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CN108226531A - 一种β2-微球蛋白检测试剂盒 - Google Patents

一种β2-微球蛋白检测试剂盒 Download PDF

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CN108226531A
CN108226531A CN201711446699.4A CN201711446699A CN108226531A CN 108226531 A CN108226531 A CN 108226531A CN 201711446699 A CN201711446699 A CN 201711446699A CN 108226531 A CN108226531 A CN 108226531A
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microglobulin
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polystyrene latex
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CN201711446699.4A
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李发强
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Sinocare Inc
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Abstract

本申请公开了一种β2‑微球蛋白检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1为缓冲液，所述试剂R2包括聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2‑微球蛋白抗体以及缓冲液，所述试剂R2的制备方法包括胶乳颗粒激活、β2‑微球蛋白抗体活化、偶联的步骤。本申请提供的β2‑微球蛋白检测试剂盒，通过对胶乳颗粒、微球蛋白进行活化，使得该试剂盒灵敏度高。特异性好、稳定性好，抗干扰能力强。

Description

一种β2-微球蛋白检测试剂盒
技术领域
本申请涉及医学检测技术领域，特别是涉及一种β2-微球蛋白检测试剂盒。
背景技术
β2-微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中。β2-微球蛋白伴随细胞代谢脱落到体液中，几乎全部从肾小球自由滤过，滤过的β2-微球蛋白99.9％在近端肾小管吸收并被细胞内的溶酶体进一步分解。正常情况下，人体血液中的β2-微球蛋白浓度仅为1-2mg/L，而人体尿液中β2-微球蛋白的排出是很微量的。因此，血清β2-微球蛋白的升高可反映肾小球滤过功能受损或滤过负荷是否增加的情况；而尿液中排出β2-微球蛋白增高，则提示肾小管损害或滤过负荷增加。β2-微球蛋白检测被认为是衡量糖尿病患者轻度肾功能减退和疗效观察的一项简便、精确而又敏感的方法。故而β2-微球蛋白的测定在临床上是有多种价值的。
目前已有的β2-微球蛋白的检测试剂盒，耗时长，特异性和灵敏度不佳，因此，如何提供一种效果更好β2-微球蛋白检测试剂盒是本领域人员亟待解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的第一个目的为提供一种β2-微球蛋白检测试剂盒；本发明提供的β2-微球蛋白检测试剂盒，通过对胶乳颗粒、微球蛋白进行活化，使得该试剂盒灵敏度高。特异性好、稳定性好，抗干扰能力强。
本发明提供的技术方案如下：
一种β2-微球蛋白检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1为缓冲液，所述试剂R2包括聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体以及缓冲液，所述试剂R2由以下步骤制备：
a、胶乳颗粒激活：向聚苯乙烯胶乳颗粒中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺活化，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；
b、β2-微球蛋白抗体活化：使用顺-乌头酸酐将β2-微球蛋白抗体非结合活性区域FC端的羟基或氨基活化，得到活化的β2-微球蛋白抗体；
c、偶联：将步骤a得到的激活的聚苯乙烯胶乳颗粒，与步骤b得到的活化的β2-微球蛋白抗体混合反应，然后加入牛血清白蛋白封闭胶乳颗粒上未反应的基团，得到聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体，洗涤，加入缓冲液，分散均匀，得到试剂R2。
优选地，所述步骤a中，向聚苯乙烯胶乳颗粒中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺混合反应后，再加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺，继续混合反应，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒。
优选地，所述步骤a中，聚苯乙烯胶乳颗粒经3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸洗涤后，分散均匀，然后再与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺进行反应。
优选地，所述试剂R1或试剂R2中的缓冲液具体为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
优选地，所述试剂R2还包括防腐剂、稳定剂中的一种或多种；所述试剂R1还包括防腐剂、稳定剂、表面活性剂中的一种或多种。
优选地，所述试剂R1或试剂R2中的防腐剂具体为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、硫柳汞钠、Prolin300中的一种或多种。
优选地，所述试剂R1或试剂R2中的稳定剂具体为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA、甘露醇中的一种或多种。
优选地，所述试剂R1中的表面活性剂具体为TWEEN系列表面活性剂、SPAN系列表面活性剂、TRITON系列表面活性剂、SDS系列表面活性剂、氯化胆碱、甘胆酸钠中的一种或多种。
优选地，所述试剂R2中，聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体的浓度为0.05-0.30％。
本发明提供的β2-微球蛋白检测试剂盒，使用胶乳增强免疫比浊法对β2-微球蛋白进行检测。原理如下：标记了抗原或抗体的胶乳颗粒，与待检测标本中相应抗体或抗原发现免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成的浊度即可测试出标本中被检物(β2-微球蛋白)的含量。
本发明中使用的聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体，其中的聚苯乙烯胶乳颗粒、β2-微球蛋白抗体分别经过活化，然后再进行偶联。聚苯乙烯胶乳颗粒经1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺活化。同时，β2-微球蛋白抗体经顺-乌头酸酐活化，将β2-微球蛋白抗体非结合活性区域FC端羟基或氨基活化成更有活性的活化脂基团，优选顺-乌头酸酐：β2-微球蛋白抗体＝1～2:5(重量比)。最后对分别活化的聚苯乙烯胶乳颗粒与β2-微球蛋白抗体进行混合时，优选β2-微球蛋白抗体：激活的聚苯乙烯胶乳颗粒＝10～20:100(重量比)。抗体经过顺-乌头酸酐活化后，在酸性介质中解离，会释放出活性抗体，这样，抗体和微球同时都是活化了，活性更高，亲和力更强，更容易结合，提高了结合效率；而且顺-乌头酸酐是可以活化羟基和氨基两种基团，不是单一的酰胺键活化，提高了结合效率。由于同时对活化抗体和微球进行了活化，顺-乌头酸酐容易将抗体中的羟基或氨基形成单酯或酰胺衍生物，而EDC能将微球中的羧基也活化成活泼酯衍生物，形成高活性的活化脂基团，使得抗体和胶乳微球颗粒结合效率高，定向偶联，不会发生抗体亲和力损失情况，保存了抗体的亲和力，大大提高了检测的灵敏度和特异性，稳定性，反应快速的同时减少了检测时间。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中线性范围测定的线性回归方程图；
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
请如图1所示，本发明实施例提供一种β2-微球蛋白检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1为缓冲液，所述试剂R2包括聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体以及缓冲液，所述试剂R2由以下步骤制备：
a、胶乳颗粒激活：向聚苯乙烯胶乳颗粒中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺活化，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；
b、β2-微球蛋白抗体活化：使用顺-乌头酸酐将β2-微球蛋白抗体非结合活性区域FC端或氨基的羟基活化，得到活化的β2-微球蛋白抗体；
c、偶联：将步骤a得到的激活的聚苯乙烯胶乳颗粒，与步骤b得到的活化的β2-微球蛋白抗体混合反应，然后加入牛血清白蛋白封闭胶乳颗粒上未反应的基团，得到聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体，洗涤，加入缓冲液，分散均匀，得到试剂R2。
本发明提供的β2-微球蛋白检测试剂盒，使用胶乳增强免疫比浊法对β2-微球蛋白进行检测。原理如下：标记了抗原或抗体的胶乳颗粒，与待检测标本中相应抗体或抗原发现免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成的浊度即可测试出标本中被检物(β2-微球蛋白)的含量。
本发明中使用的聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体，其中的聚苯乙烯胶乳颗粒、β2-微球蛋白抗体分别经过活化，然后再进行偶联。聚苯乙烯胶乳颗粒经1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺活化。同时，β2-微球蛋白抗体经顺-乌头酸酐活化，将β2-微球蛋白抗体非结合活性区域FC端羟基或氨基活化成更有活性的活化脂基团，优选顺-乌头酸酐：β2-微球蛋白抗体＝1～2:5(重量比)。最后对分别活化的聚苯乙烯胶乳颗粒与β2-微球蛋白抗体进行混合时，优选β2-微球蛋白抗体：激活的聚苯乙烯胶乳颗粒＝10～20:100(重量比)。抗体经过顺-乌头酸酐活化后，在酸性介质中解离，会释放出活性抗体，这样，抗体和微球同时都是活化了，活性更高，亲和力更强，更容易结合，提高了结合效率；而且顺-乌头酸酐是可以活化羟基和氨基两种基团，不是单一的酰胺键活化，提高了结合效率。由于同时对活化抗体和微球进行了活化，顺-乌头酸酐容易将抗体中的羟基或氨基形成单酯或酰胺衍生物，而EDC能将微球中的羧基也活化成活泼酯衍生物，形成高活性的活化脂基团，使得抗体和胶乳微球颗粒结合效率高，定向偶联，不会发生抗体亲和力损失情况，保存了抗体的亲和力，大大提高了检测的灵敏度和特异性，稳定性，反应快速的同时减少了检测时间。
本发明中使用的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺，可以使用其盐酸盐，即1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，对聚苯乙烯胶乳颗粒进行激活。最终制备得到的聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体，经清洗液清洗后，除去清洗液，然后加入缓冲液，超声分散均匀，得到试剂R2，在2-8℃下保存。
清洗液可以使用MOPSO缓冲液，一般都是使用和最终的保存液的缓冲系统一样的盐类缓冲液进行清洗。
优选地，所述步骤a中，向聚苯乙烯胶乳颗粒中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺混合反应后，再加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺，继续混合反应，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒。
先后使用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺对聚苯乙烯胶乳颗粒进行激活，S-NHS和EDC组合使用，能更好地将微球中的羧基活化成活泼酯衍生物，形成高活性的活化脂基团，使得抗体和胶乳微球颗粒结合效率高，效果较单独使用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺好，其中1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)：N-羟基硫代琥珀酰亚胺：聚苯乙烯胶乳颗粒＝1～4:1～4:1(重量比)。
优选地，所述步骤a中，聚苯乙烯胶乳颗粒经3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸洗涤后，分散均匀，然后再与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺进行反应。
其中，使用的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸的浓度可以是100mmol/L。优选使用3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸洗涤两次。
优选地，所述试剂R1或试剂R2中的缓冲液具体为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
优选地，所述试剂R2还包括防腐剂、稳定剂中的一种或多种；所述试剂R1还包括防腐剂、稳定剂、表面活性剂中的一种或多种。
优选地，所述试剂R1或试剂R2中的防腐剂具体为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、硫柳汞钠、Prolin300中的一种或多种。
优选地，所述试剂R1或试剂R2中的稳定剂具体为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA、甘露醇中的一种或多种。
优选地，所述试剂R1中的表面活性剂具体为TWEEN系列表面活性剂、SPAN系列表面活性剂、TRITON系列表面活性剂、SDS系列表面活性剂、氯化胆碱、甘胆酸钠中的一种或多种。
本发明除使用缓冲液、防腐剂、稳定剂，以维持试剂盒在长时间存放后仍稳定、有效以外，还在实际R1中加入了表面活性剂，排除临床标本中的高浓度脂类及脂蛋白干扰，去除非特异性的结合，大大提升了检测结果的准确度和可信性，且能够降低孵育时间从而提高检测速度。
优选地，所述试剂R2中，聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体的浓度为0.05-0.30％。
试剂R2中，聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体的浓度为0.05-0.30％，例如试剂R2中偶联的胶乳终浓度为0.16％(质量体积比为0.16g/100mL)。
本发明中使用的聚苯乙烯胶乳颗粒粒径优选在0.05-0.5um之间；所使用的β2-微球蛋白抗体包括但不限于多克隆抗体(羊、兔)及单克隆抗体。
本发明提供的β2-微球蛋白检测试剂盒，通过改进胶乳颗粒的标记方法，使得该试剂盒灵敏度高。特异性好、稳定性好，抗干扰能力强。
实施例1 β2-微球蛋白试剂盒的制备
试剂R1：1％的聚乙二醇6000,0.09％的叠氮钠，0.2％的BSA，0.8％的氯化钠，0.2％的吐温20，2.5％氯化胆碱，0.1M 3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液。该试剂为无色透明溶液。
试剂R2：0.1M的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液中含有0.16％β2-微球蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、0.5％BSA，0.1％叠氮钠，2％蔗糖。该试剂为乳白色溶液。试剂R2具体制备步骤如下：
a、取1mL(50mg/mL)胶乳，用0.1M pH 5.1的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸溶液(MESs溶液)洗涤2次，分散；加入500ul用0.1MpH 5.1的MES溶液配制的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，10mg/mL)混合完全，混合10min后加入500ul s-NHS(10mg/mL)，继续混合反应20min。
b、取1.6mL抗体(5mg/mL)溶液，加入1mL 20mM pH7.0的磷酸盐溶解0.078g顺-乌头酸酐，混合20min；
c、将步骤b中活化后的抗体加入步骤a中激活的胶乳溶液中，反应4h；然后加入10mL 5％的牛血清白蛋白(BSA)溶液，混合2h；用0.1M的MOPSO缓冲液洗涤1次，加入0.1M的MOPSO缓冲液(含有0.5％BSA，0.1％叠氮钠，2％蔗糖)至胶乳终浓度为0.16％。
实施例2 β2-微球蛋白的测定
检测工具：迈瑞BS230型自动分析仪
分析方法：两点终点法：主波长：546nm，样品量：2ul；R1：240ul；R2：60ul
校准方式：样条函数spline；反应方向：上升；测定温度：37℃；
样品与试剂R1混匀后，孵育3.5min后加入R2，于15S时读取A1值，于3.5min时读取吸光度A2值。反应度计算为A2与A1的差值。
计算方法：多点定标，以spline作为计算模式，根据吸光度与参考品的值作定标曲线，样品含量可以根据其吸光度值在定标曲线上计算出。
1、灵敏度试验
1.1检测限
采用5％牛血清白蛋白生理盐水溶液作为空白样本，不含被测物，在生化仪上连续测试20次，计算20次测试的结果均值及标准差，以空白均值加两倍标准差作为报告方法的检测限，从表1可见检测限为0.02mg/L。
表1
测定次数 均值(mg/L) SD X+2SD
20 0.002 0.009 0.02
1.2灵敏度
测定五种浓度接近线性范围下限的样本，每个样品测试10次，通过计算均值和标准差，从下表2可见，本发明检测试剂盒的灵敏度为0.05mg/L。
表2
2、线性范围测定
将1分低值样本(0.2mg/L)和一份高值样本(40mg/L)按照一定比例稀释制备出6个不同浓度的样本，每个样本重复测定3次，从表3和附图1可知，本发明的线性方程为y＝1.0192x-0.0853，R2＝0.9996。本发明试剂盒的检测范围可达到(0.20-40.00)mg/L，判定依据，R2>0.99。
表3
样本号 理论值 实测值
1 0.20 0.19
2 8.16 8.07
3 16.12 16.20
4 24.08 24.55
5 32.04 33.10
6 40.00 40.29
3、精密度评估
使用2个不同β2-微球蛋白含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度，使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为1.88％和1.39％(见表4)，而批间相对极差为1.29％(见表5)
表4
表5
4、干扰试验
在高中低三个不同浓度的样本中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定，加入干扰物质后的测定值与加入干扰物质前的测定值比较，测试结果偏差小于10％即无干扰，试验结果表明，按照EP-7的推荐浓度加入抗坏血酸等干扰物质，以及免疫项目常见的干扰物如类风湿因子，甘油三酯，血红蛋白，胆红素等在500IU/mL，1000mg/dL，200mg/dL，20mg/dL的浓度及以下时，它们对本发明试剂盒测定结果偏差均在10％内，无干扰。具体请见表6。
表6
通过上述试验，本发明的优点和有益效果：
第一，本发明试剂盒具有简单快速，1次测试时间才7min，灵敏度高，达到0.05mg/L，准确度好，抗干扰能力强，尤其是R1试剂中加入特殊表活使得对甘油三脂等脂质浓度很高的样本，依旧有良好的准确性，稳定性好，试剂制备过程简单易生产。
第二，本发明采用的β2-微球蛋白检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法使得β2-微球蛋白检测更经济快速，方便；而且适用于POCT产品，对床旁检测能实现快速定量检测。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1为缓冲液，所述试剂R2包括聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体以及缓冲液，所述试剂R2由以下步骤制备：
a、胶乳颗粒激活：向聚苯乙烯胶乳颗粒中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺活化，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；
b、β2-微球蛋白抗体活化：使用顺-乌头酸酐将β2-微球蛋白抗体非结合活性区域FC端的羟基或氨基活化，得到活化的β2-微球蛋白抗体；
c、偶联：将步骤a得到的激活的聚苯乙烯胶乳颗粒，与步骤b得到的活化的β2-微球蛋白抗体混合反应，然后加入牛血清白蛋白封闭胶乳颗粒上未反应的基团，得到聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体，洗涤，加入缓冲液，分散均匀，得到试剂R2。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤a中，向聚苯乙烯胶乳颗粒中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺混合反应后，再加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺，继续混合反应，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤a中，聚苯乙烯胶乳颗粒经3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸洗涤后，分散均匀，然后再与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺进行反应。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1或试剂R2中的缓冲液具体为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2还包括防腐剂、稳定剂中的一种或多种；所述试剂R1还包括防腐剂、稳定剂、表面活性剂中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1或试剂R2中的防腐剂具体为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、硫柳汞钠、Prolin300中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1或试剂R2中的稳定剂具体为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA、甘露醇中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的表面活性剂具体为TWEEN系列表面活性剂、SPAN系列表面活性剂、TRITON系列表面活性剂、SDS系列表面活性剂、氯化胆碱、甘胆酸钠中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中，聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2-微球蛋白抗体的浓度为0.05-0.30％。
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