CN108103020A - 一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，包括：采集外周血，分离单个核细胞，把单个核细胞放入被CD16单抗和HER2单抗包被过的培养瓶中培养；同时在培养基中加入IL‑2、IL‑15、IL‑21和灭活的自体血清；随后把细胞转移到没有包被过的培养瓶中培养，每2‑3天给细胞补液一次；最后收集NK细胞即可。本发明不使用任何异源血清成分和滋养层细胞，操作过程简单，可以得到很高的NK细胞产量，具有良好的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于细胞分化和培养领域，特别涉及一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer，NK)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓或胸腺微环境，主要分布于外周血和脾脏，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。NK细胞不表达特异性抗原识别受体，是不同于T、B淋巴细胞的第三类淋巴细胞。在杀伤靶细胞的过程中，NK细胞可以非特异性识别靶细胞，并且不受主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)的限制，对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用。NK细胞表达CD56但是缺失CD3，通常用标志物组合CD3-CD56+来定义NK细胞。NK细胞主要存在于外周血和脾脏中，大概占到外周血淋巴细胞的5％～15％(Huntington ND,et al.,Nat RevImmunol2007Sep,7(9):703-14)。
NK细胞在无需抗原预先致敏的情况下就能直接杀伤肿瘤细胞和被感染的细胞。NK细胞可以通过多种方式杀伤靶细胞：1、与靶细胞接触后，NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞；2、通过自身表达的配体，来激活靶细胞表面的死亡受体；3、通过抗体依赖的细胞毒性作用对靶细胞造成杀伤；4、活化的NK细胞通过释放TNF引发靶细胞的细胞凋亡(Smyth MJ,et al.,Nat Rev Cancer2002Nov,2(11):850-61)。
NK细胞是人体的第一道抵御防线，是机体抵抗恶性肿瘤细胞和抗病毒感染的重要免疫调节细胞，也是连接天然免疫和特异性免疫的重要桥梁。最新的研究表明，NK细胞能清除体内衰老的细胞，因此NK细胞在预防衰老相关的疾病和抗衰老领域也可能有重要的价值(Krizhanovsky V,et al.,Cell 2008Aug 22,134(4):657-67)。外周血中的NK细胞数量有限，所以必须通过体外培养的方法获得大量的NK细胞满足临床应用的需要，通常是利用外周血单个核细胞诱导出NK细胞。但是常规的制备NK细胞的方法有很多问题需要解决：1.所获得的NK细胞纯度偏低，产量不高，不同个体来源的NK细胞的产量差异很大，有些个体的血液细胞很难扩增出NK细胞。2.在培养NK细胞的过程中如果使用滋养层细胞可以显著提高NK细胞的纯度和产量，但是使用滋养层会大大降低临床应用的安全性。3.在培养NK细胞之前，可以用磁珠分选外周血单个核细胞，这样能提高NK细胞的纯度。但是免疫磁珠的方法过程繁琐，成本较高，还可能会引入外源性物质(磁珠、洗脱液中的成分和抗体等)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，该方法不使用任何异源血清成分和滋养层细胞，操作过程简单，可以得到很高的NK细胞产量，具有良好的临床应用价值。
本发明提供了一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，包括：
采集外周血，分离单个核细胞，把单个核细胞放入被CD16单抗和HER2单抗包被过的培养瓶中培养；同时在培养基中加入IL-2、IL-15、IL-21和灭活的自体血清；随后把细胞转移到没有包被过的培养瓶中培养，每2-3天给细胞补液一次；最后收集NK细胞即可。
所述CD16单抗的包被浓度为1～10μg/mL，包被温度为4℃，包被时间为8～16小时。优选包被浓度为10μg/ml，优选包被时间为16小时。
所述HER2单抗的包被浓度为1～1000μg/mL，包被温度为4℃，包被时间为8～16小时。优选包被浓度为100μg/mL，优选包被时间为16小时。
所述培养基中的组分包括：100～1000U/ml的IL-2，10～1000U/ml的IL-15，10～1000U/ml IL-21和5～15％的灭活的自体血清。优选浓度是1000U/ml IL-2、50U/ml IL-15、250U/ml IL-21和10％的灭活的自体血清。
所述培养基为X-VIVO 15无血清培养基。
补液的同时仍然补加灭活自体血清、IL-2、IL-15和IL-21。
所述细胞培养21天以后，收集NK细胞。
本发明在NK细胞的制备过程中使用了如下生物试剂：CD16单抗、HER2单抗、IL-2、IL-15和IL-21。CD16即FcγRⅢ，为分子量为50 000～70 000的糖蛋白，属Ig超家族成员，NK细胞上交联的CD16直接导致细胞内Ca+水平的增加和一系列的类似于T细胞受体激活的级联生化反应，CD16单克隆抗体可激活NK细胞抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(Mandelboim O,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 1999,96(10):5640-4)。人表皮生长因子受体-2(HER2)，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，属于EGFR家族成员之一。HER2蛋白由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三部分组成，HER2蛋白主要通过与家族中其他成员包括EGFR(HERl/erbBI)、HER3/erbB3、HER4/erbB4形成异二聚体而与各自的配体结合。当与配体结合后，主要通过引起受体二聚化及胞浆内酪氨酸激酶区的自身磷酸化，激活氨酸激酶的活性。HER2蛋白介导的信号转导途径主要有Ras/Raf/分裂素活化蛋白激酶(MAPK)途径，磷脂酰肌醇3羟基激酶(P13K)/Akt途径，信号转导及转录激活(STAT)途径和PLC通路等(Moasser MM,Oncogene 2007,26(45):6469-87)。
本发明所添加的细胞因子包含白介素2(IL-2)、白介素15(IL-15)、白介素21(IL-21)。在缺失受体γc(common chain gama)的老鼠中未能检测到NK细胞，因此认为受体γc对NK细胞的发育起到至关重要的作用(DiSanto JP,etal.,Proc Natl Acad Sci U S A1995,92(2):377-81)。细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的细胞受体都包含受体γc(Waldmann TA,Cancer Immunol Res 2015Mar,3(3):219-27)。敲除基因IL-2会造成NK细胞的缺失(DiSanto JP,et al.,JExpMed 1990,171(5):1697-704)，而且IL-2能够提高NK细胞的增殖能力(Shibuya A,et al.,Blood 1995,85(12):3538-46)，在制备NK细胞时IL-2是最常用的细胞因子。IL-15同样对NK细胞的发育和增殖起着至关重要的作用(Huntington ND,et al.,J Exp Med2009,206(1):25-34)；IL-21能够增加NK细胞的毒性和促进NK细胞的成熟(Wagner J,et al.,Front Immunol 2017Jun 12,8:676)；IL-21和IL-15有协同作用，能增强NK细胞的杀伤能力(Strengell M,et al.,J Immunol 2003,170(11):5464-9)。
有益效果
(1)本发明方法操作简单，稳定性高；不使用任何异源血清成分和滋养层细胞，而且不依靠磁珠分选提高NK纯度，仅仅使用抗体和细胞因子就能从外周血单个核细胞中扩增出大量的NK细胞，解决了常规NK制备方法中存在的安全性问题；
(2)本发明能够制备大量的纯度很高的NK细胞，可以单次回输，也可以多次回输，满足临床应用的需求。
附图说明
图1为常规培养方法与本发明方法所得NK细胞对Jurkat细胞的杀伤能力对比图；
图2为某志愿者的外周血单个核细胞经本发明的方法扩增后的流式分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、细胞制备需要的试剂与耗材
HER2单抗(Herceptin，赫赛汀)：每瓶440毫克，购自罗氏制药公司。
CD16单抗：购自北京同立海源生物公司。
重组人白介素21(IL-21)：购自北京同立海源生物公司。
重组人白介素15(IL-15)：购自北京同立海源生物公司。
重组人白介素2(IL-2)：购自北京同立海源生物公司。
X-VIVOTM15无血清细胞培养基：购自美国Lonza公司。
淋巴细胞分离液：购自美国GE Healthcare公司。
细胞培养瓶：购自美国Corning公司。
二、NK细胞的制备
1.用抗CD16和HER2单抗包被培养瓶
用无血清培养基稀释抗人CD16和HER2单抗，把4毫升含有10μg/ml的CD16单抗和100μg/ml的HER2单抗的无血清培养基加入到一个T75的培养瓶中。使液体铺满瓶底，把培养瓶平放在4℃冰箱中包被过夜(16个小时)。
2.分离外周血单个核细胞
找5名志愿者，从每名身上抽取100mL外周血，用注射器吸取血液缓缓滴入50ml离心管中。用600g的转速离心20分钟；分离后的血液上层为血浆层，下层为血细胞层。吸取上层血浆，封口，56℃灭活30分钟，灭活完毕；4℃放置15分钟，用1800g的速度离心15分钟，自体血浆离心结束后，分装到15mL离心管中，根据当前需要把血浆保存在-20℃或4℃中。用与血细胞层等体积的生理盐水重悬下层血细胞沉淀，混合均匀。
预先把人淋巴细胞分离液(密度为1.077g/mL)平衡到室温。把20mL分离液缓慢加入到50mL体积的无菌离心管中，倾斜离心管45度，在离分离液液面上1cm处把等体积的细胞悬液缓慢加到分离液上面。把离心管放入水平离心机，用500g的速度离心20分钟。
从离心管中吸取中间白膜层，加入到新的50mL离心管中。吹打均匀，用生理盐水定容至45mL，600g离心10分钟。离心后弃上清，补加40～45mL生理盐水吹打细胞至混匀，再次以500g离心10分钟，弃上清得到外周血单个核细胞。用20～30mL无血清培养基培养基重悬细胞，同时细胞计数。
把从每名志愿者100毫升外周血中得到的单个核细胞和血清分成两等份，一份用本发明的方法制备NK细胞，另一份用常规方法制备NK细胞作为对照组。
3.NK细胞的扩增
不需要吸走单抗溶液，直接把PBMC细胞悬液加入到培养瓶中，补加10％的灭活自体血清、1000U/ml IL-2、50U/ml IL-15和250U/ml IL-21。PBMC的最终浓度在2×106个/毫升左右，最后把细胞放进培养箱中培养。
以后每2天补加30-60％体积的新鲜培养基，同时添加自体血清和细胞因子。
整个培养过程中，细胞是在T75或者T175培养瓶中培养，一共培养21天，就能得到大量高纯度的NK细胞。
为了比较本发明的方法和常规方法，实验中同时用一种常规的制备方法作为对照。用于对照的常规制备方法如下：用无血清培养基稀释抗人CD16单抗，把4毫升含有2μg/ml的CD16单抗加入到一个T75的培养瓶中。使液体铺满瓶底，把培养瓶平放在4℃冰箱中包被过夜(16个小时)。第二天把PBMC细胞悬液加入到培养瓶中，培养基里面加入1000U/mlIL-2、100U/ml IL-15和100U/ml IL-12，每2天补液一次并补足细胞因子。细胞全程在培养瓶中培养，一共培养21天，收集免疫细胞。
三、检测NK细胞的纯度和产量
在培养第21天的时候，从培养箱中取出细胞；把上清和悬浮的免疫细胞直接转移到250毫升的离心管中一起离心；倒掉上清，用新鲜的无血清培养基重悬细胞；取两份细胞分别用于细胞计数和流式细胞仪分析。
对于分析NK细胞的纯度，在每个5mL流式细胞仪检测管中加入1×106个细胞，用800rpm的转速离心5分钟，丢掉上清；用PBS洗细胞一次，用800rpm的转速离心5分钟，丢掉上清。用10μg human IgG封闭每管细胞，室温下封闭15分钟。然后根据抗体说明书上指定的抗体使用量把抗体直接加到细胞里面，4℃孵育30分钟。用PBS洗细胞2次，用300μL的PBS重悬细胞。使用流式细胞仪之前加入荧光染料去除死细胞。
从表1可以看出本发明扩增NK细胞的能力明显优于常规方法的扩增能力。从表2可以看出使用本发明的方法普遍能得到纯度很高的NK细胞，明显优于使用常规方法得到的NK细胞纯度。
从图2可以看出，NK细胞的比例高达93.41％，剩下的2.2％是NKT细胞，3.84％是T细胞。
四、肿瘤细胞杀伤实验
白血病细胞株Jurkat培养在含有10％胎牛血清的1640培养基中，取处于对数生长期的Jurkat细胞计数并用于实验。
整个杀伤实验中用到的培养基是含有1％灭活的胎牛血清的1640培养基。用到的试剂盒是非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega,G1780)。
用新鲜的培养基把Jurkat细胞制成1×105个/mL的细胞悬液，加入到圆底的96孔板中，每孔100μL。用同样的培养基调整一系列NK细胞的浓度，把80μL NK细胞按照效应细胞：靶细胞为1:1、5:1、10:1的比例加入到Jurkat细胞中；同时设置NK细胞对照和Jurkat细胞对照组，培养基对照组和Jurkat细胞最大释放组，每孔的最终体积矫正为200μL，均设三个复孔，250g离心4分钟，把细胞放在37度的培养箱中培养24小时。
在反应结束前45分钟，把20μL裂解液加入到靶细胞最大释放组。反应结束后从每个孔吸走50μL细胞上清至另一个新的96孔板，再加入50μL LDH酶反应液，混匀30秒，室温下避光放置30分钟，再加入50μL终止液，用酶标仪测量每个孔的OD值。
计算NK细胞杀伤活力的公式：自然杀伤活性％＝(实验组OD值-NK细胞对照组OD值-Jurkat细胞对照组OD值)/(Jurkat细胞最大释放组OD值-Jurkat细胞对照组OD值)×100％。
从图1可以看出，在不同的效靶比条件下，本发明所得NK细胞的杀伤能力均明显的高于常规方法所得NK细胞的杀伤能力，p<0.01。效靶比越高，NK细胞的杀伤效率越高；在效靶比是5:1的时候，本发明制备的NK细胞的杀伤效率是91.7±3.3％，10:1的时候达到最大，95.6±2.9％。
表1：NK细胞的扩增倍数(21天)
| 志愿者1 | 志愿者2 | 志愿者3 | 志愿者4 | 志愿者5 | |
| 实验组 | 630 | 780 | 771 | 807 | 1189 |
| 对照组 | 84 | 121 | 148 | 159 | 225 |
注：常规组和实验组的扩增倍数存在显著的差异，p<0.01。
表2：NK细胞的纯度(21天)
| 志愿者1 | 志愿者2 | 志愿者3 | 志愿者4 | 志愿者5 | |
| 实验组 | 88.8％ | 89.6％ | 95％ | 93.4％ | 96.3％ |
| 对照组 | 52.1％ | 63.7％ | 75.4％ | 66％ | 79.8％ |
注：常规组和实验组的NK细胞纯度存在显著的差异，p<0.01。
Claims (6)
1.一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，包括：
采集外周血，分离单个核细胞，把单个核细胞放入被CD16单抗和HER2单抗包被过的培养瓶中培养；同时在培养基中加入IL-2、IL-15、IL-21和灭活的自体血清；随后把细胞转移到没有包被过的培养瓶中培养，每2-3天给细胞补液一次；最后收集NK细胞即可。
2.根据权利要求1所述的一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于：所述CD16单抗的包被浓度为1～10μg/mL，包被温度为4℃，包被时间为8～16小时。
3.根据权利要求1所述的一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于：所述HER2单抗的包被浓度为1～1000μg/mL，包被温度为4℃，包被时间为8～16小时。
4.根据权利要求1所述的一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于：所述培养基中的组分包括：100～1000U/ml的IL-2，10～1000U/ml的IL-15，10～1000U/ml IL-21和5～15％的灭活的自体血清。
5.根据权利要求1或4所述的一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于：所述培养基为X-VIVO 15无血清培养基。
6.根据权利要求1所述的一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于：所述细胞培养21天以后，收集NK细胞。
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