CN107849106A

CN107849106A - 融合分子

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Publication number: CN107849106A
Application number: CN201680040029.XA
Authority: CN
Inventors: C·科维; H·斯达普; J·克鲁普; C·兰格; I·福肯; D·莱特; T·施蒂德曼; H-F·莱泽; J·谢弗; B·卡兰德拉; A·雷伊; M·莫莱兹; L·弗雷斯; C·罗思; A·奥乐斯多夫; A·维德曼; M·欣纳; B·伦德; K·延森; M·许尔斯迈尔
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Pieris Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2016-07-06
Publication date: 2018-03-27
Also published as: AR105257A1; CL2018000015A1; ECSP18008488A; CA2991298A1; US10947284B2; US10316071B2; JP2018524003A; US20190382455A1; BR112018000155A2; CO2018001188A2; EA201890234A1; HK1249110A1; MX2018000206A; KR20180026755A; TN2017000547A1; EP3115371A1; AU2016289839A1; DOP2018000001A; EP3319986A1; IL256694A

Abstract

本发明涉及对绿脓菌荧光素I、II和III型和绿脓菌螯铁蛋白具有结合特异性并且可在各种应用，包括诊断和/或治疗应用中使用，例如以抑制或降低铜绿假单胞菌的生长和/或预防或治疗铜绿假单胞菌生物膜感染以及与铜绿假单胞菌生物膜感染有关的疾病或病症的融合分子。本发明还涉及生成本文中描述的融合分子的方法以及包含此类融合分子的组合物和试剂盒。本发明进一步涉及编码本文中描述的融合分子的核酸分子。

Description

融合分子

I.技术领域

本发明涉及对绿脓菌荧光素I、II和III型和绿脓菌螯铁蛋白具有结合特异性并且可以在各种应用，包括诊断和/或治疗应用中使用，例如以抑制或降低铜绿假单胞菌的生长和/或预防或治疗铜绿假单胞菌生物膜感染以及与铜绿假单胞菌生物膜感染有关的疾病或病症的融合分子。本发明还涉及生成本文中描述的融合分子的方法以及包含此类融合分子的组合物和试剂盒。本发明进一步涉及编码本文中描述的融合分子的核酸分子。

II.发明背景

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)是一种引起主要与组织损伤相关的急性感染的机会病原体。铜绿假单胞菌在留置装置上以及在具有遗传病症囊性纤维化病的患者的肺组织上形成生物膜。生物膜感染难以用常规的抗生素疗法治疗。然而，研究已经证明了铁是铜绿假单胞菌的正确生物膜形成必需的，因此铁摄取系统是抗假单胞菌疗法的潜在靶物。

铜绿假单胞菌能够通过使用分泌性铁结合铁载体绿脓菌螯铁蛋白和绿脓菌荧光素从宿主环境中清除铁。绿脓菌荧光素(Pvd)是一种肽连接的氧肟酸盐和儿茶酚盐(catecholate)型配体，而绿脓菌螯铁蛋白(Pch)是水杨酸盐和两个半胱氨酸分子的且具有酚、羧酸盐和胺配体官能性的衍生化缀合物。Pvd和Pch两者都已经证明了在铜绿假单胞菌毒力中的作用，有协同作用的某种指示。不能生成任一种铁载体的双重缺陷突变体比仅不能生成两种铁载体之一的单一缺陷突变体在毒力上减弱得多得多(Takase等,Infectionand immunity,Apr.2000,p.1834-1839)。此外，绿脓菌荧光素作用为信号传导分子以控制几种毒力因子及绿脓菌荧光素自身的生成；同时已经提出了除三价铁外，绿脓菌螯铁蛋白可以是用于获得二价金属，如二价铁和锌用于铜绿假单胞菌的致病性的系统的一部分(Visca等,1992)。

已经从几种铜绿假单胞菌菌株：从铜绿假单胞菌ATCC 15692(Briskot等,1989,Liebigs Ann Chem,p.375-384)，从铜绿假单胞菌ATCC 27853(Tappe等,1993,J.Prakt-Chem.,335,p.83-87)以及从天然隔离群铜绿假单胞菌R(Gipp等,1991,Z.Naturforsch,46c,p.534-541)中鉴定出三种结构上不同的绿脓菌荧光素类型或组。此外，对88株临床隔离群和上文提及的两个收集菌株的比较生物学调查根据下述参照菌株揭示了三种不同菌株特异性绿脓菌荧光素介导的铁摄取系统(Cornells等,1989,Infect Immun.,57,p.3491-3497；Meyer等,1997,Microbiology,143,p.35-43)：铜绿假单胞菌ATCC 15692(I型Pvd或Pvd I)、铜绿假单胞菌ATCC 27853(II型Pvd或Pvd II)和临床隔离群铜绿假单胞菌R和pa6(III型Pvd或Pvd III)。

每种绿脓菌荧光素类型具有作为琥珀酰基、琥珀酸酰胺基(succinamid)或α-酮戊二酰基的侧链上有所不同的三种成员(亚型)，即Pvd I型琥珀酰基、Pvd I型琥珀酸酰胺基、Pvd I型α-酮戊二酰基、Pvd II型琥珀酰基、Pvd II型琥珀酸酰胺基、Pvd II型α-酮戊二酰基、Pvd III型琥珀酰基、Pvd III型琥珀酸酰胺基和Pvd III型α-酮戊二酰基。

每种铜绿假单胞菌菌株表达一种Pvd类型，即铜绿假单胞菌ATCC 15692表达I型Pvd，铜绿假单胞菌ATCC 27853表达II型Pvd，而铜绿假单胞菌R和pa6表达III型Pvd，从而每种Pvd类型包括相应类型的所有三种成员，并且每种菌株还表达绿脓菌螯铁蛋白。

发明人已经将绿脓菌荧光素和绿脓菌螯铁蛋白鉴定为对于铜绿假单胞菌的致病性至关重要的靶物，并且在不产生由常规抗生素造成的强选择压力的情况下开发出对于此类靶物，即对于每种Pvd类型，包括对于每种类型而言在侧链上不同的三个成员(亚型)(PvdI s，Pvd I sa，Pvd IαKG，Pvd II s，Pvd II sa，Pvd IIαKG，Pvd III s，Pvd III sa，PvdIIIαKG)以及对于Pch，并且在每种情况下针对游离的铁载体及针对具有结合铁的铁载体的特异性抑制剂(还可参见EP 15 305 242.8)。

认为生长的生物膜模式对于持久的铜绿假单胞菌感染是至关重要的(Costerton等,1999；Singh等,2000)，并且Pvd和Pch基因的双重表达对于正常的生物膜形成是必需的(Banin等,2005)。考虑到铜绿假单胞菌生成全部在其致病性中发挥作用的给人深刻印象的一批毒力因子，一种有效抑制铜绿假单胞菌毒力的优选策略是靶向几种毒力因子。

III.发明概述

在一个方面，本发明涉及对绿脓菌荧光素I、II和III型和绿脓菌螯铁蛋白具有结合特异性的融合分子，其包含：

(a)第一多肽，所述第一多肽包含或组成为(consisting of)结合绿脓菌荧光素I型的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(hNGAL)突变蛋白；

(b)第二多肽，所述第二多肽包含或组成为结合绿脓菌荧光素II型的hNGAL突变蛋白；

(c)第三多肽，所述第三多肽包含或组成为结合绿脓菌荧光素III型的hNGAL突变蛋白；和

(d)第四多肽，所述第四多肽包含或组成为结合绿脓菌螯铁蛋白的hNGAL突变蛋白；

其中所述第一、第二、第三和第四多肽是共价连接的。

在一个实施方案中，所述hNGAL突变蛋白包含在与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQID NO:1)的位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145对应的一个或多个位置处的突变氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述hNGAL突变蛋白以200nM或更低的解离常数K_D分别结合绿脓菌荧光素I型、绿脓菌荧光素II型、绿脓菌荧光素III型和绿脓菌螯铁蛋白。

在一个实施方案中，所述第一、第二、第三和第四多肽经由接头分子共价连接。

在一个实施方案中，接头分子是肽接头。

在一个实施方案中，融合分子进一步包含允许所述融合分子多聚化的多聚化域。

在一个实施方案中，多聚化域是允许所述融合分子二聚化的二聚化域。

在一个实施方案中，所述二聚化域选自下组：Fc域、IgE重链域2(EHD2)、IgM重链域2(MHD2)、IgG重链域3(GHD3)、IgA重链域3(AHD2)、IgD重链域3(DHD3)、IgE重链域4(EHD4)、IgM重链域4(MHD4)、子宫珠蛋白二聚化域和前述中任一者的变体或片段。

在一个实施方案中，Fc域是人IgG4-Fc域。

在一个实施方案中，融合分子具有选自下组的通式：

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–X₃–L₃–X₄-C’ (I)，

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–X₃–L₃–X₄–L₄–MD-C’ (II)，

N’-MD–L₁–X₁–L₂–X₂–L₃–X₃–L₄–X₄-C’ (III)，

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–MD–L₃–X₃–L₄–X₄-C’ (IV)，

N’-X₁–L₁–MD–L₂–X₂–L₃–X₃–L₄–X₄-C’ (V)，和

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–X₃–L₃–MD–L₄–X₄-C’ (VI)

其中

X₁、X₂、X₃和X₄在每次出现时选自下组：第一、第二、第三和第四多肽，条件是所述融合分子包含所述第一、第二、第三和第四多肽之每种；

MD包含多聚化域；并且

L₁、L₂、L₃和L₄在每次出现时独立选自共价键和接头分子。

在一个实施方案中，融合分子以多聚体(例如二聚体)复合物存在。

在一个实施方案中，融合分子进一步包含至少一种允许检测和/或分离所述融合分子的标记物或标签。

在一个实施方案中，融合分子进一步包含增加所述融合分子的稳定性和/或延长所述融合分子的血清半衰期的一个或多个修饰。

在一个实施方案中，融合分子抑制或降低铜绿假单胞菌经由绿脓菌螯铁蛋白和/或绿脓菌荧光素的铁摄取。

在一个实施方案中，融合分子抑制或降低铜绿假单胞菌的毒力因子表达。

在一个实施方案中，融合分子抑制或降低绿脓菌螯铁蛋白和/或绿脓菌荧光素介导的信号传导。

在一个实施方案中，融合分子抑制或降低铜绿假单胞菌细菌生长。

在一个实施方案中，融合分子与药学活性剂结合或缀合/融合。

在一个实施方案中，药学活性剂选自下组：抗生素、细胞抑制剂、毒素、金属或金属化合物/复合物、螯合剂、半抗原和抗体。

在别的方面，本发明涉及核酸分子，其包含编码如上文限定的融合分子的核苷酸序列。

在一个实施方案中，核酸分子与调节序列可操作连接以允许核酸分子的表达。

在一个实施方案中，核酸分子被包含在载体中。

在另一个方面，本发明涉及宿主细胞，其包含如上文限定的核酸分子。

在又一个方面，本发明涉及生成如上文限定的融合分子的方法，其中(i)通过在允许融合分子表达的条件下培养如上文限定的宿主细胞并且通过从宿主细胞或其培养基分离融合分子，或者(ii)通过体外翻译如上文限定的核酸分子而生成融合分子。

在别的方面，本发明涉及药物组合物，其包含如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、或如上文限定的细胞。

在一个实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在一个实施方案中，药物组合物进一步包含另外的药学活性剂。

在一个实施方案中，另外的药学活性剂选自下组：抗生素、细胞抑制剂、毒素、金属或金属化合物/复合物、螯合剂、半抗原和抗体。

在又一个方面，本发明涉及试剂盒，其包含如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的细胞、或如上文限定的药物组合物。

在又一个方面，本发明涉及如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的细胞、或如上文限定的药物组合物，其用作药物。

在又一个方面，本发明涉及如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的细胞、或如上文限定的药物组合物，用于在预防或治疗受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染中的用途。

在又一个方面，本发明涉及如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的细胞、或如上文限定的药物组合物，用于在预防或治疗受试者中的与铜绿假单胞菌生物膜感染有关或由铜绿假单胞菌生物膜感染引起的疾病或病症中的用途。

在又一个方面，本发明涉及预防或治疗受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染的方法，其包括对受试者施用有效量的如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的细胞、或如上文限定的药物组合物。

在又一个方面，本发明涉及预防或治疗受试者中的与铜绿假单胞菌生物膜感染有关或由铜绿假单胞菌生物膜感染引起的疾病或病症的方法，其包括对受试者施用有效量的如上文限定的融合分子、如上文限定的核酸分子、如上文限定的细胞、或如上文限定的药物组合物。

在一个实施方案中，铜绿假单胞菌生物膜感染是急性或慢性感染。

IV.附图简述

图1：显示了铜绿假单胞菌铁载体的结构。图1A-C显示了三种铜绿假单胞菌绿脓菌荧光素的结构。图1A：Pvd I型的结构(参见Birskot等,1989)；图1B：Pvd II型的结构(参见Birskot等,1989)；图1C：Pvd III型的结构(Gipp等,1991)；图1D：附接于生色团部分的R可以是琥珀酰基、琥珀酸酰胺基(succinamid)或α-酮戊二酰基侧链；和图1E：绿脓菌螯铁蛋白的结构(Brandel等,2011)。

图2：提供了通过表面等离振子共振对于Pvd I s(+Fe)对脂笼蛋白突变蛋白SEQID NO:16的结合(A)、Pvd II s(+Fe)对脂笼蛋白突变蛋白SEQ ID NO:36的结合(B)、PvdIII(+Fe)对脂笼蛋白突变蛋白SEQ ID NO:53的结合(C)和绿脓菌螯铁蛋白(+Fe)对SEQ IDNO:62的结合(D)的结合速率和解离速率的典型测量。另外，图2E-H中显示了缺乏1200nM(对于绿脓菌螯铁蛋白为200nM)的相应铁载体对阴性对照SEQ ID NO:64的结合。

图3：显示了如通过表面等离振子共振测定的脂笼蛋白突变蛋白SEQ ID NO:35的例示性特异性和交叉反应性概况。证明了对绿脓菌荧光素II琥珀酰基、琥珀酸酰胺基和α-酮戊二酰基的特异性结合，同时显示了缺乏对I型和III型绿脓菌荧光素、绿脓菌螯铁蛋白、肠菌素和去铁胺(desferoxamin)的结合。对于所有分析物，使用2μM的高浓度。

图4：显示了来自生长抑制测定法的例示性数据。图4A：与在没有突变蛋白情况下生长的对照培养物相比，Pvd I特异性突变蛋白SEQ ID NO:16显示了Pvd I特异性铜绿假单胞菌菌株(ATCC27853)的生长抑制。图4B：与在没有突变蛋白情况下生长的对照培养物相比，Pvd II特异性突变蛋白SEQ ID NO:19和36显示了Pvd II特异性铜绿假单胞菌菌株(ATCC15692)的生长抑制。SEQ ID NO:36与SEQ ID NO:19相比具有更高的结合亲和力并且显示更大的生长抑制。图4C：与在没有突变蛋白情况下生长的对照培养物相比，Pvd III特异性突变蛋白SEQ ID NO:53显示了Pvd III特异性铜绿假单胞菌菌株(ATCC33360)的生长抑制。图4D：与在没有突变蛋白情况下生长的对照培养物相比，Pch特异性突变蛋白SEQ IDNO:62显示了依赖于Pch摄取铁的Pvd I敲除铜绿假单胞菌菌株(ATCC15692ΔpvdA)的生长抑制。在测定法中应用10μM脂笼蛋白突变蛋白。

图5：在小鼠中的铜绿假单胞菌诱导的肺感染模型中显示了在细菌攻击前1小时和细菌攻击之时，SEQ ID NO:19的施用以剂量依赖性方式防止小鼠中的感染形成。从200μg/小鼠的SEQ ID NO:19开始观察到显著的预防效果，在2000μg/小鼠有最大效果。

图6：显示了表达用于结晶的氨基酸序列(SEQ ID NO:129)，包括第1位的开始甲硫氨酸、第2位的赖氨酸、第3-8位的六组氨酸标签、第9-15位的氨基酸DYDIPTT的接头区(SEQID NO:132)、第16-22位的烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割位点ENLYFQG(SEQ ID NO:133)，接着是从第23位起的感兴趣的突变蛋白的氨基酸序列。

图7：显示了SEQ ID NO:31–Pvd-Fe复合物结构。显示了来自不对称单元的两个SEQID NO:31分子，即链A和链B的覆盖。

图8：显示了SEQ ID NO:31和Pvd-Fe相互作用。覆盖来自不对称单元的两个分子。描绘了与Pvd-Fe相互作用的侧链。

图9：显示了Pvd组成。参与铁结合的氧原子是框示的。

图10A：显示了根据本发明的融合分子的结构。经由接头分子(这里：序列(G₄S)₂的肽接头；参见SEQ ID NO:141)遗传融合脂笼蛋白突变蛋白1、2、3和4(LM 1、2、3、4)，其中LM1(SEQ ID NO:34或36)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素II组铁载体，LM 2(SEQ ID NO:16或17)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素I组铁载体，LM 3(SEQ ID NO:50或53)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素III组铁载体，且LM 4(SEQ ID NO:62或63)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌螯铁蛋白铁载体。融合分子构建体(SEQ ID NO:134或135)在一个分子中包含对所有铜绿假单胞菌铁载体的结合能力，并且具有对于每个Pvd组的一个结合模块和对于绿脓菌螯铁蛋白的一个结合模块。

图10B：显示了根据本发明的Fc-融合分子构建体的结构。经由接头分子(这里：序列(G₄S)₂的肽接头；参见SEQ ID NO:141)将脂笼蛋白突变蛋白1、2、3和4(LM 1、2、3、4)与人IgG4-Fc域(hu IgG4-Fc；SEQ ID NO:140)的N端遗传融合，其中LM 1(SEQ ID NO:34或36)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素II组铁载体，LM 2(SEQ ID NO:16或17)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素I组铁载体，LM 3(SEQID NO:50或53)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素III组铁载体，并且LM 4(SEQ ID NO:62或63)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌螯铁蛋白铁载体。Fc-融合分子构建体(SEQ ID NO:136或137)在一个分子中包含对所有铜绿假单胞菌铁载体的结合能力，并且具有对于每个Pvd组和对于绿脓菌螯铁蛋白的两个结合模块。

图10C：显示了根据本发明的Fc-融合分子构建体的结构。经由接头分子(这里：序列(G₄S)₂的肽接头；参见SEQ ID NO:141)将脂笼蛋白突变蛋白1、2、3和4(LM 1、2、3、4)与人IgG4-Fc域(hu IgG4-Fc；SEQ ID NO:140)的C端遗传融合，其中LM 1(SEQ ID NO:34)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素II组铁载体，LM 2(SEQ ID NO:17)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素I组铁载体，LM 3(SEQ ID NO:50)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素III组铁载体，并且LM 4(SEQ ID NO:63)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌螯铁蛋白铁载体。Fc-融合分子构建体(SEQ ID NO:138)在一个分子中包含对所有铜绿假单胞菌铁载体的结合能力，并且具有对于每个Pvd组和对于绿脓菌螯铁蛋白的两个结合模块。

图10D：显示了根据本发明的Fc-融合分子构建体的结构。经由接头分子(这里：序列(G₄S)₂的肽接头；参见SEQ ID NO:141)遗传融合脂笼蛋白突变蛋白1、2、3和4(LM 1、2、3、4)。将LM 1和LM 2遗传融合于人IgG4-Fc域(hu IgG4-Fc；SEQ ID NO:140)的N端，并且将LM3和LM 4遗传融合于人IgG4-Fc域(hu IgG4-Fc；SEQ ID NO:140)的C端，其中LM 1(SEQ IDNO:34)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素II组铁载体，LM 2(SEQID NO:17)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素I组铁载体，LM 3(SEQ ID NO:50)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌荧光素III组铁载体，并且LM 4(SEQ ID NO:63)结合具有结合的铁离子和没有复合的铁离子的绿脓菌螯铁蛋白铁载体。Fc-融合分子构建体(SEQ ID NO:139)在一个分子中包含对所有铜绿假单胞菌铁载体的结合能力，并且具有对于每个Pvd组和对于绿脓菌螯铁蛋白的两个结合模块。

图11：显示了纯化的融合分子(这里：SEQ ID NO:134)的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。

图12：显示了SEQ ID NO:137、138和139的不同Fc-融合分子构建体和SEQ ID NO:17、34、50和63的相应单一脂笼蛋白突变蛋白对溶液中的不同绿脓菌荧光素组的加载有铁的琥珀酰基变体和加载有铁的绿脓菌螯铁蛋白的结合，如在基于ELISA的测定法中测定。所有Fc-融合分子形式在结合于单一靶物中是有活性的，并且具有与单一脂笼蛋白突变蛋白的IC₅₀值相当的IC₅₀值。

图13：显示了融合分子(这里：SEQ ID NO:134)能够同时结合绿脓菌荧光素和绿脓菌螯铁蛋白。在经中性亲合素(neutravidin)涂覆的MSD板上捕获具有琥珀酰基残基的来自每个相应组(I、II和III)的生物素化的绿脓菌荧光素，并且允许融合分子结合。经由经Sulfo标签标记的绿脓菌螯铁蛋白检测结合的融合分子。

图14：显示了融合分子(这里：SEQ ID NO:134)能够在铁限制培养基中抑制生成Pvd I(A)、Pvd II(B)或Pvd III(C)的菌株，或ΔpvdA PvdII敲除菌株(D)的生长。

图15：显示了融合分子(这里：SEQ ID NO:134，称为RA10680550)在第3天在单剂后显著降低慢性感染模型中的铜绿假单胞菌肺负荷(CFU/克肺组织)，并且直至第15天不发生复发。进一步显示了融合分子不拮抗妥布霉素(Tobramycin)活性，并且在联合疗法中，两种活性协同。每种处理的几何平均值负荷以水平棒标示。在每个柱形之上，记录了与运载体相比所述处理组的Log₁₀降低(LogR)(LOD＝检测限)。

图16：显示了融合分子(这里：SEQ ID NO:134，又称为RA10680550)阻断感染大鼠的肺中的总白细胞计数的增加，并且由此增加感染的清除。相对于每种单一处理，妥布霉素/融合分子组合显示清楚的益处。感染后第3、5、7、9和15天的绝对BAL白细胞(单核细胞和嗜中性粒细胞)计数均值+SD(每ml BAL的细胞)(对数标度)。

图17：显示了融合分子在定居的早期阶段(A)或建立的定居(B)期间降低毒力因子表达。SEQ ID NO:134的测试融合分子显示对铜绿假单胞菌的rhlI的毒力基因表达的显著影响。rhlI参与通过生成N-丁酰高丝氨酸内酯(BHL)的群体感应(quorum sensing)。BHL结合其受体RhlR，由此诱导基因(包括其自身基因座)的互补物的表达(完成自身诱导回路)。

图18：显示了融合分子的结合能力不受分开四种脂笼蛋白突变蛋白的接头分子的长度影响。测试的接头分子是甘氨酸、GSGGSG(SEQ ID NO:142)和(G4S)₂(SEQ ID NO:141)。

图19：显示了Fc-融合分子防止铁饥饿培养基中指数生长的细菌的绿脓菌荧光素生成。对于铜绿假单胞菌菌株ATCC27853(A和B)，菌株ATCC15692(C和D)和菌株ATCC33360(E和F)显示了用Fc-融合分子(SEQ ID NO:136)或对照Fc-融合分子处理后cfu/ml和荧光任意单位数值的均值和s.e.m.。

图20：显示了Fc-融合分子防止铁饥饿培养基中指数生长的细菌的绿脓菌荧光素生成(还可参见图20)。对于菌株ATCC27853(A)、ATCC15692(B)和ATCC33360(C)显示了用Fc-融合分子(SEQ ID NO:136)或对照Fc-融合分子处理后绿脓菌荧光素荧光的标准化相对量。

图21：显示了图19和20中显示的效果是绿脓菌荧光素特异性的。菌株ATCC27853的培养物中及ATCC27853的pvdA/pchD双重突变体菌株中的荧光的均值数值显示了不能合成这些铁载体的突变体菌株没有展现出任何荧光信号。

图22：显示了图19和20中显示的效果是绿脓菌荧光素特异性的(还可参见图21)。为了标准化荧光信号，在荧光信号获取前使用获自野生型ATCC27853的上清液的纯化的绿脓菌荧光素II以掺入培养物，并且获得校正曲线。

图23：显示了在存在Fc-融合分子的情况下的荧光信号下降不是由于化合物对绿脓菌荧光素结合后的荧光猝灭所致。对含有绿脓菌荧光素的培养上清液(用ATCC27853的过滤的24小时培养物获得)临时添加Fc-融合分子(SEQ ID NO:136)，并且立即和在24小时后读取荧光。如通过此实验中观察到的荧光的均值数值显示，未能检出荧光猝灭。

图24：显示了Fc-融合分子影响细菌生长的动力学。用Fc-融合分子(SEQ ID NO:136)的1mg/mL处理对菌株ATCC15692和ATCC33360的影响在(A)和(B)中分别显示为cfu/mL的均值和s.e.m.。

图25：显示了铁浓度对Ppchd转录活性的影响。观察到的发光的均值和s.e.m.显示了pchD启动子表达在没有铁添加的C-MS培养基中诱导，并且通过铁添加阻抑，从而确认报告融合物的功能性。

图26：显示了用Fc-融合分子(SEQ ID NO:136)的处理在存在各种量的补充铁的情况下对Ppchd转录活性的影响。观察到的发光的均值和s.e.m.显示了启动子活性在存在Fc-融合分子的情况下被消除，而不管补充铁的量如何，而对照Fc-融合分子没有效果。

图27：显示了一定范围的剂量的Fc-融合分子(SEQ ID NO:136)对在没有铁补充物的情况下测试的PpchD转录活性的影响。观察到的发光的均值点和s.e.m.拟合于标准剂量响应曲线，并且对于Fc-融合分子产生0.03mg/mL的IC₅₀值(95％CI:0.02-0.05)，而它对于同型对照Fc-融合分子未限定。

V.发明详述

虽然下文详细描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于本文中描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以有所变化。还应当理解，本文中使用的术语是仅为了描述具体的实施方案，并且并不意图限制本发明的范围，其仅会以所附申请专利范围限制。除非另有规定，本文中使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。

在下文中，将描述本发明的要素。然而，这些要素在具体实施方案的情况下列出，应当理解，它们可以以任何方式和以任何数目组合以创建别的实施方案。各个描述的例子和优选的实施方案不应解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。此描述应当理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与具有任何数目的公开和/或优选的要素组合的实施方案。此外，应当认为本申请中的所有描述的要素的任何排列和组合被本申请的描述公开，除非上下文另有指示。

优选地，本文中使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)(生物技术术语的多语言词汇表:(IUPAC推荐))”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.编,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)中描述的那样定义。

除非另有指示，本发明的实施会采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学、和重组DNA技术的常规方法，其在本领域的文献(Sambrook,J.等(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY)中解释。

贯穿本说明书和所附的申请专利范围，除非上下文另有要求，词语“包含/包括”及变型应当理解为暗示包括叙述的成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组，但是不排除任何其它成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，可以排除此类其它成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组，即主题在于包括叙述的成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组。在描述本发明的背景中(尤其在申请专利范围的背景中)使用的术语“一个”和“一种”和“所述/该”及类似的提及应当理解为覆盖单数和复数两者，除非本文中另有指示或者上下文明确矛盾。本文中的数值范围的叙述仅仅意图充当个别提及落入范围内的每个单独数值的速记法。除非本文中另有指示，每个单独的数值并入说明书中，就像其在本文中个别叙述一样。可以以任何合适的次序进行本文中描述的所有方法，除非本文中另有指示或者上下文另有明确矛盾。本文中提供的任何和所有例子，或者例示性语言(例如“如”)的使用仅仅意图更好地例示本发明，并且不对另外要求保护的本发明的范围造成限制。说明书中的语言不应解释为指示对于本发明的实施必需的任何不要求保护的要素。

贯穿本说明书的文本引用几个文件。本文(无论在上文还是在下文)中引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的规格说明、用法说明等)在此通过提述以其整体并入。本文中的无一内容解释为承认由于在先发明，本发明没有资格早于此类公开。

A.融合分子

本发明提供了对绿脓菌荧光素I、II和III型和绿脓菌螯铁蛋白具有结合特异性的融合分子，其包含：

(a)第一多肽，所述第一多肽包含或组成为结合绿脓菌荧光素I型的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(hNGAL)突变蛋白；

其中所述第一、第二、第三和第四多肽是共价连接的。

术语“融合分子”一般指通过连接两个或更多个独特的分子(例如(多)肽或蛋白质)，特别是头-至-尾(例如N端至C端或反之亦然)，从而产生具有源自每个初始分子(例如(多)肽或蛋白质)的功能特性的单一分子而创建的分子。在一个实施方案中，融合分子是融合蛋白。

如本文中使用，术语“结合特异性”指配体(例如本发明的融合分子)区分靶物(例如绿脓菌荧光素I、II和III型和绿脓菌螯铁蛋白)和一种或多种参照靶物的能力，这是因为结合特异性不是绝对的，而是相对的特性。例如，可以根据Western印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA测试、FACS、IHC和肽扫描测定特异性结合。

如本文中使用，“绿脓菌荧光素”意指在铁缺乏性生长条件下由革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌生成并且对铁具有高亲和力的荧光铁载体。绿脓菌荧光素由三个结构部分构成：二羟基喹啉生色团、侧链和可变肽链。肽链模块参与受体识别和结合。已经鉴定出三种不同Pvd(在其肽链上不同)(I-III型；图1A-D)。绿脓菌荧光素类型的大小和氨基酸组成及绿脓菌荧光素识别特异性对于每种物种是独特的。可以区别三种铜绿假单胞菌菌株，每种生成不同绿脓菌荧光素类型和关联FpvA受体。每种类型具有在侧链上不同的三个成员(亚型)，所述侧链是琥珀酰基、琥珀酸酰胺基或α-酮戊二酰基，即Pvd I型琥珀酰基、Pvd I型琥珀酸酰胺基、Pvd I型α-酮戊二酰基、Pvd II型琥珀酰基、Pvd II型琥珀酸酰胺基、Pvd II型α-酮戊二酰基、Pvd III型琥珀酰基、Pvd III型琥珀酸酰胺基和Pvd III型α-酮戊二酰基。

如本文中使用，“绿脓菌螯铁蛋白”意指由铜绿假单胞菌生成并且溶解三价铁的水杨酸盐和两个半胱氨酸分子的且具有酚、羧酸盐和胺配体官能性的噻唑啉衍生化缀合物。绿脓菌螯铁蛋白是一种拥有酚盐，而无氧肟酸盐和儿茶酚盐(catecholate)模块的结构上独特的铁载体(参见图1E)。

如本文中使用，术语“嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(hNGAL)”(又称为“人脂笼蛋白2”或“人Lcn 2”或“人NGAL”或仅“脂笼蛋白”)指具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188的成熟人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(NGAL)。人NGAL(hNGAL)突变蛋白在本文中也可以称为“脂笼蛋白突变蛋白”或仅“突变蛋白”。SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188中显示的氨基酸序列可以用作特定的“参照序列”。在一个实施方案中，SEQ IDNO:1中显示的氨基酸序列用作参照序列。野生型hNGAL不结合绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白。野生型hNGAL的天然配体是肠菌素，其以高亲和力对接于(dock into)hNGAL的萼器(calyx)中。

如本文中使用，“突变蛋白”、“突变”实体(无论是蛋白质还是核酸)、或“突变体”指与天然存在(野生型)核酸或蛋白质参照序列/支架相比一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入。所述术语还包括如本文中描述的突变蛋白的片段和变体。优选地，在本发明的融合分子中使用的突变蛋白、其片段或变体保留结合如本文中描述的绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白的功能。

在一个实施方案中，由第一、第二、第三和第四多肽包含的hNGAL突变蛋白分别对绿脓菌荧光素I、II和III型和绿脓菌螯铁蛋白是特异性的或者特异性结合绿脓菌荧光素I、II和III型和绿脓菌螯铁蛋白。

在本文中在结合绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白的hNGAL突变蛋白的语境中使用时，术语“对…特异性”包括突变蛋白分别针对绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白、结合绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白或者与绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白起反应。如此，针对、结合或起反应包括突变蛋白分别特异性结合绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白。在此语境中的术语“特异性”意指突变蛋白与如本文中描述的绿脓菌荧光素蛋白或绿脓菌螯铁蛋白蛋白，但是基本上不与另一种蛋白质起反应。术语“另一种蛋白质”分别包括任何非绿脓菌荧光素或非绿脓菌螯铁蛋白蛋白质，包括与本文中公开的突变蛋白针对的绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白紧密相关或同源的蛋白质。然而，术语“另一种蛋白质”不排除来自除了人外的物种，如定义“受试者”的语境中描述的那些物种的绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白蛋白质、片段和/或变体。术语“基本上不结合”意指本公开的突变蛋白不结合另一种蛋白质，即显示小于30％，特别是20％，更特别是10％，甚至更特别是小于9、8、7、6或5％的交叉反应性。可以特别通过将本公开的脂笼蛋白突变蛋白与绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白的反应同所述突变蛋白与一种或多种其它蛋白质的反应进行比较而容易地测试突变蛋白是否特异性起反应，如上文限定的。例如，也可以根据Western印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-测试、FACS、IHC和肽扫描来测定“特异性结合”。

在一个实施方案中，由第一、第二、第三和第四多肽包含的hNGAL突变蛋白分别以可检测的亲和力结合绿脓菌荧光素I、II和III型和绿脓菌螯铁蛋白。

如本文中使用的，“可检出的亲和力”意指以一般约10^-5M以下，例如约10^-6M以下或约10^-7M以下的解离常数K_D结合选定的靶物的能力。更低的亲和力(即更高的K_D值)一般用常见的方法，如ELISA不再能测量到，因此是次等重要的。

如本文中使用的，可通过本领域技术人员已知的多种方法测量公开内容的蛋白质(例如人脂笼蛋白(lipocalin)2的突变蛋白)对选定的靶物(在本案的情况中为绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白)的“结合亲和力”(从而测定突变蛋白-配体的K_D值。此类方法包括但不限于荧光滴定、直接ELISA、竞争ELISA、量热方法，如等温滴定量热学(ITC)和表面等离振子共振(Biacore)。此类方法是本领域中完善建立的，并且其例子也在下文详述。

还注意到相应的结合剂和其配体之间的复合物形成受到许多不同因素影响，如相应结合配偶体的浓度、竞争剂的存在、使用的缓冲液系统的pH和离子强度、和用于测定解离常数K_D的实验方法(例如荧光滴定、直接ELISA、竞争ELISA或表面等离振子共振，仅举几例)或者甚至用于评估实验数据的数学算法。

因此，技术人员还清楚的是，K_D值(相应结合剂和其靶物/配体之间形成的复合物的解离常数)可以在某个实验范围内变化，这取决于用于测定特定突变蛋白对给定配体的亲和力的方法和实验设置。这意味着可以有测量的K_D值的略微偏差或公差范围，例如取决于是通过表面等离振子共振(Biacore)，通过竞争ELISA，还是通过“直接ELISA”测定K_D值。

在一些实施方案中，如本发明的融合分子中使用的对绿脓菌荧光素(I、II或III型)特异性的突变蛋白能够以200nM或更低，或约100nM或更低，或约50nM或更低，或约25nM或更低，或约15nM或更低的解离常数K_D结合绿脓菌荧光素(分别为I、II或III型)。在一些实施方案中，如本发明的融合分子中使用的对绿脓菌螯铁蛋白特异性的突变蛋白能够以200nM或更低，或约100nM或更低，或约50nM或更低，或约25nM或更低，或约15nM或更低的解离常数K_D结合绿脓菌螯铁蛋白。在一些别的具体实施方案中，根据本发明的融合分子的突变蛋白分别以约10nM或更低，或约5nM或更低，或约2nM或更低，或约1nM或更低，或约0.1nM或更低，或约10pM或更低的对绿脓菌荧光素(分别为I、II或III型)或绿脓菌螯铁蛋白的解离常数结合绿脓菌荧光素(I、II或III型)或绿脓菌螯铁蛋白。

在具体的实施方案中，本发明的融合分子以200nM或更低，或约100nM或更低，或约50nM或更低，或约25nM或更低，或约15nM或更低，或约10nM或更低，或约5nM或更低，或约2nM或更低，或约1nM或更低，或约0.1nM或更低，或约10pM或更低的相应解离常数K_D结合绿脓菌荧光素(I、II和III型)和绿脓菌螯铁蛋白。

在一个实施方案中，通过表面等离振子共振(Biacore)，通过竞争ELISA，或者通过“直接ELISA”测定K_D值。

在本发明的融合分子中使用的hNGAL突变蛋白以及其产生和鉴定的方法详细公开/描述于EP 15 305 242.8和PCT/EP2016/053226以及下文的“hNGAL突变蛋白”部分中。

在一个具体的实施方案中，在SEQ ID NO:2-18中任一项(例如SEQ ID NO:16)中显示了对绿脓菌荧光素I型特异性的hNGAL突变蛋白。在一个具体的实施方案中，在SEQ IDNO:19-37中任一项(例如SEQ ID NO:36)中显示了对绿脓菌荧光素II型特异性的hNGAL突变蛋白。在一个具体的实施方案中，在SEQ ID NO:38-53中任一项(例如SEQ ID NO:53)中显示了对绿脓菌荧光素III型特异性的hNGAL突变蛋白。在一个具体的实施方案中，在SEQ IDNO:54-63中任一项(例如SEQ ID NO:62)中显示了对绿脓菌螯铁蛋白特异性的hNGAL突变蛋白。

如本文中使用，术语“共价连接”指经由共价键或者经由共价接头分子的连接。在一个实施方案中，第一、第二、第三和第四多肽经由接头分子共价连接。

如本文中使用，术语“接头分子”指适合于联接/连接蛋白质模块，例如如本文中定义的第一、第二、第三和第四多肽的分子。根据本发明的接头分子可以具有任何大小/长度。然而，优选地，它长得足以提供足够的柔性程度以防止联接/连接的模块干扰彼此的活性，例如通过位阻，并且以允许正确的蛋白质折叠；可是优选地，它短得足以提供在细胞中的稳定性(例如蛋白水解稳定性)。合适的接头分子是本领域技术人员已知的，并且包括例如肽及非肽分子，例如合适长度的非肽寡聚物和多聚物。根据本发明，本文中描述的单一融合分子内的各种接头分子可以是相同或不同的。

在一个实施方案中，接头分子是肽接头。根据本发明的肽接头可以具有任何长度，即它可以包含任何数目的氨基酸残基。然而，优选地，它长得足以提供足够的柔性程度以防止联接/连接的模块干扰彼此的活性，例如通过位阻，并且以允许正确的蛋白质折叠；可是优选地，它短得足以提供在细胞中的稳定性(例如蛋白水解稳定性)。在一些实施方案中，肽接头具有1至30个氨基酸的长度，或1至25个氨基酸的长度，或1至20个氨基酸的长度，或1至15个氨基酸的长度，或1至12个氨基酸的长度或1至10个氨基酸的长度。如此，根据本发明，肽接头可以由单个氨基酸残基，例如甘氨酸(Gly，G)构成。

根据本发明的肽接头的氨基酸可以选自所有天然或非天然存在的氨基酸，特别选自氨基酸甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)和苏氨酸(Thr，T)。在一个实施方案中，肽接头是富含甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸的接头或富含甘氨酸-丝氨酸的接头，其中至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的氨基酸分别是甘氨酸或丝氨酸或苏氨酸残基或者甘氨酸或丝氨酸残基。在另一个实施方案中，氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸，即肽接头仅由甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基构成(称为甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸接头)。在又一个实施方案中，肽接头仅由甘氨酸和丝氨酸残基构成(称为甘氨酸-丝氨酸接头)。

在一个实施方案中，肽接头是甘氨酸-丝氨酸接头，并且具有1至30个氨基酸的长度，或1至25个氨基酸的长度，或1至20个氨基酸的长度，或1至15个氨基酸的长度，或1至12个氨基酸的长度或1至10个氨基酸的长度。根据本发明的具体的肽接头具有通式(GGGGX)_n，其中在每次出现时，X独立选自S和T，并且n是选自1至5，或1至4，或1至3，或1和2的整数。在一个实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列。在另一个实施方案中，肽接头具有SEQ ID NO:142的氨基酸序列。

在一个实施方案中，融合分子进一步包含允许融合分子的多聚化的多聚化域。可以通过多个(例如2、3或4，特别是2或3，更特别是2个)多聚化域之间的非共价相互作用和/或共价相互作用，特别地经由一个或多个二硫键发生多聚化。

合适的多聚化域是本领域技术人员已知的，并且包括例如三聚化域，如腱糖蛋白三聚化基序、胶原凝集素三聚化域和链霉亲合素，和二聚化域，如Fc域、IgE重链域2(EHD2)、IgM重链域2(MHD2)、IgG重链域3(GHD3)、IgA重链域3(AHD2)、IgD重链域3(DHD3)、IgE重链域4(EHD4)、IgM重链域4(MHD4)、子宫珠蛋白二聚化域。在一个实施方案中，Fc域是人IgG4-Fc域，其在一个具体的实施方案中包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列或者由SEQ ID NO:140的氨基酸序列组成。还包括任一种前述域的变体或片段，例如已经经过修饰以延长其半衰期和/或增加其效力的域，只要它们仍允许融合分子的多聚化(例如二聚化)，即是功能性的。合适的修饰是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于Fc域的提高其对FcRn的亲和力的修饰，如记载于例如Zalevsky,J.等(2010),Nature Biotechnology,28(2):157-9(例如N434S、V259I/V308F、M252Y/S254T/T256E、M428L/N434S和V259I/V308F/M428L)。

在一个实施方案中，融合分子具有选自下组的通式：

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–X₃–L₃–X₄-C’ (I)，

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–X₃–L₃–X₄–L₄–MD-C’ (II)，

N’-MD–L₁–X₁–L₂–X₂–L₃–X₃–L₄–X₄-C’ (III)，

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–MD–L₃–X₃–L₄–X₄-C’ (IV)，

N’-X₁–L₁–MD–L₂–X₂–L₃–X₃–L₄–X₄-C’ (V)，和

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–X₃–L₃–MD–L₄–X₄-C’ (VI)

其中

MD包含多聚化域；并且

根据本发明，L₁、L₂、L₃和L₄可以是相同或不同的。

因此，在一个方面中，本发明还提供了多聚体(或多聚体复合物)，其包含两个或更多个本文中描述的融合分子(例如二聚体或二聚体复合物)。此类复合物又可以称为融合分子复合物。在一个实施方案中，两个或更多个融合分子非共价或共价(例如经由二硫键)联合以形成融合分子复合物。

在一个实施方案中，融合分子进一步包含至少一个允许检测和/或分离融合分子的标记物或标签。

“允许检测和/或分离融合分子的标记物或标签”意图包括本领域中已知用于这些目的的任何标记物/标签。它们包括亲和标签，如或II(Schmidt,T.G.M.等(1996)J.Mol.Biol.255,753-766)、myc标签、FLAG标签、His6标签或HA标签或蛋白质，如麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)及其组合(例如或II和His-6标签)。具有生色或荧光特性的蛋白质，如绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)也是合适的标记物。

(多)肽标记物或标签的氨基酸序列可以在融合分子的氨基酸序列内的任何位置处引入，并且可以例如采取在编码的蛋白质结构内的环形状(例如在本文中描述的任何肽接头内或者甚至在突变蛋白内，只要标记物/标签不干扰其功能)，或者它可以是N端或C端融合的。标记物或标签可以进一步含有允许从融合分子除去标记物或标签的切割位点。类似地，可以在任何合适的位点处将非肽标记物或标签，例如荧光染料与融合分子缀合。

一般地，有可能用任何合适的化学物质或酶(其直接或间接产生可检测的化合物或化学、物理、光学或酶反应的信号)标记本发明的融合分子。物理反应和同时光学反应/标记物的一个例子是当使用放射性标记物时X射线的照射或发射后的荧光发射。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是酶标记物(和同时光学标记物)的例子，其催化生色反应产物的形成。

融合分子还可以包含用于促进分子分泌的氨基酸序列，如N端分泌信号、或信号序列。本发明的融合分子可以进一步包含结合域，其用来例如增强对特定细胞类型的选择性。这可以例如通过提供结合域实现，所述结合域结合所述细胞类型的表面上表达的特定抗原。

在一个实施方案中，融合分子进一步包含一个或多个增加融合分子的稳定性和/或延长融合分子的血清半衰期的修饰。

在一个实施方案中，融合分子的“稳定性”涉及融合分子的“半衰期”(例如体内)。“半衰期”涉及消除分子的活性、量或数目的一半需要的时间段。

在一些实施方案中，可以将融合分子与延长融合分子的血清半衰期的模块缀合(在这点上，还可见PCT公开文本WO 2006/56464 A2，其中参照对CTLA-4具有结合亲和力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白的突变蛋白描述了此类缀合策略)。延长血清半衰期的模块可以是聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、多唾液酸、脂肪酸分子，如棕榈酸(Vajo&Duckworth 2000,Pharmacol.Rev.52,1-9)、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白结合肽、清蛋白结合蛋白、或运铁蛋白，仅举几例。清蛋白结合蛋白可以是细菌清蛋白结合蛋白、抗体、抗体片段，包括域抗体(参见例如美国专利6,696,245)、或对清蛋白具有结合活性的突变蛋白。因而，适合于延长本发明的融合分子的半衰期的缀合配偶体包括清蛋白结合蛋白，例如细菌清蛋白结合域，如链球菌蛋白G的一种(T.,&Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。可以用作缀合配偶体的清蛋白结合肽的其它例子是例如具有Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cys共有序列的那些，其中Xaa₁是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa₂是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa₃是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；并且Xaa₄是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr，如美国专利申请2003/0069395或Dennis等(Dennis,M.S.,Zhang,M.,Meng,Y.G.,Kadkhodayan,M.,Kirchhofer,D.,Combs,D.&Damico,L.A.(2002)J Biol Chem 277,35035-35043)中所述。

在其它实施方案中，清蛋白自身(Osborn,B.L.等,2002,J.Pharmacol.Exp.Ther.303,540-548)，或清蛋白的生物学活性片段可以用作本发明的融合分子的缀合配偶体。术语“清蛋白”包括所有哺乳动物清蛋白，如人血清清蛋白或牛血清清蛋白或大鼠清蛋白。可以重组生成清蛋白或其片段，如美国专利5,728,553或欧洲专利申请EP 0 330 451和EP 0 361 991中所述。可以将重组人清蛋白Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)与本发明的融合分子缀合或融合以延长融合分子的半衰期。

若清蛋白结合蛋白是抗体片段，则它可为域抗体。域抗体(dAb)工程化改造为容许对生物物理特性和体内半衰期的精确控制以创建最佳安全性和效力产物概况。例如，域抗体可购自Domantis Ltd.(Cambridge,UK和MA,USA)。

使用转铁蛋白作为模块来延长本发明的融合分子的血清半衰期，融合分子可以遗传上融合于非糖基化转铁蛋白的N或C端或两者。非糖基化转铁蛋白具有14-17天的半衰期，并且类似地，转铁蛋白融合蛋白会具有延长的半衰期。转铁蛋白载体还提供高生物利用度、生物分布和循环稳定性。此技术可购自BioRexis(BioRexis PharmaceuticalCorporation,PA,USA)。用作蛋白质稳定剂/半衰期延长配偶体的重组人转铁蛋白(DeltaFerrin^TM)也可购自Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)。

若为了延长本发明的突变蛋白的血清半衰期而使用免疫球蛋白的Fc部分，可以使用可购自Syntonix Pharmaceuticals,Inc(MA,USA)的SynFusion^TM技术。此Fc-融合技术的使用容许创建更长效的生物药物，并且可以例如由与抗体的Fc区连接的至少四种突变蛋白之每种的两个拷贝组成以改善药动学、溶解度和生成效率。

延长本发明的融合分子的半衰期的又一种备选是于融合分子的N或C端融合长的、非结构化的、柔性的富含甘氨酸的序列(例如具有约20至80个连续甘氨酸残基的多聚甘氨酸)。例如，WO2007/038619中公开的此方法也已经称作“rPEG”(重组PEG)。

若使用聚亚烷基二醇作为缀合配偶体，则聚亚烷基二醇可以是取代的、未取代的、线性或分支的。它也可以是活化的聚亚烷基衍生物。合适的化合物的例子是聚乙二醇(PEG)分子，如WO 99/64016，美国专利6,177,074或涉及干扰素的美国专利6,403,564中所述，或如对其它蛋白质所述，如经PEG修饰的门冬酰胺酶，PEG-腺苷脱氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶(参见例如Fuertges等(1990)The Clinical Efficacy of Poly(EthyleneGlycol)-Modified Proteins J.Control.Release 11,139-148)。此类聚合物(如聚乙二醇)的分子量的范围可以为约300至约70.000道尔顿，包括例如具有约10.000，约20.000，约30.000或约40.000道尔顿的分子量的聚乙二醇。此外，如例如美国专利6,500,930或6,620,413中所述的，为了血清半衰期延长，可以将碳水化合物寡聚物和聚合物，如淀粉或羟乙基淀粉(HES)与本发明的融合分子缀合。

在一个实施方案中，本发明的融合分子在其N端和/或其C端融合于融合配偶体，所述融合配偶是延长融合分子的血清半衰期的蛋白质域。在别的具体的实施方案中，蛋白质域是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白结合肽、或清蛋白结合蛋白。

在另一个实施方案中，将本发明的融合分子与延长融合分子的血清半衰期的化合物缀合。更具体地，将突变蛋白与选自下组的化合物缀合：聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白结合肽、和清蛋白结合蛋白。

在一个实施方案中，融合分子降低铜绿假单胞菌的毒力因子表达。

在一个实施方案中，融合分子与药学活性剂结合或缀合/融合。可以通过本领域中公知的方法生成此类缀合物。

在一个实施方案中，药学活性剂选自下组：抗生素、细胞抑制剂、毒素、酶、金属或金属化合物/复合物、螯合剂、放射性核素、小有机分子、治疗活性肽、治疗活性核酸分子、半抗原和抗体。

合适的抗生素包括妥布霉素、阿奇霉素(Azithromycin)、氨曲南(Aztreonam)、粘菌素(Colistin)和碳青霉烯(carbapenems)。

合适的金属或金属化合物/复合物是镓、镓化合物和基于镓的复合物。

如本文中使用，术语“小有机分子”指包含至少两个碳原子，但是优选不超过7或12个可旋转的碳键，具有100-2000道尔顿，特别是100-1000道尔顿，或<900道尔顿的范围的分子量，并且任选地包含一个或两个金属原子的有机分子。

术语“治疗活性肽”指例如作用为细胞表面受体的激动剂/拮抗剂的肽或竞争给定细胞靶物上的蛋白质结合位点的肽。

术语“治疗活性核酸分子”指例如反义核酸分子、小干扰RNA、微小RNA或核酶。

具体的药学活性剂包括阿法链道酶(Dornase alfa)、皮质类固醇、白三烯修饰剂、N-乙酰半胱氨酸、吸入的谷胱甘肽、抗胆碱药、布洛芬和β2-肾上腺素能受体激动剂。

在一个实施方案中，融合分子包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:134至139和SEQ ID NO:143至186，其中在具体的实施方案中，SEQ ID NO:144至186的氨基酸序列缺乏(C端)II和His6标签。在一个实施方案中，融合分子包含SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:136的氨基酸序列或由SEQ ID NO:134或SEQID NO:136的氨基酸序列组成。

B.用于在本发明的融合分子中使用的hNGAL突变蛋白

在一些实施方案中，结合绿脓菌荧光素(I、II或III型)或绿脓菌螯铁蛋白的hNGAL突变蛋白可以包含天然的半胱氨酸残基(例如人NGAL的线性多肽序列SEQ ID NO:1的第87位的半胱氨酸残基)被另一种氨基酸(例如丝氨酸残基)的至少一个氨基酸取代。在一些其它实施方案中，结合绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白的突变蛋白可以包含取代野生型hNGAL的一个或多个氨基酸的一个或多个非天然半胱氨酸残基。在一个别的具体的实施方案中，根据本公开内容的hNGAL突变蛋白包含天然氨基酸被半胱氨酸残基的至少两个氨基酸取代，从而形成一个或多个半胱氨酸桥。在一些实施方案中，所述半胱氨酸桥可以连接至少两个环区。本文中根据Flower(Flower,1996,见上文,Flower,等,2000,见上文)和Breustedt等(2005,见上文)使用这些区域的定义。

在一些实施方案中，本公开内容的hNGAL突变蛋白不结合于肠菌素。

在一个方面中，本公开内容包括各种hNGAL突变蛋白，其例如以至少可检测的亲和力结合绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白。在此意义上，认为绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白是参照野生型hNGAL的非天然配体，其中“非天然配体”指在生理学条件下不结合野生型人脂笼蛋白2的化合物。通过将野生型hNGAL工程化改造为在某些序列位置处具有一个或多个突变，本发明人已经证明了对于非天然配体(绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白)的高亲和力和高特异性是可能的。在一些实施方案中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个编码野生型I人脂笼蛋白2上的某些序列位置的核苷酸三联体，可以经由通过核苷酸三联体的亚组在这些位置处的取代进行随机诱变。

公开内容的突变蛋白可以具有与hNGAL的线性多肽序列的某些序列位置(如人NGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的序列位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145)对应的序列位置的任何一处或多处，包括至少在任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12处的突变氨基酸残基。在一些实施方案中，突变氨基酸残基代表保守或非保守取代。在一些实施方案中，hNGAL突变蛋白包含在与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置28、54、65和87对应的一个或多个位置的突变氨基酸残基。

公开内容的突变蛋白可以包含在突变氨基酸序列位置外部的“亲本”蛋白质支架(如hNGAL)的野生型(天然)氨基酸序列。在一些实施方案中，根据公开内容的hNGAL突变蛋白还可以携带一个或多个序列位置处的一个或多个氨基酸突变，只要此类突变至少基本上不阻碍或不干扰突变蛋白的结合活性和折叠。可以在DNA水平上使用建立的标准方法(Sambrook,J.等(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)非常容易地实现此类突变。氨基酸序列的改变的例示性例子是插入或缺失以及氨基酸取代。此类取代可以是保守的，即氨基酸残基被替换为化学相似特性(特别就极性及大小而言)的氨基酸残基。保守取代的例子是以下组的成员间的替换：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也有可能在氨基酸序列中引入非保守变化。另外，代替替换单一氨基酸残基，也有可能插入或缺失人脂笼蛋白2的一级结构的一个或多个连续氨基酸，只要这些缺失或插入导致稳定的折叠/功能突变蛋白(例如具有截短的N和C端的hNGAL突变蛋白)。在此类突变蛋白中，例如，在多肽的N或C端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。一般地，此类突变蛋白可以与成熟hNGAL的氨基酸序列具有约至少70％，包括至少约80％，如至少约85％氨基酸序列同一性。作为一个说明性的例子，本公开内容还涵盖如上文限定的hNGAL突变蛋白，其中成熟hNGAL的线性多肽序列的4个氨基酸残基(G-N-I-K；位置95-98；SEQ IDNO:130)已经被缺失(例如SEQ ID NO:46)。

当同与其它脂笼蛋白的序列同一性比较时，本文中公开的hNGAL突变蛋白的氨基酸序列具有与成熟hNGAL(SEQ ID NO:1)的高序列同一性。在此一般语境中，公开内容的突变蛋白的氨基酸序列与天然野生型hNGAL的氨基酸序列是至少基本上相似的，例如条件是比对中可能有作为氨基酸的添加或缺失的结果的缺口(如下文定义)。在一些实施方案中，与成熟hNGAL的序列基本上相似的公开内容的突变蛋白的相应序列与成熟hNGAL的序列具有至少70％同一性或序列同源性、至少75％同一性或序列同源性、至少80％同一性或序列同源性、至少82％同一性或序列同源性、至少85％同一性或序列同源性、至少87％同一性或序列同源性、至少90％同一性或序列同源性，包括至少95％同一性或序列同源性，例如条件是改变的位置或序列得到保留，并且一个或多个缺口是可能的。

a)对绿脓菌荧光素特异性的hNGAL突变蛋白

在一个方面中，本公开内容涉及对一类绿脓菌荧光素，如Pvd I型、Pvd II型或PvdIII型特异性的特异性结合人脂笼蛋白2(人Lcn2或hNGAL)突变蛋白。

本公开内容的一个实施方案涉及突变蛋白，其能够例如以可检测的亲和力，如通过约200nM或更低，如约150nM或更低的K_D测量的亲和力结合一类绿脓菌荧光素。

在一个方面中，本公开内容提供了hNGAL突变蛋白，其能够以约20nM或更低，如15nM或更低的K_D结合与铁复合的Pvd I型，例如在基本上在实例6中描述的测定法中通过Biacore T200仪测量时。

在一些别的实施方案中，本公开内容的一个或多个hNGAL突变蛋白能够以通过约200nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合具有和没有复合铁的Pvd I型琥珀酰基、Pvd I型琥珀酸酰胺基和Pvd I型α-酮戊二酰基，例如在基本上在实例5中描述的ELISA测定法中测量时。

在一些实施方案中，突变蛋白能够以约150nM或更低的IC₅₀值抑制由绿脓菌荧光素I型琥珀酰基介导的铁摄取，例如在基本上在实例7中描述的竞争ELISA形式中。

在一些实施方案中，突变蛋白能够抑制Pvd I菌株的细菌生长，例如在基本上在实例8中描述的测定法中。

在这点上，公开内容涉及多肽(例如如本文中提及的第一多肽)，其中所述多肽包含hNGAL突变蛋白或由hNGAL突变蛋白组成，并且所述hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含序列位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136处的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个突变氨基酸残基，并且其中所述多肽结合Pvd I型，包括Pvd I型琥珀酰基、Pvd I型琥珀酸酰胺基和Pvd I型α-酮戊二酰基。

在一些实施方案中，公开内容的Pvd I型结合hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一处或多处包含以下突变氨基酸残基中的一个或多个：Leu 36→Asn,Thr,Val,Trp或Phe；Ala 40→Gly,Asn,Thr或Phe；Ile 41→Arg,Ala,Thr,Phe或Trp；Gln 49→Ile,Leu,Val,Ala或Pro；Tyr 52→Met,Trp或Pro；Ser 68→Asp,Val或Glu；Leu 70→Gln,Trp,Asp或Thr；Arg 72→Trp,Ala,Ser,Leu,Pro或Glu；Lys 73→Asp,Leu,Ala,Glu或Asn；Asp 77→Arg,Leu,Tyr,Ser,Gln,Thr,Ile或Asn；Trp 79→Gln,Asp,Ser,Arg,Met或Glu；Arg 81→Gln,Gly,Ile,Glu,His或Asp；Asn 96→His,Ile,Gly,Tyr或Asp；Tyr 100→Lys,Glu,Asn,Ser,Phe或Tyr；Leu 103→Lys,Pro,Gln,His,Asp,Tyr,Glu,Trp或Asn；Tyr 106→His,Gln或Phe；Lys 125→Arg,Ser,Trp,Tyr,Val或Gly；Ser 127→Trp,Asn,Ala,Thr,Tyr,His,Ile,Val或Asp；Tyr 132→Trp,Asn,Gly或Lys；和Lys134→Asn,His,Trp,Gly,Gln或Asp。在一些实施方案中，公开内容的hNGAL突变蛋白包含成熟hNGAL的这些序列位置处的两个或更多个，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多或所有突变氨基酸残基。

另外，根据公开内容的Pvd I型结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比还可以包含一个或多个或所有下述取代：Gln 28→His；Lys46→Glu；Thr 54→Val或Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp或Gln；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser或Asn；和Thr 136→Ala。

在一些别的实施方案中，结合Pvd I型的公开内容的hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下氨基酸替换：

(a)Gln 28→His；Leu 36→Asn；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Gln；Arg 72→Trp；Lys 73→Asp；Asp 77→Leu；Trp 79→Gln；Arg 81→Gln；Cys 87→Ser；Asn 96→His；Tyr 100→Lys；Leu 103→His；Tyr 106→His；Lys 125→Arg；Ser 127→Trp；Tyr 132→Trp；Lys 134→Asp；

(b)Gln 28→His；Leu 36→Thr；Ala 40→Gly；Ile 41→Phe；Gln 49→Leu；Tyr 52→Trp；Leu 70→Trp；Arg 72→Ala；Lys 73→Leu；Asp 77→Tyr；Trp 79→Asp；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Glu；Leu 103→His；Tyr 106→Gln；Lys 125→Trp；Ser 127→Asn；Tyr 132→Asn；Lys 134→Gln；

(c)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Lys；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Ala；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；

(d)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Asn；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Met；Ser 68→Asp；Leu 70→Thr；Arg 72→Glu；Lys 73→Ala；Asp 77→Arg；Trp 79→Arg；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Tyr；Tyr 100→Lys；Leu 103→Pro；Tyr 106→Phe；Lys 125→Ser；Ser 127→Thr；Tyr 132→Trp；Lys 134→Gly；

(e)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Val；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Phe；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；

(f)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Phe；Ile 41→Phe；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Trp；Arg 72→Leu；Lys 73→Asn；Asp 77→Gln；Trp 79→Glu；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Tyr；Leu 103→Tyr；Tyr 106→His；Lys 125→Val；Ser 127→His；Tyr 132→Lys；Lys 134→Trp；

(g)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Ile；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；

(h)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Asp；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Asp；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser127→Val；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；

(i)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Asp 77→Thr；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Asn；Leu 103→Glu；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser127→Asp；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；

(j)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Asp；Asp 77→Val；Trp 79→Ser；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Asn；Leu 103→Asn；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser127→Val；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；

(k)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Ser；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；

(l)Gln 28→His；Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；

(m)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→Ser；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；

(n)Leu 36→Trp；Asn 39→Asp；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Thr 136→Ala；

(o)Leu 36→Trp；Ala 40→Thr；Ile 41→Ala；Gln 49→Pro；Tyr 52→Pro；Thr 54→Val；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Gln；Arg 72→Ser；Lys 73→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Ser；Trp 79→Ser；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→His；Lys 125→Tyr；Ser 127→Thr；Tyr 132→Gly；Lys 134→Asn；Thr 136→Ala；

(p)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→Ser；Leu 103→Trp；Tyr106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；或

(q)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Asn 65→Gln；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→Ser；Leu 103→Trp；Tyr106→Gln；Lys 125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His。

在残留的区域(即与序列位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136不同的区域)中，公开内容的hNGAL突变蛋白可以包含在突变氨基酸序列位置外部的野生型(天然)氨基酸序列。

在别的具体的实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2-18或其片段或变体。

公开内容的Pvd I型结合hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与选自下组的序列可以具有高序列同一性，如至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％同一性，包括至少95％同一性：SEQ ID NO:2-18。

公开内容还包括具有选自下组的氨基酸序列的hNGAL突变蛋白的结构同源物：SEQID NO:2-18，所述结构同源物相对于所述hNGAL突变蛋白具有超过约60％，特别是超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过92％并且更特别地超过95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。

可以依靠人脂笼蛋白2的天然存在形式的诱变获得根据本公开内容的Pvd I型结合hNGAL突变蛋白。在诱变的一些实施方案中，取代(或替换)是保守取代。不过，涵盖任何取代(包括非保守取代或来自下述例示性取代的一个或多个)，只要突变蛋白保留其结合PvdI型的能力，和/或它与然后取代的序列具有的同一性在于它与成熟人脂笼蛋白2的氨基酸序列(SWISS-PROT数据库登录号P80188)具有至少60％，如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的同一性。

在另一个方面中，本公开内容提供了hNGAL突变蛋白，其以约20nM或更低，如5nM或更低的K_D结合与铁复合的Pvd II型，例如在基本上在实例6中描述的测定法中通过BiacoreT200仪测量时。

在又一些别的实施方案中，本公开内容的一个或多个hNGAL突变蛋白能够以通过约200nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合具有和没有复合铁的Pvd II型琥珀酰基、Pvd II型琥珀酸酰胺基和Pvd II型α-酮戊二酰基，例如在基本上在实例5中描述的ELISA测定法中测量时。

在一些实施方案中，突变蛋白能够以约150nM或更低的IC₅₀值抑制由绿脓菌荧光素II型琥珀酰基介导的铁摄取，例如在基本上在实例7中描述的竞争ELISA形式中。

在一些实施方案中，突变蛋白能够抑制Pvd II菌株的细菌生长，例如在基本上在实例8中描述的测定法中。

在一些其它实施方案中，突变蛋白能够抑制或减轻表达绿脓菌荧光素II型的铜绿假单胞菌菌株的生长，例如在基本上在实例10中描述的测定法中。

在这点上，公开内容涉及多肽(例如如本文中提及的第二多肽)，其中所述多肽包含hNGAL突变蛋白或由hNGAL突变蛋白组成，并且所述hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含序列位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134处的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个突变氨基酸残基，并且其中所述多肽结合Pvd II型。

在一些实施方案中，公开内容的Pvd II型结合hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一处或多处包含以下突变氨基酸残基中的一个或多个：Leu 36→Asn,Ile或Val；Ala 40→Glu,Gly,Asn,Thr或His；Ile 41→Arg,Val或Thr；Gln49→Gly,Ala或Pro；Tyr 52→Asn,Gly,Trp或Pro；Ser 68→Asp,Arg或Glu；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His,Ile,Ala,Ser或Gly；Lys 73→Asn,Met,Pro,Phe,Gln或Arg；Asp 77→His,Ile,Met,Lys,Gly或Asn；Trp 79→Ser,Tyr,Ala,Asp,Phe或Trp；Arg 81→Glu,Ser,Tyr或Asp；Asn 96→Met,Ile,Arg,Asp,Lys,Asn或Ala；Tyr 100→Lys,Glu,Asn,Ser,Phe或Tyr；Leu 103→Thr,Ile,Gln,Gly,Met,His,Trp或Val；Tyr 106→Met,Gln,Ala,Ile,Asn,Gly,Met或Phe；Lys 125→Ala,Ile或Asn；Ser 127→Lys,Arg,Ser,Met,Asp或Asn；Tyr 132→Met,Phe,Asn,Ala,Ile,Gly或Val；和Lys 134→Trp或Tyr。在一些实施方案中，公开内容的hNGAL突变蛋白包含成熟hNGAL的这些序列位置处的两个或更多个，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多或所有突变氨基酸残基。

另外，根据公开内容的Pvd II型结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比还可以包含一个或多个或所有下述取代：Gln 28→His；Thr54→Ala；Asn 65→Asp或Gln和Cys 87→Ser。

在一些别的实施方案中，结合Pvd II型的公开内容的hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下氨基酸替换：

(a)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Tyr 100→Asn；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys134→Trp；

(b)Gln 28→His；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Met；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Asn；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Met；Lys 134→Trp；

(c)Gln 28→His；Leu 36→Ile；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Pro；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Ser；Leu 103→Gly；Tyr 106→Ala；Lys 125→Lys；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；

(d)Gln 28→His；Ala 40→Asn；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Ser；Lys 73→Gln；Asp 77→Met；Trp 79→Ala；Arg 81→Tyr；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Pro；Leu 103→Thr；Tyr 106→Ile；Lys 125→Lys；Ser 127→Met；Tyr 132→Phe；Lys134→Trp；

(e)Gln 28→His；Ala 40→His；Gln 49→Ala；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Asp；Arg 72→Gly；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Asp；Leu 103→Met；Tyr 106→Phe；Lys 125→Ala；Ser 127→Asp；Tyr 132→Asn；Lys 134→Trp；

(f)Gln 28→His；Leu 36→Asn；Ala 40→Gly；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Trp；Ser 68→Arg；Leu 70→Trp；Arg 72→Asn；Lys 73→Gln；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Thr；Leu 103→Trp；Tyr 106→Asn；Lys 125→Asn；Ser127→Met；Tyr 132→Ile；Lys 134→Tyr；

(g)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Thr；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gly；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→Gly；Lys 73→Arg；Asp 77→Gly；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Trp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Gly；Lys 125→Lys；Ser 127→Asn；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；

(h)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；

(i)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Ser；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Val；Lys 134→Trp；

(j)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→His；Leu 103→Gln；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Ala；Lys 134→Trp；

(k)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Gly；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Trp；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Tyr 100→Asn；Leu 103→His；Tyr 106→Met；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys134→Trp；

(l)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Phe；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Met；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；

(m)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；

(n)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；

(o)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Glu；Ile 41→Val；Gln 49→Gly；Tyr 52→Pro；Asn 65→Gln；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Arg 72→His；Lys 73→Asn；Asp 77→Asn；Trp 79→Phe；Arg 81→Glu；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Asn；Leu 103→Val；Tyr 106→Met；Lys 125→Asn；Ser 127→Lys；Tyr 132→Gly；Lys 134→Trp；

(p)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；

(q)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；

(r)Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp；或

(s)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp。

在残留的区域(即与序列位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134不同的区域)中，公开内容的hNGAL突变蛋白可以包含在突变氨基酸序列位置外部的野生型(天然)氨基酸序列。

在别的具体的实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:19-37或其片段或变体。

公开内容的Pvd II型结合hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与选自下组的序列可以具有高序列同一性，如至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％同一性，包括至少95％同一性：SEQ ID NO:19-37。

公开内容还包括具有选自下组的氨基酸序列的hNGAL突变蛋白的结构同源物：SEQID NO:19-37，所述结构同源物相对于所述hNGAL突变蛋白具有超过约60％，特别是超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过92％并且最特别地超过95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。

可以依靠人脂笼蛋白2的天然存在形式的诱变获得根据本公开内容的Pvd II型结合hNGAL突变蛋白。在诱变的一些实施方案中，取代(或替换)是保守取代。不过，涵盖任何取代(包括非保守取代或来自下述例示性取代的一个或多个)，只要突变蛋白保留其结合PvdI型的能力，和/或它与然后取代的序列具有的同一性在于它与成熟人脂笼蛋白2的氨基酸序列(SWISS-PROT数据库登录号P80188)具有至少60％，如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的同一性。

在又一个方面中，本公开内容提供了hNGAL突变蛋白，其能够以约20nM或更低，如10nM或更低的K_D结合与铁复合的Pvd III型，例如在基本上在实例6中描述的测定法中通过Biacore T200仪测量时。

在又一些别的实施方案中，本公开内容的一个或多个hNGAL突变蛋白能够以通过约200nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合具有和没有复合铁的Pvd III型琥珀酰基、PvdIII型琥珀酸酰胺基和Pvd III型α-酮戊二酰基，例如在基本上在实例5中描述的ELISA测定法中测量时。

在一些实施方案中，突变蛋白能够以约150nM或更低的IC₅₀值抑制由绿脓菌荧光素III型介导的铁摄取，例如在基本上在实例7中描述的竞争ELISA形式中。

在一些实施方案中，突变蛋白能够抑制Pvd III菌株的细菌生长，例如在基本上在实例8中描述的测定法中。

在这点上，公开内容涉及多肽(例如如本文中提及的第三多肽)，其中所述多肽包含hNGAL突变蛋白或由hNGAL突变蛋白组成，并且所述hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含序列位置28、36、40-42、45-47、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、105-106、125、127、132、134和145处的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个突变氨基酸残基，并且其中所述多肽结合Pvd III型。

在一些实施方案中，公开内容的Pvd III型结合hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一处或多处包含以下突变氨基酸残基中的一个或多个：Leu 36→Phe或Glu；Ala 40→Trp,Leu或Arg；Ile 41→Met,Arg,Ala,Leu或Trp；Gln 49→His,Ile,Arg,Lys,Met或Pro；Tyr 52→Asn,Tyr,Arg,Ser或Met；Ser 68→Asp,Asn,Glu或Gln；Leu 70→Lys,Asn或Arg；Arg 72→Leu,Arg,Gln或Tyr；Lys73→His,Leu,Ala,Pro,Gln或Tyr；Asp 77→Ala,Ile,Lys,Gln或Arg；Trp 79→Ser或Asp；Arg 81→His,Ala,Ser或Val；Asn 96→Met,Ile,Arg,Gly,Leu或Val；Tyr 100→Ala,Ile,Asn,Pro或Asp；Leu 103→Gln,Gly,Phe或Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp或Thr；Ser 127→Val,His,Ile,Phe或Ala；Tyr132→Phe；和Lys 134→Trp,Gln或Glu。在一些实施方案中，公开内容的hNGAL突变蛋白包含成熟hNGAL的这些序列位置处的两个或更多个，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多或所有突变氨基酸残基。

另外，根据公开内容的Pvd III型结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比还可以包含一个或多个或所有下述取代：Gln 28→His；Leu 42→Arg；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Asp 47→Asn；Asn 65→Asp；Cys 87→Ser；Ser 105→Pro和Thr 145→Pro。

在一些别的实施方案中，结合Pvd III型的公开内容的hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下氨基酸替换：

(a)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Trp；Ile 41→Met；Gln 49→His；Tyr 52→Asn；Ser 68→Glu；Leu 70→Lys；Arg 72→Gln；Lys 73→Ala；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Ile；Tyr 100→Asn；Leu 103→Gly；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→His；Tyr 132→Phe；Lys 134→Gln；

(b)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Arg；Ile 41→Trp；Gln 49→Ile；Tyr 52→Tyr；Ser 68→Gln；Leu 70→Asn；Arg 72→Trp；Lys 73→Leu；Asp 77→Ala；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Ile；Leu 103→Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Thr；Ser 127→Ile；Tyr 132→Phe；Lys 134→Glu；

(c)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Leu；Ile 41→Leu；Gln 49→Arg；Tyr 52→Arg；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Leu；Lys 73→Tyr；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→Ala；Cys 87→Ser；Asn 96→Gly；Tyr 100→Ala；Leu 103→Phe；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→Ala；Lys 134→Glu；

(d)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Trp；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asn；Leu 70→Arg；Arg 72→Trp；Lys 73→Pro；Asp 77→Arg；Trp 79→Ser；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Pro；Leu 103→Gly；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Phe；Lys 134→Glu；

(e)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Ala；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；

(f)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Gln；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；

(g)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Thr；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Arg；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Val；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys134→Trp；

(h)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；

(i)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Tyr；Asp 77→Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→-；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；

(j)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；

(k)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 47→Asn；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Thr 145→Pro；

(l)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；

(m)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；

(n)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 47→Asn；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；Thr 145→Pro；

(o)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；或(p)Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Leu 42→Arg；Gln 49→Met；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→His；Asp 77→Lys；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Leu；Tyr 100→Asp；Leu 103→Gln；Ser 105→Pro；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp。

在残留的区域(即与序列位置28、36、40-42、45-47、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、105-106、125、127、132、134和145不同的区域)中，公开内容的hNGAL突变蛋白可以包含在突变氨基酸序列位置外部的野生型(天然)氨基酸序列。

在别的具体的实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:38-53或其片段或变体。

公开内容的Pvd III型结合hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与选自下组的序列可以具有高序列同一性，如至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％同一性，包括至少95％同一性：SEQ ID NO:38-53。

公开内容还包括具有选自下组的氨基酸序列的hNGAL突变蛋白的结构同源物：SEQID NO:38-53，所述结构同源物相对于所述hNGAL突变蛋白具有超过约60％，特别是超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过92％并且最特别地超过95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。

可以依靠人脂笼蛋白2的天然存在形式的诱变获得根据本公开内容的Pvd III型结合hNGAL突变蛋白。在诱变的一些实施方案中，取代(或替换)是保守取代。不过，涵盖任何取代(包括非保守取代或来自下述例示性取代的一个或多个)，只要突变蛋白保留其结合Pvd I型的能力，和/或它与然后取代的序列具有的同一性在于它与成熟人脂笼蛋白2的氨基酸序列(SWISS-PROT数据库登录号P80188)具有至少60％，如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的同一性。

b)对绿脓菌荧光素特异性的突变蛋白的应用

因此，医学中存在公开内容的绿脓菌荧光素结合突变蛋白的许多可能的应用。在一个别的方面中，公开内容涉及本文中公开的绿脓菌荧光素结合突变蛋白用于检测样品中的绿脓菌荧光素(I、II或III型)的用途以及相应的诊断方法。

本公开内容还牵涉如描述的一种或多种绿脓菌荧光素结合突变蛋白用于与绿脓菌荧光素(I、II或III型)形成复合物的用途。

因此，在公开内容的另一个方面中，公开的突变蛋白用于检测绿脓菌荧光素(I、II或III型)。此类用途可以包括下述步骤：在合适的条件下使一种或多种所述突变蛋白与怀疑含有绿脓菌荧光素的样品接触，从而允许形成突变蛋白和绿脓菌荧光素(I、II或III型)之间的复合物，并且通过合适的信号检测复合物。

可检测信号可以通过如上文解释的标记物，或者通过由于结合(即复合物形成)自身所致的物理特性的变化引起。一个例子是表面等离振子共振，其数值在结合配偶体的结合期间变化，来自所述结合配偶体的一个在表面如金箔上固定化。

本文中公开的绿脓菌荧光素结合突变蛋白也可用于分离绿脓菌荧光素(I、II或III型)。此类用途可以包括下述步骤：在合适的条件下使一种或多种所述突变蛋白与假设含有绿脓菌荧光素(I、II和/或III型)的样品接触，从而允许形成突变蛋白和绿脓菌荧光素(I、II或III型)之间的复合物，并且分开复合物与样品。

在公开的突变蛋白用于检测绿脓菌荧光素以及分开绿脓菌荧光素(I、II或III型)的用途中，可以在合适的固相上固定化突变蛋白和/或绿脓菌荧光素或其域或片段。

在又一个方面中，本公开内容特征在于诊断或分析试剂盒，其包含根据公开内容的绿脓菌荧光素结合突变蛋白。

在其在诊断学中的用途外，在又一个方面，公开内容涵盖公开内容的绿脓菌荧光素结合突变蛋白或包含此类突变蛋白的组合物用于结合受试者中的绿脓菌荧光素(I、II或III型)和/或抑制或减轻受试者中的铜绿假单胞菌生长的用途。

在又一个方面中，本公开内容特征在于结合受试者中的绿脓菌荧光素(I、II或III型)的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的公开内容的一种或多种绿脓菌荧光素结合突变蛋白或包含此类突变蛋白的一种或多种组合物。

在又一个方面中，本公开内容牵涉用于抑制或减轻受试者中的铜绿假单胞菌的生长的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的公开内容的一种或多种绿脓菌荧光素结合突变蛋白或包含此类突变蛋白的一种或多种组合物。

c)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的hNGAL突变蛋白

在一个方面中，本公开内容涉及hNGAL突变蛋白，其以约20nM或更低，如1nM或更低的K_D结合与铁复合的绿脓菌螯铁蛋白，例如在基本上在实例6中描述的测定法中通过Biacore T200仪测量时。

在又一些别的实施方案中，本公开内容的一个或多个hNGAL突变蛋白能够以通过约500nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合具有复合铁的绿脓菌螯铁蛋白，例如在基本上在实例5中描述的ELISA测定法中测量时。

在又一些别的实施方案中，本公开内容的一个或多个hNGAL突变蛋白能够以通过约200nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合没有复合铁的绿脓菌螯铁蛋白，例如在基本上在实例5中描述的ELISA测定法中测量时。

在又一些别的实施方案中，本公开内容的一个或多个hNGAL突变蛋白能够以通过约200nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合具有和没有复合铁的绿脓菌螯铁蛋白，例如在基本上在实例5中描述的ELISA测定法中测量时。

在一些实施方案中，突变蛋白能够以约150nM或更低的IC₅₀值抑制由绿脓菌螯铁蛋白介导的铁摄取，例如在基本上在实例7中描述的竞争ELISA形式中。

在一些实施方案中，突变蛋白能够抑制Pvd I敲除(ΔpvdA)的细菌生长，例如在基本上在实例8中描述的测定法中。

在这点上，公开内容涉及多肽(例如如本文中提及的第四多肽)，其中所述多肽包含hNGAL突变蛋白或由hNGAL突变蛋白组成，并且所述hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含序列位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141处的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个突变氨基酸残基，并且其中所述多肽结合绿脓菌螯铁蛋白。

在一些实施方案中，公开内容的绿脓菌螯铁蛋白结合hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的序列位置36、40-41、49、52、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134中的任何一处或多处包含以下突变氨基酸残基中的一个或多个：Leu 36→His,Met或Val；Ala 40→Ile,Gln,Tyr或Phe；Ile 41→Leu,His或Trp；Gln49→His,Arg,Ser或Ala；Tyr 52→Leu,Trp或Pro；Ser 68→Asp或His；Leu70→Arg或Trp；Arg 72→His,Ile,Ala,Ser或Gly；Lys 73→Asn,Met,Pro,Phe,Gln或Arg；Asp 77→Arg,Thr,Pro或Asp；Trp 79→Ala,Arg,Lys或Asp；Arg 81→Thr,Ile或Trp；Asn 96→Met,Asn,Pro或Ala；Tyr 100→Gly,His或Glu；Leu 103→Gly,Met,His或Gln；Tyr 106→Met,Gly,Arg或Trp；Lys125→Trp,Phe,Gly或Leu；Ser 127→Arg,Trp,Asp或Ile；Tyr 132→Ala,Glu或Thr；和Lys 134→Leu,Val,Asn或Phe。在一些实施方案中，公开内容的hNGAL突变蛋白包含成熟hNGAL的这些序列位置处的两个或更多个，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚至更多或所有突变氨基酸残基。

另外，根据公开内容的绿脓菌螯铁蛋白结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比还可以包含一个或多个或所有下述取代：Gln 28→His；Val 34→Leu；Glu 44→Gly；Asp 45→Gly；Lys→Arg或Tyr；Asn65→Asp；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Val 108→Ala；Phe123→Ser和Thr 141→Ala。

在一些别的实施方案中，结合绿脓菌螯铁蛋白的公开内容的hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下氨基酸替换：

(a)Gln 28→His；Ala 40→Ile；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Leu；Ser 68→His；Leu 70→Thr；Arg 72→Lys；Lys 73→Trp；Asp 77→Ile；Trp 79→Ser；Arg 81→His；Cys 87→Ser；Asn 96→Met；Tyr 100→Asn；Leu 103→His；Tyr 106→Met；Lys 125→Trp；Ser 127→Asp；Tyr 132→Glu；Lys 134→Leu；

(b)Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→His；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；

(c)Gln 28→His；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；

(d)Gln 28→His；Leu 36→Val；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Ala；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Trp；Lys 73→Arg；Asp 77→Arg；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Pro；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gln；Tyr 106→Arg；Lys 125→Leu；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ala；Lys 134→Asn；

(e)Gln 28→His；Val 34→Leu；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；Thr 141→Ala；

(f)Gln 28→His；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；

(g)Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→Leu；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe；

(h)Gln 28→His；Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Glu 44→Gly；Lys 46→Tyr；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Lys 74→Glu；Asp 77→His；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Val 108→Ala；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr132→Ala；Lys 134→Phe；或

(i)Leu 36→His；Ala 40→Gln；Ile 41→Trp；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Gln 49→Arg；Tyr 52→Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Asp；Leu 70→Asp；Arg 72→Ala；Lys 73→Ile；Asp 77→Leu；Trp 79→Arg；Arg 81→Thr；Cys 87→Ser；Tyr 100→His；Leu 103→Gly；Tyr 106→Gly；Lys 125→Phe；Ser 127→Ile；Tyr 132→Ala；Lys 134→Phe。

在残留的区域(即与序列位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141不同的区域)中，公开内容的hNGAL突变蛋白可以包含在突变氨基酸序列位置外部的野生型(天然)氨基酸序列。

在别的具体的实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54-63或其片段或变体。

公开内容的绿脓菌螯铁蛋白结合hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与选自下组的序列可以具有高序列同一性，如至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％同一性，包括至少95％同一性：SEQ ID NO:54-63。

公开内容还包括具有选自下组的氨基酸序列的hNGAL突变蛋白的结构同源物：SEQID NO:54-63，所述结构同源物相对于所述hNGAL突变蛋白具有超过约60％，特别是超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过92％并且最特别地超过95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。

可以依靠人脂笼蛋白2的天然存在形式的诱变获得根据本公开内容的绿脓菌螯铁蛋白结合hNGAL突变蛋白。在诱变的一些实施方案中，取代(或替换)是保守取代。不过，涵盖任何取代(包括非保守取代或来自下述例示性取代的一个或多个)，只要突变蛋白保留其结合Pvd I型的能力，和/或它与然后取代的序列具有的同一性在于它与成熟人脂笼蛋白2的氨基酸序列(SWISS-PROT数据库登录号P80188)具有至少60％，如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的同一性。

d)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的突变蛋白的应用

因此，医学中存在公开内容的对绿脓菌螯铁蛋白具有结合亲和力的突变蛋白的许多可能的应用。在一个别的方面中，公开内容涉及本文中公开的此类突变蛋白用于检测样品中的绿脓菌螯铁蛋白的用途以及相应的诊断方法。

本公开内容还牵涉如描述的一种或多种对绿脓菌螯铁蛋白具有结合亲和力的突变蛋白用于与绿脓菌螯铁蛋白形成复合物的用途。

因此，在公开内容的另一个方面中，公开的突变蛋白用于检测绿脓菌螯铁蛋白。此类用途可以包括下述步骤：在合适的条件下使一种或多种所述突变蛋白与怀疑含有绿脓菌螯铁蛋白的样品接触，从而允许形成突变蛋白和绿脓菌螯铁蛋白之间的复合物，并且通过合适的信号检测复合物。

本文中公开的突变蛋白也可以用于分离绿脓菌螯铁蛋白。此类用途可以包括下述步骤：在合适的条件下使一种或多种所述突变蛋白与假设含有绿脓菌螯铁蛋白的样品接触，从而允许形成突变蛋白和绿脓菌螯铁蛋白之间的复合物，并且分开复合物与样品。

在公开的突变蛋白用于检测绿脓菌螯铁蛋白以及分开绿脓菌螯铁蛋白的用途中，可以在合适的固相上固定化突变蛋白和/或绿脓菌螯铁蛋白或其域或片段。

因而，可以测定分子，如绿脓菌螯铁蛋白的存在或缺乏(例如在样品中)以及其浓度或水平。

在又一个方面中，本公开内容特征在于诊断或分析试剂盒，其包含根据公开内容的对绿脓菌螯铁蛋白具有结合亲和力的突变蛋白。

在其在诊断学中的用途外，在又一个方面，公开内容涵盖公开内容的此类突变蛋白或包含此类突变蛋白的组合物用于结合受试者中的绿脓菌螯铁蛋白和/或抑制或减轻受试者中的铜绿假单胞菌生长的用途。

在又一个方面中，本公开内容特征在于结合受试者中的绿脓菌螯铁蛋白的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的公开内容的一种或多种对绿脓菌螯铁蛋白具有结合亲和力的突变蛋白或包含此类突变蛋白的一种或多种组合物。

在又一个方面中，本公开内容牵涉用于抑制或减轻受试者中的铜绿假单胞菌的生长的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的公开内容的一种或多种对绿脓菌螯铁蛋白具有结合亲和力的突变蛋白或包含此类突变蛋白的一种或多种组合物。

e)包含绿脓菌荧光素结合突变蛋白和/或绿脓菌螯铁蛋白结合突变蛋白的组合物和突变蛋白的组合

本公开内容涵盖(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的第一突变蛋白或其多肽，(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的第二突变蛋白或其多肽，(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的第三突变蛋白或其多肽和/或(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的第四突变蛋白或其多肽用于结合受试者中的绿脓菌荧光素I、II、III型和/或绿脓菌螯铁蛋白的用途。此类用途包括对受试者施用有效量的(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的第一突变蛋白或其多肽,(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的第二突变蛋白或其多肽,(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的第三突变蛋白或其多肽和/或(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的第四突变蛋白或其多肽的步骤。本公开内容还涵盖(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的第一突变蛋白或其多肽,(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的第二突变蛋白或其多肽,(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的第三突变蛋白或其多肽和/或(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的第四突变蛋白或其多肽用于在受试者中防止或降低铜绿假单胞菌经由绿脓菌螯铁蛋白和/或绿脓菌荧光素的铁摄取的用途。类似地，本公开内容公开了(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的第一突变蛋白或其多肽,(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的第二突变蛋白或其多肽,(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的第三突变蛋白或其多肽和/或(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的第四突变蛋白或其多肽用于治疗或减轻受试者中的铜绿假单胞菌感染和/或生物膜形成的用途。在一些别的实施方案中，铜绿假单胞菌感染可以是急性或慢性感染。

可以组合施用第一、第二、第三和/或第四突变蛋白或其多肽，包括同时、伴随或连续。在一些实施方案中，可以在可施用的组合物中包含第一、第二、第三和/或第四突变蛋白或其多肽。组合物可以包含与至少一种药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体联合的有效量的作为活性成分的第一、第二、第三和/或第四突变蛋白或其多肽。第一、第二、第三和/或第四突变蛋白或其多肽也可以彼此独立施用，包括在独立的时间点时以单独的时间间隔。

在一些实施方案中，如公开内容中使用的对绿脓菌荧光素(I、II或III型)特异性的突变蛋白能够例如以可检测的亲和力，即以约200nM或更低，或约100nM或更低，或约50nM或更低，或约25nM或更低，或约15nM或更低的解离常数结合绿脓菌荧光素(分别为I、II或III型)。在一些实施方案中，如公开内容中使用的对绿脓菌螯铁蛋白特异性的突变蛋白能够例如以可检测的亲和力，即以约200nM或更低，或约100nM或更低，或约50nM或更低，或约25nM或更低，或约15nM或更低的解离常数结合绿脓菌螯铁蛋白。在一些别的优选的实施方案中，根据公开内容的组合的突变蛋白以约10nM或更低，或约1nM或更低，或约0.1nM或更低，或约10pM或更低的对绿脓菌荧光素(分别为I、II或III型)或绿脓菌螯铁蛋白的解离常数分别结合绿脓菌荧光素(I、II或III型)或绿脓菌螯铁蛋白。因此，本公开内容提供了(i)结合绿脓菌荧光素I型(Pvd I s、sa、αKG+/-Fe)的hNGAL突变蛋白，(ii)结合绿脓菌荧光素II型(Pvd II s、sa、αKG+/-Fe)的hNGAL突变蛋白，(iii)结合绿脓菌荧光素III型(Pvd IIIs、sa、αKG+/-Fe)的hNGAL突变蛋白和/或(iv)结合绿脓菌螯铁蛋白(Pch+/-Fe)的hNGAL突变蛋白的组合。

关于结合绿脓菌荧光素的hNGAL突变蛋白的更多详情可以参见本公开的上述部分a)。

在一个具体的实施方案中，在SEQ ID NO:2-18中的任一项中显示了对绿脓菌荧光素I型特异性的突变蛋白。在一个具体的实施方案中，在SEQ ID NO:19-37中的任一项中显示了对绿脓菌荧光素II型特异性的突变蛋白。在一个具体的实施方案中，在SEQ ID NO:38-53中的任一项中显示了对绿脓菌荧光素III型特异性的突变蛋白。

结合绿脓菌螯铁蛋白的hNGAL突变蛋白的更多详情已经公开于本公开的上述部分c)中。

在一个具体的实施方案中，在SEQ ID NO:54-63中的任一项中显示了对绿脓菌螯铁蛋白特异性的突变蛋白。

本公开内容还涉及包含下列至少一种的组合物：(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的第一突变蛋白或其多肽，(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的第二突变蛋白或其多肽，(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的第三突变蛋白或其多肽和(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的第四突变蛋白或其多肽，所述组合物可以用于结合绿脓菌荧光素I、II、III型和/或绿脓菌螯铁蛋白的方法中。

本公开内容涉及第一突变蛋白或其多肽或组合物、第二突变蛋白或其多肽或组合物、第三突变蛋白或其多肽或组合物、和/或第四突变蛋白或其多肽或组合物的组合。这些突变蛋白之一能结合作为给定的非天然靶物的绿脓菌荧光素(I、II或III型)，例如以可检测的亲和力。这些突变蛋白之一能结合作为给定的非天然靶物的绿脓菌螯铁蛋白，例如以可检测的亲和力。因此，相应的突变蛋白分别结合作为给定的非天然靶物的绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白。术语“非天然靶物”指在生理学条件下不结合相应的脂笼蛋白(野生型hNGAL)的化合物。例如，第一突变蛋白或其多肽或组合物可以结合一类绿脓菌荧光素(I、II或III型)或绿脓菌螯铁蛋白，并且第二、第三或第四突变蛋白或其多肽或组合物可以分别结合绿脓菌螯铁蛋白或另一类绿脓菌荧光素，或者反之亦然。可以以各种形式和取向提供第一、第二、第三和/或第四突变蛋白或其多肽或组合物的组合。

在又一个方面中，本公开内容特征在于结合受试者中的绿脓菌荧光素I、II、III型和/或绿脓菌螯铁蛋白的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的包含下列至少一种的组合物：(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的突变蛋白或其多肽，(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的突变蛋白或其多肽，(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的突变蛋白或其多肽和(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的突变蛋白或其多肽。在一些实施方案中，此类组合物包含(i)-(iv)的两种或更多种，例如三种或甚至全部。

在又一个方面中，本公开内容牵涉用于抑制或减轻受试者中的铜绿假单胞菌的生长的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的包含下列至少一种的组合物：(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的突变蛋白或其多肽，(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的突变蛋白或其多肽，(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的突变蛋白或其多肽和(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的突变蛋白或其多肽。在一些实施方案中，此类组合物包含(i)-(iv)的两种或更多种，例如三种或甚至全部。

本公开内容还牵涉(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的第一突变蛋白或其多肽，(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的第二突变蛋白或其多肽，(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的第三突变蛋白或其多肽，和/或(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的第四突变蛋白或其多肽用于与绿脓菌荧光素I、II、III型和/或绿脓菌螯铁蛋白形成复合物的用途。

因此，在公开内容的另一个方面中，公开的突变蛋白或多肽可以用于检测绿脓菌荧光素和绿脓菌螯铁蛋白。此类用途可以包括下述步骤：在合适的条件下使一种或多种所述突变蛋白或多肽与怀疑含有绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白的样品接触，从而分别允许形成突变蛋白或多肽和绿脓菌荧光素之间和/或突变蛋白和绿脓菌螯铁蛋白之间的复合物，并且通过合适的信号检测复合物。

本文中公开的突变蛋白或多肽也可以用于分离绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白。此类用途可以包括下述步骤：在合适的条件下使一种或多种所述突变蛋白与假设含有绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白的样品接触，由此分别允许形成突变蛋白和绿脓菌荧光素之间和/或突变蛋白和绿脓菌螯铁蛋白之间的复合物，并且分开复合物与样品。

在公开的突变蛋白或多肽用于检测绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白以及分开绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白的用途中，可以在合适的固相上固定化突变蛋白和/或绿脓菌荧光素和绿脓菌螯铁蛋白或其域或片段。

因而，可以测定绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋的存在或缺乏(例如在样品中)以及其浓度或水平。

在另一个方面中，公开内容提供了多个部分的套组/试剂盒。试剂盒在一个或多个容器中分开或在混合物中包含对绿脓菌荧光素I型特异性的突变蛋白或多肽或其组合物、对绿脓菌荧光素II型特异性的突变蛋白或多肽或其组合物、对绿脓菌荧光素III型特异性的突变蛋白或多肽或其组合物、和/或对绿脓菌螯铁蛋白特异性的突变蛋白或多肽或其组合物。在一些别的优选的实施方案中，试剂盒包括包含对绿脓菌荧光素I型特异性的第一突变蛋白或多肽或其组合物的第一容器、包含对绿脓菌荧光素II型特异性的第二突变蛋白或多肽或其组合物的第二容器、包含对绿脓菌荧光素III型特异性的第三突变蛋白或多肽或其组合物的第三容器、和/或包含对绿脓菌螯铁蛋白特异性的第四突变蛋白或多肽或其组合物的第四容器。在一些实施方案中，试剂盒进一步以与其整合方式或作为一个或多个分开的文件包含属内容物或试剂盒和突变蛋白或其多肽的用途的信息。在一些实施方案中，试剂盒可以包含一种或多种组合物，所述组合物配制用于在稀释剂中重建。此类稀释剂(例如无菌稀释剂)也可以包含在试剂盒中，例如在容器内。

f)hNGAL突变蛋白及其变体和片段

当同与另一种脂笼蛋白的序列同一性比较时，根据公开内容的突变蛋白的氨基酸序列与人脂笼蛋白2具有高序列同一性(还可参见上文)。在此一般语境中，根据公开内容的组合的突变蛋白的氨基酸序列与相应的脂笼蛋白(野生型hNGAL)的氨基酸序列是至少基本上相似的。根据公开内容的组合的突变蛋白的相应序列与成熟的hNGAL的序列是基本上相似的，如与成熟的hNGAL的序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％同一性，包括至少95％同一性。在这点上，比较而言，公开内容的突变蛋白当然可以含有如本文中描述的取代，其使突变蛋白能够分别结合绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白。通常，相对于hNGAL的天然序列，hNGAL的突变蛋白在hNGAL的配体结合位点的开放末端处的四个环中包含一个或多个氨基酸突变。如上文解释，这些区域在确定突变蛋白对绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白的结合特异性方面是必需的。突变蛋白衍生的hNGAL或其同源物在N端区中和/或在β-桶结构末端排列的三个肽环BC、DE、和FG中的任何序列位置处可以具有1、2、3、4或更多个突变氨基酸残基，所述β-桶结构位于与天然结合袋相对。

与相应的天然hNGAL相比，根据公开内容的突变蛋白包含一个或多个，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或甚至20个取代，只要此类突变蛋白应当能够分别结合绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白。例如，突变蛋白可以在与hNGAL的独特位置对应的位置处(即在相应位置处)具有取代。在一些实施方案中，根据公开内容的组合的突变蛋白包含至少两个氨基酸取代，包括2、3、4、5、或甚至更多个由精氨酸残基对天然氨基酸的氨基酸取代。因而，以产生能够分别结合绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白的突变蛋白为目的，对如本文中描述的蛋白质“参照”支架的核酸进行诱变。

还有，本文中公开的突变蛋白可以包含在其N或C端，特别是在其C端的异源氨基酸序列，如例如II，而不影响突变蛋白的生物学活性(分别结合其靶物，例如绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白)。

具体地，为了确定与野生型hNGAL不同的突变蛋白的氨基酸序列的氨基酸残基是否对应于野生型hNGAL的氨基酸序列中的某个位置，熟练技术人员可以手动或通过使用计算机程序，如BLAST2.0(其代表基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool)或ClustalW或适合于产生序列比对的任何其它合适的程序使用本领域中公知的手段和方法，例如比对。因而，野生型hNGAL可以充当“主题序列”或“参照序列”，而与本文中描述的野生型hNGAL不同的突变蛋白的氨基酸序列充当“查询序列”。术语“参照序列”和“野生型序列”在本文中可互换使用。

在一些实施方案中，取代(或替换)是保守取代。不过，涵盖任何取代(包括非保守取代或来自下文列出的例示性取代的一个或多个)，只要突变蛋白保留其分别结合绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白的能力，和/或它与然后取代的序列具有的同一性在于它与“初始”序列是至少60％，如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％相同或更高。

保守取代一般是根据要突变的氨基酸列出的以下取代，所述氨基酸后面各有一个或多个可以认为保守的替换：Ala→Gly,Ser,Val；Arg→Lys；Asn→Gln,His；Asp→Glu；Cys→Ser；Gln→Asn；Glu→Asp；Gly→Ala；His→Arg,Asn,Gln；Ile→Leu,Val；Leu→Ile,Val；Lys→Arg,Gln,Glu；Met→Leu,Tyr,Ile；Phe→Met,Leu,Tyr；Ser→Thr；Thr→Ser；Trp→Tyr；Tyr→Trp,Phe；Val→Ile,Leu。其它取代也是可允许的，并且可以凭经验或者与其它已知的保守或非保守取代一致确定。作为进一步的方向，以下八组各含有通常可以认为为限定彼此的保守取代的氨基酸：

a.丙氨酸(Ala)，甘氨酸(Gly)；

b.天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)；

c.天冬酰胺(Asn)，谷氨酰胺(Gln)；

d.精氨酸(Arg)，赖氨酸(Lys)；

e.异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，甲硫氨酸(Met)，缬氨酸(Val)；

f.苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，色氨酸(Trp)；

g.丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)；和

h.半胱氨酸(Cys)，甲硫氨酸(Met)

若此类取代导致生物学活性的变化，则可以引入更多的实质性变化，如下列各项，或者如下文参照氨基酸类进一步描述的，并且对产物筛选期望的特征。此类更多的实质性变化的例子是：Ala→Leu,Ile；Arg→Gln；Asn→Asp,Lys,Arg,His；Asp→Asn；Cys→Ala；Gln→Glu；Glu→Gln；His→Lys；Ile→Met,Ala,Phe；Leu→Ala,Met,正亮氨酸；Lys→Asn；Met→Phe；Phe→Val,Ile,Ala；Trp→Phe；Tyr→Thr,Ser；Val→Met,Phe,Ala。

通过选择取代实现hNGAL的生物学特性的实质性修饰，所述取代在其对维持下列各项的影响上显著不同：(a)取代区域中的多肽主链的结构，例如如片层或螺旋构象，(b)靶位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在的残基分成组：(1)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；(2)中性亲水性：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；(3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；(4)碱性：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；(5)影响链取向的残基：甘氨酸、脯氨酸；和(6)芳香族：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。

非保守取代将引起用这些类之一的成员交换另一类。不参与维持hNGAL的正确构象的任何半胱氨酸残基一般也可以用丝氨酸取代以改善分子的氧化稳定性，并且防止异常交联。相反，可以添加半胱氨酸键以改善其稳定性。

可以使用建立的标准方法在核酸，例如DNA水平上非常容易地实现任何突变，包括如上文讨论的插入。氨基酸序列的变化的例示性例子是插入或缺失或氨基酸取代。此类取代可以是保守的，即氨基酸残基用化学相似特性(特别就极性及大小而言)的氨基酸残基替换。保守取代的例子是下组的成员间的替换：1)丙氨酸、丝氨酸、和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸。另一方面，也有可能在氨基酸序列中引入非保守变化。另外，代替替换单一氨基酸残基，也有可能插入或缺失hNGAL的一级结构的一个或多个连续氨基酸，只要这些缺失或插入导致稳定折叠的/功能性突变蛋白。

氨基酸序列的修饰包括单一氨基酸位置的定向诱变以通过掺入用于某些限制酶的切割位点来简化突变hNGAL基因或其部分的亚克隆。另外，也可以掺入这些突变以进一步改善突变蛋白对给定靶物，如绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白的亲和力。此外，可以引入突变以调控突变蛋白的某些特征，如改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶解度或者降低聚集趋势(若必要的话)。例如，可以将天然存在的半胱氨酸残基突变为其它氨基酸以防止二硫化物桥形成。还有可能有意突变其它氨基酸序列位置为半胱氨酸以引入新的反应性基团，例如用于与其它化合物，如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白质缀合，或者用于形成非天然存在的二硫化物连接。可以使用产生的硫醇模块来使突变蛋白PEG化或HES化，例如以延长相应的突变蛋白的血清半衰期。

还有可能突变其它氨基酸序列位置为半胱氨酸以引入新的反应性基团，例如用于与其它化合物，如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白质缀合，或者用于形成非天然存在的二硫化物连接。

在一些实施方案中，若将上述模块之一与公开内容的突变蛋白缀合，则与氨基酸侧链的缀合可以是有利的。合适的氨基酸侧链可以在hNGAL的氨基酸序列中天然发生或者可以通过诱变引入。若经由诱变引入合适的结合位点，则一种可能性是合适位置处的氨基酸被半胱氨酸残基替换。

就人脂笼蛋白2的突变蛋白而言，此类突变的例示性可能性将半胱氨酸残基引入脂笼蛋白，包括人脂笼蛋白2突变蛋白的氨基酸序列中以包括至少在与人NGAL的野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158对应的序列位置之一处引入半胱氨酸(Cys)残基。在一些实施方案中，其中本公开内容的人脂笼蛋白2突变蛋白具有与SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188的序列相比半胱氨酸已经被另一个氨基酸残基替换的序列，可以将相应的半胱氨酸再引入序列中。作为一个说明性的例子，可在此类情况中通过恢复为如最初存在于SWISS-PROT登录No P80188的序列中的半胱氨酸而引入氨基酸位置87处的半胱氨酸残基。可使用氨基酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146和/或158中任一个的侧面产生的硫醇模块来使突变蛋白PEG化或HES化，例如以延长相应的人脂笼蛋白2突变蛋白的血清半衰期。

在另一个实施方案中，为了提供适合于缀合上述化合物之一与根据本公开内容的突变蛋白的氨基酸侧链，可以通过诱变引入人工氨基酸。一般地，此类人工氨基酸设计为更具反应性，并且因此促进与期望的化合物的缀合。可以经由人工tRNA引入的此类人工氨基酸的一个例子是对-乙酰基-苯丙氨酸。

对于本文中公开的突变蛋白的几种应用，有利的是以融合蛋白形式使用它们。在一些实施方案中，将公开内容的突变蛋白在其N端或其C端与蛋白质、蛋白质域或肽，例如信号序列和/或亲和标签融合，如本文中与本发明的融合分子相关的描述。公开内容的突变蛋白也可以与延长突变蛋白的血清半衰期的模块缀合，如本文中与本发明的融合分子相关的描述。公开内容的突变蛋白也可以与药学活性剂缀合/融合，如本文中与本发明的融合分子相关的描述。

一般地，通常用于抗体的所有标记物(除了那些仅与免疫球蛋白的Fc部分的糖模块一起使用的标记物外)也可以用于与公开内容的突变蛋白缀合。公开内容的突变蛋白也可以与任何合适的治疗活性剂缀合，例如用于将此类药剂靶向递送到给定的细胞、组织或器官或者用于选择性靶向细胞，例如肿瘤细胞而不影响周围的正常细胞。此类治疗活性剂的例子包括放射性核素、毒素、小有机分子、和治疗肽(如充当细胞表面受体的激动剂/拮抗剂的肽或竞争给定细胞靶物上的蛋白质结合位点的肽)。然而，公开内容的突变蛋白也可以与治疗活性核酸，如反义核酸分子、小干扰RNA、微小RNA或核酶缀合。可以通过本领域中公知的方法生成此类缀合物。

另外，本文中公开的突变蛋白可以与模块融合，所述模块可以对公开内容的突变蛋白赋予新的特征，如酶促活性或对其它分子的结合亲和力。合适的融合配偶体的例子是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶、蛋白G的清蛋白结合域、蛋白A、抗体片段、寡聚化域或毒素。

特别地，可为可能的是将本文中公开的突变蛋白与分开的酶活性位点融合，使得所得的融合蛋白的两个“组分”一起作用于给定的治疗靶物。突变蛋白的结合域附接于致病性靶物，这允许酶域消除靶物的生物学功能。

在公开内容的一个实施方案中，方法包括使核酸分子在核苷酸三联体处进行诱变，所述核苷酸三联体编码与人NGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的序列位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145对应的序列位置的至少一个，或甚至更多个。

公开内容还包括编码公开内容的突变蛋白的核酸分子，其包含在实验诱变的指定序列位置外部的额外突变。此类突变经常是容许的或者可以证明是有利的，例如在它们促成突变蛋白的改善的折叠效率、血清稳定性、热稳定性或配体结合亲和力的情况下。

如本文中结合公开内容的突变蛋白使用的，术语“片段”指N端和/或C端缩短，即缺乏至少一个N端和/或C端氨基酸的源自全长成熟人脂笼蛋白2的蛋白质或肽。此类片段可以包括成熟人脂笼蛋白2的一级序列的至少10，更多，如20或30或更多个连续氨基酸，并且在成熟人脂笼蛋白2的免疫测定法中通常可检出。一般地，如本文中就公开内容的突变蛋白的相应蛋白质配体或根据公开内容的组合的相应蛋白质配体或本文中描述的融合蛋白的相应蛋白质配体而言使用的，术语“片段”指N端和/或C端缩短的蛋白质或肽配体，其保留全长配体被根据公开内容的突变蛋白识别和/或结合的能力。

如本文中使用的，术语“诱变”意指实验条件选择为使得成熟人脂笼蛋白2的给定序列位置处天然存在的氨基酸可以由至少一种不存在于相应天然多肽序列中的此特定位置处的氨基酸替换。术语“诱变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸所致的序列区段长度的(额外)修饰。因此，在公开内容的范围内的是例如选定序列位置处的一个氨基酸由三个随机突变的区段替换，导致与野生型蛋白质的相应区段的长度相比两个氨基酸残基的插入。可以在能进行公开内容中的诱变的任何肽区段中彼此独立引入此类插入或缺失。

术语“随机诱变”意指某个序列位置处不存在预先确定的单个氨基酸(突变)，而是可以在诱变期间在预先确定的序列位置处以某种概率掺入至少两个氨基酸。

“同一性”是测量序列的相似性或关系的序列特性。如本公开内容中使用的，术语“序列同一性”或“同一性”意指成对相同残基(公开内容的多肽的序列与所讨论的序列的(同源)比对后)相对于这两个序列中的较长者中的残基数目的百分比。通过用相同氨基酸残基的数目除以残基的总数，并且将结果乘以100测量序列同一性。

术语“同源性”在本文中以其通常的意义使用，包括相同氨基酸及在公开内容的多肽(例如公开内容的任何突变蛋白)的线性氨基酸序列中的等同位置处视为保守取代(例如用天冬氨酸残基替换谷氨酸残基)的氨基酸。

在本文中可以例如使用程序BLASTP，版本blastp 2.2.5(2002年11月16日；参见Altschul,S.F.等(1997)Nucl.Acids Res.25,3389-3402)测定序列同源性或序列同一性的百分比。在此实施方案中，同源性百分比基于比对整个多肽序列(矩阵：BLOSUM 62；缺口代价：11.1；截留值设置为10^-3)，包括前肽序列，优选在逐对比较中使用野生型蛋白质支架作为参照。它以BLASTP程序输出中作为结果指示的“正”(同源氨基酸)数目除以由比对程序选择的氨基酸总数的百分比计算。

具体地，为了确定与野生型人脂笼蛋白2不同的突变蛋白的氨基酸序列的氨基酸残基是否对应于野生型人脂笼蛋白2的氨基酸序列中的某个位置，熟练技术人员可以手动或通过使用计算机程序，如BLAST2.0(其代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW或适合于产生序列比对的任何其它合适的程序使用本领域中公知的手段和方法，例如比对。因而，野生型人脂笼蛋白2可以充当“主题序列”或“参照序列”，而与本文中描述的野生型人脂笼蛋白2不同的突变蛋白的氨基酸序列充当“查询序列”。术语“参照序列”和“野生型序列”在本文中可互换使用。

“缺口”是作为氨基酸添加或缺失的结果的比对中的空格。因此，完全相同的序列的两个拷贝具有100％同一性，但是不太高度保守，并且具有缺失、添加或替换的序列可以具有较低程度的序列同一性。本领域技术人员会认可几种计算机程序可用于使用标准参数测定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402)，Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215,403-410)和Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147,195-197)。

如本公开内容中使用的，术语“变体”指包含氨基酸序列的修饰(例如通过取代、缺失、插入或化学修饰)的蛋白质或肽的衍生物。在一些实施方案中，此类修饰不降低蛋白质或肽的功能性。此类变体包括蛋白质，其中一个或多个氨基酸已经通过其相应的D-立体异构体或通过除了天然存在的20种氨基酸外的氨基酸，如例如鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟赖氨酸、正缬氨酸替换。然而，此类取代也可以是保守的，即氨基酸残基用化学类似的氨基酸残基替换。保守取代的例子是下组的成员间的替换：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

“天然序列”人脂笼蛋白2意指与源自自然的相应多肽具有相同氨基酸序列的人脂笼蛋白2。因此，天然序列人脂笼蛋白2可以具有相应的天然存在的人脂笼蛋白2的氨基酸序列。此类天然序列多肽可以从自然界中分离或者可以通过重组或合成手段生成。术语“天然序列”多肽明确涵盖人脂笼蛋白2的天然存在的截短或分泌形式，人脂笼蛋白2的天然存在的变体形式，如可替换的剪接形式和天然存在的等位变体。多肽“变体”意指与天然序列多肽具有至少约50％、60％、70％、80％或至少约85％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如下述多肽，其中在多肽的N或C端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。一般地，变体与天然序列多肽具有至少约70％，包括至少约80％，如至少约85％氨基酸序列同一性，包括至少约90％氨基酸序列同一性或至少约95％氨基酸序列同一性。

术语“位置”在根据公开内容使用时意指本文中描述的氨基酸序列内的氨基酸的位置或本文中描述的核酸序列内的核苷酸的位置。为了理解如本文中在一种或多种突变蛋白的氨基酸序列位置的上下文中使用的术语“对应”，对应位置不仅由前述核苷酸/氨基酸的编号确定。因而，可以取代的根据公开内容的给定氨基酸的位置可以由于(突变体或野生型)人脂笼蛋白2中别处的氨基酸缺失或添加而有所变化。类似地，可以取代的根据公开内容的给定核苷酸的位置可以由于突变蛋白或野生型人脂笼蛋白2 5’-非翻译区(UTR)中别处的缺失或额外的核苷酸而有所变化，所述5’-非翻译区(UTR)包括启动子和/或任何其它调节序列或基因(包括外显子和内含子)。

因此，对于根据公开内容的相应位置，优选地应当理解核苷酸/氨基酸的位置可以在指定的编号上不同于类似的相邻核苷酸/氨基酸，但是一个或多个相应的位置也包括所述相邻的核苷酸/氨基酸(其可以被交换、缺失或添加)。

另外，对于基于根据公开内容的参照支架的突变蛋白中的相应位置，优选理解的是核苷酸/氨基酸的位置在结构上对应于突变蛋白或野生型人脂笼蛋白2中别处的位置，即使它们可以在指示的编号上不同。

g)涉及hNGAL突变蛋白和包含它们的多肽(例如用于本发明的融合分子)的具体实施方案

1.一种对绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白具有结合特异性的多肽，其中所述多肽包含例如以可检测的亲和力结合绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白的hNGAL突变蛋白。

2.实施方案1的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白包含成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145对应的一个或多个位置处的突变氨基酸残基。

3.实施方案1的多肽，其中所述突变蛋白能够以约20nM或更低的K_D结合与铁复合的绿脓菌荧光素I型，例如在基本上在实例6中描述的测定法中通过Biacore T200仪测量时。

4.实施方案1的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够以通过约200nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合具有和没有复合铁的Pvd I型琥珀酰基、Pvd I型琥珀酸酰胺基和Pvd I型α-酮戊二酰基，例如在基本上在实例5中描述的ELISA测定法中测量时。

5.实施方案3的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够在基本上在实例7中描述的竞争ELISA形式中以约150nM或更低的IC₅₀值抑制由绿脓菌荧光素I型介导的铁摄取。

6.实施方案3的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够在基本上在实例8中描述的测定法中抑制Pvd I菌株的细菌生长。

7.根据前述实施方案3至6中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白在与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136对应的一个或多个位置处包含突变氨基酸残基。

8.实施方案3-7中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下突变氨基酸残基中的至少一个：Leu 36→Asn,Thr,Val,Trp或Phe；Ala 40→Gly,Asn,Thr或Phe；Ile 41→Arg,Ala,Thr,Phe或Trp；Gln 49→Ile,Leu,Val,Ala或Pro；Tyr 52→Met,Trp或Pro；Ser 68→Asp,Val或Glu；Leu 70→Gln,Trp,Asp或Thr；Arg72→Trp,Ala,Ser,Leu,Pro或Glu；Lys 73→Asp,Leu,Ala,Glu或Asn；Asp77→Arg,Leu,Tyr,Ser,Gln,Thr,Ile或Asn；Trp 79→Gln,Asp,Ser,Arg,Met或Glu；Arg 81→Gln,Gly,Ile,Glu,His或Asp；Asn 96→His,Ile,Gly,Tyr或Asp；Tyr 100→Lys,Glu,Asn,Ser,Phe或Tyr；Leu 103→Lys,Pro,Gln,His,Asp,Tyr,Glu,Trp或Asn；Tyr 106→His,Gln或Phe；Lys 125→Arg,Ser,Trp,Tyr,Val或Gly；Ser 127→Trp,Asn,Ala,Thr,Tyr,His,Ile,Val或Asp；Tyr 132→Trp,Asn,Gly或Lys；和Lys 134→Asn,His,Trp,Gly,Gln或Asp。

9.实施方案3-8中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下取代：Gln 28→His；Lys46→Glu；Thr 54→Val或Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Asn 65→Asp或Gln；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser或Asn；和Thr 136→Ala。

10.根据前述实施方案3-8中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白在成熟人NGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的序列位置28、36、39-41、46、49、52、54-55、59、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、125、127、132、134和136处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个突变氨基酸残基。

11.根据前述实施方案3-10中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含氨基酸取代的以下组之一：

(m)Gln 28→His；Ala 40→Gly；Ile 41→Trp；Lys 46→Glu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Met；Thr 54→Ala；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Ser 68→Val；Leu 70→Asp；Arg 72→Glu；Lys 73→Leu；Lys 74→Glu；Lys 75→Glu；Asp 77→Arg；Trp 79→Met；Ile 80→Thr；Arg 81→Glu；Ser 87→Asn；Asn 96→Asp；Tyr 100→sER；Leu 103→Trp；Tyr 106→Gln；Lys125→Gly；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Trp；Lys 134→His；

12.根据实施方案3-11中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2-18或其片段或变体。

13.实施方案1的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够以约20nM或更低的K_D结合与铁复合的绿脓菌荧光素II型，例如在基本上在实例6中描述的测定法中通过Biacore T200仪测量时。

14.实施方案1的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够以通过约200nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合具有和没有复合铁的Pvd II型琥珀酰基、Pvd II型琥珀酸酰胺基和Pvd II型α-酮戊二酰基，例如在基本上在实例5中描述的ELISA测定法中测量时。

15.实施方案13的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够在基本上在实例7中描述的竞争ELISA形式中以约150nM或更低的IC₅₀值抑制由绿脓菌荧光素II型介导的铁摄取。

16.实施方案13的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够在基本上在实例8中描述的测定法中抑制Pvd II菌株的细菌生长。

17.实施方案13的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够在基本上在实例9中描述的测定法中抑制表达绿脓菌荧光素II型的铜绿假单胞菌菌株的生长。

18.根据前述实施方案13至17中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白在与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134对应的一个或多个位置处包含突变氨基酸残基。

19.实施方案13-18中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下突变氨基酸残基中的至少一个：Leu 36→Asn,Ile或Val；Ala 40→Glu,Gly,Asn,Thr或His；Ile41→Arg,Val或Thr；Gln 49→Gly,Ala或Pro；Tyr 52→Asn,Gly,Trp或Pro；Ser 68→Asp,Arg或Glu；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His,Ile,Ala,Ser或Gly；Lys 73→Asn,Met,Pro,Phe,Gln或Arg；Asp 77→His,Ile,Met,Lys,Gly或Asn；Trp 79→Ser,Tyr,Ala,Asp,Phe或Trp；Arg 81→Glu,Ser,Tyr或Asp；Asn 96→Met,Ile,Arg,Asp,Lys,Asn或Ala；Tyr 100→Lys,Glu,Asn,Ser,Phe或Tyr；Leu 103→Thr,Ile,Gln,Gly,Met,His,Trp或Val；Tyr 106→Met,Gln,Ala,Ile,Asn,Gly,Met或Phe；Lys 125→Ala,Ile或Asn；Ser 127→Lys,Arg,Ser,Met,Asp或Asn；Tyr 132→Met,Phe,Asn,Ala,Ile,Gly或Val；和Lys134→Trp或Tyr。

20.实施方案13-19中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下取代：Gln 28→His；Thr 54→Ala；Asn 65→Asp或Gln和Cys 87→Ser。

21.根据前述实施方案13-20中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白在成熟人NGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的序列位置28、36、40-41、49、52、54、65、68、70、72-75、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个突变氨基酸残基。

22.根据前述实施方案13-21中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白与天然野生型hNGAL的线性多肽序列相比包含氨基酸取代的以下组之一：

(s)Leu 36→Val；Ala 40→Thr；Ile 41→Ile；Gln 49→Gly；Tyr 52→Asn；Thr 54→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Asp；Leu 70→Arg；Arg 72→Ile；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Tyr；Arg 81→Asp；Cys 87→Ser；Leu 103→Thr；Tyr 106→Gln；Lys 125→Ile；Ser 127→Arg；Tyr 132→Ile；Lys 134→Trp。

23.根据实施方案13至22中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:19-37或其片段或变体。

24.实施方案1的多肽，其中所述突变蛋白能够以约20nM或更低的K_D结合与铁复合的绿脓菌荧光素III型，例如在基本上在实例6中描述的测定法中通过Biacore T200仪测量时。

25.实施方案1的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够以通过约200nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合具有和没有复合铁的Pvd III型琥珀酰基、Pvd III型琥珀酸酰胺基和Pvd III型α-酮戊二酰基，例如在基本上在实例5中描述的测定法中测量时。

26.实施方案24的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够在基本上在实例7中描述的竞争ELISA形式中以约150nM或更低的IC₅₀值抑制由绿脓菌荧光素III型介导的铁摄取。

27.实施方案24的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够在基本上在实例8中描述的测定法中抑制Pvd III菌株的细菌生长。

28.根据前述实施方案24至27中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白在与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置28、36、40-42、45-47、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、105-106、125、127、132、134和145对应的一个或多个位置处包含突变氨基酸残基。

29.实施方案24-28中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下突变氨基酸残基中的至少一个：Leu 36→Phe或Glu；Ala 40→Trp,Leu或Arg；Ile 41→Met,Arg,Ala,Leu或Trp；Gln 49→His,Ile,Arg,Lys,Met或Pro；Tyr 52→Asn,Tyr,Arg,Ser或Met；Ser 68→Asp,Asn,Glu或Gln；Leu 70→Lys,Asn或Arg；Arg72→Leu,Arg,Gln或Tyr；Lys 73→His,Leu,Ala,Pro,Gln或Tyr；Asp 77→Ala,Ile,Lys,Gln或Arg；Trp 79→Ser或Asp；Arg 81→His,Ala,Ser或Val；Asn 96→Met,Ile,Arg,Gly,Leu或Val；Tyr 100→Ala,Ile,Asn,Pro或Asp；Leu 103→Gln,Gly,Phe或Pro；Tyr 106→Glu；Lys 125→Trp或Thr；Ser 127→Val,His,Ile,Phe或Ala；Tyr 132→Phe；和Lys 134→Trp,Gln或Glu。

30.实施方案24-29中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下取代：Gln 28→His；Leu 42→Arg；Asp 45→Gly；Lys 46→Arg；Asp 47→Asn；Asn 65→Asp；Cys 87→Ser；Ser 105→Pro和Thr 145→Pro。

31.根据前述实施方案24-30中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白在成熟人NGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的序列位置28，36，40-42，45-47，49，52，65，68，70，72-73，77，79，81，87，96，100，103，105-106，125，127，132，134和145处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个突变氨基酸残基。

32.根据前述实施方案24-31中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含氨基酸取代的以下组之一：

(i)Gln 28→His；Leu 36→Glu；Ala 40→Leu；Ile 41→Ala；Gln 49→Lys；Tyr 52→Met；Ser 68→Glu；Leu 70→Arg；Lys 73→Tyr；Asp 77→Gln；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→-；Tyr 100→Glu；Leu103→Gln；Tyr 106→Glu；Ser 127→Val；Tyr 132→Phe；Lys 134→Trp；

33.根据前述实施方案24至32中任一项的多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:38-53或其片段或变体。

34.实施方案1的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够以约20nM或更低的K_D结合与铁复合的绿脓菌螯铁蛋白，例如在基本上在实例6中描述的测定法中通过Biacore T200仪测量时。

35.实施方案1的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够以通过约500nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合具有复合铁的绿脓菌螯铁蛋白，例如在基本上在实例5中描述的测定法中测量时。

36.实施方案1的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够以通过约200nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合没有复合铁的绿脓菌螯铁蛋白，例如在基本上在实例5中描述的测定法中测量时。

37.实施方案1的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够以通过约200nM或更低的IC₅₀值测量的亲和力结合具有和没有复合铁的绿脓菌螯铁蛋白，例如在基本上在实例5中描述的测定法中测量时。

38.实施方案34的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够在基本上在实例7中描述的竞争ELISA形式中以约150nM或更低的IC₅₀值抑制由绿脓菌螯铁蛋白介导的铁摄取。

39.实施方案34的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白能够在基本上在实例8中描述的测定法中抑制Pvd I敲除(ΔpvdA)的细菌生长。

40.根据前述实施方案34至39中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141对应的一个或多个位置处包含突变氨基酸残基。

41.实施方案34-40中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下突变氨基酸残基中的至少一个：Leu 36→His,Met或Val；Ala 40→Ile,Gln,Tyr或Phe；Ile 41→Leu,His或Trp；Gln 49→His,Arg,Ser或Ala；Tyr 52→Leu,Trp或Pro；Ser 68→Asp或His；Leu 70→Arg或Trp；Arg 72→His,Ile,Ala,Ser或Gly；Lys 73→Asn,Met,Pro,Phe,Gln或Arg；Asp 77→Arg,Thr,Pro或Asp；Trp 79→Ala,Arg,Lys或Asp；Arg 81→Thr,Ile或Trp；Asn 96→Met,Asn,Pro或Ala；Tyr100→Gly,His或Glu；Leu 103→Gly,Met,His或Gln；Tyr 106→Met,Gly,Arg或Trp；Lys 125→Trp,Phe,Gly或Leu；Ser 127→Arg,Trp,Asp或Ile；Tyr132→Ala,Glu或Thr；和Lys 134→Leu,Val,Asn或Phe。

42.实施方案34-41中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含以下取代：Gln 28→His；Val 34→Leu；Glu 44→Gly；Asp 45→Gly；Lys→Arg或Tyr；Asn 65→Asp；Ile 80→Thr；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Val 108→Ala；Phe 123→Ser和Thr 141→Ala。

43.根据前述实施方案34-42中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白在成熟人NGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的序列位置28、34、36、40-41、44-46、49、52、54、65、68、70、72-74、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134和141处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个突变氨基酸残基。

44.根据前述实施方案34-43中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比包含氨基酸取代的以下组之一：

(e)Gln 28→His；Val34→Leu；Leu 36→Met；Ala 40→Phe；Ile 41→His；Gln 49→Ser；Tyr 52→Pro；Ser 68→His；Leu 70→Pro；Arg 72→Trp；Lys 73→Ala；Asp 77→Ala；Trp 79→Lys；Ile 80→Thr；Arg 81→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Ala；Tyr 100→Gly；Leu 103→Met；Tyr 106→Trp；Phe 123→Ser；Lys 125→Gly；Ser 127→Trp；Tyr 132→Thru；Lys 134→Val；Thr 141→Ala；

45.根据前述实施方案34至44中任一项的多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54-63或其片段或变体。

46.根据实施方案1的多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2-63或其片段或变体。

47.实施方案1-46中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白包含取代野生型hNGAL的一个或多个氨基酸的一个或多个非天然半胱氨酸残基。

48.实施方案1-46中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白包含天然半胱氨酸残基被另一种氨基酸的至少一个氨基酸取代。

49.实施方案48的多肽，其中所述另一种氨基酸是丝氨酸残基。

50.实施方案1-46中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白与选自下组的化合物缀合：有机分子、酶标记物、放射性标记物、有色标记物、荧光标记物、生色标记物、发光标记物、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、细胞抑制剂、毒素、金属复合物、金属、和胶体金。

51.实施方案1-46中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白在其N端和/或其C端与融合配偶体融合，所述融合配偶体是蛋白质、或蛋白质域或肽。

52.实施方案1-46中任一项的多肽，其中所述hNGAL突变蛋白与延长多肽的血清半衰期的化合物缀合。

53.实施方案52的多肽，其中所述延长血清半衰期的化合物选自下组：聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3域、免疫球蛋白的CH4域、清蛋白结合肽、和清蛋白结合蛋白。

54.实施方案53的多肽，其中所述聚亚烷基二醇分子是聚乙二醇(PEG)或其活化衍生物。

55.一种核酸分子，其包含编码实施方案1-54中任一项的多肽的核苷酸序列。

56.实施方案55的核酸分子，其中所述核酸分子与调节序列可操作连接以允许所述核酸分子的表达。

57.实施方案55或56的核酸分子，其中所述核酸分子被包含在载体中或在噬菌粒载体中。

58.一种宿主细胞，其包含实施方案55至57中任一项的核酸分子。

59.一种生成根据实施方案1-54中任一项的多肽的方法，其中依靠遗传工程方法，从编码所述多肽的核酸开始生成所述多肽。

60.实施方案59的方法，其中在细菌或真核宿主生物体中生成所述多肽，并且从此宿主生物体或其培养物分离。

61.一种组合物，其包含选自下组的一种或多种多肽：(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的多肽，(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的多肽，(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的多肽和(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的多肽。

62.实施方案61的组合物，其包含两种或更多种选自下组的多肽：(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的多肽，(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的多肽，(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的多肽和(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的多肽。

63.实施方案62的组合物，其包含三种或四种选自下组的多肽：(i)对绿脓菌荧光素I型特异性的多肽，(ii)对绿脓菌荧光素II型特异性的多肽，(iii)对绿脓菌荧光素III型特异性的多肽和(iv)对绿脓菌螯铁蛋白特异性的多肽。

64.实施方案61-63中任一项的组合物，其中所述对绿脓菌荧光素I型特异性的多肽是根据实施方案3-11中任一项的多肽。

65.实施方案61-63中任一项的组合物，其中所述对绿脓菌荧光素II型特异性的多肽是根据实施方案12-21中任一项的多肽。

66.实施方案61-63中任一项的组合物，其中所述对绿脓菌荧光素III型特异性的多肽是根据实施方案22-30中任一项的多肽。

67.实施方案61-63中任一项的组合物，其中所述对绿脓菌螯铁蛋白特异性的多肽是根据实施方案31-41中任一项的多肽。

68.实施方案61-67中任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体。

69.一种结合受试者中的绿脓菌荧光素I、II、III型和/或绿脓菌螯铁蛋白的方法，其包括对所述受试者施用有效量的实施方案61-67中任一项的组合物。

70.一种用于抑制或减轻受试者中的铜绿假单胞菌生长的方法，其包括对所述受试者施用有效量的实施方案61-67中任一项的组合物。

71.一种试剂盒，其在一个或多个容器中分开或混合包含实施方案61-67中任一项的组合物。

72.(i)根据实施方案3-11中任一项的第一多肽，(ii)根据实施方案12-21中任一项的第二多肽，(iii)根据实施方案22-30中任一项的第三多肽和/或(iv)根据实施方案31-41中任一项的第四多肽用于结合受试者中的绿脓菌荧光素I、II、III型和/或绿脓菌螯铁蛋白的用途。

73.(i)根据实施方案3-12中任一项的第一多肽，(ii)根据实施方案13-23中任一项的第二多肽，(iii)根据实施方案24-33中任一项的第三多肽和/或(iv)根据实施方案34-45中任一项的第四多肽用于在受试者中防止或降低铜绿假单胞菌经由绿脓菌螯铁蛋白和/或绿脓菌荧光素的铁摄取的用途。

74.(i)根据实施方案3-12中任一项的第一多肽，(ii)根据实施方案13-23中任一项的第二多肽，(iii)根据实施方案24-33中任一项的第三多肽和/或(iv)根据实施方案34-45中任一项的第四多肽用于治疗或减轻受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染的用途。

75.实施方案74的用途，其中所述铜绿假单胞菌生物膜感染是急性或慢性感染。

76.实施方案72-75的用途，其中组合施用所述第一、第二、第三和/或第四多肽，包括同时、伴随或连续。

77.实施方案72-75的用途，其中所述第一、第二、第三和/或第四多肽彼此独立施用，包括在独立的时间点时以单独的时间间隔。

78.(i)根据实施方案3-11中任一项的多肽，(ii)根据实施方案12-21中任一项的多肽，(iii)根据实施方案22-30中任一项的多肽和/或(iv)根据实施方案31-41中任一项的多肽的组合。

C.核酸分子

本发明还涉及核酸分子(DNA和RNA)，其包含编码本发明的融合分子的核苷酸序列。由于遗传密码的简并性允许某些密码子被规定相同氨基酸的另一个密码子的取代，本发明不限于编码如本文中描述的融合分子的具体核酸分子，而是涵盖包含编码功能性融合分子的核苷酸序列的所有核酸分子。

本申请中公开的核酸分子可以与一种或多种调节序列“可操作连接”以容许此核酸分子的表达。

若核酸分子包含含有关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件，并且此类序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作连接”，则它(如DNA)称为“能够表达核酸分子”或能够“容许表达核苷酸序列”。可操作连接是调节序列元件和要表达的序列以实现基因表达的方式相连的连接。对于基因表达必需的调节区的精确性质可以在物种间变化，但是一般地，这些区域包含启动子，其在原核生物中含有启动子本身(即指导转录的启动的DNA元件)以及在转录成RNA时会对翻译启动发信号的DNA元件两者。此类启动子区通常包含参与转录和翻译启动的5’非编码序列，如原核生物中的-35/-10框和Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA框、CAAT序列和5’加帽元件。这些区域还可以包含增强子或阻抑物元件以及翻译的信号和前导序列，用于将天然多肽靶向到宿主细胞的特定区室。

在一些实施方案中，本申请中公开的核酸分子，如DNA可以与公开内容的另一种核酸分子“可操作连接”以允许公开内容的融合蛋白的表达。在这点上，可操作连接是第一核酸分子的序列元件和第二核酸分子的序列元件以使融合蛋白能够作为单一多肽表达的方式相连的连接。

另外，3’非编码序列可以含有参与转录终止、多聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞中没有令人满意的功能，那么它们可以用在所述细胞中功能性的信号取代。

因此，本发明的核酸分子可以包含调节序列，如启动子序列。在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子是例如tet启动子、lacUV5启动子或T7启动子。可用于在原核细胞中表达的启动子的例子是SV40启动子或CMV启动子。

在一个实施方案中，核酸分子被包含在载体中。如本文中使用，术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体，粘粒载体，噬菌体载体，如λ噬菌体，噬菌粒或质粒，病毒载体，如腺病毒或杆状病毒，或人工染色体载体，如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、或P1人工染色体(PAC)。所述载体包含表达以及克隆载体。表达载体包含质粒及病毒载体，并且一般含有期望的编码序列和对于可操作连接的编码序列在特定宿主生物体(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中或在体外表达系统中的表达必需的合适的DNA序列。克隆载体一般用于工程化改造并扩增某个期望的DNA片段，并且可以缺乏期望的DNA片段的表达所需的功能序列。大量的合适的表达和克隆载体是本领域中已知的，并且是商业上可得到的。

在一个实施方案中，质粒中包含核酸分子。质粒载体意指编码与感兴趣cDNA融合的Temperent噬菌体(如M13或f1)的基因间区域，或其功能性部分的载体。在用此类噬菌粒载体和合适的辅助噬菌体(例如M13K07、VCS-M13或R408)二重感染细菌宿主细胞后，生成完整的噬菌体颗粒，从而实现编码的异源cDNA与其在噬菌体表面上展示的相应多肽的物理偶联(参见例如Lowman,H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401-424，或Rodi,

D.J.,and Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87-93)。

可以将编码如本文中描述的融合分子的DNA分子，和特别是含有此类融合分子的编码序列的载体转化或转染到能够表达基因的宿主细胞中。可以使用标准技术进行转化或转染。如此，本发明还涉及含有如本文中公开的核酸分子的宿主细胞。

在一个实施方案中，术语“细胞”或“宿主细胞”指完整的细胞，即尚未释放其正常胞内组分，如酶、细胞器或遗传物质的具有完整膜的细胞。在一个实施方案中，完整的细胞是活细胞，即能够实施其正常代谢功能的活细胞。在一个实施方案中，根据本发明，所述术语指可以用外源核酸转染或转化的任何细胞。在一个实施方案中，在用外源核酸转染或转化并且转移到接受者时的细胞能在接受者中表达核酸。术语“细胞”包括原核细胞，如细菌细胞，和真核细胞，如酵母细胞，真菌细胞或哺乳动物细胞。合适的细菌细胞包括来自革兰氏阴性细菌菌株，如大肠杆菌(Escherichia coli)，变形菌属(Proteus)，和假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株，和革兰氏阳性细菌菌株，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，链霉菌属(Streptomyces)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，和乳球菌属(Lactococcus)的菌株的细胞。合适的真菌细胞包括来自木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)、和曲霉属(Aspergillus)物种的细胞。合适的酵母细胞包括来自酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))、和汉逊酵母属(Hansenula)物种的细胞。合适的哺乳动物细胞包括原代哺乳动物细胞或永生化哺乳动物细胞系，如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、293HEK等。然而，也可以使用两栖动物细胞、昆虫细胞(例如SF9或High5)、植物细胞、和本领域中用于表达异源蛋白质的任何其它细胞。

本发明还涉及用于生成如本文中描述的融合分子的方法，其中依靠遗传工程方法从编码融合分子的核酸开始生成融合蛋白。该方法可以在体内实施，融合分子可以例如在细菌或真核宿主生物体/细胞中生成，然后从此宿主生物体/细胞或其培养物中分离。也可以在体外生成蛋白质，例如通过使用体外翻译系统。

在体内生成融合分子时，依靠重组DNA技术(如上文已经概述)将编码此类融合分子的核酸导入合适的细菌或真核宿主生物体/细胞中。为此目的，首先使用建立的标准方法用包含编码如本文中描述的融合分子的核酸分子的克隆载体转化宿主细胞。然后，在容许异源DNA表达和如此合成相应多肽的条件下培养宿主细胞。随后，从细胞中或从培养基中回收多肽。

在一些实施方案中，可以在融合分子中使用的hNGAL突变蛋白中除去Cys 76和Cys175之间的天然存在的二硫键。因而，可以在具有还原性氧化还原环境的细胞区室中，例如在革兰氏阴性菌的细胞质中生成此类突变蛋白。

若本发明的融合分子包含分子内二硫键，则可优选使用合适的信号序列将新生多肽引导到具有氧化性氧化还原环境的细胞区室中。此类氧化性环境可以由革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)的周质，在革兰氏阳性细菌的胞外环境中或者在真核细胞的内质网的腔室中提供，并且通常有利于结构性二硫键的形成。

然而，也可以在宿主细胞(特别是大肠杆菌)的胞质溶胶中生成本发明的融合分子。在此情况中，融合分子可以直接以可溶且折叠的状态获得或者以包含体形式回收，接着在体外复性。进一步的选项是使用具有氧化性胞内环境的特定宿主菌株，其如此可以容许在胞质溶胶中形成二硫键(Venturi等(2002)J.Mol.Biol.315,1-8.)。

然而，如本文中描述的融合分子可以不一定仅通过使用遗传工程生成或产生。确切而言，也可以通过化学合成(如Merrifield固相多肽合成)或者通过体外转录和翻译获得此类融合分子。用于蛋白质的固相和/或溶液相合成的方法是本领域中公知的(参见例如Bruckdorfer,T.等(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5,29-43)，并且用于体外转录/翻译的方法也是这样。还可能的是，使用分子建模鉴定有希望的突变，然后在体外合成想要的(设计的)多肽，并且调查对绿脓菌荧光素I、II、III型或绿脓菌螯铁蛋白的结合活性。用于蛋白质的固相和/或溶液相合成的方法是本领域中公知的(参见例如Bruckdorfer,T.等(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5,29-43)。

熟练技术人员会领会可用于制备融合分子的方法，所述融合分子由本发明涵盖，但是其蛋白质或核酸序列在本文中没有明确公开。作为一个概述，氨基酸序列的此类修饰包括例如单个氨基酸位置的定向诱变以通过掺入某些限制酶的切割位点来简化hNGAL突变蛋白基因或其部分的亚克隆。另外，也可以掺入这些突变以进一步改善突变蛋白对给定靶物(如分别为绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白)的亲和力。此外，可以引入突变以调控突变蛋白和融合分子的某些特征，从而改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶解度或降低聚集趋势(若必要的话)。例如，可将天然存在的半胱氨酸残基突变成其它氨基酸以阻止二硫化物桥形成。

本公开内容还涉及核酸分子，其包含编码本文中公开的突变蛋白的核苷酸序列。在这点上，本公开内容提供了编码公开内容的一些突变蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO:65-126中显示。由于遗传密码子的简并性允许某些密码子被规定相同氨基酸的其它密码子的取代，公开内容不限于编码如本文中描述的突变蛋白的具体核酸分子，而是涵盖包含编码功能性突变蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。公开内容进一步涵盖含有所述核酸分子的宿主细胞。涉及结合本发明的融合分子公开的核酸分子和(宿主)细胞的所有方面和实施方案也适用于单一突变蛋白及其组合。这适用于其生成方法。

D.组合物和试剂盒

在别的方面中，本发明涉及药物组合物，其包含如本文中限定的融合分子、如本文中限定的核酸分子、或如本文中限定的细胞。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物是无菌的和/或含有有效量的本文中描述的融合分子、核酸分子或细胞以产生期望的反应或期望的效果。

如遍及本说明书使用的，术语“有效量”指足以实现有益或期望的结果的量，其中可以在一次或多次施用中施用有效量。在治疗特定疾病或特定状况的情况下，有益或期望的结果特别涉及抑制疾病的过程。这包括减缓疾病的进展，并且特别是中断或反转疾病的进展。治疗疾病或状况中的有益或期望的结果也可以是所述疾病或所述状况的发作延迟或发作预防。本文中描述的药剂或组合物的有效量会取决于要治疗的病况、疾病的严重性、受试者的个体参数，包括年龄、生理学状况、体格和重量、治疗的持续时间、伴随疗法(若存在的话)的类型、特定的施用路径和类似的因素。因而，本文中描述的药剂的施用剂量可以取决于各种此类参数。在受试者中的反应用初始剂量不足的情况下，可以使用更高的剂量(或者通过不同的更局部化的施用路径实现的有效更高的剂量)。

药物组合物通常以一致的剂量形式提供，并且可以以本身已知的方式制备。例如，药物组合物可以为溶液或悬浮液的形式。

药物组合物可以进一步包含一种或多种载体和/或赋形剂，在具体的实施方案中，它们全部是药学可接受的。如本文中使用，术语“药学可接受”指材料的无毒性，在具体的实施方案中，所述材料不与药物组合物的活性剂的作用相互作用。

术语“载体”指组合活性成分以促进、增强或实现应用的天然或合成性质的有机或无机组分。根据本发明，术语“载体”还包括一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，其适合于对受试者施用。

适合于胃肠外施用的药物组合物通常包含活性化合物的无菌水性或非水性制剂，其在一个具体的实施方案中与接受者的血液等张。用于胃肠外施用的相容载体/溶剂/稀释剂的例子是例如无菌水、林格(Ringer)溶液、林格乳酸盐、等张氯化钠溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘和特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。另外，通常使用无菌不挥发性油作为溶液或悬浮介质。

如本文中使用，术语“赋形剂”意图包括可以存在于药物组合物中并且不是活性成分的所有物质，如盐、粘合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲物质、调味剂或着色剂。

非药学上可接受的盐可以用于制备药学上可接受的盐，并且包括在本发明中。此种类的药学上可接受的盐以非限制的方式包含那些从以下酸制备的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学上可接受的盐也可以制备为碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐或钙盐。

在药物组合物中使用的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、氯丁醇(chlorobutanol)、对羟苯甲酸酯和硫柳汞。

在药物组合物中使用的合适的缓冲物质包括盐中的乙酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸和盐中的磷酸。

药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的佐剂。

在一个实施方案中，药物组合物配制用于系统施用，特别是胃肠外(例如皮下)施用。在另一个实施方案中，药物组合物配制用于吸入。

在一个实施方案中，另外的药学活性剂选自下组：抗生素、细胞抑制剂、毒素、酶、金属或金属化合物/复合物、螯合剂、放射性核素、小有机分子、治疗活性肽、治疗活性核酸分子、半抗原和抗体。合适的抗生素包括妥布霉素、阿奇霉素、氨曲南、粘菌素和碳青霉烯。

如本文中使用，术语“小有机分子”指包含至少两个碳原子，但是优选不超过7或12个可旋转的碳键，具有范围为100-2000道尔顿，特别是100-1000道尔顿，或<900道尔顿的分子量，并且任选包含一个或两个金属原子的有机分子。

可以与本发明的融合分子组合的具体的另外的药学活性剂包括阿法链道酶、皮质类固醇、白三烯修饰剂、N-乙酰半胱氨酸、吸入的谷胱甘肽、抗胆碱药、布洛芬和β2-肾上腺素能受体激动剂。

在又一个方面，本发明涉及试剂盒，其包含如本文中限定的融合分子、如本文中限定的核酸分子、如本文中限定的细胞、或如本文中限定的药物组合物。试剂盒可以是诊断或分析试剂盒。

如本文中使用，术语“成套试剂盒(简言之：试剂盒)”指包含一个或多个容器和任选地，数据载体的制品。所述一个或多个容器可以充满本文中公开的手段或试剂中的一种或多种。试剂盒中可以包含别的容器，所述试剂盒含有例如稀释剂、缓冲剂和别的试剂。所述数据载体可以是非电子数据载体，例如图形数据载体，如信息传单、信息单、条形码或存取码、或电子数据载体，如光盘(CD)、数字通用盘(DVD)、微芯片或另一种基于半导体的电子数据载体。存取码可以允许访问数据库，例如因特网数据库，，集中式或分散式数据库。所述数据载体可以包含关于使用本发明的融合分子、核酸分子、细胞和/或药物组合物的使用说明。

涉及结合本发明的融合分子公开的组合物和试剂盒的所有方面和实施方案也适用于单一突变蛋白及其组合。

E.诊断和治疗应用

绿脓菌荧光素是假单胞菌属，如铜绿假单胞菌的主要铁载体。体外实验指示铜绿假单胞菌绿脓菌荧光素在从铁转铁蛋白释放铁中的潜在作用，但是最近仅证明了绿脓菌荧光素在体内竞争铁的能力(Meyer等,1996,Infection and Immunity,64,p.518-523)。使用烧伤小鼠模型观察到自有毒力的亲本菌株制备的突变体中绿脓菌荧光素生成的缺乏与这些突变体的毒力丧失相关联，并且毒力在补充源自野生型菌株的同源绿脓菌荧光素时恢复。此外，补充异源绿脓菌荧光素没有恢复后一种突变体的毒力。如此，对感染期间由给定铜绿假单胞菌隔离群使用的绿脓菌荧光素介导的铁摄取系统的精确了解看起来是开发经由细菌铁代谢(例如通过阻断绿脓菌荧光素生物合成或绿脓菌荧光素介导的铁转运)治疗铜绿假单胞菌感染的新方式的前提。

绿脓菌螯铁蛋白(Pch)是由铜绿假单胞菌生成并分泌以同化铁的两种主要的铁载体之一。它螯合胞外介质中的铁，并且经由特定的外膜转运蛋白FptA将它转运到细胞中。Pch强烈螯合二价金属，如Zn(II)(于p[H]7.4，pZn＝11.8)和Cu(II)(于p[H]7.4，pCu＝14.9)，并且主要形成1:2(M²⁺/Pch)复合物。铁载体不仅专用于铁(III)穿梭，而且更可能在微生物中的微妙金属稳态中展现其它特定的生物学作用。

因此，医学中存在对于本发明的绿脓菌荧光素/绿脓菌螯铁蛋白结合融合分子的许多可能的应用。

在一个方面中，本发明涉及如本文中限定的融合分子、如本文中限定的核酸分子、如本文中限定的细胞、或如本文中限定的药物组合物，其用作药物。

如本文中使用，术语“药物”指疗法中，即疾病治疗中使用的物质/组合物。

如本文中使用，术语“疾病的治疗”包括治愈疾病或其症状，缩短疾病或其症状的持续时间，改善、预防疾病或其症状，减缓或抑制疾病或其症状的进展或恶化、或者防止或延迟疾病或其症状的发作。

根据本发明，术语“疾病”指任何病理学状态，特别是与受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染有关或由受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染引起的疾病或病症。

在另一个方面中，本发明涉及如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的细胞，或如本文中限定的药物组合物，其用于预防或治疗受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染。

如遍及本说明书使用的，根据本发明，术语“受试者”意指用于治疗或诊断的受试者，特别是患病受试者(又称为“患者”)或预期/假设/有风险患病的受试者。“受试者”是脊椎动物，特别是哺乳动物。术语“哺乳动物”在本文中用于指分类为哺乳动物的任何动物，包括不限于人、家畜和农场动物，和动物园、运动、或宠物动物，如羊、犬、马、猫、牛、大鼠、猪、猿，如猕猴等，仅举几个说明性的例子。在一个具体的实施方案中，哺乳动物是人。

在又一个方面，本发明涉及如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的细胞，或如本文中限定的药物组合物，其用于预防或治疗受试者中的与铜绿假单胞菌生物膜感染有关或由铜绿假单胞菌生物膜感染引起的疾病或病症。

在又一个方面，本发明涉及预防或治疗受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染的方法，其包括对受试者施用有效量的如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的细胞，或如本文中限定的药物组合物。

在又一个方面，本发明涉及预防或治疗与受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染有关或由受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染引起的疾病或病症的方法，其包括对受试者施用有效量的如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的细胞，或如本文中限定的药物组合物。

在一个实施方案中，与铜绿假单胞菌生物膜感染有关或由铜绿假单胞菌生物膜感染引起的疾病或病症选自：囊性纤维化、医院获得性肺炎、通风装置相关的肺炎、尿路感染、眼感染、耳感染和烧伤创面感染。

在又一个方面，本发明涉及如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的细胞，或如本文中限定的药物组合物，其用于结合受试者中的绿脓菌荧光素(I、II和/或III型)和/或绿脓菌螯铁蛋白和/或抑制或减轻受试者中的铜绿假单胞菌生长。

在又一个方面中，本发明特征在于结合受试者中的绿脓菌荧光素(I、II和/或III型)和/或绿脓菌螯铁蛋白的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的细胞，或如本文中限定的药物组合物。

在又一个方面中，本发明特征在于用于抑制或减轻受试者中的铜绿假单胞菌生长的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的细胞，或如本文中限定的药物组合物。

在又一个方面中，本发明涉及如本文中限定的融合分子，如本文中限定的核酸分子，如本文中限定的细胞，或如本文中限定的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于(i)预防或治疗受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染，(ii)预防或治疗受试者中的与铜绿假单胞菌生物膜感染有关或由铜绿假单胞菌生物膜感染引起的疾病或病症，或者(iii)抑制或减轻受试者中的铜绿假单胞菌生长。

可以经由任何常规的路径，如通过表面或系统性(即肠或胃肠外)施用来施用本文中描述的药剂和组合物。胃肠外施用包括注射或输注，例如静脉内，动脉内，皮下，皮内或肌肉内。表面施用包括吸入以及滴眼剂和滴耳剂。在具体的实施方案中，通过吸入(融合分子)或系统性，例如皮下(Fc-融合分子构建体)施用本发明的融合分子。

本发明进一步涉及本文中公开的融合分子用于检测样品中的绿脓菌荧光素(I、II和/或III型)和/或绿脓菌螯铁蛋白的用途以及相应诊断方法。

如本文中使用，术语“检测”或“可检测”在定量和定性水平两者及其组合上理解。因此，它包括感兴趣的分子的定量、半定量和定性测量。

此类用途可以包括以下步骤：在合适的条件下使一种或多种融合分子与怀疑含有绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白的样品接触，从而允许形成融合分子和绿脓菌荧光素(I、II和/或III型)和/或绿脓菌螯铁蛋白之间的复合物，并且通过合适的信号检测复合物。信号可以通过如上文解释的标记物，或者通过由于结合(即复合物形成)自身所致的物理特性的变化引起。一个例子是表面等离振子共振，其数值在结合配偶体的结合期间变化，来自所述结合配偶体的一个在表面如金箔上固定化。

本文中公开的融合分子也可以用于分离绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白。此类用途可以包括以下步骤：在合适的条件下使此类融合分子与假设含有绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白的样品接触，从而分别允许形成融合分子和绿脓菌荧光素之间和/或融合分子和绿脓菌螯铁蛋白之间的复合物，并且分开复合物与样品。

在公开的融合分子用于检测绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白以及分离绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白的用途中，可以在合适的固相上固定化融合分子和/或绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白或其域或片段。

因而，可以测定绿脓菌荧光素和/或绿脓菌螯铁蛋白的存在或缺乏(例如在样品中)以及其浓度或水平。

“样品”定义为从任何受试者中采集的生物样品。生物样品包括但不限于血液、血清、尿液、粪便、精液或组织。

本文中描述的融合分子可以在与抗体或其片段相似的许多领域中使用。例如，融合分子可以用于用酶、抗体、放射性物质或任何其它具有生物化学活性或限定结合特征的基团标记。通过这样做，可以检测其相应的靶物或使其相应的靶物与它们接触。另外，本发明的融合分子可以用来依靠建立的分析方法(例如ELISA或Western印迹)或者通过显微术或免疫传感学检测化学结构。在这点上，可以通过使用合适的融合分子缀合物直接产生或者通过经由抗体的免疫化学检测结合的融合分子间接产生检测信号。

涉及结合本发明的融合分子公开的诊断和治疗应用的所有方面和实施方案也适用于单一突变蛋白及其组合。

本发明的其它目的、优点和特征在检查下述实例及其附图后对于本领域技术人员会变得明显，所述实例及其附图并不意图是限制性的。如此，应当理解，虽然通过例示性的实施方案和任选的特征具体公开本发明，但是本领域技术人员可采用本文中体现的公开内容的修改和变型，并且认为此类修改和变型在本发明的范围内。特别地，结合本发明的融合分子公开的所有方面和实施方案也适用于本文中公开的单一突变蛋白以及其组合，并且反之亦然。

实施例

实例1：铜绿假单胞菌铁载体的纯化和生物素化

铜绿假单胞菌生成三组绿脓菌荧光素，即绿脓菌荧光素I型、绿脓菌荧光素II型和绿脓菌荧光素III型。每组具有在作为琥珀酰基、琥珀酸酰胺基或α-酮戊二酰基的侧链上不同的三种形式。另外，铜绿假单胞菌生成绿脓菌螯铁蛋白。所有10种铁载体可以复合作为Fe³⁺的铁。

为了选择和筛选感兴趣的突变蛋白，可以将铁载体进行生物素化。对绿脓菌荧光素I琥珀酰基变体在琥珀酰基侧链，对绿脓菌荧光素II琥珀酰基变体在L-鸟氨酸侧链以及对绿脓菌荧光素III琥珀酰基变体主要在甘氨酸侧链上进行生物素化。在酚环上生物素化绿脓菌螯铁蛋白。

实例2：选择特异性结合铜绿假单胞菌铁载体的突变蛋白

使用通过随机诱变成熟hNGAL生成的基于hNGAL的文库来选择特异性结合铜绿假单胞菌的不同铁载体的突变蛋白。在独立的噬菌体展示和选择过程中使用生物素化且加载有铁的Pvd I琥珀酰基、Pvd II琥珀酰基和Pvd III琥珀酰基及生物素化的非加载有铁的绿脓菌螯铁蛋白。

将2x10¹²个来自这些文库的噬菌粒与200nM或500nM或1μM生物素化的靶物一起温育。使用用中性亲合素或链霉亲合素涂覆的顺磁性珠捕捉靶物/噬菌粒复合物，随后，将其用磁体分离。通过用PBST或PBS清洗珠除去未结合的噬菌粒。首先，用300μl 70mM三乙胺洗脱结合的噬菌粒10分钟，接着用100μl 1M Tris-Cl pH 6.0立即中和上清液。在一次立即清洗循环后，用100mM甘氨酸pH2.2洗脱剩余的噬菌粒10分钟，接着用50μl 0.5M Tris-碱立即中和。将这两个洗脱级份合并，并且用于感染4ml大肠杆菌XL1-blue培养物(OD₅₅₀ 0.45-0.6)以进行再扩增。在搅拌下温育30分钟后，通过以5000xg离心2分钟收集细菌，在1ml2xYT培养基中重悬，并且在三个大LB/Amp琼脂板(10g/l细菌用胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，5g/l NaCl，pH 7.5，15g/l琼脂，100μg/ml氨苄青霉素)上铺板。于32℃将板温育过夜。使用50ml补充有100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基(2xYT/Amp)从琼脂板刮下经感染的细胞。用合适体积的细菌悬浮液接种50ml 2xYT/Amp培养基以达到0.08的OD₅₅₀。于37℃在摇动器(160rpm)上温育培养物，直到达到0.5的OD₅₅₀，然后用辅助噬菌体(1.5x10¹¹pfu)通过于37℃在温和搅拌的情况下温育15分钟且在摇动器上温育45分钟感染。随后，将卡那霉素添加到终浓度70μg/ml以选择被辅助噬菌体感染的细菌。最后，通过添加25ng/ml无水四环素诱导pIII-hNGAL突变蛋白的表达。

在于24℃温育15小时后，通过离心(5000xg持续20分钟)使培养物的上清液澄清。随后，将20ml上清液通过具有0.22μm孔径的聚醚砜膜。对滤液添加5ml含有水中的20％(w/v)PEG-8000和15％(w/v)NaCl的溶液，并且温和混合。在冰上温育溶液30分钟，之后于4℃和5000xg离心20分钟。在含有200mM硼酸、160mM NaCl和1mM EDTA的1ml缓冲液中溶解含有噬菌粒的团粒。通过离心(5000xg持续5分钟)除去不溶性颗粒。将上清液转移到新管，并且与含有水中的20％(w/v)PEG-8000和15％(w/v)NaCl的200μl溶液混合。在冰上温育溶液30分钟，随后通过离心(5000xg持续5分钟)收集沉淀的噬菌粒。在补充有50mM苯甲脒的PBS中重悬噬菌粒，并且用于下一轮噬菌粒选择。

进行连续的4轮选择。应用不同清洗条件：i)在所有4个选择轮次中对于每个清洗步骤，8次与1ml PBS/T温育5分钟，ii)从轮次1至4增加的清洗循环的数目，iii)用5分钟温育清洗步骤改变快速清洗步骤，并且清洗步骤的数目逐轮增加。

从用第四次选择轮次的输出感染的大肠杆菌细胞中制备噬菌粒，并且通过用BstX1消化DNA，随后使用标准方法(Sambrook等,(1989)Molecular cloning:a laboratorymanual)经由琼脂糖凝胶电泳纯化分离hNGAL突变蛋白盒。将hNGAL突变蛋白盒插入同样切割的载体，其容许在四环素启动子的控制下的hNGAL突变蛋白的细菌生成。用连接混合物转化CaCl₂感受态TG1-F’细胞，并且在LB/Amp板上铺板。

为了优化Pvd I、Pvd II、Pvd III和Pch特异性突变蛋白，基于突变蛋白SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56和随后SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:45产生别的文库。使用选定位置的偏爱随机化或基于易错聚合酶链式反应(PCR)的方法产生文库。突变蛋白的选择如描述的那样，但是以增加的严格性进行。

为了促进在真核细胞中表达，除去潜在的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)。

此外，引入突变以进一步优化稳定性。

实例3：使用高通量ELISA筛选鉴定特异性结合相应的铜绿假单胞菌铁载体的突变蛋白

使用个别的菌落接种2xYT/Amp培养基，并且培养过夜(14-18小时)至静止期。随后，从静止期培养物中接种50μl 2xYT/Amp，并且于37℃温育3小时，然后转变成22℃，直到达到0.6-0.8的OD₅₉₅。通过添加补充有1.2μg/ml无水四环素的10μl 2xYT/Amp诱导突变蛋白的生成。于22℃温育培养物到翌日。在添加PBS/T中的40μl 5％(w/v)BSA并且于25℃温育1小时后，培养物准备好用于筛选测定法。

通过在微量滴定板上于4℃涂覆中性亲合素和链霉亲合素(在PBS中的5μg/ml)的1:1混合物过夜而测试分离的突变蛋白对相应的铁载体靶物的特异性结合。在用PBST中的2％BSA封闭板1小时后，在经涂覆的微量滴定板上以PBS/T中的1.5-2.5μg/ml的浓度捕获用于选择的相应的生物素化的铁载体靶物。在筛选中使用用生物素化的醛固酮以相同的方式涂覆的板作为阴性对照靶物。随后，将20μl经BSA封闭的培养物添加到含有捕获的靶物或醛固酮的经涂覆的微量滴定板，并且于25℃温育1小时。在用与辣根过氧化物酶缀合的抗T7抗体(Merck KgaA,Darmstadt)或与辣根过氧化物酶缀合的抗-Strep抗体(IBA,Boettingen)温育1小时后检测结合的突变蛋白。为了量化，添加20μl QuantaBlu荧光过氧化物底物，并且在320nm的激发波长和430nm的发射波长测定荧光。然后，对特异性结合相应铁载体靶物的突变蛋白测序。

为了选择具有增加的亲和力的突变蛋白，并且如下进行稳定性筛选：i)降低的抗原浓度和/或ii)与未生物素化的靶物竞争和/或iii)在添加到目标板前于65℃或70℃温育筛选上清液和/或iv)使用反向筛选形式，在用抗Strep 抗体涂覆的微量滴定板上经由Strep捕捉突变蛋白，并且添加不同浓度的生物素化的靶物，并且经由Extravidin-HRP(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)检测。

实例4：突变蛋白的表达

在2YT-Amp培养基中在大肠杆菌中表达具有C端序列SAWSHPQFEK(SEQ ID NO:127；包括SA接头和II，WSHPQFEK(SEQ ID NO:128))的独特突变蛋白以在表达后使用Streptactin亲和层析纯化突变蛋白，并且制备型大小排阻层析是适用的。

实例5：在基于ELISA的背景中测定的突变蛋白对可溶性铜绿假单胞菌铁载体的亲和力

通过“溶液结合ELISA”测定突变蛋白的溶液结合，所述溶液结合ELISA的原理如下：将恒定浓度的测试突变蛋白与可变浓度的配体(Pvd I s、sa、aKG+/-Fe/Pvd II s、sa、aKG+/-Fe/Pvd III s、sa、aKG+/-Fe/Pch+/-Fe)一起温育1h。在溶液中进行此预温育后，将突变蛋白/配体混合物的等分试样转移到经由中性亲合素固定化的生物素化的Pvd I s(+Fe)、Pvd II s(+Fe)、Pvd III s(+Fe)或Pch的ELISA板以测量游离突变蛋白的剩余浓度。经由定量ELISA设置测定游离(非配体结合)突变蛋白的浓度。

详细地，于4C以在PBS中的5μg/ml浓度用20μl中性亲合素涂覆适合于荧光测量的384孔板(Greiner FLUOTRAC^TM600，黑色平底，高结合)过夜。在清洗后，于室温用100μl含有0,1％Tween 20和2％BSA的封闭缓冲液(PBS-T/BSA)封闭经中性亲合素涂覆的孔1小时。再次清洗后，于室温添加1μg/mL浓度的封闭缓冲液中的20μl生物素化的绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白达1小时，并且除去过多的试剂。

在溶液中将固定浓度的突变蛋白与不同浓度的配体(Pvd I s、sa、aKG+/-Fe/PvdII s、sa、aKG+/-Fe/Pvd III s、sa、aKG+/-Fe/Pch+/-Fe)(使用合适的起始浓度，其以1:3比率在PBS-T/BSA中连续向下稀释到皮摩尔范围)一起温育。于室温温育1小时后，于室温将20μl反应混合物转移到其上固定化有生物素化的绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋的384孔板以捕捉未结合的(游离)突变蛋白达20分钟。为了容许将ELISA读出结果转化成绝对游离突变蛋白浓度，在PBS-T/BSA中制备含有不同浓度的突变蛋白的标准曲线，并且也在相同的ELISA板上温育20分钟。

弃去残留的上清液，并且以PBS-T/BSA中的预先确定的最佳浓度添加20μl经HRP标记的抗hNGAL抗体，并且于室温温育1小时。已经通过用突变蛋白的混合物免疫兔获得抗hNGAL抗体，随后使用试剂盒(EZ-link Plus Activated Peroxidase,Thermo Scientific)根据制造商的用法说明将抗hNGAL抗体与HRP偶联以获得抗体-HRP缀合物。在清洗后，将20μl荧光HRP底物(QuantaBlu,Thermo)添加到每孔，并且容许反应进行15至60分钟。使用荧光微板阅读器(Tecan或Molecular Devices)读出板上的每孔的荧光强度。为了评估数据，基于标准曲线结果计算游离的突变蛋白浓度c(突变蛋白)_游离，并且相对于配体浓度c(配体)绘图。为了获得配体/突变蛋白复合物的形成被阻断50％的配体浓度(IC₅₀)，通过用单位点结合模型的非线性回归根据c(突变蛋白)_游离＝c(突变蛋白)_tot/(1+c(配体)/IC₅₀))拟合曲线，其中总共示踪剂浓度c(突变蛋白)_tot和IC₅₀值为自由参数。使用GraphPad Prism 4软件进行曲线拟合。

表1A-D中汇总了所得的IC₅₀值。针对生物素化的且加载有铁的Pvd I琥珀酰基、PvdII琥珀酰基和Pvd III琥珀酰基选择的突变蛋白分别结合相应Pvd组的所有亚型，即针对生物素化的且加载有铁的Pvd I琥珀酰基选择的突变蛋白以相似的亲和力结合具有或没有复合铁离子的Pvd I琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基、-α-酮戊二酰基，针对生物素化的且加载有铁的Pvd II琥珀酰基选择的突变蛋白以相似的亲和力结合具有或没有复合铁离子的Pvd II琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基、-α-酮戊二酰基，并且针对生物素化的且加载有铁的Pvd III琥珀酰基选择的突变蛋白以相似的亲和力结合具有或没有复合铁离子的Pvd III琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基、-α-酮戊二酰基。大多数选择的突变蛋白以相当的亲和力结合具有或没有复合铁离子的的相应组的所有亚型。

针对生物素化的非加载有铁的绿脓菌螯铁蛋白的选择导致优选结合非加载有铁的绿脓菌螯铁蛋白的脂笼蛋白突变蛋白，诸如以二位数至三位数nM亲和力结合加载有铁的Pch和以弱亲和力或根本不结合非加载有铁的Pch的脂笼蛋白突变蛋白SEQ ID NO:56和57，和脂笼蛋白突变蛋白，诸如优选结合加载铁的绿脓菌螯铁蛋白的SEQ ID NO:55。

SEQ ID NO:56的亲和力优化产生以改善的亲和力结合非加载有铁的Pch并且仍以无或弱亲和力结合加载有铁的Pch的脂笼蛋白突变蛋白，而SEQ ID NO:55的亲和力优化产生以超过75倍改善的亲和力结合非加载有铁的Pch，而且还以单位数nM亲和力结合加载有铁的Pch的脂笼蛋白突变蛋白。

如此，通过脂笼蛋白突变蛋白选择和优化，实现了仅四种不同突变蛋白足以结合具有和没有复合铁离子的铜绿假单胞菌铁载体的所有10种亚型(Pvd I s、sa、αKG+/-Fe；Pvd II s、sa、αKG+/-Fe；Pvd III s、sa、αKG+/-Fe；Pch+/-Fe)。

表1A：突变蛋白对溶液中的铜绿假单胞菌铁载体绿脓菌荧光素I琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基、-α-酮戊二酰基+/-Fe³⁺的结合

表1B：突变蛋白对溶液中的可溶性铜绿假单胞菌铁载体绿脓菌荧光素II琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基、-α-酮戊二酰基+/-Fe³⁺的结合

表1C：突变蛋白对溶液中的铜绿假单胞菌铁载体绿脓菌荧光素III琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基、-α-酮戊二酰基+/-Fe³⁺的结合

表1D：突变蛋白对溶液中的铜绿假单胞菌铁载体绿脓菌螯铁蛋白+/-Fe³⁺的结合

对于高通量亲和力排序，然而以差异不大的配体浓度使用相同测定法。

实例6：Biacore中测定的突变蛋白结合铜绿假单胞菌铁载体的亲和力

在基于表面等离振子共振(SPR)的测定法中，使用Biacore T200仪(GEHealthcare)测量突变蛋白对具有复合铁离子的绿脓菌荧光素I琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基、-α-酮戊二酰基或者对具有复合铁离子的绿脓菌荧光素II琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基、-α-酮戊二酰基或对具有复合铁离子的绿脓菌荧光素III琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基、-α-酮戊二酰基的结合亲和力。应用适当过量的EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo,Cat#21329)，接着使用Zeba Spin Desalting Plate(Thermo,Cat#21329)根据制造说明分离非反应的生物素，将对于结合绿脓菌荧光素和阴性对照(SEQ ID NO:64)选择的突变蛋白于室温生物素化2小时。

在SPR亲和力测定法中，使用生物素捕捉试剂盒(GE Healthcare)在传感器芯片CAP上捕捉生物素化的突变蛋白和阴性对照：传感器芯片CAP预先固定化有ssDNA寡聚物。以2μl/分钟的流速应用未稀释的生物素捕捉试剂(与互补的ss-DNA寡聚物缀合的链霉亲合素)达300秒。随后，以5μl/min的流速应用1μg/ml至100μg/mL生物素化的突变蛋白或阴性对照300秒。仅用生物素捕捉试剂加载参照通道。

为了测定结合亲和力，在HBS-EP+缓冲液(GE Healthcare)中应用范围为5-2000nM的浓度的相应Pvd代表(Pvd I、II、III，包括琥珀酰基、琥珀酸酰胺基、-α-酮戊二酰基+Fe)的4至5个稀释，并且应用到制备好的芯片表面，应用30μl/分钟的流速，以120-180秒的样品接触时间和900-2400秒的解离时间使用单个循环或多个循环动力学方法。使用高浓度(例如1200nM)的相应Pvd确认对阴性对照SEQ ID NO:64的结合的缺乏。在配体固定化后，为了使用单一循环动力学分析，在监测解离前，以上升次序连续应用Pvd的所有4-5个浓度。为了使用多循环动力学分析，应用Pvd的4个稀释，各自接着解离阶段。于25℃进行所有测量。通过注射6M Gua-HCl及0.25M NaOH，接着是用运行缓冲液的额外清洗和120秒的稳定期实现传感器芯片CAP表面的再生。用Biacore T200评估软件(V 1.0)评估数据。使用双重参照。使用1:1结合模型来拟合原始数据。

表2A-C中汇总了用于选择脂笼蛋白突变蛋白的所得动力学常数。可以对每个Pvd组生成脂笼蛋白突变蛋白，其以亚nM至较低的单位数nM范围结合相应Pvd组的所有亚型。然而，Pvd特异性脂笼蛋白突变蛋白不结合野生型hNGAL Fe-肠菌素的天然配体。

表2A：Pvd I特异性脂笼蛋白突变蛋白对复合有Fe³⁺的Pvd I琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基和-α-酮戊二酰基的动力学常数。

表2B：Pvd II特异性脂笼蛋白突变蛋白对复合有Fe³⁺的Pvd II琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基和-α-酮戊二酰基的动力学常数。

表2C：Pvd III特异性脂笼蛋白突变蛋白对复合有Fe³⁺的Pvd III琥珀酰基、-琥珀酸酰胺基和-α-酮戊二酰基的动力学常数。

另外，使用上文描述的测定法通过对固定化突变蛋白应用高浓度(≥1μM)的下述分析物确认对不属相应绿脓菌荧光素亚组(I、II、III)的各种铁载体及对MMP-9的结合的缺乏：Fe-肠菌素、去铁胺、绿脓菌螯铁蛋白、来自相应的其它亚组的绿脓菌荧光素、MMP-9原形(proform)和活化的MMP-9。表3中提供了此分析的概述。

为了测定突变蛋白SEQ ID NO:62与Pch+Fe的相互作用的动力学常数和所得的KD，使用标准胺化学将突变蛋白或阴性对照SEQ ID NO:64在CM5芯片的表面上固定化。使用EDC和NHS活化芯片的表面。随后，以10μl/min的流速应用10mM乙酸盐pH 4.0中的5μg/mL突变蛋白或阴性对照溶液，直到实现约2000RU的高固定化水平。用乙醇胺淬灭残留的活化基团。在乙醇胺后用EDC/NHS处理参照通道(空白固定化)。

为了测定亲和力，在HBS-P+缓冲液中制备绿脓菌螯铁蛋白(+Fe)的5个稀释，并且应用到准备好的芯片表面。以接触时间180s，解离时间1200-1800s并且应用30μl/分钟的流速进行结合测定法。于25℃进行测量。通过三次连续注射10mM Gly-HCl pH 1.5(120秒)，接着是用运行缓冲液的额外清洗和稳定期实现固定化突变蛋白表面的再生。用BiacoreT200Evaluation软件(V 1.0)评估数据。使用双重参照。使用1:1结合模型拟合原始数据。

表2D中显示了SEQ ID NO:62所得的动力学常数。

使用相同测定法，通过对固定化突变蛋白SEQ ID NO:62应用高浓度(≥1μM)下述分析物确认对来自绿脓菌螯铁蛋白的铁载体及对MMP-9的结合的缺乏：Fe-肠菌素、去铁胺、绿脓菌荧光素、MMP-9原形和活化的MMP-9。表3中显示了结果的概述。

表2D：绿脓菌螯铁蛋白特异性脂笼蛋白突变蛋白SEQ ID NO:62对复合有Fe³⁺的绿脓菌螯铁蛋白的动力学常数。

表3：脂笼蛋白突变蛋白结合Pvd I、Pvd II、Pvd III或绿脓菌螯铁蛋白的特异性。

实例7：结合铜绿假单胞菌铁载体的突变蛋白的功能性测试；抑制铁摄取

为了测定活细菌中的功能性铁摄取抑制，一定剂量范围浓度的结合铜绿假单胞菌铁载体的脂笼蛋白突变蛋白与Tris.HCl 50mM pH 8.0缓冲液中的100nM加载有放射性铁的铁载体温育1小时，之后与96孔板中于595nm终浓度为OD＝1的细菌一起温育30分钟。随后，将细菌用细胞收获器过滤通过与5％的聚乙烯亚胺溶液预温育的96孔板GF/B滤器，并且用Tris缓冲液清洗3次。在过滤和干燥后，刚好在计数前在每个滤器中添加30μl闪烁体混合物。对于铁加载绿脓菌荧光素，将铁载体在200μM最终溶液中以4比1的绿脓菌荧光素与铁的比率与Tris缓冲液中的55Fe-Cl3一起温育15分钟。对于用放射性铁加载绿脓菌螯铁蛋白，将HCl 0.5N中的40μl 0.25mM的55FeCl3溶液添加到1mM的绿脓菌螯铁蛋白的甲醇溶液。在15分钟温育时间后，添加940μl Tris HCl 50mM pH 8.0以获得具有绿脓菌螯铁蛋白与铁之间的2比1比率的20μM 55Fe-Pch溶液。如下制备细菌：将接种有分离的克隆的MuellerHinton培养基中的10ml过夜培养物离心，并且在25ml琥珀酸盐培养基中重悬清洗过的团粒，并且在摇动下温育2小时。平行地，给20ml Mueller Hinton培养基接种5ml过夜培养物，并且在摇动下温育2小时以用作背景铁摄取水平。然后，离心25ml细菌培养物，并且用相应的培养基清洗，之后将团粒在Tris.HCL 50mM pH8.0缓冲液中重悬，并且测量595nm的OD以在测定法中具有OD＝1的终浓度。

对每个浓度点计算掺入百分比，并且用内部软件计算抑制。对于此计算，铁摄取的最大水平基于没有任何脂笼蛋白突变蛋白的基本琥珀酸盐培养基中获得的数值，并且在不表达铁载体受体的丰富的Mueller Hinton培养基中获得背景数值。

表4：脂笼蛋白突变蛋白阻断铜绿假单胞菌的铁摄取，如对脂笼蛋白突变蛋白SEQID NO:16、37、53和62例示性显示。

实例8：结合铜绿假单胞菌铁载体的突变蛋白的功能性测试；生长抑制

通过在具有透明底部的黑色96孔板中将补充有痕量元素溶液和0.1mg/ml BSA的经Chelex处理的琥珀酸盐培养基中的结合铜绿假单胞菌铁载体的突变蛋白与在595nm稀释为0.05的最终OD的MS细菌培养物一起温育测定细菌生长抑制。于37℃将板温育过夜，每20分钟摇动，并且在来自Thermo Labsystem的IEMS阅读器中于595nm读出OD。生长抑制在图4A中对Pvd I菌株和Pvd I特异性突变蛋白SEQ ID NO:16，在图4B中对Pvd II菌株和Pvd II特异性突变蛋白SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:36，在图4C中对Pvd III菌株和Pvd III特异性突变蛋白SEQ ID NO:53以及在图4D中对依赖绿脓菌螯铁蛋白摄取铁以生长的Pvd I敲除(ΔpvdA)菌株和绿脓菌螯铁蛋白特异性突变蛋白SEQ ID NO:62例示性显示。对照是没有脂笼蛋白突变蛋白情况下的细菌生长。

实例9：突变蛋白的稳定性评估

为了测定熔解温度作为总体稳定性的一般指示，使用毛细管nanoDSC仪(CSC6300,TA Instruments)以1℃/分钟扫描PBS(Gibco)中蛋白质浓度为1mg/ml的铁载体特异性突变蛋白(SEQ ID NO:13-18；26,31-36；47-53；58-62)(25-100℃)。使用整合的NanoAnalyze软件从显示的热分析图计算熔解温度(Tm)。

下文表5A-D中列出了脂笼蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:13-18；26,31-36；47-53；58-62)的所得熔解温度以及熔解的开始。对于所有Pvd组以及对于具有70℃的范围中的Tm的pch脂笼蛋白突变蛋白，可以选择范围为68至74℃的针对每种Pvd类型和pch的最佳脂笼蛋白突变蛋白，指示良好的分子稳定性。

表5A：如通过Pvd I特异性脂笼蛋白突变蛋白的nanoDSC测定的Tm和熔解的开始

表5B：如通过Pvd II特异性脂笼蛋白突变蛋白的nanoDSC测定的Tm和熔解开始

表5C：如通过Pvd III特异性脂笼蛋白突变蛋白的nanoDSC测定的Tm和熔解开始

表5D：如通过pch特异性脂笼蛋白突变蛋白的nanoDSC测定的Tm和熔解开始

为了评估贮存和冷冻/融化稳定性，将PBS中浓度1mg/ml的突变蛋白于37℃温育1周或者进行3个冷冻/融化循环。在定量ELISA背景中测量活性突变蛋白。在分析型大小排阻层析中测量单体蛋白质。表6中显示了SEQ ID NO:16、36、53、62的例示性数据。

为了测定蛋白质活性，应用下述ELISA：于4℃用PBS中5μg/ml浓度的20μL中性亲合素(Thermo Scientific)涂覆适合于荧光测量的384孔板(Greiner FLUOTRAC^TM600，黑色平底，高结合)过夜。在清洗后，用100μl封闭缓冲液(含有0.1％v/v Tween-20的PBS中的2％w/v BSA)将经中性亲合素涂覆的孔封闭1小时。再次清洗后，添加封闭缓冲液中的1μg/ml浓度的20μl生物素化的且加载有铁的绿脓菌荧光素I琥珀酰基、绿脓菌荧光素II琥珀酰基、绿脓菌荧光素III琥珀酰基或生物素化的绿脓菌螯铁蛋白。清洗板，并且将20μl适当稀释的蛋白质标准品，非应激(unstressed)参照样品或应激(stressed)样品转移到ELISA板，并温育。为了定量板结合的蛋白质，清洗ELISA板，弃去残留的上清液，并且在封闭缓冲液中以预先确定的最佳浓度添加20μl经HRP标记的抗hNGAL抗体，并温育。在清洗后，将20μl荧光HRP底物(QuantaBlu,Pierce)添加到每孔，并且容许反应进行20-30分钟。使用荧光微板阅读器(Tecan)阅读板上的每孔的荧光强度。

除了另有叙述，于室温进行所有温育步骤1小时，并且在每个温育步骤后，使用Biotek ELx405select CW清洗器用100μl PBS-T缓冲液(PBS,0.05％Tween 20)将板清洗5次。

对于上文描述的ELISA，制备校正曲线，包括通常范围为0.008-500ng/mL的11个稀释，并且对每个样品制备校正曲线的线性范围内的三个不同的独立稀释。将任选补充有1％人或鼠血浆的封闭缓冲液用于稀释。

使用4参数逻辑(4PL)非线性回归模型拟合校正曲线，并且用于计算测试样品的活性蛋白浓度。相对于在相同浓度并且在相同基质中贮存的非应激样品参照测定的活性蛋白浓度。

以0.3mL/分钟的流速使用PBS(Gibco)作为洗脱剂，在具有成排的两个Superdex75 5/150GL柱(GE Healthcare)的Agilent HPLC系统上进行分析性大小排阻层析。

为了评估血浆中的贮存稳定性，于37℃在人、小鼠和大鼠血浆中将0.5mg/ml浓度的突变蛋白温育1周。在如描述的定量ELISA背景中测量活性突变蛋白。

证明了所有测试的脂笼蛋白突变蛋白在所有测试条件下是稳定的。

表6：在3个冷冻/融化循环(F/T)后；在PBS中于37℃贮存1周和在人(hu)、小鼠(mu)或大鼠血浆中贮存1周的稳定性，通过qELISA中的活性回收和分析型SEC中的单体含量评估：在qELISA中稳定＝100+/-15％；在aSEC中稳定＝100+/-5％(与非应激参照样品相比单体峰面积的回收)；对于包括参照的所有样品，已经检测到100面积百分比的单体含量。

实例10：小鼠模型中的脂笼蛋白突变蛋白的体内效力

研究静脉内(i.v.)施用后的SEQ ID NO:19在小鼠的铜绿假单胞菌诱导的肺感染中的预防效果。

感染前1小时和感染时施用SEQ ID NO:19。在感染后24小时评估肺细菌载量。

本研究中使用的菌株是铜绿假单胞菌(ATCC27853)。从于-80℃贮存于PBS/15％甘油中的铜绿假单胞菌开始，于37℃在摇动下在Mueller-Hinton培养基中进行过夜培养，并且接着进行额外的传代培养(100μl过夜培养物+100ml MHB)，直到对数生长期结束。将培养物清洗两次，并且在磷酸盐缓冲液盐水中重悬，之后以1E+09CFU/ml冷冻。对于每个实验，融化新的管形瓶，并且通过活菌计数确认接种物。

在使用前容许购自Janvier laboratories,(Route dessecs,53940LeGenest Saint Ile,France)的7至8周龄雄性Swiss小鼠(5只动物/组)驯化至少5天。于22±2℃的温度以40-70％的相对湿度和12-15空气新鲜交换/小时维持动物。光周期12/12小时：光照7a.m.至7p.m.(正常周期)。连续记录温度和相对湿度偏差。每笼容纳5只动物，并且容许它们任意获得水和标准饮食(AO4C标准饮食(SAFE))。所有实验在得到Sanofi R&D(CEPAL)的伦理委员会批准下进行。

通过用50μl NaCl 0.9％中的1.E+07CFU/小鼠的铜绿假单胞菌皮内攻击雄性Swiss小鼠诱导肺感染。

在感染前1小时和感染时通过静脉内推注施用200、400、1000或2000μg/小鼠浓度的SEQ ID NO:19。

感染后24小时，对动物实施安乐死，并且测定来自肺匀浆物的细菌计数，并且以log10CFU/ml表示为均值±sem。

使用SAS v9.2进行统计学分析。Excel软件2003用于图呈现。SEQ ID NO:19剂量与媒介物的比较用单因素方差分析，接着是Dunnett检验评估(ZAR J.H.,《BiostatisticalAnalysis》,Prentice Hall International Editions,4èmeédition,1999.；C.W.Dunnett,“A multiple comparison procedure for comparing several treatments with acontrol”,J.Amer.Statist.Assoc.,50(1955),pp.1096-1121,1955)。

在铜绿假单胞菌诱导的小鼠肺感染模型中，在细菌攻击前1小时和当时施用SEQID NO:19，并且SEQ ID NO:19以剂量依赖性方式阻止小鼠中的感染形成。从200μg/小鼠开始，对SEQ ID NO:19观察到显著的预防效果，最大效果在2000μg/小鼠。

实例11：结晶

为了测定与Pvd-Fe复合的SEQ ID NO:31蛋白质的三维结构，应用下述方法。

在pET-24a质粒中克隆图6中描绘的蛋白质序列，并表达为有N端标签的6His-TEV蛋白酶识别位点构建体。

使用质粒来转化BL21(DE3)Star大肠杆菌细胞，并且将所得的克隆在OvernightExpress Instant TB培养基(Novagen)中接种，并且于18℃以200RPM搅拌温育47小时后在最终OD600 4.7时收获细胞。在含有500mM NaCl、10mM咪唑、1mM MgCl₂、1mM TCEP、5％甘油和20mM Tris pH7.4的缓冲液中重悬细胞团粒，并且通过标准超声处理方法裂解该细胞团粒。通过低速度离心使所得的提取物澄清，并且将上清液过滤通过22nm膜，之后加载到用100mM NaCl、10mM咪唑、100mM HEPES pH 8缓冲液预先平衡的Ni NTA(Qiagen)5ml柱。通过咪唑10mM至300mM的线性梯度洗脱蛋白质，并且进一步过夜透析到100mM NaCl、10mM咪唑、100mM HEPES pH 8缓冲液。将蛋白质浓缩到20mg/ml，并且加载到凝胶过滤Superdex 75柱(GE)。在存在TEV蛋白酶(1/50比率)的情况下将所得的蛋白质过夜透析到100mM NaCl、10mMHEPES pH 8缓冲液以除去6His N-端标签，接着进行如上文描述的负Ni NTA纯化步骤以分开经切割的蛋白质。将最终的蛋白质在100mM NaCl,50mM HEPES pH 7.5中浓缩到12mg/ml，等分取样，在液氮中速冻，并且于-80℃贮存以进一步使用。

对于结晶，将蛋白质与高10x倍的摩尔浓度的Pvd-Fe一起温育过夜，并且铺板以在SBS形式板中进行结晶筛选，其中在蒸汽扩散坐滴形式实验中于20℃和4℃混合100nL蛋白质液滴与100nL结晶筛选溶液。检出许多结晶命中，并且进一步优化结晶条件以获得完全衍射x-射线质量晶体。

使用同步加速器x-射线源评估晶体衍射质量，并且在20％PEG3350和0.2M LiSO4条件下于20℃获得最佳衍射晶体。通过将PEG3350浓度提高到35％低温保护最佳晶体，然后在液氮中速冻，并且在100K温度收集数据集。

通过MOSFLM处理X-射线数据，并且通过使用pdb 1LKE作为搜索工具的分子替换方法测定蛋白质结构，并且将结构模型进一步精修到P41212中的R自由＝0.233-R＝0.200质量，每个不对称单元具有2个三重蛋白质复合物。

蛋白质结构呈现具有与不对称单元中存在的两个突变蛋白蛋白质结合的Pvd-Fe的经典脂笼蛋白支架，图7。图8中分析并呈现了参与Pvd-Fe结合的氨基酸残基。图9中鉴定并呈现了直接结合Fe的Pvd的氧。

实例12：融合分子构建体的生成

通过基因合成遗传融合4个单一脂笼蛋白突变蛋白以形成融合分子(参见图10A)。通过接头，如(G4S)₂将脂笼蛋白突变蛋白彼此分开，除去潜在的N-糖基化位点(N-X-S/T)，并且随后将所得的构建体亚克隆到附加体表达载体pXL(由Durocher等(2002),Nucl.AcidsRes.30(2)描述的pTT载体的类似物)中。通过遗传融合SEQ ID NO:36、16、53和62的脂笼蛋白突变蛋白产生SEQ ID NO:134的融合分子。通过遗传融合SEQ ID NO:34、17、50和63的脂笼蛋白突变蛋白产生SEQ ID NO:135的融合分子。

通过将以(G4S)₂接头分开的4个单一脂笼蛋白突变蛋白与人IgG4的Fc域(SEQ IDNO:140)融合产生所谓的Fc-融合分子构建体。通过将以(G4S)₂接头分开的SEQ ID NO:36、16、53和62的脂笼蛋白突变蛋白与人IgG4Fc域(SEQ ID NO:140)的N端遗传融合产生SEQ IDNO:136。通过将以(G4S)₂接头分开的SEQ ID NO:34、17、50和63的脂笼蛋白突变蛋白与人IgG4Fc域(SEQ ID NO:140)的N端遗传融合产生SEQ ID NO:137。通过将以(G4S)₂接头分开的SEQ ID NO:34、17、50和63的脂笼蛋白突变蛋白与人IgG4Fc域(SEQ ID NO:140)的C端遗传融合产生SEQ ID NO:138。通过将以(G4S)₂接头分开的SEQ ID NO:34和17的脂笼蛋白突变蛋白与人IgG4Fc域(SEQ ID NO:140)的N端和将以(G4S)₂接头分开的SEQ ID NO:50和63的脂笼蛋白突变蛋白与人IgG4Fc域(SEQ ID NO:140)的C端遗传融合产生SEQ ID NO:139。图10B至D中显示了这些Fc-融合分子构建体的总体结构。

别的例示性融合分子构建体是SEQ ID NO:143至186的构建体。

注意到序列表中的突变蛋白和融合蛋白构建体使用的内部参照与参照序列，即野生型hNGAL的序列(例如SEQ ID NO:1)相比不一定反映突变或所有突变。可以通过比较突变蛋白/融合分子序列与参照序列容易地确定实际的突变。

实例13：融合分子构建体的表达和质量控制

在大肠杆菌中增殖用于转染的表达质粒，并且使用来自Qiagen的EndoFree Mega试剂盒制备。通过在来自Life Technologies的FreeStyle F17表达培养基中生长的HEK293细胞的瞬时转染生成融合分子。于37℃在Kuehner ISF1-X培养箱摇动器中以110rpm在8％CO₂的情况下培养细胞。在转染后6至7天通过以4500g离心20分钟除去细胞。经由0.2μm膜过滤上清液以除去剩余的颗粒。

通过在来自GE Healthcare的HisTrap柱上的亲和层析纯化加有His标签的蛋白质。为了避免非特异性结合，在捕捉捕捉前添加20mM咪唑。用MES缓冲液(50mM MES,1MNaCl,pH 6.5)和Tris缓冲液(50mM Tris,50mM NaCl pH 8)清洗蛋白质，并且用直至Tris缓冲液中的500mM咪唑(imidamidazol)的梯度洗脱。

通过在来自GE Healthcare的HiTrap蛋白A柱上的亲和层析纯化FC变体。用PBS缓冲液(Life Technologies)清洗蛋白质，接着用100mM柠檬酸盐缓冲液pH3洗脱，并且用Tris缓冲液pH 9中和。加有His标签的蛋白质和FC变体的精制(polishing)步骤由用PBS(LifeTechnologies)使用Superdex 200(GE Healthcare)的大小排阻层析(SEC)组成。在通过超滤浓缩后，将融合分子无菌过滤(0.2μm)，等分取样，并且于-80℃贮存。通过测量280nm的吸光度测定蛋白质浓度。

通过分析SEC、SDS-PAGE(参见图11)和质谱术完成进一步的质量控制。使用装备有TSKgel3000SWXL(7.8x300mm,Tosoh)及保护柱(7.8x50mm,Tosoh)或MabPac SEC-1柱(4x300mm,Thermo)和MabPac SEC-1保护柱(4x50mm,Thermo Fisher)的BioSECcurity HPLC(PSS)进行分析SEC。在以280nm和260nm检测的情况下使用250mM NaCl，100mM磷酸钠pH 6.7以1ml/min(对于TSKgel柱)或0.25ml/min(对于MabPac柱)运行分析。将5μg蛋白质(为D-PBS中的1mg/ml)应用到柱上。为了评估分子大小，使用凝胶过滤标准混合物(凝胶过滤试剂盒MWGF-1000，SIGMA Aldrich和蛋白质试剂盒，PSS)校准柱。使用WinGPC软件v5.11(PSS)进行数据评估。下文表7中显示了一个融合分子和一个Fc-融合分子构建体的结果。

表7：通过分析SEC(TSKgel3000SWXL柱)分析融合分子构建体。

蛋白质	通过SEC测得的聚集体	通过SEC测得的MW
			SEQ ID NO:134	<1％	125kDa
SEQ ID NO:136	1％	457kDa

使用装备有双重ESI离子源的6540UHD Accurate Mass Q-TOF LC-MS系统(Agilent)进行准确质量分析。在阳离子模式中以延伸的质量范围(2GHz)完成测量。在D-PBS中将样品稀释到0.5mg/ml的浓度。为了测量被还原的样品，添加10mM TCEP。在将250个单位的PNGaseF(NEB)添加到12.5μg蛋白质并且在37℃温育18小时后用D-PBS中的0.5mg/ml的样品完成天然条件下的去糖基化。将2μg蛋白质应用到于40℃运行的具有保护柱(Narrowbore Poroshell300SB-C8,2.1x12.5mm,5μm,Agilent)的Poroshell 300SB-C8柱(0.5x75mm,5μm,Agilent)上。洗脱液A是具有0.1％甲酸的LC水；洗脱液B是具有0.1％甲酸的90％乙腈。用在7分钟中从5％B至100％B的线性梯度和180μl/min的流速实现分离。使用MassHunter定性分析软件第B.06版完成数据处理和分析。下文表8中显示了一个融合分子和一个Fc-融合分子构建体的结果。

表8：通过ESI-MS对融合分子构建体的准确质量分析。

实例14：单一脂笼蛋白突变蛋白的表达

在大肠杆菌中增殖用于转染的表达质粒，并且使用来自Qiagen的EndoFree Mega试剂盒制备。通过在来自Life Technologies的FreeStyle F17表达培养基中生长的HEK293细胞的瞬时转染生成脂笼蛋白突变蛋白。于37℃在Kuehner ISF1-X培养箱摇动器中以110rpm在8％CO₂的情况下培养细胞。在转染后6至7天通过以4500g离心20分钟除去细胞。经由0.2μm膜过滤上清液以除去剩余的颗粒。通过在来自GE Healthcare的HisTrap柱上的亲和层析纯化加有His标签的蛋白质。为了避免非特异性结合，在捕捉步骤前添加20mM咪唑。用MES缓冲液(50mM MES,1M NaCl,pH 6.5)和Tris缓冲液(50mM Tris,50mM NaCl pH 8)清洗蛋白质，并且用直至Tris缓冲液中的500mM咪唑的梯度洗脱。抛光步骤由用PBS(LifeTechnologies)使用Superdex 75(GE Healthcare)的大小排阻层析(SEC)组成。在通过超滤浓缩后，将蛋白质无菌过滤(0.2μm)，等分取样，并且于-80℃贮存。通过测量280nm的吸光度测定蛋白质浓度。通过分析SEC、SDS-PAGE和质谱术完成进一步的质量控制。

实例15：融合分子的稳定性评估

为了测定熔解温度作为总体稳定性的一般指标，以PBS(Gibco)中的1mg/ml蛋白质浓度使用SEQ ID NO:134的铁载体特异性融合分子和单一脂笼蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:16、36、53和62)，并且使用毛细管nanoDSC仪(CSC6300,TA Instruments)以1℃/min的增量在25-100℃的温度范围中扫描。使用集成Nano Analyze软件从展示的热分析图计算熔解温度(Tm)。下文表9中列出了所得的熔解温度及熔解的开始。

表9：如通过nanoDSC对单一脂笼蛋白突变蛋白和对铜绿假单胞菌铁载体特异性的融合分子测定的Tm和熔解的开始。

熔解的开始对于单一脂笼蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:16、36、53和62)为61-67℃，并且对于融合分子(SEQ ID NO:134)为57℃。熔解温度对于单一脂笼蛋白突变蛋白(SEQ IDNO:16、36、53和62)为66-76℃，并且对于融合分子(SEQ ID NO:134)为64/66℃。虽然与单一脂笼蛋白突变蛋白相比，熔解的开始和熔解温度对于融合分子略低，但是它在融合分子和单一脂笼蛋白突变蛋白之间是相当的，并且指示蛋白质的良好稳定性。

为了评估贮存和冷冻/融化稳定性，将PBS中的1mg/ml浓度的SEQ ID NO:134的融合分子或SEQ ID NO:136的Fc-融合分子在37℃或42℃温育1周或者经历三个冷冻/融化循环。在定量ECL测定背景中测量活性融合分子浓度。采用如实例8中描述的三种不同同时结合形式来检查同时结合每种绿脓菌荧光素(I、II和III)和绿脓菌螯铁蛋白的能力。在分析性大小排阻层析中测量单体蛋白质的峰面积。

对于如实例9中描述的定量ECL-测定法，制备包括通常范围为0.1-5000ng/mL的11个稀释度的校正曲线，并且对于每个样品，制备在校正曲线的线性范围内的三个不同的独立稀释度。将任选补充有1％人血浆的封闭缓冲液用于稀释。使用4参数逻辑(4PL)非线性回归模型拟合校正曲线，并且用于计算测试样品的活性蛋白质浓度。相对于在相同浓度并且在相同基质中贮存的非应激样品(unstressed sample)参照测定的活性蛋白质浓度。

以0.3mL/min的流速使用PBS(Gibco)作为洗脱液在具有成行的两个Superdex 755/150GL柱(GE Healthcare)的Agilent HPLC系统上进行分析大小排阻层析。使用WinGPCUnichrom GPC/SEC软件(PSS：Polymer Standards Service-USA Inc.)计算应激样品和非应激参照的单体峰面积。以回收率＝单体峰面积样品/单体峰面积参照计算单体峰面积的回收率。为了评估血浆中的贮存稳定性，将0.5mg/ml浓度的融合分子和Fc-融合分子在人血浆中于37℃温育1周。在如上文描述的定量ECL测定背景中测量活性融合分子的浓度。

下文表10中显示了SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:136的构建体的数据。融合分子和Fc-融合分子构建体在所有测试条件下展现出高稳定性。

实例16：在基于ELISA的背景中测定的融合分子对铜绿假单胞菌铁载体的亲和力

通过“溶液结合ELISA”测定个别的突变蛋白、融合分子或Fc-融合分子的溶液结合，所述溶液结合ELISA的原理如下：将恒定浓度的测试的个别突变蛋白或融合分子构建体与各个浓度的配体(Pvd I s、sa、aKG+/-Fe/Pvd II s、sa、aKG+/-Fe/Pvd III s、sa、aKG+/-Fe/Pch+/-Fe)一起温育1小时。在溶液中的此预温育后，将突变蛋白/配体混合物的等分试样转移到具有经由中性亲合素固定化的生物素化的Pvd I s(+Fe)、Pvd II s(+Fe)、PvdIII s(+Fe)或Pch的ELISA板以测量剩余浓度的游离的突变蛋白或融合分子构建体。经由定量ELISA设置测定游离的(非配体结合的)突变蛋白或融合分子构建体的浓度。

详细地，于4℃用20μl在PBS中的5μg/ml浓度的中性亲合素涂覆适合于荧光测量的384孔板(Greiner FLUOTRAC^TM600，黑色平底，高结合)过夜。在清洗后，在室温用100μl含有0.1％Tween 20和2％BSA的封闭缓冲液(PBS-T/BSA)封闭经中性亲合素涂覆的孔达1小时。再次清洗后，在室温添加20μl在封闭缓冲液中的浓度1μg/mL的生物素化的绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白达1小时，并且除去过量的试剂。将固定浓度的突变蛋白或融合分子构建体与使用合适的起始浓度的不同浓度的配体(Pvd I s、sa、aKG+/-Fe/Pvd II s、sa、aKG+/-Fe/Pvd III s、sa、aKG+/-Fe/Pch+/-Fe)在溶液中一起温育，所述合适的起始浓度以1:3比率在PBS-T/BSA中连续向下稀释到皮摩尔范围。在室温温育1小时后，将20μl反应混合物转移到384孔板，所述384孔板上固定化生物素化的绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白以在室温捕捉未结合的(游离的)突变蛋白或融合分子构建体达20分钟。为了允许将ELISA读出结果转化为绝对游离突变蛋白/融合分子构建体浓度，在PBS-T/BSA中制备含有不同浓度的突变蛋白/融合分子构建体的标准曲线，并且也在相同ELISA板上温育20分钟。

弃去残留的上清液，并且以PBS-T/BSA中的预先确定的最佳浓度添加20μl经HRP标记的抗hNGAL抗体，并且在室温温育1小时。已经通过用突变蛋白的混合物免疫兔获得抗hNGAL抗体，随后使用试剂盒(EZ-link Plus Activated Peroxidase,Thermo Scientific)根据制造商的用法说明与HRP偶联，以获得抗体-HRP缀合物。在清洗后，对每个孔添加20μl荧光HRP底物(QuantaBlu,Thermo)，并且允许反应进行15至60分钟。使用荧光微板读板仪(Tecan或Molecular Devices)读取板上的每个孔的荧光强度。为了评估数据，游离的突变蛋白或融合分子构建体浓度，c(突变蛋白/融合分子)_游离基于标准曲线结果计算，并且相对于配体浓度，c(配体)绘图。通过用单一位点结合模型的非线性回归拟合IC₅₀值。使用GraphPad Prism4软件进行曲线拟合。

表11中汇总了所得的IC₅₀值。融合分子和Fc-融合分子与个别的突变蛋白以实际上相同的亲和力结合所有相应的铁载体。

表11：融合分子、具有与Fc域的N端融合的脂笼蛋白突变蛋白的Fc-融合分子蛋白、和单一脂笼蛋白突变蛋白对溶液中的靶物的结合。使用追踪浓度的0.1nM脂笼蛋白突变蛋白或融合分子(对于SEQ ID NO:16为0.2nM)，因此，测定法灵敏性不受限制。Pvdx：Pvd I、Pvd II、Pvd III。

融合分子和Fc-融合分子构建体以subnM或2nM范围中的IC₅₀值结合Pvd靶物，以IC₅₀<10nM结合加载有铁的Pch，并且以IC₅₀<50nM结合没有铁的Pch，这与相应的单一脂笼蛋白突变蛋白的IC₅₀值相当，如对Pvdx s(+Fe)和绿脓菌螯铁蛋白(+/-Fe)例示性显示，证明了个别脂笼蛋白突变蛋白的结合效力在融合分子形式中完全保持。

实例17：在基于ELISA的背景中测定的不同融合分子形式的结合效力的比较

在与实例5中描述的测定法相当的溶液结合测定法中测试与含有的个别的脂笼蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:34、17、50和63)相比SEQ ID NO:137、138和139的Fc-融合分子构建体(参见实例1和图10B、C和D)对溶液中的相应的铁载体组(Pvd Is(+Fe)、Pvd IIs(+Fe)、Pvd IIIs(+Fe)和Pch)的结合。

如表12和图12中显示，对于个别的脂笼蛋白突变蛋白和不同的Fc-融合分子形式，所得的IC₅₀值是相当的。

表12：Fc-融合分子蛋白和单一脂笼蛋白突变蛋白对溶液中的相应靶物的结合。使用示踪浓度的0.1nM或0.2nM Fc-融合分子或脂笼蛋白突变蛋白，因此，测定法灵敏性不受限制。使用Pvd I、Pvd II和Pvd III的加载有铁的琥珀酰基变体作为相应绿脓菌荧光素组的代表。

实例18：在Biacore测定法中测定的融合分子结合铜绿假单胞菌铁载体的亲和力

在基于表面等离振子共振(SPR)的测定法中，使用Biacore T200仪器(GEHealthcare)测量个别的突变蛋白或融合分子对绿脓菌荧光素铁载体(对具有复合铁离子的绿脓菌荧光素I琥珀酰基、-琥珀酸酰胺、-α-酮戊二酰或对具有复合铁离子的绿脓菌荧光素II琥珀酰基、-琥珀酸酰胺、-α-酮戊二酰或对具有复合铁离子的绿脓菌荧光素III琥珀酰基、-琥珀酸酰胺、-α-酮戊二酰)的结合亲和力。为此，应用适当过量的EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo,Cat#21329)，在室温将为了结合绿脓菌荧光素选择的突变蛋白(SEQ IDNO:16、36、53)、融合分子(SEQ ID NO:134)和阴性对照(SEQ ID NO:64)生物素化2小时，接着使用Zeba旋转脱盐板(Thermo,Cat#21329)根据制造商的说明分离未反应的生物素。

在SPR亲和测定法中，使用Biotin CAPture试剂盒(GE Healthcare)在传感器芯片CAP上捕捉生物素化的突变蛋白和阴性对照，其中传感器芯片CAP预先固定化有ssDNA寡聚物。以2μl/分钟的流速应用未稀释的生物素CAPture试剂(与互补的ss-DNA寡聚物缀合的链霉亲合素)达300秒。随后，以5μl/分钟的流速应用20μg/ml至100μg/mL生物素化的突变蛋白或融合分子阴性对照达300秒。仅用生物素CAPture试剂加载参照通道。为了测定结合亲和力，在HBS-EP+缓冲液(GE Healthcare)中制备相应的Pvd的4个稀释，并且应用于芯片表面。应用30μl/分钟的流速，以180秒的样品接触时间和1800-2400s的解离时间使用单一循环动力学方法。使用高浓度1200nM的相应Pvd确认对SEQ ID NO:64阴性对照结合的缺乏。在配体固定化后，在监测解离前以升序连续应用4个浓度的Pvd。在25℃进行所有测量。用6M Gua-HCl及0.25M NaOH的注射实现传感器芯片表面的再生，接着是用运行缓冲液的额外清洗和120秒的稳定期。用Biacore T200评估软件(V 1.0)评估数据。进行双重参照。使用1:1结合模型拟合原始数据。另外，通过将高浓度(≥1μM)的以下分析物应用于固定化融合分子使用上文描述的测定法确认对不由铜绿假单胞菌生成的各种铁载体和对MMP-9的结合的缺乏：Fe-肠菌素、去铁胺、MMP-9原形和活化的MMP-9。

用于测定脂笼蛋白突变蛋白对绿脓菌螯铁蛋白的亲和力的Biacore分析

为了测定突变蛋白SEQ ID NO:62与pch+Fe的相互作用的动力学常数和所得的K_D，使用标准胺化学将突变蛋白或阴性对照(SEQ ID NO:64)固定化到CM5芯片的表面：使用EDC和NHS活化芯片的表面。随后，以10μl/min的流速应用10mM乙酸盐pH 4.0中的5μg/mL突变蛋白或阴性对照溶液，直至达到约2000RU的高固定化水平。用乙醇胺淬灭残留的活化基团。在乙醇胺后用EDC/NHS处理参照通道(空白固定化)。为了测定亲和力，在HBS-P+缓冲液中制备绿脓菌螯铁蛋白(+/-Fe)的4至5个稀释，并且应用于准备好的芯片表面。以180s的接触时间，1500-1800s的解离时间并且应用30μl/min的流速实施结合测定法。在25℃进行测量。通过连续三次注射10mM Gly-HCl pH 1.5(120s)实现固定化的突变蛋白表面的再生，接着是用运行缓冲液的额外清洗和稳定期。用Biacore T200评估软件(V 1.0)评估数据。进行双重参照。使用1:1结合模型拟合原始数据。使用相同测定法，通过将高浓度(≥1μM)的以下分析物应用于固定化的SEQ ID NO:62的突变蛋白确认对与绿脓菌螯铁蛋白不同的铁载体和对MMP-9的结合的缺乏：Fe-肠菌素、去铁胺、绿脓菌荧光素、MMP-9原形和活化的MMP-9。

用于检测融合分子对绿脓菌螯铁蛋白的结合的Biacore分析。

使用Series S传感器芯片NTA和NTA试剂套盒(都是GE Healthcare)在基于SPR的测定法中清楚证明了绿脓菌螯铁蛋白对捕获的SEQ ID NO:134融合分子的特异性结合。经由加载有Ni²⁺的NTA捕捉加有His的融合分子(SEQ ID NO:134)和加有His标签的脂笼蛋白突变蛋白(结合Pvd II的SEQ ID NO:16和结合PvdII的SEQ ID NO:53，两者都用作阴性对照)。使用绿脓菌螯铁蛋白作为分析物。虽然绿脓菌螯铁蛋白(+/-Fe)的结合明显可检出，并且传感图与绿脓菌螯铁蛋白对共价固定化突变蛋白SEQ ID NO:62的结合是相当可比的，但是由于制备的表面的不稳定性(捕获的融合分子从镍-NTA芯片解离)而不能测定动力学常数。

下文表13中汇总了融合分子和相应的单一脂笼蛋白突变蛋白的不同Biacore分析的结果。

表13：在针对相应的靶物的Biacore测定法和特异性测试中评估的动力学常数。Pvd x：Pvd I、Pvd II、Pvd III。

在针对Pvd I s+Fe、Pvd II s+Fe和Pvd III s+Fe的融合分子和脂笼蛋白突变蛋白的Biacore测定法中测量的亲和力是相当的。针对所有Pvd亚型的SEQ ID NO:134融合分子的Biacore中测量的亲和力在亚纳摩尔至单数位纳摩尔范围中，并且也与实例5中描述的溶液结合ELISA中测定的IC₅₀值相当。此外，对具有和没有结合铁的绿脓菌荧光素靶物的结合亲和力是相似的。SEQ ID NO:134融合分子对绿脓菌螯铁蛋白的结合在经由Ni-NTA捕捉加有His标签的SEQ ID NO:134融合分子的Biacore测定法中可检出，但是由于高漂移，不能测定准确的K_D。设立SPR测定法以检测对小有机靶物，如绿脓菌螯铁蛋白的结合的考验并不是预料不到的。特异性评估确认SEQ ID NO:134的融合分子和SEQ ID NO:16、36、53和62的单一脂笼蛋白突变蛋白特异性结合其靶物而不结合其它铁载体，即Fe-肠菌素和去铁胺或MMP-9蛋白。用作Fe-肠菌素阳性对照的SEQ ID NO:1和64的脂笼蛋白突变蛋白显示对用作MMP-9阳性对照的天然配体Fe-肠菌素和MMP-9特异性抗体的结合，显示对MMP-9的结合。SEQID NO:64没有显示对绿脓菌荧光素或绿脓菌螯铁蛋白的结合(数据未显示)。

实例19：融合分子对绿脓菌荧光素和绿脓菌螯铁蛋白的同时结合

在Meso Scale发现(MSD)平台上进行的电化学发光(ECL)测定法中显示了融合分子(SEQ ID NO:134)一次对相应的4种相应的靶物组的两种代表性靶物(绿脓菌荧光素I琥珀酰基(+Fe)和绿脓菌螯铁蛋白、绿脓菌荧光素II琥珀酰基(+Fe)和绿脓菌螯铁蛋白或绿脓菌荧光素III琥珀酰基(+Fe)和绿脓菌螯铁蛋白)的同时结合。简言之，经由中性亲合素在MSD板上捕获相应的生物素化的绿脓菌荧光素，并且添加可变浓度的融合分子。用经Sulfo-tag标记的绿脓菌螯铁蛋白检测结合的融合分子。

除非另外详明，在室温在以300rpm摇动的情况下将所有温育步骤进行1小时，并且在每个温育步骤后使用Biotek ELx405Select CW清洗器用80μL PBST缓冲液(PBS pH7.4,0.05％Tween 20)清洗板5次。测定缓冲液是PBST/BSA(PBS pH7.4,0.1％Tween 20,2％BSA)。在4℃用PBS中的5μg/mL浓度的20μL中性亲合素涂覆384孔MSD板(L25XA,Meso ScaleDiscovery)过夜。在清洗后，用60μL封闭缓冲液(PBST/BSA)封闭经涂覆的孔，并且添加0.2μg/mL浓度的生物素化的绿脓菌荧光素，并且在进一步清洗步骤后温育。将融合分子的浓度调节到5μg/mL，然后以1:3比率在PBS-T/BSA中连续稀释溶液。将20μL体积的稀释液转移到384孔板，并且允许结合1小时。在温育后，弃去残留的上清液，并且添加20μL在PBS-T/BSA中的0.1μg/mL的经Sulfo-tag标记的绿脓菌螯铁蛋白，并且温育1小时。在清洗后，添加35μL具有表面活性剂(R92TC,Meso Scale Discovery)的2x浓缩的MSD读取缓冲液T，并且在15分钟内在Sector Imager 2400读取器(MSD)上测量板。相对于融合分子浓度绘图ECL信号，并且使用Prism Graphpad 5中的单一位点结合模型拟合。对于结合亲和力，所得的EC₅₀值不是代表性的。

可以检出融合分子对相应绿脓菌荧光素类型的代表(Pvd I s(+Fe)、Pvd II s(+Fe)和Pvd III s(+Fe))中的每个和绿脓菌螯铁蛋白的同时结合。图13中显示了所得的结合曲线。

实例20：融合分子对铜绿假单胞菌铁载体的结合的功能测试：抑制铁摄取

为了测定活细菌中的功能性铁摄取抑制，将剂量范围浓度的SEQ ID NO:134融合分子与Tris-HCl 50mM pH 8.0缓冲液中的100nM加载有放射性铁的铁载体一起温育1小时，之后在96孔板中与595nm终浓度OD＝1的细菌一起温育30分钟。随后，用细胞采集器将细菌过滤流过用5％聚乙烯亚胺溶液预温育的96孔板GF/B滤器，并且用5％BSA溶液清洗3次。在过滤和干燥后，在计数前在每个滤器孔中添加30μl闪烁混合物。对加载有铁的绿脓菌荧光素，以在200μM最终溶液中的4比1比率的绿脓菌荧光素和铁将铁载体与Tris缓冲液中的55Fe-Cl3一起温育15分钟。为了给绿脓菌螯铁蛋白加载放射性铁，将40μl在HCl 0.5N中的0.25mM 55FeCl3溶液添加到1mM的绿脓菌螯铁蛋白的甲醇溶液。在15分钟温育时间后，添加940μl Tris HCl 50mM pH 8.0以获得具有绿脓菌螯铁蛋白和铁之间的2比1比率的20μM55Fe-Pch溶液。如下制备细菌：将10ml与分离的克隆一起温育的Mueller Hinton培养基中的过夜培养物离心，并且将清洗过的团粒在25ml琥珀酸盐培养基中重悬，并且在摇动下温育2小时。平行地，给20ml Mueller Hinton培养基接种5ml过夜培养物，并且在摇动下温育2小时以用作背景铁摄取水平。然后，离心25ml细菌培养物，并且用相应的培养基清洗，之后将团粒在Tris.HCL 50mM pH8.0缓冲液中重悬，并且测量595nm的OD以在测定法中具有OD＝1的终浓度。对每个浓度点计算掺入百分比，并且用内部软件计算抑制。对于此计算，铁摄取的最大水平基于没有任何融合分子的基本琥珀酸盐培养基中获得的数值，并且在不表达铁载体受体的丰富的Mueller Hinton培养基中获得背景数值。

融合分子在活细胞中有效阻断铁摄取(参见表14和表15)。它与单一脂笼蛋白突变蛋白显示相当的对铁摄取的抑制，并且IC₅₀数值在100-200nM范围中(表14)。单一脂笼蛋白突变蛋白仅可以阻断表达相应绿脓菌荧光素组的铜绿假单胞菌菌株的铁摄取，即SEQ IDNO:16仅可以阻断表达组I的绿脓菌荧光素的铜绿假单胞菌菌株中的铁摄取，SEQ ID NO:36仅可以阻断表达组II的绿脓菌荧光素的铜绿假单胞菌菌株中的铁摄取，并且SEQ ID NO:53仅可以阻断表达组III的绿脓菌荧光素的铜绿假单胞菌菌株中的铁摄取。SEQ ID NO:62仅可以阻断由绿脓菌螯铁蛋白介导的铜绿假单胞菌菌株中的铁摄取。然而，融合分子蛋白质可以阻断所有铜绿假单胞菌菌株中的铁摄取，即SEQ ID NO:134可阻断Pvd I、II和III表达菌株中的铁摄取以及由绿脓菌螯铁蛋白介导的铁摄取。

表14：融合分子和单一脂笼蛋白突变蛋白在相同IC₅₀范围中阻断铜绿假单胞菌菌株的铁摄取。

表15：融合分子阻断活细菌细胞中的铁摄取。

实例21：融合分子对铜绿假单胞菌铁载体的结合的功能测试：生长抑制

通过在具有透明底部的黑色96孔板中将补充有痕量元素溶液和0.1mg/ml BSA的经Chelex处理的琥珀酸盐培养基中的结合铜绿假单胞菌铁载体的SEQ ID NO:134融合分子与以595nm的最终OD为0.05稀释的MS细菌培养物一起温育测定细菌生长抑制。于37℃将板温育过夜，每20分钟摇动，并且在来自Thermo Labsystem的IEMS读取器MF中在595nm读取OD。

在图14A至D中，对不同绿脓菌荧光素类型铜绿假单胞菌菌株(Pvd I菌株、Pvd II菌株和Pvd III菌株)和对pvdA基因缺失的菌株例示性显示生长抑制以证明对绿脓菌螯铁蛋白介导的铁摄取的抑制。对照是在缺乏脂笼蛋白突变蛋白的情况下的细菌生长。

融合分子能够抑制测试的每个单一铜绿假单胞菌菌株的生长。

实例22：融合分子的体内效力

通过传代培养到新鲜的血液琼脂板上并且在37℃温育过夜从于-80℃的长期贮存恢复铜绿假单胞菌PA01。通过从培养板挑出5-10个独特的菌落制备接种物，接着在10mLMuller-Hinton培养液中悬浮。以300rpm和37℃在定轨摇动器上将培养物温育18小时。在PBS中清洗培养物两次，，然后在PBS中重悬团粒，并且调节到600nm的光密度0.669(约1.2x10⁹CFU/mL)。将这进一步稀释以给出6x10⁷CFU/mL的接种物浓度。将1mL此接种物添加到30mL细菌学琼脂，用于制备琼脂糖珠(Cash H.A.等,1979)。琼脂糖珠中的PA01的终浓度是2x 10⁶CFU/mL(每50μL接种物为1x 10⁵CFU)。在主要研究前在3只大鼠中测试接种物的感染性，并且与先前的模型相似，在感染后48小时时实现5x10⁶CFU/克肺组织的组织负荷。

本研究中使用的Sprague Dawley大鼠由Charles River Laboratories UK供应。大鼠在递送时为200-225g，并且是无特定病原体的。在到达后，允许大鼠在开始研究前驯化至少7天。大鼠在开始研究时是250-300g。将大鼠按组收容在无菌个别通风的笼中，使动物一直暴露于经HEPA过滤的无菌空气。大鼠自由获取食物和水(无菌)，并且具有无菌白洋木屑衬垫(每3-4天或在适当时更换)。室温是22℃±1℃，相对湿度为50-60％和最大背景噪音为56dB。以黎明/黄昏阶段将大鼠暴露于12小时光照/黑暗循环。在UK内政部许可证下并且在地方伦理委员会许可的情况下进行所有动物研究。所有研究由技术人员进行，所述技术人员已经完成UK内政部个人许可证课程的1、2和3部分，并且持有目前的个人许可证。

以1x 10⁵CFU/大鼠用50μL PA01包埋珠在气管内感染深度麻醉的大鼠。用无菌珠浆体接种未感染的对照大鼠。在感染后3天启动处理，并且在感染后第3天、第4天、第5天、第6天、第7天和第8天对动物给药。一天两次(一日二次，BD)静脉内(IV)施用融合分子(SEQ IDNO:134；RA10680550)，两剂之间有5小时时间间隔。以12小时时间间隔IV BD施用妥布霉素。在感染后第3、5、7、9和15天对动物实施安乐死。在第3天、第5天和第7天，在第一剂处理后4小时对动物实施安乐死。从第9天起，在已经给予第一剂处理时对动物实施安乐死。在安乐死后，收集支气管肺泡灌洗(BAL)，并且取出肺，用于细菌菌落形成单位(CFU)和白细胞计数和细胞因子/炎性标志物分析。

融合分子单一疗法与相应的媒介物组相比显示显著的效力，并且在大多数情况中到感染后第7天清除组织负荷(图15)。

20mg/kg/剂的妥布霉素从感染后第5天开始清除感染。用融合分子和妥布霉素的联合疗法诱导加速的肺负荷清除，指示融合分子对妥布霉素活性没有拮抗影响(图15)。

融合分子单一疗法显示抗炎特性，降低总白细胞计数和单核细胞和嗜中性粒细胞的绝对数目两者(图16)。融合分子单一疗法比媒介物或妥布霉素单一疗法显著更有效，提示了融合分子比妥布霉素更具抗炎性。在组合组中看到相似的结果，但是融合分子单一疗法数据表明驱动由联合疗法引起的抗炎效果的是融合分子而非妥布霉素。

实例23：在铜绿假单胞菌的肺定居的小鼠模型中融合分子对群体感应转录物降低的体内效用。

于37℃在旋转的摇动的水浴中在胰蛋白酶大豆培养液(BiomerieuxLaboratories,Lyon,France)中培养铜绿假单胞菌PA01达8小时。通过分光光度术将接种物校准为1x10⁹个菌落形成单位(cfu)/ml，然后在琼脂珠中俘获病原体。

在受保护的单元中维持购自Charles River Laboratories(Domaine desoncins,L’Arbresle,France)的雄性C57BL/6小鼠(8周龄)。在里尔机构动物护理和使用委员会(Lille Institutional Animal Care and Use Committee)的批准下进行所有实验。用七氟醚吸入(Abbott,UK)麻醉小鼠，并且以背斜靠放置。使用24-G动物喂食针的经气管插入以滴注60μl琼脂糖珠制备物(2x10⁵cfu/小鼠)。

感染后1小时(定居的早期阶段)或48小时(定居的晚期阶段)启动处理，并且以5小时时间间隔一天两次腹膜内(ip)对动物给药达2天。

感染后48小时(对于早期阶段)或96小时(对于晚期阶段)时，对小鼠实施安乐死，并且收集肺以提取RNA。在逆转录后，通过qPCR分析进行ExoA、Alginate和RhL的基因表达。

融合分子(SEQ ID NO:134；RA10680550)防止细菌抵抗宿主免疫应答的能力，从而阻断毒力因子表达。融合分子处理在定居的早期阶段期间诱导群体感应的三种主要基因的显著降低(图17A)。对于rhII，此效应即使在建立的定居中也得到维持(图17B)。这些数据证明了融合分子防止细菌抵抗宿主免疫应答的能力，从而阻断毒力因子表达的效力。

实例24：接头分子长度对融合分子的结合能力的影响

对于融合分子设计，测试不同接头分子长度和接头分子组成。更具体地，测试范围为(G4S)₂肽接头(10个氨基酸)下到作为接头的单一甘氨酸的接头长度，并且发现对单一靶物的结合没有影响或仅具有微小的影响(图18)。可以假设长度为超过10个氨基酸的肽接头对融合分子的结合能力也将没有负面影响。

实例25：菌株、化合物、培养基和生长条件

铜绿假单胞菌菌株ATCC15692/PA01(绿脓菌荧光素I铁型(siderotype)),ATCC27853(绿脓菌荧光素II铁型和ATCC33360(绿脓菌荧光素III铁型)从美国典型培养物保藏中心获得，并且按指示维持。测试的化合物是SEQ ID NO:136的Fc-融合分子(又称为SAR439349或RA10680578)或非结合对照Fc-融合分子(RA11043715)。除非另有规定，在如下制备的经处理的琥珀酸盐培养基(C-MS)中培养细菌：用K₂HPO₄：6g/L，KH₂PO₄：3g/l，(NH₄)₂SO₄：1g/L，MgSO₄.7H₂O：0.2g/L，和琥珀酸钠：4g/L制备琥珀酸盐培养基；然后在室温以50g/L添加(Biorad)达5小时，之后使用0.22μM膜过滤。

对于每个实验，在摇动的情况下于37℃在C-MS中在细胞培养管中过夜培养从胰蛋白酶大豆琼脂板挑出的铜绿假单胞菌的各种菌株的单菌落。离心过夜培养物以消除存在于生长培养基中的绿脓菌荧光素。然后，重悬细菌团粒，并且在新鲜的C-MS培养基中稀释为5.10⁵cfu/mL的密度，并且在96孔板中在摇动的情况下在37℃培养箱中一式两份或一式三份培养。使用以下公式从600nm的光密度(OD600nm)近似cfu/mL的数值：0.125OD600nm单位＝1.5x10⁸cfu/mL。

实例26：在存在Fc-融合分子的情况下绿脓菌荧光素生成的动力学

单独(未处理对照)或在存在各个剂量的Fc-融合分子(SEQ ID NO:136)或对照Fc-融合分子的情况下在总体积200μL中一式两份在96孔板中培养如实例25中描述的那样制备的细菌达24小时。在各个时间时，以405nm的激发波长和460nm的发射波长使用微板读板仪(Enspire,Perkin Elmer Instruments)在板中直接测量培养物中的绿脓菌荧光素荧光，如之前描述(Wilderman等,2001,Infect Immun.,69(9),p.5385-94)。同时，通过测量OD600nm(其被转化为cfu/mL)评估细菌生物量。用铜绿假单胞菌的ATCC15692、ATCC27853和ATCC33360菌株中的每种将实验再现至少5次。

为了呈现原始数据，对于ATCC27853，分别在图19A和19B中；对于ATCC15692，分别在图19C和19D中和对于ATCC33360，分别在图19E和19F中对未处理的对照和用两种化合物的处理(用剂量-响应)给出代表性实验的cfu/ml和荧光任意单位数值的均值和s.e.m.。为了说明化合物对生物量的影响(其可以解释绿脓菌荧光素水平的差异)，用每个时间点时绿脓菌荧光素的荧光的平均量除以相应的平均值OD600nm。然后，相对于未处理对照的绿脓菌荧光素荧光的相对量标准化这些相对量。对于ATCC27853、ATCC15692和ATCC33360，图20A、20B、20C中分别显示了标准化的相对量。一式三份进行实验两次，并且代表均值和s.e.m.。进行相对于未处理对照的单因素ANOVA和Dunnett后检验以确定用Fc-融合分子的处理的影响(*p<0.05,**p^>0.01,***p<0.001)。另外，将点拟合到标准剂量-响应曲线，并且对于ATCC27853、ATCC15692和ATCC33360分别产生0.04mg/mL、0.11mg/mL和0.8mg/mL的IC₅₀值。

通过测量菌株ATCC27853的培养物的荧光，和如实例25中描述的那样培养的ATCC27853的pvdA/pchD双重突变体菌株的培养物的荧光确认荧光信号对绿脓菌荧光素的特异性。作为图21中显示的此实验中获得的荧光的均值数值，不能合成这些铁载体的突变体菌株没有展现出任何荧光信号。为了标准化荧光信号，在荧光信号采集前使用从野生型ATCC27853的上清液获得的纯化的绿脓菌荧光素II掺入培养物，并且获得校正曲线，如图22中通过此实验中获得的荧光的均值数值显示。另外，为了确认在存在Fc-融合分子的情况下荧光信号的下降不是由于化合物结合绿脓菌荧光素后的荧光淬灭所致，将Fc-融合分子即时添加到含有绿脓菌荧光素的培养上清液(用ATCC27853的过滤的24小时培养物获得)，并且立即和在24小时后读取荧光。如具有此实验中观察到的荧光的均值数值的图23中显示，没有观察到荧光淬灭。

总之，这些实验显示了测量的荧光明确是由于绿脓菌荧光素存在所致，并且用Fc-融合分子处理后观察到的荧光的下降是由于化合物阻止铁饥饿培养基中指数生长的细菌的绿脓菌荧光素生成。此外，此现象是稳固的，并且在所有三种铁型的代表性菌株中看到。

实例27：在存在Fc-融合分子的情况下的生长的动力学

单独(未处理对照)或在存在0.1或1mg/mL Fc-融合分子(SEQ ID NO:136)或非结合对照Fc-融合分子的情况下在总体积200μL中一式两份在96孔板中培养如实例25中描述的那样制备的细菌达24小时。每30分钟，在板中直接测量OD600nm，并且转化为cfu/mL。用各种铜绿假单胞菌菌株将实验再现5次，并且图24A和24B中以cfu/mL的均值和s.e.m.分别显示了例示1mg/mL处理对ATCC15692和ATCC33360的影响的代表性实验。计算生长曲线的指数阶段的生长速率，并且在表16中呈现为Δcfu.mL^-1.Δh^-1。

表16：经Fc-融合分子处理的细菌的生长曲线的指数阶段的生长速率。

总体上，这些结果显示了Fc-融合分子特异性减慢了铁饥饿培养基中的细菌的指数生长，并且在所有三种铁型的代表性菌株中看到此现象。

还针对铜绿假单胞菌的5种新近的VAP临床隔离群，测试了10μM的另一种融合分子(RA10680550；SEQ ID NO:134)对C-MS培养基中的细菌生长的影响，并且在所有5种情况中，观察到指数生长的斜率的降低。

实例28：Fc-融合分子对pchD启动子活性的影响

已经显示了绿脓菌螯铁蛋白生物合成基因表达受到结合有铁的绿脓菌螯铁蛋白正调节，所述结合有铁的绿脓菌螯铁蛋白在转录水平上经由PchR调节物起作用(Heinrichs等,1996,J Bacteriol.,178(9),p.2586-92)。为了测试Fc-融合分子对绿脓菌螯铁蛋白生物合成基因表达的影响，在pchD启动子的控制下克隆合成luxCDABE操纵子，并且在ATCC33360的染色体中插入PpchD::lux融合物。

为了测量pchD启动子活性，单独(未处理对照)或在存在0.1或1mg/mL Fc-融合分子(SEQ ID NO:136)或非结合对照Fc-融合分子的情况下和在存在各种量的FeCl₃的情况下在总体积200μL中一式两份在96孔板中在摇动的情况下在37℃培养箱中培养携带PpchD::lux融合物的ATCC33360达24小时。在24小时生长后，使用微板读板仪(Enspire,PerkinElmer Instruments)在板中直接测量发光。

在一式三份进行的3个独立实验中评估铁浓度对Ppchd转录活性的影响，并且代表性实验在图25中以观察到的发光的均值和s.e.m.显示。如预期，pchD启动子表达在没有铁添加的C-MS培养基中被诱导，并且通过铁添加被阻遏。这确认报告物融合物的功能性。

在一式三份进行的单一实验中评估在存在各种量的补充铁的情况下Fc-融合分子处理对Ppchd转录活性的影响，并且在图26中以观察到的发光的均值和s.e.m.显示了结果。它显示了此启动子活性的活性在存在Fc-融合分子的情况下被消除，不管补充的铁的量如何，而对照Fc-融合分子没有影响。

测试了一定剂量范围的Fc-融合分子或对照Fc-融合分子对PpchD转录活性的影响，在一式三份进行的3个实验中没有补充铁。在每个实验中，相对于未处理的对照标准化荧光素酶活性的量。在图27中显示了这3个实验中获得的观察到的发光的均值和s.e.m.。将点拟合到标准剂量-响应曲线，并且对于Fc-融合分子产生0.03mg/mL的IC₅₀值(95％CI:0.02-0.05)，并且对于同型对照Fc-融合分子未限定。

总体上，这些结果显示了Fc-融合分子在铁饥饿培养基中特异性防止通常由结合有铁的绿脓菌螯铁蛋白转导的信号。这应当导致减少的此铁载体的量，如用绿脓菌荧光素观察到的。相反，由于已经显示了绿脓菌荧光素自身对绿脓菌荧光素合成的相似的正调节(Lamont等,2000,Proc Natl Acad Sci U S A,99(10),p.7072-7)，吸引人的是推测上文看到的Fc-融合分子对绿脓菌荧光素生成的影响是由于阻断绿脓菌荧光素介导的信号传导。还知道铁载体介导的信号传导影响毒力因子的合成(Lamont等,2000,Proc Natl Acad SciU S A,99(10),p.7072-7)，并且因此预期Fc-融合分子会影响毒力。

序列表

<110> Sanofi (赛诺菲)

<120> 融合分子

<130> DE2015/080

<150> EP 15 306 106.4

<151> 2015年7月7日

<160> 186

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<213> 人工序列

<220>

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Pro Lys Met Pro Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Asp Val Gln Phe Pro Asp Lys Lys Cys Ile Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Ile Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gly

85 90 95

Ile Lys Ser Asn Pro Gly Asp Thr Ser His Leu Val Arg Val Val Ser

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Asn Arg Glu Gly Phe Asn Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

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Asp Gly

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<213> 人工序列

<220>

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1 5 10 15

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20 25 30

Val Val Gly Trp Ala Gly Asn Thr Thr Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

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65 70 75 80

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Ile Lys Ser Asn Pro Gly Glu Thr Ser His Leu Val Arg Val Met Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Tyr Val Asp Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Gly Phe Asn Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

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145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

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Asp Gly

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<211> 178

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<213> 人工序列

<220>

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1 5 10 15

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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165 170 175

Asp Gly

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<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Asp Gly

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<211> 178

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<213> 人工序列

<220>

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1 5 10 15

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20 25 30

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Asp Gly

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<213> 人工序列

<220>

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20 25 30

Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Trp Leu Arg Glu Asp Glu Asp Pro

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Asn Val Thr Val Val Asp Phe Glu Leu Glu Glu Cys Arg Tyr Met Thr

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100 105 110

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165 170 175

Asp Gly

<210> 15

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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165 170 175

Asp Gly

<210> 16

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0544.04C04_H28Q_N65D

<400> 16

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Trp Ala Gly Asn Thr Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

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165 170 175

Asp Gly

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<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Trp Leu Arg Glu Asp Glu Asp Pro

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165 170 175

Asp Gly

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<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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1 5 10 15

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65 70 75 80

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Asp Gly

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<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

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Val Val Gly Val Ala Gly Asn Glu Val Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

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Asn Val Thr Glu Val Arg Phe His Asn Lys Lys Cys Asn Tyr Ser Ile

65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 20

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S449.1 M1.1_M5

<400> 20

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Thr Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

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65 70 75 80

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

Asp Gly

<210> 21

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

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Asn Val Thr Glu Val Arg Phe Ala Pro Lys Lys Cys Ile Tyr Ser Ile

65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

Asn Arg Glu Val Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 22

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S449.8 M1.1_F3

<400> 22

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Asn Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Ala Lys Met Pro Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Glu Val Arg Phe Ser Gln Lys Lys Cys Met Tyr Ala Ile

65 70 75 80

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85 90 95

Ile Lys Ser Pro Pro Gly Thr Thr Ser Ile Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

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Asn Arg Glu Phe Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

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145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 23

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S449.5 M1.1_E8

<400> 23

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Leu Ala Gly Asn His Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Ala Lys Met Pro Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Glu Val Arg Phe Gly Arg Lys Lys Cys His Tyr Trp Ile

65 70 75 80

Glu Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Arg

85 90 95

Ile Lys Ser Asp Pro Gly Met Thr Ser Phe Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ala Val Asp Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Asn Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 24

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S437.1 M1.1_P2

<400> 24

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Asn Ala Gly Asn Gly Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Arg Val Trp Phe Asn Gln Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Ile

65 70 75 80

Glu Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asp

85 90 95

Ile Lys Ser Thr Pro Gly Trp Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Asn Val Met Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 25

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S449.1 M1.1_I7

<400> 25

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Thr Thr Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Gly Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Glu Val Arg Phe Gly Arg Lys Lys Cys Gly Tyr Trp Ile

65 70 75 80

Glu Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Ala

85 90 95

Ile Lys Ser Trp Pro Gly Ile Thr Ser Gly Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Asn Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Val Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 26

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0475.06L06

<400> 26

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Glu Val Leu Arg Asp Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Gly Lys Met Pro Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Glu Val Arg Phe His Asn Lys Lys Cys Asn Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Glu Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys

85 90 95

Ile Lys Ser Asn Pro Gly Val Thr Ser Met Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Asn Val Lys Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Gly Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 27

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0475.08G23

<400> 27

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Thr Val Leu Arg Asp Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Gly Lys Met Pro Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Glu Val Arg Phe His Asn Lys Lys Cys Asn Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Glu Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn

85 90 95

Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Gln Thr Ser Met Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Lys Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Val Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 28

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0475.06G17

<400> 28

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Thr Val Leu Arg Asp Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Gly Lys Met Pro Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

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100 105 110

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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Asp Gly

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<211> 178

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<213> 人工序列

<220>

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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 41

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Trp Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

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65 70 75 80

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100 105 110

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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 42

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

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Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 43

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Met Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Glu Val Arg Phe Arg Gln Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Ile

65 70 75 80

Val Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Leu

85 90 95

Ile Lys Ser Asp Pro Gly Gln Thr Ser Glu Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

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115 120 125

Asn Arg Glu Tyr Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 44

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0512.01M12_x103Q

<400> 44

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Thr Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Met Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Glu Val Arg Phe Arg Arg Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Ile

65 70 75 80

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85 90 95

Ile Lys Ser Asp Pro Gly Gln Thr Ser Glu Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

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115 120 125

Asn Arg Glu Tyr Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 45

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0512.01F10_x103Q

<400> 45

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Met Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

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Asn Val Thr Glu Val Arg Phe Arg His Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Ile

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 46

<211> 174

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0510.10A04_x103Q

<400> 46

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20 25 30

Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170

<210> 47

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 47

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Ala Arg Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Met Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Glu Val Arg Phe Arg His Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Ile

65 70 75 80

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85 90 95

Ile Lys Ser Asp Pro Gly Gln Thr Pro Glu Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

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115 120 125

Asn Arg Glu Tyr Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 48

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

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Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asn Pro

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Met Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Glu Val Arg Phe Arg His Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Ile

65 70 75 80

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Ile Lys Ser Asp Pro Gly Gln Thr Pro Glu Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Val Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Tyr Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Pro Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 49

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 49

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1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Ala Leu Arg Glu Gly Arg Asp Pro

35 40 45

Met Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Glu Val Arg Phe Arg His Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Ile

65 70 75 80

Val Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Leu

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Ile Lys Ser Asp Pro Gly Gln Thr Pro Glu Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Val Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Tyr Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

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Asp Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Ala Arg Arg Glu Asp Lys Asp Pro

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Met Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Glu Val Arg Phe Arg His Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Ile

65 70 75 80

Val Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Leu

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Ile Lys Ser Asp Pro Gly Gln Thr Pro Glu Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

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Asp Gly

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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

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<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Ala Leu Arg Glu Gly Arg Asp Pro

35 40 45

Met Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Glu Val Arg Phe Arg His Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Ile

65 70 75 80

Val Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Leu

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Ile Lys Ser Asp Pro Gly Gln Thr Pro Glu Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Val Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Tyr Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 53

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 53

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu Ala Arg Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Met Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Glu Val Arg Phe Arg His Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Ile

65 70 75 80

Val Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Leu

85 90 95

Ile Lys Ser Asp Pro Gly Gln Thr Pro Glu Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

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115 120 125

Asn Arg Glu Tyr Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 54

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1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ile Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

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65 70 75 80

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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 55

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0455.04F23

<400> 55

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly His Ala Gly Asn Gln Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

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115 120 125

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130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 56

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0455.04F09

<400> 56

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

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65 70 75 80

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100 105 110

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Asn Arg Glu Thr Phe Val Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 57

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 57

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1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Tyr Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

Asn Arg Glu Ala Phe Asn Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 58

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.15K24

<400> 58

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Leu Gly Met Ala Gly Asn Phe His Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Ser Lys Met Pro Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr His Val Pro Phe Trp Ala Lys Lys Cys Ala Tyr Lys Thr

65 70 75 80

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85 90 95

Ile Lys Ser Gly Pro Gly Met Thr Ser Trp Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Ser Lys Gly Val Trp Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Thr Phe Val Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Ala Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 59

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0527.05N11

<400> 59

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Met Ala Gly Asn Phe His Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 60

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05A05

<400> 60

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly His Ala Gly Asn Gln Trp Leu Arg Glu Gly Arg Asp Pro

35 40 45

Arg Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Asp Val Asp Phe Ala Ile Lys Lys Cys Leu Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Thr Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn

85 90 95

Ile Lys Ser His Pro Gly Gly Thr Ser Gly Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Ile Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ala Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 61

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05M06

<400> 61

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly His Ala Gly Asn Gln Trp Leu Arg Gly Asp Tyr Asp Pro

35 40 45

Arg Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Asp Val Asp Phe Ala Ile Glu Lys Cys His Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Thr Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Asn

85 90 95

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100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Ile Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ala Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 62

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05A05_H28Q_N65D

<400> 62

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly His Ala Gly Asn Gln Trp Leu Arg Glu Gly Arg Asp Pro

35 40 45

Arg Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Asp Val Asp Phe Ala Ile Lys Lys Cys Leu Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Thr Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn

85 90 95

Ile Lys Ser His Pro Gly Gly Thr Ser Gly Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Ile Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ala Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 63

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05M06_N65D

<400> 63

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly His Ala Gly Asn Gln Trp Leu Arg Gly Asp Tyr Asp Pro

35 40 45

Arg Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Asp Val Asp Phe Ala Ile Glu Lys Cys His Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Thr Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Asn

85 90 95

Ile Lys Ser His Pro Gly Gly Thr Ser Gly Leu Ala Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Ile Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ala Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 64

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3004wt = NGAL98

<400> 64

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile

65 70 75 80

Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn

85 90 95

Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 65

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.12C05

<400> 65

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcaatgc cggaaatgga 120

tggctgcgtg aggataagga tccgatcaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgttgtgcaa ttttgggaca agaaatgcct gtaccaaatt 240

caaacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccacat taaaagtaaa 300

ccgggccaca catcacactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agcgtgtgtg gcagaaccgc gagtggtttg acatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 66

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.02P05

<400> 66

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcaccgc cggaaatgga 120

ttcctgcgtg aggataagga tccgctgaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cagcgtgtgg tttgcactga agaaatgcta ctacgacatt 240

ggaacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcatcat taaaagtgag 300

ccgggccaca catcacaatt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtgggtgaa tcagaaccgc gagaattttc aaatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 67

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.09A08

<400> 67

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggctgggc cggaaatacc 120

accctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgacgtgcaa tttagcgaga agaaatgcag ctacagcatt 240

atcacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggaat taaaagtaat 300

ccgggcaaaa catcacactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtacgtggc acagaaccgc gagggattta atatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 68

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.09M05

<400> 68

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcttcgc cggaaataat 120

cgtctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgacgtgacc tttgaggcaa agaaatgccg ttaccgtatt 240

atcacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggctacat taaaagtaaa 300

ccgggcccta catcattctt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agagcgtgac ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 69

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.09E05

<400> 69

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcctggc cggaaatgga 120

tggctgcgtg aggataagga tccggttaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgttgtggac tttgagctga agaaatgccg ttacatgatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgacat taaaagtttc 300

ccgggctgga catcacaatt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agggagtgta ccagaaccgc gagtggtttc acatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 70

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.09E13

<400> 70

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgttgc cggaaatttc 120

ttcctgcgtg aggataagga tccggcaaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgtgg tttctgaata agaaatgcca atacgagatt 240

cacacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggctacat taaaagttac 300

ccgggctaca catcacactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggttgtgca ccagaaccgc gataaatttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 71

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0512.17L07

<400> 71

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggctgggc cggaaatacg 120

acgctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgatgtgcag tttcctgaga agaaatgcat ttactctact 240

attacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggtat taaaagtagt 300

ccgggccaga catcacattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtatgtgat tcagaaccgc gaggggttta atatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 72

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0512.17O10

<400> 72

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggctgggc cggaaatacg 120

acgctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgatgtgcag tttccggata agaaatgcat ttactcgatt 240

attacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgggat taaaagtaat 300

ccgggcgata catcacattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtatgtggt gcagaaccgc gagggtttta atatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 73

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0512.19M08

<400> 73

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggctgggc cggaaatacg 120

acgctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgatgtgcag tttcctgaga agaaatgcac gtactcgatt 240

attacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgatat taaaagtaat 300

ccgggcgaga catcacattt ggtccgcgtc atgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtatgtgga tcagaaccgc gaggggttta atatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 74

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0512.17O03

<400> 74

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggctgggc cggaaatact 120

acgctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgatgtgcag tttccggata agaaatgcgt gtactcgatt 240

attacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgggat taaaagtaat 300

ccgggcaata catcacattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtatgtggt gcagaaccgc gaggggttta atatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 75

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0510.05H10

<400> 75

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggccttgc cggaaatggt 120

tggctgcgtg aggataagga tccgcttaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgtggtggat tttgagctta agaaatgcag gtacatgatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgatat taaaagttct 300

ccgggctgga catcacagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agggggtgta tcagaaccgc gagtggtttc atatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 76

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.06H10

<400> 76

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggctgggc cggaaatacg 120

acgctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgcctgcgg tcatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgatgtgcag tttcccgaga aggaatgcat ttactctact 240

attacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggtat taaaagtagt 300

ccgggccaga catcacattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtatgtgac tcagaaccgc gaggggttta atatcacgct gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 77

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.04N16

<400> 77

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggccttgc cggaaatggt 120

tggctgcgtg aggatgagga tccgcttaaa atgatggcgg ccgtttacga gttgagagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgtggtggat tttgagcttg aggaatgcag gtacatgact 240

gagacctttg tgccggggaa ccagccgggc gagtttactt taggcgatat taaaagttct 300

ccgggctgga catcacagct ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agggggtgta tcagaaccgc gagtggtttc atatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 78

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0544.01B06_H28Q_N65D

<400> 78

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggctgggc cggagatacg 120

acgctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgcctgcgg tcatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgatgtcac cgatgtgcag tttcccgaga aggaatgcat ttactctact 240

attacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggtat taaaagtagt 300

ccgggccaga catcacattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtatgtgac tcagaaccgc gaggggttta atatcgcgct gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 79

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0544.04C04_H28Q_N65D

<400> 79

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggctgggc cggaaatacg 120

gctctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgcctgcgg tcatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgatgtcac cgatgtgcag tttcccgaga aggaatgcat ttactctact 240

attacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggtat taaaagtagt 300

ccgggccaga catcacattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtatgtgac tcagaaccgc gaggggttta atatcgctct gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 80

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.04N16_N65D

<400> 80

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggccttgc cggaaatggt 120

tggctgcgtg aggatgagga tccgcttaaa atgatggcgg ccgtttacga gttgagagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cgtggtggat tttgagcttg aggaatgcag gtacatgact 240

gagacctttg tgccggggaa ccagccgggc gagtttactt taggcgatat taaaagttct 300

ccgggctgga catcacagct ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agggggtgta tcagaaccgc gagtggtttc atatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 81

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.04N16_N65Q

<400> 81

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggccttgc cggaaatggt 120

tggctgcgtg aggatgagga tccgcttaaa atgatggcgg ccgtttacga gttgagagaa 180

gataaatcat atcaggtcac cgtggtggat tttgagcttg aggaatgcag gtacatgact 240

gagacctttg tgccggggaa ccagccgggc gagtttactt taggcgatat taaaagttct 300

ccgggctgga catcacagct ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agggggtgta tcagaaccgc gagtggtttc atatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 82

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S447.3 M1.1_N4

<400> 82

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgttgc cggaaatgag 120

gttctgcgtg aggataagga tccgggaaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgcgt tttcacaata agaaatgcaa ttacagcatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagtaat 300

ccgggccaaa catcaatgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaagtgaa acagaaccgc gagggatttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 83

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S449.1 M1.1_M5

<400> 83

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcctggc cggaaatacc 120

atcctgcgtg aggataagga tccgggaaaa atgaatgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgacgtgcgt tttatcatga agaaatgcca ctactacatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcatcat taaaagtaat 300

ccgggcacca catcacaatt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agatcgtgcg tcagaaccgc gagatgtttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 84

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S449.5 M1.1_L10

<400> 84

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcatcgc cggaaatacc 120

gttctgcgtg aggataagga tccgggaaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgcgt tttgcaccta agaaatgcat ctacagcatt 240

agcacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcatgat taaaagtagc 300

ccgggcggaa catcagcatt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaagtgag ccagaaccgc gaggtttttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 85

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S449.8 M1.1_F3

<400> 85

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcctggc cggaaataat 120

atcctgcgtg aggataagga tccggcaaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgcgt tttagccaaa agaaatgcat gtacgcaatt 240

tacacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccgtat taaaagtcct 300

ccgggcacca catcaatctt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaagtgat gcagaaccgc gagttctttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 86

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S449.5 M1.1_E8

<400> 86

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcctggc cggaaatcac 120

atcctgcgtg aggataagga tccggcaaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgcgt tttggacgta agaaatgcca ctactggatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccgtat taaaagtgac 300

ccgggcatga catcattctt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggcagtgga ccagaaccgc gagaattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 87

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S437.1 M1.1_P2

<400> 87

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcaatgc cggaaatgga 120

cgtctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac ccgtgtgtgg tttaatcaaa agaaatgcaa atacgacatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgacat taaaagtacc 300

ccgggctgga catcaaattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaatgtgat gcagaaccgc gagatctttt acatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 88

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S449.1 M1.1_I7

<400> 88

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgttgc cggaaatacc 120

accctgcgtg aggataagga tccgggaaaa atgggagcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgcgt tttggacgta agaaatgcgg atactggatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgcaat taaaagttgg 300

ccgggcatca catcaggatt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaagtgaa tcagaaccgc gaggtttttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 89

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0475.06L06

<400> 89

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgtggc cggaaatgag 120

gtgctgcgtg atgataagga tccggggaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgagg tttcataata agaaatgcaa ttactcgatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtaat 300

ccgggcgtga catcaatgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaatgtgaa gcagaaccgc gaggggtttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 90

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0475.08G23

<400> 90

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgtggc cggaaatact 120

gtgctgcgtg atgataagga tccggggaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgagg tttcataata agaaatgcaa ttactctatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagttat 300

ccgggccaga catcaatgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtgaa gcagaaccgc gaggtgtttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 91

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0475.06G17

<400> 91

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgttgc cggaaatacg 120

gtgctgcgtg acgataagga tccgggtaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgcgg tttcataaga agaaatgcaa ttactttatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtcat 300

ccgggccaga catcaatgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtgaa gcagaaccgc gaggcgtttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 92

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0475.03N20

<400> 92

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgttgc cggaaatcag 120

gtgctgcgtg atgataagga tccgggtaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgagg tttcataata agaaatgcaa ttactggatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagtaat 300

ccgggccata catcaatgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtgaa gcagaaccgc gagggttttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 93

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0474.05F20

<400> 93

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgttgc cggaaatacg 120

attctgcgtg aggataagga tccggggaaa atgaatgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgatgtgagg tttattttta agaaatgcca ttactatatt 240

gatacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagttat 300

ccgggcatga catcacagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agattgtgag gcagaaccgc gagatttttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 94

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0474.01H22

<400> 94

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgtggc cggaaatact 120

attctgcgtg aggataagga tccggggaaa atgaatgcaa ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgatgtgagg tttattagga agaaatgcca ttactatatt 240

gatacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagttat 300

ccgggcacta catcacagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agattgtgag gcagaaccgc gagatttttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 95

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0475.06L06_N65D_S79F

<400> 95

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgtggc cggaaatgag 120

gtgctgcgtg atgataagga tccggggaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgatgtcac cgaggtgagg tttcataata agaaatgcaa ttacttcatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtaat 300

ccgggcgtga catcaatgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaatgtgaa gcagaaccgc gaggggtttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 96

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0475.06L06_N65Q_S79F

<400> 96

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgtggc cggaaatgag 120

gtgctgcgtg atgataagga tccggggaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atcaggtcac cgaggtgagg tttcataata agaaatgcaa ttacttcatt 240

gagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtaat 300

ccgggcgtga catcaatgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaatgtgaa gcagaaccgc gaggggtttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 97

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0474.01H22_T54A_N65D

<400> 97

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgtggc cggaaatact 120

attctgcgtg aggataagga tccggggaaa atgaatgcag ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgatgtcac cgatgtgagg tttattagga agaaatgcca ttactatatt 240

gatacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagttat 300

ccgggcacta catcacagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agattgtgag gcagaaccgc gagatttttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 98

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0474.01H22_T54A_N65Q

<400> 98

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgtggc cggaaatact 120

attctgcgtg aggataagga tccggggaaa atgaatgcag ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atcaggtcac cgatgtgagg tttattagga agaaatgcca ttactatatt 240

gatacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagttat 300

ccgggcacta catcacagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agattgtgag gcagaaccgc gagatttttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 99

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0474.01H22_H28Q_T54A_N65D

<400> 99

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcgtggc cggaaatact 120

attctgcgtg aggataagga tccggggaaa atgaatgcag ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgatgtcac cgatgtgagg tttattagga agaaatgcca ttactatatt 240

gatacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagttat 300

ccgggcacta catcacagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agattgtgag gcagaaccgc gagatttttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 100

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0474.01H22_N65Q

<400> 100

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgtggc cggaaatact 120

attctgcgtg aggataagga tccggggaaa atgaatgcaa ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atcaggtcac cgatgtgagg tttattagga agaaatgcca ttactatatt 240

gatacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagttat 300

ccgggcacta catcacagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agattgtgag gcagaaccgc gagatttttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 101

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.14D07

<400> 101

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcttcgc cggaaattgg 120

atgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgaatgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgaaa tttcaagcaa agaaatgcat ctacagcatt 240

cacacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcatcat taaaagtaat 300

ccgggcggaa catcagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtgggtgca ccagaaccgc gagttctttc aaatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 102

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.05N20

<400> 102

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcttcgc cggaaatcgt 120

tggctgcgtg aggataagga tccgatcaaa atgtacgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac ccaagtgaat ttttggctga agaaatgcgc atacagcatt 240

agcacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccgtat taaaagtatc 300

ccgggcccta catcagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaccgtgat ccagaaccgc gagttctttg agatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 103

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.16B14

<400> 103

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcttcgc cggaaatctg 120

ctgctgcgtg aggataagga tccgcgtaaa atgcgtgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgacgtgcgt tttctgtaca agaaatgcat ctacagcatt 240

gcaacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcggaat taaaagtgca 300

ccgggcttca catcagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtgggtggc acagaaccgc gagtactttg agatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 104

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.15E20

<400> 104

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcttcgc cggaaattgg 120

cgtctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac caatgtgcgt ttttggccta agaaatgccg ttacagcatt 240

agcacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcatgat taaaagtcct 300

ccgggcggaa catcagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtgggtgtt ccagaaccgc gagttctttg agatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 105

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0466.13C10

<400> 105

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctg 120

gcactgcgtg aggataagga tccgaaaaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgcgt tttcgtcaca agaaatgcca atacgacatt 240

gcaacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcctgat taaaagtgac 300

ccgggccaaa catcagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaagtggt tcagaaccgc gagttctttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 106

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0510.11H24

<400> 106

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

gctctgcgtg aggataagga tccgatgaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgagg tttaggcaga agaaatgcaa gtacgatatt 240

gttacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccttat taaaagtgat 300

ccgggccaga catcagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtggt tcagaaccgc gagtattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 107

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0512.01M12_X103Q

<400> 107

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

actctgcgtg aggataagga tccgatgaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgagg tttaggcgta agaaatgcaa gtacgatatt 240

gttacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgtgat taaaagtgat 300

ccgggccaga catcagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtggt tcagaaccgc gagtattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 108

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0512.01F10_X103Q

<400> 108

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

gctctgcgtg aggataagga tccgatgaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgagg tttaggcata agaaatgcaa gtacgatatt 240

gttacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccttat taaaagtgat 300

ccgggccaga catcagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtggt tcagaaccgc gagtattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 109

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0510.10A04_X103Q

<400> 109

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

gctctgcgtg aggataagga tccgaagaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgagg tttcggtata agaaatgcca gtacgatatt 240

gttacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taagtgagcc gggccagaca 300

tcagagttgg tccgcgtcgt gagcaccaac tacaaccagc atgccatggt gttcttcaag 360

aaggtggtgc agaaccgcga gtttttttgg atcacactgt acgggcgcac gaaagaactg 420

acaagcgagc tgaaggaaaa ttttatccgc ttttccaaat ctctgggcct ccctgaaaac 480

cacatcgtct tccctgtccc aatcgaccag tgtatcgacg gc 522

<210> 110

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07G09

<400> 110

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

gctcggcgtg aggataagga tccgatgaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgagg tttaggcata agaaatgcaa gtacgatatt 240

gttacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccttat taaaagtgat 300

ccgggccaga caccagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtggt ccagaaccgc gagtattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 111

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07K20

<400> 111

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

gctctgcgtg aggataagaa tccgatgaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgagg tttaggcata agaaatgcaa gtacgatatt 240

gttaccttcg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccttat taaaagtgat 300

ccgggccaga cgccagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtggt tcagaaccgc gagtattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgccaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 112

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07K21

<400> 112

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

gctctgcgtg agggtaggga tccgatgaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgaggtgagg tttaggcata agaaatgcaa gtacgatatt 240

gttacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccttat taaaagtgat 300

ccgggccaga caccagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtggt tcagaaccgc gagtattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 113

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07G09_N65D

<400> 113

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

gctcggcgtg aggataagga tccgatgaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cgaggtgagg tttaggcata agaaatgcaa gtacgatatt 240

gttacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccttat taaaagtgat 300

ccgggccaga caccagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtggt ccagaaccgc gagtattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 114

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07K20_N65D

<400> 114

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

gctctgcgtg aggataagaa tccgatgaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cgaggtgagg tttaggcata agaaatgcaa gtacgatatt 240

gttaccttcg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccttat taaaagtgat 300

ccgggccaga cgccagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtggt tcagaaccgc gagtattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgccaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 115

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07K21_N65D

<400> 115

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

gctctgcgtg agggtaggga tccgatgaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cgaggtgagg tttaggcata agaaatgcaa gtacgatatt 240

gttacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccttat taaaagtgat 300

ccgggccaga caccagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtggt tcagaaccgc gagtattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 116

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0530.07G09_H28Q_N65D

<400> 116

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcgaggc cggaaatctt 120

gctcggcgtg aggataagga tccgatgaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cgaggtgagg tttaggcata agaaatgcaa gtacgatatt 240

gttacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccttat taaaagtgat 300

ccgggccaga caccagagtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agaaggtggt ccagaaccgc gagtattttt ggatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 117

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0455.04F12

<400> 117

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcctggc cggaaatatc 120

ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgctggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac ccacgtgacc tttaaatgga agaaatgcta ctacgcaatt 240

cgtacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcatgat taaaagtgag 300

ccgggccaca catcaatgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agtgggtgga ccagaaccgc gaggagtttc tgatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 118

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0455.04F23

<400> 118

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggccacgc cggaaatcaa 120

tggctgcgtg aggataagga tccgcgtaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgacgtggac tttgcaatca agaaatgcca ctaccgtatt 240

accacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagtcac 300

ccgggcggaa catcaggatt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agttcgtgat ccagaaccgc gaggcatttt tcatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 119

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0455.04F09

<400> 119

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaatttc 120

cacctgcgtg aggataagga tccgagcaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac ccacgtgcct ttttgggcaa agaaatgcgc atacaaaatt 240

atcacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgcaat taaaagtgga 300

ccgggcatga catcatggtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agggagtgtg gcagaaccgc gagacctttg ttatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 120

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0455.04M08

<400> 120

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcgttgc cggaaattac 120

tggctgcgtg aggataagga tccggcaaaa atgtacgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgacgtgcgt ttttggcgta agaaatgccg ttacgacatt 240

tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccctat taaaagtgag 300

ccgggccaaa catcacggtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agctggtgcg tcagaaccgc gaggcattta atatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 121

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.15K24

<400> 121

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcc tgggcatggc cggaaatttc 120

cacctgcgtg aggataagga tccgagcaag atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac ccacgtgcct ttttgggcaa agaaatgcgc atacaaaact 240

atcacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgcaat taaaagtgga 300

ccgggcatga catcatggtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttctcca agggagtgtg gcagaaccgc gagacctttg ttatcacact gtacgggcgc 420

gcgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 122

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0527.05N11

<400> 122

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaatttc 120

cacctgcgtg aggataagga tccgagcaaa atgcctgcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac ccacgtgcct ttttgggcaa agaaatgcgc atacaaaact 240

atcacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgcaat taaaagtgga 300

ccgggcatga catcatggtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttctcca agggagtgtg gcagaaccgt gagacctttg ttatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 123

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05A05

<400> 123

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggccacgc cggaaatcaa 120

tggctgcgtg agggtaggga tccgcgtaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgacgtggac tttgcaatca agaaatgcct ctaccgtatt 240

accacctttg tgccagggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagtcac 300

ccgggcggaa catcaggatt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agttcgtgat ccagaaccgc gaggcatttt tcatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 124

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05M06

<400> 124

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggccacgc cggaaatcaa 120

tggctgcgtg gggattacga tccgcgtaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat ataacgtcac cgacgtggac tttgcaatcg agaaatgcca ctaccgtatt 240

accacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt ttggcaatat aaaaagtcac 300

ccgggcggaa catcaggatt ggcccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agttcgtgat ccagaaccgc gaggcatttt tcatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 125

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05A05_H28Q_N65D

<400> 125

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggccacgc cggaaatcaa 120

tggctgcgtg agggtaggga tccgcgtaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cgacgtggac tttgcaatca agaaatgcct ctaccgtatt 240

accacctttg tgccagggag ccagccgggc gagtttactt taggcaatat taaaagtcac 300

ccgggcggaa catcaggatt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agttcgtgat ccagaaccgc gaggcatttt tcatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 126

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> S0522.05M06_N65D

<400> 126

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggccacgc cggaaatcaa 120

tggctgcgtg gggattacga tccgcgtaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cgacgtggac tttgcaatcg agaaatgcca ctaccgtatt 240

accacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt ttggcaatat aaaaagtcac 300

ccgggcggaa catcaggatt ggcccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca agttcgtgat ccagaaccgc gaggcatttt tcatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 127

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白的C端序列

<400> 127

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5 10

<210> 128

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SA接头和Strep标签II

<400> 128

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 129

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达的蛋白质氨基酸序列

<400> 129

Met Lys His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu

1 5 10 15

Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala

20 25 30

Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln

35 40 45

Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Val Ala Gly Asn Thr Ile Leu

50 55 60

Arg Glu Asp Lys Asp Pro Gly Lys Met Asn Ala Thr Ile Tyr Glu Leu

65 70 75 80

Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Asp Val Arg Phe Ile Arg Lys

85 90 95

Lys Cys His Tyr Tyr Ile Asp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly

100 105 110

Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Thr Ser Gln

115 120 125

Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe

130 135 140

Phe Lys Ile Val Arg Gln Asn Arg Glu Ile Phe Trp Ile Thr Leu Tyr

145 150 155 160

Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg

165 170 175

Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val

180 185 190

Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly

195 200

<210> 130

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 位置95-98

<400> 130

Gly Asn Ile Lys

1

<210> 131

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 清蛋白结合肽的例子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是Asp, Asn, Ser, Thr, 或Trp中的任一种

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是Asn, Gln, His, Ile, Leu, 或Lys中的任一种

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是Ala, Asp, Phe, Trp, 或Tyr中的任一种

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, 或Thr中的任一种

<400> 131

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys

1 5

<210> 132

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 132

Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr

1 5

<210> 133

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶切割位点

<400> 133

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 134

<211> 742

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0474.01H22_H28Q_T54A_N65D_(G4S)2S0544.04C04_H28Q_N65D_(G4S)2

S0530.07G09_H28Q_N65D_(G4S)2 S0522.05A05_H28Q_N65D

<400> 134

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Thr Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Gly Lys Met Asn Ala Ala Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Asp Val Arg Phe Ile Arg Lys Lys Cys His Tyr Tyr Ile

65 70 75 80

Asp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn

85 90 95

Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Thr Ser Gln Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ile Val Arg Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr

180 185 190

Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln

195 200 205

Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Trp

210 215 220

Ala Gly Asn Thr Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Pro Lys Met Pro

225 230 235 240

Ala Val Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Asp

245 250 255

Val Gln Phe Pro Glu Lys Glu Cys Ile Tyr Ser Thr Ile Thr Phe Val

260 265 270

Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gly Ile Lys Ser Ser

275 280 285

Pro Gly Gln Thr Ser His Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn

290 295 300

Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Tyr Val Thr Gln Asn Arg Glu Gly

305 310 315 320

Phe Asn Ile Ala Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu

325 330 335

Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn

340 345 350

His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Gly Gly

355 360 365

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile

370 375 380

Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp

385 390 395 400

Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu

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Gly Lys Met Asn Ala Ala Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Asp Val Arg Phe Ile Arg Lys Lys Cys His Tyr Tyr Ile

65 70 75 80

Asp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn

85 90 95

Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Thr Ser Gln Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ile Val Arg Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

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Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr

180 185 190

Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln

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Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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290 295 300

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Ser Glu Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met

485 490 495

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500 505 510

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Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly

545 550 555 560

Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro

565 570 575

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580 585 590

Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Met Ala Gly Asn Phe His Leu Arg Glu

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675 680 685

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725 730 735

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His His His His His His

755

<210> 185

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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S0466.13C10(N65Q) (G4S)2 S0455.04F09(N65Q) StrepII, His6

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165 170 175

Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr

180 185 190

Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln

195 200 205

Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu

210 215 220

Ala Gly Asn Gly Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Lys Met Met

225 230 235 240

Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Gln Val Thr Val

245 250 255

Val Asp Phe Glu Leu Lys Lys Cys Arg Tyr Met Ile Glu Thr Phe Val

260 265 270

Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asp Ile Lys Ser Phe

275 280 285

Pro Gly Trp Thr Ser Gln Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn

290 295 300

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305 310 315 320

Phe His Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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725 730 735

Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

740 745 750

His His His His His His

755

<210> 186

<211> 758

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S0475.06L06(N65Q;S79F) (G4S)2 S0466.09E05(N65Q) (G4S)2

S0466.13C10(N65Q) (G4S)2 S0455.04F09(N65Q) StrepII His标签

<400> 186

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Glu Val Leu Arg Asp Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Gly Lys Met Pro Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Gln Val Thr Glu Val Arg Phe His Asn Lys Lys Cys Asn Tyr Phe Ile

65 70 75 80

Glu Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Asn Arg Glu Gly Phe Trp Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr

180 185 190

Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln

195 200 205

Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu

210 215 220

Ala Gly Asn Gly Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Lys Met Met

225 230 235 240

Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Gln Val Thr Val

245 250 255

Val Asp Phe Glu Leu Lys Lys Cys Arg Tyr Met Ile Glu Thr Phe Val

260 265 270

Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asp Ile Lys Ser Phe

275 280 285

Pro Gly Trp Thr Ser Gln Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn

290 295 300

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305 310 315 320

Phe His Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu

325 330 335

Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn

340 345 350

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355 360 365

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile

370 375 380

Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp

385 390 395 400

Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Leu

405 410 415

Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Lys Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

Ser Glu Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met

485 490 495

Val Phe Phe Lys Lys Val Val Gln Asn Arg Glu Phe Phe Trp Ile Thr

500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly

545 550 555 560

Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro

565 570 575

Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His

580 585 590

Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Met Ala Gly Asn Phe His Leu Arg Glu

595 600 605

Asp Lys Asp Pro Ser Lys Met Pro Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu

610 615 620

Asp Lys Ser Tyr Gln Val Thr His Val Pro Phe Trp Ala Lys Lys Cys

625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys

675 680 685

Gly Val Trp Gln Asn Arg Glu Thr Phe Val Ile Thr Leu Tyr Gly Arg

690 695 700

Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser

705 710 715 720

Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile

725 730 735

Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

740 745 750

His His His His His His

755

Claims

1.一种对绿脓菌荧光素I、II和III型和绿脓菌螯铁蛋白具有结合特异性的融合分子，其包含：

(a)第一多肽，所述第一多肽包含结合绿脓菌荧光素I型的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(hNGAL)突变蛋白；

(b)第二多肽，所述第二多肽包含结合绿脓菌荧光素II型的hNGAL突变蛋白；

(c)第三多肽，所述第三多肽包含结合绿脓菌荧光素III型的hNGAL突变蛋白；和

(d)第四多肽，所述第四多肽包含结合绿脓菌螯铁蛋白的hNGAL突变蛋白；

其中所述第一、第二、第三和第四多肽是共价连接的。

2.权利要求1的融合分子，其中所述hNGAL突变蛋白包含在与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置28、34、36、39-42、44-47、49、52、54-55、65、68、70、72-75、77、79-81、87、96、100、103、106、108、123、125、127、132、134、141和145对应的一个或多个位置处的突变氨基酸残基。

3.权利要求1或2的融合分子，其中所述hNGAL突变蛋白以200nM或更低的解离常数K_D分别结合绿脓菌荧光素I型、绿脓菌荧光素II型、绿脓菌荧光素III型和绿脓菌螯铁蛋白。

4.权利要求1至3中任一项的融合分子，其中所述第一、第二、第三和第四多肽经由接头分子，特别是肽接头共价连接。

5.权利要求1至4中任一项的融合分子，其进一步包含允许所述融合分子多聚化的多聚化域，特别是允许所述融合分子二聚化的二聚化域。

6.权利要求5的融合分子，其中所述二聚化域选自下组：Fc域、IgE重链域2(EHD2)、IgM重链域2(MHD2)、IgG重链域3(GHD3)、IgA重链域3(AHD2)、IgD重链域3(DHD3)、IgE重链域4(EHD4)、IgM重链域4(MHD4)、子宫珠蛋白二聚化域和前述任一项的变体或片段，其中特别地，所述Fc域是人IgG4-Fc域。

7.权利要求1至6中任一项的融合分子，其具有选自下组的通式：

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–X₃–L₃–X₄-C’ (I)，

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–X₃–L₃–X₄–L₄–MD-C’ (II)，

N’-MD–L₁–X₁–L₂–X₂–L₃–X₃–L₄–X₄-C’ (III)，

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–MD–L₃–X₃–L₄–X₄-C’ (IV)，

N’-X₁–L₁–MD–L₂–X₂–L₃–X₃–L₄–X₄-C’ (V)，和

N’-X₁–L₁–X₂–L₂–X₃–L₃–MD–L₄–X₄-C’ (VI)

其中

MD包含多聚化域；并且

8.权利要求1至7中任一项的融合分子，其以多聚体(例如二聚体)复合物存在。

9.权利要求1至8中任一项的融合分子，其中所述融合分子具有下列一个或多个性质：

(i)它进一步包含至少一个允许检测和/或分离所述融合分子的标记物或标签；

(ii)它进一步包含一个或多个增加所述融合分子的稳定性和/或延长所述融合分子的血清半衰期的修饰；

(iii)它抑制或降低铜绿假单胞菌经由绿脓菌螯铁蛋白和/或绿脓菌荧光素的铁摄取；

(iv)它抑制或降低铜绿假单胞菌的毒力因子表达；

(v)它抑制或降低绿脓菌螯铁蛋白和/或绿脓菌荧光素介导的信号传导；

(vi)它抑制或降低铜绿假单胞菌细菌生长；并且

(vii)它与药学活性剂结合或缀合/融合，其中特别地，所述药学活性剂选自下组：抗生素、细胞抑制剂、毒素、金属或金属化合物/复合物、螯合剂、半抗原和抗体。

10.一种核酸分子，其包含编码权利要求1至9中任一项的融合分子的核苷酸序列。

11.一种宿主细胞，其含有权利要求10的核酸分子。

12.一种药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项的融合分子、权利要求10的核酸分子、或权利要求11的细胞。

13.一种试剂盒，其包含权利要求1至9中任一项的融合分子、权利要求10的核酸分子、权利要求11的细胞、或权利要求12的药物组合物。

14.权利要求1至9中任一项的融合分子、权利要求10的核酸分子、权利要求11的细胞、或权利要求12的药物组合物，其用作药物。

15.权利要求1至9中任一项的融合分子、权利要求10的核酸分子、权利要求11的细胞、或权利要求12的药物组合物，其用于预防或治疗受试者中的铜绿假单胞菌生物膜感染。

16.权利要求1至9中任一项的融合分子、权利要求10的核酸分子、权利要求11的细胞、或权利要求12的药物组合物，其用于预防或治疗受试者中的与铜绿假单胞菌生物膜感染有关的或由铜绿假单胞菌生物膜感染引起的疾病或病症。

17.用于权利要求15或16的用途的融合分子、核酸分子、细胞或药物组合物，其中所述铜绿假单胞菌生物膜感染是急性或慢性感染。