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CN108333368A - 一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法 - Google Patents

一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法 Download PDF

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CN108333368A CN201810123018.9A CN201810123018A CN108333368A CN 108333368 A CN108333368 A CN 108333368A CN 201810123018 A CN201810123018 A CN 201810123018A CN 108333368 A CN108333368 A CN 108333368A
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SHENZHEN CITY BOLAOTE BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法。该试剂盒采用特定的微球偶联物封闭试剂替代传统的封闭剂，能够准确、定量、快速、灵敏的检测人粪便中的钙卫蛋白。

Description

一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法。
背景技术
钙卫蛋白是由两条分子量为14kD的重链和一条分子量为8kD的轻链以共价键连接的钙结合蛋白质异三聚体组成，是中性粒细胞和活化的巨噬细胞质中重要的蛋白质，在许多炎症情况下含量增加。作为一种肠炎症标志物它可以清楚的区分器质性炎症性疾病IBD和功能性疾病IBS，可以作为一种评价炎性肠病的活动性指标，评估炎性肠病黏膜，评价药物治疗作用，治愈和预测疾病复发情况。常规内镜检查和活检组织学分析为侵入性检查，铟标志白细胞为放射性元素这均对患者健康造成一定的影响，且试验操作较复杂；通过检测钙卫含量对其进行区分，能避免使用费用昂贵的和侵入性的结肠镜检查。
目前，检测钙卫蛋白含量的方法主要有酶联免疫法和胶体金层析法。其中，采用酶联免疫法的德国Buhlmann Laboratories AG钙卫蛋白试剂盒，该试剂盒能准确的测试粪便中钙卫蛋白的含量，但ELISA需要洗板，孵育，加酶和底物对温度环境严格，操作繁琐不能现场检测，测试时间长。厦门为正生物科技有限公司制备的钙卫蛋白检测试剂盒采用有胶体金法测试钙卫蛋白含量，由于胶体金颗粒与被标记的蛋白是靠静电作用结合，结合不稳定易受环境的干扰，灵敏度低，无法定量检测。而且，现有的这些检测试剂盒对粪便中的钙卫蛋白进行检测前，通常需要提取液将粪便溶解、震荡10分钟以上，震荡提取时间较长。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法。本发明采用特定的微球偶联物封闭试剂替代传统的封闭剂制得的试剂盒能够准确、定量、快速、灵敏的检测人粪便中钙卫蛋白的含量，使得整个检测过程仅需11min。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒，包括盒体本身和位于试剂盒中的检测试纸条；所述检测试纸条包括底板以及依次设置在底板上的样品垫、结合垫1、结合垫2、反应膜和吸水纸；
所述结合垫1包被有第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物和生物素标记的第二钙卫蛋白抗体；
所述结合垫2包被有亲和素；
所述反应膜上按层析方向依次设置检测T线和质控C线，所述反应膜上T线位置所述检测T线包被生物素-牛血清白蛋白偶联物或生物素-鸡卵清白蛋白偶联物，所述质控C线上包被羊抗鼠IgG抗体；
所述抗钙卫蛋白抗体荧光微球偶联物由如下方法制备得到：
将活化的荧光微球与第一抗钙卫蛋白抗体偶联，然后用封闭剂封闭，获得所述第一抗钙卫蛋白抗体荧光微球偶联物，所述封闭剂为包含所述封闭剂为包含1～3wt％明胶、2～4wt％NH2-PEG和0.5～1wt％海藻糖的25～50mM MES缓冲液。
其中，第一抗钙卫蛋白抗体和第二钙卫蛋白抗体均为鼠源抗体，可以是多抗也可以是单抗，两种抗体都可以和钙卫蛋白结合，且识别钙卫蛋白的抗原表位不同。
本发明试剂盒的检测原理为：
当待测粪便样本中存在钙卫蛋白时，随着层析作用，待测样本经过结合垫1时，与结合垫上的第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物和生物素标记的第二抗体结合，形成夹心复合物：第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物—钙卫蛋白—生物素标记的第二抗钙卫蛋白抗体；随着层析作用，经过结合垫2时，该夹心复合物上的生物素与结合垫2上的亲和素结合，形成第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物—钙卫蛋白—生物素标记的第二抗钙卫蛋白抗体—亲和素复合物，所述结合亲和素的复合物在经过反应膜时，被反应膜检测T线包被的bi-BSA偶联物(或bi-OVA)捕获。过量的第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物经过质控线C时被质控C线上包被的羊抗鼠IgG抗体捕获，检测T线和质控C线经激光激发，产生荧光信号，通过仪器读取获得信号反应值。将检测得到的信号反应值代入预设的标准曲线中，计算获得待测样本中钙卫蛋白的浓度。
本发明还提供了基于本发明提供的试剂盒的非用于疾病诊断和治疗目的的检测方法，包括如下步骤：
取钙卫蛋白标准品，制成一定浓度梯度的标准品样本，取标准品样本滴加到本发明试剂盒中的检测试试纸条的样品垫上，室温放置10min。将检测试纸条插入专用荧光定量检测仪读取钙卫蛋白的含量，以检测线T线的荧光强度值(AT)与质控线C线的荧光强度值(AC)的比值(AT/AC)为纵坐标，以钙卫蛋白标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线；
取待测样品滴加到本发明试剂盒中的检测试纸条的样品垫上，室温放置10min，将检测试纸条插入专用荧光定量检测仪读取试纸条待测样本的荧光强度，根据标准曲线，获得待测样品中钙卫蛋白含量。
作为优选，本发明所述的检测方法中，建立标准曲线时采用的钙卫蛋白标准品样本中钙卫蛋白的浓度为2000μg/g 1600μg/g、1200μg/g、600μg/g、300μg/g、100μg/g、30μg/g、10μg/g、0μg/g。
作为优选，在绘制标准曲线时，采用的检测试纸条为同一批次生产的试纸条，每个浓度测试6次。
将待测样本的荧光强度值代入上述标准曲线可计算获得待测样本中钙卫蛋白的浓度。
本发明中，结合垫2上包被亲和素，其作用在于将生物素化抗体与生物素-牛血清白蛋白偶联物(或生物素-鸡血清白蛋白偶联物)结合。具体地，待测样本经过结合垫1时获得夹心复合物，即第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物—钙卫蛋白—生物素标记的第二抗钙卫蛋白抗体，然后以结合垫2上的亲和素为“桥”，将该夹心复合物与反应膜检测T线上的生物素-牛血清白蛋白偶联物(或生物素-鸡卵清白蛋白偶联物)连接，达到多层放大效果。
本发明提供的具体实施例中，所述封闭剂为包含2wt％明胶、2wt％NH2-PEG和0.5wt％海藻糖的50mM MES缓冲液。
作为优选，所述结合垫1和所述结合垫2为玻璃纤维素膜；所述反应膜为硝酸纤维素膜。
作为优选，所述底板为粘性PVC底板。
作为优选，本发明所述试剂盒，还包括粪便提取缓冲液，所述粪便提取缓冲液为包含2.5～4.0M尿素、0.025～0.05M CaCl2、0.1～0.5wt％SDS、10～20mM EDTA、0.25M～0.5M柠檬酸、0.02～0.05wt％叠氮钠和1.25-5wt％BSA的pH为8.0的0.25～0.5M Tris-HCl缓冲液。
本发明提供的具体实施例中，所述粪便提取缓冲液为包含2.5M尿素、0.05MCaCl2、0.25wt％SDS、20mM EDTA、0.5M柠檬酸、0.05％叠氮钠和2wt％BSA的pH为8.0的0.5MTris-HCl缓冲液。
本发明研究发现，采用本发明试剂盒中的提取液与待测粪便样本混匀后进行测试，钙卫蛋白的提取率为93.4～100.2％，效果远远优于采用生理盐水提取然后进行测试的结果。表明本发明试剂盒能够快速、高效地从待测粪便样本中提取钙卫蛋白，进而实现了快速、准确的检测人粪便中钙卫蛋白含量的目的。
本发明还提供了所述试剂盒的制备方法，包括：
样品垫的制备：用含5-10％的海藻糖的0.25～0.5M的Tris-HCl缓冲液浸泡样品垫5-10min，37℃干燥2h，密封储存，备用；
反应膜的制备：将BSA-bi包被到硝酸纤维素膜上作T线，将稀释羊抗鼠IgG包被到硝酸纤维素膜上作C线，37℃干燥16-22h，密封储存，备用；
结合垫1的制备：分别制备第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物和生物素标记的第二抗钙卫蛋白抗体，然后将其喷涂在玻璃纤维膜上，37℃干燥2h密封储存，备用；
结合物垫2的制备：将亲和素喷涂在玻璃纤维素膜上，37℃干燥2h密封储存备用；
检测试纸条的组装：将粘性PVC底板上依次搭接样品垫，结合物垫1，结合物垫2硝酸纤维素膜，缓冲垫，吸水纸并裁成一定宽度，制得所述检测试纸条；
将所述粪便提取缓冲液装入试剂瓶中，与制得的检测试纸条一同置于盒体内，得到所述试剂盒。
在一些实施例中，所述结合垫1的制备中，所述第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物由如下方法制备得到：
选取粒径为200-300nm的荧光微球，用pH为6.0-6.5的MES缓冲液洗涤荧光微球，加入NHS和EDC，室温混匀反应，得到活化的荧光微球；
在上述活化的微球中加入第一抗钙卫蛋白抗体，室温混匀反应，然后用封闭剂封闭，获得所述第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物；所述封闭剂为包含1～3wt％明胶、2～4wt％NH2-PEG和0.5～1wt％海藻糖的0.25～0.5M MES缓冲液。
在一些实施例中，所述结合垫1的制备中，所述生物素标记的第二抗钙卫蛋白抗体由Sμlfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒(购自thermo公司)将鼠源第二抗钙卫蛋白抗体生物素化制备得到。
本发明所述试剂盒采用特定的微球偶联物封闭试剂(包含1～3wt％明胶、2～4wt％NH2-PEG和0.5～1wt％海藻糖的0.25～0.5M MES缓冲液)替代传统的封闭剂制得的试剂盒，能够准确、定量、快速、灵敏的检测人粪便中的钙卫蛋白，且整个检测过程仅需11min。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明试剂盒中的检测试纸条；
图2为采用本发明试剂盒中的检测试纸条的检测原理图；
图3为本发明试剂盒与瑞士Buhlmann Laboratories AG公司试剂盒对钙卫蛋白含量进行检测的相关性曲线图。
具体实施方式
本发明公开了一种人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明试剂盒的制备
使用thermo公司EZ-Sμlfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒牛血清白蛋白(BSA)生物素化，透析纯化得到Bi-BSA偶联物暂存备用。
1.样品垫的制备：用含5-10％海藻糖的0.25～0.5M Tris-HCl缓冲液浸泡样品垫5-10min，37度干燥2h密封储存。
2.反应膜的制备：将生物素-牛血清白蛋白偶联物包被到硝酸纤维素膜上作T线，将稀释后的羊抗鼠IgG抗体包被到硝酸纤维素膜上作C线，37℃干燥16-22h，密封储存，备用。
3.结合垫1的制备
3.1抗钙卫蛋白抗体生物素化偶联物的制备
使用thermo公司Sμlfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒将另一株鼠源抗钙卫蛋白抗体生物素化。
3.2第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物的制备
将第一抗钙卫蛋白抗体(购于珠海博美生物科技有限公司)用pH为7.5的50mM MES缓冲液透析三遍备用。
选取粒径为200nm的荧光微球，用pH为6.0的MES缓冲液将荧光微球洗涤两次，10000r/min离心，用pH6.0的MES缓冲液重悬，然后按每100μl微球加入0.2-0.4μgNHS和0.2-0.4μgEDC加入NHS和EDC，室温混匀反应30-40min，得到活化的荧光微球；
将上述活化的荧光微球10000r/min离心，去上清，用pH＝7.0的50mM MES缓冲液离心洗涤2遍，按每100μl微球加入0.1-0.2mg第一抗钙卫蛋白抗体加入透析好的第一抗钙卫蛋白抗体，室温混匀反应1-2h；然后加入封闭剂进行封闭，获得所述抗钙卫蛋白抗体荧光微球偶联物；其中，所述封闭剂为包含2wt％明胶、2wt％NH2-PEG和0.5wt％海藻糖的50mM MES缓冲液；
将上述制备好的第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物用pH为8.5的10mmol/L硼酸溶液10000r/min洗涤两遍，加保存液保存，所述保存液为1％-5％BSA，1％-2％海藻糖的pH＝8.5的10mmol/L硼酸溶液。
3.3.生物素标记的第二抗钙卫蛋白抗体的制备
使用EZ-Sμlfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒(购自thermo公司)将鼠源第二抗钙卫蛋白抗体生物素化，制得生物素标记的第二抗钙卫蛋白抗体。
3.4将抗钙卫蛋白抗体荧光微球偶联物和抗钙卫蛋白抗体生物素化偶联物与以适当浓度喷在玻纤上，37度干燥2h密封储存备用。
4.结合物垫2的制备
将亲和素以5.2μg/ml喷在玻璃纤维素膜上，37℃干燥2h，密封储存，备用。
5.反应膜的制备
用包被液(含5％-10％海藻糖的PBS缓冲液)将生物素-牛血清白蛋白偶联物以1-2mg/ml的浓度包被到NC膜上作T线，稀释羊抗鼠IgG抗体至1-2mg/ml包被到NC膜上作C线，37℃干燥16-22h，密封储存，备用。
6.试纸条的组装
在粘性PVC底板上依次搭接上述制备好的样品垫，结合物垫1，结合物垫2、反应膜(硝酸纤维素膜)，吸水纸，裁成4mm宽度的试纸条，装卡，制得所述检测试纸条，如图1所示。
7.粪便提取缓冲液的配制
配制包含2.5尿素、0.05M CaCl2、0.25wt％SDS、20mM EDTA、0.5M柠檬酸、0.05wt％叠氮钠和2wt％BSA的pH为8.0的0.5M Tris-HCl缓冲液。
将配制好的粪便提取缓冲液装入试剂瓶中，与上述制好的检测试纸条一同置于盒体内，得到所述试剂盒。
实施例2本发明试剂盒的制备
该试剂盒中检测试纸条的制备中步骤3结合垫1的制备，采用的封闭剂为2wt％明胶(w/w)、2wt％NH2-PEG和0.5wt％海藻糖的0.5M MES缓冲液，其他步骤与实施例1相同。
实施例3本发明试剂盒的制备
该试剂盒中粪便提取缓冲液的配方为：4.0M尿素、0.025M CaCl2、0.5wt％SDS、10mM EDTA、0.5M柠檬酸、0.05叠氮钠和5wt％BSA的pH为8.0的0.25M Tris-HCl缓冲液，其他步骤与实施例1相同。
实施例4本发明试剂盒与瑞士Buhlmann Laboratories AG公司试剂盒的相关性测试
用取样装置将50mg待测粪便样本放入试管中，加入样本净重的49倍的提取缓冲液(实施例1试剂盒中的粪便提取缓冲液)中混匀，作为待测样本溶液。将待测样本稀释为浓度不同的样本1～样本20，分别采用实施例1试剂盒中的检测试纸条和瑞士BuhlmannLaboratories AG公司的粪便钙卫蛋白检测试剂盒(酶联免疫法)同时进行测试。
本发明试剂盒的测试方法：
取钙卫蛋白标准品制备钙卫蛋白的浓度为2000μg/g 1600μg/g、1200μg/g、600μg/g、300μg/g、100μg/g、30μg/g、10μg/g、0μg/g的标准品样本。分别取上述标准品样本滴加到本发明试剂盒中的检测试试纸条的样品垫上，室温放置10min，每个样本浓度测试6次，然后将检测试纸条插入专用荧光定量检测仪读取钙卫蛋白的含量，以检测线T线的荧光强度值(AT)与质控线C线的荧光强度值(AC)的比值(AT/AC)为纵坐标，以钙卫蛋白标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线；
取上述待测样本溶液(样本1～样本20)，分别滴加到本发明试剂盒中的检测试纸条的样品垫上，室温放置10min，每个样本浓度测试6次，然后将检测试纸条插入专用荧光定量检测仪读取试纸条待测样本的荧光强度，根据标准曲线，获得待测样品中钙卫蛋白含量。同时，按照瑞士Buhlmann Laboratories AG公司的粪便钙卫蛋白检测试剂盒(酶联免疫法)的方法对样本1～20进行检测，检测结果如表1所示。
表1本发明试剂盒与瑞士Buhlmann Laboratories AG公司试剂盒的相关性
以实施例1的试剂盒中的检测试纸条的测试结果为横坐标，以瑞士BuhlmannLaboratories AG公司的粪便钙卫蛋白检测试剂盒测试结果为纵坐标建立相关性曲线，见图3。
结果显示，在钙卫蛋白浓度为8-2100μg/g的范围内，本发明实施例1试剂盒中的检测试纸条与瑞士Buhlmann Laboratories AG公司的粪便钙卫蛋白检测试剂盒(酶联免疫法)相比，测试结果具有良好的一致性，相关系数r2＝0.9687，表明本发明检测试纸条的测试结果准确可靠，可以有效作为临床检验的依据。
实施例5本发明试剂盒精密度测试
选取高、中、低值钙卫蛋白含量的3份粪便，经Buhlmann Laboratories AG粪便钙卫蛋白检测试剂盒测定钙卫蛋白的含量分别为1500.2μg/g,603.0μg/g,42.8μg/g。采用本发明实施例1的试剂盒进行检测，在同次试验内每份样品重复测定10次，分别计算平均值、标准差，计算试验内变异系数CV(％)；每天测定1次，连续测定10天，计算试验间CV(％)值。计算公式为：CV(％)＝标准差/平均值×100％，结果见表2。
表2 精密度测试结果
注：实验内是指在一次试验中，对相同试验反复测试多次；实验间指相同试验在不同时间内重复测试。
结果显示，本发明试剂盒满足免疫类测定项目通常精密度＜10％的要求，精密度良好。
实施例6本发明试剂盒的准确度测试
选择用Buhlmann Laboratories AG粪便钙卫蛋白检测试剂盒测定的两份粪便样本，钙卫蛋白浓度分别为200μg/g和1200μg/g，提取后的上清液分别以1：4、1：1和9：1比例混合成3份不同浓度的样本溶液，钙卫蛋白浓度的理论值分别为1000、700和300μg/g。采用本发明实施例1的试剂盒进行检测，计算检测值与理论值的一致性，即回收率。计算公式为:
回收率＝测试值/理论值×100％
回收率计算结果见表3。
表3 回收率检测结果
测试 低血清(μl) 高血清(μL) 理论值(μg/g) 测试值(μg/g) 回收率(μg/g)
1 2 8 1000 1020 102
2 5 5 700 690.2 98.6
3 9 1 300 273.3 91
结果显示，本发明试剂盒的回收率在98.6％-102％之间，准确度高。
实施例7本发明提取缓冲液与常规提取液的效果比较
该实施例将本发明试剂盒中的粪便提取缓冲液与Buhlmann公司的提取装置中的抽提液(0.9％NaCl溶液)的提取效果进行比较。
用瑞士Buhlmann Laboratories AG公司的粪便钙卫蛋白检测试剂盒的确定的10份粪便样本，其中钙卫蛋白的理论浓度为：25.8μg/g、61.2μg/g、200.5μg/g、312.3μg/g、520.7μg/g、580.6μg/g、832.1μg/g、1212.5μg/g、1424.6μg/g、1920.5μg/g，称取50mg粪便按1：50(g/ml)分别加入上述两种提取液。然后用实施例1试剂盒中的检测试纸条进行测试，结果见表4。
表4 本发明试剂盒的提取液与常规提取液的测试结果比较
结果显示，采用本发明试剂盒中的提取液与粪便混匀后1min内进行测试，钙卫蛋白的提取率为93.4～100.2％，效果远远优于Buhlmann公司的提取装置Cap中的抽提液1min内立刻测试和震荡15min的测试结果。
实施例8本发明封闭剂与常规封闭剂的效果比较
用含10％BSA的pH为7.2的0.02M的磷酸缓冲液作为封闭剂，其他步骤同实施例1，制备得到对照试剂盒1。
采用本发明实施例1的试剂盒和对照试剂盒1同时进行测试，测试样本为BuhlmannLaboratories AG试剂盒确定的15个临床阴性样本。测试结果见表5表5 本发明封闭剂与常规封闭剂的检测结果比较
注：“-”表示阴性，“±”表示弱阳，“+”表示阳性。
结果显示，采用本发明实施例1的试剂盒对15个临床阴性样本的测试结果全部为阴性，采用含10％BSA的pH为7.2的0.02M的磷酸缓冲液作为封闭剂的对照试剂盒1有7个样品为假阳性，假阳性率为42％。
取实施例2～3的试剂盒进行实施例4～8的测试试验，结果与实施例1相同或相近，无显著差异(p>0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒，其特征在于，包括盒体本身和位于试剂盒中的检测试纸条；所述检测试纸条包括底板以及依次设置在底板上的样品垫、结合垫1、结合垫2、反应膜和吸水纸；
所述结合垫1包被有第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物和生物素标记的第二抗钙卫蛋白抗体；
所述结合垫2包被有亲和素；
所述反应膜上按层析方向依次设置检测T线和质控C线，所述反应膜上T线位置所述检测T线包被生物素-牛血清白蛋白偶联物或生物素-鸡卵清白蛋白偶联物，所述质控C线上包被羊抗鼠IgG抗体；
所述第一抗钙卫蛋白抗体荧光微球偶联物由如下方法制备得到：
将活化的荧光微球与第一抗钙卫蛋白抗体偶联，然后用封闭剂封闭，获得所述第一抗钙卫蛋白抗体荧光微球偶联物，所述封闭剂为包含1～3wt％明胶、2～4wt％NH2-PEG和0.5～1wt％海藻糖的25～50mM MES缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭剂为包含2wt％明胶、2wt％NH2-PEG和0.5wt％海藻糖的50mM MES缓冲液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述结合垫1和所述结合垫2为玻璃纤维素膜。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜。
5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括粪便提取缓冲液，所述粪便提取缓冲液为包含2.5～4.0M尿素、0.025～0.05M CaCl2、0.1～0.5wt％SDS、10～20mMEDTA、0.25M～0.5M柠檬酸、0.02～0.05wt％叠氮钠和1.25-5wt％BSA的pH为8.0的0.25～0.5M Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述粪便提取缓冲液为包含2.5M尿素、0.05M CaCl2、0.25wt％SDS、20mM EDTA、0.5M柠檬酸、0.05％叠氮钠和2wt％BSA的pH为8.0的0.5M Tris-HCl缓冲液。
7.权利要求5或6任意一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
样品垫的制备：用含5-10％的海藻糖的0.25～0.5M的Tris-HCl缓冲液浸泡样品垫5-10min，37℃干燥2h，密封储存，备用；
反应膜的制备：将BSA-bi包被到硝酸纤维素膜上作T线，将稀释羊抗鼠IgG包被到硝酸纤维素膜上作C线，37℃干燥16-22h，密封储存，备用；
结合垫1的制备：分别制备第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物和生物素标记的第二抗钙卫蛋白抗体，然后将其喷涂在玻璃纤维膜上，37℃干燥2h密封储存，备用；
结合物垫2的制备：将亲和素喷涂在玻璃纤维素膜上，37℃干燥2h密封储存备用；
检测试纸条的组装：将粘性PVC底板上依次搭接样品垫，结合物垫1，结合物垫2硝酸纤维素膜，缓冲垫，吸水纸并裁成一定宽度，制得所述检测试纸条；
将所述粪便提取缓冲液装入试剂瓶中，与制得的检测试纸条一同置于盒体内，得到所述试剂盒。
8.根据权利要求7的制备方法，其特征在于，所述结合垫1的制备中，所述第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物由如下方法制备得到：
选取粒径为200-300nm的荧光微球，用pH为6.0-6.5的MES缓冲液洗涤荧光微球，加入NHS和EDC，室温混匀反应，得到活化的荧光微球；
在上述活化的微球中加入第一抗钙卫蛋白抗体，室温混匀反应，然后用封闭剂封闭，获得所述第一抗钙卫蛋白抗体-荧光微球偶联物；所述封闭剂为包含1～3wt％明胶、2～4wt％NH2-PEG和0.5～1wt％海藻糖的25～50mM MES缓冲液。
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