CN107850568A - 用于质谱定量由微量取样装置提取的分析物的方法 - Google Patents
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Abstract
描述了用于测定通过微量取样装置收集的样品中分析物的量的质谱方法。本文提供的是涉及定量样品中分析物的量的方法，其通过从由微量取样装置收集的样品提取分析物；通过液相色谱法纯化样品；电离分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和通过质谱法测定一种或多种离子的量。样品中分析物的量与患者中分析物的量相关。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2015年5月27日提交的美国申请系列号62/167,164的优先权，其全部通过引用并入本文。
发明背景
质谱定量来自患者的分析物需要收集相对大数量的流体样品。这类样品需要干冰冷藏或冷冻进行运输，这对于个人操纵样品是昂贵的且繁重的。再者，流体样品可以被认为是生物危害物，其需要专门的运输方法。
使用干血斑卡片(dried blood spot card)收集患者样品与上面描述的流体收集相比需要较少的体积。通过运用从刺破脚后跟或手指获得的并涂抹至滤纸上的几滴血液收集干血斑样本，其然后冲孔(hole punch)进行提取和分析。然而，由于在将血液放置在滤纸上之后出现的红细胞和血清的固有分离，干血斑卡片存在定量上不一致性和可变性的问题。再者，待提取和分析的冲孔区域的位置的可变性可以显著影响定量结果。
需要用于质谱定量分析物的可靠的和准确的方法。
发明内容
在一个方面，本文提供的是用于质谱定量由微量取样装置收集和提取的分析物的方法。
在某些实施方式中，本文提供的方法涉及定量样品中分析物的量，其包括：(a)从通过微量取样装置收集的样品提取分析物；(b)电离分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和(c)通过质谱法测定一种或多种离子的量。在一些实施方式中，测定的一种或多种离子的量被用于测定样品中分析物的量。在一些实施方式中，样品中分析物的量与患者中分析物的量相关。
在某些实施方式中，本文提供的方法涉及定量毛细血管血样品中分析物的量，其包括：(a)从通过微量取样装置收集的毛细血管血样品提取分析物；(b)电离分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和(c)通过质谱法测定一种或多种离子的量。在一些实施方式中，测定的一种或多种离子的量被用于测定样品中分析物的量。在一些实施方式中，样品中分析物的量与患者中分析物的量相关。
在一些实施方式中，通过微量取样装置收集毛细血管血。在一些实施方式中，不通过干血斑收集毛细血管血。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括在质谱法之前纯化样品。在一些实施方式中，方法包括使用液相色谱法纯化样品。在一些实施方式中，液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)或高湍流液相色谱法(HTLC)。在一些实施方式中，方法包括使样品经受固相提取(SPE)。在一些实施方式中，方法包括使样品经受反相分析柱。
在一些实施方式中，本文提供的方法涉及定量样品中分析物的量，其包括(a)从通过微量取样装置收集的样品提取分析物，(b)通过液相色谱法纯化样品，(c)电离分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和(d)通过质谱法测定一种或多种离子的量。在一些实施方式中，测定的一种或多种离子的量被用于测定样品中分析物的量。在一些实施方式中，样品中分析物的量与患者中分析物的量相关。
在一些实施方式中，质谱法包括串联质谱法。在一些实施方式中，质谱法是高分辨率质谱法。在一些实施方式中，质谱法是高分辨率/高准确度质谱法。
在一些实施方式中，电离是通过大气压化学电离(APCI)。在一些实施方式中，电离是通过电喷雾电离(ESI)。在一些实施方式中，所述电离处于正离子模式。在一些实施方式中，所述电离处于负离子模式。
在一些实施方式中，包含样品的微量取样装置被置于96-孔板中。在一些实施方式中，包含样品的微量取样装置被置于96-置放架(rack)中。在一些实施方式中，自动化机器(automation)将96-置放架置于96-孔板中。在一些实施方式中，自动化机器是自动化机器。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括向样品添加内标。在一些实施方式中，内标是标记的。在一些实施方式中，内标是氘化的或同位素标记的。在一些实施方式中，内标添加有提取缓冲液。在一些实施方式中，利用内标预浸微量取样装置并干燥。
在一些实施方式中，提取步骤包括向通过微量取样装置收集的样品添加提取缓冲液。在一些实施方式中，提取步骤包括将包含样品的微量取样装置置于包含提取溶剂的96-孔板中。在一些实施方式中，提取步骤是自动化的。在一些实施方式中，使96-孔板涡旋然后移除微量取样装置的吸收管尖。在一些实施方式中，提取步骤包括在氮气下干燥。在一些实施方式中，提取步骤包括重构样品为溶液。在一些实施方式中，重构包括向样品添加含水酸或有机溶液或两者。在一些实施方式中，重构的溶液被过滤。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括同时高通量(high-throughput)自动化提取和质谱分析多个样品。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用能够实现同时自动化提取和质谱分析多个样品的设备。在一些实施方式中，能够实现自动化的设备包括微量取样装置。在一些实施方式中，微量取样装置以高通量设备配置。
在一些实施方式中，提取的样品被注入质谱系统。在一些实施方式中，提取的样品被注入液相色谱法。在一些实施方式中，以在线方式执行提取和质谱法步骤从而允许自动化的样品分析。在一些实施方式中，以在线方式执行提取、纯化和质谱法步骤从而允许自动化的样品分析。
在一些实施方式中，分析物是非衍生化的(underivatized)。
在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品不需要样品加工。
在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品是全血。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品是尿。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品是唾液。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品是血清或血浆。
在一些实施方式中，微量取样装置包括收集样品的吸收管尖。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品吸收固定体积的患者流体。在一些实施方式中，患者流体是毛细血管血。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有小于或等于150μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有小于或等于100μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有小于或等于50μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有5μL和150μL之间的体积，包括端点。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有10μL和100μL之间的体积，包括端点。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约10μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约15μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约20μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约30μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约50μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约100μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品吸收固定体积的血液，不管血细胞比容的量如何。
在某些实施方式中，本文提供的方法涉及定量低体积的样品中分析物的量。在一些实施方式中，本文提供的方法涉及定量样品中分析物的量，其包括(a)从小于或等于100μL的样品提取分析物；(b)电离分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和(c)通过质谱法测定一种或多种离子的量。在一些实施方式中，测定的一种或多种离子的量被用于测定样品中分析物的量。在一些实施方式中，样品中分析物的量与患者中分析物的量相关。
在一些实施方式中，样品是毛细血管血样品。在一些实施方式中，样品不是静脉血样品。
在一些实施方式中，本文提供的方法涉及定量低体积毛细血管血样品中分析物的量。在一些实施方式中，本文提供的方法涉及定量样品中分析物的量，其包括(a)从小于或等于100μL的毛细血管血样品提取分析物；(b)通过液相色谱法纯化样品；(c)电离分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和(d)通过质谱法测定一种或多种离子的量。在一些实施方式中，测定的一种或多种离子的量被用于测定毛细血管血样品中分析物的量。在一些实施方式中，样品中分析物的量与患者中分析物的量相关。
在一些实施方式中，方法包括从小于或等于50μL的样品提取分析物。在一些实施方式中，方法包括从小于或等于30μL的样品提取分析物。在一些实施方式中，方法包括从小于或等于20μL的样品提取分析物。在一些实施方式中，方法包括从小于或等于15μL的样品提取分析物。在一些实施方式中，方法包括从小于或等于10μL的样品提取分析物。
在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以在没有冷藏或冷冻的情况下运输。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以在没有干冰的情况下运输。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以在室温下运输。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以被运输而没有生物危害担忧。
在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品需要少量训练(littletraning)进行收集。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以在任何地方收集。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以在环境温度下干燥进行船运。
在一些实施方式中，微量取样装置包括能够实现自动化提取和质谱分析的设备。在一些实施方式中，微量取样装置包括能够实现同时高通量自动化提取和质谱分析多个样品的设备。在一些实施方式中，微量取样装置是管尖。在一些实施方式中，微量取样装置被包裹在设计用于自动化提取和质谱分析的盒中。
在一些实施方式中，方法进一步包括利用微量取样装置收集样品。在一些实施方式中，收集步骤包括执行手指刺破和施加微量取样装置的吸收管尖至血液。在一些实施方式中，收集步骤包括在患者的尿或唾液中施加吸收管尖。在一些实施方式中，风干在微量取样装置中收集的样品。在一些实施方式中，在运输之前风干在微量取样装置中收集的样品1至2小时。
在一些实施方式中，分析物是类固醇。在一些实施方式中，类固醇是皮质醇、可的松、孕酮、17-羟基孕酮、雄烯二酮(androstenedione)、睾酮、脱氢表雄酮、皮质酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、孕烯醇酮、17-羟基孕烯醇酮、18-羟基皮质酮或21-脱氧皮质醇。在一些实施方式中，分析物是用于诊断先天性肾上腺增生(CAH)的类固醇组(panel)中的类固醇。在一些实施方式中，类固醇选自皮质醇、可的松、孕酮、17-羟基孕酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、皮质酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、孕烯醇酮、17-羟基孕烯醇酮、18-羟基皮质酮和21-脱氧皮质醇。在一些实施方式中，类固醇是25-羟基维生素D2或25-羟基维生素D3。
在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有361.4±0.5的质荷比(m/z)的可的松先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有121.2±0.5或163.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有363.4±0.5的质荷比(m/z)的皮质醇先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有121.1±0.5或267.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有347.3±0.5的质荷比(m/z)的21-脱氧皮质醇先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有121.1±0.5或269.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有347.4±0.5的质荷比(m/z)的皮质酮(coticosterone)先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有121.1±0.5或311.3±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有347.4±0.5的质荷比(m/z)的11-脱氧皮质醇先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有97.1±0.5或109.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有287.4±0.5的质荷比(m/z)的雄烯二酮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有97.1±0.5或109.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有331.4±0.5的质荷比(m/z)的11-脱氧皮质酮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有97.1±0.5或109.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有289.4±0.5的质荷比(m/z)的睾酮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有97.1±0.5或109.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有331.4±0.5的质荷比(m/z)的17-羟基孕酮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有97.1±0.5或109.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有315.3±0.5的质荷比(m/z)的孕酮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有97.1±0.5或109.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有369.4±0.5的质荷比(m/z)的可的松-d7先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有169.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有367.4±0.5的质荷比(m/z)的皮质醇-d4先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有121.0±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有351.1±0.5的质荷比(m/z)的皮质酮-d4先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有121.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有350.4±0.5的质荷比(m/z)的11-脱氧皮质醇-13C3先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有100.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有290.4±0.5的质荷比(m/z)的雄烯二酮(androstendione)-13C3先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有100.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有292.4±0.5的质荷比(m/z)的睾酮-13C3先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有112.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有334.3±0.5的质荷比(m/z)的17-羟基孕酮-13C3先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有100.0±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有318.5±0.5的质荷比(m/z)的孕酮-13C3先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有100.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。
在一些实施方式中，分析物是阿片剂(opiate)。在一些实施方式中，阿片剂是顺式曲蚂多、O-去甲基曲蚂多、他喷他多(tapentadol)、N-去甲基他喷他多、可待因、吗啡、羟吗啡酮(oxymorphone)、去甲氢可酮(norhydrocodone)、羟考酮、去甲羟考酮、氢吗啡酮(hydromorphone)、氢可酮、丁丙诺啡叔丁啡、去甲丁丙诺啡叔丁啡、芬太尼、去甲芬太尼、6-单乙酰基吗啡(6-MAM)、美沙酮、二氢可待因、纳洛酮、纳曲酮、6β-纳曲醇(naltrexol)、烯丙吗啡、纳布啡(nalbuphine)或2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷(EDDP)。在一些实施方式中，阿片剂选自顺式曲蚂多、O-去甲基曲蚂多、他喷他多、N-去甲基他喷他多、可待因、吗啡、羟吗啡酮、去甲氢可酮、羟考酮、去甲羟考酮、氢吗啡酮、氢可酮、丁丙诺啡叔丁啡、去甲丁丙诺啡叔丁啡、芬太尼、去甲芬太尼、6-单乙酰基吗啡(6-MAM)、美沙酮、二氢可待因、纳洛酮、纳曲酮、6β-纳曲醇、烯丙吗啡、纳布啡和2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷(EDDP)。在一些实施方式中，阿片剂提取自全血、唾液或尿样品。
在一些实施方式中，分析物是苯并二氧在一些实施方式中，苯并二氧是奥沙西泮、羟基安定、劳拉西泮、去甲地西泮、地西泮(diazepam)、氯氮草、三唑仑(triazolam)、咪达唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、溴西泮(bromazepam)、氯巴占、硝西泮、溴氯苯基二氢苯并二氮杂酮、环丙安定、去氧安定、氟硝西泮、或氟西泮。在一些实施方式中，苯并二氧选自奥沙西泮、羟基安定、劳拉西泮、去甲地西泮、地西泮、氯氮草、三唑仑、咪达唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、溴西泮、氯巴占、硝西泮、溴氯苯基二氢苯并二氮杂酮、环丙安定、去氧安定、氟硝西泮和氟西泮。在一些实施方式中，苯并二氧提取自全血或尿样品。
在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有316±0.5的质荷比(m/z)的溴西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有214±0.5或270±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有287±0.5的质荷比(m/z)的奥沙西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有104±0.5或241±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有300±0.5的质荷比(m/z)的氯巴占先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有224±0.5或259±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有282±0.5的质荷比(m/z)的硝西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有180±0.5或236±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有309.1±0.5的质荷比(m/z)的阿普唑仑先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有165±0.5或280.9±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有343±0.5的质荷比(m/z)的三唑仑先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有206±0.5或308±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有316±0.5的质荷比(m/z)的氯硝西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有214±0.5或270±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有388±0.5的质荷比(m/z)的氟西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有287.9±0.5或315±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有321±0.5的质荷比(m/z)的劳拉西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有229.1±0.5或331±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有314±0.5的质荷比(m/z)的氟硝西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有211±0.5或268±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有301.1±0.5的质荷比(m/z)的羟基安定先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有177±0.5或255±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有326±0.5的质荷比(m/z)的咪达唑仑先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有129±0.5或244±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有271±0.5的质荷比(m/z)的去甲地西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有139.8±0.5或165±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有351±0.5的质荷比(m/z)的溴氯苯基二氢苯并二氮杂酮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有185.9±0.5或206±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有301±0.5的质荷比(m/z)的氯地西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有259±0.5或224±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有285±0.5的质荷比(m/z)的地西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有154±0.5或193±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有325±0.5的质荷比(m/z)的环丙安定先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有165±0.5或271±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有271±0.5的质荷比(m/z)的去氧安定先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有180±0.5或207.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。
在一些实施方式中，分析物是抗癫痫药物。在一些实施方式中，抗癫痫药物是丙戊酸、替加宾(tiagabine)、托吡酯(topiramate)、左乙拉西坦(levitiracetum)、拉莫三嗪(lamotrigine)、拉科酰胺(lacosamide)、乙琥胺、卡马西平、艾司利卡马西平(eslicarbamazepine)、10,11-卡马西平、苯巴比妥、卢非酰胺(rufinamide)、扑米酮、苯妥英、唑尼沙胺(zonisamide)、非氨酯、加巴喷丁(gabapentin)或普瑞巴林(pregablin)。在一些实施方式中，抗癫痫药物选自丙戊酸、替加宾、托吡酯、左乙拉西坦、拉莫三嗪、拉科酰胺、乙琥胺、卡马西平、艾司利卡马西平、10,11-卡马西平、苯巴比妥、卢非酰胺、扑米酮、苯妥英、唑尼沙胺、非氨酯、加巴喷丁和普瑞巴林。在一些实施方式中，抗癫痫药物提取自全血样品。
在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有339±0.5的质荷比(m/z)的非氨酯先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有117.3±0.5或261±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有117±0.5的质荷比(m/z)的非氨酯先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有115±0.5或91±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有142±0.5的质荷比(m/z)的乙琥胺先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有44.3±0.5或39.3±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有251±0.5的质荷比(m/z)的拉科酰胺先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有91.2±0.5或65.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有256±0.5的质荷比(m/z)的拉莫三嗪先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有211±0.5或145±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有338.2±0.5的质荷比(m/z)的托吡酯先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有78.2±0.5或96.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有172.3±0.5的质荷比(m/z)的加巴喷丁先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有91.2±0.5或67.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有297.1±0.5的质荷比(m/z)的艾司利卡西平(eslicarbazepine)先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有194±0.5或179±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有219.8±0.5的质荷比(m/z)的扑米酮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有79±0.5或135.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有160.1±0.5的质荷比(m/z)的普瑞巴林(pregabalin)先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有55.2±0.5或77.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有237±0.5的质荷比(m/z)的卡马西平先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有194.1±0.5或179±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有231±0.5的质荷比(m/z)的苯巴比妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有44.2±0.5或188.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有236.2±0.5的质荷比(m/z)的环氧化物先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有141.2±0.5或112.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有213.2±0.5的质荷比(m/z)的唑尼沙胺先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有77.2±0.5或102.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有376.2±0.5的质荷比(m/z)的替加宾先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有111.1±0.5或149.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有253.1±0.5的质荷比(m/z)的苯妥英先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有104.2±0.5或182.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有171.2±0.5的质荷比(m/z)的左乙拉西坦(levetiracetam)先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有126.2±0.5或69.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有143±0.5的质荷比(m/z)的丙戊酸先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有143±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有239±0.5的质荷比(m/z)的卢非酰胺先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有127.2±0.5或261±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有219±0.5的质荷比(m/z)的扑米酮(primdone)先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有126±0.5或141±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有350±0.5的质荷比(m/z)的托吡酯D12先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有78.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有256±0.5的质荷比(m/z)的环氧化物D3先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有77±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有259±0.5的质荷比(m/z)的拉莫三嗪13C3先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有214±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有177.2±0.5的质荷比(m/z)的左乙拉西坦D6先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有132.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。
在一些实施方式中，分析物是免疫抑制剂。在一些实施方式中，免疫抑制剂是环孢菌素A、西罗莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)或依维莫司(everolimus)。在一些实施方式中，免疫抑制剂选自环孢菌素A、西罗莫司、他克莫司和依维莫司。在一些实施方式中，免疫抑制剂提取自全血样品。
在一些实施方式中，分析物是巴比妥酸盐。在一些实施方式中，巴比妥酸盐是苯巴比妥(phenobarbitol)、异戊巴比妥(amobarbitol)、布他比妥(butalbital)、戊巴比妥(pentobarbitol)、司可巴比妥(secobarbitol)或硫喷妥。在一些实施方式中，巴比妥酸盐选自苯巴比妥、异戊巴比妥、布他比妥、戊巴比妥、司可巴比妥和硫喷妥。在一些实施方式中，巴比妥酸盐提取自全血样品。
在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有237.0±0.5的质荷比(m/z)的司可巴比妥(secobarbital)先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有42.0±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有225.0±0.5的质荷比(m/z)的异戊巴比妥(ammobarbital)先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有182.0±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有225.6±0.5的质荷比(m/z)的戊巴比妥(pentobarbital)先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有42.0±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有241.0±0.5的质荷比(m/z)的硫喷妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有57.9±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有231.0±0.5的质荷比(m/z)的苯巴比妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有42.0±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有223.1±0.5的质荷比(m/z)的布他比妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有42.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。
在一些实施方式中，分析物是他莫昔芬。在一些实施方式中，分析物是他莫昔芬的代谢物。在一些实施方式中，所述代谢物是诺吲哚昔芬(去甲吲哚昔芬，norendoxifen)。在一些实施方式中，所述代谢物是吲哚昔芬(endoxifen)或N-去甲基-4-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物是4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物是4-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物是N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物是N-去甲基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物选自诺吲哚昔芬、吲哚昔芬、4’-羟基他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬、N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬和N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，他莫昔芬或其代谢物提取自全血样品。
在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有372.2±0.5的质荷比(m/z)的他莫昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有72.14±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有374.2±0.5的质荷比(m/z)的吲哚昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有58.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有388.2±0.5的质荷比(m/z)的4-羟基他莫昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有72.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有374.2±0.5的质荷比(m/z)的N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有58.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有388.2±0.5的质荷比(m/z)的4’-羟基他莫昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有72.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有358.2±0.5的质荷比(m/z)的N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有58.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。
在一些实施方式中，分析物是肿瘤学药物。在一些实施方式中，分析物是阿那曲唑(anastrozole)。在一些实施方式中，分析物是来曲唑(letrozole)。在一些实施方式中，分析物是依西美坦(exemestane)。在一些实施方式中，分析物选自阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。在一些实施方式中，肿瘤学药物提取自全血样品。
在一些实施方式中，分析物是四氢大麻酚(THC)或其代谢物。在一些实施方式中，THC提取自尿样品。
在一些实施方式中，提取的分析物被水解。在一些实施方式中，分析物在提取前被水解。
在一些实施方式中，碰撞能量在大约5至60V的范围内。在一些实施方式中，碰撞能量在大约5至60V的范围内。
在另一方面，本文提供的是用于诊断患者中先天性肾上腺增生的方法。在一些实施方式中，本文提供的定量内源性类固醇的方法被用于诊断先天性肾上腺增生。
在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中THC使用的方法。在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中巴比妥酸盐使用的方法。在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中阿片剂使用的方法。在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中苯并二氧使用的方法。
在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中抗癫痫药物使用的方法。在另一方面，本文提供的是用于监测个体中抗癫痫药物功效的方法。
在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中他莫昔芬使用的方法。在另一方面，本文提供的是用于监测个体中他莫昔芬功效的方法。
在另一方面，本文提出的某些方法利用高分辨率/高准确度质谱法测定样品中分析物的量。在一些利用高准确度/高分辨率质谱法的实施方式中，方法包括：(a)在适合生成离子的条件下使来自样品的分析物经受电离源，其中离子是由质谱法可检测的；和(b)通过高分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种离子的量。在这些实施方式中，在步骤(b)中测定的一种或多种离子的量与样品中分析物的量相关。在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法在10,000的FWHM和50ppm的质量准确度下实施。在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法使用高分辨率/高准确度飞行时间(TOF)质谱仪实施。在一些实施方式中，电离条件包括在酸性条件下电离分析物。在一些相关的实施方式中，酸性条件包括在电离之前使用甲酸处理所述样品。
在本文描述的任何方法中，样品可以包括生物学样品。在一些实施方式中，生物学样品可以包括生物学流体诸如尿、血浆或血清。在一些实施方式中，生物学样品可以包括来自人的样品；诸如来自成年男性或女性，或青少年男性或女性，其中青少年在18岁以下、15岁以下、12岁以下或10岁以下。可以分析人样品以诊断或监测疾病状态或状况，或监测治疗疾病状态或状况的疗效。在一些相关的实施方式中，本文描述的方法可以被用于测定当取自人时的生物学样品中分析物的量。
在利用串联质谱法的实施方式中，可以通过本领域已知的任何方法实施串联质谱法，包括例如多反应监测、先驱离子扫描或产物离子扫描。
在一些实施方式中，串联质谱法包括使先驱离子破碎为一种或多种碎片离子。在测定两种或更多种碎片离子的量的实施方式中，量可以经受本领域已知的任何数学运算，以便使测量的离子量与样品中分析物的量相关。例如，两种或更多种碎片离子的量可以加和作为测定样品中分析物的量的一部分。
在一些实施方式中，在大于或等于大约10,000，诸如大于或等于大约15,000，诸如大于或等于大约20,000，诸如大于或等于大约25,000的分辨能力(FWHM)下，实施高分辨率/高准确度质谱法。在一些实施方式中，在小于或等于大约50ppm，诸如小于或等于大约20ppm，诸如小于或等于大约10ppm，诸如小于或等于大约5ppm；诸如小于或等于大约3ppm的准确度下，实施高分辨率/高准确度质谱法。在一些实施方式中，在大于或等于大约10,000的分辨能力(FWHM)和小于或等于大约50ppm的准确度下实施高分辨率/高准确度质谱法。在一些实施方式中，分辨能力大于大约15,000并且准确度小于或等于大约20ppm。在一些实施方式中，分辨能力大于或等于大约20,000并且准确度小于或等于大约10ppm；优选地分辨能力大于或等于大约20,000并且准确度小于或等于大约5ppm，诸如小于或等于大约3ppm。
在一些实施方式中，可以使用轨道阱质谱仪、飞行时间(TOF)质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(有时称为傅里叶变换质谱仪)实施高分辨率/高准确度质谱法。
可在正离子模式中进行质谱法(串联或高分辨率/高准确度质谱法)。可选地，可在负离子模式中进行质谱法。可以使用多种电离源——包括例如大气压化学电离(APCI)或电喷雾电离(ESI)——电离分析物。
在本文呈现的任何方法中，可以在样品中提供可单独检测的内标，其量也在样品中被测定。在利用可单独检测的内标的实施方式中，样品中存在的感兴趣的分析物和内标二者的所有或部分被电离以产生在质谱仪中可检测的多种离子，并且通过质谱法检测由每种产生的一种或多种离子。在这些实施方式中，通过与检测的内标离子的量比较，可以使由感兴趣的分析物生成的离子的存在或量与样品中感兴趣的分析物的存在或量相关。
可选地，通过与一种或多种外部参考标准物比较，可以测定样品中分析物的量。示例性外部参考标准物包括掺加(spike)有人或非人分析物、合成分析物类似物或其同位素标记的变体的空白血浆或血清。
上面描述的发明内容是非限制性的，并且根据下列具体实施方式和所附权利要求书，本发明的其它特征和优点将是清楚的。
附图说明
图1显示了由质谱法分析的14种类固醇的色谱图。
图2-5显示了通过本测试定量的正常成年男性中皮质醇(图2)、可的松(图3)、睾酮(图4)和雄烯二酮(图5)的正常水平。
图6-10显示了通过本测试定量的正常成年女性中孕酮(图6)、皮质醇(图7)、可的松(图8)、雄烯二酮(图9)、17-OH孕酮(图10)的正常水平。
图11-17显示了通过本测试定量的儿童中皮质醇(图11)、可的松(图12)、孕酮(图13)、雄烯二酮(图14)、睾酮(图15)、21-脱氧皮质醇(图16)和17-OH孕酮(图17)的水平。
图18显示了50-10,000ng/dL之间的睾酮的标准线性。
图19显示了他莫昔芬及其代谢物的色谱图。
图20显示了来曲唑、依西美坦和阿那曲唑的色谱图。
图21显示了阿片剂(羟吗啡酮、氢吗啡酮和可待因)和对应的内标的示例性色谱图。
图22显示了阿片剂(去甲羟考酮、羟考酮和去甲氢可酮)和对应的内标的示例性色谱图。
图23显示了阿片剂(吗啡、氢可酮和去甲芬太尼)和对应的内标的示例性色谱图。
图24显示了阿片剂(芬太尼)和对应的内标的示例性色谱图。
图25至28显示了使用20uL 管尖，利用葡糖醛酸糖苷酶水解从患者尿获得的吗啡、可待因、氢吗啡酮和羟考酮(分别地)数据。
图29显示了使用50uL 管尖从患者唾液获得的羟考酮数据。
图30和31分别显示了丁丙诺啡叔丁啡和去甲芬太尼的血细胞比容研究的结果。
图32和33显示了掺加有巴比妥酸盐(司可巴比妥、异戊巴比妥、戊巴比妥和硫喷妥)的阴性尿的结果。
图34至38显示了对苯巴比妥和布他比妥定量的各种患者样品的结果。
图39显示使用20uL管尖和葡糖醛酸糖苷酶水解的患者样品中THC羧基代谢物分析的结果。
图40显示了加巴喷丁和卢非酰胺的血细胞比容研究的结果。
图41显示了25-羟基维生素D分析的色谱图。
图42显示了25-羟基维生素D2分析的校准曲线。
图43显示了25-羟基维生素D3分析的校准曲线。
具体实施方式
如本文使用的，除非另外规定，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因而，例如，提及“蛋白质”包括多个蛋白质分子。
如本文使用的，术语“纯化(purification)”、“纯化(purifying)”和“富集”不指从样品去除——除感兴趣的分析物(一种或多种)之外——所有材料。相反，这些术语指的是相对于样品中可能干扰感兴趣的分析物的检测的其它组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量的过程。通过多种手段纯化样品可以允许相对减少一种或多种干扰物质，如，可能干扰或可能不干扰通过质谱法检测选择的母离子或子离子的一种或多种物质。相对减少——当使用此术语时——不需要通过纯化完全地去除在待纯化的材料中与感兴趣的分析物一起存在的任何物质。
如本文使用的，术语“免疫纯化(immunopurification)”或“免疫纯化(immunopurify)”指的是利用抗体——其包括多克隆或单克隆抗体——富集一种或多种感兴趣的分析物的纯化过程。可以使用本领域熟知的任何免疫纯化方法进行免疫纯化。通常，免疫纯化过程利用结合、缀合或以其它方式附加至固相支持体——例如柱、孔、管、凝胶、胶囊、颗粒等——的抗体。如本文使用的免疫纯化包括但不限于本领域通常称为免疫沉淀的程序，以及本领域通常称为亲和色谱法或免疫亲和色谱法的过程。
如本文使用的，术语“免疫颗粒”指的是胶囊、珠、凝胶颗粒等，其具有结合、缀合或以其它方式附加至其表面(颗粒上和/或颗粒中)的抗体。在某些优选的实施方式中，免疫颗粒是琼脂糖凝胶或琼脂糖珠。在可选的优选实施方式中，免疫颗粒包括玻璃珠、塑料珠或二氧化硅珠，或硅胶。
如本文使用的，术语“样品”指的是可能包含感兴趣的分析物的任何样品。如本文使用的，术语“体液”意思是可以从个体的身体分离的任何流体。例如，“体液”可以包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿、眼泪、汗等。在优选的实施方式中，样品包括来自人的体液样品；优选地，血浆或血清。
如本文使用的，术语“固相提取”或“SPE”指的是由于溶解或悬浮于溶液(即，流动相)的组分对溶液穿过或围绕的固体(即，固相)的亲和力，化学混合物分离为组分的过程。在一些情况下，在流动相穿过或围绕固相时，固相可以保留流动相的非期望的组分，其导致纯化流动相中的分析物。在其它情况下，固相可以保留分析物，其允许流动相的非期望的组分穿过或围绕固相。在这些情况下，然后使用第二流动相将保留的分析物从固相洗脱下用于进一步的加工或分析。SPE——包括TFLC——可以经由单一或混合模式机制操作。混合模式机制利用相同柱中的离子交换和疏水保留；例如，混合模式SPE柱的固相可展示出强的阴离子交换和疏水保留；或可以展示出强的阳离子交换和疏水保留。
通常，SPE柱填充材料对分析物的亲和力可能由于各种机制中的任一种，诸如一种或多种化学相互作用或免疫亲和相互作用。在一些实施方式中，在不使用免疫亲和柱填充材料的情况下实施分析物的SPE。即，在一些实施方式中，通过不是免疫亲和柱的SPE柱从样品纯化分析物。
如本文使用的，术语“色谱法”指的是由于在化学实体围绕固定液相或固相或在其上流动时它们的差异性分布，液体或气体携带的化学混合物分离为组分的过程。
如本文使用的，术语“液相色谱法”或“LC”意思是在流体均匀地渗透过细碎物质的柱或渗透过毛细管通道时，选择性地阻滞流体溶液的一种或多种组分的过程。阻滞由如下引起：在此流体相对于固定相(一种或多种)移动时，混合物的组分在一种或多种固定相和体相流体(bulk fluid)(即，流动相)之间的分布。“液相色谱法”的实例包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和湍流液相色谱法(TFLC)(有时称为高湍流液相色谱法(HTLC)或高通量液相色谱法)。
如本文使用的，术语“高效液相色谱法”或“HPLC”(有时称为“高压液相色谱法”)指的是通过在压力下迫使流动相穿过固定相——通常致密填充柱——增加分离程度的液相色谱法。
如本文使用的，术语“湍流液相色谱法”或“TFLC”(有时称为高湍流液相色谱法或高通量液相色谱法)指的是利用被试验的材料湍流通过柱填充物作为进行分离的基础的色谱法形式。TFLC已经被应用于在通过质谱法分析之前制备包含两种不知名的药物的样品。参见，如，Zimmer et al.,J Chromatogr A 854:23-35(1999)；还参见，美国专利号5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874，其进一步说明了TFLC。本领域普通技术人员理解“湍流”。当流体缓慢地和平稳地流动时，流动被称为“层流”。例如，以低流速移动通过HPLC柱的流体是层流的。在层流中，流体颗粒的运动是有序的，其中颗粒通常以基本上直线移动。在较快的速度下，水的惯性克服流体摩擦力并且湍流产生。未接触不规则边界的流体“超过”通过摩擦减慢或通过粗糙表面偏转的流体。当流体湍流地流动时，其以涡流和旋转(或漩涡)流动，其具有比流动是层流的时更大的“阻力”。许多参考可获得用于帮助确定流体流动何时是层流的或湍流的(例如，Turbulent Flow Analysis:Measurement and Prediction,P.S.Bernard&J.M.Wallace,John Wiley&Sons,Inc.,(2000)；An Introduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu&Julian Scott,Cambridge UniversityPress(2001))。
如本文使用的，术语“气相色谱法”或“GC”指的是如下色谱法：其中样品混合物被汽化并注入移动通过柱——其包含由液体或微粒固体组成的固定相——的运载气体流(如氮气或氦气)，并且根据化合物对固定相的亲和力分离为其组分化合物。
如本文使用的，术语“大颗粒柱”或“提取柱”指的是包含大于大约50μm的平均粒径的色谱柱。如在此上下文中使用的，术语“大约”意思是±10％。
如本文使用的，术语“分析柱”指的是如下色谱柱：其具有足够的色谱板以实现在从柱洗脱的样品中分离材料，其足以允许测定分析物的存在或量。这样的柱通常区别于“提取柱”——其具有从非保留的材料分离或提取保留的材料以便获得纯化的样品用于进一步的分析的通用目的。如在此上下文中使用的，术语“大约”意思是±10％。在优选的实施方式中，分析柱包含直径大约5μm的颗粒。
如本文使用的，术语“在线(on-line)”和“联机(inline)”，例如如在“在线自动化方式”或“在线提取”中使用的，指的是在不需要操作者介入的情况下进行的程序。相反，如本文使用的术语“离线(off-line)”指的是需要操作者手动介入的程序。因而，如果样品经历沉淀并且上清液然后被手动装载入自动采样器，则沉淀和装载步骤与后续步骤是离线的。在方法的多个实施方式中，一个或多个步骤可以以在线自动化方式进行。
如本文使用的，术语“质谱法”或“MS”指的是通过化合物的质量鉴定化合物的分析技术。MS指的是基于离子的质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。MS技术通常包括(1)电离化合物以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比。可以通过任何合适的手段电离和检测化合物。“质谱仪”通常包括电离器、质量分析器和离子检测器。一般而言，一种或多种感兴趣的分子被电离，并且离子随后被引入质谱仪器，在其中由于磁场和电场的组合，离子遵循空间中依赖于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径。参见，例如，标题为“Mass Spectrometry From Surfaces”的美国专利号6,204,500；标题为“Methodsand Apparatus for Tandem Mass Spectrometry”的美国专利号6,107,623；标题为“DNADiagnostics Based On Mass Spectrometry”的美国专利号6,268,144；标题为“Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection OfAnalytes”的美国专利号6,124,137；Wright et al.,Prostate Cancer and ProstaticDiseases 1999,2:264-76；和Merchant and Weinberger,Electrophoresis 2000,21:1164-67。
如本文使用的，“高分辨率/高准确度质谱法”指的是使用质量分析器——其能够以足够的精确度和准确度测定带电物类的质荷比以确认独特的化学离子——实施的质谱法。当来自离子的个体同位素峰可容易地分辨时，对该离子确认独特的化学离子是可能的。确认独特的化学离子需要的具体的分辨能力和质量准确度随着离子的质量和电荷状态而变化。
如本文使用的，术语“分辨能力”或“分辨能力(FWHM)”(本领域也称为“m/Δm50％”)指的是观察到的质荷比除以在50％最大高度处质量峰的宽度(半峰全宽，“FWHM”)。在图1A-C中图解了分辨能力差异的影响，其显示了m/z为大约1093的离子的理论质谱。图1A显示了来自分辨能力为大约3000(常规的四极质量分析器的典型操作条件)的质量分析器的理论质谱。如图1A中可见，没有个体同位素峰可分辨。通过比较，图1B显示了来自分辨能力为大约10,000的质量分析器的理论质谱，其具有清晰可分辨的个体同位素峰。图1C显示了来自分辨能力为大约12,000的质量分析器的理论质谱。在此最高分辨能力下，个体同位素峰包含小于1％的来自基线的贡献。
如本文使用的，关于质谱法的“独特的化学离子”指的是具有单个原子组成的单个离子。单个离子可以是单电荷的或多电荷的。
如本文使用的，关于质谱法的术语“准确度”(或“质量准确度”)指的是仪器响应与调查的离子的真实m/z的潜在偏差。通常以百万分之一(ppm)表示准确度。在图2A-D中图解了质量准确度差异的影响，其显示了对于在1093.52094的m/z处的理论峰，检测的m/z和实际的m/z之间的潜在差异的界限。图2A显示了在120ppm的准确度下检测的m/z的潜在范围。相比之下，图2B显示了50ppm的准确度下检测的m/z的潜在范围。图2C和2D显示了20ppm和10ppm的准确度下检测的m/z的甚至更窄的潜在范围。
本发明的高分辨率/高准确度质谱方法可以在能够以大于10,000、15,000、20,000、25,000、50,000、100,000或甚至更大的FWHM进行质量分析的仪器上实施。同样，本发明的方法可以在能够以小于50ppm、20ppm、15ppm、10ppm、5ppm、3ppm或甚至更小的准确度进行质量分析的仪器上实施。能够具有这些性能特性的仪器可以包含某些轨道阱质量分析器、飞行时间(“TOF”)质量分析器、或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器。在优选的实施方式中，使用包括轨道阱质量分析器或TOF质量分析器的仪器实施方法。
术语“轨道阱”描述了由外部桶形电极和同轴内部电极构成的离子阱。离子切线地注入电极之间的电场，并且在离子围绕同轴内部电极运行时，离子因为离子和电极之间的静电相互作用被离心力平衡而被捕获。在离子围绕同轴内部电极运行时，捕获的离子的轨迹沿着中心电极的轴以相对于离子的质荷比的谐振频率振荡。检测轨道振荡频率允许轨道阱被用作具有高准确度(低至1-2ppm)和高分辨能力(FWHM)(高至大约200,000)的质量分析器。基于轨道阱的质量分析器在美国专利号6,995,364中详细描述，其通过引用以其整体并入本文。已经报道将轨道阱分析器用于多种分析物的定性和定量分析。参见，例如，美国专利申请公布号2008/0118932(2007年11月9日提交)；et al.,Rapid Commun.MassSpectrom.,2008,22:477-485；Le Breton,et al.,Rapid Commun.Mass Spectrom.,2008,22:3130-36；Thevis,et al.,Mass Spectrom.Reviews,2008,27:35-50；Thomas,et al.,J.Mass Spectrom.,2008,43:908-15；Schenk,et al.,BMC Medical Genomics,2008,1:41；和Olsen,et al.,Nature Methods,2007,4:709-12。
如本文使用的，术语“在负离子模式中操作”指的是其中生成并检测负离子的那些质谱方法。如本文使用的，术语“在正离子模式中操作”指的是其中生成并检测正离子的那些质谱方法。在优选的实施方式中，质谱法在正离子模式中实施。
如本文使用的，术语“电离(ionization)”或术语“电离(ionizing)”指的是生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的那些，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的那些。
如本文使用的，术语“电子电离”或“EI”指的是其中气相或蒸汽相中感兴趣的分析物与电子流相互作用的方法。电子与分析物的碰撞产生分析物离子，其然后可以经受质谱技术。
如本文使用的，术语“化学电离”或“CI”指的是如下方法：其中试剂气体(例如氨)经受电子碰撞，并且通过试剂气体离子和分析物分子的相互作用形成分析物离子。
如本文使用的，术语“快原子轰击”或“FAB”指的是如下方法：其中高能原子(通常，Xe或Ar)束碰撞不挥发的样品，解吸和电离在样品中包含的分子。测试样品溶解于粘性液体基质比如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。用于化合物或样品的适当的基质的选择是经验过程。
如本文使用的，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”指的是如下方法：其中不挥发的样品被暴露于激光照射，其通过多种电离途径——包括光致电离、质子化、去质子化和集团衰变(cluster decay)——解吸和电离样品中的分析物。对于MALDI，样品与能量吸收基质混合，后者促进分析物分子的解吸。
如本文使用的，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”指的是另一种方法：其中不挥发的样品被暴露于激光照射，其通过多种电离途径——包括光致电离、质子化、去质子化和集团衰变——解吸和电离样品中的分析物。对于SELDI，样品通常被结合至优先地保留一种或多种感兴趣的分析物的表面。如在MALDI中，此过程也可以采用能量吸收材料以促进电离。
如本文使用的，术语“电喷雾电离”或“ESI”指的是使溶液沿着毛细管——向其末端施加高的正或负电势——的短长度穿过的方法。到达管的末端的溶液被汽化(雾化)为溶剂蒸汽中极小的溶液液滴的喷射流(jet)或喷雾。此雾滴流动通过蒸发室。随液滴变小，电气表面电荷密度增加，直到相同电荷之间的自然排斥使得离子以及中性分子被释放的这类时刻。
如本文使用的，术语“大气压化学电离”或“APCI”指的是类似于ESI的质谱方法；然而，APCI通过在大气压下在等离子体内发生的离子-分子反应产生离子。通过喷雾毛细管和对电极之间的放电维持等离子体。然后，通常通过使用一组差动泵送的撇取器站(differentially pumped skimmer stage)将离子提取入质量分析器。干燥的和预热的N2气体的逆流可以被用于改进溶剂的去除。APCI中的气相电离可以比ESI更有效地用于分析低极性物类。
如本文使用的，术语“大气压光致电离”或“APPI”指的是其中电离分子M的机制是光子吸收和电子发射以形成分子离子M+的质谱法形式。因为光子能量通常仅高于电离电位，所以分子离子较不易于解离。在许多情况下，在不需要色谱法的情况下分析样品可以是可能的，因而节约了显著的时间和费用。在存在水蒸汽或质子溶剂的情况下，分子离子可以提取H以形成MH+。如果M具有高质子亲和力，这倾向于发生。因为M+和MH+的总和是常数，所以这并不影响定量准确度。质子溶剂中的药物化合物通常被观察为MH+，而非极性化合物比如萘或睾酮通常形成M+。参见，例如，Robb et al.,Anal.Chem.2000,72(15):3653-3659。
如本文使用的，术语“电感耦合等离子体”或“ICP”指的是如下方法：其中样品在足够高的温度下与部分电离的气体相互作用，以便大部分元素被原子化和电离。
如本文使用的，术语“场解吸”指的是如下方法：其中不挥发的测试样品被放置在电离表面上，并且强电场被用于生成分析物离子。
如本文使用的，术语“解吸”指的是从表面去除分析物和/或使分析物进入气相。激光解吸热解吸是如下技术：其中通过激光脉冲将包含分析物的样品热解吸入气相。激光击中具有金属基底的特制的96孔板的背面。激光脉冲加热基底并且热引起样品转移入气相。气相样品然后被吸入质谱仪。
如本文使用的，术语“选择性离子监测”是质谱仪器的检测模式，其中仅检测相对窄的质量范围内——通常大约一个质量单位——的离子。
如本文使用的，“多反应模式”——有时称为“选择的反应监测”——是质谱仪器的检测模式，其中选择性地检测先驱离子和一种或多种碎片离子。
如本文使用的，术语“量化下限”、“定量下限”或“LLOQ”指的是测量变得数量上有意义的点。在此LOQ处的分析物反应是可鉴定的、离散的和可再现的，其具有小于20％的相对标准偏差(RSD％)和85％至115％的准确度。
如本文使用的，术语“检测限”或“LOD”是测量值大于与其相关联的不确定性的点。LOD是值超过与其测量相关联的不确定性的点，并且被定义为零浓度下平均值的RSD的3倍。
如本文使用的，体液样品中分析物的“量”通常指的是反映在样品的体积中可检测的分析物的质量的绝对值。然而，量也考虑与另一种分析物量比较的相对量。例如，样品中分析物的量可以是大于在样品中正常存在的分析物的对照或正常水平的量。
如本文关于定量测量——不包括离子质量的测量——使用的术语“大约”指的是指示的值加或减10％。在测定给定的分析物的质量中，质谱仪器可以轻微地变化。在离子的质量或离子的质/荷比的上下文中的术语“大约”指的是+/-0.50个原子质量单位。
从新生儿收集静脉血可能是有问题的。虽然对于综合类固醇组(活CAH组)所需要的最小血清体积是最小的，但是通过静脉穿刺获得至少1-2mL的全血。使用微量取样装置(Mitra管尖)仅仅需要20uL的毛细血管血并且使得其更加容易和更少侵入性，尤其对于新生儿，其消除了进行静脉穿刺的需要。
在一个方面，本文提供的是用于质谱定量由微量取样装置收集和提取的分析物的方法。
在某些实施方式中，本文提供的方法涉及定量样品中分析物的量，其包括：(a)从通过微量取样装置收集的样品提取分析物；(b)电离分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和(c)通过质谱法测定一种或多种离子的量。在一些实施方式中，测定的一种或多种离子的量被用于测定样品中分析物的量。在一些实施方式中，样品中分析物的量与患者中分析物的量相关。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括在质谱法之前纯化样品。在一些实施方式中，方法包括使用液相色谱法纯化样品。在一些实施方式中，液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)或高湍流液相色谱法(HTLC)。在一些实施方式中，方法包括使样品经受固相提取(SPE)。在一些实施方式中，方法包括使样品经受反相分析柱。
在一些实施方式中，本文提供的方法涉及定量样品中分析物的量，其包括：(a)从通过微量取样装置收集的样品提取分析物，(b)通过液相色谱法纯化样品，(c)电离分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和(d)通过质谱法测定一种或多种离子的量。在一些实施方式中，测定的一种或多种离子的量被用于测定样品中分析物的量。在一些实施方式中，样品中分析物的量与患者中分析物的量相关。
在一些实施方式中，质谱法包括串联质谱法。在一些实施方式中，质谱法是高分辨率质谱法。在一些实施方式中，质谱法是高分辨率/高准确度质谱法。
在一些实施方式中，电离是通过大气压化学电离(APCI)。在一些实施方式中，电离是通过电喷雾电离(ESI)。在一些实施方式中，所述电离处于正离子模式。在一些实施方式中，所述电离处于负离子模式。
在一些实施方式中，包含样品的微量取样装置被置于96-孔板中。在一些实施方式中，包含样品的微量取样装置被置于96-置放架中。在一些实施方式中，自动化机器将96-置放架置于96-孔板中。在一些实施方式中，自动化机器是自动化机器。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括向样品添加内标。在一些实施方式中，内标是标记的。在一些实施方式中，内标是氘化的或同位素标记的。在一些实施方式中，内标添加有提取缓冲液。在一些实施方式中，利用内标预浸微量取样装置并干燥。
在一些实施方式中，提取步骤包括向通过微量取样装置收集的样品添加提取缓冲液。在一些实施方式中，提取步骤包括将包含样品的微量取样装置置于包含提取溶剂的96-孔板中。在一些实施方式中，提取步骤是自动化的。在一些实施方式中，使96-孔板涡旋(vortexed)然后移除微量取样装置的吸收管尖。在一些实施方式中，提取步骤包括在氮气下干燥。在一些实施方式中，提取步骤包括重构样品为溶液。在一些实施方式中，重构包括向样品添加含水酸或有机溶液或两者。在一些实施方式中，重构的溶液被过滤。
在一些实施方式中，提取的样品被注入质谱系统。在一些实施方式中，提取的样品被注入液相色谱法。在一些实施方式中，以在线方式执行提取和质谱法步骤从而允许自动化的样品分析。在一些实施方式中，以在线方式执行提取、纯化和质谱法步骤从而允许自动化的样品分析。
在一些实施方式中，分析物是非衍生化的。
在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品不需要样品加工。
在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品是全血。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品是尿。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品是唾液。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品是血清或血浆。
在一些实施方式中，微量取样装置包括收集样品的吸收管尖。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品吸收固定体积的患者流体。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有小于或等于150μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有小于或等于100μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有小于或等于50μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有5μL和150μL之间的体积，包括端点。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有10μL和100μL之间的体积，包括端点。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约10μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约15μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约20μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约30μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约50μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品具有大约100μL的体积。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品吸收固定体积的血液，不管血细胞比容的量如何。
在一些实施方式中，本文提供的方法涉及定量样品中分析物的量，其包括(a)从小于或等于100μL的样品提取分析物；(b)电离分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和(c)通过质谱法测定一种或多种离子的量。在一些实施方式中，测定的一种或多种离子的量被用于测定样品中分析物的量。在一些实施方式中，样品中分析物的量与患者中分析物的量相关。
在一些实施方式中，本文提供的方法涉及定量样品中分析物的量，其包括(a)从小于或等于100μL的样品提取分析物；(b)通过液相色谱法纯化样品；(c)电离分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和(d)通过质谱法测定一种或多种离子的量。在一些实施方式中，测定的一种或多种离子的量被用于测定样品中分析物的量。在一些实施方式中，样品中分析物的量与患者中分析物的量相关。
在一些实施方式中，方法包括从小于或等于50μL的样品提取分析物。在一些实施方式中，方法包括从小于或等于30μL的样品提取分析物。在一些实施方式中，方法包括从小于或等于20μL的样品提取分析物。在一些实施方式中，方法包括从小于或等于15μL的样品提取分析物。在一些实施方式中，方法包括从小于或等于10μL的样品提取分析物。
在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以在没有冷藏或冷冻的情况下运输。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以在没有干冰的情况下运输。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以在室温下运输。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以被运输而没有生物危害担忧。
在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品需要少量训练进行收集。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以在任何地方收集。在一些实施方式中，通过微量取样装置收集的样品可以在环境温度下干燥进行船运。
在一些实施方式中，微量取样装置是管尖。在一些实施方式中，微量取样装置被包裹在设计用于自动化提取和质谱分析的盒中。
在一些实施方式中，方法进一步包括利用微量取样装置收集样品。在一些实施方式中，收集步骤包括执行手指刺破和施加微量取样装置的吸收管尖至血液。在一些实施方式中，收集步骤包括在患者的尿或唾液中施加吸收管尖。在一些实施方式中，风干在微量取样装置中收集的样品。在一些实施方式中，在运输之前风干在微量取样装置中收集的样品1至2小时。
在一些实施方式中，分析物是类固醇。在一些实施方式中，类固醇是皮质醇、可的松、孕酮、17-羟基孕酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、皮质酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、孕烯醇酮、17-羟基孕烯醇酮、18-羟基皮质酮或21-脱氧皮质醇。在一些实施方式中，分析物是用于诊断先天性肾上腺增生(CAH)的类固醇组中的类固醇。在一些实施方式中，类固醇选自皮质醇、可的松、孕酮、17-羟基孕酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、皮质酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、孕烯醇酮、17-羟基孕烯醇酮、18-羟基皮质酮和21-脱氧皮质醇。在一些实施方式中，类固醇是25-羟基维生素D2或25-羟基维生素D3。
在一些实施方式中，分析物是阿片剂。在一些实施方式中，阿片剂是顺式曲蚂多、O-去甲基曲蚂多、他喷他多、N-去甲基他喷他多、可待因、吗啡、羟吗啡酮、去甲氢可酮、羟考酮、去甲羟考酮、氢吗啡酮、氢可酮、丁丙诺啡叔丁啡、去甲丁丙诺啡叔丁啡、芬太尼、去甲芬太尼、6-单乙酰基吗啡(6-MAM)、美沙酮、二氢可待因、纳洛酮、纳曲酮、6β-纳曲醇、烯丙吗啡、纳布啡或2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷(EDDP)。在一些实施方式中，阿片剂选自顺式曲蚂多、O-去甲基曲蚂多、他喷他多、N-去甲基他喷他多、可待因、吗啡、羟吗啡酮、去甲氢可酮、羟考酮、去甲羟考酮、氢吗啡酮、氢可酮、丁丙诺啡叔丁啡、去甲丁丙诺啡叔丁啡、芬太尼、去甲芬太尼、6-单乙酰基吗啡(6-MAM)、美沙酮、二氢可待因、纳洛酮、纳曲酮、6β-纳曲醇、烯丙吗啡、纳布啡和2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷(EDDP)。在一些实施方式中，阿片剂提取自全血、唾液或尿样品。
在一些实施方式中，分析物是苯并二氧在一些实施方式中，苯并二氧是奥沙西泮、羟基安定、劳拉西泮、去甲地西泮、地西泮、氯氮草、三唑仑、咪达唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、溴西泮、氯巴占、硝西泮、溴氯苯基二氢苯并二氮杂酮、环丙安定、去氧安定、氟硝西泮或氟西泮。在一些实施方式中，苯并二氧选自奥沙西泮、羟基安定、劳拉西泮、去甲地西泮、地西泮、氯氮草、三唑仑、咪达唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、溴西泮、氯巴占、硝西泮、溴氯苯基二氢苯并二氮杂酮、环丙安定、去氧安定、氟硝西泮和氟西泮。在一些实施方式中，苯并二氧提取自全血或尿样品。
在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有316±0.5的质荷比(m/z)的溴西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有214±0.5或270±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有287±0.5的质荷比(m/z)的奥沙西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有104±0.5或241±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有300±0.5的质荷比(m/z)的氯巴占先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有224±0.5或259±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有282±0.5的质荷比(m/z)的硝西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有180±0.5或236±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有309.1±0.5的质荷比(m/z)的阿普唑仑先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有165±0.5或280.9±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有343±0.5的质荷比(m/z)的三唑仑先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有206±0.5或308±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有316±0.5的质荷比(m/z)的氯硝西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有214±0.5或270±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有388±0.5的质荷比(m/z)的氟西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有287.9±0.5或315±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有321±0.5的质荷比(m/z)的劳拉西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有229.1±0.5或331±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有314±0.5的质荷比(m/z)的氟硝西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有211±0.5或268±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有301.1±0.5的质荷比(m/z)的羟基安定先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有177±0.5或255±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有326±0.5的质荷比(m/z)的咪达唑仑先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有129±0.5或244±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有271±0.5的质荷比(m/z)的去甲地西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有139.8±0.5或165±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有351±0.5的质荷比(m/z)的溴氯苯基二氢苯并二氮杂酮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有185.9±0.5或206±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有301±0.5的质荷比(m/z)的氯地西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有259±0.5或224±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有285±0.5的质荷比(m/z)的地西泮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有154±0.5或193±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有325±0.5的质荷比(m/z)的环丙安定先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有165±0.5或271±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有271±0.5的质荷比(m/z)的去氧安定先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有180±0.5或207.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。
在一些实施方式中，分析物是抗癫痫药物。在一些实施方式中，抗癫痫药物是丙戊酸、替加宾、托吡酯、左乙拉西坦、拉莫三嗪、拉科酰胺、乙琥胺、卡马西平、艾司利卡马西平、10,11-卡马西平、苯巴比妥、卢非酰胺、扑米酮、苯妥英、唑尼沙胺、非氨酯、加巴喷丁或普瑞巴林。在一些实施方式中，抗癫痫药物选自丙戊酸、替加宾、托吡酯、左乙拉西坦、拉莫三嗪、拉科酰胺、乙琥胺、卡马西平、艾司利卡马西平、10,11-卡马西平、苯巴比妥、卢非酰胺、扑米酮、苯妥英、唑尼沙胺、非氨酯、加巴喷丁和普瑞巴林。在一些实施方式中，抗癫痫药物提取自全血样品。
在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有339±0.5的质荷比(m/z)的非氨酯先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有117.3±0.5或261±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有142±0.5的质荷比(m/z)的乙琥胺先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有44.3±0.5或39.3±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有251±0.5的质荷比(m/z)的拉科酰胺先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有91.2±0.5或65.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有256±0.5的质荷比(m/z)的拉莫三嗪先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有211±0.5或145±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有338.2±0.5的质荷比(m/z)的托吡酯先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有78.2±0.5或96.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有172.3±0.5的质荷比(m/z)的加巴喷丁先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有91.2±0.5或67.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有297.1±0.5的质荷比(m/z)的艾司利卡西平先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有194±0.5或179±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有219.8±0.5的质荷比(m/z)的扑米酮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有79±0.5或135.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有160.1±0.5的质荷比(m/z)的普瑞巴林先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有55.2±0.5或77.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有237±0.5的质荷比(m/z)的卡马西平先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有194.1±0.5或179±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有231±0.5的质荷比(m/z)的苯巴比妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有44.2±0.5或188.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有236.2±0.5的质荷比(m/z)的环氧化物先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有141.2±0.5或112.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有213.2±0.5的质荷比(m/z)的唑尼沙胺先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有77.2±0.5或102.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有376.2±0.5的质荷比(m/z)的替加宾先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有111.1±0.5或149.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有253.1±0.5的质荷比(m/z)的苯妥英先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有104.2±0.5或182.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有171.2±0.5的质荷比(m/z)的左乙拉西坦先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有126.2±0.5或69.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有143±0.5的质荷比(m/z)的丙戊酸先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有143±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有239±0.5的质荷比(m/z)的卢非酰胺先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有127.2±0.5或261±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有219±0.5的质荷比(m/z)的扑米酮先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有126±0.5或141±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有350±0.5的质荷比(m/z)的托吡酯D12先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有78.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有256±0.5的质荷比(m/z)的环氧化物D3先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有77±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有259±0.5的质荷比(m/z)的拉莫三嗪13C3先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有214±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有177.2±0.5的质荷比(m/z)的左乙拉西坦D6先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有132.2±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。
在一些实施方式中，分析物是免疫抑制剂。在一些实施方式中，免疫抑制剂是环孢菌素A、西罗莫司、他克莫司或依维莫司。在一些实施方式中，免疫抑制剂选自环孢菌素A、西罗莫司、他克莫司和依维莫司。在一些实施方式中，免疫抑制剂提取自全血样品。
在一些实施方式中，分析物是巴比妥酸盐。在一些实施方式中，巴比妥酸盐是苯巴比妥、异戊巴比妥、布他比妥、戊巴比妥、司可巴比妥或硫喷妥。在一些实施方式中，巴比妥酸盐选自苯巴比妥、异戊巴比妥、布他比妥、戊巴比妥、司可巴比妥和硫喷妥。在一些实施方式中，巴比妥酸盐提取自全血样品。
在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有237.0±0.5的质荷比(m/z)的司可巴比妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有42.0±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有225.0±0.5的质荷比(m/z)的异戊巴比妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有182.0±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有225.6±0.5的质荷比(m/z)的戊巴比妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有42.0±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有241.0±0.5的质荷比(m/z)的硫喷妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有57.9±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有231.0±0.5的质荷比(m/z)的苯巴比妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有42.0±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有223.1±0.5的质荷比(m/z)的布他比妥先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有42.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。
在一些实施方式中，分析物是他莫昔芬。在一些实施方式中，分析物是他莫昔芬的代谢物。在一些实施方式中，所述代谢物是诺吲哚昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物是吲哚昔芬或N-去甲基-4-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物是4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物是4-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物是N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物是N-去甲基他莫昔芬。在一些实施方式中，所述代谢物选自诺吲哚昔芬、吲哚昔芬、4’-羟基他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬、N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬和N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬。在一些实施方式中，他莫昔芬或其代谢物提取自全血样品。
在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有372.2±0.5的质荷比(m/z)的他莫昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有72.14±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有374.2±0.5的质荷比(m/z)的吲哚昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有58.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有388.2±0.5的质荷比(m/z)的4-羟基他莫昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有72.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有374.2±0.5的质荷比(m/z)的N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有58.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有388.2±0.5的质荷比(m/z)的4’-羟基他莫昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有72.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有358.2±0.5的质荷比(m/z)的N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬先驱离子。在一些实施方式中，一种或多种离子包括具有58.1±0.5的质荷比(m/z)的一种或多种碎片离子。
在一些实施方式中，分析物是肿瘤学药物。在一些实施方式中，分析物是阿那曲唑。在一些实施方式中，分析物是来曲唑。在一些实施方式中，分析物是依西美坦。在一些实施方式中，分析物选自阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。在一些实施方式中，肿瘤学药物提取自全血样品。
在一些实施方式中，分析物是四氢大麻酚(THC)或其代谢物。在一些实施方式中，THC提取自尿样品。
在一些实施方式中，提取的分析物被水解。在一些实施方式中，分析物在提取之前被水解。
在一些实施方式中，碰撞能量在大约5至60V的范围内。在一些实施方式中，碰撞能量在大约5至60V的范围内。
在另一方面，本文提供的是用于诊断患者中先天性肾上腺增生的方法。在一些实施方式中，本文提供的定量内源性类固醇的方法被用于诊断先天性肾上腺增生。
在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中THC使用的方法。在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中巴比妥酸盐使用的方法。在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中阿片剂使用的方法。在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中苯并二氧使用的方法。
在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中抗癫痫药物使用的方法。在另一方面，本文提供的是用于监测个体中抗癫痫药物功效的方法。
在另一方面，本文提供的是用于检测或监测个体中他莫昔芬使用的方法。在另一方面，本文提供的是用于监测个体中他莫昔芬功效的方法。
在另一方面，本文提出的某些方法利用高分辨率/高准确度质谱法测定样品中分析物的量。在一些利用高准确度/高分辨率质谱法的实施方式中，方法包括：(a)在适合生成离子的条件下使来自样品的分析物经受电离源，其中离子是由质谱法可检测的；和(b)通过高分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种离子的量。在这些实施方式中，在步骤(b)中测定的一种或多种离子的量与样品中分析物的量相关。在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法在10,000的FWHM和50ppm的质量准确度下实施。在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法使用高分辨率/高准确度飞行时间(TOF)质谱仪实施。在一些实施方式中，电离条件包括在酸性条件下电离分析物。在一些相关的实施方式中，酸性条件包括在电离之前使用甲酸处理所述样品。
在本文描述的任何方法中，样品可以包括生物学样品。在一些实施方式中，生物学样品可以包括生物学流体诸如尿、血浆或血清。在一些实施方式中，生物学样品可以包括来自人的样品；诸如来自成年男性或女性，或青少年男性或女性，其中青少年在18岁以下、15岁以下、12岁以下或10岁以下。可以分析人样品以诊断或监测疾病状态或状况，或监测治疗疾病状态或状况的疗效。在一些相关的实施方式中，本文描述的方法可以被用于测定当取自人时的生物学样品中分析物的量。
在利用串联质谱法的实施方式中，可以通过本领域已知的任何方法实施串联质谱法，包括例如多反应监测、先驱离子扫描或产物离子扫描。
在一些实施方式中，串联质谱法包括使先驱离子破碎为一种或多种碎片离子。在测定两种或更多种碎片离子的量的实施方式中，量可以经受本领域已知的任何数学运算，以便使测量的离子量与样品中分析物的量相关。例如，两种或更多种碎片离子的量可以加和作为测定样品中分析物的量的一部分。
在一些实施方式中，在大于或等于大约10,000，诸如大于或等于大约15,000，诸如大于或等于大约20,000，诸如大于或等于大约25,000的分辨能力(FWHM)下，实施高分辨率/高准确度质谱法。在一些实施方式中，在小于或等于大约50ppm，诸如小于或等于大约20ppm，诸如小于或等于大约10ppm，诸如小于或等于大约5ppm；诸如小于或等于大约3ppm的准确度下，实施高分辨率/高准确度质谱法。在一些实施方式中，在大于或等于大约10,000的分辨能力(FWHM)和小于或等于大约50ppm的准确度下实施高分辨率/高准确度质谱法。在一些实施方式中，分辨能力大于大约15,000并且准确度小于或等于大约20ppm。在一些实施方式中，分辨能力大于或等于大约20,000并且准确度小于或等于大约10ppm；优选地分辨能力大于或等于大约20,000并且准确度小于或等于大约5ppm，诸如小于或等于大约3ppm。
在一些实施方式中，可以使用轨道阱质谱仪、飞行时间(TOF)质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(有时称为傅里叶变换质谱仪)实施高分辨率/高准确度质谱法。
可在正离子模式中进行质谱法(串联或高分辨率/高准确度质谱法)。可选地，可在负离子模式中进行质谱法。可以使用多种电离源——包括例如大气压化学电离(APCI)或电喷雾电离(ESI)——电离分析物。
在本文呈现的任何方法中，可以在样品中提供可单独检测的内标，其量也在样品中被测定。在利用可单独检测的内标的实施方式中，样品中存在的感兴趣的分析物和内标二者的所有或部分被电离以产生在质谱仪中可检测的多种离子，并且通过质谱法检测由每种产生的一种或多种离子。在这些实施方式中，通过与检测的内标离子的量比较，可以使由感兴趣的分析物生成的离子的存在或量与样品中感兴趣的分析物的存在或量相关。
可选地，通过与一种或多种外部参考标准物比较，可以测定样品中分析物的量。示例性外部参考标准物包括掺加有人或非人分析物、合成分析物类似物或其同位素标记的变体的空白血浆或血清。
用于质谱分析的样品制备
可以在质谱法之前使用的一种样品纯化方法是在如下条件下将样品施加至固相提取(SPE)柱：通过柱填充材料可逆地保留感兴趣的分析物，而不保留一种或多种其它材料。在此技术中，可以采用通过柱保留感兴趣的分析物的第一流动相条件，并且随后在洗涤掉(wash through)非保留的材料后可以采用第二流动相条件以从柱移出保留的材料。
在一些实施方式中，样品中的分析物可以被可逆地保留在具有填充材料——其包括烷基结合表面——的SPE柱上。例如，在一些实施方式中，在质谱分析之前，C-8在线SPE柱(比如来自Phenomenex,Inc.的Oasis HLB在线SPE柱/盒(2.1mm×20mm)或等价物)可以被用于富集分析物。在一些实施方式中，使用HPLC级0.2％水性甲酸作为洗涤液和使用乙腈中的0.2％甲酸作为洗脱液实施SPE柱的使用。
可以在质谱法之前使用的另一种样品纯化方法是液相色谱法(LC)。在液相色谱技术中，可以通过在流动相条件下将样品施加至色谱分析柱来纯化分析物，其中与一种或多种其它材料相比，感兴趣的分析物在差异的速率下洗脱。这样的程序可以相对于样品的一种或多种其它组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量。
某些液相色谱方法——包括HPLC——依赖于相对缓慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填充物，其中通过柱的样品的层流是从样品分离感兴趣的分析物的基础。技术人员将理解这样的柱中的分离是分配过程并且可以选择适合与C肽一起使用的LC——包括HPLC、仪器和柱。色谱分析柱通常包括促进化学部分的分离(即，分级)的介质(即，填充材料)。介质可以包括微小的颗粒。颗粒通常包括与多种化学部分相互作用以促进化学部分的分离的结合表面。一种适合的结合表面是疏水性结合表面，比如烷基结合或氰基结合表面。烷基结合表面可以包括C-4、C-8、C-12或C-18结合的烷基。在一些实施方式中，色谱分析柱是整体C-18柱。色谱分析柱包括接收样品的入口和排出包括分级样品的流出物的出口。样品可以被直接地供给至入口，或从SPE柱比如在线SPE柱或TFLC柱供给。在一些实施方式中，可以在SPE柱和/或HPLC柱之前使用在线过滤器以在样品到达SPE和/或TFLC和/或HPLC柱之前去除样品中的微粒和磷脂。
在一个实施方式中，样品可以在入口处施加至LC柱，使用溶剂或溶剂混合物洗脱，并且在出口处排出。可以选择不同溶剂模式用于洗脱感兴趣的分析物(一种或多种)。例如，可以使用梯度模式、等度模式、或多型(即混合)模式进行液相色谱法。在色谱法期间，材料的分离通过下述变量实现，比如洗脱剂(也称为“流动相”)的选择、洗脱模式、梯度条件、温度等。
在一些实施方式中，使用HPLC富集样品中的分析物。可以使用整体C-18柱色谱系统——例如，来自Phenomenex Inc.的Onyx整体C-18柱(50×2.0mm)或等价物——实施该HPLC。在某些实施方式中，使用的HPLC级0.2％水性甲酸作为溶剂A和乙腈中的0.2％甲酸作为溶剂B进行HPLC。
通过仔细选择阀和连接器管道(plumbing)，可以根据需要连接两个或更多个色谱柱，以便材料从一个传至下一个，而不需要任何手动步骤。在优选的实施方式中，通过预编程以执行必需步骤的计算机控制阀和管道的选择。最优选地，色谱系统还以这样的在线方式被连接至检测器系统，例如，MS系统。因而，操作者可以将一盘样品放置在自动进样器中，并且在计算机控制下进行其余的操作，其导致纯化和分析选择的所有样品。
在一些实施方式中，TFLC可以被用于在质谱法之前纯化分析物。在这样的实施方式中，可以使用捕获分析物的TFLC柱提取样品。分析物然后被洗脱和在线转移至分析性HPLC柱。例如，可以使用具有大粒径(50μm)填充物的TFLC提取盒完成样品提取。然后在质谱法之前，从此柱洗脱下的样品可以被在线转移至HPLC分析柱上用于进一步的纯化。因为可以以自动化方式连接涉及这些色谱程序的步骤，所以可以最小化在分析物的纯化期间对操作者参与的需要。此特征可以导致节省时间和成本，并且消除操作者错误的机会。
在一些实施方式中，上面的纯化技术中的一种或多种可以被并行地用于纯化分析物以允许同时加工多个样品。
通过质谱法检测和定量分析物
使用质谱仪——其包括用于电离分级样品和产生带电分子用于进一步分析的离子源——进行质谱法。在多个实施方式中，可以通过技术人员已知的任何方法电离分析物。例如，可以通过电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、激光二极管热解吸(LDTD)、快原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离进行分析物的电离。技术人员将理解可以基于待测量的分析物、样品的类型、检测器的类型、正对负模式的选择等确定电离方法的选择，可以在正或负模式中电离分析物。在优选的实施方式中，在正离子模式中通过ESI电离分析物。
通常在质谱技术中，在样品已经被电离后，可以分析由此产生的带正电或负电的离子以测定质荷比(m/z)。用于测定m/z的多种分析器包括四极分析器、离子阱分析器、飞行时间分析器、傅里叶变换离子回旋共振质量分析器和轨道阱分析器。在Bartolucci,etal.,Rapid Commun.Mass Spectrom.2000,14:967-73中描述了一些示例性离子阱方法。
可以使用数种检测模式检测离子。例如，即，可以使用选择性离子监测模式(SIM)检测选择的离子，或可选地，可以监测由碰撞诱发的解离或中性丢失引起的质量相变，例如，多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)。在一些实施方式中，使用四极分析器测定质荷比。在“四极”或“四极离子阱”仪器中，振荡射频场中的离子经历与在电极之间施加的DC电位、RF信号的振幅、和质/荷比成比例的力。可以选择电压和振幅，使得仅具有特定质/荷比的离子行进四极的长度，而所有其它离子被偏转。因而，四极仪器可以充当注入仪器的离子的“质量过滤器”和“质量检测器”二者。
在离子与检测器碰撞时，它们产生转化为数字信号的电子脉冲。获取的数据被中继至计算机，其标绘收集的离子的计数对时间。得到的质量色谱图与以传统的HPLC-MS方法中生成的色谱图类似。可以测量对应于特定离子的峰下面积、或这样的峰的振幅，并且与感兴趣的分析物的量相关联。在某些实施方式中，测量碎片离子(一种或多种)和/或先驱离子的曲线下面积、或峰的振幅以测定分析物的量。基于内部或外部分子标准物的一种或多种离子的峰，使用校准标准曲线，可以将给定的离子的相对丰度转换为原始分析物的绝对量。
可以通过“串联质谱法”或“MS/MS”增强采用某些质谱分析器的MS技术的分辨率。在此技术中，可以在MS仪器中过滤由感兴趣的分子生成的先驱离子(也称为母离子)，并且随后破碎先驱离子以产生一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子)，其然后在第二个MS程序中被分析。通过仔细选择先驱离子，仅由某些分析物产生的离子被传至破碎室，在其中与惰性气体的原子碰撞产生碎片离子。因为在给定组的电离/破碎条件下以可再现方式产生先驱离子和碎片离子二者，所以MS/MS技术可以提供极强大的分析工具。例如，过滤/破碎的组合可以被用于消除干扰物质，并且在复杂的样品比如生物学样品中是特别有用的。在某些实施方式中，采用具有多个四极分析器的质谱仪器(比如三重四极仪器)实施串联质谱分析。
在使用MS/MS技术的某些实施方式中，先驱离子被分离用于进一步的破碎，并且碰撞活化解离(CAD)被用于由先驱离子生成碎片离子用于进一步的检测。在CAD中，先驱离子通过与惰性气体的碰撞获得能量，并且随后通过称为“单分子分解”的过程被破碎。必须在先驱离子中蓄积足够的能量，使得离子内的某些键可以由于增加的振动能量而被破坏。
在一些实施方式中，如下使用MS/MS检测和/或定量样品中的分析物。通过首先使样品经受SPE，然后经受液相色谱法，优选地HPLC富集样品中的分析物；来自色谱分析柱的液体溶剂流进入MS/MS分析器的加热的雾化器接口；并且在接口的加热的带电管道系统中将溶剂/分析物混合物转化为蒸汽。在这些过程期间，分析物被电离。离子——例如先驱离子——穿过仪器的孔口并且进入第一四极。四极1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，其允许基于它们的质荷比(m/z)选择离子(即，分别选择Q1和Q3中的“先驱”离子和“碎片”离子)。四极2(Q2)是碰撞单元(collision cell)，在其中离子被破碎。质谱仪的第一四极(Q1)选择具有分析物离子的m/z的分子。具有正确的m/z的先驱离子被允许传入碰撞室(Q2)，而具有任何其它m/z的不需要的离子与四极的侧面碰撞并且被消除。进入Q2的先驱离子与中性气体分子(比如氩分子)碰撞并且破碎。生成的碎片离子被传入四极3(Q3)，在其中选择碎片离子进行检测。
可以在某些实施方式中使用的操作串联质谱仪器的替代模式包括产物离子扫描和先驱离子扫描。对于这些操作模式的描述，参见，例如，E.Michael Thurman,et al.,Chromatographic-Mass Spectrometric Food Analysis for Trace Determination ofPesticide Residues,Chapter 8(Amadeo R.Fernandez-Alba,ed.,Elsevier 2005)(387)。
在其它实施方式中，高分辨率/高准确度质量分析器可以被用于根据本发明的方法定量分析分析物。为了取得定量结果的可接受的精确度，质谱仪必须能够对感兴趣的离子展示出10,000或更大的分辨能力(FWHM)，以及大约50ppm或更小的准确度；优选地，质谱仪展示出18,000或更好的分辨能力(FWHM)，以及大约5ppm或更小的准确度；比如20,000或更好的分辨能力(FWHM)和大约3ppm或更小的准确度；比如25,000或更好的分辨能力(FWHM)和大约3ppm或更小的准确度。对分析物离子能够展示出必需性能水平的三种示例性分析器是轨道阱质量分析器、某些TOF质量分析器和傅里叶变换离子回旋共振质量分析器。
在生物学活性分子中发现的元素——比如碳、氧和氮——以许多不同的同位素形式天然存在。例如，大部分碳作为12C存在，但是所有天然存在的碳的大约1％作为13C存在。因而，一些部分的包含至少一个碳原子的天然存在的分子将包含至少一个13C原子。在分子中包括天然存在的元素同位素导致多种分子同位素形式。分子同位素形式的质量差异是至少1个原子质量单位(amu)。这是因为元素同位素相差至少一个中子(一个中子的质量≈1amu)。当分子同位素形式被电离至多电荷状态时，因为质谱检测基于质荷比(m/z)，因此同位素形式之间的质量区别可以变得难以分辨。例如，质量相差1amu的均被电离至5+状态的两种同位素形式将在其m/z中展示仅仅0.2的差异。高分辨率/高准确度质谱仪能够分辨高度多电荷离子(比如带有±2、±3、±4、±5、或更高电荷的离子)的同位素形式。
由于天然存在的元素同位素，对于每种分子离子，通常存在多种同位素形式(如果使用足够灵敏的质谱仪器进行分析，其每种可以导致可单独检测的谱峰)。多种同位素形式的m/z比和相对丰度共同地构成分子离子的同位素特征。在一些实施方式中，可以利用两种或更多种分子同位素形式的m/z比和相对丰度以确认调查的分子离子的身份。在一些实施方式中，来自一种或多种同位素形式的质谱峰被用于定量分子离子。在一些相关的实施方式中，来自一种同位素形式的单个质谱峰被用于定量分子离子。在其它相关的实施方式中，多个同位素峰被用于定量分子离子。在这些随后的实施方式中，多个同位素峰可以经受任何适当的数学处理。数种数学处理是本领域已知的并且包括但不限于对多个峰下面积求和、或平均来自多个峰的反应。然而，由于仪器变化，对于任何离子的同位素变体观察的精确质量可能轻微地变化。
在一些实施方式中，使用高分辨率/高准确度质谱仪测量一种或多种离子的相对丰度，以便定量地评估样品中分析物的量。已经报道了将高分辨率轨道阱分析器用于定性和定量分析多种分析物。参见，例如，美国专利申请公布号2008/0118932(2007年11月9日提交)；et al.,Rapid Commun.Mass Spectrom.,2008,22:477-485；Le Breton,etal.,Rapid Commun.Mass Spectrom.,2008,22:3130-36；Thevis,et al.,MassSpectrom.Reviews,2008,27:35-50；Thomas,et al.,J.Mass Spectrom.,2008,43:908-15；Schenk,et al.,BMC Medical Genomics,2008,1:41；和Olsen,et al.,Nature Methods,2007,4:709-12。
可以通过本领域已知的众多方法使分析物试验的结果与原始样品中分析物的量相关。例如，考虑到仔细地控制取样和分析参数，给定的离子的相对丰度可以与将该相对丰度转换为原始分子的绝对量的表格比较。可选地，外标可以与样品一起运行，并且基于由那些标准物生成的离子构建标准曲线。使用这样的标准曲线，给定的离子的相对丰度可以被转换为原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，内标被用于生成计算分析物的数量的标准曲线。生成和使用这样的标准曲线的方法是本领域熟知的并且普通技术人员能够选择适当的内标。例如，在优选的实施方式中，一种或多种形式的同位素标记的分析物可以被用作内标。使离子的量与原始分子的量相关的众多其它方法将是本领域普通技术人员熟知的。
如本文使用的，当通过质谱技术进行分析时，相对于未标记的分子，“同位素标记”在标记的分子中产生质量偏移。合适的标记的实例包括氘(2H)、13C和15N。可以在分子中的一个或多个位置处并入一个或多个同位素标记，并且可以在相同同位素标记的分子上使用一种或多种同位素标记。
可以使用自动化机器进行任何上面描述的方法的一个或多个步骤。在某些实施方式中，在线进行一个或多个纯化步骤，并且更优选地，可以以在线方式进行所有纯化和质谱法步骤。
下列实施例用来说明本发明。这些实施例绝不意欲限制方法的范围。
实施例
实施例1：类固醇的质谱测试
直接从20uL的管尖提取患者样品。将管尖直接置于96-深孔板上。然后将500uL的提取溶剂(50/50的甲醇/乙酸乙酯的1M NH4OH)和50uL的内标(包含稳定同位素)和提取缓冲液添加至每个孔。在室温下混合板一个小时，然后在氮气下干燥。在干燥步骤之后，通过向每个孔添加含水酸和有机溶剂(200uL的50/50水/甲醇中0.1％FA)将样品还原为溶液。混合板然后过滤。将100uL的滤液注入具有正离子模式的APCI(大气压化学电离)源的LC-MS/MS系统。使用以下的试剂：流动相A–水中的0.1％甲酸；流动相B–80/20甲醇/乙腈；提取溶剂：50/50甲醇/乙酸乙酯中1M氢氧化铵。
使用来自Thermo Scientific的 TX-4系统进行液相色谱法并且通过反相分析柱( C18)HPLC柱实现分离。使用的检测器为来自AB Sciex的6500。
使用一个20uL的管尖或两个来自DBS的6mm冲头检测和定量(非衍生化)下面的类固醇：皮质醇、可的松、孕酮、17-羟基孕酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、皮质酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、孕烯醇酮、17-羟基孕烯醇酮和21-脱氧皮质醇。图1。
下面的质量转换(mass transition)被用于通过质谱法分析。
图2-17显示了成年男性、成年女性和儿童中多种类固醇的水平。
表1显示了先天性肾上腺增生酶缺乏的区别特性：
表1.先天性肾上腺增生酶缺乏的区别特性
分析灵敏度：定量限(LOQ)是测量变得在数量上有意义的点。对于LOQ的可接受标准被定义为在变异系数(CV)为≤20％处最低的、可再现的浓度。为了测定初始LOQ，运行浓度不同的样品的若干重复持续若干天。以线性范围研究测定初始分析可测量的范围。表2：
表3显示了引起典型先天性肾上腺增生的酶促缺乏的差异诊断：
引起典型先天性肾上腺增生的酶促缺乏的差异诊断
图18显示了50-10,000ng/dL之间的睾酮的标准线性。
实施例2：肿瘤学药物
在该测试中，使用20uL的管尖收集患者样品。在内标中预浸管尖并干燥2至24小时。
在校准标准品中浸润管尖。在500uL的洗脱缓冲液中洗脱样品并干燥。将样品重悬浮在200uL的装载缓冲液(loading buffer)中。将90uL的样品注入LC-MS/MS进行定量。
图19显示了他莫昔芬及其代谢物的色谱图。
图20显示了来曲唑、依西美坦和阿那曲唑的色谱图。
实施例3：阿片剂
在该测试中，离心全血并以不同浓度水平掺加阿片剂标准品作为测试校准物。
将10uL和15uL的管尖浸入全血校准物，直到完全饱和。将以全血校准物饱和的管尖放置在室温下干燥持续至少2.5小时。
400uL的提取缓冲液(65％的乙酸乙酯中氘化阿片剂内标：甲醇中0.1％甲酸)被用于在涡旋器上从管尖提取阿片剂，持续40分钟。可选地，500uL的具有1％甲酸的60:40乙酸乙酯和甲醇被用于在涡旋器上在850rpm下从管尖提取阿片剂，持续1小时。然后将管尖丢弃并且通过Porvair在60℃氮气下完全干燥提取的样品。然后将样品重悬浮在水中的30％MeOH:0.1％FA中，涡旋。可选地，将样品重悬浮在230uL的具有0.1％甲酸的50:50甲醇和水中。然后将样品注入LC-MS/MS进行在Thermo Ultra三重四极质谱仪上以ESI正模式定量。对于流动相A，使用水中0.1％甲酸。对于流动相B，使用100％乙腈。使用Agilent苯基己基3×100mm柱。运行时间为9分钟。
表4 显示了10uL管尖对比15uL管尖中每种阿片剂的线性范围。
图21至24显示了阿片剂和对应的内标的示例性色谱图。
图25至28(分别地)显示了使用20uL 管尖，利用葡糖醛酸糖苷酶水解从患者尿获得的吗啡、可待因、氢吗啡酮和羟考酮数据。
图29显示了使用50uL 管尖从患者唾液获得的羟考酮数据。
图30和31分别地显示了丁丙诺啡叔丁啡和去甲芬太尼的血细胞比容研究的结果。
实施例4：苯并二氧
在该测试中，离心全血并以不同浓度水平掺加苯并二氧标准品作为测试校准物。
将10uL和20uL的管尖浸入全血校准物，直到完全饱和。将以全血校准物饱和的管尖放置在室温下干燥持续至少2.5小时。
400uL的提取缓冲液(65％的乙酸乙酯中氘化苯并二氧内标：甲醇中0.1％甲酸)被用于在涡旋器上从管尖提取阿片剂，持续40分钟。可选地，500uL的具有1％甲酸(或可选地，0.1％甲酸)的60:40乙酸乙酯和甲醇被用于在涡旋器上在850rpm下从管尖提取苯并二氧持续1小时。然后将管尖丢弃并且通过Porvair在60℃氮气下完全干燥提取的样品。然后将样品重悬浮在水中的30％MeOH:0.1％甲酸中，涡旋。可选地，将样品重悬浮在230uL的具有0.1％甲酸的50:50甲醇和水中。可选地，将样品重悬浮在200uL的10％甲醇和90％水中0.1％甲酸中。使样品以1200rpm涡旋持续5至30分钟。然后将样品注入LC-MS/MS进行在Thermo Ultra三重四极质谱仪上以ESI正模式定量。对于流动相A，使用水中0.1％甲酸。可选地，使用在pH 5.2下的20mM乙酸铵。对于流动相B，使用100％乙腈。使用Agilent苯基己基3×100mm柱。可选地，使用BDS Hypersil C18，100×3mm，3μ柱。运行时间为6分钟。
获得0.7mL/分钟的流速：0-60 sec-90％A:10％B；60-210 sec-斜升至(ramp to)30％B；210-360 sec-斜升至65％B；360-420 sec-斜升至100％B；420-480 sec-阶梯状(step)100％B；480-600 sec-阶梯状90％A:10％B。
表5显示了在20uL管尖上分析的苯并二氧
表6显示了10uL管尖对比20uL管尖中每种阿片剂的线性范围。
实施例5：巴比妥酸盐
在该测试中，以不同浓度水平掺加巴比妥酸盐标准品至对巴比妥酸盐阴性的尿样品作为测试校准物。
将20uL 管尖浸入尿校准物，直到完全饱和。将以尿校准物饱和的管尖放置在室温下干燥。
在甲醇中提取样品1小时。在热混合器上在60℃下水解提取的样品。然后离心样品并将上清液注入LC-MS/MS进行定量。液相色谱法运行时间为5.75分钟。采集窗口为2.5分钟。测试允许每2.75分钟2个重叠(plex)数据。使用0.03％NH4OH作为流动相A。使用90％CAN和10％MP A作为流动相B。
图32和33显示了掺加巴比妥酸盐(司可巴比妥、异戊巴比妥、戊巴比妥和硫喷妥)的阴性尿的结果。
图34至38显示了对苯巴比妥和布他比妥定量的各种患者样品的结果。
实施例6：THC
在该测试中，分析患者尿样品。
将20uL 管尖浸入尿样品，直到完全饱和。将以尿样品饱和的管尖放置在室温下干燥。
通过在900rpm下涡旋1小时在100％甲醇中提取样品。在60℃下利用氮气干燥样品直到完全干燥。将样品重悬浮在200uL的pH 4.5下的20mM柠檬酸钠缓冲液中。将葡糖醛酸糖苷酶添加至样品并在热混合仪上在60℃下培育40分钟。在5500rpm下离心样品3分钟并将上清液注入LC-MS/MS(ABI5500)进行定量。
图39显示了使用20uL管尖和葡糖醛酸糖苷酶水解的患者样品中THC羧基代谢物分析的结果。
实施例7：抗癫痫药物
在该测试中，分析患者全血样品。
将20uL 管尖浸入全血样品，直到完全饱和。将以全血样品饱和的管尖放置在室温下干燥。
在90％甲醇和10％水中提取样品1小时。在60℃下利用氮气干燥样品直到完全干燥。将样品重悬浮在水中的0.1％甲酸中并注入LC-MS/MS进行定量。将5uL注入ThermoFisher Quantiva。使用Thermo Fisher Beta-Basic C18，100×3mm分析柱。流动相A：0.1％FA；流动相B：甲醇。
表7显示了质谱分析中使用的质量转换。
| 化合物 | 起始时间(min) | 结束时间(min) | 极性 | 先驱(m/z) | 产物(m/z) | 碰撞能量(V) |
| 非氨酯 | 0 | 6.5 | 正 | 117 | 91 | 24 |
| 非氨酯Q | 0 | 6.5 | 正 | 117 | 115 | 20 |
| 乙琥胺Q | 0 | 6.5 | 正 | 142.2 | 39.3 | 39 |
| 乙琥胺 | 0 | 6.5 | 正 | 142.2 | 44.3 | 32 |
| 普瑞巴林 | 0 | 6.5 | 正 | 160.1 | 55.25 | 23 |
| 普瑞巴林Q | 0 | 6.5 | 正 | 160.1 | 77.2 | 35 |
| 普瑞巴林D6 | 0 | 6.5 | 正 | 166.2 | 148 | 9 |
| 左乙拉西坦Q | 0 | 6.5 | 正 | 171.2 | 69.2 | 29 |
| 左乙拉西坦 | 0 | 6.5 | 正 | 171.2 | 126.2 | 16 |
| 加巴喷丁Q | 0 | 6.5 | 正 | 172.3 | 67.2 | 30 |
| 加巴喷丁 | 0 | 6.5 | 正 | 172.3 | 91.2 | 26 |
| 左乙拉西坦D6 | 0 | 6.5 | 正 | 177 | 132 | 16 |
| 加巴喷丁D10 | 0 | 6.5 | 正 | 182.2 | 147 | 26 |
| 加巴喷丁D10 | 0 | 6.5 | 正 | 182.2 | 164 | 26 |
| 唑尼沙胺 | 0 | 6.5 | 正 | 213.2 | 77.2 | 32 |
| 唑尼沙胺Q | 0 | 6.5 | 正 | 213.2 | 102.1 | 30 |
| 唑尼沙胺13C6 | 0 | 6.5 | 正 | 219 | 82 | 31 |
| 唑尼沙胺13C6 | 0 | 6.5 | 正 | 219 | 108 | 30 |
| 卡马西平Q | 0 | 6.5 | 正 | 237 | 179 | 36 |
| 卡马西平 | 0 | 6.5 | 正 | 237 | 194.1 | 20 |
| 卢非酰胺 | 0 | 6.5 | 正 | 239 | 127.2 | 28 |
| 卢非酰胺Q | 0 | 6.5 | 正 | 239 | 261 | 10 |
| 卡马西平D10 | 0 | 6.5 | 正 | 247 | 204 | 30 |
| 拉科酰胺Q | 0 | 6.5 | 正 | 251 | 65.2 | 58 |
| 拉科酰胺 | 0 | 6.5 | 正 | 251 | 91.2 | 23 |
| 1012环氧化物Q | 0 | 6.5 | 正 | 253 | 167.2 | 39 |
| 1011环氧化物 | 0 | 6.5 | 正 | 253 | 180.1 | 28 |
| 苯妥英 | 0 | 6.5 | 正 | 253.1 | 104.2 | 34 |
| 苯妥英Q | 0 | 6.5 | 正 | 253.1 | 182.2 | 19 |
| 拉科酰胺13C D3 | 0 | 6.5 | 正 | 255.1 | 91.1 | 23 |
| 拉莫三嗪Q | 0 | 6.5 | 正 | 256 | 145 | 39 |
| 拉莫三嗪 | 0 | 6.5 | 正 | 256 | 211 | 27 |
| 1011环氧化物13C6 | 0 | 6.5 | 正 | 259.2 | 186.2 | 30 |
| 拉莫三嗪13C 15N4 | 0 | 6.5 | 正 | 261 | 213 | 27 |
| 苯妥英D10 | 0 | 6.5 | 正 | 263 | 192 | 19 |
| 艾司利卡西平Q | 0 | 6.5 | 正 | 297.1 | 179 | 44 |
| 艾司利卡西平 | 0 | 6.5 | 正 | 297.1 | 194 | 58 |
| 非氨酯Q | 0 | 6.5 | 正 | 339 | 117.3 | 21 |
| 非氨酯 | 0 | 6.5 | 正 | 339 | 261 | 9 |
| 替加宾 | 0 | 6.5 | 正 | 376.2 | 111.1 | 33 |
| 替加宾Q | 0 | 6.5 | 正 | 376.2 | 149.1 | 27 |
| 替加宾D6 | 0 | 6.5 | 正 | 382 | 253.1 | 25 |
表8显示了分析中使用的校准标准品。
在试验精确度内：可接受标准：％CV应当小于可允许的≤TEa/2。对该测试的Tea被确定为30％。以如下顺序：低、中和高，在单次测试中分析每个质量对照的十个重复。
表9显示了乙琥胺的试验精确度内。乙琥胺的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从5.16％至2.23％。
表10显示了加巴喷丁的试验精确度内。加巴喷丁的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从7.01％至3.61％。
表11显示了左乙拉西坦的试验精确度内。左乙拉西坦的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从8.46％至4.17％。
表12显示了普瑞巴林的试验精确度内。普瑞巴林的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从6.10％至4.08％。
表13显示了唑尼沙胺的试验精确度内。唑尼沙胺的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从6.35％至4.87％。
表14显示了拉莫三嗪的试验精确度内。拉莫三嗪的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从6.77％至6.10％。
表15显示了拉科酰胺的试验精确度内。拉科酰胺的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从5.78％至3.26％。
表16显示了卢非酰胺的试验精确度内。卢非酰胺的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从9.12％至5.78％。
表17显示了非氨酯的试验精确度内。非氨酯的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从8.63％至5.89％。
表18显示了10,11卡马西平环氧化物的试验精确度内。10,11卡马西平环氧化物的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从8.46％至5.89％。
表19显示了苯妥英的试验精确度内。苯妥英的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从8.40％至7.26％。
表20显示了卡马西平的试验精确度内。卡马西平的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从9.45％至4.93％。
表21显示了艾司利卡马西平的试验精确度内。艾司利卡马西平的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从10.65％至3.74％。
表22显示了替加宾的试验精确度内。替加宾的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从13.18％至7.05％。
总试验精确度：可接受标准：如果总SD≥1/2Tea是不可接受的或总SD必须小于限定的最大SD或CV。％CV应当小于可允许的≤TEa/2。对该测试的Tea被确定为30％。
乙琥胺的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从12.84％至1.11％。
加巴喷丁的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从10.43％至3.05％。
左乙拉西坦的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从8.48％至2.28％。
普瑞巴林的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从10.21％至2.43％。
唑尼沙胺的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从12.44％至1.44％。
拉莫三嗪的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从12.17％至3.80％。
拉科酰胺的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从12.17％至3.80％。
卢非酰胺的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从12.01％至2.50％。
非氨酯的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从7.92％至2.03％。
10,11卡马西平环氧化物的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从12.44％至1.76％。
苯妥英的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从10.92％至2.55％。
卡马西平的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从12.64％至2.05％。
艾司利卡马西平的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从13.49％至3.60％。
替加宾的％CV跨越全部三个质量对照水平范围从16.11％至0％。
分析灵敏度:检测限(LOD)-计算：LOD＝空白的均值+4SD。下面为LOD：乙琥胺-3.24ng/ml；左乙拉西坦-0.22ng/ml；普瑞巴林-0.29ng/ml；拉莫三嗪-0.17ng/ml；拉科酰胺-0.47ng/ml。
准确度:已知标准品的回收—可接受标准:当Tea为30％时，由于缺少完美回收造成的误差(回收的量减去添加的量)应当≤2SD或15％CV。三个全血样品以下面的浓度掺加：10、30和60ug/mL，每个掺加水平测试三次。由于在Mitra微量取样装置上收集和干燥全血的方式，没有稀释分析。
表23显示了乙琥胺的准确度。
表24显示了左乙拉西坦的准确度。
表25显示了普瑞巴林的准确度。
表26显示了唑尼沙胺的准确度。
表27显示了拉莫三嗪的准确度。
表28显示了拉科酰胺的准确度。
表29显示了卢非酰胺的准确度。
表30显示了非氨酯的准确度。
表31显示了卡马西平(carbamzepine)的准确度。
表32显示了苯妥英的准确度。
表33显示了卡马西平的准确度。
表34显示了艾司利卡马西平的准确度。
表35显示了替加宾的准确度。
图40显示了加巴喷丁和卢非酰胺的血细胞比容研究的结果。
实施例8：25OH羟基维生素D
在该测试中，分析患者全血样品。
通过添加10uL的内标和500uL的提取溶剂(50:50乙酸乙酯和甲醇中的1M氢氧化铵溶液)进入清洁的96-孔板从20uL Mitra微量取样装置提取人血液中的维生素D。Mitra管尖被浸入具有IS/提取溶剂混合物的孔中。在加热的板混合器/涡旋器(vortexer)中以800rpm在45℃下混合该板持续1小时(Eppendorf混合物)。混合的样品板中的提取溶剂在60℃下在加热的氮气中干燥～15分钟以浓缩样品。当干燥完成，将100uL 0.1ng/mL的乙腈中衍生化试剂(PTAD)添加至样品孔并在室温下培育一小时。将100uL的HPLC级水添加至孔以淬灭反应。然后将样品转移至96-孔过滤板(Captiva ND)，同时清洁的96-孔收集板固定在其下面。向过滤板施加正压力以使得滤液通过。将25uL的样品注入LC-MSMS系统。
通过使用反相C18柱和由0.1％含水甲酸(流动相A)和50:50甲醇和乙腈(流动相B)构成的流动相实现分离。装备有Agilent SL泵的Aria LX-系统被联接至具有加热的电喷雾(HESI)源的作为检测器的TSQ Quantum Ultra三重四极质谱仪。在正电离模式MRM/SRM扫描上检测和定量25-羟基维生素D2和D3。使用下面的参数：电离电压5000V；气化器温度450℃；保护气体20Arb；Aux 20 Arb；碰撞压力1.0mTorr；碰撞能量16–18V。
监测下面的质量转换：
| 分析物 | 母质量 | 碎片质量 | 保留时间(分钟) |
| 25OHD2 | 570.3 | 298.1 | 1.11 |
| 25OHD2-d3 | 573.3 | 301.1 | 1.11 |
| 25OHD3 | 558.3 | 298.2 | 1.07 |
| 25OHD3-d3 | 561.3 | 301.2 | 1.07 |
图41显示了25-羟基维生素D分析的色谱图。图42显示了25-羟基维生素D2分析的校准曲线。图43显示了25-羟基维生素D3分析的校准曲线。
分析的线性范围为5-100ng/ml。定量限(LOQ)为4ng/ml。
本文提及或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件和可电子获取的信息的内容由此通过引用以其全部并入，其程度如同每个单独的出版物被具体地和单独地指示通过引用并入。申请人保留将来自任何这样的文章、专利、专利申请或其它物理和电子文件的任何和所有材料与信息物理地并入本申请的权利。
本文说明性描述的方法可以适合在不存在本文未明确地公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下实践。因而，例如，应当广义地和非限制性地理解术语“包含”、“包括”、“含有”等。另外，已经将本文采用的术语和表述用作描述而非限制的术语，并且不意欲使用排除显示和描述的特征的任何等价物或其部分的这样的术语和表述。应当认识到多种修改在要求保护的发明的范围内是可能的。因而，应当理解虽然已经通过优选的实施方案和任选的特征具体地公开了本发明，但是本领域的技术人员可以采取本文公开的其中体现的本发明的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为在本发明范围内。
本文已经宽泛地和一般地描述了本发明。落入一般公开内容内的较窄物类和下位分组中的每种也形成方法的一部分。这包括使用限制性条款或否定限定——其从种类去除任何主题——对方法的一般描述，而不管被除去的材料是否在本文被明确地陈述。
其它实施方式在所附权利要求的范围内。另外，在按照马库什群组描述方法的特征或方面时，本领域技术人员将认识到还从而按照马库什群组的任何单个成员或成员亚组来描述本发明。
Claims (43)
1.一种通过质谱法测定样品中分析物的量的方法，所述方法包括：
(a)从通过微量取样装置收集的样品提取分析物；
(b)电离所述分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和
(c)通过质谱法测定所述一种或多种离子的量；
其中测定的所述一种或多种离子的量被用于测定所述样品中分析物的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品中分析物的量与所述患者中分析物的量相关。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括全血、尿、唾液、血浆或血清样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取步骤包括向通过微量取样装置收集的所述样品添加提取缓冲液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述提取步骤包括在氮气下干燥。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取步骤包括重构所述样品为溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述微量取样装置包括能够实现同时自动化提取和质谱分析多个样品的设备。
8.根据权利要求1所述的方法，其中以在线方式执行所述提取和质谱法步骤从而允许自动化的样品分析。
9.根据权利要求1所述的方法，通过所述微量取样装置收集的所述样品具有小于或等于100μL的体积。
10.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述微量取样装置收集的所述样品具有小于或等于50μL的体积。
11.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述微量取样装置收集的所述样品具有大约10μL、大约15μL或大约20μL的体积。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在通过质谱法定量之前所述样品被水解。
13.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在质谱法之前纯化所述样品。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括使所述样品经受液相色谱法。
15.根据权利要求14所述的方法，其中液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)或高湍流液相色谱法(HTLC)。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是毛细血管血。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱法是串联质谱法。
18.根据权利要求1所述的方法，其中电离是大气压化学电离(APCI)。
19.根据权利要求1所述的方法，其中电离处于正离子模式。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物的内标被添加至所述样品。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述内标是氘化的或同位素标记的。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述微量取样装置被包裹在设计用于自动化提取和质谱分析的盒中。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述微量取样装置是管尖。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是类固醇。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述类固醇是皮质醇、可的松、孕酮、17-羟基孕酮、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、皮质酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、孕烯醇酮、17-羟基孕烯醇酮、18-羟基皮质酮、21-脱氧皮质醇、25-羟基维生素D2或25-羟基维生素D3。
26.根据权利要求1所述的方法，其中分析物是阿片剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述阿片剂是顺式曲蚂多、O-去甲基曲蚂多、他喷他多、N-去甲基他喷他多、可待因、吗啡、羟吗啡酮、去甲氢可酮、羟考酮、去甲羟考酮、氢吗啡酮、氢可酮、丁丙诺啡叔丁啡、去甲丁丙诺啡叔丁啡、芬太尼、去甲芬太尼、6-单乙酰基吗啡(6-MAM)、美沙酮、二氢可待因、纳洛酮、纳曲酮、6β-纳曲醇、烯丙吗啡、纳布啡或2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷(EDDP)。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是苯并二氧
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述苯并二氧是奥沙西泮、羟基安定、劳拉西泮、去甲地西泮、地西泮、氯氮草、三唑仑、咪达唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、溴西泮、氯巴占、硝西泮、溴氯苯基二氢苯并二氮杂酮、环丙安定、去氧安定、氟硝西泮或氟西泮。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是抗癫痫药物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述抗癫痫药物是丙戊酸、替加宾、托吡酯、左乙拉西坦、拉莫三嗪、拉科酰胺、乙琥胺、卡马西平、艾司利卡马西平、10,11-卡马西平、苯巴比妥、卢非酰胺、扑米酮、苯妥英、唑尼沙胺、非氨酯、加巴喷丁或普瑞巴林。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是免疫抑制剂。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述免疫抑制剂是环孢菌素A、西罗莫司、他克莫司或依维莫司。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是巴比妥酸盐。
35.根据权利要求35所述的方法，其中所示巴比妥酸盐是苯巴比妥、异戊巴比妥、布他比妥、戊巴比妥、司可巴比妥或硫喷妥。
36.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是他莫昔芬或其代谢物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述代谢物是诺吲哚昔芬、N-去甲基-4-羟基他莫昔芬、4’-羟基他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬、N-去甲基-4’-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬。
38.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是肿瘤学药物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述分析物是阿那曲唑、来曲唑或依西美坦。
40.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是四氢大麻酚(THC)或其代谢物。
41.一种通过质谱法测定样品中分析物的量的方法，所述方法包括：
(a)从通过微量取样装置收集的样品提取分析物；
(b)通过液相色谱法纯化所述样品；
(c)电离所述分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和
(d)通过质谱法测定所述一种或多种离子的量；
其中测定的所述一种或多种离子的量被用于测定所述样品中分析物的量。
42.一种通过质谱法测定样品中分析物的量的方法，所述方法包括：
(a)从小于或等于100μL的样品提取所述分析物；
(b)通过液相色谱法纯化所述样品；
(c)电离所述分析物以生成由质谱法可检测的一种或多种离子；和
(d)通过质谱法测定所述一种或多种离子的量；
其中测定的所述一种或多种离子的量被用于测定所述样品中分析物的量。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述方法包括从小于或等于50μL或小于或等于30μL的样品提取分析物。
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