CN102776153A - 鼠抗人ngal单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2及其分别产生的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2。本发明提供的两种单克隆抗体属于相同的IgG2a亚类，但是识别不同的表位，能够同时与具有SEQIDNO.1所示氨基酸序列的NGAL重组蛋白特异性结合。本发明的两种单克隆抗体可应用于人体液中NGAL浓度的检测，具有重要的应用前景。

Description

鼠抗人NGAL单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体领域，涉及到杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2，及其分别产生鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1与鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2，可用于检测人体液中NGAL的浓度。

背景技术

1993年中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)在中性粒细胞中首次被发现。国内外研究表明，NGAL与炎症、胚胎发育、免疫应答、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程有关。在卵巢癌细胞系、结肠肿瘤和乳腺癌中的NGAL的表达明显增强。免疫组化证明在NGAL在胰腺癌中会从阴性增加到强阳性，肺癌组织中的NGAL呈强阳性，而支气管肺泡细胞癌和粘液细胞癌染色最强。

研究表明，在发生缺血性和毒性肾损伤过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL会显著增加，因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感标志物。进一步研究证实,NGAL是多种原因引起的肾损伤的一个保护因素并且由于分子量小，对蛋白酶有天然的抗性,NGAL在肾脏损伤后很快聚积,可作为急性肾衰的诊断标记物,是有效评价急性肾衰临床治疗效果及预后的良好指标。美国专利2004／0219603和2005／0272101描述了NGAL作为检测早期肾小管细胞损伤的标记物用途。

目前，NGAL抗体的制备的方法一般采用多抗制备方法，即利用NGAL免疫动物，纯化抗NGAL抗体，最后运用SDS-PAGE、Western blotting分别鉴定抗NGAL抗体的纯度与免疫反应性。用这种方法制备的NGAL抗体特异性和一致性存在局限，用于免疫组化时显色背景高，质量不易控制，难以在临床应用上推广。目前市场上已存在NGAL单克隆抗体，但是这些抗体主要用于实验室实验研究，尚不能很好地用于检测人细胞中NGAL的临床检测。因此，目前临床上迫切需要满足要求的NGAL单克隆抗体，以便进行肾损伤的临床快速诊断和预后判断，并指导临床治疗。

发明内容

本发明的目的是提供可产生鼠抗人NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明提供的可产生鼠抗人NGAL单克隆抗体的为杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2。杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2于2012年5月9日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号分别为CCTCC NO:C201249、CCTCC NO:C201250。

本发明的另一个目的是提供了鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2，所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2都能够与具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的NGAL重组蛋白特异性结合。

所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2均属于IgG2a亚类。

所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2具有不同的表位，能同时与NGAL重组蛋白特异性结合，所述NGAL重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体的方法，所述的方法包括：用SEQ ID NO.1所示的NGAL-Trx重组蛋白为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，选择能产生与重组NGAL蛋白反应而与杂蛋白不反应的抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或者从注射杂交瘤细胞的小鼠腹水中获得所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体。

所述的NGAL重组蛋白的制备方法为：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的质粒载体转化大肠杆菌，然后用IPTG诱导，纯化后得到NGAL重组蛋白。

本发明专利的又一个目的是提供鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2可用于人体液中NGAL浓度检测中的应用。

所述的体液包括尿液、血液、血清、血浆或其他纯化组分。

本发明的有益效果主要表现在：提供了可产生鼠抗人NGAL单克隆抗体的为杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2，以及鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2；鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2通过双抗夹心对人体液中NGAL浓度进行检测，具有重要的应用前景。

附图说明

图1为SDS-PAGE电泳检测目标NGAL蛋白结果，样1为包涵体蛋白，样2为纯化后的NGAL-Trx重组蛋白，M为蛋白marker；

图2为间接ELISA法检测鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1的效价结果，▲为杂交瘤细胞株3B1抗体，■为稀释液；

图3为间接ELISA法检测鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2的效价结果，▲为杂交瘤细胞株4C2抗体，◆为稀释液；

图4为鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2亚型鉴定结果；

图5为间接ELISA法检测鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1与NGAL特异性结合的结果，其中，对照组为人血清白蛋白HSA和BL21裂解物；

图6为间接ELISA法检测鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2与NGAL特异性结合的结果，其中，对照组为人血清白蛋白HSA和BL21裂解物；

图7为鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2通过双抗体夹心法测定NGAL重组蛋白的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1：NGAL重组蛋白的制备

1、NGAL原核表达载体的构建

合成表1中的引物序列，采用套叠(Gene SOEing)PCR技术将引物全部加入进行PCR扩增，然后以一次PCR产物为模板，以引物1和引物24为上下游引物，进行二次PCR扩增，得到NGAL目的片段（如SEQ ID No.2基因序列所示）。将其连接到原核表达质粒pET32a中，通过CaCl₂法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取菌落接种于50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃ 220r/min震荡培养过夜，用菌液做PCR鉴定，阳性克隆送测序验证。

表1  引物序列

2、NGAL-Trx融合蛋白的表达

测序正确质粒通过CaCl₂法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，复苏后转接到含50μg/mL氨苄青霉素LB培养基过夜培养，次日以1:100转接到新鲜的含有50μg/mL氨苄青霉素的的LB培养基中，于37℃220r/min震荡培养至A600=0.4～0.6时，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L的，37℃诱导表达4h。4℃,10000r/min，离心3min，收集沉淀。

3、NGAL-Trx融合蛋白的纯化

（1）用缓冲液A（50mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100mM NaCl）漂洗菌体细胞（10ml/g），离心6000g×15min,收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。

（2）将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B（50mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA，100 mM NaCl，1%NP-40）中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。

（3）将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ（50mM Tris-HCl （pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，0.5%Triton X-100（V/V），4M尿素）、缓冲液Ⅱ（50M Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，3% Triton X-100）、缓冲液Ⅲ（50mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，0.5%Triton X-100，2M 盐酸胍）分别超声洗涤一次，10000g离心收集包涵体沉淀。

（4）包涵体的溶解：用含高浓度尿素的缓冲液室温放置30min，然后离心10000g×15min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。

（5）溶解后的包涵体蛋白通过亲和层析进一步纯化：将2mL IMAC Sepharose High Performance装入简易层析柱，用5个柱体积结合缓冲液平衡镍柱，蛋白样品经0.45μm滤膜过滤后上柱，用10个柱体积结合缓冲液洗涤后用含300mM咪唑洗脱液进行洗脱，并以每管收集1ml洗脱液；用10个柱体积纯水过柱清洗；用20％乙醇过柱，并于4℃保存。

4、SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE电泳检测目标NGAL蛋白，结果见图1，样1为包涵体蛋白，样2为纯化后的NGAL-Trx重组蛋白，M为蛋白marker。融合蛋白以包涵体的形式存在，其理论分子量为37.7KD。BCA法检测蛋白浓度为2mg/ml,用ELISA方法，以临床标本数值做标准曲线，测得蛋白浓度为1.2 mg/ml，说明表达的蛋白具有良好的免疫活性，可进一步用于抗体制备。

实施例2：动物免疫

以纯化的人NGAL重组蛋白为抗原，常规方法免疫6周龄BALB/c小鼠，首次基础免疫皮下注射抗原200μg，使用完全弗氏佐剂；每隔2周进行一次免疫，共三次，100μg/只/次，最后一次基础免疫后2周后腹腔注射加强免疫，50μg/只，断尾采血检测小鼠血清抗体效价达到1:10⁴以上，免疫完成。

实施例3 ：杂交瘤细胞的制备

1、饲养细胞的制备

以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，其制备方法为：取一只BALB/c小鼠，将小鼠拉颈处死，用75％酒精体表消毒，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用75％酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml DMEM培养液至腹腔，反复冲洗，回收冲洗液，1000r/min离心10分钟，弃上清，得到饲养细胞。用含15％小牛血清的DMEM培养液重悬沉淀，调整细胞浓度为2×10⁵个/ml。将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml，置37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜，备用次日。

2、免疫脾细胞的制备

取免疫后的BALB/c小鼠，通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，无菌条件下取出脾脏，至于平皿中，DMEM培养液清洗1次。将脾脏移入另一盛有10ml DMEM培养液的平皿中，使脾细胞进入培养液。将脾脏研磨成细胞悬液后，用吸管吹打数次使细胞分散均匀，过滤，收获脾细胞悬液，1000r/min离心10分钟，用DMEM培养液离心洗涤2次，然后将细胞重悬，计数，用于细胞融合。

3、骨髓瘤细胞

于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养，融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管。1000r/min离心10分钟，弃去上清。加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。取骨髓瘤细胞悬液，计数，用于细胞融合。

4、免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合

将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶5比例混合，在50ml离心管内用DMEM培养液洗1次，1000r/min，离心10min，弃上清，用滴管小心吸出残留液体。在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热。在45秒内加入预热至40℃的50％PEG(PH 8.0)1ml，然后缓慢滴加DMEM培养液至10ml，作用10min。1000r/min，离心5min，弃去上清。加入5mlHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培养基至80ml。分装96孔细胞培养板，每孔0.1ml，然后将培养板置37℃，5％CO₂培养箱内培养。

24小时后用HAT培养基换出1/2培养基，4天后完全换液。两周后用HT培养基换出HAT培养基，再维持两周后，改用RPMI 1640培养液。

HT培养基的配制方法：将100倍浓缩的HT液体（1mL）以及100倍浓缩的谷氨酰胺（1mL）稀释入DMEM培养基。

HAT培养基的配制方法：将100倍浓缩的HT液体（1mL）、100倍浓缩A液体（1mL）以及100倍浓缩的谷氨酰胺（1mL）稀释入DMEM培养基（97mL）。

100倍浓缩的HT液体的配制方法：称取136.1mg次黄嘌呤，38.8mg胸腺嘧啶核苷，逐次溶解在100ml双蒸水中，过滤除菌，分装，于-20℃保存。

100倍浓缩A液体的配制方法:称取1.76mg氨基喋呤，加入80ml双蒸水加入1mol／L氢氧化钠溶液至完全溶解，再加1mol／L盐酸将pH调制7.0，然后定容至100mL，过滤除菌，分装，于-20℃保存。

100倍浓缩的谷氨酰胺的配制方法：称取2.92g L-谷氨酰胺溶于100mL双蒸水中，过滤除菌，分装，于-20℃保存。

5、杂交瘤细胞的筛选

杂交瘤细胞融合两周后，观察杂交瘤细胞的生长情况，当克隆长至孔底面积的1／3～1／2时，取上清，用间接ELISA方法进行检测，筛选出能分泌抗NGAL抗体的杂交瘤孔。

6、杂交瘤的克隆化和冻存

a)杂交瘤细胞的克隆

克隆化方案为有限稀释法，按照常规杂交瘤细胞克隆方法进行，同法克隆进行三次。

b)杂交瘤细胞的冻存

细胞冻存液：20％小牛血清+70％DMEM培养液+10％二甲基亚砜

将杂交瘤细胞离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为10⁶-10⁷/ml，转移至冻存管中，每瓶1ml。置于-70℃冰箱中，次日转入液氮中。

实施例4 ：单克隆抗体的制备

本发明中，大量生产单克隆抗体的方案为小鼠腹水法，步骤如下：

本方案将上述获得的杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，得到大量的腹水单抗。

具体方法为：BALB/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.5ml。两周后，腹腔接种用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠1×10⁶个杂交瘤细胞。间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待小鼠腹部可见明显膨胀，反复几次抽取腹水。室温静止30min，1000r/min，离心10min，收集上清，分装，-70℃冻存备用。

实施例5：鼠抗人NGAL单克隆抗体纯化以及鉴定

1、单克隆抗体的纯化

将实施例3中的获得的腹水单抗通过为protein A亲和柱层析法进行纯化，具体步骤为：

平衡：用5～10CV的平衡缓冲液（20 mM PB+0.15M NaCl，pH 7.0，添加适当浓度的NaCl抑制非特异性吸附）平衡层析柱，至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。

上柱：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤（0.45μm）处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。

洗涤：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

洗脱：用洗脱缓冲液（20 mM乙酸钠，pH 3.0-4.0或0.1M甘氨酸，pH 3.0）洗脱，收集流出液。洗脱后，应立刻用碱性缓冲液（1M Tris/HCl，pH 9.0）将收集到的抗体溶液中和到中性，避免抗体失活，维持抗体的生物活性。

再生、原位清洗：介质使用数次（5-10次）后，需要对介质进行再生、在位清洗。

（1）用0.1M的乙酸或0.1M的乙酸/20%乙醇淋洗柱子3～5CV，然后用缓冲液洗到中性即可重复使用。

（2）也可用0.05M NaOH+1M NaCl或6M盐酸胍淋洗柱子3～5CV，并用3～10 CV的纯水冲洗，然后用缓冲液洗到中性即可重复使用。

2、鼠抗人NGAL单克隆抗体效价测定

用间接ELISA法测定NGAL单抗的效价。包被抗原为NGAL重组蛋白（3ug/ml），对照为PBS缓冲液，抗体浓度从1:1000开始进行10倍梯度稀释至1：10⁷。检测纯化的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2的效价均为1：10⁵（结果见图2和图3）。

3、鼠抗人NGAL单克隆抗体亚型鉴定

使用sigma抗体亚型鉴定试剂盒（货号为ISO2）鉴定，鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2的亚型均为IgG2a（结果见图4）。

4、抗体特异性鉴定

用间接ELISA法择鉴定NGAL单抗的特异性，包被抗原为NGAL重组蛋白（3ug/ml），对照为大肠杆菌BL21裂解产物和人血清白蛋白HSA（各为3ug/ml）。结果表明鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2对重组NGAL蛋白抗原均具有特异性（结果见图5和图6）。

5、抗体表位类型分析

为了确定两株抗体所识别的抗体表位类型，对它们所结合的抗原表位进行了初步的定性分析，确定它们多识别的是线性表位还是构象表位。如果识别的是构象表位，那么在抗原变性后，反应活性将大大下降（＞50%），如果识别的线性表位，那么活性下降幅度会比较小（＜50%）。首先，将重组NGAL抗原加入8M尿素，使之线性化，用间接ELISA法测定变性前后3B1、4C2两株抗体(5ug/ml)的OD450，结果见表2，从表中可以看出抗体3B1、4C2对变性后NGAL的反应活性比变性前分别降低了88.18%和90.42%，表明它们识别的表位是构象表位。

表2单克隆抗体对变性前后抗原的反应结果

抗体名称	OD450（变性前NGAL）	OD450（变性后NGAL）	反应活性减低（%）
				3B1	2.978	0.352	88.18
4C2	2.934	0.281	90.42

实施例5：双抗体夹心法检测NGAL 

1、单克隆抗体的生物素标记

纯化后的单克隆抗体的酶标记物的制备方案为NHS活化生物素偶联法，具体步骤如下：

抗体在标记前用PBS(pH 7.4)调整浓度为2mg/ml。按照产品说明书，用水配制10mM的Sulfo-NHS-Biotin溶液，按IgG:Biotin摩尔比1:20～1:50加入，室温振摇反应30分钟。然后用超滤管超滤去除未结合的生物素或用透析袋在PBS透析液中4℃透析过夜除去未结合生物素。调整标记抗体至适宜浓度即可使用。

2、双抗体夹心法检测NGAL重组蛋白

用夹心ELISA法检测NGAL重组蛋白，其中用将抗体3B1包被在酶标板上，将4C2抗体用生物素标记，检测的抗原是NGAL重组蛋白，对照为稀释液。结果见图7。结果表明，生物素标记抗体4C2-bio可以和3B1进行配对特异检测NGAL重组蛋白，进一步表明4C2抗体和抗体3B1是不同的抗体，它们的识别的抗原表位是不同的。同时，这个结果表明，单克隆抗体4C2与3B1配对可用于开发检测NGAL的诊断试剂。

3、双抗体夹心法检测尿液样本中NGAL含量

用夹心ELISA法检测尿液样本中NGAL含量，其中用将抗体3B1包被在酶标板上，将4C2抗体用生物素标记，对照为空白。200例正常人中尿液样本OD＜0.120，即均为阴性，而在130例患者中，仅有1例为阴性，并且所有样本检测的0D值与样本浓度的相关性良好（R²＞0.9），由此可以看出，用鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2对NGAL进行检测的效果良好。

＜110＞南京基蛋生物科技有限公司

＜120＞鼠抗人NGAL单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用

＜160＞2

 

＜210＞1

＜211＞178

＜212＞PRT

＜213＞人

＜400＞1

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln

                          5                            10                          15                             20

Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala

                           25                             30                           35                            40

Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu

                          45                              50                          55                           60

Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile

                         65                          70                            75                           80

Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr

                         85                             90                            95                         100

Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met

                         105                          110                       115                           120

Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg

                        125                         130                        135                          140

Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

                         145                        150                        155                         160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly

                         165                       170                       175           178

 

＜210＞2

＜211＞537

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞

＜223＞根据NGAL蛋白氨基酸序列推断的基因序列

＜400＞2

caggactcta  ctagcgatct  gatcccggct  ccgccgctgt  ccaaagttcc  gctgcaacag 60

 

aacttccagg  acaatcagtt  ccagggcaaa  tggtacgtag  ttggcctggc  cggcaacgcg 120

 

attctgcgtg  aagataaaga  ccctcagaaa  atgtacgcta  ccatctacga  gctgaaggag 180

 

gataagtctt  ataacgtgac  cagcgtgct  gttccgcaag  aagaaatgtg  actactggatt 240

 

cgtaccttcg  ttccgggctg  tcagcctggc  gagttcaccc  tgggtaacat  caaatcttat 300

 

ccgggcctga  cctcctatct  ggtacgcgtt  gtatccacga  actacaacca  gcatgcaatg 360

 

gtgttcttta  aaaaggtgtc  ccagaaccgt  gaatacttca  aaattaccct  gtacggtcgc 420

 

acgaaagaac  tgacttctga  actgaaagaa  aactttattc  gtttcagcaa  aagcctgggt 480

 

ctgccagaga  atcacatcgt  ctttccggtt  ccgattgacc  aatgcatcga  cggttaa    537

 

Claims (8)

1.保藏号为CCTCC NO：C201249的杂交瘤细胞株3B1和保藏号为CCTCC NO：C201250的杂交瘤细胞株4C2。

2.鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2分别由杂交瘤细胞株3B1和杂交瘤细胞株4C2产生，其特征在于，鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2都能够与具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的NGAL重组蛋白特异性结合。

3.权利要求2所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2均属于IgG2a亚型。

4.根据权利要求2所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2能同时与NGAL重组蛋白特异性结合，具有不同的表位。

5.一种制备权利要求2所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体的方法，包括：用SEQ ID NO.1所示的NGAL-Trx重组蛋白为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，选择能产生与NGAL重组蛋白反应而与杂蛋白不反应的抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或者从注射杂交瘤细胞的小鼠腹水中获得所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的NGAL重组蛋白的制备方法为：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的质粒载体转化大肠杆菌，然后用IPTG诱导，纯化后得到NGAL-Trx重组蛋白。

7.根据权利要求2所述的鼠抗人NGAL单克隆抗体3B1和鼠抗人NGAL单克隆抗体4C2可用于人体液中NGAL浓度检测的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的体液包括尿液、血液、血清、血浆或其他纯化组分。

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