CN103074303A - 产生抗人ngal特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了产生抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其产生的单克隆抗体。所述杂交瘤细胞株由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后，小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。所述的抗体，能够用于人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋的免疫检测。藉此能够开发出人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋的免疫检测试剂，用于诊断或检测急性肾损伤等疾病。

Description

产生抗人NGAL特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体与应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白特异性单克隆抗体。 

背景技术

肾损伤是临床上各种危重疾病最常见的并发症之一。近几十年来虽然对肾损伤病理生理和发病机制的研究以及临床治疗方法已经有了很大进步，但其发病率和死亡率仍然居高不下。已经明确，早期治疗对肾损伤的逆转十分重要，而早期诊断是指导临床及时治疗的关键。目前，临床上常用的经典肾损伤生物化学标志物主要有血尿素氮、血肌酐、血胱抑素C。尿素是人体蛋白质代谢的重要终末小分子代谢产物，其浓度并不完全依赖于肾功能，当肾小球滤过率下降到正常的50％以下时，血尿素浓度才迅速升高，只能作为粗略估计肾功能的指标；肌酐是肌酸代谢的终末产物，与尿素相比，其受肾外因素影响小，能较好的指示肾脏功能。但与血尿素一样，血肌酐对肾脏储备功能的损失不敏感；有研究表明血胱抑素C在肾损伤发生12小时才上升，此时肾功能已经受到不可逆损伤，增加了肾损伤的死亡率。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)在急性肾损伤极早期就显著升高，其敏感性高，窗口期短，作为肾损伤的生物学预警和诊断指标受到广泛关注。 

NGAL是中性粒细胞特异性颗粒中发现的一种25Kd的小分子分泌型蛋白。广泛分布于成人骨髓、子宫、前列腺、唾液腺、胃、阑尾、结肠和气管以及胎儿脾脏和肺组织中。这种25kDa的蛋白质由198个氨基酸组成，前20个氨基酸为前导序列，NGAL是脂质运载蛋白（lipocalin）超家族的新成员，能够结合并 运输疏水性小分子，参与体内抗炎作用并可能与肿瘤存在密切联系。2003年Mishra J等观察到缺血再灌注损伤后的小鼠肾脏和顺铂诱导的中毒性肾损害中，小鼠尿液中NGAL显著增高，2011年Barasch研究小组在Nature Medcine上报道了用Luciferase-2和mCherry双萤光报告基因在NGAL启动子和其5’UTR驱动下的knock in小鼠模型的实验结果，揭示了缺血性和细胞毒性肾损害时NGAL基因表达活性在肾组织中的Henles管和集合管的上皮细胞呈剂量依赖性的显著变化。说明肾损伤时尿中NGAL主要来自肾组织，而不是来自正常时也低表达NGAL的中性粒细胞、肝细胞、呼吸道和肠道等上皮细胞。说明NGAL在肾损伤诊断中有重要的应用价值。 

实现NGAL免疫检测的关键问题是如何获得其单克隆抗体及多克隆抗体以及作为免疫检测的抗原标准品。根据生物信息学预测，NGAL蛋白在86位氨基酸可能有糖基化，为能最好地接近天然蛋白的结构和功能，通过基因工程在293细胞中表达适用于免疫学检测工作标准品的重组NGAL蛋白，为下一步NGAL单克隆抗体和多克隆抗体的制备提供抗原，并用于NGAL特性的研究。NGAL对于肾损伤的早期诊断更具有特异性和敏感性，有望成为理想的肾损伤早期诊断生化指标。免疫检测技术是基于抗原—抗体反应的原理对待测物（抗原/抗体）进行定量定性分析的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、便捷等优点，是现代生命科学的重要研究手段，在生物分析检测领域有着广泛的应用前景。构建基于免疫检测技术的NGAL检测体系对于肾脏疾病早期诊断、人类健康等都具有重要的意义，同时具有较大的社会意义和经济价值。目前市场上出售的用于检测NGAL的酶联免疫（ELISA）试剂盒，均采用国外进口NGAL抗体，价格昂贵，且为科研用试剂盒，难以大面积进行临床应用。因此，制备高特异性的NGAL特异性单克隆抗体成为迫切需要。 

发明内容

本发明的目的是提供两株产生抗人NGAL特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

本发明所提供的产生抗人NGAL的单克隆抗体的杂交瘤细胞株均保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编： 430072，保藏日期为2012年12月26日，保藏号分别为CCTCC NO.C2012197和CCTCC NO.C2012198，分类命名分别为杂交瘤细胞株NGAL(1-F2)和杂交瘤细胞株NGAL(1-G2)，在本申请中分别命名为1-F2和1-G2。 

杂交瘤细胞株1-F2和1-G2均由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。 

本发明还提供一种由杂交瘤细胞株1-F2所产生的单克隆抗体，该单克隆抗体的亚类属于IgG1。 

本发明还提供一种由杂交瘤细胞株1-G2所产生的单克隆抗体。该单克隆抗体的亚类属于IgG1。 

本发明还提供杂交瘤细胞株1-F2所产生的单克隆抗体和/或杂交瘤细胞株1-G2所产生的单克隆抗体制备肾损伤诊断或检测制剂中的应用。 

本发明还提供一种用于诊断或检测肾损伤的试剂盒，其包含杂交瘤细胞株1-F2所产生的单克隆抗体和/或杂交瘤细胞株1-G2所产生的单克隆抗体。 

本发明具体通过下述技术方案完成本发明的目的： 

1.NGAL重组蛋白的制备：从GENEBANK中获得人NGAL编码序列，通过扩增人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白NGAL的基因片断，将目的基因与真核表达载体连接，构建真核表达重组质粒。将重组质粒稳定转染到293细胞中，表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。纯化重组蛋白并进行纯度、浓度和活性鉴定，得到高纯度的NGAL重组蛋白。 

2.通过生物信息学预测，NGAL蛋白86位氨基酸有明显糖基化，为能得到最好的能够识别天然蛋白的特异性单克隆抗体，以方案1中得到的NGAL重组蛋白作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株并检测其细胞培养上清的效价。之后进行抗体亚类鉴定和抗体的特异性实验，证实得到的抗体是特异性针对NGAL的。 

3.建立NGAL的ELISA检测体系：利用已制备的抗NGAL抗体作为捕获抗体和检测抗体，以NGAL重组蛋白作为检测抗原，进行抗体配对试验，经过优化ELISA反应条件，获得能检测天然NGAL的配对抗体并以此成功建立了检 测NGAL的双抗体夹心ELISA方法。 

本发明通过杂交瘤技术，制备了抗NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株1-F2和1-G2，能分泌相应的NGAL特异性单克隆抗体，能进行成功配对和检测天然血清，初步建立了检测NGAL的双抗体夹心ELISA方法。 

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。 

附图说明

图1为NGAL基因逆转录PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。其中，M为DNA Marker；1-5分别为五个退火温度60℃、62℃、64℃、66℃、68℃。 

图2为pcDNA3.1-NGAL用EcoRⅠ及Acc65Ⅰ双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果分析图。其中，M为DNA marker；泳道1为pcDNA3.1，泳道2为pcDNA3.1-NGAL。 

图3为重组NGAL蛋白表达Western blot鉴定图；其中，1为细胞提取蛋白；2为细胞培养上清。 

图4为重组NGAL蛋白纯化图。其中1为紫外吸收曲线，2为溶液电导，3为纯化抗体浓度，F1、F2、分别为指不同时间蛋白纯化出现的吸收峰。 

图5为纯化后重组NGAL蛋白的SDS-PAGE鉴定。其中，M为分子量标准；泳道1为纯化后NGAL。 

图6为ELISA鉴定单克隆抗体1-F2检测NGAL重组蛋白。其中，左1孔为阴性对照，左2～12孔分别为抗体稀释倍数1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000、1:1024000。 

图7为ELISA鉴定单克隆抗体1-G2检测NGAL重组蛋白。其中，左1-3孔为阴性对照，左4～12孔分别为抗体稀释倍数1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000。 

图8为Western blot鉴定单克隆抗体1-F2结合NGAL重组蛋白；其中，泳道1为重组蛋白NGAL；泳道2为无关蛋白PCT。 

图9为Western blot鉴定单克隆抗体1-G2结合NGAL重组蛋白。其中，泳道1为重组蛋白NGAL；泳道2为无关蛋白PCT。 

图10为标准ELISA检测重组蛋白的标准曲线。 

图11为标准ELISA检测临床标本中NGAL结果（正常人与肾病患者比较）。 

具体实施方式

本发明通过RT-PCR扩增人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白NGAL的基因片断，将目的基因与真核表达载体pcDNA3.1连接，构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-NGAL。用重组质粒稳定转染到293细胞，表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。利用pcDNA3.1构建的NGAL真核表达质粒在293细胞实现了分泌表达，经SDS-PAGE电泳分析显示，表达的重组蛋白分子质量约为25kD。采用蛋白亲和层析柱纯化NGAL重组蛋白，通过镍柱纯化后得到高纯度NGAL重组蛋白，含量约为0.54mg/mL。 

本发明通过生物信息学预测得知NGAL蛋白86位氨基酸可能有糖基化，为能得到最好的能够识别天然蛋白的特异性单克隆抗体，以293细胞表达的NGAL重组蛋白作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗NGAL特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，腹水经HiTrap IgG Purification HP亲和层析柱纯化，对所得的单克隆抗体进行效价测定和亲和力测定。经筛选得到2株稳定分泌NGAL特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株1-F2和1-G2，经亚类鉴定均为IgG1，2株单抗效价均在1:256000以上，亲和力分别为6.39×10¹⁰M^-1和3.65×10⁹M^-1，Western blot鉴定表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。 

本发明建立了NGAL的ELISA检测体系：应用抗NGAL抗体1-F2为捕获抗体，抗NGAL抗体1-G2为检测抗体，建立标准的双抗体夹心ELISA检测方法，能够检测尿液中的天然NGAL，并以此成功建立了检测NGAL的双抗体夹心ELISA方法。 

材料和来源 

实验动物：Balb/c小鼠购自第三军医大学实验动物中心（中国重庆）。 

细胞株和质粒：293细胞株中国典型培养物保藏中心购买（CCTCC），pcDNA3.1质粒购自Novagen公司。 

细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司，Lipo2000购自Novagen公司。 

酶及试剂盒：限制性内切酶EcoRⅠ及Acc65Ⅰ和质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根公司。 

其它试剂：HRP-山羊抗小鼠IgG购自中山公司。 

实施例1NGAL重组蛋白的制备 

1.NGAL编码序列全基因获得 

根据GeneBank提供的NGAL基因序列（NM_005564.3），确定人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白基因拟克隆序列，具体如SEQ ID NO:2所示： 

设计NGAL全长引物：分别如SEQ ID NO:3和4所示 

SEQ ID NO:3：NGAL-1：5’-TAAGGTACCCATGCCCCTAGGTCTCCTG-3’ 

SEQ ID NO::4：NGAL-2：5’-GGTGGAATTTTAGCCGTCGATACACTG-3’ 

引物分别含酶切位点：NGAL-1：Acc651；NGAL-2：EcoRⅠ，由Invitrogen公司合成。 

通过Trizol Reagent法提取白细胞总RNA，通过逆转录获得白细胞cDNA，通过PCR扩增获得人NGAL，建立PCR体系，在不同的退火温度下进行PCR。取25μL PCR产物1%TAE电泳进行分析（图1）。使用北京天根的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（普通离心柱型）回收PCR产物。2.NGAL重组质粒构建及酶切鉴定 

将pcDNA3.1载体及NGAL PCR回收产物分别用EcoRⅠ和Acc65Ⅰ双酶切消化1h后，进行DNA凝胶电泳，回收目的条带，用T4DNA连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，将菌液混匀后涂于含氨苄青霉素的LB培养板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基扩大培养过夜。 

用质粒提取试剂盒从培养细菌中提取质粒，用EcoRⅠ和Acc65Ⅰ双酶切后行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在约600bp处可见特异性条带，表明pcDNA3.1载体中 已插入大小约为600bp的片段（图2）。 

3.NGAL重组质粒目的片断测序 

将pcDNA3.1-NGAL重组质粒送往上海英骏公司测序，并应用Vector5.0工具将测序结果与GeneBank的NGAL序列进行同源性分析。测序的结果显示，插入片段长度为597bp，与GeneBank中报道的NGAL序列完全一致。 

4.NGAL重组蛋白的表达及鉴定 

1）293细胞的复苏和培养 

将冻存的293细胞迅速由液氮转入37℃水浴中，将DMEM培养基和血清37℃预热并配置含10%小牛血清的DMEM完全培养基。将细胞悬液移入37℃预热的完全培养基，1000rmp/min离心5min，弃上清，加入3-4mL含10%胎牛血清的完全培养基并轻轻吹匀，转入培养瓶中，置于5%CO₂、37℃孵育箱培养，每日换液。 

2）转染293细胞 

将培养的293细胞接种至六孔板内，次日观察细胞长满平板达90-95%密度，用转染试剂Lipofectamin2000（Invitrogen公司）将重组质粒pcDNA3.1转染转染到293细胞中，培养48h后加入G418（800μg/ml），培养3天，收取上清和细胞进行Wester nblot鉴定（图3）。确定转染成功进行克隆化，得到稳定表达细胞株并扩大培养。 

3）NGAL重组蛋白的表达和纯化 

收取培养上清，使用蛋白亲和层析柱（Ni²⁺22DA2Sepharose Fast Flow）纯化重组蛋白（图4）。收集得到成品蛋白，然后分别取样行SDS-PAGE电泳（图5），经HPLC检测其纯度为95%。 

5.NGAL重组蛋白浓度、纯度鉴定 

Lowry法测定重组蛋白浓度：按照常规方法制备用于分析的标准曲线并测定标本浓度，多管计算平均值，测得浓度为0.54mg/ml。 

实施例2生物信息学分析及免疫原的确定 

1.从GENEBANK中查找NGAL蛋白的氨基酸序列，该蛋白由198个氨基酸 残基组成。 

2.在线生物信息学糖基化预测分析NGAL蛋白中86位氨基酸可能会被糖基化，为能得到最好的能够识别天然蛋白的特异性单克隆抗体，选取293细胞表达的全长NGAL蛋白作为免疫原，其氨基酸序列具体同SEQ ID NO:1。 

实施例3抗NGAL单克隆抗体的制备 

1.NGAL单克隆抗体的制备 

将重组全长NGAL蛋白与等量的弗氏完全佐剂乳化，抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只8周龄左右的Balb/c小鼠，进行基础免疫（100μg/小鼠）。2周后，将NGAL全抗原与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只Balb/c小鼠，进行追加免疫（100μg/小鼠）；2周后，再采用同样方式追加免疫一次，7天后处死取出小鼠脾脏，将脾细胞进行细胞融合。 

融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞（Sp2/0）以8:1混合，以聚乙二醇为融合剂。融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中，并置于6%CO₂中在37℃培养。用ELISA法进行筛选。对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行亚克隆，并置于5%CO₂中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止，即可进行单克隆抗体的扩大培养。 

采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行扩大培养。取已成年的Balb/c小鼠，于腹腔内注入液态石蜡0.5mL，1周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至4×10⁵个/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞。10-14天后收集腹水。 

2.NGAL单克隆抗体的纯化 

收集腹水后对其进行纯化，具体方案为：配置抗体纯化所需buffer：Binding Buffer（A液，20mmol/L磷酸钠，0.8mol/L(NH4)₂SO₄，pH7.5）；Elution Buffer（B液，20mmol/L磷酸钠，pH7.5）；Regeneration buffer（C液，20mmol/L磷酸钠，pH7.5，并按体积比30%加入异丙醇）。在单抗腹水中加入硫酸铵，使其终溶度与A液中硫酸铵的溶度一致，0.45μm滤膜过滤等待上样；选用HiTrap IgG Purification HP柱接入AKTA prime蛋白纯化仪，用A、B液和C液对柱子进行 充分洗涤，用A液进行充分平衡后，将准备的样品从A管上样，上样后用A液平衡柱子，去除杂蛋白，再用B液洗脱纯化柱，收集洗脱峰；调节洗脱蛋白的pH至7.0-8.0，将抗体分装冷冻于-20℃保存；用C液使填料进行再生，然后用A液进行平衡即可。 

3.抗NGAL单克隆抗体亚类的鉴定 

采用美国Sigma公司Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents（ELISA/Ouchterlony Double Diffusion，Stock No.ISO-2LOT114k4817），操作按说明书进行。 

1）包被酶标板：用包被液将NGAL重组蛋白稀释为最佳工作浓度5μg/mL，每孔加100μL抗原液，每株加12孔，于4℃过夜，洗涤5遍，空干。 

2）封闭：每孔加封闭液350μL，37℃孵育1h～1.5h，洗涤5遍，空干。 

3）每孔加入100μl新鲜的杂交瘤细胞培养上清或稀释单抗，室温（20℃～25℃）静置1h，摇洗3min，共5次。 

4）用抗体稀释液以1:2000稀释IgM、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG、IgA。 

5）每孔加入100μL已稀释的抗体，每种抗体均加2孔，室温静置30min，摇洗3min，共5次。 

6）每孔加入100μL1：1000稀释的兔抗羊IgG抗体，室温静置15min，摇洗3min，共5次。 

7）每孔加入100μL底物显色液，室温避光反应10min～15min。h.每孔加入50μL终止液，观察结果，确定Ig亚类。 

4.单克隆抗体亲和力鉴定 

以Friguent法测定亲和力常数，将NGAL抗原溶解在0.05mol/L碳酸缓冲液（pH9.6）中，终浓度为lμg/ml，以每孔100μl的量将溶液加到96孔板中4℃包被过夜，以含1%BSA的PBS溶液对板进行封闭，将板干燥后在4℃保存备用。 

反应系统的建立：反应系统中抗NGAL单抗的初始浓度为20ng/mL。NGAL抗原的初始浓度从1000ng/ml（1250x l0mol/L）往下倍比稀释，形成8个反应 系统，在37℃反应lh；以每孔100μl将反应液以双孔加入到包被了NGAL抗原的免疫反应板，37℃孵育lh后洗板5次；加人100μ1山羊抗鼠二抗每结合物溶液37℃反应lh，洗板5次，加人底物显色15min后加人终止液，测定OD450值计算各个反应系统的抗原结合率推算亲和力常数，得出1-F2亲和力为6.39×10¹⁰M^-1，1-G2为3.65×10⁹M^-1。 

5.ELISA鉴定抗NGAL单克隆抗体 

将纯化的NGAL抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml，ELISA条板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出板子弃抗原，洗板。将待鉴定单克隆抗体作1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000......，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1h，洗板，加入二抗，1:3000稀释HRP标记山羊抗小鼠IgG，按100μl/孔加入对应条孔中，37℃孵育40min。弃液，洗板，拍干，加入底物液100μl/孔，避光显色10min，加入终止液50μl/孔。结果可见，抗NGAL单克隆抗体1-F2和1-G2呈现肉眼可见的浓度梯度（图6、图7）。 

6.抗NGAL单克隆抗体的Western blot鉴定 

1）将Marker3μl、NGAL抗原20μl、无关蛋白procalcitonin（PCT）20μl电泳。 

2）电泳结束后，取下凝胶，置于转印缓冲液中平衡10min。 

3）将0.22μm PVDF膜先用无水甲醇处理20s，再用ddH2O洗涤5min。然后再浸入Transfer Buffer超过5min。同时将滤纸浸入Transfer Buffer中。 

4）转膜：从下至上依次排列，滤纸-PVDF膜-胶-滤纸，排出气泡，放入转膜仪，18V恒压电转移1.5h。 

5）转膜完成后，在膜上可见清晰蛋白marker，ddH2O清洗两遍，TBST洗5min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭2h。 

6）弃去封闭液，用1×TBST漂洗膜3次，每次15min。 

7）加入以1:1000稀释的纯化抗体，4℃孵育过夜。 

8）1×TBST漂洗膜3次，每次15min。 

9）加入已稀释到1:10000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育3h。 

10）1×TBST洗涤3次，每次15min。 

11）用化学发光显色，显影定影后，观察分析结果并摄像。在重组NGAL蛋白25KD处均可见抗NGAL单克隆抗体结合清晰条带（图8、图9）。 

实施例4双抗体夹心ELISA法检测标准中的NGAL 

1.HRP标记抗体 

本法是以NaIO₄先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体蛋白的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，具体步骤如下：称取10mg HRP酶，加2mL纯水配置为5mg/ml的HRP液体，按照每mg HRP酶加入34μL计算，加340μLNaIO₄，4℃避光放置，1h后，按照每mg HRP酶加入250μL的量加入乙二醇250μL，避光放置4℃，30min后转入透析袋中，用1mM醋酸缓冲液（pH4.0-4.4）透析过夜，期间至少换液2次，均要求避光。抗体的准备：0.01M的PBS缓冲液进行4℃透析过夜，并测定蛋白浓度。标记：抗体与HRP酶按1:1（质量比）混合，加入1mol/LNa₂CO₃缓冲液（1:80），调解反应的pH为9.5，25℃反应2-3h。终止：新鲜配制0.1mol/LNaH₄B（4mg/mL），按照每mg HRP酶加入47μl。4℃放置2h后，转入透析袋。用0.01mol/L PBS缓冲液（pH7.0-7.2）透析过夜，期间至少换液两次，避光。分装保存：标记好的抗体用避光EP管分装，并测定抗体效价。-20℃保存。 

2.抗体配对及临床样本的检测 

1）标本收集： 

从第三军医大学第一和第二附属医院收集临床诊断明确肾病患者的尿液标本，取回过程中用冰袋储存，以保持标本新鲜，离心取上清加防腐剂后做好标记分装于1.5ml Ep管中，-80℃保存，并将病人基本信息录入电脑，做好编号。 

2）标本检测： 

选取单克隆抗体1-F2作为捕获抗体，酶标单克隆抗体1-G2作为检测抗体，重组蛋白NGAL为标准品，样本检测方法如下： 

a.包被酶标板：用包被液将抗体稀释为5μg/ml，每孔加100μl，4℃包被过夜。 

b.将包被过夜的酶标板洗3遍，甩干。 

c.封闭：每孔加封闭液350μl，37℃孵育1h，洗涤3遍，甩干。 

d.用抗体稀释液将NGAL重组蛋白从500ng/ml开始倍比稀释，每孔加100μl，第一孔为空白对照，做标准曲线。检测33例肾损伤标本，24例正常标本，每孔加100μl，37℃孵育1h。 

e.洗板3遍，甩干。 

f.将相对应的酶标二抗以1:5000稀释，每孔加入100μl，37℃孵育30min。 

g.洗板5遍，甩干。 

h.每孔加入100μl底物显色液，室温避光显色5min。 

i.每孔加入50μl终止液，读板，根据标准曲线确定临床样本中NGAL的含量。 

3）统计学分析 

运用SPSS13.0软件将心梗组合正常对照组用ELISA所测NGAL结果进行统计学分析。 

结果表明，利用配对抗体1-F2-1-G2和NGAL重组蛋白标准品成功绘制了标准曲线（图10），并且在对24例正常尿液和33例肾损伤患者尿液检测时发现，33例肾病患者(285.854ng/ml)显著高于24例正常血清(6.155ng/ml；P<0.01)（图11），说明配对抗体能够成功应用于天然血清中NGAL的检测。 

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。 

序列表

 

Claims (10)

1.一种产生抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO.C2012197。

2.一种产生抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO.C2012198。

3.如权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后，小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。

4.如权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示。

5.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亚类属于IgG1。

7.一种由权利要求2所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。

8.一种如权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亚类属于IgG1。

9.如权利要求5和/或7所述的单克隆抗体在制备人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白免疫检测制剂中的应用。

10.一种用于诊断或检测肾损伤的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求5和/或7所述的单克隆抗体。

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