[go: up one dir, main page]

KR102123287B1 - 면봉으로 채취된 타액 내 부신피질호르몬 평가 방법 - Google Patents

면봉으로 채취된 타액 내 부신피질호르몬 평가 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102123287B1
KR102123287B1 KR1020180135752A KR20180135752A KR102123287B1 KR 102123287 B1 KR102123287 B1 KR 102123287B1 KR 1020180135752 A KR1020180135752 A KR 1020180135752A KR 20180135752 A KR20180135752 A KR 20180135752A KR 102123287 B1 KR102123287 B1 KR 102123287B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
saliva
adrenal cortical
cortisol
quantifying
minutes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020180135752A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200052601A (ko
Inventor
이채린
김정희
최만호
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020180135752A priority Critical patent/KR102123287B1/ko
Priority to US16/395,069 priority patent/US11360105B2/en
Publication of KR20200052601A publication Critical patent/KR20200052601A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102123287B1 publication Critical patent/KR102123287B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G01N30/724—Nebulising, aerosol formation or ionisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/665—Assays involving proteins derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • G01N2333/695—Corticotropin [ACTH]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

본 발명은 생체 내 생화학적 스트레스 평가 관련 부신호르몬 측정을 위하여, 면봉에 의해 채취된 타액 내 코르티솔과 그의 전구체 및 대사체들의 농도를 기반으로 대사활성을 평가하는 기술에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 면봉에 묻힌 미량의 타액으로부터 추출된 코르티솔과 코르티손을 포함하는 부신피질호르몬들을 질량분석법으로 분석하여, 각 화합물의 절대량은 물론 두 화합물의 대사비율을 평가하여 생리학적으로 차별화되는 부신호르몬의 대사활성 비교에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 면봉으로 채취된 미량의 타액 내 코르티솔과 코르티손을 포함하는 부신피질호르몬들의 양을 측정하여 생화학적 스트레스에 대한 반응 및 관련 질환들의 평가를 위한 지표로 활용될 수 있다.

Description

면봉으로 채취된 타액 내 부신피질호르몬 평가 방법{Evaluating adrenal　steroids in saliva collected by a cotton swab}
본 명세서는 면봉으로 채취된 미량의 타액으로부터 코르티솔과 코르티손을 포함, 코르티솔의 전구체 및 대사체들의 정량분석과 그들의 대사비율 측정에 의한 다양한 내분비계 부신질환관련 대사활성 평가에 관한 것이다.
부신은 신장 상부에 위치한 내분비기관으로 3개의 층(구상대, 속상대, 망상대)으로 구성되는 부신피질과 가장 안쪽에 위치한 부신수질로 구분되며, 부신피질에서 대사 및 분비되는 호르몬으로는 염류코르티코이드, 당질코르티코이드 그리고 남성호르몬이 있다.
뇌의 시상하부에서 분비되는 부신피질자극호르몬방출호르몬(Corticotropin-releasing hormone, CRH)은 뇌하수체의 부신피질자극호르몬(Adrenocorticotropic hormone, ACTH)의 분비를 촉진시킴으로서 부신피질호르몬들의 기능을 조절한다. 즉, 시상하부-뇌하수체-부신 축(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA axis)의 음성 되먹임(Nagative feedback) 과정에 의해 부신피질호르몬의 분비가 조절 된다. 부신피질호르몬의 대사에 관여하는 효소 중 11β-히드록시스테로이드 탈수소효소(11β-hydroxysteroid dehydrogenase, 11β-HSD)는 코르티솔과 코르티손의 상호전환을 일으킨다. 두 가지의 동형효소 중, 11β-HSD 제2형은 코르티솔을 코르티손으로 산화시키며, 11β-HSD 제1형은 코르티손의 11번 케톤기를 환원하여 다시 코르티솔을 형성한다. 이러한 서로 다른 촉매성질을 갖는 두 가지 동형효소에 의해 당질코르티코이드의 활성화 및 발현이 조절되므로, 생체 내 코르티솔과 코르티손의 농도를 측정하고 대사비율을 분석함으로써 11β-히드록시스테로이드 탈수소효소의 활성을 평가할 수 있다.
하지만 어떠한 원인에 의해 되먹임 과정에 문제가 생겨 부신피질호르몬이 비정상적으로 분비되거나, 11β-히드록시스테로이드 탈수소효소의 유전적 결함이 생기게 되면, 쿠싱증후군, 애디슨병, 선천성 부신증식증 및 원발성 알도스테론증 등 정상적인 상태와는 다른 대사경향이 나타난다. 따라서 시상하부-뇌하수체-부신 축의 기능이상 또는 이로 인한 부신관련 질환들의 예측 및 평가를 위한 방법으로 혈액 내 코르티솔의 측정방법이 임상현장에서 유용하게 사용되고 있다.
혈액 내 코르티솔의 농도와 더불어 최근에는 타액을 이용하여 코르티솔과 코르티손의 농도를 분석하는 연구가 많이 보고되고 있다[Journal of Chromatography B, 2009, 877.29: 3771-3775; Clinica Chimica Acta, 2015, 451: 247-251]. 타액은 주사기로 혈액을 채취하는 방법과는 달리, 비침습적이며 시료의 채취 및 저장, 운반이 용이하다는 장점이 있다. 타액 채취를 위한 가장 일반적인 방법인 Salivette® Cortisol (Sarstedt, N
Figure 112018110394270-pat00001
mbrecht, Germany) 키트의 경우, 질량분석법 및 효소면역법 등으로 스테로이드들을 검출하는데 사용되지만[대한민국 특허 KR10-1228322B1], 키트 안에 들어있는 합성솜과 같은 필터를 3분 동안 입에 넣은 후, 이 필터를 시험관에 옮기고 원심분리하여 기포가 제거된 타액을 얻을 수 있다. 그러나, 이 방법은 3분 동안 필터를 입에 물고 있어야 하는 이물감 등의 불편함이 있으며, 특히 응급환자 등 신체적 제한상태에 있는 사람을 대상으로 타액을 채취하기에는 어려움이 있다.
상기와 같은 점을 감안하여, 의료현장에서 효용성이 검증[European Journal of Applied Physiology, 2009, 107: 743-746]되었을 뿐만 아니라 가정에서 직접 빠르고 간편하게 타액을 채취할 수 있는 면봉을 사용하여 미량의 타액만으로도 코르티솔과 코르티손을 포함하는 다양한 부신피질호르몬들을 정량분석하여, 각각의 양 뿐만 아니라 그들의 비율로서 관련 대사활성을 측정하고자 하였다.
한국등록특허 10-1228322호
본 발명자들은 면봉을 이용하여 채취한 미량의 타액으로부터 코르티솔과 코르티손을 포함하는 부신피질호르몬(도 1)을 추출한 후, 고체상 추출법을 통해 이들 화합물을 정제 및 농축한다. 또한 이 추출물들을 유기용매로 재용해하여 액체크로마토크래프-질량분석기로 각 화합물의 양을 측정하고, 대사비율을 평가함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 면봉에 묻힌 미량의 타액 내 존재하는 코르티솔과 코르티손, 그리고 대사상관성이 있는 부신피질호르몬들의 농도를 측정하기 위한 분석방법의 개발과 이를 통해 대사비율을 평가함으로써 정상인과 차별화되는 스트레스 반응 관련 부신호르몬의 대사활성을 평가 하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
본 발명의 일측면은 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법에 있어서, (a) 면봉을 이용하여 타액을 채취하는 단계, (b) 타액을 효소 가수분해 하는 단계, (c) 가수분해된 타액을 메탄올 용매를 사용한 고체상 추출법을 통해 용출시켜 추출하는 단계, 및 (d) 상기 추출된 시료를 유기용매로 재용해하여 액체 크로마토그래피-질량분석법으로 분석하는 단계를 포함하는 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 타액을 채취하는 단계는 면봉을 입안에 약 3~5초간 머무르게 하는 것을 특징으로 하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (a) 단계에서 타액을 묻힌 면봉은 가수분해 전 분석의 대상이 된 부신피질호르몬의 내부표준물질과 혼합하는 단계를 포함하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (b)의 효소 가수분해는 베타-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)를 이용하여 가수분해 하는 것인, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (d)의 액체 크로마토그래피-질량분석법으로 분석하는 단계에서 이온화 방식은 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI)인, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 전기분무이온화에서 사용하는 질수 분무가스의 유량은 2.0 L/min 내지 3.0 L/min 이며, 기화 온도는 250℃ 내지 350℃ 이고, capillary 전압은 3.0 kV 내지 5.0 kV 인, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (d)의 액체 크로마토그래피의 컬럼은 길이가 40 내지 60 mm 이고, 내경은 1 내지 3 mm 이며, 충전물 입자의 크기는 1.0 μm 내지 3.0 μm 인, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (d)의 액체 크로마토그래피의 이동상은 5% 아세토니트릴(acetonitrile)과 0.1% 포름산(formic acid)을 포함한 수용액 (A)과, 0.1% 포름산(formic acid)을 포함한 95% 아세토니트릴 수용액(B)의 농도 구배가 형성된 것을 사용하며, 유속은 0.20 ㎖/min 내지 0.30 ㎖/min 으로 유지시키는 것을 특징으로 하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (d)의 액체 크로마토그래피의 농도 구배 조건은 A : B = 90 : 10 (v/v)에서 5분까지 B가 25% 되도록 한 다음, 8분까지 B가 60%, 14분까지 B를 100%, 18분까지 B를 초기 조성인 10%가 되도록 회귀한 다음, 10분 동안 B를 10%의 조성으로 유지시키는 것을 특징으로 하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 내부표준물질은 프로게스테론에 대해서는 중수소 치환 프로게스테론(progesterone-2,2,4,6,6,17α,21,21,21-d 9 ),
코르티솔과 코르티손 및 코르티솔의 대사체들에 대해서는 중수소 치환 코르티솔(cortisol-9,11,12,12-d 4 ),을 사용하는 것을 특징으로 하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명은 면봉으로 채취된 미량의 타액으로부터 측정된 코르티솔과 코르티손을 포함하는 부신피질호르몬의 정량결과를 활용, 화합물간의 대사비율 평가를 통하여 부신기능 관련 대사활성 평가 방법을 제공한다. 또한 면봉을 사용함으로써 비침습적이고 간편한 시료채취에 의해 일반인들과 중증의 환자들로부터 시료를 얻을 수 있는 장점이 있으며, 동일 시료로부터 측정된 화합물간의 대사비율을 측정함으로써 채취되는 시료의 양에 관계없이 일정한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명에서 면봉으로 채취된 미량의 타액으로부터 분석하고자 하는 코르티솔과 코르티손의 11β-히드록시스테로이드 탈수소효소(11β-hydroxysteroid dehydrogenase)에 의한 대사작용을 포함하는 다양한 효소들에 의한 부신피질호르몬들의 대사상관성을 나타낸다.
도 2는 본 발명을 통하여 면봉으로부터 채취된 타액 내 코르티솔(F)과 코르티손(E)의 대사비율(F/E)을 평가한 것으로서, 쿠싱질환과 정상인과의 차이(A) 및 쿠싱질환 환자의 수술 전후의 변화(B)를 도식화 한 그래프이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 면봉을 이용하여 미량의 타액을 채취하고, 타액 내에 존재하는 코르티솔과 코르티손을 포함하는 부신피질호르몬들을 효소로 가수분해 및 추출한 뒤, 고체상 추출법을 통해 분석 방해물질들을 제거함과 동시에 분석하고자 하는 화합물들을 정제 및 농축시킨다. 이후, 크로마토그래피-질량분석법으로 부신피질호르몬들의 절대량을 측정하고, 그들 간의 대사비율을 평가한다.
본 발명은 면봉을 이용하여 타액을 채취하는 단계, 면봉에 묻힌 타액으로부터 코르티솔과 코르티손을 포함하는 부신피질호르몬을 추출하는 단계, 상기 추출물을 고체상 추출법을 통해 정제 및 농축시키는 단계, 유기용매로 재용해하여 액체 크로마토그래피-질량분석법으로 화합물들의 농도를 측정하고, 코르티솔과 코르티손의 대사비율을 평가하는 단계를 포함한다.
이하에서는 본 발명의 다양한 측면을 설명한다.
본 발명의 일측면은 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법에 있어서, (a) 면봉을 이용하여 타액을 채취하는 단계, (b) 타액을 효소 가수분해 하는 단계, (c) 가수분해된 타액을 메탄올 용매를 사용한 고체상 추출법을 통해 용출시켜 추출하는 단계, 및 (d) 상기 추출된 시료를 유기용매로 재용해하여 액체 크로마토그래피-질량분석법으로 분석하는 단계를 포함하는 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
상기 "타액 내 부신피질호르몬"은 도1에 도식화된 6종의 호르몬 중에서 선택된 하나 이상을 의미한다. 그러므로 본 발명의 타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법은 상기 6종의 호르몬 모두를 동시에 정량하거나 그 일부 종(2종 내지 5종)의 호르몬을 동시에 정량하는 데 이용될 수 있으며, 경우에 따라서는 상기 6종의 호르몬중 각 1종의 호르몬만을 정량하는 데 이용될 수도 있다.
일 구현예에서, 상기 (a) 단계의 타액 시료는 건강한 개체(사람임, 이하 같음), 질병을 가진 개체, 질병의 이환 여부의 진단이 필요한 개체 등 임의의 개체로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 타액을 채취하는 단계는 면봉을 입안에 1분 이하, 바람직하게는 3~5초 머무르게 하는 것을 특징으로 하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (a) 단계에서 타액을 묻힌 면봉은 가수분해 전 분석의 대상이 된 부신피질호르몬의 내부표준물질과 혼합하는 단계를 포함하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (b)의 효소 가수분해는 베타-글루쿠로니 다아제(β-glucuronidase)를 이용하여 가수분해 하는 것인, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (d)의 액체 크로마토그래피-질량분석법으로 분석하는 단계에서 이온화 방식은 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI)인, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 전기분무이온화에서 사용하는 질수 분무가스의 유량은 2.0 L/min 내지 3.0 L/min 이며, 기화 온도는 250℃ 내지 350℃ 이고, capillary 전압은 3.0 kV 내지 5.0 kV 인, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (d)의 액체 크로마토그래피의 컬럼은 길이가 40 내지 60 mm 이고, 내경은 1 내지 3 mm 이며, 충전물 입자의 크기는 1.0 μm 내지 3.0 μm 인, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (d)의 액체 크로마토그래피의 이동상은 5% 아세토니트릴(acetonitrile)과 0.1% 포름산(formic acid)을 포함한 수용액 (A)과, 0.1% 포름산(formic acid)을 포함한 95% 아세토니트릴 수용액(B)의 농도 구배가 형성된 것을 사용하며, 유속은 0.20 ㎖/min 내지 0.30 ㎖/min 으로 유지시키는 것을 특징으로 하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 (d)의 액체 크로마토그래피의 농도 구배 조건은 A : B = 90 : 10 (v/v)에서 5분까지 B가 25% 되도록 한 다음, 8분까지 B가 60%, 14분까지 B를 100%, 18분까지 B를 초기 조성인 10%가 되도록 회귀한 다음, 10분 동안 B를 10%의 조성으로 유지시키는 것을 특징으로 하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 내부표준물질은 프로게스테론에 대해서는 중수소 치환 프로게스테론(progesterone-2,2,4,6,6,17α,21,21,21-d 9 ),
코르티솔과 코르티손 및 코르티솔의 대사체들에 대해서는 중수소 치환 코르티솔(cortisol-9,11,12,12-d 4 ),을 사용하는 것을 특징으로 하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법을 제공한다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:
1) 타액 채취
일반적으로 가정용 및 의료용으로 사용되는 면봉으로 입 안 혀주위의 타액을 묻히거나 약 3~5초간 적신 후, 1.5 mL 마이크로 튜브 또는 마개가 있는 시험관에 넣어서 실험 전까지 냉동고에 보관한다. 실험을 위하여 튜브 내의 면봉을 시험관에 옮기고 중수소가 치환된 내부 표준물질 혼합용액(d 4-코르티솔, d 9 -프로게스테론) 20 μL를 넣어준다.
2) 효소 가수분해
시험관에 1.5 mL 인산 완충액(phosphate buffer, pH 7.2)을 넣고 5초 동안 흔들어준 후, 50 μL β-glucuronidase 를 넣고 55 oC에서 1시간 반응을 시킨다. 반응이 끝난 용액을 상온에서 온도를 식힌다.
3) 고체상 추출법
고체상 추출법은 Oasis HLB 카트리지(60 mg / 3 cc, Waters, Milford, MA, USA)를 사용한다. 메탄올과 물로 각각 2 mL씩, 2회 카트리지에 흘려준 후, 핀셋을 이용하여 카트리지 안으로 면봉을 넣어준다. 상기 2)의 추출물을 흘려줌으로써 분석물질인 코르티솔과 코르티손 포함 부신피질호르몬들을 정지상에 머물게 한다. 정지상에 머물러 있는 타액 내 매트릭스 성분을 제거하기 위해 0.7 mL의 10% 메탄올을 사용하여 총 2회 세척해준다. 마지막으로 분석물질을 용출시키기 위해 1 mL의 메탄올을 총 2회 흘려주어 깨끗한 시험관에 얻는다. 그 후, 용출액에 포함되어 있는 용매를 40 oC에서 질소 증발기를 이용하여 메탄올을 제거한다.
4) 액체 크로마토그래피-질량분석법
상기 3)의 건조된 잔사에 50 μL 메탄올을 넣고 30초 동안 섞어준 후, Ultrafree®-MC VV Centrifugal Filter(0.1 μm filter unit; Millipore, Bedford, MA, USA)에 넣고 14,000 rpm에서 5분 동안 여과를 한다. 그 후, 시험관에 50 μL의 10% DMSO를 추가한 후, 30초 동안 섞어주어, 위와 동일한 filter에 넣고 14,000 rpm에서 5분 동안 여과를 한다. 여과된 시료를 액체크로마토그래프 vial에 넣은 후, 5 μL를 주입하여 분석한다.
분석에 사용한 액체 크로마토그래프-질량분석기는 Shimadzu사의 LCMS-8050 triple quadrupole mass spectrometer가 연결된 Nexera Ultra High Performance Liquid Chromatograph이며, 질량분석기의 이온화 방식은 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI)이고, 다중 반응 검지법(multiple-reaction monitoring, MRM)을 사용한다. 또한, 분석에 사용한 컬럼은 Thermo Fisher사의 Hypersil GOLD C18을 사용하며, 이 컬럼의 길이는 50 mm, 내경은 2 mm, 충전물 입자 크기는 1.9 μm이다. 이동상은 5% 아세토니트릴(acetonitrile)과 0.1% 포름산(formic acid)을 포함한 수용액 (A)와 0.1% 포름산(formic acid)을 포함한 95% 아세토니트릴 (B)를 사용하며, 이때 유속은 0.25 mL/min 이다. 기울기 용리법의 조건은 초기에 B를 10%의 조성으로 시작하여 5분까지 B를 25%, 8분까지 B를 30%, 10분까지 B를 60%, 14분까지 B를 100%, 18분까지 B를 초기 조성인 10%가 되도록 하고, 10분 동안 B를 10%의 조성으로 유지시킨다. 전기분무이온화법에서 사용한 질소 분무가스의 유량은 2.5 L/min이며, 기화 온도는 300 oC 이며, capillary 전압은 4.0 kV 이다.
코르티솔과 코르티손을 포함하는 부신피질호르몬들을 각각의 내부표준물질을 기반으로 정량하며, 화합물 당 2개의 특성 이온 피크의 높이 비율과 컬럼 내 머무름 시간을 비교하여 정성적으로 확인한다.
5) 분석대상 화합물들의 농도평가
면봉에서 채취된 타액 내에 존재하는 코르티솔과 코르티손을 포함하는 부신피질호르몬들의 양을 평가하기 위하여, 각 화합물들의 표준용액을 농도별로 취하여 정량곡선을 위한 시료를 준비한 후, 상기 1, 2, 3, 4) 의 설명에 따라 실제 임상시료와 동일하게 처리하여 각 화합물들의 피크 높이와 내부 표준물질의 피크 높이의 비율을 통해 검정곡선을 작성한다. 작성된 검정곡선을 바탕으로 얻은 y = ax + b 수식에 내부 표준물질 대비 시료로부터 검출된 화합물의 비율을 대입하여 부신피질호르몬들의 절대량을 측정한다.
또한, 실험에 사용된 면봉 내에 채취되는 타액의 양은 정확하게 계산할 수 없으며, 면봉의 크기가 클수록 채취량이 증가하게되므로, 측정된 화합물들의 절대량을 기반으로 화합물간의 대사비율을 계산할 수 있으며, 본 발명에서는 대표적으로 11β-히드록시스테로이드 탈수소효소의 활성을 평가하기 위하여 코르티솔(F)과 코르티손(E)의 대사비율(F/E)을 평가하였다.
시험 예 1
상기 실시 예 1의 분석방법을 통하여 뇌하수체 쿠싱질환 환자 6명과 정상인 10명으로부터 채취된 면봉 내 타액을 이용하여 코르티솔과 코르티손의 절대량을 측정한 후, 기존에 임상에서 주로 사용되는 키트(Salivette® Cortisol; Sarstedt, N
Figure 112018110394270-pat00002
umbrecht, Germany)를 사용하여 동일한 대상인으로부터 얻은 0.2 mL 용량의 타액 결과와도 비교하였으며, 특히 11β-히드록시스테로이드 탈수소효소의 활성을 평가하기 위하여 그들의 대사비율을 측정하여, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
쿠싱질환 환자군에서 코르티솔과 코르티손의 정량결과는 정상군에 비해 각각 10배와 3배 정도 높은 것으로 관찰되었으며, 해당 결과는 기존 키트에 의한 방법과 면봉에 의한 방법 모두에서 유사한 결과를 나타내었다.
분석물질 정상인 쿠싱질환
기존타액키트
(ng/mL)		 면봉
(pg)		 기존타액키트
(ng/mL)		 면봉
(pg)
코르티솔(F) 3.87±1.62 584±125 31.11±16.14 5378±1208
코르티손(E) 12.32±4.93 1029±367 31.83±16.66 3247±644
F/E 0.36±0.18 1.93±4.09 0.51±0.74 0.66±1.08
시험예 2
면봉으로부터 채취된 타액 내 코르티솔과 코르티손을 포함하는 부신피질호르몬들의 절대량을 평가할 수 있는 바, 7명의 쿠싱질환 환자들의 수술 전후에 얻은 타액 내 농도를 표 2에 나타내었으며, 코르티솔의 전구체인 프로게스테론을 제외한 코르티솔 포함 모든 코르티솔의 대사체들이 수술 후 감소하고 있으며, 11β-히드록시스테로이드 탈수소효소의 활성을 나타낼 수 있는 코르티솔과 코르티손의 대사비율 F/E의 값이 증가하고 있음을 확인하였다.
분석물질 수술 전
(pg)		 수술 직후
(pg)
progesterone 637±118 848±484
20a-hydroxycortisol 842±172 160±39
18-hydroxycortisol 114±46 55±10
tetrahydrocortisol 4378±442 1911±413
21-deoxycortisol 191±113 178±22
cortisol (F) 4724±1116 1529±288
cortisone (E) 3038±337 929±277
F/E 0.63±0.99 1.26±1.24
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

  1. 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법에 있어서,
    (a) 면봉을 이용하되, 면봉을 입안에 1분 이하로 머무르게 하여 타액을 채취하는 단계,
    (b) 타액을 효소 가수분해 하는 단계,
    (c) 가수분해된 타액을 메탄올 용매를 사용한 고체상 추출법을 통해 용출시켜 추출하는 단계, 및
    (d) 상기 추출된 시료를 유기용매로 재용해하여 액체 크로마토그래피-질량분석법으로 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI)방식으로 분석하는 단계를 포함하며,
    상기 전기분무이온화에서 사용하는 질수 분무가스의 유량은 2.0 L/min 내지 3.0 L/min 이며, 기화 온도는 250℃ 내지 350℃ 이고, capillary 전압은 3.0 kV 내지 5.0 kV 이고,
    상기 (d)의 액체 크로마토그래피의 이동상은 5% 아세토니트릴(acetonitrile)과 0.1% 포름산(formic acid)을 포함한 수용액 (A)과, 0.1% 포름산(formic acid)을 포함한 95% 아세토니트릴 수용액(B)의 농도 구배가 형성된 것을 사용하며, 유속은 0.20 ㎖/min 내지 0.30 ㎖/min 으로 유지시키는 것을 특징으로 하는,
    타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 타액을 묻힌 면봉은 가수분해 전 분석의 대상이 된 부신피질호르몬의 내부표준물질과 혼합하는 단계를 포함하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (b)의 효소 가수분해는 베타-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)를 이용하여 가수분해 하는 것인, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (d)의 액체 크로마토그래피의 컬럼은 길이가 40 내지 60 mm 이고, 내경은 1 내지 3 mm 이며, 충전물 입자의 크기는 1.0 μm 내지 3.0 μm 인, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 (d)의 액체 크로마토그래피의 농도 구배 조건은 A : B = 90 : 10 (v/v)에서 5분까지 B가 25% 되도록 한 다음, 8분까지 B가 60%, 14분까지 B를 100%, 18분까지 B를 초기 조성인 10%가 되도록 회귀한 다음, 10분 동안 B를 10%의 조성으로 유지시키는 것을 특징으로 하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법.
  10. 제 3항에 있어서,
    상기 내부표준물질은 프로게스테론에 대해서는 중수소 치환 프로게스테론(progesterone-2,2,4,6,6,17α,21,21,21-d 9 ),
    코르티솔과 코르티손, 그리고 코르티솔의 전구체 및 대사체에 대해서는 중수소 치환 코르티솔(cortisol-9,11,12,12-d 4 ),을 사용하는 것을 특징으로 하는, 타액 내 부신피질호르몬을 정량하는 방법.
KR1020180135752A 2018-11-07 2018-11-07 면봉으로 채취된 타액 내 부신피질호르몬 평가 방법 Active KR102123287B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180135752A KR102123287B1 (ko) 2018-11-07 2018-11-07 면봉으로 채취된 타액 내 부신피질호르몬 평가 방법
US16/395,069 US11360105B2 (en) 2018-11-07 2019-04-25 Method of evaluating adrenal steroids in saliva collected by cotton swab

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180135752A KR102123287B1 (ko) 2018-11-07 2018-11-07 면봉으로 채취된 타액 내 부신피질호르몬 평가 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200052601A KR20200052601A (ko) 2020-05-15
KR102123287B1 true KR102123287B1 (ko) 2020-06-17

Family

ID=70459499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180135752A Active KR102123287B1 (ko) 2018-11-07 2018-11-07 면봉으로 채취된 타액 내 부신피질호르몬 평가 방법

Country Status (2)

Country Link
US (1) US11360105B2 (ko)
KR (1) KR102123287B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160231341A1 (en) * 2015-02-05 2016-08-11 Castle Medical, LLC Multidrug analysis in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry
US20160349221A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Quest Diagnostics Investments Llc Methods for mass spectrometric quantitation of analytes extracted from a microsampling device

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101029251B1 (ko) 2009-06-18 2011-04-18 전남대학교산학협력단 타액내 코티졸 측정을 통한 코티졸의 일주기리듬 평가 지표 및 방법
KR101152902B1 (ko) * 2010-10-05 2012-06-07 한국과학기술연구원 정량적인 스테로이드 인식 기술을 이용한 머리카락 시료 간 대사 차별성 평가 방법
KR101228322B1 (ko) * 2010-12-29 2013-01-31 재단법인 서울의과학연구소 타액 중의 스테로이드 호르몬의 정량 방법
EP3042208A4 (en) 2013-09-06 2017-04-19 Theranos, Inc. Systems and methods for detecting infectious diseases

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160231341A1 (en) * 2015-02-05 2016-08-11 Castle Medical, LLC Multidrug analysis in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry
US20160349221A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Quest Diagnostics Investments Llc Methods for mass spectrometric quantitation of analytes extracted from a microsampling device
JP2018515796A (ja) 2015-05-27 2018-06-14 クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ エルエルシー マイクロサンプリングデバイスにより抽出された被分析物の質量分析による定量のための方法

Also Published As

Publication number Publication date
US11360105B2 (en) 2022-06-14
KR20200052601A (ko) 2020-05-15
US20200141952A1 (en) 2020-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
McWhinney et al. Measurement of cortisol, cortisone, prednisolone, dexamethasone and 11-deoxycortisol with ultra high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry: application for plasma, plasma ultrafiltrate, urine and saliva in a routine laboratory
Spyridaki et al. Doping control analysis in human urine by liquid chromatography–electrospray ionization ion trap mass spectrometry for the Olympic Games Athens 2004: Determination of corticosteroids and quantification of ephedrines, salbutamol and morphine
Büttler et al. Testosterone, androstenedione, cortisol and cortisone levels in human unstimulated, stimulated and parotid saliva
Kataoka et al. Simultaneous determination of testosterone, cortisol, and dehydroepiandrosterone in saliva by stable isotope dilution on-line in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography–tandem mass spectrometry
KR101228322B1 (ko) 타액 중의 스테로이드 호르몬의 정량 방법
US20110281369A1 (en) Analysis of mycophenolic acid in saliva using liquid chromatography tandem mass spectrometry
Kicman et al. Proposed confirmatory procedure for detecting 5 alpha-dihydrotestosterone doping in male athletes
Elio et al. Human saliva cortisone and cortisol simultaneous analysis using reverse phase HPLC technique
Bui et al. Salivary testosterone in female-to-male transgender adolescents during treatment with intra-muscular injectable testosterone esters
Honour Steroid profiling
Sánchez-Guijo et al. Determination of free cortisol and free cortisone in human urine by on-line turbulent flow chromatography coupled to fused-core chromatography–tandem mass spectrometry (TFC–HPLC–MS/MS)
Godage et al. Biocompatible SPME fibers for direct monitoring of nicotine and its metabolites at ultra trace concentration in rabbit plasma following the application of smoking cessation formulations
Ahi et al. Simultaneous identification of prednisolone and its ten metabolites in human urine by high performance liquid chromatography‐tandem mass spectrometry
Alvi et al. An improved method for measurement of testosterone in human plasma and saliva by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
Koskivuori et al. A quantitative ultra-performance liquid chromatography high-resolution mass spectrometry analysis of steroids from human scalp hair
Vanaelst et al. Measurement of cortisol and cortisone in children's hair using ultra performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry
KR102123287B1 (ko) 면봉으로 채취된 타액 내 부신피질호르몬 평가 방법
CN110702829A (zh) 一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法
Pommier et al. Simultaneous determination of imipramine and its metabolite desipramine in human plasma by capillary gas chromatography with mass-selective detection
US20180348176A1 (en) Stress biomarkers and related non-invasive detection methods
US20020064883A1 (en) Measurement and quantification of 17 ketosteroid-sulfates as a biomarker of biological age
Cho et al. Rapid column‐switching liquid chromatography/mass spectrometric assay for DHEA‐sulfate in the plasma of patients with Alzheimer's disease
CN108020625A (zh) 血浆中花生四烯酸乙醇胺和2-花生四烯甘油含量的检测方法及先兆流产诊断试剂盒
Weiermair et al. Implementation and validation of a UHPLC-MS/MS method for quantification of the endocannabinoids AEA and 2-AG in cerebral interstitial fluid and plasma
JP2023547378A (ja) ヒト血漿中のリゼルギン酸ジエチルアミド（ｌｓｄ）及び２，３－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－２－オキソリセルギド（ｏ－ｈ－ｌｓｄ）を定量化するための方法

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20181107

PA0201 Request for examination
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20200107

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20200429

PG1501 Laying open of application
PN2301 Change of applicant

Patent event date: 20200604

Comment text: Notification of Change of Applicant

Patent event code: PN23011R01D

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20200610

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20200611

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230523

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20240527

Start annual number: 5

End annual number: 5