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CN105388292A - 试剂盒及联合检测pct、crp及il-6的方法 - Google Patents

试剂盒及联合检测pct、crp及il-6的方法 Download PDF

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CN105388292A
CN105388292A CN201510673472.8A CN201510673472A CN105388292A CN 105388292 A CN105388292 A CN 105388292A CN 201510673472 A CN201510673472 A CN 201510673472A CN 105388292 A CN105388292 A CN 105388292A
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pct
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CN201510673472.8A
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马岚
蒋宇扬
吴峰
岑瑜
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Shenzhen Graduate School Tsinghua University
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Shenzhen Graduate School Tsinghua University
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Abstract

本发明公开了一种联合检测PCT、CRP和IL-6的方法及其试剂盒。试剂盒包括第一和第二包被膜，第一包被膜的一端与第二包被膜的一端相连，第一包被膜中的至少一块区域包被有标记抗体混合物，标记抗体混合物包含第一、第二和第三标记抗体，第二包被膜包含分离的第一、第二、第三和第四区域，第一、第二和第三区域分别包被有第一、第二和第三包被抗体，第一包被抗体和第一标记抗体能够特异性结合第一抗原，第二包被抗体和第二标记抗体能够特异性结合第二抗原，第三包被抗体和第三标记抗体能够特异性结合第三抗原，第四区域包被有抗抗体，抗抗体能够特异性结合第一、第二和第三标记抗体。利用该试剂盒能够同时快速准确地检测PCT、CRP和IL-6。

Description

试剂盒及联合检测PCT、CRP及IL-6的方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体地，本发明涉及能够同时检测多种生物物质的试剂盒及其应用，更具体的，本发明涉及一种试剂盒以及一种联合检测降钙素原、C反应蛋白及白细胞介素6的方法。
背景技术
急性时相蛋白(acutephaseprotein，APP)是与感染性炎症紧密相关的一类特异性蛋白。近年来，大量研究表明，多种正负性急性期蛋白与感染性炎症均具有显著的相关性，且比检测白细胞、血沉、酶活性与含量变化等方法更加准确和可靠，可作为感染性炎症的炎症标志物。
C反应蛋白(Creactiveprotein，CRP)由肝脏合成，是一种典型的急性时相蛋白，正常血清中其含量极微，在炎症急性期、恶性肿瘤、局部缺血、组织损伤等患者的血浆中，CRP含量可以千倍增加。在炎症初期4h～6h内升高，36h～50h达到高峰。感染一旦得到控制，其含量即会迅速恢复至正常水平。研究发现，细菌性感染才会致使CRP水平升高，当超过140mg/L时可基本确定细菌性感染的存在。且其水平与感染程度呈正相关；而当病毒感染时，CRP水平一般不升高。对于急性感染性疾病的诊断，检测血清CRP较白细胞总数更敏感、更准确，更可靠。
降钙素原(procalcitonin，PCT)是降钙素的前体，属糖蛋白，半衰期25h～30h，在体内外稳定性好。生理情况下由甲状腺的C细胞产生，但其含量极低(小于0.1μg/L)。当其含量大于0.5μg/L时视为异常。研究发现PCT是细菌或真菌感染早期的一个诊断指标，感染时才升高，在非感染时其水平一般并不升高，且升高值的大小与感染的严重程度密切相关。通过对细菌性感染和病毒性感染的比较分析发现，细菌感染时，血清PCT水平明显升高，而在病毒感染时，血清PCT水平却无明显升高。对CRP和PCT的比较分析发现，PCT的升高早于CRP的上升。在局部感染时，PCT一般并不升高，CRP却升高。这些研究表明在非全身感染时，CRP是一个重要的观察指标；在全身感染时，PCT是一个较好的指标。
白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)是由212个氨基酸组成的糖蛋白，机体受炎症刺激后由T细胞、B细胞、单核巨噬细胞及内皮细胞等分泌。IL-6是一种多效性细胞因子，它有多种生物学活性，包括介导前感染反应和细胞保护功能。IL-6参与许多疾病的发生和发展，其血浆水平与炎症、病毒感染、自身免疫疾病密切相关，它的变化比CRP更早。目前认为是炎症、脓毒症的早期敏感性“警示”标志物。
由上可知，联合检测PCT、IL-6及CRP等炎症标志物，对于感染/脓毒症等的早期快速精确诊断、病程监测、疗效跟踪等均具有重要支撑作用。然而，目前尚缺少可以同时快速、定量准确检测上述三种指标的联检试剂。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种商业选择。
依据本发明的一方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包括：第一包被膜和第二包被膜，所述第一包被膜的一端与所述第二包被膜的一端相连，所述第一包被膜中的至少一块区域包被有标记抗体混合物，所述标记抗体混合物包含第一标记抗体、第二标记抗体和第三标记抗体，所述第二包被膜包含分离的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域，所述第一区域比所述第二区域靠近所述第一包被膜，所述第二区域比所述第三区域靠近所述第一包被膜，所述第三区域比所述第四区域靠近所述第一包被膜，所述第一区域包被有第一包被抗体，所述第一包被抗体和所述第一标记抗体能够特异性结合第一抗原，所述第二区域包被有第二包被抗体，所述第二包被抗体和所述第二标记抗体能够特异性结合第二抗原，所述第二区域包被有第三包被抗体，所述第三包被抗体和所述第三标记抗体能够特异性结合第三抗原，所述第四区域包被有抗抗体，所述抗抗体能够特异性结合所述第一标记抗体、所述第二标记抗体和所述第三标记抗体。所称的“包被”为免疫学术语，包含固定和/或吸附之意。
利用该试剂盒，基于针对多种抗原，对标记、抗各种抗原的标记抗体和包被抗体的分子特性的研究，通过优化双抗体夹心免疫反应的条件，能够同时检测多种抗原物质。根据本发明的实施例，所称第一抗原、第二抗原和第三抗原分别为PCT、CRP和IL-6，利用本发明的这一试剂盒，能够同时快速且准确地定量检测这三种物质。
根据本发明的实施例，本发明的这一方面的试剂盒还能够具有以下附加技术特征至少之一：
本发明的试剂盒对第一包被膜中的包被有标记抗体混合物的区域的大小不作限制，可以是整个第一包被膜，也可以是第一包被膜的一部分。根据本发明的一个实施例，由于利用该试剂盒检测时，待测样本的加入位置为第一包被膜中的包被有标记抗体混合物的区域，所以也将第一包被膜称为样品垫。
同样的，对第二包被膜中的分离的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域各自的大小也不作特别限制。根据本发明的一个实施例，如图1所示，试剂盒的第一包被膜和第二包被膜都是长方形的，第一包被膜的一条宽边和第二包被膜的一条宽边相粘，第一包被膜中的包被有标记抗体混合物的区域为长约2cm、宽约3mm的长方形，第二包被膜中的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域都为线状，第一区域被称为检测线1(T1线)，第二区域被称为检测线2(T2线)，第三区域被称为检测线3(T3线)，第四区域被称为质控线(C线)，两个区域所在的线状平面都平行于两包被膜的粘结边，所说的线状第一、第二、第三或者第四区域的宽度大约为0.5-1mm、长度为膜的宽。
该试剂盒利用第一膜和第二膜分别包被有能特异性结合同一种抗原的标记抗体和包被抗体，加入待测样品后利用膜层析，在第二膜上形成双抗体夹心复合物，基于检测复合物中的标记抗体上带的标记，例如荧光标记的荧光强度来对样品中的所说的抗原进行定量。这一试剂盒能够明显的提高检测的特异性，缩短检测所需时间。通过标记抗体，能够明显的提高检测灵敏度。根据本发明的实施例，当所称第一抗原、第二抗原和第三抗原分别为PCT、CRP和IL-6，该试剂盒为能够联合检测PCT、CRP和IL-6的试剂盒，利用该试剂盒能够实现对PCT、CRP和IL-6的快速和高灵敏测定，具有如下优点：灵敏度高、特异性强、快速、简便，可实现客观化测定。根据本发明的实施例，利用该试剂盒的联合检测PCT、CRP和IL-6，检测PCT的灵敏度达0.05ng/mL，检测CRP的灵敏度达0.01ug/mL，检测IL-6的灵敏度达10pg/mL。
根据本发明的一个实施例，试剂盒中的第二包被膜的另一端连接有吸水垫。吸水垫可为强吸水物质，这样在检测液态样品时能够给予定向动力使液态样品从第一包被膜定向层析至第二包被膜。
根据本发明的一个实施例，所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水垫均固定在同一固相基质上。固相基质主要为提供承载，方便操作，固相基质的类型不作特别限定，可以为不会与待测样品发生反应或者不影响抗原抗体结合的惰性材料，比如纸板、塑料板等。
根据本发明的一个实施例，所述第一包被膜为玻璃纤维素膜，所述第二包被膜为硝酸纤维素膜(NC膜)。玻璃纤维膜呈化学惰性，不含粘合剂，采用100％硼硅酸玻璃纤维制造而成，其上包被有荧光标记的第一抗体，利于第一抗体与待测样品中的目标抗原发生特异性结合。而NC膜本身是已经添加了表面活性剂来改善亲水能力，而且已经存在有一定的缓冲系统，具有毛细纤维结构，能吸附比同等纤维素滤纸更多的水分，流速快，耐高温，利于其上包被的第二抗体与前述的荧光标记第一抗体-抗原发生特异性结合反应，激发荧光。
根据本发明的实施例，所述标记抗体混合物中的第一、第二和第三标记抗体中带有的标记均为荧光标记，例如为荧光微球标记。第一标记抗体、第二标记抗体和第三标记抗体与荧光微球标记通过肽键共价结合。这样，提高标记物的稳定性，避免了抗体空间位阻的影响，有利于提高灵敏度和特异性。根据本发明的一个实施例，所称荧光微球直径在纳米级范围内，其直径范围为10-500nm，较佳地为20-300nm，其上负载有荧光物质，是受外界能量刺激能激发出荧光的固体微粒。所述荧光微球负载的荧光物质为掺杂荧光染料、稀土络合物、量子点等的转换荧光纳米材料。所述荧光微球负载的荧光物质通过高分子聚合物修饰有活性官能基团，所述活性官能基团为羧基，氨基，羟基，巯基。根据本发明的一个实施例，所述活性官能基团具体为羧基，所述第一标记抗体、第二标记抗体和第三标记抗体分别为待标记的第一抗体、第二抗体和第三抗体和羧基修饰的荧光微球以肽键共价结合形成的聚合体。
根据本发明的实施例，第一抗原为PCT，所述第一标记抗体为荧光微球标记的抗PCT抗体，第二抗原为CRP，所述第二标记抗体为荧光微球标记的抗CRP抗体，所述第三抗原为IL-6，所述第三标记抗体为荧光微球标记的抗IL-6抗体，所述第一包被抗体为能够特异性结合到不同于所述第一标记抗体特异性结合的PCT表位的抗PCT抗体，所述第二包被抗体为能够特异性结合到不同于所述第二标记抗体特异性结合的CRP表位的抗CRP抗体，所述第三包被抗体为能够特异性结合到不同于所述第三标记抗体特异性结合的IL-6表位的抗IL-6抗体。每种抗原的标记抗体和包被抗体，都可以特异性结合该种抗原，较佳地，标记抗体和包被抗体能与该抗原的不同表面决定簇特异性结合，这样利于该种抗原的准确检测或者定量。
这里，所称的第一标记抗体、第二标记抗体和第三标记抗体，即抗PCT标记抗体、抗CRP标记抗体和抗IL-6标记抗体可为单克隆抗体，或者为多克隆抗体。所称的第一包被抗体、第二包被抗体和第三包被抗体，即抗PCT包被抗体、抗CRP包被抗体和抗IL-6包被抗体可为单克隆抗体，或者为多克隆抗体。根据本发明的实施例，所述第一标记抗体和第一包被抗体为不同的抗PCT单克隆抗体，所述第二标记抗体和所述第二包被抗体为不同的抗CRP单克隆抗体，所述第三标记抗体和所述第三包被抗体为不同的抗IL-6单克隆抗体。如此，检测同种抗原的包被抗体和标记抗体与该抗原的不同表面决定簇特异性结合，利于准确检测该抗原。该试剂盒是基于对荧光标记、抗原和抗体特性的研究，通过选择适合的荧光标记与特异性的抗体进行定向共价化学偶联，获得荧光标记抗体分析，并通过优化双抗体夹心免疫反应的各种条件，制备得到上述能够同时检测这三种物质的试剂盒。
根据本发明的一个实施例，所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体，其能够与第一、第二和第三标记抗体特异性结合，即与多余的标记抗体结合形成免疫复合物，激发荧光，得以能够定性和/或定量检测该免疫复合物。
依据本发明的另一方面，提供上述本发明一方面的或者任一实施例中的试剂盒在联合检测PCT、CRP和IL-6中的用途。前面对本发明一方面或者任一实施例中的试剂盒的优点和技术特征的描述，仍适用于该试剂盒的用途，在此不再赘述。
依据本发明的又一方面，本发明提供一种联合检测PCT、CRP和IL-6的方法，该方法包括：将待测样本加到上述本发明一方面或者任一实施例中的试剂盒中的第一包被膜中的包被有标记抗体混合物的区域；分别检测所述试剂盒中的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的荧光强度，对应获得第一区域荧光强度、第二区域荧光强度、第三区域荧光强度和第四区域荧光强度；比较比值与预定阈值的大小，以确定所述待测样本是否为PCT、CRP和/或IL-6阳性样本，其中，PCT检测的比值＝第一区域荧光强度/第四区域荧光强度，CRP检测的比值＝第二区域荧光强度/第四区域荧光强度，IL-6检测的比值＝第三区域荧光强度/第四区域荧光强度，PCT检测的预定阈值是通过利用所述试剂盒检测多个PCT正常样本或者多个PCT阳性样本来确定的，CRP检测的预定阈值是通过利用所述试剂盒检测多个CRP正常样本或者多个CRP阳性样本来确定的，IL-6检测的预定阈值是通过利用所述试剂盒检测多个IL-6正常样本或者多个IL-6阳性样本来确定的。上述对本发明一方面或者任一实施例中的试剂盒的优点和技术特征的描述，仍适用于该检测方法，在此不再赘述。
第一包被膜中的包被有标记抗体混合物区域为与待测样本中的目标抗原结合的区域，在本发明的一个实施例中，也将该区域称为加样端。
根据本发明的实施例，各种抗原的预定阈值，是通过利用该试剂盒，测定多个正常样本，即阴性样本和/或多个阳性样本来确定的，是多个已知阴性样本的比值的均值，或者为多个已知阳性样本的比值的均值，利用某种抗原检测的预定阈值可以准确判断或者定量检测待测样本是该种抗原阳性样本还是阴性样本。根据本发明的一个实施例，在检测某一样本时，通过手持仪器检测荧光强度，分别获得第一区域荧光强度、第二区域荧光强度和第三区域荧光强度与第四区域荧光强度的比值，将各比值与各预定阈值即临界值比较，能够客观得到检测结果，而且该检测结果与市售检测PCT、CRP或者IL-6的荧光PCR试剂盒的检测结果一致。利用本发明的这一方面的检测方法，利用上述任一实施例中的试剂盒，能够实现快速、高灵敏度、高准确性以及强抗干扰的联合测定PCT、IL-6及CRP等炎症标志物，对于感染/脓毒症等的早期快速精确诊断、病程监测、疗效跟踪等均具有重要支撑作用，提高了感染/脓毒症检测治疗准确性，降低检测成本。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明的一个实施例中的试剂盒结构示意图。
图2是本发明的一个实施例中的联合检测PCT、CRP和IL-6的试剂盒的结构示意图。
图3是本发明的一个实施例中的联合检测PCT、CRP和IL－6的试剂盒检测值与浓度标准曲线示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中，自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。需要说明的，本文中所使用的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅为方便描述，不能理解为指示或暗示相对重要性，也不能理解为之间有先后顺序关系。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。在本文中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的荧光微球是购自BangsLaboratories,Inc.公司，产品目录号为FC02F/10930固含量为10mg/ml，为羧基修饰的荧光微球，该荧光微球平均直径为110nm。
下述实施例中所用的待标记抗PCT、CRP和IL-6抗体是购自云南大学单克隆抗体工程技术中心的编号为P-01、C-03、I6-02抗PCT、CRP和IL-6的单克隆抗体。
下述实施例中的抗PCT、CRP和IL-6包被抗体是购自云南大学单克隆抗体工程技术中心的编号为P-03、C-05、I6-01抗PCT、CRP和IL-6的单克隆抗体。
下述实施例中用于制作样品垫的玻璃纤维膜购自Millipore公司、商品目录号为GF-CP20300。
下述实施例中用于制作吸水垫的吸水纸购自Millipore公司、商品目录号为CF-SP22300。
下述实施例中用于制作包被膜的硝酸纤维素膜购自Millipore公司、商品目录号为Hi-FlowPlusHF135。
下述实施例中的pH为7.4的0.02MPBS缓冲液按照如下方法配制：称取2.3gNa2HPO4、0.524gNaH2PO4.H2O、8.77gNaCl溶于纯水，用纯水定容至1L，调pH至7.4，得到pH为7.4的0.02MPBS缓冲液。
下述实施例中的膜处理缓冲液按照如下方法配制：将Tween-20、BSA、蔗糖溶于上述pH为7.4的0.02MPBS缓冲液使Tween-20的质量百分含量为0.2％、BSA的质量百分含量为1％、蔗糖的质量百分含量为2％，调pH至7.4，得到膜处理缓冲液。
下述实施例中的50mMpH为8.5的硼砂缓冲液按照如下方法配制：称取1.9gNa2B4O7.10H2O溶于100ml纯水，调pH至8.5得到50mMpH为8.5的硼砂缓冲液。
下述实施例中的样品处理液按照如下方法配制：将Tween-20溶于上述pH为7.4的0.02MPBS缓冲液使Tween-20的质量百分含量为0.2％，调pH至7.4，得到样品处理液。
联合检测PCT、CRP和IL-6试剂盒的制备方法一般包括以下步骤：
(一)羧基修饰的荧光微球标记探针的制备
采用适合的羧基修饰的荧光微球，活化其表面的羧基后，采用共价偶联的方式分别将PCT、CRP和IL-6标记抗体定向连接到该羧基修饰的荧光微球表面。
(二)测试区T线和C线处抗体的包被
采用喷膜仪器，于包被膜测试区的T1线处喷涂PCT包被抗体，于包被膜测试区的T2线处喷涂CRP包被抗体，于包被膜测试区的T3线处喷涂IL-6包被抗体，于C线处喷涂羊抗鼠IgG抗体。
(三)样品垫处标记探针的包被
采用喷涂仪器，于样品垫特定位置处喷涂荧光微球标记的抗PCT、CRP和IL-6抗体混合物。
(四)试剂盒的组装成型
按照试剂盒的结构图，如见图2所示，于塑料支撑背板中间粘贴作为测试区的包被膜，于包被膜的T线端粘贴样品垫，C线端粘贴吸水垫。采用试纸分切机，将其分切为一定宽带的纸条，并装入夹片，用装有干燥剂的铝箔袋进行包装。
(五)抗原-抗体荧光免疫复合物的形成
于上述组装成型的反应板的加样端处加入待测样品，样品中的PCT与荧光微球标记的抗PCT标记抗体结合后层析到T1线处喷涂的抗PCT包被抗体，在T1线处形成包被抗体-抗原-荧光微球标记抗体免疫复合物，多余的荧光微球标记抗PCT抗体则在C线处与羊抗鼠IgG形成的荧光标记免疫复合物；样品中的CRP与荧光微球标记的抗CRP标记抗体结合后层析到T2线处喷涂的抗CRP包被抗体，在T2线处形成包被抗体-抗原-荧光微球标记抗体免疫复合物，多余的荧光微球标记抗CRP抗体则在C线处与羊抗鼠IgG形成的荧光标记免疫复合物。样品中的IL－6与荧光微球标记的抗IL－6标记抗体结合后层析到T3线处喷涂的抗IL－6包被抗体，在T3线处形成包被抗体-抗原-荧光微球标记抗体免疫复合物，多余的荧光微球标记抗IL－6抗体则在C线处与羊抗鼠IgG形成的荧光标记免疫复合物。
(六)荧光标记免疫复合物荧光强度检测
用荧光检测仪测定T1线处、T2线处和T3线处的荧光强度，通过与设定的阈值比对而确定其阳性或阴性结果，C线测定结果则作为该测定方法的质控内标。
所述的荧光标记免疫复合物的荧光强度，是指在T1线、T2线、T3线和C线处分别滞留下的结合荧光微球的数量用荧光检测仪测定后所得到的数值。通过双抗体夹心免疫反应的条件，研究发现，经大量测定正常样本和添加阳性样本可确定出各不同正常样本的测定均值，以此作为临界值(cutoff)来确定检测样本的阳性或阴性结果。C线测定结果则作为该测定方法的质控内标。
实施例1：联合检测PCT、CRP和IL-6试剂盒的制备
(一)荧光微球标记抗体的制备
以平均直径为110nm、羧基修饰的荧光微球(购自BangsLaboratories,Inc.公司，产品目录号为FC02F/10930)，抗PCT、CRP、IL-6单克隆抗体(购自云南大学单克隆抗体工程技术中心的编号为P-03、C-05、I6-01)，按照下述方法制备荧光微球标记PCT、CRP、IL-6标记抗体：
取15mg的上述羧基修饰的荧光微球用MES缓冲液(0.1M、pH4.7)洗涤并离心后，用1mlMES缓冲液(0.1M、pH4.7)重悬，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)至终浓度为5mM、加入NHS(N-羟基丁二酰亚胺)至终浓度为10mM，室温避光，反应半小时得到活化后羧基修饰的荧光微球。
用50mMpH8.5的硼砂缓冲液洗涤该活化后羧基修饰的荧光微球，分别取0.37mg上述待标记抗PCT、CRP和IL－6抗体和5mg上述活化后羧基修饰的荧光微球混合到50mMpH8.5的硼砂缓冲液中充分混匀。室温避光下反应2小时，让抗体和荧光微球形成稳定的肽键共价结合得到荧光微球与抗PCT、CRP和IL－6抗体的偶联物。反应结束后，加入终浓度为1％(质量百分含量)的BSA溶液对荧光微球与抗PCT、CRP和IL－6抗体的偶联物上剩余活性羧基位点进行封闭，室温避光反应0.5小时。完成后，用pH7.4的0.02MPBS缓冲液洗涤、重悬得到5mg/ml荧光微球分别标记PCT、CRP、IL-6抗体液体，4℃保存待用。
(二)联合检测PCT、CRP、IL-6试剂盒的制备
以PCT、CRP、IL-6包被抗体，以羊抗鼠IgG抗体制备包被膜，具体方法如下：
采用pH7.4的0.02MPBS缓冲液，将羊抗鼠IgG抗体(长沙博优生物科技有限公司，ABGAM-0500)配制为浓度1mg/ml溶液，将PCT、CRP、IL-6包被抗体(购自云南大学单克隆抗体工程技术中心的编号为P-01、C-03、I6-02)的浓度分别配制为浓度2mg/ml溶液，选用BioDot的XYZ3050喷膜系统将羊抗鼠IgG抗体喷至包被膜(硝酸纤维素膜)的质控线(C线)位置，将PCT包被抗体喷至检测线(T1线)位置，将CRP包被抗体喷至检测线(T2线)位置，将IL-6包被抗体喷至检测线(T3线)位置，于相对湿度为10％以下的干燥车间进行抽湿4小时后干燥待用，得到具有检测线和质控线的包被膜。
用上述膜处理缓冲液浸泡玻璃纤维纸半小时，浸泡的温度为37℃，于同样的抽湿条件进行抽湿4小时后，用上述膜处理缓冲液稀释步骤(一)所得荧光微球标记PCT、CRP、IL-6抗体液体至荧光微球标记抗PCT、CRP、IL－6抗体含量为0.05mg/ml混合液后，采用BioDot的XYZ3050喷膜系统将其喷涂至上述处理过的玻璃纤维素膜上制备形成样品垫，于同样的抽湿条件进行干燥。在10万级洁净和干燥的车间中把上述干燥好的具有检测线和质控线的包被膜、上述样品垫、吸水垫、背板按图2所示进行搭配组装后，采用BioDot的CM4000裁切系统将贴好的纸板裁切为4mm/条的宽度，装入检测用夹片待用。其结构示意图如图2所示。
实施例2：联合检测PCT、CRP、IL-6试剂盒的评价
(一)检测灵敏度
以PCT、CRP、IL-6标准品作为待测样品来测定实施例1的联合检测PCT、CRP、IL-6试剂盒的灵敏度。
分别将PCT标准品配制为系列浓度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/mL)，将CRP标准品配制为系列浓度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ug/mL)，将IL－6标准品配制为系列浓度(0、5、10、50、100、500、1000、2000pg/mL)，分别加入由实施例1得到的联合检测PCT、CRP、IL－6试剂盒的加样孔中，并采用荧光检测仪检测荧光强度。检测步骤：检测前先将待检测样品恢复室温(25℃)，用精确移液器取待检测样品60μl垂直缓慢滴入实施例1得到的联合检测PCT、CRP、IL－6试剂盒的加样孔，10分钟后用荧光检测仪进行测试。
其检测结果如下表1所示。从检测结果中可以得出实施例1的检测PCT的灵敏度为0.05ng/mL，线性范围0.05-100ng/mL；检测CRP的灵敏度为0.01ug/mL，线性范围0.01-10ug/mL；检测IL－6的灵敏度为10pg/mL，线性范围10-2000pg/mL。
PCT、CRP、IL－6试剂盒检测值与浓度曲线图如图3所示。
表1、PCT、CRP、IL－6不同样品浓度的试剂盒检测值
(二)精密性检测
选取3份不同浓度的样本，分别按照本发明所述的方法重复测量10次，根据10次的结果计算批内平均偏差CV％值。按照本发明所述的方法制备的3批试剂盒，选取3份不同浓度的样本，分别重复测量10次，根据结果计算批间平均偏差CV％值。其检测结果如下表2所示。
表2、批内批间差测定
(三)干扰实验检测
将血清中的干扰物质血红蛋白、胆红素、甘油三脂配制为浓度血红蛋白10mg/mL、胆红素1umol/mL、甘油三脂20mg/mL,分别加入由实施例1得到的联合检测PCT、CRP、IL－6试剂盒的加样孔中，10分钟后用荧光检测仪进行测试。其检测结果表明当样本中存在以上浓度的干扰物质时，对试剂盒检测结果没有影响。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种试剂盒，其特征在于，包括：
第一包被膜和第二包被膜，
所述第一包被膜的一端与所述第二包被膜的一端相连，
所述第一包被膜中的至少一块区域包被有标记抗体混合物，所述标记抗体混合物包含第一标记抗体、第二标记抗体和第三标记抗体，
所述第二包被膜包含分离的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域，
所述第一区域比所述第二区域靠近所述第一包被膜，
所述第二区域比所述第三区域靠近所述第一包被膜，
所述第三区域比所述第四区域靠近所述第一包被膜，
所述第一区域包被有第一包被抗体，所述第一包被抗体和所述第一标记抗体能够特异性结合第一抗原，
所述第二区域包被有第二包被抗体，所述第二包被抗体和所述第二标记抗体能够特异性结合第二抗原，
所述第二区域包被有第三包被抗体，所述第三包被抗体和所述第三标记抗体能够特异性结合第三抗原，
所述第四区域包被有抗抗体，所述抗抗体能够特异性结合所述第一标记抗体、所述第二标记抗体和所述第三标记抗体。
2.权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述第二包被膜的另一端连接有吸水垫。
3.权利要求2的试剂盒，其特征在于，所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水垫固定于同一固相基质上。
4.权利要求1-3任一试剂盒，其特征在于，所述第一包被膜为玻璃纤维素膜，所述第二包被膜为硝酸纤维素膜。
5.权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述第一标记抗体、所述第二标记抗体和所述第三标记抗体均带有荧光标记。
6.权利要求5的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为荧光微球标记，所述第一标记抗体、所述第二标记抗体和所述第三标记抗体分别通过肽键共价结合所述荧光微球标记。
7.权利要求6的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原为PCT，所述第一标记抗体为荧光微球标记的抗PCT抗体，
所述第二抗原为CRP，所述第二标记抗体为荧光微球标记的抗CRP抗体，
所述第三抗原为IL-6，所述第三标记抗体为荧光微球标记的抗IL-6抗体，
所述第一包被抗体为能够特异性结合到不同于所述第一标记抗体特异性结合的PCT表位的抗PCT抗体，
所述第二包被抗体为能够特异性结合到不同于所述第二标记抗体特异性结合的CRP表位的抗CRP抗体，
所述第三包被抗体为能够特异性结合到不同于所述第三标记抗体特异性结合的IL-6表位的抗IL-6抗体。
8.权利要求1的试剂盒，所述第一标记抗体和所述第一包被抗体为不同的抗PCT单克隆抗体，
所述第二标记抗体和所述第二包被抗体为不同的抗CRP单克隆抗体，
所述第三标记抗体和所述第三包被抗体为不同的抗IL-6单克隆抗体；
任选的，所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。
9.权利要求1-8任一试剂盒在联合检测PCT、CRP和IL-6中的用途。
10.一种联合检测PCT、CRP和IL-6的方法，其特征在于，包括：
将待测样本加到权利要求1-8任一试剂盒中的第一包被膜中的包被有标记抗体混合物的区域；
分别检测所述试剂盒中的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的荧光强度，对应获得第一区域荧光强度、第二区域荧光强度、第三区域荧光强度和第四区域荧光强度；
比较比值与预定阈值的大小，以确定所述待测样本是否为PCT、CRP和/或IL-6阳性样本，其中，
PCT检测的比值＝第一区域荧光强度/第四区域荧光强度，
CRP检测的比值＝第二区域荧光强度/第四区域荧光强度，
IL-6检测的比值＝第三区域荧光强度/第四区域荧光强度，
PCT检测的预定阈值是通过利用所述试剂盒检测多个PCT正常样本或者多个PCT阳性样本来确定的，
CRP检测的预定阈值是通过利用所述试剂盒检测多个CRP正常样本或者多个CRP阳性样本来确定的，
IL-6检测的预定阈值是通过利用所述试剂盒检测多个IL-6正常样本或者多个IL-6阳性样本来确定的。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106404731A (zh) * 2016-08-30 2017-02-15 王燕 一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的pct与crp双标记时间分辨荧光免疫分析方法
CN107167597A (zh) * 2017-07-18 2017-09-15 深圳市惠安生物科技有限公司 定量检测saa、crp、pct的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法
CN108318691A (zh) * 2017-04-17 2018-07-24 清华大学深圳研究生院 A型流感病毒和b型流感病毒侧向层析检测试剂盒及方法
CN108593935A (zh) * 2018-05-08 2018-09-28 湖南汉康生物医药有限公司 一种炎症快速检测胶体金试纸条
CN109716134A (zh) * 2016-03-24 2019-05-03 莫洛克有限公司 败血症的检测
CN109975557A (zh) * 2019-04-29 2019-07-05 厦门稀土材料研究所 Il-6/pct联合检测时间分辨检测试剂盒及方法
CN113433329A (zh) * 2021-08-26 2021-09-24 宁波奥丞生物科技有限公司 基于量子点荧光微球的pct/il-6二联检测试剂盒及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989009628A1 (en) * 1988-04-04 1989-10-19 Potempa Lawrence A Binding of immune complexes by modified forms of c-reactive protein
CN101246163A (zh) * 2008-01-29 2008-08-20 广州益善生物技术有限公司 脓毒症早期诊断液相芯片及其制备方法
CN101281198A (zh) * 2008-05-08 2008-10-08 黑龙江美康汇融生物技术股份有限公司 Ca27.29、tps、cyfra21-1乳腺癌胶体金三联检诊断试剂盒及其制备方法
CN104407135A (zh) * 2014-11-03 2015-03-11 清华大学深圳研究生院 A型流感病毒h5和h9亚型检测方法及其试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989009628A1 (en) * 1988-04-04 1989-10-19 Potempa Lawrence A Binding of immune complexes by modified forms of c-reactive protein
CN101246163A (zh) * 2008-01-29 2008-08-20 广州益善生物技术有限公司 脓毒症早期诊断液相芯片及其制备方法
CN101281198A (zh) * 2008-05-08 2008-10-08 黑龙江美康汇融生物技术股份有限公司 Ca27.29、tps、cyfra21-1乳腺癌胶体金三联检诊断试剂盒及其制备方法
CN104407135A (zh) * 2014-11-03 2015-03-11 清华大学深圳研究生院 A型流感病毒h5和h9亚型检测方法及其试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
许程 等: "脓毒症早期预警生物标志物的研究进展", 《检验医学》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109716134A (zh) * 2016-03-24 2019-05-03 莫洛克有限公司 败血症的检测
CN109716134B (zh) * 2016-03-24 2022-12-02 莫洛迪克有限公司 败血症的检测
CN106404731A (zh) * 2016-08-30 2017-02-15 王燕 一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的pct与crp双标记时间分辨荧光免疫分析方法
CN106404731B (zh) * 2016-08-30 2020-03-31 王燕 一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的pct与crp双标记时间分辨荧光免疫分析方法
CN108318691A (zh) * 2017-04-17 2018-07-24 清华大学深圳研究生院 A型流感病毒和b型流感病毒侧向层析检测试剂盒及方法
CN107167597A (zh) * 2017-07-18 2017-09-15 深圳市惠安生物科技有限公司 定量检测saa、crp、pct的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法
CN108593935A (zh) * 2018-05-08 2018-09-28 湖南汉康生物医药有限公司 一种炎症快速检测胶体金试纸条
CN109975557A (zh) * 2019-04-29 2019-07-05 厦门稀土材料研究所 Il-6/pct联合检测时间分辨检测试剂盒及方法
CN109975557B (zh) * 2019-04-29 2023-08-29 厦门稀土材料研究所 Il-6/pct联合检测时间分辨检测试剂盒及方法
CN113433329A (zh) * 2021-08-26 2021-09-24 宁波奥丞生物科技有限公司 基于量子点荧光微球的pct/il-6二联检测试剂盒及其制备方法

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