施方案中，将细胞在培养基和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或低温保存，所述培养基和/或溶液具有最终浓度为或约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将细胞在培养基和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或低温保存，所述培养基和/或溶液具有最终浓度为或约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或在0.1％与-5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间或在1％与2％之间的HSA。一个例子包括使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以为或约1°/分钟的速率冷冻至为或约-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，细胞或群体的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，细胞基于一种或多种特性来分离，所述特性如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或耐药性。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。与一种或多种选择试剂一起孵育，例如作为选择方法的一部分可以使用一种或多种选择试剂来进行，以用于基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在来选择一种或多种不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的利用一种或多种选择试剂基于此类标记进行分离的方法。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合至抗体或结合配偶体的那些细胞。
在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用任何系统或方法进行，所述系统或方法使得在分离的细胞与特异性结合至细胞上的标记的分子(例如，固体表面(例如颗粒)上的抗体或其他结合配偶体)之间产生有利的能量相互作用。在一些实施方案中，所述方法是使用颗粒如珠(例如磁珠)进行，所述颗粒包被有对细胞的标记具有特异性的选择剂(例如抗体)。可以将颗粒(例如珠)与细胞在容器(如管或袋)中一起孵育或混合，同时振荡或混合，其中细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能量上有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中所述选择的全部或一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，使用在国际专利申请公开号WO2009/072003或US20110003380 A1中所述的系统、装置或设备进行分离或分开。在一个例子中，系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中实施此类选择步骤或其部分(例如，与抗体包被的颗粒(例如，磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，如各种溶液的体积、在加工期间溶液的添加及其时间安排，与其他可用过程相比，这可以提供多种优势。例如，在孵育期间减少腔室中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如，珠试剂)的浓度，从而增加溶液的化学势，而不影响腔室中的细胞总数。这又可以增强正在加工的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤，允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分是在离心室中进行，其包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类工艺的一些方面，将一定体积的细胞与一定量所需的基于亲和力的选择试剂混合，所述体积和所述量显著少于在管或容器中根据制造商的说明书进行类似选择以选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常所用的体积和量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量是根据制造商的说明书用于在基于管或容器的孵育中针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有具有选择试剂的选择缓冲液，所述选择试剂如特异性地结合至希望富集和/或耗尽的细胞上(而不是组合物中其他细胞上)的表面标记的分子，如抗体，其任选地偶联到支架(如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠)。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不超过所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL，如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间是从5分钟至6小时或从约5分钟至约6小时，如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，如在旋转的存在下进行，通常以相对低的力或速度旋转，如速度低于用于使细胞沉淀的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm、或1500rpm、或1700rpm)，如在对室或其他容器的样品或壁的一定RCF下，所述RCF是从80g至100g或从约80g至约100g(例如，为或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行的，如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这种过程是在与室为整体的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，如预先洗涤步骤洗涤含有细胞的样品，如单采术样品)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入和推出室并进行离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，将所孵育的细胞进行分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，其中将细胞与选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与选择试剂一起孵育后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细胞)转移至系统中用于基于免疫亲和力来分离细胞。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记进行分离。
在一些实施方案中，过程步骤还包括如使用可以进行基于亲和力的选择的系统或设备对孵育的细胞进行阴性和/或阳性选择。在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，通过以下方式完成阳性或阴性选择：将细胞与特异性结合至一种或多种表面标记的一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育，所述一种或多种表面标记分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高的水平表达(标记高)。可以进行多轮相同的选择步骤(例如阳性或阴性选择步骤)。在某些实施方案中，使阳性或阴性选择的级分经受选择过程，如通过重复阳性或阴性选择步骤。在一些实施方案中，将选择重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或多于九次。在某些实施方案中，相同的选择进行多至五次。在某些实施方案中，相同的选择步骤进行三次。
分离无需导致特定细胞群或表达特定标记的细胞的100％富集或去除。例如，对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要使不表达所述标记的细胞完全不存在。同样，对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要使所有此类细胞完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时对多个细胞类型进行阳性选择。在某些实施方案中，一个或多个分离步骤重复和/或进行多于一次。在一些实施方案中，使从分离步骤得到的阳性或阴性选择的级分经受相同的分离步骤，如通过重复阳性或阴性选择步骤。在一些实施方案中，单个分离步骤重复和/或进行多于一次，例如以增加阳性选择细胞的产率，以增加阴性选择细胞的纯度，和/或以进一步从阴性选择的级分去除阳性选择的细胞。在某些实施方案中，一个或多个分离步骤进行和/或重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或多于十次。在某些实施方案中，一个或多个选择步骤进行和/或重复一次与十次之间、一次与五次之间或三次与五次之间。在某些实施方案中，一个或多个选择步骤重复三次。
例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术来分离T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或表达高水平的表面标记的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。在一些实施方案中，通过与特异性结合此类标记的一种或多种抗体或结合配偶体一起孵育来选择此类细胞。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体可以与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)缀合(如直接或间接地)以实现选择。例如，CD3+、CD28+T细胞可以使用CD3/CD28缀合的磁珠(例如，M-450 CD3/CD28 T细胞扩增器和/或珠)进行阳性选择。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+和CD8+群体可以通过针对在一种或多种幼稚T细胞、记忆T细胞和/或效应T细胞子群体上表达或表达至相对较高程度的标记进行阳性或阴性选择来进一步分选为子群体。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，使CD8+T细胞针对幼稚、中央记忆、效应子记忆和/或中央记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中央记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人,(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，中央记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一方面，中央记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分经受基于CD14和CD45RA的表达的阴性选择以及基于CD62L的阳性选择。
在一些方面这种选择是同时进行的，而在其他方面依序以任一顺序进行。在一些方面，用于制备CD8+T细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+T细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分二者被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。在一些实施方案中，对CD4+T细胞群的选择和对CD8+T细胞群的选择同时进行。在一些实施方案中，以任一顺序依序进行CD4+T细胞群和CD8+T细胞群的选择。在一些实施方案中，用于选择细胞的方法可以包括公开的美国申请号US20170037369中所述的那些。在一些实施方案中，可以在选择之后将经选择CD4+T细胞群和经选择CD8+T细胞群合并。在一些方面，可以将经选择CD4+T细胞群和经选择CD8+T细胞群合并在如本文所述的生物反应器袋中。在一些实施方案中，如根据所提供的方法，分别加工经选择CD4+T细胞群和经选择CD8+T细胞群，由此使经选择CD4+T细胞群富集CD4+T细胞并且将其与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)一起孵育，用编码重组蛋白(例如CAR)的病毒载体转导并且在扩增T细胞的条件下培育；并且使经选择CD8+T细胞群富集CD8+T细胞并且将其与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)一起孵育，用编码重组蛋白(例如CAR)(如与来自同一供体的用于工程化CD4+T细胞的相同的重组蛋白)的病毒载体转导，并且在扩增T细胞的条件下培育。
在特定实施方案中，使生物样品(例如PBMC或其他白细胞的样品)经受CD4+T细胞的选择，其中同时保留阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD8+T细胞选自阴性级分。在一些实施方案中，使生物样品经受CD8+T细胞的选择，其中同时保留阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD4+T细胞选自阴性级分。
在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经历CD4+T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分二者。然后对阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中央记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，可以将CD4+T辅助细胞分选为幼稚、中央记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、或CD4+T细胞。在一些实施方案中，中央记忆CD4+T细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+T细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+T细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体结合至固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于以下文献中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑Humana Press Inc.,Totowa,NJ)。
在一些方面，将待分离的所孵育的细胞样品或组合物与含有小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像Dynabeads或珠))的选择试剂一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附接至结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性结合。
在一些实施方案中，磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。用于磁分离方法中的许多熟知的磁响应材料是已知的，例如Molday的美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。还可以使用胶体大小的颗粒，如在Owen的美国专利号4,795,698；和Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些。
孵育通常在如下条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附接至磁性颗粒或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于样品内的细胞上的话)特异性结合。
在某些实施方案中，将磁响应颗粒在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中进行包被。在某些实施方案中，磁性颗粒通过对一种或多种标记具特异性的一抗的包被而附接至细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记细胞而不是珠，然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)包被的磁粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些方面，在其中将样品置于磁场中的程序中实现分离，并且具有附接至其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加工或经历另外的分离步骤。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotech，加利福尼亚州奥本)进行的。磁激活细胞分选(MACS)(例如，CliniMACS系统)能够对其上附接有磁化颗粒的细胞进行高纯度选择。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶标和靶标种类。也就是说，附接至磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附接的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，非靶细胞被标记并从异质细胞群中耗尽。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附接至细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，颗粒保持附接至细胞以向患者施用。在一些实施方案中，从细胞去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，分离和/或选择产生经富集T细胞，例如CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一种或多种输入组合物。在一些实施方案中，从单一生物样品中分离、选择、富集或获得两种或更多种单独的输入组合物。在一些实施方案中，从单独的生物样品中分离、选择、富集和/或获得单独的输入组合物，所述单独的生物样品从同一受试者收集、获取和/或获得。
在某些实施方案中，一种或多种输入组合物是或包括经富集T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD3+T细胞。在特定实施方案中，经富集T细胞的输入组合物基本上由CD3+T细胞组成。
在某些实施方案中，一种或多种输入组合物是或包括经富集CD4+T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在某些实施方案中，CD4+T细胞的输入组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物基本上由CD4+T细胞组成。
在某些实施方案中，一种或多种组合物是或包括CD8+T细胞的组合物，所述组合物是或包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，CD8+T细胞的组合物含有少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物基本上由CD8+T细胞组成。
在一些实施方案中，在分离、选择和/或富集之后将经富集T细胞的一种或多种输入组合物冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻。在一些实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制细胞的组合物的任何步骤之前冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻一种或多种输入组合物。在特定实施方案中，将一种或多种低温冷冻的输入组合物例如在或在约-80℃下储存12小时至7天、24小时至120小时或2天至5天。在特定实施方案中，将一种或多种低温冷冻的输入组合物在或在约-80℃下储存少于10天、9天、8天、7天、6天或5天、4天、3天、2天或1天的时间量。在一些实施方案中，将一种或多种低温冷冻的输入组合物在或在约-80℃下储存或储存约1天、2天、3天、4天、5天或6天。
B.细胞的激活和刺激
在一些实施方案中，将所提供的方法与在刺激条件下孵育细胞结合使用。在一些实施方案中，刺激条件包括激活或刺激和/或能够激活或刺激细胞(例如，CD4+T细胞或CD8+T细胞)中的信号(如从TCR和/或共受体生成的信号)的条件。在一些实施方案中，刺激条件包括用刺激试剂(例如，激活或刺激和/或能够激活或刺激细胞中的信号的试剂)和/或在刺激试剂的存在下培养、培育、孵育、激活、繁殖细胞的一个或多个步骤。在一些实施方案中，刺激试剂刺激和/或激活TCR和/或共受体。在特定实施方案中，刺激试剂是在第II-B-1节中所述的试剂。
在某些实施方案中，在对细胞进行基因工程化，如通过第II-C节中提供的技术转染和/或转导细胞之前，在刺激条件下孵育经富集T细胞的一种或多种组合物。在特定实施方案中，在已从生物样品中分离、选择、富集或获得经富集T细胞的一种或多种组合物之后，在刺激条件下孵育一种或多种组合物。在特定实施方案中，一种或多种组合物是输入组合物。在特定实施方案中，一种或多种输入组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在孵育之前解冻。
在某些实施方案中，经富集T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物，例如单独的输入组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，两种单独组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，两种单独组合物包括经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下孵育。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的单一组合物在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，单一组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，单一组合物是在孵育之前已从单独组合物合并的经富集CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD4+T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD4+T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+T细胞的单独组合物合并为单一组合物并且在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成孵育之后将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独经刺激组合物合并为单一组合物。在一些实施方案中，如根据所提供的方法，在已经进行和/或完成孵育之后分别加工经刺激CD4+T和经刺激CD8+T细胞的单独经刺激组合物，由此将经刺激CD4+T细胞群(例如与刺激性抗CD3/抗CD28磁珠刺激试剂一起孵育)用编码重组蛋白(例如CAR)的病毒载体转导并且在扩增T细胞的条件下培育，并且将经刺激CD8+T细胞群(例如与刺激性抗CD3/抗CD28磁珠刺激试剂一起孵育)用编码重组蛋白(例如CAR)(如与来自同一供体的用于工程化CD4+T细胞的相同的重组蛋白)的病毒载体转导并且在扩增T细胞的条件下培育。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育可以包括培养、培育、刺激、激活、繁殖，包括通过在刺激条件的存在下孵育，所述刺激条件例如设计为诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的条件。在特定实施方案中，刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和设计为激活细胞的任何其他药剂))。
在一些方面，在刺激条件下的刺激和/或孵育是根据多种技术来进行，所述多种技术如以下文献中所述的那些技术：Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方法扩增细胞(例如T细胞)、细胞组合物和/或细胞群，如CD4+和CD8+T细胞或其组合物、群体或亚群：向培养起始组合物中添加饲养细胞如非分裂外周血单个核细胞(PBMC)(例如，使得所得细胞群对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，将PBMC用范围为约3000至3600拉德的γ射线辐照，以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加至培养基。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或约37摄氏度。在一些实施方案中，在培养期间实现温度转变，如从37摄氏度至35摄氏度。任选地，孵育还可以包括添加非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐射LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在实施方案中，可以通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性的CD4+和CD8+的群体。例如，可以通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原生成抗原特异性T细胞系或克隆。也可以使用幼稚T细胞。
在特定实施方案中，刺激条件包括将细胞与刺激试剂一起孵育、培养和/或培育。在特定实施方案中，刺激试剂是在第II-B-1节中所述的试剂。在某些实施方案中，刺激试剂含有或包括珠。示例性刺激试剂是或包括抗CD3/抗CD28磁珠。在某些实施方案中，当将细胞与刺激试剂发生接触和/或与刺激试剂一起孵育时，发生在刺激条件下孵育、培养和/或培育细胞的开始和/或起始。在特定实施方案中，在基因工程化细胞(例如，如通过转染或转导将重组多核苷酸引入细胞中)之前、期间和/或之后，孵育细胞。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与细胞以为或为约3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1或0.2:1的刺激试剂和/或珠(例如，抗CD3/抗CD28磁珠)的比率一起孵育。在特定实施方案中，刺激试剂和/或珠与细胞的比率在2.5:1与0.2:1之间、在2:1与0.5:1之间、在1.5:1与0.75:1之间、在1.25:1与0.8:1之间、在1.1:1与0.9:1之间。在特定实施方案中，刺激试剂与细胞的比率为约1:1或为1:1。
在特定实施方案中，将细胞以小于3:1或每细胞少于3个刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)的比率(如1:1的比率)孵育降低了孵育期间发生的细胞死亡(例如像因激活诱导的细胞死亡所致)的量。在一些实施方案中，将细胞与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)以小于3(或3:1或每细胞少于3个珠)的珠与细胞的比率一起孵育。在特定实施方案中，将细胞以小于3:1或每细胞少于3个珠的比率(如1:1的比率)孵育降低了孵育期间发生的细胞死亡(例如像因激活诱导的死亡所致)的量。
在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)以小于3:1的刺激试剂和/或珠与细胞的比率(如1:1的比率)一起孵育，并且在完成孵育后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的T细胞存活，例如是有活力的并且/或未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物与刺激试剂以小于3:1的刺激试剂和/或珠与细胞的比率(如1:1的比率)一起孵育，并且在孵育期间少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的细胞经历激活诱导的细胞死亡。
在某些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)以小于3:1的珠与细胞的比率(如1:1的比率)一起孵育，并且与经历示例性和/或替代性过程(其中将经富集T细胞的组合物与刺激试剂以3:1或更大的比率一起孵育)的细胞相比，所述组合物的细胞具有大至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的存活率。
在一些实施方案中，与刺激试剂一起孵育的经富集T细胞的组合物包含从1.0x105个细胞/mL至1.0x108个细胞/mL或从约1.0x105个细胞/mL至约1.0x108个细胞/mL，如至少或约至少或约1.0x105个细胞/mL、5x105个细胞/mL、1x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、1x107个细胞/mL、5x107个细胞/mL或1x108个细胞/mL。在一些实施方案中，与刺激试剂一起孵育的经富集T细胞的组合物包含约0.5x106个细胞/mL、1x106个细胞/mL、1.5x106个细胞/mL、2x106个细胞/mL、2.5x106个细胞/mL、3x106个细胞/mL、3.5x106个细胞/mL、4x106个细胞/mL、4.5x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、5.5x106个细胞/mL、6x106个细胞/mL、6.5x106个细胞/mL、7x106个细胞/mL、7.5x106个细胞/mL、8x106个细胞/mL、8.5x106个细胞/mL、9x106个细胞/mL、9.5x106个细胞/mL或10x106个细胞/mL，如约2.4x106个细胞/mL。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与刺激试剂在从约25℃至约38℃，如从约30℃至约37℃，例如为或约37℃±2℃的温度下一起孵育。在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与刺激试剂在从约2.5％至约7.5％，如从约4％至约6％，例如为或约5％±0.5％的CO2水平下一起孵育。在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与刺激试剂在为或约37℃的温度下和/或在为或约5％的CO2水平下一起孵育。
在特定实施方案中，刺激条件包括用一种或多种细胞因子和/或在一种或多种细胞因子存在下孵育、培养和/或培育经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括IL-2。在一些实施方案中，刺激条件包括在如所述的刺激试剂(抗CD3/抗CD28磁珠)的存在下和在一种或多种重组细胞因子存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞或经富集CD8+T细胞)的组合物。
在特定实施方案中，将经富集CD4+T细胞的组合物与IL-2，例如重组IL-2一起孵育。在不希望受理论束缚的情况下，特定实施方案设想到，从一些受试者获得的CD4+T细胞不产生或不足够地产生如下量的IL-2，所述量允许在用于生成输出细胞(例如适合于在细胞疗法中使用的工程化细胞)的组合物的整个过程中的生长、分裂和扩增。在一些实施方案中，在重组IL-2的存在下在刺激条件下孵育经富集CD4+T细胞的组合物增加了所述组合物的CD4+T细胞在孵育步骤期间和整个过程中将继续存活、生长、扩增和/或激活的概率或可能性。在一些实施方案中，与未在重组IL-2存在下孵育经富集CD4+T细胞的组合物的替代性和/或示例性方法相比，在重组IL-2存在下孵育经富集CD4+T细胞的组合物将从经富集CD4+T细胞的组合物产生经富集CD4+T细胞(例如适合于细胞疗法的工程化CD4+T细胞)的输出组合物的概率和/或可能性增加至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
在某些实施方案中，一种或多种细胞因子的量或浓度是用国际单位(IU)测量和/或定量的。国际单位可以用于定量维生素、激素、细胞因子、疫苗、血液制品和类似的生物活性物质。在一些实施方案中，IU是或包括通过与具有特定重量和强度的国际参考标准(例如，针对人IL-2的WHO第一国际标准(WHO 1st International Standard for Human IL-2)，86/504)相比的生物制剂效力的度量单位。国际单位是报告生物活性单位的唯一公认且标准化的方法，所述生物活性单位公开和源自国际合作研究工作。在特定实施方案中，可以通过与类似的WHO标准产品的产品比较测试获得细胞因子的组合物、样品或来源的IU。例如，在一些实施方案中，将人重组IL-2、IL-7或IL-15的组合物、样品或来源的IU/mg分别与WHO标准IL-2产品(NIBSC代码：86/500)、WHO标准IL-17产品(NIBSC代码：90/530)和WHO标准IL-15产品(NIBSC代码：95/554)进行比较。
在一些实施方案中，以IU/mg计的生物活性等同于(以ng/ml计的ED50)-1x106。在特定实施方案中，重组人IL-2或IL-15的ED50等同于使用CTLL-2细胞的细胞增殖的半最大刺激(XTT切割)所需的浓度。在某些实施方案中，重组人IL-7的ED50等同于PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖的半最大刺激所需的浓度。与IL-2的IU的测定和计算相关的细节论述于Wadhwa等人,Journal of Immunological Methods(2013),379(1-2):1-7；和Gearing和Thorpe,Journal of Immunological Methods(1988),114(1-2):3-9中；与IL-15的IU的测定和计算相关的细节论述于Soman等人Journal of Immunological Methods(2009)348(1-2):83-94中；所述文献通过引用以其整体特此并入。
在特定实施方案中，在IL-2和/或IL-15的存在下在刺激条件下孵育经富集CD8+T细胞的组合物。在某些实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下在刺激条件下孵育经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些方面，经富集T细胞组合物的孵育还包括刺激试剂，例如抗CD3/抗CD28磁珠的存在。
在一些实施方案中，将细胞与细胞因子，例如重组人细胞因子一起孵育，所述细胞因子的浓度在1IU/ml与1,000IU/ml之间、在10IU/ml与50IU/ml之间、在50IU/ml与100IU/ml之间、在100IU/ml与200IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在250IU/ml与500IU/ml之间或在500IU/ml与1,000IU/ml之间。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与IL-2，例如人重组IL-2一起孵育，所述IL-2的浓度在1IU/ml与200IU/ml之间、在10IU/ml与200IU/ml之间、在10IU/ml与100IU/ml之间、在50IU/ml与150IU/ml之间、在80IU/ml与120IU/ml之间、在60IU/ml与90IU/ml之间或在70IU/ml与90IU/ml之间。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物与重组IL-2一起孵育，所述重组IL-2的浓度为或为约50IU/ml、55IU/ml、60IU/ml、65IU/ml、70IU/ml、75IU/ml、80IU/ml、85IU/ml、90IU/ml、95IU/ml、100IU/ml、110IU/ml、120IU/ml、130IU/ml、140IU/ml或150IU/ml。在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物在为或约85IU/ml的重组IL-2的存在下孵育。在一些实施方案中，将与重组IL-2一起孵育的组合物针对T细胞(例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)的群体进行富集。在一些实施方案中，T细胞群是CD4+T细胞群。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD8+T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD8+T细胞进行富集，其中CD4+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+T细胞。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+T细胞进行富集，其中CD8+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+T细胞。在一些实施方案中，与重组IL-2一起孵育的经富集CD4+T细胞组合物也可以与重组IL-7和/或重组IL-15如以所述量一起孵育。在一些实施方案中，与重组IL-2一起孵育的经富集CD8+T细胞组合物也可以与重组IL-15如以所述量一起孵育。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与重组IL-7，例如人重组IL-7一起孵育，所述重组IL-7的浓度在100IU/ml与2,000IU/ml之间、在500IU/ml与1,000IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在500IU/ml与750IU/ml之间、在750IU/ml与1,000IU/ml之间或在550IU/ml与650IU/ml之间。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物与重组IL-7一起孵育，所述重组IL-7的浓度为或为约50IU/ml、100IU/ml、150IU/ml、200IU/ml、250IU/ml、300IU/ml、350IU/ml、400IU/ml、450IU/ml、500IU/ml、550IU/ml、600IU/ml、650IU/ml、700IU/ml、750IU/ml、800IU/ml、750IU/ml、750IU/ml、750IU/ml或1,000IU/ml。在特定实施方案中，在为或约600IU/ml的重组IL-7的存在下孵育经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，将与重组IL-7一起孵育的组合物针对T细胞(例如CD4+T细胞)的群体进行富集。在一些实施方案中，与重组IL-7一起孵育的经富集CD4+T细胞组合物也可以与重组IL-2和/或重组IL-15如以所述量一起孵育。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+T细胞进行富集，其中CD8+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+T细胞。在一些实施方案中，不将经富集CD8+T细胞组合物与重组IL-7一起孵育。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与重组IL-15，例如人重组IL-15一起孵育，所述重组IL-15的浓度在0.1IU/ml与100IU/ml之间、在1IU/ml与100IU/ml之间、在1IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与25IU/ml之间、在25IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与15IU/ml之间或在10IU/ml与100IU/ml之间。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物与重组IL-15一起孵育，所述重组IL-15的浓度为或为约1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、11IU/ml、12IU/ml、13IU/ml、14IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、40IU/ml或50IU/ml。在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物在或在约10IU/ml重组IL-15中孵育。在一些实施方案中，将与重组IL-15一起孵育的组合物针对T细胞(例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)的群体进行富集。在一些实施方案中，T细胞群是CD4+T细胞群。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD8+T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD8+T细胞进行富集，其中CD4+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+T细胞。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+T细胞进行富集，其中CD8+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+T细胞。在一些实施方案中，与重组IL-15一起孵育的经富集CD4+T细胞组合物也可以与重组IL-7和/或重组IL-2如以所述量一起孵育。在一些实施方案中，与重组IL-15一起孵育的经富集CD8+T细胞组合物也可以与重组IL-2如以所述量一起孵育。
在特定实施方案中，将细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)在一种或多种抗氧化剂的存在下与刺激试剂一起孵育。在一些实施方案中，抗氧化剂包括但不限于，一种或多种抗氧化剂包括生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、α-生育醌、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-二甲酸)、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、类黄酮、异黄酮、番茄红素、β-胡萝卜素、硒、泛醌、梅毒菌素(luetin)、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、柠檬酸、L-肉碱、BHT、硫代甘油、抗坏血酸、没食子酸丙酯、甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽(gluthatione)、胱胺和胱硫醚(cysstathionine)和/或甘氨酸-甘氨酸-组氨酸。在一些方面，将经富集T细胞组合物(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)与抗氧化剂一起孵育还包括刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)和一种或多种重组细胞因子(如所述的)的存在。
在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是或包括含硫氧化剂。在某些实施方案中，含硫抗氧化剂可以包括含硫醇抗氧化剂和/或例如在环结构内展现出一个或多个硫部分的抗氧化剂。在一些实施方案中，含硫抗氧化剂可以包括例如N-乙酰半胱氨酸(NAC)和2,3-二巯基丙醇(DMP)、L-2-氧代-4-噻唑烷甲酸酯(OTC)和硫辛酸。在特定实施方案中，含硫抗氧化剂是谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，谷胱甘肽前体是可以在细胞内的一个或多个步骤中被修饰成衍生的谷胱甘肽的分子。在特定实施方案中，谷胱甘肽前体可以包括但不限于N-乙酰半胱氨酸(NAC)、L-2-氧代噻唑烷-4-甲酸(丙半胱氨酸(Procysteine))、硫辛酸、S-烯丙基半胱氨酸或甲基甲硫氨酸锍氯化物。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)包括在一种或多种抗氧化剂的存在下孵育细胞。在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂的存在下用刺激试剂刺激细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1 500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的一种或多种抗氧化剂的存在下孵育细胞。在一些实施方案中，在为或约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的一种或多种抗氧化剂的存在下孵育细胞。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是或包括含硫抗氧化剂。在特定实施方案中，一种或多种抗氧化剂是或包括谷胱甘肽前体。
在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是或包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)。在一些实施方案中，在刺激条件下孵育细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)包括在NAC的存在下孵育细胞。在特定实施方案中，在NAC的存在下用刺激试剂刺激细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1 -500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的NAC的存在下孵育细胞。在一些实施方案中，在为或约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的NAC的存在下孵育细胞。在一些实施方案中，用或用约0.8mg/ml孵育细胞。
在特定实施方案中，如与在不存在抗氧化剂的情况下的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)的组合物减少了细胞中的激活。在某些实施方案中，降低的激活通过细胞中一种或多种激活标记的表达来测量。在某些实施方案中，激活标记包括但不限于增加的细胞内复杂性(例如，如通过测量侧向散射(SSC)确定的)、增加的细胞大小(例如，如通过测量细胞直径和/或前向散射(FSC)确定的)、增加的CD27表达和/或减少的CD25表达。在一些实施方案中，当在孵育、工程化、转导、转染、扩增或配制期间或之后，或在孵育后进行的过程的任何阶段期间或之后进行检查时，组合物的细胞具有阴性、减少的或低的激活标记的表达和/或程度。在一些实施方案中，在过程完成后，组合物的细胞具有阴性、减少的或低的激活标记的表达和/或程度。在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有阴性、减少的或低的激活标记的表达和/或程度。
在一些实施方案中，将流式细胞术用于确定细胞的相对大小。在特定实施方案中，将FSC和SSC参数用于分析细胞以及基于大小和内部复杂性将细胞彼此区分。在特定实施方案中，可以测量已知大小的颗粒或珠作为确定细胞实际大小的标准。在一些实施方案中，将流式细胞术与染色剂例如标记的抗体组合使用，以测量或定量表面蛋白(如激活标记，例如CD25或CD27)的表达。
在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，细胞直径减少至少0.25μm、0.5μm、0.75μm、1.0μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm或超过5μm。在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育经富集T细胞的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，如通过FSC测量的细胞大小减少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，如通过SSC测量的细胞内复杂性减少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，例如如通过流式细胞术测量的CD27表达降低至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在某些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，例如如通过流式细胞术测量的CD25表达增加至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)的组合物增加了例如在如第II-D节中所述的孵育或培育步骤或阶段期间的扩增。在一些实施方案中，经富集细胞的组合物在开始培育的14天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天内或3天内实现了2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、或大于10倍的扩增。在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂的存在下孵育经富集T细胞的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂的存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的经培育细胞相比，所述组合物的细胞在培育期间经历快至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍的扩增速率。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)的组合物减少了细胞死亡(例如因细胞凋亡所致)的量。在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育经富集T细胞的组合物，并且在完成孵育后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的细胞存活，例如未经历细胞凋亡。在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC的存在下孵育组合物，并且与经历其中未将细胞在一种或多种抗氧化剂的存在下孵育的示例性和/或替代性过程的细胞相比，所述组合物的细胞具有大至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的存活率。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，半胱天冬酶表达，例如半胱天冬酶3表达降低至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在一些实施方案中，在如所述的刺激条件或刺激剂的存在下孵育组合物或细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞)。此类条件包括设计用于在群体中诱导细胞的增殖、扩增、激活和/或存活以模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的那些。示例性刺激试剂(如抗CD3/抗CD28磁珠)在下文描述。与刺激试剂一起孵育还可以在一种或多种刺激细胞因子的存在下，如在重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15中的一种或多种的存在下，和/或在至少一种抗氧化剂如NAC存在下进行，如上文所述。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞的组合物在刺激条件下与刺激剂(即重组IL-2、重组IL-7、重组IL-15)和NAC如以如所述量一起孵育。在一些实施方案中，将经富集CD8+T细胞的组合物在刺激条件下与刺激剂(即重组IL-2、重组IL-15)和NAC如以如所述量一起孵育。
在一些实施方案中，用于刺激和/或激活的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计用于激活细胞的药剂))。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，如以下文献中所述的那些技术：Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，在一种或多种刺激条件或刺激剂存在下进行的孵育的至少一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行，如国际公开号WO2016/073602中所述的。在一些实施方案中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如所选择的细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述刺激条件或刺激剂远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的刺激条件或刺激剂。
在一些实施方案中，将刺激剂以一定的量添加至室空腔中的细胞，所述一定的量与例如在周期性振荡或旋转的管或袋中进行选择而不在离心室中混合时，对相同细胞数量或相同细胞体积实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的刺激剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和刺激剂中添加孵育缓冲液的情况下进行孵育，以实现孵育例如约10mL至约200mL或约20mL至约125mL(如至少或至少约或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、105mL、110mL、115mL、120mL、125mL、130mL、135mL、140mL、145mL、150mL、160mL、170mL、180mL、190mL、或200mL)试剂的目标体积。在一些实施方案中，在添加细胞之前预先混合孵育缓冲液和刺激剂。在一些实施方案中，将孵育缓冲液和刺激剂单独添加至细胞中。在一些实施方案中，在周期性温和混合条件下进行刺激孵育，这可能有助于促进能量上有利的相互作用，并且从而允许在实现细胞的刺激和激活的同时使用较少的总体刺激剂。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，如在旋转的存在下进行，通常以相对低的力或速度旋转，如速度低于用于使细胞沉淀的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm、或1500rpm、或1700rpm)，如在对室或其他容器的样品或壁的一定RCF下，所述RCF是从80g至100g或从约80g至约100g(例如，为或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行的，如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间、18小时与30小时之间、或12小时与24小时之间，如为至少或为至少约或为约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，包含端值。
在一些实施方案中，在用于例如通过转导和/或转染将多核苷酸例如编码重组受体的多核苷酸引入细胞中的步骤(如通过第II-C节所述)之前和/或期间，在刺激条件下培养、培育和/或孵育细胞。在某些实施方案中，在基因工程化之前将细胞在刺激条件下培养、培育和/或孵育如下时间量：在30分钟与2小时之间、在1小时与8小时之间、在1小时与6小时之间、在6小时与12小时之间、在12小时与18小时之间、在16小时与24小时之间、在12小时与36小时之间、在24小时与48小时之间、在24小时与72小时之间、在42小时与54小时之间、在60小时与120小时之间、在96小时与120小时之间、在90小时之间和在1天与7天之间、在3天与8天之间、在1天与3天之间、在4天与6天之间或在4天与5天之间。在一些实施方案中，在工程化之前将细胞孵育为或约2天。
在某些实施方案中，在基因工程化细胞之前和/或期间将细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育。在某些实施方案中，将细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育如下时间量：在12小时与36小时之间、在24小时与48小时之间、在24小时与72小时之间、在42小时与54小时之间、在60小时与120小时之间、在96小时与120小时之间、在90小时之间和在2天与7天之间、在3天与8天之间、在1天与8天之间、在4天与6天之间或在4天与5天之间。在特定实施方案中，在基因工程化细胞之前和/或期间将细胞在刺激条件下培养、培育和/或孵育如下时间量：少于10天、9天、8天、7天、6天或5天、4天，或如下时间量：少于168小时、162小时、156小时、144小时、138小时、132小时、120小时、114小时、108小时、102小时或96小时。在特定实施方案中，将细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育为或约4天、5天、6天或7天。在一些实施方案中，将细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育为或约4天。在特定实施方案中，将细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育为或约5天。在某些实施方案中，将细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂的存在下孵育少于7天。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育细胞包括将细胞与在第II-B-1节中所述的刺激试剂一起孵育。在一些实施方案中，刺激试剂含有或包括珠，如顺磁珠，并且将细胞与刺激试剂以小于3:1(珠:细胞)的比率，如1:1的比率一起孵育。在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子和/或一种或多种抗氧化剂的存在下将细胞与刺激试剂一起孵育。在一些实施方案中，在重组IL-2、IL-7、IL-15和NAC的存在下将经富集CD4+T细胞的组合物与刺激试剂以1:1(珠:细胞)的比率一起孵育。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-15和NAC的存在下将经富集CD8+T细胞的组合物与刺激试剂以1:1(珠:细胞)的比率一起孵育。在一些实施方案中，在从开始或起始孵育起，例如从将刺激试剂添加至细胞或与细胞接触的时间起的6天、5天或4天时、6天、5天或4天内或约6天、5天或4天内，将所述刺激试剂从所述细胞去除和/或分离。
1.刺激试剂
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育经富集细胞的组合物是或包括使经富集细胞的组合物与能够激活和/或扩增T细胞的刺激试剂孵育和/或接触。在一些实施方案中，刺激试剂能够刺激和/或激活细胞中的一个或多个信号。在一些实施方案中，一个或多个信号由受体介导。在特定实施方案中，一个或多个信号是信号转导和/或第二信使(例如，cAMP和/或细胞内钙)的水平或量的变化，一种或多种细胞蛋白的量、细胞定位、构象、磷酸化、泛素化和/或截短的变化，和/或细胞活性(例如转录、翻译、蛋白降解、细胞形态、激活状态和/或细胞分裂)的变化，或与所述变化相关。在特定实施方案中，刺激试剂激活和/或能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
在某些实施方案中，刺激试剂含有与能够激活和/或扩增细胞(例如，T细胞)的一种或多种药剂(例如，生物分子)缀合或连接的颗粒(例如，珠)。在一些实施方案中，一种或多种药剂结合至珠。在一些实施方案中，珠是生物相容的，即由适合于生物学用途的材料构成。在一些实施方案中，珠对培养的细胞(例如培养的T细胞)是无毒的。在一些实施方案中，珠可以是能够以允许药剂与细胞之间相互作用的方式附接药剂的任何颗粒。
在一些实施方案中，刺激试剂含有能够激活和/或扩增细胞(例如T细胞)的一种或多种药剂，所述一种或多种药剂结合至或以其他方式附接至珠，例如结合至或附接至珠的表面。在某些实施方案中，珠是非细胞颗粒。在特定实施方案中，珠可以包括胶体颗粒、微球体、纳米颗粒、磁珠等。在一些实施方案中，珠是琼脂糖珠。在某些实施方案中，珠是琼脂糖凝胶珠。
在特定实施方案中，刺激试剂含有单分散的珠。在某些实施方案中，单分散的珠包含彼此的直径标准差小于5％的尺寸分散体。
在一些实施方案中，珠含有一种或多种药剂，如与珠的表面偶联、缀合或连接(直接或间接)的药剂。在一些实施方案中，如本文设想的药剂可以包括但不限于RNA、DNA、蛋白质(例如，酶)、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、碳水化合物、脂质凝集素或对所希望的靶标具有亲和力的任何其他生物分子。在一些实施方案中，所需靶标是T细胞受体和/或T细胞受体的组分。在某些实施方案中，所需靶标是CD3。在某些实施方案中，所需靶标是T细胞共刺激分子，例如CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。一种或多种药剂可以通过在本领域中已知和可用的各种方法直接或间接附接至珠上。附接可以是共价的、非共价的、静电的或疏水的，并且可以通过各种附接手段(包括例如化学手段、机械手段或酶促手段)来实现。在一些实施方案中，生物分子(例如，生物素化的抗CD3抗体)可以通过直接附接至珠的另一种生物分子(例如，抗生物素抗体)间接附接至珠上。
在一些实施方案中，刺激试剂含有珠和直接与细胞表面上的大分子相互作用的一种或多种药剂。在某些实施方案中，珠(例如，顺磁珠)通过对细胞上的一种或多种大分子(例如一种或多种细胞表面蛋白)具有特异性的一种或多种药剂(例如，抗体)与细胞相互作用。在某些实施方案中，将珠(例如，顺磁珠)用本文所述的第一药剂(如一抗(例如，抗生物素抗体)或其他生物分子)标记，然后添加第二药剂(如二抗(例如，生物素化的抗CD3抗体)或其他第二生物分子(例如，链霉亲和素)，由此所述二抗或其他第二生物分子与颗粒上的此类一抗或其他生物分子特异性结合。
在一些实施方案中，刺激试剂含有一种或多种药剂(例如，抗体)，所述一种或多种药剂附接至珠(例如顺磁珠)并且与细胞(例如，T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性结合：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54(ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BB(CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la(LFA-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、Notch配体(例如，δ样1/4、Jagged1/2等)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7和CXCR3或其片段，包括这些大分子的相应配体或其片段。在一些实施方案中，附接至珠的药剂(例如，抗体)与细胞(例如，T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性结合：CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO。在一些实施方案中，附接至珠的一种或多种药剂是抗体。抗体可以包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)、以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)。在一些实施方案中，刺激试剂是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。应当理解，任何同种型的恒定区都可以用于本文设想的抗体，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且此类恒定区可以从任何人或动物物种(例如，鼠物种)获得。
在一些实施方案中，药剂是结合和/或识别T细胞受体的一种或多种组分的抗体。在特定实施方案中，药剂是抗CD3抗体。在某些实施方案中，药剂是结合和/或识别共受体的抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包括抗CD28抗体。在特定实施方案中，刺激剂含有抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，抗体是Fab。在一些实施方案中，刺激剂含有抗CD3Fab和抗CD28 Fab。
在一些实施方案中，刺激剂是抗CD3/抗CD28链霉亲和素寡聚体试剂，如PCT公开号WO/2015/158868或WO 2019/197949中所述。
在一些实施方案中，刺激剂是抗CD3/抗CD28珠(例如，M-450CD3/CD28 T细胞扩增器和/或珠)。
在一些实施方案中，珠具有大于约0.001μm、大于约0.01μm、大于约0.1μm、大于约1.0μm、大于约10μm、大于约50μm、大于约100μm、或大于约1000μm且不超过约1500μm的直径。在一些实施方案中，珠具有约1.0μm至约500μm、约1.0μm至约150μm、约1.0μm至约30μm、约1.0μm至约10μm、约1.0μm至约5.0μm、约2.0μm至约5.0μm、或约3.0μm至约5.0μm的直径。在一些实施方案中，珠具有约3μm至约5μm的直径。在一些实施方案中，珠具有至少或至少约或约0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm、或20μm的直径。在某些实施方案中，珠具有为或约4.5μm的直径。在某些实施方案中，珠具有为或约2.8μm的直径。
在一些实施方案中，珠的密度大于0.001g/cm3、大于0.01g/cm3、大于0.05g/cm3、大于0.1g/cm3、大于0.5g/cm3、大于0.6g/cm3、大于0.7g/cm3、大于0.8g/cm3、大于0.9g/cm3、大于1g/cm3、大于1.1g/cm3、大于1.2g/cm3、大于1.3g/cm3、大于1.4g/cm3、大于1.5g/cm3、大于2g/cm3、大于3g/cm3、大于4g/cm3、或大于5g/cm3。在一些实施方案中，珠的密度在约0.001g/cm3与约100g/cm3之间、约0.01g/cm3与约50g/cm3之间、约0.1g/cm3与约10g/cm3之间、约0.1g/cm3与约.5g/cm3之间、约0.5g/cm3与约1g/cm3之间、约0.5g/cm3与约1.5g/cm3之间、约1g/cm3与约1.5g/cm3之间、约1g/cm3与约2g/cm3之间、或约1g/cm3与约5g/cm3之间。在一些实施方案中，珠的密度为约0.5g/cm3、约0.5g/cm3、约0.6g/cm3、约0.7g/cm3、约0.8g/cm3、约0.9g/cm3、约1.0g/cm3、约1.1g/cm3、约1.2g/cm3、约1.3g/cm3、约1.4g/cm3、约1.5g/cm3、约1.6g/cm3、约1.7g/cm3、约1.8g/cm3、约1.9g/cm3、或约2.0g/cm3。在某些实施方案中，珠的密度为约1.6g/cm3。在特定实施方案中，珠或颗粒的密度为约1.5g/cm3。在某些实施方案中，颗粒的密度为约1.3g/cm3。
在某些实施方案中，多个珠具有均匀的密度。在某些实施方案中，均匀的密度包含平均珠密度的小于10％、小于5％或小于1％的密度标准差。
在一些实施方案中，珠的表面积在约0.001m2/克颗粒(m2/g)至约1,000m2/g、约.010m2/g至约100m2/g、约0.1m2/g至约10m2/g、约0.1m2/g至约1m2/g、约1m2/g至约10m2/g、约10m2/g至约100m2/g、约0.5m2/g至约20m2/g、约0.5m2/g至约5m2/g或约1m2/g至约4m2/g之间。在一些实施方案中，颗粒或珠的表面积为约1m2/g至约4m2/g。
在一些实施方案中，珠在磁场中反应。在一些实施方案中，珠是磁珠。在一些实施方案中，磁珠是顺磁性的。在特定实施方案中，磁珠是超顺磁性的。在某些实施方案中，珠不显示任何磁性特性，除非它们暴露于磁场。
在特定实施方案中，珠包含磁核、顺磁核或超顺磁核。在一些实施方案中，磁核含有金属。在一些实施方案中，金属可以是但不限于铁、镍、铜、钴、钆、锰、钽、锌、锆或其任何组合。在某些实施方案中，磁核包含金属氧化物(例如，氧化铁)、铁氧体(例如，锰铁氧体、钴铁氧体、镍铁氧体等)、赤铁矿和金属合金(例如，CoTaZn)。在一些实施方案中，磁核包含铁氧体、金属、金属合金、氧化铁或二氧化铬中的一种或多种。在一些实施方案中，磁核包含元素铁或其化合物。在一些实施方案中，磁核包含磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γFe2O3)或硫复铁矿(Fe3S4)中的一种或多种。在一些实施方案中，内核包含氧化铁(例如，Fe3O4)。
在某些实施方案中，珠含有被表面官能化涂层(coat或coating)覆盖的磁核、顺磁核和/或超顺磁核。在一些实施方案中，涂层可以含有如下材料：其可以包括但不限于聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸、蛋白质、碳、琼脂糖、琼脂糖凝胶或其组合。在一些实施方案中，聚合物可以是聚乙二醇、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯或聚乙烯醇。在某些实施方案中，外包衣(coat或coating)包含聚苯乙烯。在特定实施方案中，外包衣是表面官能化的。
在一些实施方案中，刺激试剂包含珠，其含有金属氧化物核(例如，氧化铁核)和涂层，其中所述金属氧化物核包含至少一种多糖(例如，葡聚糖)，并且其中所述涂层包含至少一种多糖(例如，氨基葡聚糖)、至少一种聚合物(例如，聚氨酯)和二氧化硅。在一些实施方案中，金属氧化物核是胶体氧化铁核。在某些实施方案中，一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗生物素抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包括抗生物素抗体。在一些实施方案中，珠具有约3μm至约10μm的直径。在一些实施方案中，珠具有约3μm至约5μm的直径。在某些实施方案中，珠具有约3.5μm的直径。
在一些实施方案中，刺激试剂包含附接至珠的一种或多种药剂，所述珠包含金属氧化物核(例如，氧化铁内核)和涂层(例如，保护涂层)，其中所述涂层包含聚苯乙烯。在某些实施方案中，珠是单分散的顺磁(例如超顺磁)珠，其包含顺磁(例如超顺磁)铁核(例如，包含磁铁矿(Fe3O4)和/或磁赤铁矿(γFe2O3)的核)和聚苯乙烯涂层(coat或coating)。在一些实施方案中，珠是无孔的。在一些实施方案中，珠含有一种或多种药剂附接的官能化表面。在某些实施方案中，一种或多种药剂在表面上共价地结合至珠。在一些实施方案中，一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，刺激试剂是或包含抗CD3/抗CD28磁珠。在一些实施方案中，一种或多种药剂包括抗CD3抗体和/或抗CD28抗体，以及能够与标记的抗体(例如，生物素化的抗体)(如标记的抗CD3或抗CD28抗体)结合的抗体或其片段。在某些实施方案中，珠具有约1.5g/cm3的密度和约1m2/g至约4m2/g的表面积。在特定实施方案中；珠是单分散的超顺磁珠，其具有约4.5μm的直径和约1.5g/cm3的密度。在一些实施方案中，珠是具有约2.8μm的平均直径和约1.3g/cm3的密度的单分散的超顺磁珠。
在一些实施方案中，以为或为约3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1或0.2:1的珠与细胞的比率将经富集T细胞的组合物与刺激试剂一起孵育。在特定实施方案中，珠与细胞的比率为在2.5:1与0.2:1之间、在2:1与0.5:1之间、在1.5:1与0.75:1之间、在1.25:1与0.8:1之间、在1.1:1与0.9:1之间。在特定实施方案中，刺激试剂与细胞的比率为约1:1或为1:1。
2.从细胞去除刺激试剂
在某些实施方案中，将刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)从细胞去除和/或分离。在不希望受理论束缚的情况下，特定实施方案设想到，在一些情况下，在孵育期间，刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合可能随着时间而减少。在某些实施方案中，可以添加一种或多种药剂以减少刺激剂与细胞之间的结合和/或缔合。在特定实施方案中，细胞培养条件(例如培养基温度或pH)的改变可以减少刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合。因此，在一些实施方案中，可以将刺激试剂与细胞分开地从孵育、细胞培养系统和/或溶液中去除，例如不会将细胞也从孵育、细胞培养系统和/或溶液中去除。
从细胞去除刺激试剂(例如，为或含有颗粒如珠颗粒或可磁化颗粒的刺激试剂)的方法是已知的。在一些实施方案中，可以使用竞争性抗体(如未标记的抗体)的使用，其例如与刺激试剂的一抗结合，并改变所述一抗对细胞上其抗原的亲和力，从而允许温和脱附。在一些情况下，在脱附之后，竞争性抗体可以保持与颗粒(例如，珠颗粒)缔合，而未反应的抗体被洗掉或可以被洗掉，并且细胞不含分离、选择、富集和/或激活抗体。这种试剂的例子是DETACaBEAD(Friedl等人1995；Entschladen等人1997)。在一些实施方案中，可以在可切割接头(例如，DNA接头)的存在下除去颗粒(例如，珠颗粒)，由此使颗粒结合的抗体缀合至接头(例如，CELLection、Dynal)。在一些情况下，接头区提供了可切割位点，以在分离之后例如通过添加DNase或其他释放缓冲液从细胞中除去颗粒(例如，珠颗粒)。在一些实施方案中，还可以采用其他酶促方法从细胞中释放颗粒(例如，珠颗粒)。在一些实施方案中，颗粒(例如，珠颗粒或可磁化颗粒)是可生物降解的。
在一些实施方案中，刺激试剂是磁性的、顺磁性的和/或超顺磁性的，和/或含有是磁性的、顺磁性的和/或超顺磁性的珠，并且可以通过将细胞暴露于磁场来从细胞去除刺激试剂。含有用于生成磁场的磁体的合适设备的例子包括DynaMag CTS(Thermo Fisher)、磁分离器(Takara)和EasySep磁体(Stem Cell Technologies)。
在特定实施方案中，在完成所提供的方法之前，例如在收获、收集和/或配制通过本文提供的方法产生的工程化细胞之前，将刺激试剂从细胞去除或分离。在一些实施方案中，在工程化(例如转导或转染)细胞之前，将刺激试剂从细胞去除和/或分离。在特定实施方案中，在工程化细胞的步骤之后，将刺激试剂从细胞去除和/或分离。在某些实施方案中，在培育细胞之前，例如，在促进增殖和/或扩增的条件下培育经工程化，例如经转染或转导的细胞之前，将刺激试剂去除。
在某些实施方案中，在一定时间量后将刺激试剂从细胞分离和/或去除。在特定实施方案中，所述时间量是从在刺激条件下开始和/或起始孵育起的时间量。在特定实施方案中，孵育的开始被认为是在或约在细胞与刺激试剂和/或含有刺激试剂的培养基或溶液接触的时候。在特定实施方案中，在开始或起始孵育后10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天内或者约10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天内将刺激试剂从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在开始或起始孵育后为或约9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天时将刺激试剂从细胞去除和/或分离。在某些实施方案中，在开始或起始孵育后为或约168小时、162小时、156小时、144小时、138小时、132小时、120小时、114小时、108小时、102小时或96小时将刺激试剂从细胞去除和/或分离。在特定实施方案中，在开始和/或起始孵育后为或约5天时将刺激试剂从细胞去除和/或分离。在一些实施方案中，在开始和/或起始孵育后为或约4天时将刺激试剂从细胞去除和/或分离。
C.工程化细胞
在一些实施方案中，所提供的方法涉及向患有疾病或病症的受试者施用表达重组抗原受体的细胞。用于引入基因工程化组分例如重组受体(例如CAR或TCR)的各种方法是熟知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔来进行。
表达受体并通过所提供的方法施用的细胞包括工程化细胞。基因工程通常涉及将编码重组或工程化组分的核酸引入含有细胞的组合物中，如通过逆转录病毒转导、转染或转化。
在一些实施方案中，本文所提供的方法与工程化经富集T细胞的一种或多种组合物结合使用。在某些实施方案中，工程化是或包括引入多核苷酸，例如编码重组蛋白的重组多核苷酸。在特定实施方案中，重组蛋白是重组受体，如第II节中描述的任何受体。将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔来进行。在一些实施方案中，工程化产生经富集T细胞的一种或多种工程化组合物。
在某些实施方案中，在如通过第II-D节中提供的方法例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞之前，将经富集T细胞的一种或多种组合物工程化，例如转导或转染。在特定实施方案中，在一种或多种组合物已经在刺激条件(如在第II-B节中提供的方法中所述)下被刺激、激活和/或孵育之后，将经富集T细胞的一种或多种组合物工程化。在特定实施方案中，一种或多种组合物是经刺激组合物。在特定实施方案中，一种或多种经刺激组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在工程化之前解冻。
在某些实施方案中，经刺激T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独的经刺激组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，已从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别工程化。在某些实施方案中，两种单独组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，两种单独组合物包括经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的两种单独组合物如在如上所述的刺激条件下孵育之后分别基因工程化。在一些实施方案中，将经富集T细胞的单一组合物基因工程化。在某些实施方案中，单一组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，单一组合物是在工程化之前已从单独组合物合并的经富集CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，经工程化，例如经转导或转染的经富集CD4+T细胞(如经刺激CD4+T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在某些实施方案中，经工程化的经富集CD4+T细胞(如经刺激CD4+T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，经工程化，例如经转导或转染的经富集CD8+T细胞(如经刺激CD8+T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，经工程化的经富集CD8+T细胞(如经刺激CD8+T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+T细胞的单独组合物合并为单一组合物并且进行基因工程化，例如转导或转染。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成基因工程化之后将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独工程化组合物合并为单一组合物。在特定实施方案中，将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独组合物(如经刺激CD4+和CD8+T细胞的单独组合物)分别工程化，并且在已经进行和/或完成基因工程化之后分别加工以进行T细胞的培育和/或扩增。
在一些实施方案中，多核苷酸，例如编码重组蛋白的重组多核苷酸的引入通过使经富集CD4+或CD8+T细胞(如经刺激CD4+或CD8+T细胞)与含有所述多核苷酸的病毒颗粒接触来进行。在一些实施方案中，接触可以通过离心如旋转接种(spinoculation)(例如离心接种)来实现。在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以从100g至3200g或从约100g至约3200g(例如，为或约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)，如为或约693g的力(例如，相对离心力)来进行，所述力如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。在一些实施方案中，细胞(例如来自经富集CD4+T细胞或经富集CD8+T细胞的经刺激组合物的细胞)与病毒进行的接触、孵育和/或工程化的至少一部分在约100g与3200g、1000g与2000g、1000g与3200g、500g与1000g、400g与1200g、600g与800g、600g与700g或500g与700g之间的旋转下进行。在一些实施方案中，旋转在600g与700g之间，例如在为或约693g下进行。
在某些实施方案中，工程化、转导和/或转染的至少一部分在旋转，例如旋转接种和/或离心下进行。在一些实施方案中，将旋转进行、进行约、或进行至少或至少约5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、2天、3天、4天、5天、6天，或进行至少7天。在一些实施方案中，将旋转进行为或约60分钟。在某些实施方案中，将旋转进行约30分钟。在一些实施方案中，将旋转在600g至700g之间，例如在为或约693g下进行约30分钟。
在某些实施方案中，待工程化、转导和/或转染的活细胞的数量的范围为从约5x106个细胞至约100x107个细胞，如从约10x106个细胞至约100x106个细胞、从约100x106个细胞至约200x106个细胞、从约200x106个细胞至约300x106个细胞、从约300x106个细胞至约400x106个细胞、从约400x106个细胞至约500x106个细胞或从约500x106个细胞至约100x107个细胞。在特定例子中，待工程化、转导和/或转染的活细胞的数量为约或少于约300x106个细胞。
在某些实施方案中，工程化、转导和/或转染的至少一部分在如下体积(例如，旋转接种体积)下进行，所述体积从约5mL至约100mL，如从约10mL至约50mL、从约15mL至约45mL、从约20mL至约40mL、从约25mL至约35mL，或为或为约30mL。在某些实施方案中，旋转接种后的细胞团粒体积的范围为从约1mL至约25mL，如从约5mL至约20mL、从约5mL至约15mL、从约5mL至约10mL，或为或为约10mL。
在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导应答(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。在某些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先将细胞在刺激条件下孵育，如通过第I-B节中所述的方法中的任一种。
在一些实施方案中，用于基因工程化的方法通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，接触可以通过离心如旋转接种(例如，离心接种)来实现。此类方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的那些方法中的任一种。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于和2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统以及加工仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于这样的系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中执行的一个或多个各种其他加工步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中所述的离心室系统进行的一个或多个加工步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US2008/0171951中。
在一些实施方案中，系统包括一系列容器，例如袋、管、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，容器(如袋)包括一个或多个容器(如袋)，其在同一容器或单独容器(如同一袋或单独袋)中含有要转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，系统进一步包括一个或多个容器(如袋)，所述容器含有培养基，如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述培养基抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。容器可以连接在系统中的一个或多个位置，如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，室与离心机相关联，离心机能够实现室的旋转，如围绕其旋转轴旋转。结合细胞的转导和/或在一个或多个其他加工步骤中，旋转可以发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个加工步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
在一些实施方案中，在将组合物提供至空腔之前，可以将含有细胞的组合物和含有病毒载体颗粒的组合物以及任选的空气合并或混合。在一些实施方案中，将含有细胞的组合物和含有病毒载体颗粒的组合物以及任选的空气分别提供在空腔中并且在其中合并和混合。在一些实施方案中，可以以任何顺序将含有细胞的组合物、含有病毒载体颗粒的组合物和任选的空气提供至内部空腔。在此类一些实施方案中的任一种中，含有细胞和病毒载体颗粒的组合物是曾经合并或混合在一起的输入组合物，不论所述输入组合物是在离心室内部还是外部合并和/或混合，和/或不论细胞和病毒载体颗粒是一起还是分别(如同时还是依序)提供至离心室。
在一些实施方案中，在转导方法中，在孵育细胞和病毒载体颗粒(如旋转)之前进行一定体积的气体(如空气)的摄入。在一些实施方案中，在转导方法中在细胞和病毒载体颗粒的孵育(如旋转)期间进行一定体积的气体(如空气)的摄入。
在一些实施方案中，构成转导组合物的细胞或病毒载体颗粒的液体体积、以及任选地空气的体积可以是预定体积。所述体积可以是被编程到系统中和/或由与所述系统相关联的电路控制的体积。
在一些实施方案中，手动、半自动和/或自动地控制转导组合物和任选地气体(如空气)的摄入，直到已经将所需或预定的体积摄入室的内部空腔中为止。在一些实施方案中，与系统相关的传感器可以如通过其颜色、流速和/或密度来检测流入和流出离心室的液体和/或气体，并且可以与相关电路通信以按照需要停止或继续摄入，直到已经实现这种所需或预定体积的摄入为止。在一些方面，可以使被编程或仅能够检测系统中的液体而非气体(例如空气)的传感器能够在不停止摄入的情况下允许气体(如空气)通过进入系统中。在一些此类实施方案中，当需要气体(如空气)摄入时，可以将一条不透明的管道放置在传感器附近的线中。在一些实施方案中，可以手动地控制气体(如空气)的摄入。
在所提供的方法的方面，使离心室的内部空腔经历高速旋转。在一些实施方案中，在液体输入组合物和任选地空气的摄入之前、同时、之后或间歇地实现旋转。在一些实施方案中，在液体输入组合物和任选地空气的摄入之后实现旋转。在一些实施方案中，旋转是通过在内部空腔的侧壁的内表面和/或在细胞的表面层处的为或约或至少或至少约800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3500g或4000g的相对离心力对离心室的离心进行。在一些实施方案中，旋转是通过大于或约1100g，如通过大于或约1200g、大于或约1400g、大于或约1600g、大于或约1800g、大于或约2000g、大于或约2400g、大于或约2800g、大于或约3000g或大于或约3200g的力的离心进行。在一些实施方案中，旋转是通过为或约1600g的力的离心进行。
在一些实施方案中，转导方法包括在离心室中将转导组合物和任选地空气旋转或离心，持续大于或约5分钟，如大于或约10分钟、大于或约15分钟、大于或约20分钟、大于或约30分钟、大于或约45分钟、大于或约60分钟、大于或约90分钟或大于或约120分钟。在一些实施方案中，将转导组合物和任选地空气在离心室中旋转或离心，持续大于5分钟，但持续不超过60分钟、不超过45分钟、不超过30分钟或不超过15分钟。在特定实施方案中，转导包括旋转或离心持续为或约60分钟。
在一些实施方案中，转导方法包括使转导组合物和任选的空气在离心室中旋转或离心以下时间：在或在约10分钟与60分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值，并且所述旋转或离心是以至少或大于或约1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2400g、2800g、3200g或3600g的内部空腔侧壁内表面处和/或细胞表层处的力来进行的。在特定实施方案中，所述转导方法包括使转导组合物(例如，细胞和病毒载体颗粒)以为或约1600g旋转或离心为或约60分钟。
在一些实施方案中，将室的空腔中的气体(如空气)从室中排出。在一些实施方案中，将气体(如空气)排出到容器，所述容器作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接。在一些实施方案中，容器是自由或空的容器。在一些实施方案中，室的空腔中的空气(如气体)通过过滤器排出，所述过滤器通过无菌管组线与室的内部空腔可操作地连接。在一些实施方案中，使用手动、半自动或自动过程排出空气。在一些实施方案中，在从室的空腔中输送(express)含有孵育的细胞和病毒载体颗粒(如已经开始转导的细胞或已经用病毒载体转导的细胞)的输出组合物之前、同时、间歇或随后将空气从空腔排出。
在一些实施方案中，转导和/或其他孵育作为连续或半连续过程或作为所述连续或半连续过程的一部分进行。在一些实施方案中，连续过程涉及连续摄入细胞和病毒载体颗粒，例如转导组合物(作为单一预先存在的组合物，或者通过连续抽入同一器皿(例如空腔)中，从而混合其部分)，和/或在孵育的至少一部分期间(例如，在离心的同时)，从器皿中连续输送或排出液体，以及任选地排出气体(例如空气)。在一些实施方案中，至少部分同时进行连续摄入和连续输送。在一些实施方案中，连续摄入发生在部分孵育期间，例如在部分离心期间，并且连续输送发生在孵育的单独部分期间。两者可以交替进行。因此，在进行孵育的同时，连续摄入和输送可以允许加工(例如转导)总体积更大的样品。
在一些实施方案中，孵育是连续过程的一部分，所述方法包括在孵育的至少一部分期间，实现在室旋转期间以及在孵育的一部分期间将所述转导组合物连续摄入空腔中，实现在室的旋转期间通过所述至少一个开口自空腔连续输送液体并任选地排出气体(例如空气)。
在一些实施方案中，通过在以下步骤之间交替来进行半连续孵育：实现将组合物摄入空腔中，孵育，自空腔输送液体和任选地自空腔排出气体(例如空气)，如到输出容器，然后摄入含有更多细胞和用于加工的其他试剂(例如，病毒载体颗粒)的随后的(例如第二、第三等)组合物，并重复所述过程。例如，在一些实施方案中，孵育是半连续过程的一部分，所述方法包括在孵育之前，实现将转导组合物通过至少一个开口摄入空腔中，及在孵育之后，实现自空腔输送流体；实现将包含细胞和病毒载体颗粒的另一转导组合物摄入内部空腔中；以及在所述内部空腔中在一定条件下孵育另一转导组合物，由此使所述另一转导组合物中的细胞被所述载体转导。所述过程能以迭代的方式继续进行许多另外的回合。在此方面，半连续或连续方法可以允许产生甚至更大体积和/或数量的细胞。
在一些实施方案中，转导孵育的一部分在离心室中进行，其在包括旋转或离心的条件下进行。
在一些实施方案中，所述方法包括孵育，其中细胞和病毒载体颗粒的孵育的另一部分在无旋转或离心的情况下进行，所述另一部分一般在孵育的包括室的旋转或离心的至少一部分之后进行。在某些实施方案中，细胞和病毒载体颗粒的孵育在无旋转或离心的情况下进行至少1小时、6小时、12小时、24小时、32小时、48小时、60小时、72小时、90小时、96小时、3天、4天、5天或大于5天。在某些实施方案中，将孵育进行为或约72小时。
在一些此类实施方案中，进一步孵育是在一定条件下实现，以使病毒载体整合到一个或多个细胞的宿主基因组中。评估或确定孵育是否已经导致病毒载体颗粒整合到宿主基因组中，并且因此凭经验确定进一步孵育的条件是在技术人员的水平内。在一些实施方案中，可以通过测量在孵育后由病毒载体颗粒基因组中含有的核酸编码的重组蛋白(如异源蛋白)的表达水平来评估病毒载体在宿主基因组中的整合。可以使用多种熟知方法来评价重组分子的表达水平，例如在细胞表面蛋白的情况下，如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)来检测，如通过流式细胞术进行。在一些例子中，通过检测转导标记和/或报告物构建体来测量表达。在一些实施方案中，编码截短的表面蛋白的核酸包括在载体内并用作其表达和/或增强的标记。
在一些实施方案中，可以使含有细胞、载体(例如病毒颗粒)和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以从100g至3200g或从约100g至约3200g(例如为或约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，所述力如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。
在一些实施方案中，在基因工程的至少一部分(例如转导)期间，和/或在基因工程之后，将细胞转移到生物反应器袋组件中，用于培养经基因工程化的细胞，如用于培育或扩增细胞，如上所述。
在某些实施方案中，在转导佐剂的存在下工程化，例如转导或转染经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，在一种或多种聚阳离子的存在下工程化经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，在一种或多种转导佐剂的存在下转导，例如与病毒载体颗粒一起孵育经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，在一种或多种转导佐剂的存在下转染，例如与非病毒载体一起孵育经富集T细胞的组合物。在某些实施方案中，一种或多种转导佐剂的存在如通过增加组合物中工程化(例如，转导或转染)的细胞的量、部分和/或百分比来增加基因递送的效率。在某些实施方案中，一种或多种转导佐剂的存在增加了转染的效率。在某些实施方案中，一种或多种转导佐剂的存在增加了转导的效率。在特定实施方案中，在聚阳离子存在下工程化的细胞的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％含有或表达重组多核苷酸。在一些实施方案中，与在不存在转导佐剂的情况下工程化细胞的替代性和/或示例性方法相比，在聚阳离子的存在下，组合物中多至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的细胞被工程化为含有或表达重组转导佐剂。
在一些实施方案中，在小于100μg/ml、小于90μg/ml、小于80μg/ml、小于75μg/ml、小于70μg/ml、小于60μg/ml、小于50μg/ml、小于40μg/ml、小于30μg/ml、小于25μg/ml、小于20μg/ml或小于μg/ml、小于10μg/ml的转导佐剂存在下工程化经富集细胞的组合物。在某些实施方案中，适用于所提供的方法的转导佐剂包括但不限于聚阳离子、纤连蛋白或源自纤连蛋白的片段或变体、RetroNectin及其组合。
在一些实施方案中，在细胞因子，例如重组人细胞因子的存在下工程化细胞，所述细胞因子的浓度在1IU/ml与1,000IU/ml之间、在10IU/ml与50IU/ml之间、在50IU/ml与100IU/ml之间、在100IU/ml与200IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在250IU/ml与500IU/ml之间或在500IU/ml与1,000IU/ml之间。
在一些实施方案中，在IL-2，例如人重组IL-2的存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述IL-2的浓度在1IU/ml与200IU/ml之间、在10IU/ml与100IU/ml之间、在50IU/ml与150IU/ml之间、在80IU/ml与120IU/ml之间、在60IU/ml与90IU/ml之间或在70IU/ml与90IU/ml之间。在特定实施方案中，在重组IL-2的存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述重组IL-2的浓度为或为约50IU/ml、55IU/ml、60IU/ml、65IU/ml、70IU/ml、75IU/ml、80IU/ml、85IU/ml、90IU/ml、95IU/ml、100IU/ml、110IU/ml、120IU/ml、130IU/ml、140IU/ml或150IU/ml。在一些实施方案中，在为或约85IU/ml的存在下工程化经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，T细胞群是CD4+T细胞群。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+T细胞进行富集，其中CD8+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+T细胞。在特定实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD8+T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD8+T细胞进行富集，其中CD4+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+T细胞。
在一些实施方案中，在重组IL-7，例如人重组IL-7的存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述重组IL-7的浓度在100IU/ml与2,000IU/ml之间、在500IU/ml与1,000IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在500IU/ml与750IU/ml之间、在750IU/ml与1,000IU/ml之间或在550IU/ml与650IU/ml之间。在特定实施方案中，在IL-7的存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述IL-7的浓度为或为约50IU/ml、100IU/ml、150IU/ml、200IU/ml、250IU/ml、300IU/ml、350IU/ml、400IU/ml、450IU/ml、500IU/ml、550IU/ml、600IU/ml、650IU/ml、700IU/ml、750IU/ml、800IU/ml、750IU/ml、750IU/ml、750IU/ml或1,000IU/ml。在特定实施方案中，在为或约600IU/ml的IL-7的存在下工程化经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，将在重组IL-7的存在下工程化的组合物针对T细胞(例如CD4+T细胞)的群体进行富集。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+T细胞进行富集，其中CD8+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+T细胞。
在一些实施方案中，在重组IL-15，例如人重组IL-15的存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述重组IL-15的浓度在0.1IU/ml与100IU/ml之间、在1IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与25IU/ml之间、在25IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与15IU/ml之间、或在10IU/ml与100IU/ml之间。在特定实施方案中，在IL-15的存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述IL-15的浓度为或为约1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、11IU/ml、12IU/ml、13IU/ml、14IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、40IU/ml或50IU/ml。在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物在或在约10IU/ml IL-15中工程化。在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物在或在约10IU/ml重组IL-15中孵育。在一些实施方案中，将在重组IL-15的存在下工程化的组合物针对T细胞(例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)的群体进行富集。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD8+T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD8+T细胞进行富集，其中CD4+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+T细胞。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的组合物针对CD4+T细胞进行富集，其中CD8+T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+T细胞。
在特定实施方案中，在IL-2和/或IL-15的存在下工程化经富集CD8+T细胞的组合物。在某些实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下工程化经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂的存在下工程化细胞。在一些实施方案中，抗氧化剂包括但不限于，一种或多种抗氧化剂包括生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、α-生育醌、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-二甲酸)、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、类黄酮、异黄酮、番茄红素、β-胡萝卜素、硒、泛醌、梅毒菌素、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、柠檬酸、L-肉碱、BHT、硫代甘油、抗坏血酸、没食子酸丙酯、甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、胱胺和胱硫醚和/或甘氨酸-甘氨酸-组氨酸。
在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是或包括含硫氧化剂。在某些实施方案中，含硫抗氧化剂可以包括含硫醇抗氧化剂和/或例如在环结构内展现出一个或多个硫部分的抗氧化剂。在一些实施方案中，含硫抗氧化剂可以包括例如N-乙酰半胱氨酸(NAC)和2,3-二巯基丙醇(DMP)、L-2-氧代-4-噻唑烷甲酸酯(OTC)和硫辛酸。在特定实施方案中，含硫抗氧化剂是谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，谷胱甘肽前体是可以在细胞内的一个或多个步骤中被修饰成衍生的谷胱甘肽的分子。在特定实施方案中，谷胱甘肽前体可以包括但不限于N-乙酰半胱氨酸(NAC)、L-2-氧代噻唑烷-4-甲酸(丙半胱氨酸(Procysteine))、硫辛酸、S-烯丙基半胱氨酸或甲基甲硫氨酸锍氯化物。
在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂的存在下工程化细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的一种或多种抗氧化剂的存在下工程化细胞。在一些实施方案中，在为或约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的一种或多种抗氧化剂存在下工程化细胞。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是或包括含硫抗氧化剂。在特定实施方案中，一种或多种抗氧化剂是或包括谷胱甘肽前体。
在一些实施方案中，在NAC的存在下工程化细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1,500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的NAC的存在下工程化细胞。在一些实施方案中，在为或约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的NAC存在下工程化细胞。在一些实施方案中，用或用约0.8mg/ml工程化细胞。
在一些实施方案中，在一种或多种聚阳离子的存在下工程化经富集T细胞(如经刺激T细胞，例如经刺激CD4+T细胞或经刺激CD8+T细胞)的组合物。在一些实施方案中，在一种或多种聚阳离子的存在下转导，例如与病毒载体颗粒一起孵育经富集T细胞(如经刺激T细胞，例如经刺激CD4+T细胞或经刺激CD8+T细胞)的组合物。在特定实施方案中，在一种或多种聚阳离子的存在下用非病毒载体转染(例如与非病毒载体一起孵育)经富集T细胞(如经刺激T细胞，例如经刺激CD4+T细胞或经刺激CD8+T细胞)的组合物。在某些实施方案中，一种或多种聚阳离子的存在如通过增加组合物中工程化(例如，转导或转染)的细胞的量、部分和/或百分比来增加基因递送的效率。在某些实施方案中，一种或多种聚阳离子的存在增加了转染的效率。在某些实施方案中，一种或多种聚阳离子的存在增加了转导的效率。在特定实施方案中，在聚阳离子存在下工程化的细胞的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％含有或表达重组多核苷酸。在一些实施方案中，与在不存在聚阳离子的情况下工程化细胞的替代性和/或示例性方法相比，在聚阳离子的存在下，组合物中多至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的细胞被工程化为含有或表达重组多核苷酸。
在某些实施方案中，例如，相对于在聚阴离子的存在下工程化细胞的示例性和/或替代性方法，在低浓度或量的聚阳离子的存在下工程化经富集细胞的组合物，例如经富集CD4+T细胞或经富集CD8+T细胞(如其经刺激T细胞)的组合物。在某些实施方案中，在小于90％、小于80％、小于75％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％的用于工程化细胞的示例性和/或替代性过程的聚阳离子的量或浓度的存在下工程化经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+T细胞或经刺激CD8+T细胞)的组合物。在一些实施方案中，在小于100μg/ml、小于90μg/ml、小于80μg/ml、小于75μg/ml、小于70μg/ml、小于60μg/ml、小于50μg/ml、小于40μg/ml、小于30μg/ml、小于25μg/ml、小于20μg/ml或小于μg/ml、小于10μg/ml的聚阳离子的存在下工程化经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+T细胞或经刺激CD8+T细胞)的组合物。在特定实施方案中，在为或约1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml或50μg/ml的聚阳离子的存在下工程化经富集细胞(如经刺激T细胞，例如经刺激CD4+T细胞或经刺激CD8+T细胞)的组合物。
在特定实施方案中，在聚阳离子的存在下工程化经富集细胞，如经刺激T细胞(例如，经刺激CD4+T细胞或经刺激CD8+T细胞)的组合物减少了细胞死亡(例如，因坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡所致)的量。在一些实施方案中，在低量聚阳离子(例如，小于100μg/ml、50μg/ml或10μg/ml)的存在下工程化经富集T细胞，如经刺激T细胞(例如，经刺激CD4+T细胞或经刺激CD8+T细胞)的组合物，并且在完成工程化步骤后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的细胞存活，例如未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在一些实施方案中，与在较高量或浓度的聚阳离子(例如，超过50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml或1,000μg/ml)的存在下工程化细胞的替代性和/或示例性方法相比，在低浓度或量的聚阳离子的存在下工程化组合物，并且与经历所述示例性和/或替代性过程的细胞相比，所述组合物的细胞具有大至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的存活率。
在一些实施方案中，聚阳离子带正电荷。在某些实施方案中，聚阳离子降低细胞与载体(例如病毒或非病毒载体)之间的斥力，并且介导载体与细胞表面的接触和/或结合。在一些实施方案中，聚阳离子是聚凝胺、DEAE-葡聚糖、硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸或阳离子脂质体。
在特定实施方案中，聚阳离子是硫酸鱼精蛋白。在一些实施方案中，在小于或约500μg/ml、小于或约400μg/ml、小于或约300μg/ml、小于或约200μg/ml、小于或约150μg/ml、小于或约100μg/ml、小于或约90μg/ml、小于或约80μg/ml、小于或约75μg/ml、小于或约70μg/ml、小于或约60μg/ml、小于或约50μg/ml、小于或约40μg/ml、小于或约30μg/ml、小于或约25μg/ml、小于或约20μg/ml或小于或约15μg/ml或小于或约10μg/ml的硫酸鱼精蛋白的存在下工程化经富集T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+T细胞或经刺激CD8+T细胞)的组合物。在特定实施方案中，在为或约1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml或150μg/ml的硫酸鱼精蛋白的存在下工程化经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+T细胞或经刺激CD8+T细胞)的组合物。
在一些实施方案中，经富集CD4+T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+T细胞)的工程化组合物包含至少40％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在某些实施方案中，经工程化的经富集CD4+T细胞，如经刺激T细胞(如经刺激CD4+T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，经工程化的经富集CD8+T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD8+T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，经工程化的经富集CD8+T细胞，如经刺激T细胞(如经刺激CD8+T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，将细胞工程化包括与载体(例如病毒载体或非病毒载体)一起培养、接触或一起孵育。在某些实施方案中，工程化包括将细胞与载体一起培养、接触和/或孵育，进行、进行约或进行至少4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或超过7天。在特定实施方案中，工程化包括将细胞与载体一起培养、接触和/或孵育，持续为或约24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或84小时，或持续为或约2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，将工程化步骤进行为或约24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或84小时。在某些实施方案中，将工程化进行约60小时或约84小时，进行为或约72小时，或进行为或约2天。
在一些实施方案中，工程化是在从约25℃至约38℃，如从约30℃至约37℃、从约36℃至约38℃，或为或为约37℃±2℃的温度下进行。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物在从约2.5％至约7.5％，如从约4％至约6％，例如为或为约5％±0.5％的CO2水平下工程化。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物在为或为约37℃的温度下和/或在为或为约5％的CO2水平下工程化。
在一些实施方案中，在进行用于基因工程化例如转导或转染细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)以含有编码重组受体的多核苷酸的一个或多个步骤之后，培育细胞。在一些实施方案中，培育可以包括培养、孵育、刺激、激活、扩增和/或繁殖。在一些此类实施方案中，进一步培育是在一定条件下实现，以使病毒载体整合到一个或多个细胞的宿主基因组中。孵育和/或工程化可以在培养器皿中进行，所述培养器皿是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或者用于培养或培育细胞的其他容器。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育组合物或细胞。此类条件包括设计用于在群体中诱导细胞的增殖、扩增、激活和/或存活以模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的那些。
在一些实施方案中，进一步孵育是在高于室温的温度下进行，所述温度为如高于或高于约25℃，如通常高于或高于约32℃、35℃或37℃。在一些实施方案中，进一步孵育是在为或约37℃±2℃的温度下，如在为或约37℃的温度下实现。
在一些实施方案中，进一步孵育是在用于刺激和/或激活细胞的条件下进行，所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他经设计以激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如刺激性和/或辅助性药剂)，例如配体。在一些方面，药剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联，如适于递送初级信号以例如启动ITAM诱导的信号(如对TCR组分具有特异性的那些)的激活的药剂，和/或促进共刺激信号(如对T细胞共刺激受体具有特异性的共刺激信号)的药剂，例如抗CD3、抗CD28或抗41-BB(例如，其任选地结合至固体支持物如珠)和/或一种或多种细胞因子。刺激剂包括抗CD3/抗CD28珠(例如，M-450 CD3/CD28 T细胞扩增器和/或珠)。任选地，扩增方法可以还包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括例如结合至固体支持物(如珠)的抗体，如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些抗体(例如抗CD3、抗CD28)；和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL、至少约50单位/mL、至少约100单位/mL或至少约200单位/mL。
条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶受体和设计为激活细胞的任何其他药剂))。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，如以下文献中所述的那些技术：Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，进一步孵育是在进行接触的相同容器或设备中进行。在一些实施方案中，进一步孵育是在没有旋转或离心的情况下进行，这通常是在旋转下(例如与离心或旋转接种结合)进行的孵育的至少一部分之后进行。在一些实施方案中，进一步孵育是在固定相之外进行，如在色谱基质之外、例如在溶液中进行。
在一些实施方案中，进一步孵育是在与进行接触的容器或设备不同的容器或设备中进行，如通过将细胞组合物在与病毒颗粒和试剂接触之后转移(例如自动转移)至不同的容器或设备中。
在一些实施方案中，进一步培养或孵育例如以促进离体扩增进行大于或大于约24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，进一步培养或孵育进行不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天或不超过24小时。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，如至少或约至少或约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，包含端值。
在一些实施方案中，本文所提供的方法不包括进一步培养或孵育，例如，不包括离体扩增步骤，或者包括显著更短的离体扩增步骤。
在一些实施方案中，在工程化之前将刺激试剂从细胞去除和/或分离。在特定实施方案中，在工程化之后将刺激试剂从细胞去除和/或分离。在某些实施方案中，在工程化之后并且在例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞之前将刺激剂从细胞去除和/或分离。在某些实施方案中，刺激试剂是在第I-B-1节中所述的刺激试剂。在特定实施方案中，如在第I-B-2节中所述将刺激试剂从细胞去除和/或分离。
1.载体和方法
在一些实施方案中，将细胞(例如T细胞)基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，工程化是通过引入编码重组受体或其部分或组分的一种或多种多核苷酸来进行。还提供了编码重组受体的多核苷酸，以及含有此类核酸和/或多核苷酸的载体或构建体。
在特定实施方案中，载体是病毒载体、非病毒载体。在一些情况下，载体是病毒载体，如逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，编码重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组受体的表达。在一些例子中，多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组受体的表达。在一些实施方案中，多核苷酸可以含有对引入所述多核苷酸的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性的调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，酌情并考虑所述多核苷酸是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，多核苷酸可以含有调节/控制元件，如启动子、增强子、内含子、多腺苷酸化信号、Kozak共有序列、内部核糖体进入位点(IRES)、2A序列和剪接受体或供体。在一些实施方案中，多核苷酸可以含有与编码重组受体和/或一种或多种另外的多肽的核苷酸序列可操作地连接的非天然启动子。在一些实施方案中，启动子选自RNA pol I、pol II或pol III启动子。在一些实施方案中，启动子由RNA聚合酶II识别(例如，CMV、SV40早期区域或腺病毒主要晚期启动子)。在另一个实施方案中，启动子由RNA聚合酶III识别(例如U6或H1启动子)。在一些实施方案中，启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子以及在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还设想其他已知的启动子。
在一些实施方案中，启动子是或包含组成型启动子。示例性组成型启动子包括例如猿病毒40早期启动子(SV40)、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人泛素C启动子(UBC)、人延伸因子1α启动子(EF1α)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在一些实施方案中，组成型启动子是合成或修饰的启动子。在一些实施方案中，启动子是或包含MND启动子，它是一种含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的经修饰的MoMuLV LTR的U3区的合成启动子(参见Challita等人(1995)J.Virol.69(2):748-755)。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。在另一个实施方案中，启动子是病毒启动子。在另一个实施方案中，启动子是非病毒启动子。在一些实施方案中，示例性启动子可以包括但不限于人延伸因子1α(EF1α)启动子或其修饰形式或MND启动子。
在另一个实施方案中，启动子是受调节的启动子(例如诱导型启动子)。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子或阻抑型启动子。在一些实施方案中，启动子包含Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列，或者是其类似物或能够由Lac阻遏因子或四环素阻遏因子或其类似物结合或识别。在一些实施方案中，多核苷酸不包括调节元件，例如，启动子。
在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ ID NO:10中所示并且由SEQID NO:9中所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽、SEQ ID NO:11中所示的CD8α信号肽或SEQ ID NO:12中所示的CD33信号肽。
在一些实施方案中，多核苷酸含有编码一种或多种另外的多肽(例如一种或多种标记和/或一种或多种效应分子)的核酸序列。在一些实施方案中，一种或多种标记包括转导标记、替代标记和/或选择标记。所引入的例如编码一种或多种另外的多肽的另外的核酸序列包括：可以如通过促进所转移细胞的活力和/或功能来改善疗法的功效的核酸序列；提供用于选择和/或评价细胞(如评估体内存活或定位)的遗传标记的核酸序列；例如通过使细胞对体内阴性选择敏感来提高安全性的核酸序列，如以下文献中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy3:319-338(1992)；还参见WO 1992008796和WO 1994028143(描述源自将显性阳性可选标记与阴性可选标记融合的双功能可选融合基因的用途)，以及美国专利号6,040,177。
在一些实施方案中，标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可用于检测已经引入多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记是制备以在细胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在某些实施方案中，替代标记由编码重组受体的相同多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地由内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自我切割肽或引起核糖体跳跃的肽如2A序列的核酸隔开。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞结合用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下，还可以用于促进细胞消除和/或细胞自杀。
示例性替代标记可以包括截短形式的细胞表面多肽，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常被细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括生长因子或其他受体的截短形式，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，SEQ ID NO:2或3所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式(如截短的PSMA(tPSMA))。在一些方面，tEGFR可以含有由抗体西妥昔单抗或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记(例如，替代标记)包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如，截短的非人CD19)。截短的EGFR(例如，tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:2或3至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标记是或包含可检测蛋白，如荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体、经密码子优化的、稳定的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。在一些方面，酶的表达可以通过添加底物来检测，所述底物可以根据所述酶的表达和功能活性来检测。
在一些实施方案中，标记是抗性标记或选择标记。在一些实施方案中，抗性标记或选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，抗性标记或选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，抗性标记或选择标记是赋予哺乳动物细胞抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，抗性标记或选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
本文所述的重组受体和/或一种或多种另外的多肽中的任一种可以由一种或多种多核苷酸编码，所述多核苷酸含有呈任何组合、定向或排列的编码重组受体的一个或多个核酸序列。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同多肽(例如，重组受体或其部分或组分)和/或一种或多种另外的多肽(例如，标记和/或效应分子)。在一些实施方案中，一种多核苷酸含有编码重组受体(例如，CAR)或其部分或组分的核酸序列，以及编码一种或多种另外的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码重组受体(例如，CAR)或其部分或组分的核酸序列，并且单独载体或构建体含有编码一种或多种另外的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列和编码一种或多种另外的多肽的核酸序列可操作地连接至两种不同启动子。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码一种或多种另外的多肽的核酸的上游。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码一种或多种另外的多肽的核酸的下游。
在某些情况下，一种多核苷酸含有的核酸序列编码两种或更多种不同多肽链，例如，重组受体和一种或多种另外的多肽，例如，标记和/或效应分子。在一些实施方案中，编码两种或更多种不同多肽链(例如，重组受体和一种或多种另外的多肽)的核酸序列存在于两种单独多核苷酸中。例如，提供两种单独多核苷酸，并且每一种可以单独地转移至或引入细胞中以供在细胞中表达。在一些实施方案中，编码标记的核酸序列和编码重组受体的核酸序列存在于或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，编码标记的核酸序列和编码重组受体的核酸序列可操作地连接至两种不同启动子。
在一些实施方案中，如多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码不同多肽链中的每一种的编码序列可以与相同或不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列和编码一种或多种另外的多肽的核酸序列可操作地连接至相同启动子，并且任选地由内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自我切割肽或引起核糖体跳跃的肽(如2A元件)的核酸隔开。例如，示例性标记和任选的核糖体跳跃序列可以是PCT公开号WO 2014031687中披露的任一种。
在一些实施方案中，可以将转录单元工程化为含有IRES的双顺反子单元，其允许基因产物(例如，编码重组受体和另外的多肽)通过来自单一启动子的信息共表达。可替代地，在一些情况下，单一启动子可以引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如，编码标记和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A序列)的序列或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶)彼此分开。因此，ORF编码单一多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或翻译后被加工成单独蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见例如，de Felipe,Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。各种2A元件是已知的。可以用于本文公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ IDNO:8)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:7)、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asignavirus)(T2A，例如SEQ ID NO:1或4)和猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1(P2A，例如SEQID NO:5或6)，如美国专利公开号20070116690中所述。
在一些实施方案中，编码重组受体和/或另外的多肽的多核苷酸含于载体中或可以被克隆至一种或多种载体中。在一些实施方案中，一种或多种载体可以用于转化或转染宿主细胞，例如用于工程化的细胞。示例性载体包括设计用于引入、增殖和扩增或用于表达或用于两者的载体，如质粒和病毒载体。在一些方面，载体是表达载体，例如，重组表达载体。在一些实施方案中，可以使用标准重组DNA技术来制备重组表达载体。
在一些实施方案中，载体可以是如下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。
在一些实施方案中，如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码重组受体和/或一种或多种另外的多肽的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
在一些实施方案中，载体是病毒载体，如逆转录病毒载体。在一些实施方案中，将编码重组受体和/或一种或多种另外的多肽的多核苷酸通过逆转录病毒或慢病毒载体或通过转座子引入细胞中(参见例如，Baum等人(2006)Molecular Therapy:The Journal ofthe American Society of Gene Therapy.13:1050-1063；Frecha等人(2010)MolecularTherapy18:1748-1757；和Hackett等人(2010)Molecular Therapy 18:674-683)。
在一些实施方案中，载体包括病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒载体或转座子，例如睡美人转座子系统；源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体；慢病毒载体或逆转录病毒载体，如γ-逆转录病毒载体，源自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，使用电穿孔将一种或多种多核苷酸引入T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；以及Van Tedeloo等人(2000)GeneTherapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec TherNucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质(例如，多核苷酸和/或载体)的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))和例如国际专利申请公开号WO 2014055668和美国专利号7,446,190中所述的其他方法。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后将编码重组受体和/或一种或多种另外的多肽的一种或多种多核苷酸或载体引入细胞(例如，T细胞)中。例如，一种或多种多核苷酸或一种或多种载体的该引入可以用任何合适的逆转录病毒载体来进行。然后可以使所得基因工程化细胞摆脱初始刺激物(例如，抗CD3/抗CD28刺激物)，随后在第二种类型的刺激物(例如，通过从头引入的重组受体)的存在下进行刺激。该第二种类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然抗原和/或配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell basedtherapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66；或Barrett等人,Chimeric AntigenReceptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情况下，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的至少一部分的同时或期间将细胞工程化。
a.病毒载体颗粒
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如像，源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将一种或多种多核苷酸引入细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将一种或多种多核苷酸引入T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550-557。
在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的几个物种的宿主细胞。在一个实施方案中，要表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多例示性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(如抗原受体，如CAR)的异源核酸被包含在和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道(University Blvd.)10801号20110-2209))获得，或者使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因生成慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998，美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道(University Blvd.)10801号20110-2209))获得，或者使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(如慢病毒)的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。典型地，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，病毒载体(如HIV病毒载体)的核酸缺乏另外的转录单元。载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol 72：9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的U3区中的缺失可以用于生成自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将此缺失转移到原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有自3'长末端重复序列(LTR)的增强子和启动子序列缺失，所述缺失在载体整合期间被拷贝到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在经转导细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录之后生成的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。可以通过本领域已知的任何方法来构建自失活3'LTR。在一些实施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以在病毒构建体中用启动子序列(如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系中回收的病毒的滴度。还可以包括增强子序列。可以使用增加病毒RNA基因组在包装细胞系中的表达的任何增强子/启动子组合。在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合型载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身以通过例如使一个或两个附接位点突变或缺失来防止整合，或者通过缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤束(PPT)没有功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传途径；这些途径包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些方法并不相互排斥；也就是说，可以一次使用多于一种所述方法。例如，整合酶和附接位点两者可以都没有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附接位点和PPT位点可以没有功能，或者它们全部都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参见Philpott和Thrasher,Human GeneTherapy 18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人J Virol 73:9011(1999)；WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin JVirol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，载体含有用于在宿主细胞(如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有用于在原核细胞(如细菌细胞)中繁殖的一个或多个复制起点。在一些实施方案中，包括原核复制起点的载体还可以含有这样的基因，其表达赋予可检测或可选择标记，如抗药性。
病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因递送系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及生成病毒载体颗粒所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分之一或两者时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef和/或Tat(HIV的主要反式激活因子))。在一些实施方案中，慢病毒载体(如基于HIV的慢病毒载体)仅包含三种亲本病毒的基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了一种或多种目的序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并且在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用含有生成颗粒所必需的组分的一种或多种质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目标序列，即编码抗原受体(如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离生成逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能生成有复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性、多嗜性或双嗜性包膜，如辛德比斯病毒包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体颗粒中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是众所周知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许待包装至病毒颗粒中的重组质粒的RNA转录，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行逐步调整。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许生成慢病毒颗粒，而在包装细胞系(如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有可以回收并逐步调整的重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，如CAR)的表达。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及通过使包含多个细胞的细胞组合物与病毒颗粒接触(例如孵育)来转导细胞的方法。在一些实施方案中，待转染或转导的细胞是或包含从受试者获得的原代细胞，例如从受试者富集和/或选择的细胞。
在一些实施方案中，组合物中待转导的细胞的浓度为从1.0x105个细胞/mL至1.0x108个细胞/mL或从约1.0x105个细胞/mL至约1.0x108个细胞/mL，如止水或约至少或约1.0x105个细胞/mL、5x105个细胞/mL、1x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、1x107个细胞/mL、5x107个细胞/mL或1x108个细胞/mL。
在一些实施方案中，病毒颗粒是以病毒载体颗粒拷贝或其感染单位(IU)与待转导的细胞总数的某一比率(IU/细胞)来提供。例如，在一些实施方案中，病毒颗粒在接触期间是以为或约或至少为或至少约每个细胞0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60IU的病毒载体颗粒存在。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度在或在约1x106IU/mL与1x108IU/mL之间，如在或在约5x106IU/mL与5x107IU/mL之间，如至少6x106IU/mL、7x106IU/mL、8x106IU/mL、9x106IU/mL、1x107IU/mL、2x107IU/mL、3x107IU/mL、4x107IU/mL或5x107IU/mL。
在一些实施方案中，可以按小于100(如通常小于60、50、40、30、20、10、5或更小)的感染复数(MOI)来实现转导。
在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒颗粒接触或孵育。在一些实施方案中，接触进行30分钟至72小时，如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，例如至少或约至少或约30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时或更长时间。
在一些实施方案中，接触是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒颗粒以如下体积接触：从0.5mL至500mL或从约0.5mL至约500mL，如从或从约0.5mL至200mL、0.5mL至100mL、0.5mL至50mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、5mL至500mL、5mL至200mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL。
在某些实施方案中，用包含结合分子的颗粒对输入细胞进行处理、孵育或接触，所述结合分子结合至或识别由病毒DNA编码的重组受体。
在一些实施方案中，将细胞与病毒载体颗粒一起孵育导致或产生包含用病毒载体颗粒转导的细胞的输出组合物。
b.非病毒载体
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
在一些实施方案中，将重组核酸通过转座子转移到T细胞中。转座子(转座元件)是可以从基因组内的一个基因座移动到另一个基因座的DNA可移动区段。这些元件通过保守的“剪切粘贴”机制移动：转座酶催化转座子从其原始位置切除，并促进其在基因组中的其他位置的重新整合。如果转座酶是由另一个转座酶基因提供，则可以动员缺乏转座酶的元件。因此，可以将转座子用于将外来DNA掺入宿主基因组中而无需使用病毒转导系统。适合于与哺乳动物细胞(例如人原代白细胞)一起使用的转座子的例子包括但不限于睡美人(Sleeping Beauty)和PiggyBacs。
基于转座子的转染是由转座酶和转座子组成的两组分系统。在一些实施方案中，系统包含转座子，所述转座子被工程化以包含外来DNA(本文也称为货物DNA)(例如编码重组受体的基因)，其侧翼为由伴随的转座酶识别的反向重复/同向重复(IR/DR)序列。在一些实施方案中，非病毒质粒编码在启动子的控制下的转座酶。将质粒转染到宿主细胞中导致转座酶的瞬时表达，由此在转染后的最初时期中，转座酶以足够水平表达以将转座子整合到基因组DNA中。在一些实施方案中，转座酶本身不整合到基因组DNA中，并且因此转座酶的表达随时间推移降低。在一些实施方案中，转座酶表达由宿主细胞以足以使相应转座子整合持续以下时间的水平表达：少于约4小时、少于约8小时、少于约12小时、少于约24小时、少于约2天、少于约3天、少于约4天、少于约5天、少于约6天、少于约7天、少于约2周、少于约3周、少于约4周、少于约周、或少于约8周。在一些实施方案中，引入宿主基因组中的货物DNA随后不会从宿主基因组中被去除，至少是因为宿主不表达能够切除货物DNA的内源转座酶。
睡美人(SB)是转座子的Tc/1-水手超家族的合成成员，是由鲑科鱼基因组中具有的休眠元件重新构建的。基于SB转座子的转染是一个由转座酶和转座子组成的两组分系统，所述转座子含有导致精确整合到TA二核苷酸中的反向重复/同向重复(IR/DR)序列。将转座子设计成具有侧翼为IR/DR的目的表达盒。SB转座酶结合位于睡美人转座子IR上的特异性结合位点。SB转座酶介导转座子的整合，所述转座子是编码货物序列的可移动元件，在所述货物序列的两侧都侧接具有催化性酶(SB)结合位点的反向末端重复序列。当SB通过剪切粘贴机制将基因序列在TA靶二核苷酸处插入脊椎动物染色体中时，获得稳定的表达。已将此系统用于工程化各种脊椎动物细胞类型，包括人原代外周血白细胞。在一些实施方案中，将细胞与SB转座子接触、与SB转座子一起孵育和/或用SB转座子处理，所述SB转座子包含货物基因(例如编码重组受体或CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为SB IR序列。在特定实施方案中，将待转染的细胞与包含SB转座子的质粒接触、与包含SB转座子的质粒一起孵育、和/或用包含SB转座子的质粒处理，所述SB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为SB IR序列。在某些实施方案中，质粒还包含编码侧翼没有SB IR序列的SB转座酶的基因。
PiggyBac(PB)是可以用于将货物DNA整合到宿主(例如人)的基因组DNA中的另一种转座子系统。PB转座酶识别位于转座子两个末端的PB转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且高效地将内容物从原始位点移出并将所述内容物高效地整合到TTAA染色体位点中。PB转座子系统使得能够将PB载体中两个ITR之间的目的基因动员到靶基因组中。已将PB系统用于工程化各种脊椎动物细胞类型，包括人原代细胞。在一些实施方案中，将待转染的细胞与PB转座子接触、与PB转座子一起孵育、和/或用PB转座子处理，所述PB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为PB IR序列。在特定实施方案中，将待转染的细胞与包含PB转座子的质粒接触、与包含PB转座子的质粒一起孵育、和/或用包含PB转座子的质粒处理，所述PB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为PB IR序列。在某些实施方案中，质粒还包含编码侧翼没有PB IR序列的SB转座酶的基因。
在一些实施方案中，可以通过限制酶切割、连接和分子克隆的标准方法来产生用于主题方法中的转座子/转座酶的各种元件，例如一种或多种SB或PB载体。用于构建主题载体的一种方案包括以下步骤。首先，用限制性核酸内切酶从初始来源(例如包含转座酶基因的载体)切割经纯化的核酸片段，所述核酸片段含有所需组分核苷酸序列以及外来序列。然后使用常规分离方法(例如通过琼脂糖凝胶电泳)将含有所需核苷酸序列的片段与不同大小的不需要片段分离。将所需片段从凝胶上切下，并以适当的配置连接在一起，从而产生含有所需序列(例如如上所述的与主题载体的各种元件对应的序列)的环状核酸或质粒。然后，在需要的情况下，在原核宿主(例如大肠杆菌)中扩增如此构建的环状分子。这些步骤中涉及的切割、质粒构建、细胞转化和质粒产生的程序对本领域技术人员而言是熟知的，并且限制性酶切和连接所需的酶可商购获得。(参见例如，R.Wu编辑,Methods in Enzymology,第68卷,Academic Press,N.Y.(1979)；T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1982)；目录号1982-83,New England Biolabs,Inc.；目录号1982-83,Bethesda Research Laboratories,Inc。如何构建主题方法中采用的载体的例子提供于下文的实验章节中。在WO 98/40510和WO 99/25817中也披露了代表性睡美人转座子系统的制备)。
在一些实施方案中，用包含转座酶基因的质粒和包含转座子的质粒进行用转座子的转导，所述转座子含有侧翼为由转座酶识别的反向重复/同向重复(IR/DR)序列的货物DNA序列。在某些实施方案中，货物DNA序列编码异源蛋白，例如重组T细胞受体或CAR。在一些实施方案中，质粒包含转座酶和转座子。在一些实施方案中，转座酶在遍在启动子或适合于驱动转座酶在靶细胞中表达的任何启动子的控制下。遍在启动子包括但不限于EF1a、CMB、SV40、PGK1、Ubc、人β-肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、CaMKIIa和U6。在一些实施方案中，货物DNA包含选择盒，所述选择盒允许选择将货物DNA稳定整合到基因组DNA中的细胞。合适的选择盒包括但不限于编码以下的选择盒：卡那霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、红霉素抗性基因和多粘菌素B抗性基因。
在一些实施方案中，将用于用转座子转导的组分(例如包含SB转座酶和SB转座子的质粒)引入靶细胞中。可以采用任何方便的方案，其中取决于靶细胞的位置，所述方案可以将系统组分体外或体内引入靶细胞中。例如，在靶细胞是分离的细胞的情况下，可以例如通过使用标准转化技术，在容许靶细胞活力的细胞培养条件下将系统直接引入细胞中。此类技术包括但不必限于：病毒感染、转化、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、病毒载体递送等。方法的选择通常取决于待转化的细胞的类型和发生转化的环境(即体外、离体或体内)。这些方法的一般性讨论可以在Ausubel等人,ShortProtocols in Molecular Biology,第3版,Wiley&Sons,1995中找到。
在一些实施方案中，在足以从携带转座子的载体上切下反向重复侧翼核酸并且随后将切下的核酸整合到靶细胞的基因组中的条件下，将SB转座子和SB转座酶来源引入多细胞生物体(例如哺乳动物或人)的靶细胞中。一些实施方案还包括确保必需的转座酶活性连同引入的转座子一起存在于靶细胞中的步骤。取决于转座子载体本身的结构，即载体是否包括编码具有转座酶活性的产物的区域，所述方法还可以包括将编码必需转座酶活性的第二载体引入靶细胞中。
在一些实施方案中，引入细胞中的包含转座子的载体核酸的量和编码转座酶的载体核酸的量足以提供所需的将转座子核酸切下并插入靶细胞基因组中。这样，引入的载体核酸的量应提供足够量的转座酶活性和足够拷贝数的期望插入靶细胞中的核酸。引入靶细胞中的载体核酸的量取决于所采用的特定引入方案(例如所采用的特定离体施用方案)的效率而变化。
一旦载体DNA与必需的转座酶组合进入了靶细胞，就通过所提供的转座酶从载体上切下侧翼为反向重复序列的载体核酸区域(即位于睡美人转座酶识别的反向重复序列之间的载体核酸)并将其插入靶细胞的基因组中。这样，在将载体DNA引入靶细胞中之后，随后进行转座酶介导的对载体携带的外源核酸的切除并将其插入靶细胞的基因组中。在特定实施方案中，将载体整合到至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、或至少20％的用SB转座子和/或SB转座酶转染的细胞的基因组中。在一些实施方案中，核酸整合到靶细胞基因组中是稳定的，即，载体核酸保持存在于靶细胞基因组中持续超过瞬时时间段，并且一部分染色体遗传物质传递到靶细胞的后代。
在某些实施方案中，转座子用于将各种大小的核酸(即多核苷酸)整合到靶细胞基因组中。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约0.1kb至200kb、从约0.5kb至100kb、从约1.0kb至约8.0kb、从约1.0至约200kb、从约1.0至约10kb、从约10kb至约50kb、从约50kb至约100kb、或从约100kb至约200kb。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约8.0kb。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约200kb。在特定实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约8.0kb。
D.细胞的培育和/或扩增
在一些实施方案中，所提供的方法包括用于培育细胞(例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞)的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在基因工程化的步骤(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)之后，在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后培育细胞。在一些实施方案中，培育产生富集T细胞的一种或多种培育组合物。
在某些实施方案中，在配制细胞之前，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育经富集T细胞(包括经刺激和经转导T细胞)的一种或多种组合物(如此类CD4+和CD8+T细胞的单独组合物)。在一些方面，培育方法(如用于促进增殖和/或扩增)包括本文如在第I-F节中提供的方法。在特定实施方案中，在已对一种或多种经富集T细胞的组合物进行工程化(例如转导或转染)之后，培育一种或多种组合物。在特定实施方案中，一种或多种组合物是工程化组合物。在特定实施方案中，一种或多种工程化组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在培育之前解冻。
在某些实施方案中，工程化T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物。在特定实施方案中，将引入有重组受体(例如CAR)的经富集T细胞的两种单独组合物在促进细胞的增殖和/或扩增的条件下分别培育，所述单独组合物是例如从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物。在一些实施方案中，条件是刺激条件。在某些实施方案中，两种单独组合物包括经富集CD4+T细胞(如引入有编码重组受体的核酸和/或表达重组受体的工程化CD4+T细胞)的组合物。在特定实施方案中，两种单独组合物包括经富集CD8+T细胞(如引入有编码重组受体的核酸和/或表达重组受体的工程化CD8+T细胞)的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞(如工程化CD4+T细胞和工程化CD8+T细胞)的两种单独组合物例如在促进增殖和/或扩增的条件下分别培育。在一些实施方案中，培育经富集T细胞的单一组合物。在某些实施方案中，单一组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，单一组合物是在培育之前已从单独组合物合并的经富集CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育的经富集CD4+T细胞(如工程化CD4+T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在一些实施方案中，组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用编码重组受体的重组多核苷酸转导或转染的CD4+T细胞。在某些实施方案中，培育的经富集CD4+T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育的经富集CD8+T细胞(如工程化CD8+t细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在特定实施方案中，组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用编码重组受体的重组多核苷酸转导或转染的CD8+T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+T细胞的单独组合物(如工程化CD4+和工程化CD8+T细胞的单独组合物)合并为单一组合物并且例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成培育之后将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独培育的组合物合并为单一组合物。在特定实施方案中，将经富集CD4+和CD8+T细胞的单独组合物(如工程化CD4+和工程化CD8+T细胞的单独组合物)例如在促进增殖和/或扩增的条件下分别培育。
在一些实施方案中，在为、为约、或为至少100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1,000mL、1,200mL、1,400mL、1,600mL、1,800mL、2,000mL、2,200mL、或2,400mL的体积的培养基中培育细胞(例如工程化细胞)。在一些实施方案中，以初始体积培育细胞，初始体积稍后被调节至不同的体积。在特定实施方案中，体积稍后在培育期间被调节。在特定实施方案中，体积从培育期间的初始体积增加。在某些实施方案中，当细胞在培育期间实现密度时，将体积进行增加。在某些实施方案中，初始体积为或为约500mL。
在特定实施方案中，当细胞在培育期间实现密度或浓度时，体积从初始体积增加。在特定实施方案中，当细胞实现如下密度和/或浓度时，将体积进行增加：为、为约、或为至少0.1x106个细胞/ml、0.2x106个细胞/ml、0.4x106个细胞/ml、0.6x106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.4x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml、或10x106个细胞/ml。在一些实施方案中，当细胞实现为、至少或约0.6x106个细胞/ml的密度和/或浓度时，体积从初始体积增加。在一些实施方案中，密度和/或浓度是培养物中活细胞的。在特定实施方案中，当细胞实现如下密度和/或浓度时，将体积进行增加：为、为约、或为至少0.1x106个活细胞/ml、0.2x106个活细胞/ml、0.4x106个活细胞/ml、0.6x106个活细胞/ml、0.8x106个活细胞/ml、1x106个活细胞/ml、1.2x106个活细胞/ml、1.4x106个活细胞/ml、1.6x106个活细胞/ml、1.8x106个活细胞/ml、2.0x106个活细胞/ml、2.5x106个活细胞/ml、3.0x106个活细胞/ml、3.5x106个活细胞/ml、4.0x106个活细胞/ml、4.5x106个活细胞/ml、5.0x106个活细胞/ml、6x106个活细胞/ml、8x106个活细胞/ml、或10x106个活细胞/ml。在一些实施方案中，当活细胞实现为、为至少或为约0.6x106个活细胞/ml的密度和/或浓度时，从初始体积增加体积。在一些实施方案中，可以在培育期间确定或监测细胞或活细胞的密度和/或浓度，如通过使用如所述的方法，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，细胞实现一定密度和/或浓度，并且体积增加、增加约或增加至少100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1,000mL、1,200mL、1,400mL、1,600mL、1,800mL、2,000mL、2,200mL或2,400mL。在一些实施方案中，体积增加500mL。在特定实施方案中，体积增加到如下体积：为、为约或至少500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1,000mL、1,200mL、1,400mL、1,600mL、1,800mL、2,000mL、2,200mL或2,400mL。在某些实施方案中，体积增加到1,000mL的体积。在某些实施方案中，体积以如下速率增加：为、为至少或为约每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟5mL、10mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、75mL、80mL、90mL或100mL。在某些实施方案中，速率为或为约每8分钟50mL。
在一些实施方案中，在促进增殖和/或扩增的条件下培育经富集T细胞(如工程化T细胞)的组合物。在一些实施方案中，此类条件可以经设计以诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活。在特定实施方案中，刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计为促进细胞的生长、分裂和/或扩增的药剂))。
在一些实施方案中，培育是在如下条件下进行，所述条件通常包括适合于原代免疫细胞(如人T淋巴细胞)生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或约37摄氏度。在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物在25℃至38℃，如30℃至37℃，例如为或约37℃±2℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所需或阈值密度、浓度、数量或剂量的细胞。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所需或阈值密度、浓度、数量或剂量的活细胞。在一些实施方案中，孵育是大于或大于约或持续约或24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。在一些实施方案中，可以在培育期间确定或监测细胞的密度、浓度和/或数量或剂量，如通过使用如所述的方法，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，在培育之前将所述刺激试剂从所述细胞去除和/或分离。在某些实施方案中，在工程化之后并且在例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞之前将所述刺激剂从所述细胞去除和/或分离。在一些实施方案中，所述刺激试剂是本文例如在第I-B-1节中所述的刺激试剂。在特定实施方案中，如本文(例如在第I-B-2节中)所述，从细胞去除和/或分离刺激试剂。
在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子的存在下培育经富集T细胞(如工程化T细胞)的组合物(例如工程化CD4+T细胞和工程化CD8+T细胞的单独组合物)。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。
在特定实施方案中，将经富集CD4+T细胞(如工程化CD4+T细胞)的组合物用重组IL-2培育。在一些实施方案中，在重组IL-2的存在下培育经富集CD4+T细胞(如工程化CD4+T细胞)的组合物增加了所述组合物的CD4+T细胞在培育步骤期间和整个所述过程中将继续存活、生长、扩增和/或激活的概率或可能性。在一些实施方案中，与未在重组IL-2存在下培育经富集CD4+T细胞的组合物的替代性和/或示例性方法相比，在重组IL-2存在下培育经富集CD4+T细胞(如工程化CD4+T细胞)的组合物使得将从经富集CD4+T细胞的组合物产生经富集CD4+T细胞(例如适合于细胞疗法的工程化CD4+T细胞)的输出组合物的概率和/或可能性增加至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％或至少200％ CD4+。
在一些实施方案中，用细胞因子，例如重组人细胞因子培育细胞(如工程化CD4+T细胞和工程化CD8+T细胞的单独组合物)，所述细胞因子的浓度在1IU/ml与2,000IU/ml之间、在10IU/ml与100IU/ml之间、在50IU/ml与500IU/ml之间、在100IU/ml与200IU/ml之间、在500IU/ml与1400IU/ml之间、在250IU/ml与500IU/ml之间或在500IU/ml与2,500IU/ml之间。
在一些实施方案中，用重组IL-2，例如人重组IL-2培育经富集T细胞的组合物(如工程化CD4+T细胞和工程化CD8+T细胞的单独组合物)，所述重组IL-2的浓度在2IU/ml与500IU/ml之间、在10IU/ml与250IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml或在100IU/ml与400IU/ml之间。在特定实施方案中，用IL-2培育经富集T细胞的组合物，所述IL-2的浓度为或为约50IU/ml、75IU/ml、100IU/ml、125IU/ml、150IU/ml、175IU/ml、200IU/ml、225IU/ml、250IU/ml、300IU/ml或400IU/ml。在一些实施方案中，用浓度为200IU/ml的重组IL-2培育经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD4+T细胞的组合物，如工程化CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD8+T细胞的组合物，如工程化CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，用IL-7，例如人重组IL-7培育经富集T细胞的组合物(如工程化CD4+T细胞和CD8+T细胞的单独组合物)，所述IL-7的浓度在10IU/ml与5,000IU/ml之间、在500IU/ml与2,000IU/ml之间、在600IU/ml与1,500IU/ml之间、在500IU/ml与2,500IU/ml之间、在750IU/ml与1,500IU/ml之间或在1,000IU/ml与2,000IU/ml之间。在特定实施方案中，用IL-7培育经富集T细胞的组合物，所述IL-7的浓度为或为约100IU/ml、200IU/ml、300IU/ml、400IU/ml、500IU/ml、600IU/ml、700IU/ml、800IU/ml、900IU/ml、1,000IU/ml、1,200IU/ml、1,400IU/ml或1,600IU/ml。在一些实施方案中，在浓度为或约1,200IU/ml的重组IL-7的存在下培育细胞。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD4+T细胞(如工程化CD4+T细胞)的组合物。
在一些实施方案中，用IL-15，例如人重组IL-15培育经富集T细胞的组合物(如工程化CD4+T细胞和CD8+T细胞的单独组合物)，所述IL-15的浓度在0.1IU/ml与200IU/ml之间、在1IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与25IU/ml之间、在25IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与15IU/ml之间、或在10IU/ml与100IU/ml之间。在特定实施方案中，用IL-15培育所述经富集T细胞的组合物，所述IL-15的浓度为或为约1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、11IU/ml、12IU/ml、13IU/ml、14IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、40IU/ml、50IU/ml、100IU/ml或200IU/ml。在特定实施方案中，用浓度为20IU/ml的重组IL-15培育经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，经富集T细胞的组合物是经富集CD4+T细胞(如工程化CD4+T细胞)的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+T细胞(如工程化CD8+T细胞)的组合物。
在特定实施方案中，在IL-2和/或IL-15(如以如所述量)的存在下培育经富集CD8+T细胞(如工程化CD8+T细胞)的组合物。在某些实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15(如以如所述量)的存在下培育经富集CD4+T细胞(如工程化CD4+T细胞)的组合物。在一些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。
在特定实施方案中，在封闭系统中进行培育。在某些实施方案中，在无菌条件下在封闭系统中进行培育。在特定实施方案中，在与所提供系统的一个或多个步骤相同的封闭系统中进行培育。在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物从封闭系统中去除并且置于用于培育的生物反应器中和/或与其连接。合适的用于培育的生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM 20|50、Finesse SmartRocker生物反应器系统和Pall XRS生物反应器系统。在一些实施方案中，在培育步骤的至少一部分期间，使用生物反应器灌注和/或混合细胞。
在一些实施方案中，在密闭的、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育的细胞在培育期间比没有生物反应器的情况下培育的细胞(例如在静态条件下(例如在没有混合、摇摆、运动和/或灌注的情况下)培育的细胞)经历更快的扩增。在一些实施方案中，在封闭的、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育的细胞在14天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时内达到或实现阈值扩增、细胞计数和/或密度。在一些实施方案中，与未在封闭的、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育细胞的示例性和/或替代性过程中培育的细胞相比，在封闭的、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育的细胞达到或实现至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍的阈值扩增、细胞计数和/或密度。
在一些实施方案中，混合是或包括摇摆和/或运动。在一些情况下，生物反应器可以经受运动或摇摆，其在一些方面可以增加氧气传递。使生物反应器运动可以包括但不限于沿着水平轴线旋转、沿着竖直轴线旋转、沿着生物反应器的倾斜(tilted或inclined)的水平轴线的摇摆运动、或其任何组合。在一些实施方案中，在摇摆的情况下进行孵育的至少一部分。可以调节摇摆速度和摇摆角度以实现所希望的搅动。在一些实施方案中，摇摆角度为20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在某些实施方案中，摇摆角度在6°-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在7°-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在8°-12°之间。在一些实施方案中，摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，摇摆速率在4rpm与12rpm之间，例如在4rpm与6rpm之间并包含端值。
在一些实施方案中，使生物反应器保持等于或接近37℃的温度和等于或接近5％的CO2水平，且具有如下稳定空气流量：为、为约或至少0.01L/min、0.05L/min、0.1L/min、0.2L/min、0.3L/min、0.4L/min、0.5L/min、1.0L/min、1.5L/min或2.0L/min或大于2.0L/min。在某些实施方案中，在灌注的情况下，如以290ml/天、580ml/天和/或1160ml/天的速率(例如，这取决于与培育起始相关的时间安排和/或经培育细胞的密度)进行培育的至少一部分。在一些实施方案中，在摇摆运动(如以在5°与10°之间(如6°)的角度，以恒定摇摆速度(如在5与15RPM之间(如6RPM或10RPM)的速度))的情况下进行细胞培养物扩增的至少一部分。
在一些实施方案中，在恒定灌注(例如，慢稳定速率的灌注)下进行培育步骤的所述至少一部分。在一些实施方案中，灌注是或包括液体(例如，用过的培养基)的流出和新鲜培养基的流入。在某些实施方案中，灌注用新鲜培养基更换用过的培养基。在一些实施方案中，培育的至少一部分在灌注下进行，所述灌注具有如下稳定速率：为或约或至少100ml/天、200ml/天、250ml/天、275ml/天、290ml/天、300ml/天、350ml/天、400ml/天、450ml/天、500ml/天、550ml/天、575ml/天、580ml/天、600ml/天、650ml/天、700ml/天、750ml/天、800ml/天、850ml/天、900ml/天、950ml/天、1000ml/天、1100ml/天、1160ml/天、1200ml/天、1400ml/天、1600ml/天、1800ml/天、2000ml/天、2200ml/天或2400ml/天。
在特定实施方案中，在没有灌注的条件下开始培育，并且在设定和/或预定的时间量(如在培育开始或起始后为或约或至少12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、或72小时或超过72小时)之后开始灌注。在特定实施方案中，当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时开始灌注。在一些实施方案中，当经培育细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x106个细胞/ml、0.2x106个细胞/ml、0.4x106个细胞/ml、0.6x106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.4x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml或10x106个细胞/ml。在特定实施方案中，当活细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时开始灌注。在一些实施方案中，当经培育活细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x106个活细胞/ml、0.2x106个活细胞/ml、0.4x106个活细胞/ml、0.6x106个活细胞/ml、0.8x106个活细胞/ml、1x106个活细胞/ml、1.2x106个活细胞/ml、1.4x106个活细胞/ml、1.6x106个活细胞/ml、1.8x106个活细胞/ml、2.0x106个活细胞/ml、2.5x106个活细胞/ml、3.0x106个活细胞/ml、3.5x106个活细胞/ml、4.0x106个活细胞/ml、4.5x106个活细胞/ml、5.0x106个活细胞/ml、6x106个活细胞/ml、8x106个活细胞/ml或10x106个活细胞/ml。
在特定实施方案中，在培育期间以不同的速度进行灌注。例如，在一些实施方案中，灌注的速率取决于经培育细胞的密度和/或浓度。在某些实施方案中，当细胞达到设定或预定的密度或浓度时，增加灌注的速率。在培育期间灌注速率可以改变，例如从一种稳定灌注速率变为增加的稳定灌注速率，改变一次、两次、三次、四次、五次、超过五次、超过十次、超过15次、超过20次、超过25次、超过50次或超过100次。在一些实施方案中，当细胞达到如下设定或预定的细胞密度或浓度时增加稳定灌注速率：为、为约或至少0.6x106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.4x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml或10x106个细胞/ml。在一些实施方案中，当细胞达到如下设定或预定的活细胞密度或浓度时增加稳定灌注速率：为、为约或至少0.6x106个活细胞/ml、0.8x106个活细胞/ml、1x106个活细胞/ml、1.2x106个活细胞/ml、1.4x106个活细胞/ml、1.6x106个活细胞/ml、1.8x106个活细胞/ml、2.0x106个活细胞/ml、2.5x106个活细胞/ml、3.0x106个活细胞/ml、3.5x106个活细胞/ml、4.0x106个活细胞/ml、4.5x106个活细胞/ml、5.0x106个活细胞/ml、6x106个活细胞/ml、8x106个活细胞/ml或10x106个活细胞/ml。在一些实施方案中，可以确定或监测在培育期间(如在灌注下)细胞或活细胞的密度和/或浓度，如通过使用如所述的方法，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，在没有灌注的条件下开始培育，并且当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时开始灌注。在一些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时，以如下速率开始灌注：为、为约或至少100ml/天、200ml/天、250ml/天、275ml/天、290ml/天、300ml/天、350ml/天、400ml/天、450ml/天、500ml/天、550ml/天、575ml/天、580ml/天、600ml/天、650ml/天、700ml/天、750ml/天、800ml/天、850ml/天、900ml/天、950ml/天、1000ml/天、1100ml/天、1160ml/天、1200ml/天、1400ml/天、1600ml/天、1800ml/天、2000ml/天、2200ml/天或2400ml/天。在一些实施方案中，当经培育细胞或经培育活细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x106个细胞/ml、0.2x106个细胞/ml、0.4x106个细胞/ml、0.6x106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.4x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml或10x106个细胞/ml。
在某些实施方案中，培育的至少一部分在某一速率的灌注下进行，并且当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时，将灌注速率增加到如下速率：为、为约或至少100ml/天、200ml/天、250ml/天、275ml/天、290ml/天、300ml/天、350ml/天、400ml/天、450ml/天、500ml/天、550ml/天、575ml/天、580ml/天、600ml/天、650ml/天、700ml/天、750ml/天、800ml/天、850ml/天、900ml/天、950ml/天、1000ml/天、1100ml/天、1160ml/天、1200ml/天、1400ml/天、1600ml/天、1800ml/天、2000ml/天、2200ml/天或2400ml/天。在一些实施方案中，当经培育细胞或经培育活细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x106个细胞/ml、0.2x106个细胞/ml、0.4x106个细胞/ml、0.6x106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.4x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml或10x106个细胞/ml。在一些实施方案中，当以如下体积培育细胞时进行灌注：为、为约或至少300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。在一些实施方案中，体积是1000mL。
在某些实施方案中，在没有灌注或以某一速率灌注的条件下开始培育，并且当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少0.61x106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少290ml/天。在某些实施方案中，当以为、为约或至少1000mL的体积培育细胞时，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少0.61x106个细胞/ml的浓度时，以为、为约或至少290ml/天的速率灌注细胞。在一些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少0.81x106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少580ml/天。在某些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少1.01x106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少1160ml/天。在一些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少1.2x106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少1160ml/天。
在所提供的实施方案的方面，通过在培育期间评估细胞的密度和/或浓度或评估活细胞的密度和/或浓度来确定灌注速率，包括如本文及上文所述的开始或增加灌注时的时间安排。在一些实施方案中，可以使用如所述的方法确定细胞的密度和/或浓度，所述方法包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，在表面活性剂的存在下培育经富集细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物。在特定实施方案中，培育组合物的细胞减少了在培育期间例如由于混合、摇摆、运动和/或灌注而可能发生的剪切应力的量。在特定实施方案中，用表面活性剂培育经富集T细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物，并且在完成培育后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的T细胞存活，例如是有活力的并且/或者未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在特定实施方案中，在表面活性剂的存在下培育经富集T细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物，并且少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的细胞未经历如由于剪切或剪切诱导的应力而引起的细胞死亡，例如程序性细胞死亡、细胞凋亡和/或坏死。
在特定实施方案中，在如下量的表面活性剂的存在下培育经富集T细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物：在0.1μl/ml与10.0μl/ml之间、在0.2μl/ml与2.5μl/ml之间、在0.5μl/ml与5μl/ml之间、在1μl/ml与3μl/ml或在2μl/ml与4μl/ml之间。在一些实施方案中，在如下量的表面活性剂的存在下培育经富集T细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物：为、为约或至少0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2μl/ml、2.5μl/ml、5μl/ml、10μl/ml、25μl/ml或50μl/ml。在某些实施方案中，在为或约2μl/ml的表面活性剂的存在下培育经富集T细胞的组合物。
在一些实施方案中，表面活性剂是或包括降低液体和/或固体的表面张力的药剂。例如，表面活性剂包括脂肪醇(例如，甾醇)、聚氧乙二醇辛基酚醚(例如Triton X-100)或聚氧乙二醇失水山梨糖醇烷基酯(例如聚山梨醇酯20、40、60)。在某些实施方案中，表面活性剂选自聚山梨醇酯80(PS80)、聚山梨醇酯20(PS20)、泊洛沙姆188(P188)。在示例性实施方案中，化学确定的进料培养基中的表面活性剂的浓度为约0.0025％至约0.25％(v/v)的PS80；约0.0025％至约0.25％(v/v)的PS20；或约0.1％至约5.0％(w/v)的P188。
在一些实施方案中，表面活性剂是或包括添加到其中的阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、月桂酸钾、硬脂酸三乙醇胺、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸盐、海藻酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠、磷脂酰甘油、磷脂酰肌苷、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸及其盐、羧甲基纤维素钠、胆酸和其他胆汁酸(例如胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸)及其盐(例如脱氧胆酸钠)。
在一些实施方案中，合适的非离子表面活性剂包括：甘油酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨酯)、聚氧乙烯脂肪酸酯、脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、聚丙二醇、鲸蜡醇、鲸蜡基硬脂醇、硬脂醇、芳基烷基聚醚醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)、泊洛沙胺、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、非结晶纤维素、多糖(包括淀粉和淀粉衍生物，如羟乙基淀粉(HES))、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。在某些实施方案中，非离子表面活性剂是聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物，并且优选是丙二醇和乙二醇的嵌段共聚物。此类聚合物以商标名POLOXAMER出售，有时也被称为F68或P188。聚氧乙烯脂肪酸酯包括具有短烷基链的那些。这种表面活性剂的一个例子是HS15，即聚乙烯-660-羟基硬脂酸酯。
在一些实施方案中，合适的阳离子表面活性剂可以包括但不限于天然磷脂、合成磷脂、季铵化合物、苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、壳聚糖、月桂基二甲基苄基氯化铵、酰基肉碱盐酸、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、双十四酰基三甲基铵丙烷(DMTAP)、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)、1,2-二酰基甘油-3-(O-烷基)磷酸胆碱、O-烷基磷脂酰胆碱、烷基吡啶鎓卤化物或长链烷基胺(例如正辛胺和油酰胺)。
两性离子表面活性剂是电中性的，但在同一分子内具有局部正电荷和负电荷。合适的两性离子表面活性剂包括但不限于两性离子磷脂。合适的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二酰基-甘油-磷酸乙醇胺(如双十四酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DSPE)和二油酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DOPE))。在本发明中可以使用磷脂(包括阴离子磷脂和两性离子磷脂)的混合物。此类混合物包括但不限于溶血磷脂、卵磷脂或大豆磷脂或其任何组合。磷脂(无论是阴离子的磷脂、两性离子磷脂还是磷脂的混合物)可以被盐化或脱盐、氢化或部分氢化或者是天然半合成的或合成的。
在某些实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆，例如，泊洛沙姆188。在一些实施方案中，在如下量的泊洛沙姆的存在下培育经富集T细胞的组合物：在0.1μl/ml与10.0μl/ml之间、在0.2μl/ml与2.5μl/ml之间、在0.5μl/ml与5μl/ml之间、在1μl/ml与3μl/ml或在2μl/ml与4μl/ml之间。在一些实施方案中，在如下量的表面活性剂的存在下培育所述经富集T细胞的组合物：为、为约或至少0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2μl/ml、2.5μl/ml、5μl/ml、10μl/ml、25μl/ml或50μl/ml。在某些实施方案中，在为或约2μl/ml的泊洛沙姆的存在下培育所述经富集T细胞的组合物。
在特定实施方案中，当细胞实现阈值量、浓度和/或扩增时，如通过收获细胞结束培育。在特定实施方案中，当例如关于和/或相对于培育开始或起始时细胞密度的量，细胞实现或实现约或至少1.5倍扩增、2倍扩增、2.5倍扩增、3倍扩增、3.5倍扩增、4倍扩增、4.5倍扩增、5倍扩增、6倍扩增、7倍扩增、8倍扩增、9倍扩增、10倍扩增或大于10倍扩增时，培育结束。在一些实施方案中，阈值扩增为例如关于和/或相对于开始或起始培育时细胞的量或密度的4倍扩增。
在一些实施方案中，当细胞实现细胞的阈值总量，例如阈值细胞计数时，如通过收获细胞结束培育。在一些实施方案中，当细胞实现阈值总有核细胞(TNC)计数时，结束培育。在一些实施方案中，当细胞实现阈值活细胞量(例如阈值活细胞计数)时，培育结束。在一些实施方案中，阈值细胞计数为或为约或为至少50x106个细胞、100x106个细胞、200x106个细胞、300x106个细胞、400x106个细胞、600x106个细胞、800x106个细胞、1000x106个细胞、1200x106个细胞、1400x106个细胞、1600x106个细胞、1800x106个细胞、2000x106个细胞、2500x106个细胞、3000x106个细胞、4000x106个细胞、5000x106个细胞、10,000x106个细胞、12,000x106个细胞、15,000x106个细胞或20,000x106个细胞，或前述活细胞阈值中的任一项。在特定实施方案中，当细胞实现阈值细胞计数时，结束培育。在一些实施方案中，在实现阈值细胞计数后为、为约6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天或在6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天内，培育结束。在特定实施方案中，在实现阈值细胞计数后为或约1天时结束培育。在某些实施方案中，阈值密度为、为约或为至少0.1x106个细胞/ml、0.5x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.5x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml、或10x106个细胞/ml，或前述活细胞阈值中的任一项。在特定实施方案中，当细胞实现阈值密度时，培育结束。在一些实施方案中，在实现阈值密度后为或为或约6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天或在6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天内，培育结束。在特定实施方案中，在实现阈值密度后为或约1天，培育结束。
在一些实施方案中，将培育步骤进行对于细胞实现阈值量、密度和/或扩增所需的时间量。在一些实施方案中，将培育进行如下时间量：为或为约或少于6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、2天、3天4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周或4周。在特定实施方案中，对于从不同生物样品中分离、富集和/或选择的经富集T细胞的多种单独组合物的细胞实现阈值密度所需的平均时间量为、为约或少于6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、2天、3天4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周或4周。在某些实施方案中，对于从不同生物样品中分离、富集和/或选择的经富集T细胞的多种单独组合物的细胞实现阈值密度所需的平均时间量为、为约或少于6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、2天、3天4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周或4周。
在某些实施方案中，将培育步骤进行最少4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天或10天，和/或直到细胞实现如下阈值细胞计数(或数量)或阈值活细胞计数(或数量)后的12小时、24小时、36小时、1天、2天或3天：为或约1000x106个细胞、1200x106个细胞、1400x106个细胞、1600x106个细胞、1800x106个细胞、2000x106个细胞、2500x106个细胞、3000x106个细胞、4000x106个细胞或5000x106个细胞。在一些实施方案中，进行培育步骤直到细胞实现为或约1200x106个细胞的阈值细胞计数并且培养最少10天后1天，和/或直到细胞实现为或约5000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行培育步骤直到细胞实现为或约1200x106个细胞的阈值细胞计数并且培养最少9天后1天，和/或直到细胞实现为或约5000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行培育步骤直到细胞实现为或约1000x106个细胞的阈值细胞计数并且培养最少8天后1天，和/或直到细胞实现为或约4000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在某些实施方案中，培育是扩增步骤并且将其进行最少4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天或10天，和/或直到细胞实现如下阈值细胞计数(或数量)或阈值活细胞计数(或数量)后的12小时、24小时、36小时、1天、2天或3天：为或约1000x106个细胞、1200x106个细胞、1400x106个细胞、1600x106个细胞、1800x106个细胞、2000x106个细胞、2500x106个细胞、3000x106个细胞、4000x106个细胞或5000x106个细胞。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或约1200x106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少10天后1天，和/或直到细胞实现为或约5000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或约1200x106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少9天后1天，和/或直到细胞实现为或约5000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或约1000x106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少8天后1天，和/或直到细胞实现为或约4000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或约1400x106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少5天后1天，和/或直到细胞实现为或约4000x106个细胞的阈值细胞计数后1天。
在一些实施方案中，将培育进行至少最少时间量。在一些实施方案中，即使在最少时间量之前实现阈值，也将培育进行至少14天、至少12天、至少10天、至少7天、至少6天、至少5天、至少4天、至少3天、至少2天、至少36小时、至少24小时、至少12小时或至少6小时。在一些实施方案中，在一些情况下，增加进行培育的最少时间量可以在经培育细胞、经配制细胞和/或输出组合物的细胞中减少激活和/或降低一种或多种激活标记的水平。在一些实施方案中，最少培育时间从示例性过程的确定点(例如选择步骤；解冻步骤；和/或激活步骤)开始计数到收获细胞的那一天。
在所提供的实施方案的方面，在培育期间监测细胞或活细胞的密度和/或浓度或在培育期间进行，如直到实现如所述的阈值量、密度和/或扩增。在一些实施方案中，此类方法包括如所述的那些，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在某些实施方案中，培育的细胞是输出细胞。在一些实施方案中，已经进行培育的经富集T细胞(如工程化T细胞)的组合物是经富集T细胞的输出组合物。在特定实施方案中，已经进行培育的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞是输出CD4+和/或CD8+T细胞。在特定实施方案中，已经进行培育的经富集CD4+T细胞(如工程化CD4+T细胞)的组合物是经富集CD4+T细胞的输出组合物。在一些实施方案中，已经进行培育的经富集CD8+T细胞(如工程化CD8+T细胞)的组合物是经富集CD8+T细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞。在特定实施方案中，培育的至少一部分是在恒定的混合和/或灌注(如通过生物反应器控制的混合或灌注)的情况下进行。在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子的存在下并且用表面活性剂(例如泊洛沙姆，如泊洛沙姆188)培育细胞，以减少来自恒定混合和/或灌注的剪切和/或剪切应力。在一些实施方案中，在重组IL-2、IL-7、IL-15和泊洛沙姆的存在下培育经富集CD4+T细胞(如工程化CD4+T细胞)的组合物，其中所述培育的至少一部分是在恒定混合和/或灌注的情况下进行。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-15和泊洛沙姆的存在下培育经富集CD8+T细胞(如工程化CD8+T细胞)的组合物，其中所述培育的至少一部分是在恒定混合和/或灌注的情况下进行。在一些实施方案中，进行培育直到细胞达到例如与开始培育时相比至少4倍的阈值扩增。
1.在培育期间监测细胞
在一些实施方案中，在培育步骤期间监测细胞。可以进行监测，例如以确定(例如，测量、定量)细胞形态、细胞活力、细胞死亡和/或细胞浓度(例如，活细胞浓度)。在一些实施方案中，监测是手动进行，如由人类操作者进行。在一些实施方案中，监测通过自动化系统进行。自动化系统可能需要最少的人工输入或不需要人工输入来监测培育的细胞。在一些实施方案中，监测是手动和通过自动化系统进行的。
在某些实施方案中，通过无需人工输入的自动化系统来监测细胞。在一些实施方案中，自动化系统与生物反应器(例如本文所述的生物反应器)兼容，使得可以将经历培育的细胞从生物反应器中移取出、监测并随后返回至生物反应器。在一些实施方案中，监测和培育以闭环配置发生。在一些方面，在闭环配置中，自动化系统和生物反应器保持无菌。在实施方案中，自动化系统是无菌的。在一些实施方案中，自动化系统是在线系统。
在一些实施方案中，自动化系统包括使用光学技术(例如显微镜检查)检测细胞形态、细胞活力、细胞死亡和/或细胞浓度(例如活细胞浓度)。本文设想了适合于确定例如细胞特征、活力和浓度的任何光学技术。有用的光学技术的非限制性例子包括亮视野显微术、荧光显微术、微分干涉差(DIC)显微术、相差显微术、数字全息显微术(DHM)、差分数字全息显微术(DDHM)或其组合。差分数字全息显微术、DDHM和差分DHM可以在本文中互换使用。在某些实施方案中，自动化系统包括差分数字全息显微镜。在某些实施方案中，自动化系统包括差分数字全息显微镜，包括照明装置(例如，激光、led)。DDHM方法和使用的描述可以发现于例如以下文献中：US 7,362,449；EP 1,631,788；US 9,904,248；和US 9,684,281，所述申请通过引用以其整体并入本文。
DDHM允许对细胞进行无标记的无损成像，从而产生高对比度的全息图像。可以对图像进行对象分割和进一步分析，以获得定量地描述所成像的对象(例如，培育的细胞、细胞碎片)的多个形态特征。这样，可以使用例如图像采集、图像处理、图像分割和特征提取的步骤，直接从DDHM评估或计算各种特征(例如，细胞形态、细胞活力、细胞浓度)。在一些实施方案中，自动化系统包括数字记录装置以记录全息图像。在一些实施方案中，自动化系统包括计算机，所述计算机包括用于分析全息图像的算法。在一些实施方案中，自动化系统包括用于显示全息图像分析结果的监测器和/或计算机。在一些实施方案中，分析是自动化的(即，能够在没有用户输入的情况下进行)。用于在培育步骤期间监测细胞的合适的自动化系统的例子包括但不限于Ovizio iLine F(Ovizio Imaging Systems NV/SA，比利时布鲁塞尔)。
在某些实施方案中，在培育步骤期间连续进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤期间实时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤期间的离散时间点进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每15分钟进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每30分钟进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每45分钟进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每2小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每4小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每6小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每8小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每10小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每12小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每14小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每16小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每18小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每20小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每22小时进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内每天至少进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每两天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每三天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每四天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每五天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每六天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每七天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每八天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每九天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每十天进行一次监测。在一些实施方案中，在培育步骤期间至少进行一次监测。
在一些实施方案中，可以通过监测(包括使用光学技术，如DHM或DDHM)确定的细胞特征包括细胞活力、细胞浓度、细胞数量和/或细胞密度。在一些实施方案中，表征或确定细胞活力。在一些实施方案中，表征或确定细胞浓度、密度和/或数量。在一些实施方案中，表征或确定活细胞浓度、活细胞数量和/或活细胞密度。在一些实施方案中，通过自动化系统监测经培育的细胞，直到达到如上所述的扩增的阈值。在一些实施方案中，一旦达到扩增的阈值，就例如通过自动化或手动方法例如由人类操作者收获培育的细胞。扩增的阈值可能取决于由自动化系统确定的培养细胞的总浓度、密度和/或数量。可替代地，扩增的阈值可能取决于活细胞浓度、密度和/或数量。
在一些实施方案中，如所述配制收获的细胞，如在药学上可接受的载体的存在下配制。在一些实施方案中，在低温保护剂的存在下配制收获的细胞。在一些实施方案中，根据上文第I节中提供的方法评估治疗性组合物的收获的细胞的效力。在一些实施方案中，在低温保存之前评估治疗性组合物的收获的细胞的效力。在一些实施方案中，在低温保存之后评估治疗性组合物的收获的细胞的效力。
E.配制重组受体工程化细胞的细胞和治疗性组合物
还提供了含有治疗性细胞组合物的组合物，包括其药物组合物和配制品，根据上文(第I节)提供的方法评估所述治疗性细胞组合物的效力。在一些实施方案中，所提供的用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的方法可以包括配制由所提供的加工步骤产生的基因工程化细胞，以产生含有表达重组受体的细胞的治疗性细胞组合物。在一些实施方案中，所提供的与细胞的配制相关的方法包括在封闭系统中加工转导的细胞，如使用上述加工步骤转导和/或扩增的细胞。在一些实施方案中，将包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的所述剂量的细胞作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品提供。此类组合物可以根据所提供的方法使用，如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法中。
在一些情况下，在用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的一个或多个步骤(例如，在离心室和/或封闭系统中进行的)中加工细胞，可以包括在培养(例如培育和扩增)和/或如所述的一个或多个其他加工步骤之前或之后配制细胞，例如配制由所提供的转导加工步骤产生的基因工程化细胞。在一些情况下，可以以用于剂量施用(如用于单一单位剂量施用或多剂量施用)的量配制细胞。在一些实施方案中，使用根据上文第I节中提供的方法确定的治疗性组合物的细胞的效力来确定单位剂量和/或剂量施用。在一些实施方案中，出于确定单位剂量和/或剂量施用的目的，根据第I节中提供的方法评估治疗性组合物的细胞的效力。在一些实施方案中，所提供的与细胞的配制相关的方法包括在封闭系统中加工转导的细胞，如使用上述加工步骤转导和/或扩增的细胞。
在某些实施方案中，配制经富集T细胞(如工程化和经培育T细胞，例如输出T细胞)的一种或多种组合物、治疗性细胞组合物。在特定实施方案中，在已经工程化和/或培育一种或多种组合物之后配制经富集T细胞(如工程化和经培育T细胞，例如输出T细胞)的一种或多种组合物、治疗性细胞组合物。在特定实施方案中，一种或多种组合物是输入组合物。在一些实施方案中，先前已经将一种或多种输入组合物低温冷冻并储存，并在孵育之前解冻。
在某些实施方案中，经富集T细胞(如工程化和经培育T细胞，例如输出T细胞)的一种或多种治疗性组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物，例如单独的工程化和/或经培育组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独治疗性组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/或富集的、单独工程化和单独培育的经富集CD4+T细胞和CD8+T细胞的两种单独组合物分别配制。在某些实施方案中，两种单独治疗性细胞组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，两种单独治疗性细胞组合物包括经富集CD8+T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的两种单独治疗性组合物(如工程化和经培育CD4+T细胞和工程化和经培育CD8+T细胞的单独组合物)分别配制。在一些实施方案中，对经富集T细胞的单一治疗性组合物进行配制。在某些实施方案中，单一治疗性组合物是经富集CD4+T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，单一治疗性组合物是在配制之前已从单独组合物合并的经富集CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+T细胞的单独治疗性组合物(如工程化和经培育CD4+和CD8+T细胞的单独组合物)合并为单一治疗性组合物并配制。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成配制之后将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独经配制治疗性组合物合并为单一治疗性组合物。在特定实施方案中，将经富集CD4+和CD8+T细胞的单独治疗性组合物(如工程化和经培育CD4+和CD8+T细胞的单独组合物)分别配制为单独组合物。
在一些实施方案中，经配制的经富集CD4+T细胞(如经工程化和经培育CD4+T细胞，例如输出CD4+T细胞)的治疗性组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在一些实施方案中，组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD4+T细胞。在某些实施方案中，经配制的经富集CD4+T细胞(如工程化和经培育CD4+T细胞，例如输出CD4+T细胞)的治疗性组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，经配制的经富集CD8+T细胞(如经工程化和经培育CD8+T细胞，例如输出CD8+T细胞)的治疗性组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，治疗性组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+T细胞(如工程化和经培育CD8+T细胞，例如输出CD8+T细胞)的治疗性组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在某些实施方案中，经配制细胞是输出细胞。在一些实施方案中，经富集T细胞的经配制治疗性组合物(如工程化和经培育T细胞的经配制组合物)是经富集T细胞的输出组合物。在特定实施方案中，经配制CD4+T细胞和/或经配制CD8+T细胞是输出CD4+和/或CD8+T细胞。在特定实施方案中，经富集CD4+T细胞的经配制组合物是经富集CD4+T细胞的输出组合物。在一些实施方案中，经富集CD8+T细胞的经配制组合物是经富集CD8+T细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，可以将细胞配制到容器(如袋或小瓶)中。在一些实施方案中，在细胞后在培育期间已经实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后0天与10天之间、0与5天之间、2天与7天之间、0.5天与4天之间或1天与3天之间，配制细胞。在某些实施方案中，在培育期间已经实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后为或为或约12小时、18小时、24小时、1天、2天或3天或在12小时、18小时、24小时、1天、2天或3天内，配制细胞。在一些实施方案中，在培育期间已经实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后为或约1天内，配制细胞。
在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液在一些方面可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，加工包括将培养基更换成药学上可接受的或向受试者施用所需的培养基或配制缓冲液。在一些实施方案中，加工步骤可以涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以替代药学上可接受的缓冲液中的细胞，所述药学上可接受的缓冲液可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。包括药学上可接受的载体或赋形剂的此类药物形式的例子可以是下文与将细胞和组合物施用于受试者可接受的形式结合描述的任何形式。在一些实施方案中，药物组合物以有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有细胞。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或施用方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，在组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗功效或预防功效。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，重复进行治疗直至发生所希望的对疾病症状的抑制。然而，其他施用方案可能有用并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物或通过连续输注施用组合物来递送。
可以使用标准施用技术、配制品和/或装置来施用所述细胞。提供了用于储存和施用所述组合物的配制品和装置(如注射器和小瓶)。细胞的施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以从一名受试者获得，并且施用同一受试者或不同的相容受试者。外周血来源的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外来源的)可以通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。在施用治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，将细胞群肠胃外施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送将细胞群施用于受试者。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至所选pH。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更易于制备。另外地，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散培养基，所述溶剂或分散培养基含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。所述组合物也可以是冻干的。所述组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、颜料等，这取决于施用途径和所需的制剂。在一些方面，可以查阅标准文本来制备合适的制剂。
可以添加各种增强组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过不同的抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸等)来确保防止微生物的作用。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射药物形式的延长吸收。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
在一些实施方案中，配制缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方案中，用低温保存剂溶液配制细胞，所述低温保存剂溶液含有1.0％至30％的DMSO溶液，如5％至20％的DMSO溶液或5％至10％的DMSO溶液。在一些实施方案中，低温保存剂溶液是或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS、或其他合适的细胞冷冻培养基。在一些实施方案中，低温保存剂溶液是或含有例如至少或约7.5％ DMSO。在一些实施方案中，加工步骤可以涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以替换在低温保存剂溶液中的细胞。在一些实施方案中，将细胞在培养基和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或低温保存，所述培养基和/或溶液具有最终浓度为或约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将细胞在培养基和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或低温保存，所述培养基和/或溶液具有最终浓度为或约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或在0.1％与5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间或在1％与2％之间的HSA。
在特定实施方案中，对经富集T细胞(例如，已经刺激、工程化和/或培育的T细胞)的治疗性组合物进行配制，低温冷冻，然后储存一定时间量。在某些实施方案中，通常将所配制的低温冷冻的细胞储存在多个小瓶或容器中，直到将细胞释放以用于输注。在一些实施方案中，可以使用特定治疗性组合物的小瓶或容器以在输注治疗性细胞组合物之前进行所提供的效力测定。在特定实施方案中，所配制的低温冷冻的细胞储存持续1天与6个月之间、在1个月与3个月之间、在1天与14天之间、在1天与7天之间、在3天与6天之间、在6个月与12个月之间、或长于12个月。在一些实施方案中，将细胞低温冷冻并储存持续、持续约、或持续少于1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在某些实施方案中，在储存之后，将细胞解冻并施用于受试者。在某些实施方案中，将细胞储存或储存约5天。
在一些实施方案中，将细胞在药学上可接受的缓冲液(任选地包括低温保护剂)中配制，所述药学上可接受的缓冲液的体积为从10mL至1000mL或从约10mL至约1000mL，如至少或约至少或约50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。在一些实施方案中，将治疗性细胞组合物储存在容器(如一个或多个小瓶或袋)中。在一些实施方案中，小瓶或袋通常含有待施用的细胞，例如其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是要施用于受试者的细胞的量或数量，或者是要施用的细胞的数量的两倍(或更多数量)。它可以是要施用于受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)单独包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致或基本相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x106、2x106、5x106、1x107、5x107或1x108个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的经配制细胞组合物的体积为10mL至100mL，如至少或约至少或约20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方案中，容器(例如，袋或小瓶)中的细胞可以是低温保存的。在一些实施方案中，容器(例如，小瓶)可以储存在液氮中，直到进一步使用。
在一些实施方案中，使用本文所述的效力测定确定或测量如通过包括一个或多个所述步骤的方法产生的含有重组受体表达细胞(例如，CAR表达细胞)的组合物的细胞的效力(如相对效力)。在一些实施方案中，可以向受试者施用含有重组受体表达细胞(例如，CAR表达细胞)的组合物的细胞(如通过包括一个或多个所述步骤的方法产生和/或已经确定其效力)，以治疗疾病或病症。
III.重组受体
在一些实施方案中，对来自含有或表达或经工程化以含有或表达重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR))的组合物的细胞执行或进行所提供的用于确定治疗性细胞组合物的效力(如相对效力)的方法。在某些实施方案中，本文提供的方法产生和/或能够产生如下细胞或含有和/或富集如下细胞的群体或组合物，所述细胞经工程化以表达或含有重组蛋白并且可以确定或测量此类产生的工程化细胞的效力。在各种实施方案中，所提供的方法是对细胞组合物，如免疫细胞(例如T细胞进行的，所述免疫细胞(例如T细胞)是经工程化、转化、转导或转染以表达一种或多种重组受体的细胞。
在一些实施方案中，所提供的方法用于评估表达一种或多种重组受体的工程化细胞，如免疫细胞，如T细胞的效力。受体包括抗原受体以及含有其一种或多种组分的受体。重组受体可以包括嵌合受体(如含有配体结合结构域或其结合片段和细胞内信号传导结构域或区域的那些)、功能性非TCR抗原受体、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)(如重组或转基因TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)和前述任一项的组分。重组受体(如CAR)通常包括(在一些方面通过接头和/或一个或多个跨膜结构域)与一个或多个细胞内信号传导组分连接的胞外抗原(或配体)结合结构域。在一些实施方案中，工程化细胞表达含有不同组分、结构域或区域的两种或更多种受体。在一些方面，两种或更多种受体允许在空间或时间上调节或控制重组受体的特异性、活性、抗原(或配体)结合、功能和/或表达。
A.嵌合抗原受体(CAR)
在所提供的方法的一些实施方案中，嵌合受体(如嵌合抗原受体)含有一个或多个结构域，所述一个或多个结构域将提供对所需靶标(例如，抗原(例如，肿瘤抗原))的特异性的配体结合结构域(例如，抗体或抗体片段)与细胞内信号传导结构域组合。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是激活细胞内结构域部分，如T细胞激活结构域，从而提供初级激活信号。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应子功能。在一些实施方案中，嵌合受体在被基因工程化至免疫细胞中时，可以调节T细胞活性，并且在一些情况下可以调节T细胞分化或稳态，由此产生在体内具有改善的寿命、存活和/或持久性的基因工程化细胞，如用于过继细胞治疗方法。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、WO 2015/168613、WO 2016/030414；美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337、US20190389925；美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、8,479,118、10,266,580；以及欧洲专利申请号EP 2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoSONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。CAR的例子包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
嵌合受体(如CAR)通常包括胞外靶标结合结构域(例如，抗原结合结构域)，例如像抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如scFv抗体片段。
在一些实施方案中，受体所靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，所述抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，抗原是或包括αvβ6整联蛋白(avb6整联蛋白)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或包含通用标签或与通用标签缔合的抗原、和/或生物素化的分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特有的或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，抗体是包括一个或多个接头的抗原结合片段(如scFv)，所述一个或多个接头连接两个抗体结构域或区域(如重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区)。接头通常是肽接头，例如，柔性和/或可溶肽接头。接头包括富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下富含苏氨酸的那些。在一些实施方案中，接头还包括带电荷的残基，如赖氨酸和/或谷氨酸，它们可以改进溶解性。在一些实施方案中，接头还包括一个或多个脯氨酸。在一些方面，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一个或多个此类氨基酸。在一些实施方案中，它们包括至少为或约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸构成。接头的长度通常在约5个与约50个氨基酸之间，通常在为或约10个与为或约30个之间，例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个，并且在一些例子中长度在10个与25个氨基酸之间。示例性接头包括具有不同数量的序列GGGGS(4GS；SEQ ID NO:22)或GGGS(3GS；SEQ ID NO:23)的重复(如在2、3、4与5个之间的这种序列的重复)的接头。示例性接头包括具有SEQ ID NO:24(GGGGSGGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:25(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)或SEQ IDNO:26(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)所示序列或由所述序列组成的那些。
在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US2016/0152723中所述。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性地结合抗原的重链可变(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联双scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能抗体片段，在本文也称为“抗原结合片段”。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在本领域中是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中已知是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variabledomains:an automatic modeling and analysis tool,”J MolBiol,2001年6月8日；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号基于最常见的抗体区序列长度，其中通过插入字母例如“30a”提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat与Chothia定义之间的折衷，是基于Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的方案。
表1列出了分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如，FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间，等等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，指定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述所提供抗体的示例性CDR序列，但应当理解，所提供抗体可以包括如根据任何其他上述编号方案或熟练技术人员已知的其他编号方案所描述的CDR。
同样，除非另有规定，否则给定抗体或其区域如其可变区的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如任何已知方案所定义的一个(或特定)框架区。在一些情形中，指定用于鉴定特定CDR、FR或多个特定FR或CDR的鉴定方案，如通过Kabat、Chothia、AbM或Contact方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情形中，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
包括在所提供的CAR中的抗体包括抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；重链可变(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和仅含有VH区的单结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗原结合结构域是或包括含有可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区的抗体片段。在特定实施方案中，抗体是包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区的单链抗体片段(例如scFv)。
在一些实施方案中，scFv源自FMC63。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocytetyping III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含SEQ ID NO:27和28分别所示的CDRH1和H2，以及SEQ ID NO:29或30所示的CDRH3、以及SEQ ID NO:55所示的CDRL1、以及SEQ IDNO:32或33所示的CDR L2、以及SEQ ID NO:34或35所示的CDR L3。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:31的CDRL1序列、SEQ ID NO:32的CDRL2序列和SEQ ID NO:34的CDRL3序列的可变轻链，和/或含有SEQ ID NO:27的CDRH1序列、SEQ ID NO:28的CDRH2序列和SEQ ID NO:29的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:36中所示的可变重链区和SEQ ID NO:37中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ IDNO:25所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列或与SEQ IDNO:38展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:39至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv源自SJ25C1。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typingIII.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含分别在SEQ ID NO:51-53中所示的CDRH1、H2和H3，以及分别在SEQ ID NO:48-50中所示的CDRL1、L2和L3序列。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:48的CDRL1序列、SEQ ID NO:49的CDRL2序列和SEQ ID NO:50的CDRL3序列的可变轻链，和/或含有SEQ ID NO:51的CDRH1序列、SEQ ID NO:52的CDRH2序列和SEQ ID NO:53的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:46中所示的可变重链区和SEQ ID NO:47中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ IDNO:24所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:54至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如，scFv或VH结构域)特异性识别抗原(如BCMA)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自与BCMA特异性结合的抗体或抗原结合片段，或者是所述抗体或抗原结合片段的变体。
在一些实施方案中，CAR是对BCMA(例如人BCMA)具有特异性的抗BCMA CAR。先前已经描述了含有抗BCMA抗体(包括小鼠抗人BCMA抗体和人抗人抗体)的嵌合抗原受体以及表达此类嵌合受体的细胞。参见Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060，WO 2016/090320，WO 2016090327，WO 2010104949A2和WO 2017173256。在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是BCMA。在一些实施方案中，scFv含有源自对BCMA具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合BCMA的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090327和WO 2016/090320中所述的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，抗BCMACAR包含抗原结合结构域(如scFv)，所述抗原结合结构域含有源自WO 2016/090320或WO 2016090327中所述的抗体的可变重链(VH)区和/或可变轻链(VL)区。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:55所示的VH和SEQ ID NO:56所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:57所示的VH和SEQ ID NO:58所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQID NO:59所示的VH和SEQ ID NO:60所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:61所示的VH和SEQ ID NO:62所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:63所示的VH和SEQ ID NO:64所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:65所示的VH和SEQ ID NO:66所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:67所示的VH和SEQ ID NO:68所示的VL。在一些实施方案中，VH或VL具有展现出与任何前述VH或VL序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且保留与BCMA结合的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH区位于VL区的氨基末端。在一些实施方案中，VH区位于VL区的羧基末端。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是GPRC5D。在一些实施方案中，scFv含有源自对GPRC5D具特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329和WO 2016/090312中所述的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些方面，CAR含有结合或识别(例如，特异性结合)通用标签或通用表位的配体(例如，抗原)结合结构域。在一些方面，结合结构域可以结合分子、标签、多肽和/或表位，所述分子、标签、多肽和/或表位可以连接至识别与疾病或障碍相关的抗原的不同结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)。示例性标签或表位包括染料(例如，异硫氰酸荧光素)或生物素。在一些方面，结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)与标签连接，所述标签识别与疾病或障碍相关的抗原(例如，肿瘤抗原)，且工程化细胞表达对所述标签具有特异性的CAR，以实现工程化细胞的细胞毒性或其他效应子功能。在一些方面，CAR对与疾病或障碍相关的抗原的特异性由带标签的结合分子(例如，抗体)提供，并且不同的带标签的结合分子可以用于靶向不同抗原。对通用标签或通用表位具有特异性的示例性CAR包括例如以下文献中所述的那些：U.S.9,233,125；WO 2016/030414；Urbanska等人,(2012)Cancer Res 72:1844-1852；和Tamada等人,(2012).Clin Cancer Res 18:6436-6445。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特有的或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，如抗体或抗原结合片段(例如，scFv)，其特异性识别作为主要组织相容性复合物(MHC)-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(如肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(如抗原受体)的部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非T细胞受体(TCR)抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，含有展现针对肽-MHC复合物的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在MHC分子的情境下在细胞表面上被识别。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的胞外抗原结合结构域通过接头和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或类似通过天然抗原受体(如TCR)的信号，以及通过这种受体与共刺激受体的组合的信号。
提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机构加工的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈递具有T细胞上的抗原受体(如TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是具有跨膜α链(在一些情况下具有三个α结构域)和非共价缔合的β2微球蛋白的异二聚体。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β构成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，所述有效部分含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体识别所必需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，在此处MHC-肽复合物被T细胞(如通常是CD8+T细胞，但是在一些情况下是CD4+T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，其中肽通常被CD4+T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，它们在小鼠中统称为H-2，并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也可以称为人白细胞抗原(HLA)。
术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，MHC-肽复合物可以由抗原受体(如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性识别。
在一些实施方案中，多肽的肽(如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，如用于由抗原受体识别。通常，肽源自或基于较长生物分子(如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，肽通常具有约8至约24个氨基酸的长度。在一些实施方案中，对于MHC II类复合物中的识别，肽的长度为从或从约9至22个氨基酸。在一些实施方案中，对于MHC I类复合物中的识别，肽的长度为从或从约8至13个氨基酸。在一些实施方案中，在识别MHC分子(如MHC-肽复合物)背景下的肽后，抗原受体(如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或可通过已知方法产生(参见例如，美国公开申请号US2002/0150914；US2003/0223994；US2004/0191260；US2006/0034850；US2007/00992530；US20090226474；US20090304679；和国际申请公开号WO 03/068201)。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，MHC-肽复合物的肽是能够与MHC结合的抗原的表位，所述抗原是例如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主施用有效量的免疫原以用于引发免疫应答，其中免疫原保持其三维形式持续一段足以引发针对所述肽在MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫应答的时间。然后测定从宿主中收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈递的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目的肽以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所需抗体。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以生成突变体Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如，美国专利申请公开号US 20020150914、US20140294841；以及Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
在一些实施方案中，抗原是CD20。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD20具特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD20的抗体或抗体片段是如下抗体，所述抗体是利妥昔单抗或源自利妥昔单抗，如是利妥昔单抗scFv。
在一些实施方案中，抗原是CD22。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD22具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD22的抗体或抗体片段是抗体，所述抗体是m971或源自m971，如是m971 scFv。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv。
在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)的抗体部分进一步包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分，如铰链区(例如IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的恒定区或部分。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后增强的细胞应答性。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；国际专利申请公开号WO 2014031687、美国专利号8,822,647或公开的申请号US 2014/0271635。
在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的恒定区或部分。在一些实施方案中，间隔子具有序列ESKYGPPCPPCP(如SEQ ID NO:69所示)，并且由SEQ ID NO:70所示的序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:71所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:72所示的序列。在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的恒定区或部分。在一些实施方案中，间隔子是免疫球蛋白恒定区的一部分，其是或包含铰链序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:73所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有展现出与SEQ ID NO:69、70、71、72或73中的任一者至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:74-82所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有展现出与SEQ ID NO:74-82中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原受体包含与胞外结构域直接或间接连接的细胞内结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含ITAM。例如，在一些方面，抗原识别结构域(例如胞外结构域)通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如模拟通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)进行激活和/或通过另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分)连接。在一些实施方案中，嵌合受体包含在胞外结构域(例如，scFv)与细胞内信号传导结构域之间连接或融合的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)与一种或多种跨膜结构域和细胞内信号传导结构域连接。
在一个实施方案中，使用与受体(例如CAR)中的结构域之一天然地缔合的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下(即包含其至少一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。
在一些实施方案中，胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在一些实施方案中，胞外结构域和跨膜结构域通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，受体含有衍生出跨膜结构域的分子的胞外部分，如CD28胞外部分。
细胞内信号传导结构域包括模拟或接近以下的那些：通过天然抗原受体的信号、通过这种受体与共刺激受体的组合的信号、和/或仅通过共刺激受体的信号。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头(如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括这样的信号传导组分中的一种或两种。
受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自CD3ζ链、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD3跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)进一步包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体后，所述受体的胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如经工程化以表达所述CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助细胞活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体的那些胞质序列，所述共受体在自然环境中与此类受体协同作用以启动抗原受体接合后的信号转导。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要经由TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，相同的CAR包括激活组分和共刺激组分两者。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有源自T细胞共刺激分子的细胞内结构域或其功能变体，如位于跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方案中，激活结构域包括于一个CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括均在同一细胞上表达的激活或刺激CAR、共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或激活CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，如识别除了与疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症特有的抗原以外的抗原的CAR，其中通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应。
在一些实施方案中，这两种受体分别将激活和抑制性信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的连接激活细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的连接诱导抑制或减弱该应答的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR(iCAR)的组合。例如，这种策略可以用于例如降低在如下背景中的脱靶效应的可能性，在所述背景中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在所述疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些方面，嵌合受体是或包括抑制性CAR(例如，iCAR)，并且包括减弱或抑制免疫应答(例如细胞中ITAM和/或共同刺激促进的应答)的细胞内组分。此类细胞内信号传导组分的示例是在免疫检查点分子(包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR))上发现的那些组分。在一些方面，工程化细胞包括抑制性CAR，所述抑制性CAR包含这种抑制性分子的信号传导结构域或源自这种抑制性分子的信号传导结构域，使得其用于减弱例如由激活和/或共刺激CAR诱导的细胞应答。
在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，抗原受体还包括标记，和/或表达CAR或其他抗原受体的细胞还包括替代标记，如细胞表面标记，所述替代标记可以用于确认细胞被转导或工程化以表达受体。在一些方面，标记包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR或表皮生长因子受体，如这种细胞表面受体的截短形式(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(如可切割的接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记以及任选地接头序列可以是如公开的专利申请号WO 2014031687中所披露的任一种。例如，标记可以是截短EGFR(tEGFR)，其任选地连接接头序列，如T2A可切割接头序列。
截短的EGFR(例如，tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:2或3至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQ ID NO:1或4所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:1或4至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标记是并非在T细胞上天然发现的或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即不被将被过继转移细胞的宿主免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，标记不起任何治疗作用和/或不产生除了用作遗传工程化的标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，标记可以是治疗性分子或原本发挥一定所需作用的分子，如在体内所遇到的细胞的配体，如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或减弱细胞在过继转移和遇到配体后的应答。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体如CD28或CD137的细胞内信号传导结构域的信号；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
例如，在一些实施方案中，CAR含有对抗原(包括如所述的任一种)具有特异性的抗体(例如抗体片段，如scFv)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有对抗原(包括如所述的任一种)具有特异性的抗体(例如抗体片段，如scFv)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体进一步包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的跨膜结构域是或包含人CD28(例如，登录号P01747.1)的跨膜结构域或其变体，如包含SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:83至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，重组受体的含有跨膜结构域的部分包含SEQ ID NO:84中所示的氨基酸序列或具有与其至少为或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的一种或多种细胞内信号传导组分含有人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的结构域。例如，细胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:85或86中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:85或86至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内结构域包含4-1BB(例如，登录号Q07011.1)的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:87中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:87至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ的亚型3(登录号：P20963.2)的112个AA的胞质结构域或如美国专利号：7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:88、89或90中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:88、89或90至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ ID NO:69所示的仅铰链间隔子。在其他实施方案中，间隔子是或含有任选地与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4衍生的铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:72中所示。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:71中所示。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(如抗体片段，包括scFv)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分(如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔子，如含有Ig铰链的间隔子)、含有CD28衍生的跨膜结构域的全部或部分的跨膜结构域、CD28衍生的细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(如scFv)、间隔子(如任何含Ig铰链的间隔子)、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB衍生的细胞内信号传导结构域和CD3ζ衍生的信号传导结构域。
示例性替代标记可以包括截短形式的细胞表面多肽，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常被细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括生长因子或其他受体的截短形式，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在2或3中所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有由抗体西妥昔单抗或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，所述表位可以用于鉴定或选择已经工程化以表达tEGFR构建体和编码的外源蛋白质的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记(例如，替代标记)包括全部或部分(例如，截短形式的)CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如，截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体、以及密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是抗性标记或选择标记。在一些实施方案中，抗性标记或选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，抗性标记或选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，抗性标记或选择标记是赋予哺乳动物细胞抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，抗性标记或选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687。
在一些实施方案中，编码此类CAR构建体的核酸分子例如在编码CAR的序列的下游还包括编码T2A核糖体跳跃元件的序列和/或tEGFR序列。在一些实施方案中，序列编码SEQID NO:1或4所示的T2A核糖体跳跃元件，或展现出与SEQ ID NO:1或4至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，还可以生成表达抗原受体(例如，CAR)的T细胞以表达截短EGFR(tEGFR)作为非免疫原性选择表位(例如，通过引入编码由T2A核糖体开关隔开的CAR和tEGFR的构建体以从相同构建体表达两种蛋白质)，然后可以使用所述截短EGFR作为标记来检测此类细胞(参见例如，美国专利号8,802,374)。在一些实施方案中，序列编码SEQ IDNO:2或3中所示的tEGFR序列，或展现出与SEQ ID NO:2或3至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，肽(如T2A)可以导致核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见例如de Felipe.GeneticVaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic5:616-626(2004))。许多2A元件是已知的。可以用于本文公开的方法和核酸中的2A序列的例子包括但不限于来自以下的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:8)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:7)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:1或4)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ ID NO:5或6)，如美国专利公开号20070116690中所述。
由施用于受试者的细胞表达的重组受体(如CAR)通常识别或特异性结合以下分子，所述分子在被治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与被治疗的疾病或病症或其细胞相关和/或对被治疗的疾病或病症或其细胞具特异性。在与分子(例如抗原)特异性结合后，所述受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方案中，细胞表达与抗原特异性地结合的CAR，所述抗原由所述疾病或病症的细胞或组织表达或与所述疾病或病症相关。
B.嵌合自身抗体受体(CAAR)
在一些实施方案中，重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR结合(例如特异性地结合)或识别自身抗体。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞(例如经工程化以表达CAAR的T细胞)可以用于结合至并杀伤表达自身抗体的细胞，而不是表达正常抗体的细胞。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以用于治疗与自身抗原的表达相关的自身免疫性疾病，例如自身免疫性疾病。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以靶向最终产生自身抗体并在其细胞表面上展示自身抗体的B细胞，将这些B细胞标记为用于治疗性干预的疾病特异性靶标。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向和杀伤自身免疫性疾病中的致病性B细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAAR，如美国专利申请公开US2017/0051035中所述的任一种。
在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导区域或结构域(也可互换地称为细胞质信号传导结构域或区域)。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中刺激和/或诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域(例如CD3-Zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或区域或其功能变体或信号传导部分)和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
在一些实施方案中，自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，自身抗原的选择可能是由于其识别与特定疾病状态(例如，自身免疫性疾病，如自身抗体介导的自身免疫性疾病)相关的靶细胞(如B细胞)上的自身抗体。在一些实施方案中，自身免疫性疾病包括寻常型天疱疮(PV)。示例性自身抗原包括桥粒黏蛋白1(Dsg1)和Dsg3。
C.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，提供工程化的细胞(如T细胞)，其表达识别靶多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合部分，并且其能够特异性结合至与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，发现TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或其抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合(如与MHC-肽复合物结合)。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有高变环或互补决定区(CDR)，它们通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示更低可变性(参见例如，Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者是在给定TCR可变区的用于所述肽-MHC复合物的加工肽部分的抗原识别和/或用于与其相互作用的三个CDR中最重要的CDR。在一些情境下，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情境下，β链的CDR1可以与所述肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，β链的可变区可以含有其他高变区(CDR4或HVR4)，所述高变区通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)Clinical Microbiology Reviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾(参见例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune Systemin Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链(例如，α链或β链)的胞外部分可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常为基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences ofProteins of Immunological Interest”,USDept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat编号的链的位置117至259；或β链恒定结构域或Cβ，通常为基于Kabat的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，其中可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，由此连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可在每条α和β链中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有胞质尾。在一些情况下，结构允许TCR与其他分子(如CD3和其亚基)缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导设备或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者其可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体，所述链是通过例如一个或多个二硫键连接。
在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα,β链的序列)生成，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是易于获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。
在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据对TCR序列的知识以合成方式生成。
在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR生成的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来生成，所述T细胞是从受试者分离，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，可以从CD4+或CD8+T细胞生成TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源(即，正常TCR文库)扩增。在一些实施方案中，TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如通过在从人获得的样品(如T细胞)中进行RT-PCR。在一些实施方案中，scTv文库可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中扩增的产物被克隆或组装以通过接头分开。取决于受试者和细胞的来源，文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化生成。在一些方面，使TCR经受例如α或β链的定向进化，如通过诱变来进行。在一些方面，TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰选择的TCR。在一些实施方案中，可以选择抗原特异性T细胞，如通过筛选以评估针对肽的CTL活性。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过对抗原的结合活性(例如，特定亲和力或亲合力)来选择。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已经修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来生成具有改变的特性如具有较高的对特定MHC-肽复合物的亲和力的TCR。在一些实施方案中，通过展示方法实现定向进化，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad SciU S A,97,5387-92)；噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途径涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在一些实施方案中，用于产生或生成目的TCR的靶多肽的肽是已知的或者可以容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于在生成TCR或抗原结合部分中使用的肽可以基于目的靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics17(12):1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods in MolecularBiology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有白种人的约39％至46％中表达，并且因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
使用计算机预测模型的蛋白酶体和免疫蛋白酶体的HLA-A0201结合基序和切割位点是已知的。用于预测MHC I类结合位点的此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS17(12):1236-1237 2001)和SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHIDatabase forSearching and T-Cell Epitope Prediction.,Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,第409卷(1):75-93 2007)。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白质或其突变形式(其中一种或多种特性(如结合特征)已经被改变)。在一些实施方案中，TCR可以源自各种动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，TCR呈在细胞的表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，TCR是全长TCR。在一些实施方案中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO 2011/044186中所述的结构。
在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于细胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR能够与CD3形成TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与在T细胞的表面上产生活性TCR的信号传导结构域连接。在一些实施方案中，TCR在细胞的表面上表达。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列的N末端融合)，第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，键可以对应于天然二聚αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。在一些实施方案中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链(含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序)和TCRβ链(包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序)，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，可以使用已知的方法生成scTCR，参见例如Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际公开PCT号WO96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO 2011/044186；以及Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如，国际公开PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有通过肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公开PCT号WO 99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段、由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段(融合至对应于TCRβ链恒定结构域胞外序列的氨基酸序列的N末端)和将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端的接头序列。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至所述第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至所述第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR的连接所述第一和第二TCR区段的接头可以是能够形成单多肽链同时保留TCR结合特异性的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，接头具有足够的长度以跨越第一区段的C末端与第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长以阻断或减少scTCR与靶配体的结合。在一些实施方案中，接头可以含有从10至45个氨基酸或从约10至约45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:91)。在一些实施方案中，接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:92)
在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，所述共价二硫键将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。
在含有引入的链间二硫键的dTCR或scTCR的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，用形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸取代另一残基，如取代丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于公开的国际PCT号WO 2006/000830中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段展现对靶抗原的亲和力，其平衡结合常数在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克隆或其他合适的方式扩增，并且克隆到一种或多种合适的表达载体中。表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕洛阿尔托)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，可以使用标准重组DNA技术来制备重组表达载体。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对引入载体的宿主(例如，细菌、真菌、植物或动物)的类型具有特异性，酌情并考虑载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其与编码TCR或抗原结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子以及在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还设想其他已知的启动子。
在一些实施方案中，为了生成编码TCR的载体，将α和β链从自表达目的TCR的T细胞克隆分离的总cDNA进行PCR扩增，并克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所生成的α和β链掺入逆转录病毒(例如，慢病毒)载体中。
IV.施用方法
还提供了组合物的使用方法和用途，如用于治疗疾病、病症和障碍，例如癌症。
提供了施用已经根据本文(例如，第I节)提供的方法评估其效力的治疗性细胞组合物的方法，以及此类细胞、群体和组合物用于治疗或预防疾病、病症和障碍(包括癌症)的用途。还提供了已经根据本文(例如，第I节)提供的方法评估其效力的治疗性细胞组合物的使用方法和用途，以及此类治疗性细胞组合物用于治疗或预防疾病、病症和障碍(包括癌症)的用途。在特定实施方案中，细胞、群体和组合物是如根据任何所提供的方法产生并工程化的那些。在一些实施方案中，将细胞、群体和组合物施用于受试者或患者，所述受试者或患者患有待治疗例如经由过继细胞疗法(如过继T细胞疗法)治疗的特定疾病或病症。在一些实施方案中，将通过所提供方法制备的细胞和组合物(如在孵育和/或其他加工步骤后，工程化的组合物和生产结束时(end-of-production)的组合物)施用于受试者，如患有疾病或病症或具有所述疾病或病症的风险的受试者。在一些方面，所述方法由此治疗疾病或病症(例如，改善其一种或多种症状)，如通过减轻表达由工程化T细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负荷。
此类方法和用途包括治疗性方法和用途，例如，其涉及将通过所提供的方法制备的细胞和组合物(如在孵育和/或其他加工步骤后的工程化组合物和生产结束时的组合物)施用于患有疾病、病症或障碍(如癌症)的受试者，以实现疾病或障碍的治疗。在一些实施方案中，根据本文提供的方法确定组合物的效力。用途包括组合物在此类方法和治疗中的用途，以及此类组合物在制备药物以进行此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，所述方法和用途由此治疗受试者的疾病或病症或障碍，如肿瘤或癌症。
用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)。参见例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，向其施用细胞、细胞群或组合物的受试者(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，灵长类动物是猴或猿。受试者可以是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体如“治疗(treat或treating))”是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结局或表型的完全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结局的影响。
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减慢、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发展。此延迟可以具有变化的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
如本文所用的，“抑制”功能或活性是当与除了目标条件或参数之外在其他方面相同的条件相比时，或者可替代地，与另一种情况相比时，减少功能或活性。例如，与不存在所述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
在施用的情境下，药剂(例如药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(例如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如，药物配制品或细胞)的“治疗有效量”是指在所需剂量下和所需时间段中有效实现所需治疗结果(如针对疾病、病症或障碍的治疗)和/或治疗的药代动力学或药效学作用的量。治疗有效量可以根据诸如以下的因素而变化：疾病状态、受试者的年龄、性别和体重和所施用的细胞群。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)施用细胞和/或组合物。在一些实施方案中，使用治疗性细胞组合物的所确定的效力来确定有效量，例如治疗有效量。
“预防有效量”是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下能有效实现所需预防结果的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的，所以预防有效量将小于治疗有效量。在一些实施方案中，使用治疗性细胞组合物的所确定的效力来确定预防有效量。
所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病、病症或障碍的病因相关和/或参与所述病因，例如引起、加重或以其他方式参与这种疾病、病症或障碍。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病或者例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。示例性抗原(其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原)描述于上文中。在特定实施方案中，嵌合抗原受体或转基因TCR与和疾病或病症相关的抗原特异性结合。
因此，所提供的方法和用途包括用于过继细胞疗法的方法和用途。在一些实施方案中，所述方法包括将细胞或含有所述细胞的组合物施用于受试者、组织或细胞，例如患有、有风险患上或怀疑患有疾病、病症或障碍的受试者、组织或细胞。在一些实施方案中，例如通过过继细胞疗法如过继T细胞疗法将细胞、群体和组合物施用于患有待治疗的特定疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，将细胞或组合物施用于受试者(如患有或有风险患上所述疾病或病症的受试者)改善所述疾病或病症的一个或多个症状。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从接受细胞疗法的受试者或从源自这种受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞来源于需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和加工后将所述细胞施用于同一受试者。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者与第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。细胞可以通过任何合适的方式施用。给药和施用可以部分取决于施用是短暂的还是长期的。各种给药时间表包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
在某些实施方案中，细胞或单独的细胞亚型群体以约100万至约1000亿个细胞和/或按每公斤体重所述细胞量的范围施用于受试者，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤体重的这些范围之间的任何值。同样，剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，剂量可以取决于治疗性细胞组合物的效力。在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时施用或依序以任何顺序施用。在一些实施方案中，将细胞与一种或多种另外的治疗剂共同施用或与另一种治疗性干预结合施用(同时或依序以任何顺序施用)。在一些情境下，将细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，将细胞在一种或多种另外的治疗剂之前施用。在一些实施方案中，将细胞在一种或多种另外的治疗剂之后施用。在一些实施方案中，一种或多种另外的药剂包括细胞因子(如IL-2)，例如以增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括施用化学治疗剂。
在一些实施方案中，在施用细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化细胞群(例如，治疗性细胞组合物)的生物活性。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(例如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，通过评估临床结局(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。
在某些实施方案中，将工程化细胞以任何数量的方式进一步修饰，使得其治疗或预防功效增加。例如，可以将群体表达的工程化CAR或TCR直接或通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践在本领域是已知的。参见例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)和美国专利5,087,616。在一些实施方案中，使用本文(例如，第I节)所述的评估效力的方法确定增加的治疗或预防功效的确认。
IV.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号以及其他技术和科学术语或用辞意图具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
在整个本公开文本中，要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限与下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其他所陈述值或中间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括所述限值中的之一或两者的情况下，排除那些所包括限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(如序列表所示)是指，在使用标准比对算法(例如，GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导，鉴定相应的残基。通常，为了鉴定相应位置，比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见例如，Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,New York,1993；Computer AnalysisofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M StocktonPress,New York,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已将其引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导与它们操作性地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如逆转录病毒(例如，γ逆转录病毒和慢病毒)载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阳性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中的可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括为了在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
氨基酸取代可以包括用一个氨基酸替代多肽中的另一个氨基酸。取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入感兴趣的结合分子(例如抗体)、和针对所希望的活性(例如保留/改进的抗原结合、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可能涉及将这些类别之一的成员更换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号以及其他技术和科学术语或用辞意图具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
V.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种确定治疗性细胞组合物的效力的方法，所述方法包括：
进行多个孵育，所述多个孵育中的每一个包括将治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂一起培养，所述治疗性组合物包含经工程化以表达重组受体的细胞，其中：
所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合刺激所述细胞的重组受体依赖性活性；并且
所述多个孵育中的每一个包括不同逐步调整比率的所述治疗性细胞组合物的细胞与所述重组受体刺激剂；
测量来自所述多个孵育中的每一个的重组受体依赖性活性；
基于从所述多个孵育中的每一个测量的所述重组受体依赖性活性，确定导致半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率。
2.根据实施方案1所述的方法，所述方法进一步包括通过将导致所述治疗性细胞组合物的半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率与导致参考标准品的半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率进行比较来确定所述治疗性细胞组合物的相对效力。
3.一种确定治疗性细胞组合物的效力的方法，所述方法包括：
进行多个孵育，所述多个孵育中的每一个包括将治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂一起培养，所述治疗性组合物包含经工程化以表达重组受体的细胞，其中：
所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合刺激所述细胞的重组受体依赖性活性；并且
所述多个孵育中的每一个包括不同逐步调整比率的所述治疗性细胞组合物的细胞与所述重组受体刺激剂；
测量来自所述多个孵育中的每一个的重组受体依赖性活性；以及
通过将所述治疗性细胞组合物的半最大重组受体依赖性活性与参考标准品的半最大重组受体依赖性活性进行比较来确定所述治疗性细胞组合物的相对效力。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述多个孵育中的每一个包括将所述生成治疗性组合物的恒定数量的细胞与不同量的所述重组受体刺激剂一起培养以多个不同的逐步调整比率。
5.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述多个孵育中的每一个包括将恒定量的结合分子与所述治疗性组合物的不同数量的细胞一起培养以生成多个不同的逐步调整比率。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中对两种或更多种，任选地3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种治疗性细胞组合物进行所述多个孵育。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自包含相同的重组受体。
8.根据实施方案6所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自包含不同的重组受体。
9.根据实施方案6所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物中的至少一种包含与其他治疗性组合物不同的重组受体。
10.根据实施方案6-9中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自使用相同的制造过程来制造。
11.根据实施方案6-9中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自使用不同的制造过程来制造。
12.根据实施方案6-9中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物中的至少一种使用与用于制造其他治疗性细胞组合物的制造过程不同的制造过程来制造。
13.根据实施方案6-12中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物由来自单个受试者的细胞产生。
14.根据实施方案6-12中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物是由来自不同受试者的细胞产生的。
15.根据实施方案13或实施方案14所述的方法，其中所述受试者是健康受试者或患有疾病或病症的受试者。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述多个孵育是至少三个孵育。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述多个孵育是至少五个孵育。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述多个孵育是至少七个孵育。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述多个孵育是至少十个孵育。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括以下中的一种或多种：细胞因子表达、细胞溶解活性、受体上调、受体下调、增殖、基因上调、基因下调或细胞健康。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞因子表达或产生。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞因子表达或产生，其中所述细胞因子是TNF-α、IFN-γ(IFNg)或IL-2。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞溶解活性。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是受体上调。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是受体下调。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是增殖。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是基因上调。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是基因下调。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞健康。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞健康，其中所述细胞健康包括细胞死亡、细胞直径、活细胞浓度和细胞计数中的一种或多种。
31.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中将在所述多个孵育中的每一个测量的所述重组受体依赖性活性相对于针对所述治疗性细胞组合物测量的最大受体依赖性活性归一化。
32.根据实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述参考标准品是包含导致半最大重组受体依赖性活性的经验证的逐步调整比率的治疗性细胞组合物、可商购获得的治疗性细胞组合物、使用与用于制造所述治疗性细胞组合物的制造过程相同的制造过程制造的治疗性细胞组合物、使用与用于制造所述治疗性细胞组合物的制造过程不同的制造过程制造的治疗性细胞组合物、包含与所述治疗性细胞组合物相同的重组受体的治疗性细胞组合物、包含与所述治疗性细胞组合物不同的重组受体的治疗性细胞组合物、从相同受试者制造的治疗性细胞组合物、或从不同受试者制造的治疗性细胞组合物。
33.根据实施方案6-32中任一项所述的方法，其中所述参考标准品是所述两种或更多种治疗性组合物中的一种。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂包括所述重组受体的靶抗原或其胞外结构域结合部分，任选地重组抗原。
35.根据实施方案34所述的方法，其中所述重组受体刺激剂包括所述抗原的胞外结构域结合部分，并且所述胞外结构域结合部分包含由所述重组受体识别的表位。
36.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是对所述重组受体的胞外抗原结合结构域具有特异性的抗独特型抗体。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂固定或附接至固体支持物。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述固体支持物是器皿的表面，任选地是微孔板的孔，在其中进行所述多个孵育。
39.根据实施方案37所述的方法，其中所述固体支持物是珠。
40.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是抗原表达细胞，任选地其中所述细胞是克隆、来自细胞系、或取自受试者的原代细胞。
41.根据实施方案40所述的方法，其中所述抗原表达细胞是细胞系。
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述细胞系是肿瘤细胞系。
43.根据实施方案40所述的方法，其中所述抗原表达细胞是已经任选地通过转导被引入以表达所述重组受体的抗原的细胞。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述逐步调整比率达到所述参考标准品的重组受体依赖性活性的线性剂量反应范围。
45.根据实施方案44所述的方法，其中所述逐步调整比率包括所述参考标准品的较低渐近线(最小)重组受体依赖性活性和较高渐近线(最大)重组受体依赖性活性。
46.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含从生物样品富集或纯化的单细胞亚型或任选地通过混合从生物样品富集或纯化的细胞亚型获得的混合细胞亚型群体。
47.根据实施方案46所述的方法，其中所述生物样品包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单个核细胞(PBMC)样品、未分级细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
48.根据实施方案1-47中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含原代细胞。
49.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含来自待治疗的受试者的自体细胞。
50.根据实施方案1-49中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含同种异体细胞。
51.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含CD3+、CD4+和/或CD8+T细胞。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含或者是CD4+T细胞。
53.根据实施方案1-52中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含或者是CD8+T细胞。
54.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
55.根据实施方案1-54中任一项所述的方法，其中所述多个孵育在烧瓶、管或多孔板中进行。
56.根据实施方案1-55中任一项所述的方法，其中所述多个孵育各自在多孔板的孔中单独进行。
57.根据实施方案55或实施方案56所述的方法，其中所述多孔板是96孔板、48孔板、12孔板或6孔板。
58.根据实施方案1和4-57中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于导致半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率，确定用于向有需要的受试者施用的所述治疗性组合物的细胞的剂量。
59.根据实施方案2-57中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述相对效力，确定用于向有需要的受试者施用的所述治疗性组合物的细胞的剂量。
60.根据实施方案58或实施方案59所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症。
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
62.根据实施方案2-61中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述相对效力，确定产生最佳治疗性细胞组合物效力的制造过程，其中所述最佳治疗性细胞组合物效力与完全和/或持久反应和/或降低的毒性相关。
63.根据实施方案2-62中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述相对效力，确定产生具有降低的或低的效力差异的治疗性细胞组合物的制造过程，其中所述降低的或低的差异是与不同制造过程中的差异进行比较来确定的。
VI.实施例
以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并且不意图限制本发明的范围。
实施例1：用于评估细胞疗法产品对抗原刺激的敏感性的测定。
将测定设计为测量含有表达重组受体(例如，嵌合抗原受体)的细胞的治疗性细胞组合物对抗原刺激的敏感性。
从来自供体白细胞单采术样品的分离的PBMC中选择来自三名患者或健康人供体的原代CD4+和CD8+T细胞。在无血清培养基中在存在重组IL-2、IL-7和IL-15的情况下，在存在抗CD3和抗CD28抗体或结合片段的情况下刺激CD4+和CD8+T细胞。通过孵育将刺激进行18至30小时之间。将细胞用编码针对特定抗原(例如，CD19或BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒载体转导。CAR含有对抗原(例如，CD19或BCMA)具有特异性的scFv抗原结合结构域、免疫球蛋白间隔子、跨膜结构域(例如，来自人CD28的跨膜结构域)以及含有人CD3-ζ细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域(例如，人4-1BB细胞内信号传导结构域)的细胞内信号传导结构域。然后将转导的细胞在存在重组细胞因子的情况下培育以用于扩增。尽管此实施例用生成的CAR表达T细胞进行例示，但是可以使用该测定来评估任何抗原定向重组受体的抗原特异性敏感性。
为了测量示例性治疗性细胞组合物对抗原特异性刺激的敏感性，将固定浓度的治疗性细胞组合物与逐步调整量的抗原表达靶细胞一起孵育。将治疗性细胞组合物的约50,000个CAR+T细胞(其在此测定中充当效应细胞)添加至多孔板的每个孔中。将抗原表达靶细胞以抗原表达靶细胞与效应细胞比率(T:E比率)从12:1至0.012:1的逐步调整量添加。将细胞共培养2与48小时之间，然后通过监测T细胞的功能活性来评估抗原特异性应答。在此示例性测定中，在16小时后收集上清液以评估抗原特异性细胞因子产生。
图1A示出了依据三种示例性生成的细胞产物的供体的在每个T:E比率下的示例性分泌的细胞因子IFNγ浓度。图1B示出了相对于在较高渐近线(Vmax)处观察到的最大细胞因子浓度归一化的细胞因子分泌(y轴)。
确定每个供体产生50％细胞因子分泌(例如，50％有效刺激或ES50)的T:E比率，并计算相对于供体1(参考标准品)的相对效力。为了比较，使用传统测定形式评估三种不同的细胞组合物产物，在传统测定形式中测量在药物产品的最大抗原刺激下的细胞因子分泌，并且还计算相对于供体1的相对效力。结果示于表E1中。表E1中所述的结果显示了在最大抗原特异性刺激下由治疗性细胞组合物的细胞分泌的细胞因子的量与它们对抗原特异性刺激的敏感性(如通过在50％有效刺激(ES50)下的T:E比率所确定的)之间的不同关系。这些结果表明，传统测定可能导致抗原刺激水平饱和，这可能无法提供对抗原刺激的抗原敏感性的准确测量，而所提供的测定可以更可靠地测量抗原定向治疗性细胞组合物对抗原刺激的敏感性。
表E1.通过测定确定的相对效力。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
<120> 确定治疗性细胞组合物的效力的方法
<130> 73504-20230.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> 63/164,527
<151> 2021-03-22
<160> 92
<170>用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 1
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 2
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 3
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 3
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 4
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 5
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 6
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 7
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 8
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 9
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 10
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 11
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33信号肽
<400> 12
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 13
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人BCMA的胞外结构域 (GenBank编号
NP_001183.2)
<400> 13
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala
50
<210> 14
<211> 668
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD22胞外结构域
<400> 14
Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu Tyr Ala Trp
1 5 10 15
Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala Leu Asp Gly
20 25 30
Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr Asn Lys Asn
35 40 45
Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr Lys Asp Gly
50 55 60
Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly Asp Lys Asn
65 70 75 80
Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn Asp Ser Gly
85 90 95
Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp Met Glu Arg
100 105 110
Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His Ile Gln Leu
115 120 125
Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr Cys Leu Leu
130 135 140
Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp Leu Leu Glu
145 150 155 160
Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser Leu Thr Ile
165 170 175
Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro Gln Trp Ser
180 185 190
His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala Asp Gly Lys
195 200 205
Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His Thr Pro Lys
210 215 220
Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg Glu Gly Asp
225 230 235 240
Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro Glu Tyr Thr
245 250 255
Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys Gln Asn Thr
260 265 270
Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser Gly Lys Tyr
275 280 285
Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser Glu Glu Val
290 295 300
Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val Gln Ile Leu
305 310 315 320
His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu Cys Met Ser
325 330 335
Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His Asn Gly Lys
340 345 350
Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro Lys Ile Leu
355 360 365
Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn Ile Leu Gly
370 375 380
Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln Tyr Pro Pro
385 390 395 400
Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile Arg Glu Gly
405 410 415
Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn Pro Ser Val
420 425 430
Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu Pro Ser Leu
435 440 445
Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr Thr Ile Ala
450 455 460
Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro Val Ala Leu
465 470 475 480
Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys Ile Lys Pro
485 490 495
Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln Cys Asp Phe
500 505 510
Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu Lys Asn Gly
515 520 525
Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser Ile Ser Pro
530 535 540
Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser Ile Gly Gln
545 550 555 560
Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala Pro Arg Arg
565 570 575
Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu Gly Lys Ser
580 585 590
Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val Ser His Tyr
595 600 605
Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His Ser Gln Lys
610 615 620
Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala Tyr Trp Cys
625 630 635 640
Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu Ser Thr Leu
645 650 655
Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg
660 665
<210> 15
<211> 556
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> CD19
<400> 15
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1 5 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100 105 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130 135 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145 150 155 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
165 170 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225 230 235 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245 250 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260 265 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275 280 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290 295 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val
325 330 335
Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu
340 345 350
Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala
355 360 365
Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp
370 375 380
Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly
385 390 395 400
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu
405 410 415
Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu
420 425 430
Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly
435 440 445
Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu
450 455 460
Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser
465 470 475 480
Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly
485 490 495
Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln
500 505 510
Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala
515 520 525
Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp
530 535 540
Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg
545 550 555
<210> 16
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1 Fc
<400> 16
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 17
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的人IgG1 Fc
<400> 17
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 18
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-Fc融合多肽
<400> 18
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ser Asp
50 55 60
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala
65 70 75 80
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
85 90 95
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
100 105 110
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
115 120 125
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
130 135 140
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
145 150 155 160
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
165 170 175
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
180 185 190
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
195 200 205
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
210 215 220
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
225 230 235 240
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
245 250 255
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
260 265 270
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
275 280 285
Gly Lys
290
<210> 19
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人ROR1片段
<400> 19
Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser
1 5 10 15
Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp
20 25 30
Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu
35 40 45
His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys
50 55 60
Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp
85 90 95
Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser
100 105 110
Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser
115 120 125
Pro Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr
130 135 140
Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met
145 150 155 160
Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala
165 170 175
Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln
180 185 190
Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu
195 200 205
Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu
210 215 220
Ile Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser
225 230 235 240
Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu
245 250 255
Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile
260 265 270
Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr
275 280 285
Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln
290 295 300
Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala
305 310 315 320
Leu Arg Phe Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro
325 330 335
Gly Asn Gln Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe
340 345 350
Lys Ser Asp Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys
355 360 365
Glu Lys Asn Lys Met Glu Ile Leu Tyr
370 375
<210> 20
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ROR1-Fc融合多肽
<400> 20
Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser
1 5 10 15
Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp
20 25 30
Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu
35 40 45
His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys
50 55 60
Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp
85 90 95
Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser
100 105 110
Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser
115 120 125
Pro Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr
130 135 140
Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met
145 150 155 160
Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala
165 170 175
Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln
180 185 190
Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu
195 200 205
Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu
210 215 220
Ile Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser
225 230 235 240
Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu
245 250 255
Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile
260 265 270
Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr
275 280 285
Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln
290 295 300
Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala
305 310 315 320
Leu Arg Phe Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro
325 330 335
Gly Asn Gln Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe
340 345 350
Lys Ser Asp Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys
355 360 365
Glu Lys Asn Lys Met Glu Ile Leu Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys
370 375 380
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
385 390 395 400
Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
405 410 415
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
420 425 430
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
435 440 445
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
450 455 460
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
465 470 475 480
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser
485 490 495
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
500 505 510
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
515 520 525
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
530 535 540
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
545 550 555 560
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
565 570 575
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
580 585 590
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
595 600 605
Leu Ser Pro Gly Lys
610
<210> 21
<211> 904
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD22-Fc融合多肽
<400> 21
Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu Tyr Ala Trp
1 5 10 15
Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala Leu Asp Gly
20 25 30
Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr Asn Lys Asn
35 40 45
Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr Lys Asp Gly
50 55 60
Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly Asp Lys Asn
65 70 75 80
Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn Asp Ser Gly
85 90 95
Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp Met Glu Arg
100 105 110
Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His Ile Gln Leu
115 120 125
Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr Cys Leu Leu
130 135 140
Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp Leu Leu Glu
145 150 155 160
Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser Leu Thr Ile
165 170 175
Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro Gln Trp Ser
180 185 190
His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala Asp Gly Lys
195 200 205
Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His Thr Pro Lys
210 215 220
Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg Glu Gly Asp
225 230 235 240
Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro Glu Tyr Thr
245 250 255
Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys Gln Asn Thr
260 265 270
Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser Gly Lys Tyr
275 280 285
Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser Glu Glu Val
290 295 300
Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val Gln Ile Leu
305 310 315 320
His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu Cys Met Ser
325 330 335
Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His Asn Gly Lys
340 345 350
Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro Lys Ile Leu
355 360 365
Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn Ile Leu Gly
370 375 380
Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln Tyr Pro Pro
385 390 395 400
Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile Arg Glu Gly
405 410 415
Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn Pro Ser Val
420 425 430
Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu Pro Ser Leu
435 440 445
Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr Thr Ile Ala
450 455 460
Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro Val Ala Leu
465 470 475 480
Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys Ile Lys Pro
485 490 495
Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln Cys Asp Phe
500 505 510
Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu Lys Asn Gly
515 520 525
Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser Ile Ser Pro
530 535 540
Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser Ile Gly Gln
545 550 555 560
Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala Pro Arg Arg
565 570 575
Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu Gly Lys Ser
580 585 590
Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val Ser His Tyr
595 600 605
Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His Ser Gln Lys
610 615 620
Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala Tyr Trp Cys
625 630 635 640
Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu Ser Thr Leu
645 650 655
Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg Gly Gly Gly Gly
660 665 670
Ser Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
675 680 685
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
690 695 700
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
705 710 715 720
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
725 730 735
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
740 745 750
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
755 760 765
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
770 775 780
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
785 790 795 800
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
805 810 815
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
820 825 830
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
835 840 845
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
850 855 860
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
865 870 875 880
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
885 890 895
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
900
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 23
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 25
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 26
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 27
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 28
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 29
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 30
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 31
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 32
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 33
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 34
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 35
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 36
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 38
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>编码scFv的序列
<400> 38
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 39
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 40
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 41
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 42
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 43
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 44
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 45
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 46
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 47
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 48
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 49
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 50
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 51
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 52
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 53
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 54
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 55
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 55
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 56
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 57
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 57
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 58
Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 60
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 61
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 62
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 63
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Ser Lys Ser Ile Val Ser Tyr Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 64
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Val Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 65
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Ser Tyr Arg Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 66
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 67
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Ile Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Tyr Ser Gly Val Leu Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 68
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Phe Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子
(IgG4铰链) (aa)
<400> 69
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 70
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子
(IgG4铰链) (nt)
<400> 70
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 71
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH3
间隔子
<400> 71
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 72
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3
间隔子
<400> 72
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 73
<211> 200
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 73
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly
195 200
<210> 74
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG
铰链
<400> 74
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG
铰链
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa是半胱氨酸或苏氨酸
<400> 75
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG
铰链
<400> 76
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 77
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG
铰链
<400> 77
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 78
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG
铰链
<400> 78
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 79
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG
铰链
<400> 79
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 80
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG
铰链
<400> 80
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG
铰链
<400> 81
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG
铰链
<400> 82
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 83
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> CD28 (登录号
P10747的
氨基酸
153-179 )
<400> 83
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 84
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> CD28 (登录号
P10747的
氨基酸
114-179)
<400> 84
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 85
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> CD28 (P10747的
氨基酸
180-220)
<400> 85
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 86
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> CD28 (LL至GG)
<400> 86
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 87
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> 4-1BB (Q07011.1的
氨基酸
214-255)
<400> 87
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 88
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 88
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 89
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 89
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 90
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人 (Homo Sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 90
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 91
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头；P是脯氨酸， G是甘氨酸并且S是
丝氨酸
<400> 91
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
20 25 30
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 92
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser

Claims (65)

1.一种确定治疗性细胞组合物的效力的方法，所述方法包括：
进行多个孵育，所述多个孵育中的每一个包括将治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂一起培养，所述治疗性细胞组合物包含经工程化以表达重组受体的细胞，其中：
所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合刺激所述细胞的重组受体依赖性活性；并且
所述多个孵育中的每一个包括不同逐步调整比率的所述治疗性细胞组合物的细胞与所述重组受体刺激剂；
测量来自所述多个孵育中的每一个的重组受体依赖性活性；以及
基于从所述多个孵育中的每一个测量的所述重组受体依赖性活性，确定导致半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括通过将导致所述治疗性细胞组合物的半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率与导致参考标准品的半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率进行比较来确定所述治疗性细胞组合物的相对效力。
3.一种确定治疗性细胞组合物的效力的方法，所述方法包括：
进行多个孵育，所述多个孵育中的每一个包括将治疗性细胞组合物的细胞与重组受体刺激剂一起培养，所述治疗性细胞组合物包含经工程化以表达重组受体的细胞，其中：
所述重组受体刺激剂与所述重组受体的结合刺激所述细胞的重组受体依赖性活性；并且
所述多个孵育中的每一个包括不同逐步调整比率的所述治疗性细胞组合物的细胞与所述重组受体刺激剂；
测量来自所述多个孵育中的每一个的重组受体依赖性活性；以及
通过将所述治疗性细胞组合物的半最大重组受体依赖性活性与参考标准品的半最大重组受体依赖性活性进行比较来确定所述治疗性细胞组合物的相对效力。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述多个孵育中的每一个包括将所述治疗性组合物的恒定数量的细胞与不同量的所述重组受体刺激剂一起培养以生成多个不同的逐步调整比率。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述多个孵育中的每一个包括将恒定量的重组受体刺激剂与所述治疗性组合物的不同数量的细胞一起培养以生成多个不同的逐步调整比率。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中对两种或更多种，任选地3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种治疗性细胞组合物进行所述多个孵育。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自包含相同的重组受体。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自包含不同的重组受体。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物中的至少一种包含与其他治疗性组合物不同的重组受体。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自使用相同的制造过程来制造。
11.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物各自使用不同的制造过程来制造。
12.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物中的至少一种使用与用于制造其他治疗性细胞组合物的制造过程不同的制造过程来制造。
13.根据权利要求6-12中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物是由来自单个受试者的细胞产生的。
14.根据权利要求6-12中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种治疗性细胞组合物是由来自不同受试者的细胞产生的。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者是健康受试者或患有疾病或病症的受试者。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述不同受试者中的每一个患有相同的疾病或病症。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述不同受试者中的每一个将要用相同的治疗性细胞组合物治疗以治疗所述受试者的疾病或病症。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述多个孵育是至少三个孵育。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述多个孵育是至少五个孵育。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述多个孵育是至少七个孵育。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述多个孵育是至少十个孵育。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括以下中的一种或多种：细胞因子表达、细胞溶解活性、受体上调、受体下调、增殖、基因上调、基因下调或细胞健康。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞因子表达或产生。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞因子表达或产生，其中所述细胞因子是TNF-α、IFN-γ(IFNg)或IL-2。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞溶解活性。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是受体上调。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是受体下调。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是增殖。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是基因上调。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是基因下调。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞健康。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述重组受体依赖性活性包括或者是细胞健康，其中所述细胞健康包括细胞死亡、细胞直径、活细胞浓度和细胞计数中的一种或多种。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中将在所述多个孵育中的每一个测量的所述重组受体依赖性活性相对于针对所述治疗性细胞组合物测量的最大受体依赖性活性归一化。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述参考标准品是包含导致半最大重组受体依赖性活性的经验证的逐步调整比率的治疗性细胞组合物、可商购获得的治疗性细胞组合物、使用与用于制造所述治疗性细胞组合物的制造过程相同的制造过程制造的治疗性细胞组合物、使用与用于制造所述治疗性细胞组合物的制造过程不同的制造过程制造的治疗性细胞组合物、包含与所述治疗性细胞组合物相同的重组受体的治疗性细胞组合物、包含与所述治疗性细胞组合物不同的重组受体的治疗性细胞组合物、从相同受试者制造的治疗性细胞组合物、或从不同受试者制造的治疗性细胞组合物。
35.根据权利要求6-34中任一项所述的方法，其中所述参考标准品是所述两种或更多种治疗性组合物中的一种。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂包括所述重组受体的靶抗原或其胞外结构域结合部分，任选地重组抗原。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述重组受体刺激剂包括所述抗原的胞外结构域结合部分，并且所述胞外结构域结合部分包含由所述重组受体识别的表位。
38.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是对所述重组受体的胞外结合结构域具有特异性的抗体。
39.根据权利要求1-35和38中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是对所述重组受体的胞外抗原结合结构域具有特异性的抗独特型抗体。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂固定或附接至固体支持物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述固体支持物是器皿的表面，任选地是微孔板的孔，在其中进行所述多个孵育。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述固体支持物是珠。
43.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述重组受体刺激剂是抗原表达细胞，任选地其中所述细胞是克隆、来自细胞系、或取自受试者的原代细胞。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述抗原表达细胞是细胞系。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述细胞系是肿瘤细胞系。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述抗原表达细胞是已经任选地通过转导被引入以表达所述重组受体的抗原的细胞。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述逐步调整比率达到所述参考标准品的重组受体依赖性活性的线性剂量反应范围。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述逐步调整比率包括所述参考标准品的较低渐近线(最小)重组受体依赖性活性和较高渐近线(最大)重组受体依赖性活性。
49.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含从生物样品富集或纯化的单细胞亚型或任选地通过混合从生物样品富集或纯化的细胞亚型获得的混合细胞亚型群体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述生物样品包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单个核细胞(PBMC)样品、未分级细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含原代细胞。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含来自待治疗的受试者的自体细胞。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含同种异体细胞。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含CD3+、CD4+和/或CD8+T细胞。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞组合物包含CD4+T细胞和CD8+T细胞。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述多个孵育在烧瓶、管或多孔板中进行。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述多个孵育中的每一个在多孔板的孔中单独进行。
59.根据权利要求57或权利要求58所述的方法，其中所述多孔板是96孔板、48孔板、12孔板或6孔板。
60.根据权利要求1和4-59中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于导致半最大重组受体依赖性活性的逐步调整比率，确定用于向有需要的受试者施用的所述治疗性组合物的细胞的剂量。
61.根据权利要求2-59中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述相对效力，确定用于向有需要的受试者施用的所述治疗性组合物的细胞的剂量。
62.根据权利要求60或权利要求61所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症。
63.根据权利要求15-62中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
64.根据权利要求2-63中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述相对效力，确定产生最佳治疗性细胞组合物效力的制造过程，其中所述最佳治疗性细胞组合物效力与完全和/或持久反应和/或降低的毒性相关。
65.根据权利要求2-64中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述相对效力，确定产生具有降低的或低的效力差异的治疗性细胞组合物的制造过程，其中所述降低的或低的差异是与不同制造过程中的差异进行比较来确定的。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022182891A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Lyell Immunopharma, Inc. Ror1 targeting chimeric antigen receptor
WO2024220588A1 (en) * 2023-04-18 2024-10-24 Juno Therapeutics, Inc. Cytotoxicity assay for assessing potency of therapeutic cell compositions

Family Cites Families (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5876435A (ja) 1981-10-30 1983-05-09 Japan Synthetic Rubber Co Ltd 重合体粒子
US4452773A (en) 1982-04-05 1984-06-05 Canadian Patents And Development Limited Magnetic iron-dextran microspheres
NO155316C (no) 1982-04-23 1987-03-11 Sintef Fremgangsmaate for fremstilling av magnetiske polymerpartikler.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4554088A (en) 1983-05-12 1985-11-19 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US4795698A (en) 1985-10-04 1989-01-03 Immunicon Corporation Magnetic-polymer particles
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IN165717B (zh) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5091206A (en) 1987-10-26 1992-02-25 Baxter Diagnostics Inc. Process for producing magnetically responsive polymer particles and application thereof
US5395688A (en) 1987-10-26 1995-03-07 Baxter Diagnostics Inc. Magnetically responsive fluorescent polymer particles
EP0452342B1 (en) 1988-12-28 1994-11-30 MILTENYI, Stefan Methods and materials for high gradient magnetic separation of biological materials
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2645160B1 (zh) 1989-03-31 1992-10-02 Rhone Poulenc Chimie
FR2656318B1 (fr) 1989-12-27 1994-02-04 Rhone Poulenc Chimie Microspheres "core-shell" magnetisables a base d'organopolysiloxane reticule, leur procede de preparation et leur application en biologie.
US5318797A (en) 1990-06-20 1994-06-07 Clarkson University Coated particles, hollow particles, and process for manufacturing the same
US5200084A (en) 1990-09-26 1993-04-06 Immunicon Corporation Apparatus and methods for magnetic separation
AU650085B2 (en) 1990-11-13 1994-06-09 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
DE4228458A1 (de) 1992-08-27 1994-06-01 Beiersdorf Ag Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung
JPH09500783A (ja) 1993-05-21 1997-01-28 ターゲッティッド ジェネティクス コーポレイション シトシンデアミナーゼ（ｃｄ）遺伝子に基づく二機能性選択融合遺伝子
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
WO1996013593A2 (en) 1994-10-26 1996-05-09 Procept, Inc. Soluble single chain t cell receptors
WO1996018105A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 The President And Fellows Of Harvard College Single chain t-cell receptor
US20020150914A1 (en) 1995-06-30 2002-10-17 Kobenhavns Universitet Recombinant antibodies from a phage display library, directed against a peptide-MHC complex
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5834121A (en) 1996-01-16 1998-11-10 Solid Phase Sciences Corp. Composite magnetic beads
DE19608753C1 (de) 1996-03-06 1997-06-26 Medigene Gmbh Transduktionssystem und seine Verwendung
WO1997034634A1 (en) 1996-03-20 1997-09-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain fv constructs of anti-ganglioside gd2 antibodies
US6123655A (en) 1996-04-24 2000-09-26 Fell; Claude Cell separation system with variable size chamber for the processing of biological fluids
DE69841648D1 (de) 1997-03-11 2010-06-17 Univ Minnesota Dns-basiertes transposon-system für die einführung von nucleinsäure in die dns einer zelle
WO1999018129A1 (en) 1997-10-02 1999-04-15 Sunol Molecular Corporation Soluble single-chain t-cell receptor proteins
US6074884A (en) 1997-10-09 2000-06-13 Coulter International Corp. Stable protein-nickel particles and methods of production and use thereof
JP2001523450A (ja) 1997-11-13 2001-11-27 リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ 細胞のｄｎａへの核酸の導入のための核酸転移ベクター
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP1066380B1 (en) 1998-05-19 2001-11-14 Avidex Ltd Soluble t cell receptor
JP2002524081A (ja) 1998-09-04 2002-08-06 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 前立腺−特異的膜抗原に特異的な融合受容体およびその使用
US6410319B1 (en) 1998-10-20 2002-06-25 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
DE69919029T2 (de) 1998-12-24 2005-09-08 Biosafe S.A. Vorrichtung zur bluttrennung, insbesondere zur konzentrierung von hematopoietischen stammzellen
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
WO2001094944A2 (en) 2000-06-02 2001-12-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
ATE338124T1 (de) 2000-11-07 2006-09-15 Hope City Cd19-spezifische umgezielte immunzellen
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
CA2457652C (en) 2001-08-31 2012-08-07 Avidex Limited Soluble t cell receptor
US7939059B2 (en) 2001-12-10 2011-05-10 California Institute Of Technology Method for the generation of antigen-specific lymphocytes
US6992176B2 (en) 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
CA2476625A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Dyax Corp. Mhc-peptide complex binding ligands
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
NZ539225A (en) 2002-10-09 2006-09-29 Avidex Ltd Single chain recombinant T cell receptors
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
DE602004005338T2 (de) 2003-05-16 2007-12-13 Université Libre de Bruxelles Digitales holographisches mikroskop für dreidimensionale abbildung und verfahren zu dessen verwendung
WO2005116072A2 (en) 2004-05-27 2005-12-08 Weidanz Jon A Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
US20090304679A1 (en) 2004-05-27 2009-12-10 Weidanz Jon A Antibodies as T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
US20090226474A1 (en) 2004-05-27 2009-09-10 Weidanz Jon A Antibodies as T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
JP5563194B2 (ja) 2004-06-29 2014-07-30 イムノコア リミテッド 改変ｔ細胞レセプターを発現する細胞
ES2345837T3 (es) 2005-03-23 2010-10-04 Biosafe S.A. Sistema integrado para la recogida, el procesamiento y el trasplante de subgrupos de celulas, incluyendo celulas madre adultas, para medicina regenerativa.
CN101627065B (zh) 2006-12-21 2012-05-23 茵维特罗根戴纳股份公司 颗粒和其在分离核酸的方法或分离磷蛋白的方法中的应用
SI2856876T1 (en) 2007-03-30 2018-04-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred T lymphocytes
HUE034888T2 (hu) 2007-12-07 2018-03-28 Miltenyi Biotec Gmbh Sejtfeldolgozási rendszerek és eljárások
US8479118B2 (en) 2007-12-10 2013-07-02 Microsoft Corporation Switching search providers within a browser search box
LT2222861T (lt) 2007-12-11 2018-03-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Retrovirusiniai vektoriai modifikuoti polipurino atkarpa
JP5173594B2 (ja) 2008-05-27 2013-04-03 キヤノン株式会社 管理装置、画像形成装置及びそれらの処理方法
HRP20211788T1 (hr) 2008-08-26 2022-02-18 City Of Hope Postupak i pripravci za poboljšanje anti-tumorskog efektorskog funkcioniranja t stanica
EP3141562A1 (en) 2009-03-10 2017-03-15 Biogen MA Inc. Anti-bcma antibodies
WO2011044186A1 (en) 2009-10-06 2011-04-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Human single-chain t cell receptors
WO2011056894A2 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Jensen Michael C TRUNCATED EPIDERIMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFRt) FOR TRANSDUCED T CELL SELECTION
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
CA2821080C (en) 2010-12-14 2021-02-02 University Of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing t cells and methods of treating cancer
AU2012230780B2 (en) 2011-03-23 2016-10-27 Fred Hutchinson Cancer Center Method and compositions for cellular immunotherapy
KR20140033029A (ko) 2011-04-01 2014-03-17 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 에이치엘에이 에이2에 의해 제공된 더블유티1 펩타이드에 특이적인 티 세포 수용체 유사 항체
US8398282B2 (en) 2011-05-12 2013-03-19 Delphi Technologies, Inc. Vehicle front lighting assembly and systems having a variable tint electrowetting element
JP6092206B2 (ja) 2011-07-19 2017-03-08 オヴィジオ イメージング システムズ エン．ヴェー． 細胞試料内のがん性細胞を検出し、及び／又は分類する方法及びシステム
US9708384B2 (en) 2011-09-22 2017-07-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Universal immune receptor expressed by T cells for the targeting of diverse and multiple antigens
MX359234B (es) 2011-11-11 2018-09-20 Hutchinson Fred Cancer Res Inmunoterapia de celulas t objetivadas en ciclina a1 para cancer.
ES2774160T3 (es) 2012-02-13 2020-07-17 Seattle Childrens Hospital D/B/A Seattle Childrens Res Institute Receptores de antígenos quiméricos biespecíficos y usos terapéuticos de los mismos
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
NZ702108A (en) 2012-05-03 2016-09-30 Hutchinson Fred Cancer Res Enhanced affinity t cell receptors and methods for making the same
US9371396B2 (en) 2012-06-15 2016-06-21 Sinomab Bioscience Limited Anti-CD22 anti-idiotypic antibodies and uses thereof
CA3177394A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Fred Hutchinson Cancer Center Method and compositions for cellular immunotherapy
WO2014044823A1 (en) 2012-09-20 2014-03-27 Ovizio Imaging Systems NV/SA Digital holographic microscope with fluid systems
EP2903637B1 (en) 2012-10-02 2019-06-12 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
HUE056852T2 (hu) 2014-04-16 2022-03-28 Juno Therapeutics Gmbh Sejtpopuláció felszaporítására szolgáló eljárások, készletek és berendezés
KR102447958B1 (ko) 2014-04-23 2022-09-27 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 치료용 면역 세포 집단의 단리, 배양 및 유전자 조작 방법
EP4008725A1 (en) 2014-05-02 2022-06-08 The Trustees of the University of Pennsylvania Compositions and methods of chimeric autoantibody receptor t cells
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
ES2688035T3 (es) 2014-08-29 2018-10-30 Gemoab Monoclonals Gmbh Receptor de antígeno universal que expresa células inmunes para direccionamiento de antígenos múltiples diversos, procedimiento para fabricación del mismo y utilización del mismo para tratamiento de cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes
PT3757206T (pt) 2014-11-05 2024-05-21 Juno Therapeutics Inc Métodos de transdução e processamento de células
SI3227339T1 (sl) 2014-12-05 2022-02-28 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Himerni antigenski receptorji, ki ciljajo na receptor, povezan z G-proteinom, in njihova uporaba
CA2969877A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibodies targeting b-cell maturation antigen and methods of use
EP3227324A4 (en) 2014-12-05 2018-08-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibodies targeting g-protein coupled receptor and methods of use
NZ732563A (en) 2014-12-05 2023-01-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen and uses thereof
WO2017112784A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Spycatcher and spytag: universal immune receptors for t cells
TWI691596B (zh) 2016-04-01 2020-04-21 美商凱特製藥公司 嵌合抗原和ｔ細胞受體及使用方法
EP3491024B1 (en) 2016-07-29 2024-12-18 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies against anti-cd19 antibodies
CA3053539A1 (en) * 2017-02-27 2018-08-30 Juno Therapeutics, Inc. Compositions, articles of manufacture and methods related to dosing in cell therapy
ES3009018T3 (en) 2017-07-29 2025-03-25 Juno Therapeutics Inc Reagents for expanding cells expressing recombinant receptors
CA3084514A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
WO2019197949A1 (en) 2018-04-09 2019-10-17 King Abdullah University Of Science And Technology Low power water cut sensing

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