CN107746430A - 一种gp73 c端抗原的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种GP73 C端蛋白，由此制备抗GP73 C端的单克隆抗体，为了解决目前临床上缺乏GP73定量检测试剂盒作为肝硬化早期诊断检测手段的不足，本发明的另一目的在于提供了一种操作简便、准确灵敏、质量稳定、可大规模生产的检测试剂盒及其测定方法，以便从蛋白水平上观察GP73表达含量，能尽早采取有效的综合治疗方案，有效预防肝硬化的进一步恶变。

Description

一种GP73 C端抗原的制备及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及GP73 C端抗原的制备及其应用。

背景技术

肝硬化是各种慢性肝病发展的晚期阶段，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。在我国大多数为肝炎后肝硬化，少部分为酒精性肝硬化和血吸虫性肝硬化。病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生、结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化。早期由于肝脏代偿功能较强可无明显症状，后期则以肝功能损害和门脉高压为主要表现，并有多系统受累，晚期常出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、脾功能亢进、腹水以及癌变等并发症。

引起肝硬化的病因很多，可分为病毒性肝硬化、酒精性肝硬化、代谢性肝硬化、胆汁淤积性肝硬化、肝静脉回流受阻性肝硬化、自身免疫性肝硬化、毒物和药物性肝硬化、营养不良性肝硬化及隐源性肝硬化等。

Child－Pugh分级标准是一种临床上常用的对肝硬化患者的肝脏储备功能进行量化评估的分级标准，该标准最早由Child于1964年提出，当时Child将患者5个指标(包括一般状况、腹水、血清胆红素、血清白蛋白浓度及凝血酶原时间)的不同状态分为三个层次，分别记以1分，2分和3分，并将5个指标计分进行相加，总和最低分为5分，最高分为15分，从而根据该总和的多少将肝脏储备功能分为A、B、C三级，预示着三种不同严重程度的肝脏损害(分数越高，肝脏储备功能越差)。但由于患者的一般状况项常常不易计分，随后Pugh提出用肝性脑病的有无及其程度代替一般状况，即如今临床常用的Child－Pugh改良分级法。

肝硬化又可分为代偿期和失代偿期肝硬化。代偿期肝硬化相当于Child－Pugh标准中的A级，失代偿期相当于B和C级。

肝硬化疾病呈现一个慢性过程。在Child－Pugh的任一级，或代偿期和失代偿期，其病理组织学上均有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生、结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化。

肝纤维化是疾病演变中一个连续进展的过程，也是慢性肝病演变为肝硬化的中间必经阶段。

临床上较难将肝纤维化和肝硬化两者截然区别，但是二者有本质的区别。肝纤维化不是一种独立的疾病，仅是一种伴随多种慢性肝病的肝脏病变，肝纤维化是由肝脏内弥漫性细胞外基质(特别是胶原)过度沉积而引起的，肝硬化则是过度纤维化使肝脏萎缩变硬而引起的。

肝纤维化是肝硬化的前期病变，其早期是可逆的，而肝硬化是肝纤维化进一步发展的结果，是多种肝脏疾病的终末期表现，通常较难逆转。

肝纤维化的病理特点为汇管区和肝小叶内有大量纤维组织增生和沉积，但尚未形成小叶内间隔，肝硬化则有假小叶形成，中心静脉区和汇管区出现间隔，肝脏的正常结构遭到破坏，肝纤维化进一步发展即为肝硬化。

总之，肝硬化是一种慢性进行性肝病。早期诊断有助于在肝纤维化阶段进行有效的治疗，使肝脏疾病成为可逆，否者发展成为肝硬化预后较差。

目前诊断肝硬化的辅助检测方法主要包括：影像学检查、肝活检和实验室的血清学检测。影像学检查结果可靠，但是只有肝脏组织结构发生明显变化时才能发现，因而不利于肝硬化的早期诊断。肝脏活检可以建立肝硬化的明确诊断，但是由于其创伤性，较难为患者接受。而目前实验室的血清学检测均为肝纤维化检测，很难给出肝硬化的明确诊断。以肝纤维化阶段的四项检查(Ⅲ型前胶原，Ⅳ型胶原，层粘连蛋白和透明质酸酶)为例，肝纤维化四项检查因为受到肝脏的炎症影响较大，因此其特异性和灵敏度均不高。

GP73又名Golm1或Golph2，是研究人员在2000年首先发现的一种Ⅱ型高尔基体跨膜蛋白。分子量约45KD，糖基化后约为73KD，其在GeneBank中的序列号为51280。因为在电泳时显示7.3×10⁴的分子量，因而称为GP73。编码GP73的基因位于第9号染色体，全长共3080个核苷酸，其基因中含有1200bp的开放阅读框架，编码402个氨基酸，具有5个糖基化位点。GP73是一个由胞内、跨膜和胞外三个区域构成的跨膜蛋白。免疫组化研究证实：多种细胞可表达GP73，而正常肝细胞表达量很少甚至不表达。正常情况下，GP73是高尔基体膜上的一种整合膜蛋白，疾病情况下可分泌到细胞内以及细胞表面。有研究人员证实：GP73经剪切酶作用分泌到细胞外，进入外周血。

进一步又有研究人员发现：慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎患者肝脏组织中GP73水平高于正常人70倍。在各种肝病中GP73表达均有升高，提示GP73水平与病毒感染无关。进一步研究发现：在所有细胞中，所有肝病均引发GP73升高，而在结缔组织周边和肝硬化结节部位尤为显著。

根据发明人所进行的资料检索，国内外尚无其他有关检测针对GP73C端的双单抗夹心ELISA方法的报道。

发明内容

为了探讨单克隆抗体检测GP73蛋白在肝硬化诊断中的敏感性和特异性，本发明做了大量临床试验。结果表明血清GP73可以作为肝硬化的辅助诊断指标，特别是在慢性肝炎转为肝硬化的过程中，更具有重要的临床诊断价值。

本发明的目的在于，提供一种GP73 C端蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明的另一目的在于，提供一种GP73 C端蛋白的制备方法，主要包括如下步骤：

(1)PCR扩增：采用含BamHI、EcoRI酶切位点的引物PCR扩增GP73 C端基因(1019～1336bp)，酶切纯化后与经BamHI、EcoRI酶切后的PGEX-4T-2质粒连接，转化入大肠杆菌BL21；

(2)确定表达形式：随机挑选阳性克隆，25℃采用1％异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)化学诱导，1％NP-40裂解，-80℃反复冻融3次，离心，取上清和沉淀分别进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，确定表达形式；

(3)扩大培养及纯化：选取阳性克隆进行扩大培养，1％NP-40裂解，-80℃反复冻融3次，采用层析法纯化GP73C端抗原。

其中，步骤(1)中的上游引物为GC GCT GGA TCC CAG CTG GCC TCA(5’-3’，下游引物为GC GAA TTC TGA TGTGAG ATGATT。

本发明的另一目的在于，提供一种GP73 C端蛋白单克隆抗体制备方法，主要包括如下步骤：

(1)动物免疫

取重组GP73C端抗原蛋白300mg/L与完全福氏佐剂等量混合制成乳化剂，共免疫Balb/c小鼠5只；第1次免疫100μg/只，皮下多点注射,2周后用不完全福氏佐剂第2次免疫，剂量、途径与第1次相同；2周后尾静脉取血测定效价，效价达1：1000～1：5000时供融合用；融合前3天用抗原直接腹腔脾区加强免疫1次；

(2)采用间接ELISA法测定效价

包被聚苯乙烯板的纯化重组GP73C端抗原浓度为5mg/L，酶标记抗体为羊抗鼠IgG(Sigma公司产品，工作浓度为1：5000)，酶标仪450nm波长测定OD值；P/N值≥2.1倍为阳性，＜2.1倍为阴性(N值<0.05，按0.05计算)；

(3)免疫脾细胞的制备

取已免疫Balb/c小鼠，眼球放血供检测抗体用；无菌操作取出脾脏，轻轻清洗并去除结缔组织，置于铜网上挤压研磨，并通过网孔挤到溶液中，离心1000r/min，5min,弃上清,重悬于溶液中制成脾细胞悬液，加台盼兰染液作细胞计数；

(4)髓瘤细胞液制备

将骨髓瘤细胞置于37℃5％CO₂培养箱中扩大培养；融合当天收集处于对数生长期的SP2/O骨髓瘤细胞，离心1000r/min,5min,弃上清，重悬于液体后作细胞计数；

(5)细胞融合

分别吸取脾细胞和骨髓瘤细胞悬液按5：1混合，置于离心管内充分混匀后离心，弃上清，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状；取50％的聚乙二醇(PEG)0.7ml加入混合细胞中促进融合，严格控制作用时间在2～3min内，立即加入不完全培养液稀释，使PEG中止作用；离心800r/min,7min,弃上清；加入10mL HAT培养液制成细胞悬液,并加入已铺成饲养细胞层的96孔板中，每孔0.1mL，置37℃5％CO2培养箱中培养，4～5d后换液1次，8～10d时取上清，用ELISA法测效价，进行初筛，阳性孔进行亚克隆；

(6)杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)及腹水制备

将96孔板中待做克隆化的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，取少许细胞悬液置另一无菌小瓶中；将此细胞悬液准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞；将稀释好的细胞悬液接种于已铺有饲养细胞层的96孔板中，每孔0.1mL，即每孔含一个细胞，置37℃5％CO₂培养箱中培养，5d左右在倒置显微镜下观察细胞克隆生长情况；反复克隆3次，确定阳性单克隆细胞株，最后对克隆细胞株编号，置液氮中保存。

本发明的另一目的在于，提供一种用于诊断肝脏疾病的试剂，其中含有GP73 C端蛋白单克隆抗体。

本发明的另一目的在于，提供用于诊断肝脏疾病的试剂盒，其中含有GP73 C端蛋白单克隆抗体。

本发明的另一目的在于，提供上述的试剂和/或试剂盒在制备用于诊断肝脏疾病产品中的应用。

具体的，针对GP73胞膜外区不同表位，本发明筛选到3对配对较好的单抗。

且，本发明公开了上述单克隆抗体i)通过ELISA法检测血清中GP73含量试剂盒方面的应用；ii)通过磁珠化学发光法检测GP73含量试剂盒方面的应用；iii)通过ELISA法检测血清中岩藻糖基化GP73含量试剂盒方面的应用。

其中，GP73 C端蛋白夹心ELLSA定量检测方法，为用两株针对GP73 C端蛋白不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色检测GP73蛋白，通过校准品制备的标准曲线确定GP73蛋白的含量。

其中，包被抗体包被酶标板，检测抗体标记辣根过氧化物酶。

需要说明的是：GP73的C末端肽具有较好的亲水性和可及性，编码的氨基酸位于细胞外区域，不包含其他的跨膜区域，并且在人蛋白质库中是唯一的；同时，血清GP73是由弗林蛋白酶在第55位氨基酸处酶切后释放到胞外的，含有完整的C末端。因此，将GP73 C末端的一段序列作为表位，原核表达GP73 C端蛋白，由此制备的单抗针对于GP73 C端，用于生产试剂盒可提高样本中GP73的检出率。

软件分析确定为302～401位氨基酸，结果显示该片段抗原结合位点暴露较多，因而具有较强的抗原性，且亲水可溶，该片段含100个氨基酸，分子量较大，易于长期稳定贮存。采用基因工程方法制备GP73 C端蛋白，基因方法为：采用PCR方法扩增出编码表达GP73C端的DNA序列，然后将该序列插入到表达载体的多克隆位点，构建重组表达质粒，然后转化到表达宿主菌，构建得到工程菌株，工程菌株经诱导表达，分离纯化得到GP73C端重组蛋白。用表达合成的GP73C端重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备并筛选杂交瘤细胞株，制备腹水并纯化单克隆抗体。

采用双抗体夹心法制备针对GP73抗原的测定试剂盒，对人血清中GP73进行定量检测。用GP73C端的单克隆抗体包被酶标板，加入待测血清，反应后加入另一株GP73C端的单克隆抗体的酶结合物，再与TMB底物作用，显色强度与样本中GP73的浓度相关。采用HRP-mAb2替代HRP—兔多抗、或兔多抗及HRP—羊抗兔抗体的结合反应。

本发明的有益效果是，提供一种GP73 C端蛋白，由此制备抗GP73 C端的单克隆抗体，为了解决目前临床上缺乏GP73定量检测试剂盒作为肝硬化早期诊断检测手段的不足，本发明的另一目的在于提供了一种操作简便、准确灵敏、质量稳定、可大规模生产的检测试剂盒及其测定方法，以便从蛋白水平上观察GP73表达含量，能尽早采取有效的综合治疗方案，有效预防肝硬化的进一步恶变；

另外，本发明提供的GP73C端试剂盒检测限≤1.00ng/ml；线性范围：1.00～450.00ng/ml，相关系数≥0.9900；批内、批间变异系数CV≤15％；回收率85～115％；与AFP(甲胎蛋白)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)及人血清白蛋白交叉反应值≤1.00ng/ml；在2～8℃可稳定储存9个月。

附图说明

图1为实施例中用GP73校准品浓度对数与OD值对数绘制的标准曲线。

图2为肝硬化标本ROC曲线分析。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明创造进行进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或本领域技术人员在知识范围内能够推知的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中涉及的试剂和仪器用具，通常为商用可市购产品，或能够通过其他公开途径获得的产品。

实施例1 GP73 C端抗原制备方法

为了制备出特异性好、亲和力高的单克隆抗体进而应用于临床GP73检测试剂盒，首先要表达GP73C端抗原。GP73基因位于第9号染色体，全长3042bp，内含唯一开放读码框(1200bp)，有编码402个氨基酸。GP73与血清GP73(sGP73)在结构上是不同的。GP73由一段处在胞质中被豆蔻酰化的N末端、单一跨膜区和一段长的C端细胞外功能区构成。其N末端疏水，糖基化，含单一跨膜区和信号肽酶切割位点(aa28-aa29)，且包含两个螺旋—螺旋结构域。其C末端富含酸性氨基酸，内含十四(烷)酰化连续序列(GLGNGRRS)和有5个糖基化位点。紧接跨膜区有数个参与蛋白质之间相互作用的卷曲螺旋。这些性质提示，该蛋白质通过细胞外区域与其他蛋白质发生作用。GP73的C末端肽具有较好的亲水性和可及性，编码的氨基酸位于细胞外区域，不包含其他的跨膜区域，并且在人蛋白质库中是唯一的；同时，血清GP73是由弗林蛋白酶在第55位氨基酸处酶切后释放到胞外的，含有完整的C末端。因此，将GP73C末端的一段序列作为表位，原核表达GP73 C端蛋白，由此制备的单抗针对于GP73 C端，用于生产试剂盒可提高样本中GP73的检出率。软件分析确定为302～401位氨基酸，结果显示该片段抗原结合位点暴露较多，因而具有较强的抗原性，且亲水可溶，该片段含100个氨基酸，分子量较大，易于长期稳定贮存。

在众多的蛋白质表达系统中，原核表达系统具有易于操作、生长迅速、产量高及费用低廉等优势，因此本实验采用了原核表达系统。选择合适的载体和受菌体对表达外源基因非常重要，受菌体可根据外界环境因素的变化调整自身基因的表达，使自身生长和繁殖处于最佳状态，而且，由于原核生物自身转录和翻译是偶联的，原核生物对外界环境变化的反应也相当的快。本实施例采用PGEX-4T-2作为表达载体，它带有GST·Tag标签，可以用来纯化表达蛋白。

具体制备方法如下：

1.分析抗原表位：

从NCBI网站下载GP73的核苷酸和氨基酸全序列，应用Biosun生物学软件比对序列，分析抗原表位并筛选代表性抗原表位区段。确定为302～401位氨基酸，找到该区段对应的核苷酸序列，进行下一步的合成。软件分析结果显示该片段抗原结合位点暴露较多，因而具有较强的抗原性，且亲水可溶，该片段含100个氨基酸，分子量较大，易于长期稳定贮存。

2.获得GP73C端抗原基因：

根据GP73基因序列，设计针对GP73 1019～1336bp序列的引物。上游引物：GC GCTGGA TCC CAG CTG GCC TCA(5’-3’下游引物：GC GAA TTC TGA TGTGAG ATGATT(5’-3’以cDNA质粒为模板，通过PCR合成基因片段，进行PCR产物胶回收纯化，常规方法转化连接入PMD19T(测序载体)，进行测序验证。PCR扩增后，1.5％琼脂糖电泳鉴定，获得300bp的扩增片段，与预期结果一致，与T载体连接转化后得到多个阳性克隆，测序结果分析(Gen-Bank登录号AP002069完全匹配)，基因序列正确。

3.克隆表达与纯化GP73C端抗原

(1)连接转化：采用含BamHI、EcoRI酶切位点的引物扩增GP73 C端基因(1019～1336bp)，酶切纯化后常规方法与经BamHI、EcoRI酶切后的PGEX-4T-2质粒连接，转化入BL21。

(2)确定表达形式：随机挑选阳性克隆，25℃采用1％异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)化学诱导，1％NP-40裂解，-80℃反复冻融3次，离心，取上清和沉淀分别进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，确定表达形式。结果显示，纯化的GP73C端抗原在诱导后大量表达，主要以可溶性蛋白形式存在。

(3)扩大培养及纯化：选取阳性克隆进行扩大培养，1％NP-40裂解，-80℃反复冻融3次，采用层析法纯化GP73C端抗原。

4.检测纯化产物：

以Abnova公司的GP73抗原作为对照，与本实施例纯化所得的GP73C端抗原同时进行胶浓度为12％的常规电泳，转膜。5％脱脂奶粉室温封闭1h，以高尔基蛋白多克隆抗体A01、单克隆抗体M06、M04为一抗，封闭液稀释后于4℃孵育过夜。用洗液(含0.05％Tween 20的Tris盐缓冲液，TBST)室温洗膜3次。辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，室温孵育1h，TBST室温洗膜3次，结果经电化学超敏发光(ECL)呈现，进行蛋白印迹分析技术(Westernblot)检测。结果表明GP73C端抗原针对3种抗体反应性均较好，且两种抗原的反应性无明显差别。

5.检测抗原免疫活性：

应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测。高尔基蛋白多克隆抗体A01、单克隆抗体M06和M04作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，检测纯化所得抗原的免疫活性。将纯化所得的GP73C端抗原用碳酸盐缓冲液稀释至2μg/ml包被ELISA微孔板，每孔100μl，4℃过夜后弃液，用洗涤液(含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液，PBS)洗板3次后弃液，拍干；每孔加入封闭液(含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，BSA-PBS100μl，4℃过夜，弃液；每孔加入50μl浓度为100ng/ml的一抗，混匀后37℃温浴1h，洗涤液洗板5次，拍干；每孔分别加入50μl1万倍、2万倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，经37℃温浴30min，洗涤液洗板5次，拍干；加入单组分显色剂100μl，37℃温浴，避光显色10min；每孔加50μl终止液，用酶标仪读取450nm吸光值。一抗采用正常小鼠血清作为阴性对照，cut-off值为2.1倍的阴性对照吸光值，检测结果大于cut-off值者判定为阳性。

当辣根过氧化物酶标记的单抗鼠IgG为2万倍稀释时，本实施例纯化的GP73C端抗原与所购抗原对A01的反应性均较弱，针对其他几种抗体的反应性均较好。当辣根过氧化物酶标记的单抗鼠IgG为1万倍稀释时，本研究纯化的GP73C端抗原与所购抗原对3种抗体均具有良好的反应性，表明所表达的GP73C端蛋白具有较强的免疫活性。

实施例2 GP73C端的单克隆抗体制备

1.动物免疫

取重组GP73C端抗原蛋白300mg/L与完全福氏佐剂等量混合制成乳化剂，共免疫Balb/c小鼠5只。第1次免疫100μg/只，皮下多点注射,2周后用不完全福氏佐剂第2次免疫，剂量、途径与第1次相同。2周后尾静脉取血测定效价，效价达1：1000～1：5000时供融合用。融合前3天用抗原直接腹腔脾区加强免疫1次。

2.采用常规间接ELISA法测定效价

包被聚苯乙烯板的纯化重组GP73C端抗原浓度为5mg/L，酶标记抗体为羊抗鼠IgG(Sigma公司产品，工作浓度为1：5000)，酶标仪450nm波长测定OD值。P/N值≥2.1倍为阳性，＜2.1倍为阴性(N值<0.05，按0.05计算)。

3.免疫脾细胞的制备

取已免疫Balb/c小鼠，眼球放血供检测抗体用。无菌操作取出脾脏，轻轻清洗并去除结缔组织，置于铜网上挤压研磨，并通过网孔挤到溶液中，离心1000r/min，5min,弃上清,重悬于溶液中制成脾细胞悬液，加台盼兰染液作细胞计数。

4.髓瘤细胞液制备

将骨髓瘤细胞置于37℃5％CO₂培养箱中扩大培养。融合当天收集处于对数生长期的SP2/O骨髓瘤细胞，离心1000r/min,5min,弃上清，重悬于液体后作细胞计数。

5.细胞融合

分别吸取脾细胞和骨髓瘤细胞悬液按5：1混合，置于离心管内充分混匀后离心，弃上清，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。取50％的聚乙二醇(PEG)0.7ml加入混合细胞中促进融合，严格控制作用时间在2～3min内，立即加入不完全培养液稀释，使PEG中止作用。离心800r/min,7min,弃上清。加入10mL HAT培养液制成细胞悬液,并加入已铺成饲养细胞层的96孔板中，每孔0.1mL，置37℃5％CO₂培养箱中培养，4～5d后换液1次，8～10d时取上清，用ELISA法测效价，进行初筛，阳性孔进行亚克隆。

6.杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)及腹水制备

将96孔板中待做克隆化的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，取少许细胞悬液置另一无菌小瓶中。将此细胞悬液准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞。将稀释好的细胞悬液接种于已铺有饲养细胞层的96孔板中，每孔0.1mL，即每孔含一个细胞，置37℃5％CO₂培养箱中培养，5d左右在倒置显微镜下观察细胞克隆生长情况。反复克隆3次，确定阳性单克隆细胞株，最后克隆株编号，置液氮中保存。单抗细胞株效价结果如表1。

表1 6株GP73McAb效价测定结果

单克隆抗体编号	腹水抗体效价
		GP73C端-1	1:120000
GP73 C端-2	1:3200000
		GP7 C端3-3	1:1280000
GP73 C端-4	1:640000
		GP73 C端-5	1:1600000
GP73 C端-6	1:800000

ELISA结果显示，GP73 C端的单克隆抗体对抗原的识别具有高度敏感性，最高效价达到1:3200000。所获的6株GP73McAb只与GP73抗原蛋白产生反应，同其他无关蛋白均无交叉反应，与HepG2细胞的免疫荧光实验中均能很好识别天然状态的GP73蛋白，提示制备的GP73McAb具有良好的特异性和免疫活性。

7.亚类鉴定

用GP73 C端抗原(2.5mg/L)包被96孔板条，4℃过夜。2％BSA-PBS-Tween20封闭后，加入不同株细胞培养上清液(0.1ml/孔)，室温2h，洗涤后加入抗小鼠Ig及其亚类的兔免疫血清，37℃孵育1h，洗涤后加入酶标记羊抗兔Ig抗体，37℃1h，洗涤，显色，判断结果。

亚类鉴定结果：

对6株抗-GP73McAb上清分别进行IgG亚类鉴定，6株单抗均属IgG1，K链(Kapa链)，保存于液氮中多次复苏传代后仍能稳定分泌抗体，采用ELISA测定效价均未降低。

8.GP73C端的单抗抗原表位分析

GP73C端的单抗包被酶标板(2mg/L)，加入GP73 C端表达抗原，用双抗体夹心法检测GP73。筛选到3对配对较好的单抗，针对GP73胞膜外区不同表位，分别是：GP73C端-1—GP73C端-2，GP73C端-1—GP73C端-5，GP73C端-3—GP73C端-6。以GP73C端-1—GP73C端-2的配对为最佳，在后续试剂盒生产中也使用此2种单抗配对，用GP73C端-1作为包被抗体包被酶标板，用GP73C端-2作为检测抗体标记辣根过氧化物酶。

实施例3 HRP标记的GP73C端的单克隆抗体(酶标抗体)的制备

采用改良过碘酸钠法制备HRP标记的单抗，具体步骤如下：

1.取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO₄水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO₄)0.5ml，混匀，置4℃30min；

2.取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH₂O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min；

3.加入含5mg纯化GP73C端的单克隆抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合；

4.加入NaBH₄溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃2h；

5.在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜；

6.次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－抗体(HRP－IgG)结合物，以0.02Mol/LpH 7.4PBS液加至5ml；

7.效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。

实施例4试剂盒主要生产物料及生产工艺

1.GP73C端抗体包被板的生产工艺

1.1 领料

按照生产指令领取相应量的包被液、抗体原液、酶标板及封板膜。

1.2 包被

在酶标板上按2μg/mL的浓度包被纯化的GP73C端-1，于2～8℃孵育不少于16小时。

1.3 封闭

甩掉酶标板里的包被液，用洗涤液(磷酸盐缓冲液，PH 7.2)洗1遍，甩掉洗涤液，加入封闭液，于2～8℃孵育不少于16小时。

1.4 干燥

甩掉酶标板里的封闭液，干燥后真空密封，于中间品暂存室2～8℃保存。

2.试剂盒的生产工艺

2.1 领料

按照生产指令及试剂配方领取所需试剂及耗材，见表2。

表2 试剂盒生产工艺物料一览表

本实施例采用单组分TMB显色液(国内商品化试剂盒中的底物液为2种，采用AB液分开配制，使用前再混合的方法，操作复杂，批间差较大)，减少了操作步骤。

本实施例中辣根过氧化物酶(HRP)及其标记物(酶标抗体，抗原，多肽等)在低浓度下不稳定，极易失活。因此，HRP及其标记物的稀释以及稳定型工作液的配制对科研人员提出了更高的要求。

本实施例制备的辣根酶标记物稀释液含有数种HRP稳定剂，对HRP及其标记物和抗体活性都具有很强的保护作用，使稀释的HRP，酶标记物和抗体等试剂在极低浓度(ng水平)下，室温使用仍很稳定，从而可满足从事ELISA等实验的科研人员配制酶及其标记物稳定型工作液的要求。

本实施例中ELISA检测方法操作步骤虽简单，但影响因素较多，封闭是其中最重要的影响因素之一。封闭不当会直接影响ELISA检测方法的敏感度和特异性，产生假阳性结果；良好的封闭液还可以发挥稳定剂和保护剂作用，提高酶标板的保存期；不佳封闭液还会干扰各种试剂的反应。

本实施例制备的封闭液使用高浓度的无关蛋白质溶液进行再包被，可以让不相关的蛋白质充填这些未包被间隙，从而减少ELISA后续步骤中干扰物质的再吸附。

2.2 称量

按照生产指令计算本批产品用量，准确称量/吸取所需试剂。

注意事项：浓缩酶结合物属于易污染试剂，并注意避光保存。

硫酸溶液具有腐蚀性，应避免液体溅撒到皮肤和衣物上。

2.3 配制

按顺序溶解所称试剂，用去离子水定容，测定PH值。封闭液、酶贮存液、浓缩酶结合物稀释液以及校准品稀释液需要用0.22μm滤器过滤。在容器上贴上标签，注明名称、批号、容量及有效期等，于中间品暂存室2～8℃保存。

2.4 分装半成品

2.4.1 领料

按照生产指令领取相应量的半成品及原材料，半成品需放置室温(18～28℃)平衡1小时后按照说明书组分表进行分装。

注：所有半成品均已通过半成品检验。

3.主要原材料的要求

3.1 抗原、抗体

3.1.1 来源

重组GP73C端蛋白(以下简称GP73C端抗原)、GP73C端单抗均为天津金虹生物科技开发有限公司。

表3 主要原材料用途及来源

名称	用途	来源
			GP73C端抗原	配制校准品	大肠杆菌原核表达
GP73C端-1	包被酶标板	Balb/c小鼠
			GP73C端-2	标记辣根过氧化物酶	Balb/c小鼠

3.1.2 外观

肉眼观察，原材料应澄清透明，无沉淀。

3.1.3 纯度及分子量

采用SDS－PAGE测定纯度，上样量为10μg。GP73C端抗原纯度大于90％，分子量在12KD左右；抗体纯度均大于90％，在25KD和55KD左右分别显示有一条色带。

3.1.4 蛋白浓度

采用BCA法测定GP73C端抗原中蛋白浓度。纯化后的GP73C端-1和辣根过氧化物酶(HRP)标记的GP73C端-2均用紫外分光光度计测定OD₂₈₀，按(OD₂₈₀×0.625)＝_mg/mL计算蛋白浓度。

GP73C端抗原及纯化后GP73C端单克隆抗体的蛋白浓度应大于0.5mg/mL，HRP标记GP73C端单克隆抗体克分子比值在1～2之间。

3.1.5 线性

3.1.5.1 GP73C端抗原线性测定

用纯化的GP73C端-1按2ug/mL包被酶标板，用表达纯化的GP73C端抗原配制校准品，制成试剂盒后进行检测。

线性范围在1.00～450.00ng/mL之间，相关系数不低于0.9900。

3.1.6 GP73C端的单克隆抗体腹水效价

分别用GP73C端的单克隆细胞株1号、2号注射小鼠腹腔，将得到的腹水稀释，用表达纯化的GP73C端的抗原包被酶标板，采用ELISA间接法检测。阴性对照OD值的2.1倍为判定阳性的阈值，阳性反应的最大稀释度即为单克隆抗体腹水效价。

GP73C端的单克隆抗体腹水效价不低于1:10⁵。

实施例5 试剂盒相关成品及半成品性能指标及检验规程

一、成品性能指标及检验规程

1.性能指标

1.1 外观

试剂盒外观应完整，无破损；酶标板条应平整、无飞边、表面光洁度好、底部无波纹及划伤；液体组分应清澈透明，无絮状物，无渗漏；标签清晰易识别。

1.2 检测限

检测限≤1.00ng/mL。

1.3 线性

在1.00ng/mL～450.00ng/mL范围内，相关系数≥0.9900。

1.4 批内重复性

变异系数CV≤15％。

1.5 批间重复性

变异系数CV≤15％。

1.6 准确度

回收率在85％～115％范围内。

1.7 稳定性

取过效期试剂盒，检测外观、检测限、线性、重复性及准确度，结果应符合1.1～1.4、1.6的要求。

1.8 溯源性

本产品校准品可溯源至重组GP73C端蛋白(以下简称GP73C端抗原)。

2.检验方法

2.1 外观

试验方法：目测检查，其结果应符合1.1的要求。

试验结果见表4。

表4

2.2 检测限

试验方法：用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果(X值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对应的X值，将X值带入标准曲线方程中，求出对应的浓度值，即为检测限，其结果应符合1.2的要求。

试验结果见表5。

表5

2.3 线性

试验方法：用超出或者接近线性范围上限浓度(活性)的样本按一定比例稀释至少5个稀释浓度(xi)点，其中低值浓度应接近线性范围下限。分别用测试试剂盒测试，每个稀释浓度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数(r)。

其结果应符合2.3的要求。

试验结果见表6。

表6

批号	第一批	第二批	第三批
				线性	0.9942	0.9919	0.9948

2.4 批内重复性

试验方法：用试剂盒测试高(100.00ng/mL～300.00ng/mL)、中(30.00ng/mL～100.00ng/mL)、低(1.00ng/mL～30.00ng/mL)三个水平浓度样本，重复测试20次(n＝20)，得出20次测量结果(X值)，分别计算每个浓度样本20个测量值的平均值(M)和标准差(SD)，计算变异系数(CV)，其结果应符合2.4的要求。

试验结果见表7。

表7

批号	低浓度CV(％)	中浓度CV(％)	高浓度CV(％)
				第一批	5.33	3.53	4.55
第二批	5.94	8.53	5.02
				第三批	2.56	3.34	1.69

2.5 批间重复性

试验方法：取三个不同批号的试剂盒，分别测试同一份样本(浓度为30.00ng/mL～100.00ng/mL)，每个批号重复测试10次，得出30次测量结果(X值)，计算30个测量值的平均值(M)和标准差(SD)，计算变异系数(CV)，其结果应符合2.5的要求。

试验结果见表8。

表8

批号	第一批、第二批、第三批
		中浓度CV(％)	8.33

2.6 准确度

试验方法：在高浓度标准溶液或纯品中加入一定的低浓度血清样本(标准溶液体积与样本体积比应不大于1:9或其体积比不会产生基质的变化，加入标准溶液后样本总浓度必须在试剂盒测定线性范围内)，每个浓度重复测定3次，按公式(4)计算回收率，其结果应符合2.6的要求。

式中：R—回收率；

V—加入标准液体积；

V0—低浓度样品的体积；

C—低浓度样品加入标准液后的测定浓度；

C0—低浓度样品的测定浓度；

Cs—标准液的浓度。

试验结果见表9。

表9

批号	第一批	第二批	第三批
				回收率(％)	109.04	105.71	108.46

2.7 稳定性

取过效期试剂盒，检测2.1～2.4、2.6项，其结果应符合1.7的要求。

二、半成品性能指标及检验规程

3.1 GP73C端抗体包被板

外观检验：GP73C端抗体包被板条应平整、无飞边、表面光洁度好、底部无波纹及划伤。

取已完成检验的试剂盒，与待检半成品GP73C端抗体包被板，共同测试该试剂盒中的6瓶校准品，两种GP73C端抗体包被板分别每瓶重复测试3次，取各点OD值的均值，校准品各浓度点的OD值相对偏差在±15％范围内。真空包装，2～8℃保存。

3.2 试剂外观

外观检验：液体组分应清澈透明，无絮状物，无渗漏。

3.3 试剂检验、分装及保存

3.3.1 校准品

取已完成检验的试剂盒，与待检校准品，分别测试两种校准品，各6瓶，每瓶重复测试3次，取各点OD值的均值，校准品各浓度点的OD值相对偏差在±15％范围内。

每个试剂盒每个浓度的校准品分装量为0.5mL，2～8℃保存。

3.3.3 酶结合物

取已完成检验的试剂盒，与待检试剂，共同测试该试剂盒中的6瓶校准品，两种试剂分别每瓶重复测试3次，取各点OD值的均值，校准品各浓度点的OD值相对偏差在±15％范围内。

每个试剂盒的分装量为12mL，2～8℃保存。

3.3.4 浓缩洗涤液(20×)

每个试剂盒中的洗涤液为20倍浓缩的磷酸盐缓冲液，分装量为50mL，2～8℃保存。

3.3.5 单组份TMB显色液

取已完成检验的试剂盒，与待检试剂，共同测试该试剂盒中的6瓶校准品，两种试剂分别每瓶重复测试3次，取各点OD值的均值，校准品各浓度点的OD值相对偏差在±15％范围内。

每个试剂盒的分装量为12mL，2～8℃避光保存。

3.3.6 终止液

每个试剂盒中的分装量为7mL，室温(18～28℃)保存。

实施例6 临床实验结果

天津金虹生物科技开发有限公司经过大量的实验，建立了测定血清中GP73水平的双抗体夹心法。该方法采用单克隆抗体为原材料，优化了传统工艺，因而具有较高的灵敏度(1.00ng/ml)和特异性。检测方法简便快速，需时小于1.5小时。标准曲线线性关系良好，相关系数r≥0.9900，如图1。

以858例肝硬化血清样本和1111例健康体检人群血清样本的GP73浓度绘制ROC曲线。ROC曲线下面积为0.959，当8.52ng/ml为GP73诊断肝硬化的cut-off值时，敏感度和特异性为最佳，分别为81.4％和95.0％，如图2所示。GP73浓度大于4.53ng/ml，中度肝损伤，提示可能存在显著肝纤维化以上的肝病；GP73浓度>8.52ng/ml时，提示肝硬化存在的可能。同时发现：血清GP73在慢性迁延性肝炎时轻度升高，肝硬化时升高显著，其水平高低与肝病变程度呈正相关。因此，本试剂盒在临床辅助诊断肝硬化的基础上，也可辅助提示肝硬化早期的肝纤维化。

本研究显示，肝硬化患者不同Child-Pugh分级之间血清GP73的浓度有显著性统计学差异。伴随肝功能衰退，血清GP73水平也相应升高。Child-Pugh为C级的患者(32.58ng/mL±16.52ng/mL)显著高于B级(19.37ng/mL±10.23ng/mL)和A级的患者(12.28ng/mL±6.09ng/mL)。

在丙肝病中GP73阳性率与浓度均显著高于乙肝相关肝病(P<0.001)，表明在HCV侵染的细胞中GP73表达上调，GP73是HCV分泌过程中的关键物质，与文献报道相符。

分别检测6种非肝脏恶性肿瘤标本中GP73的浓度为1.0ng/ml，显著低于肝硬化标本(P<0.05)，提示GP73特异性良好，可作为仅针对肝硬化的血清标志物。

检测了158例肝硬化及160例健康体检人群血浆标本。结果显示，肝硬化人群血浆标本的GP73含量为(9.10ng/mL±8.71ng/mL)，健康体检人群血浆标本的GP73含量为(1.16ng/mL±0.25ng/mL)，表明本实施例的试剂盒可同时用于血浆样本的检测。

总之，本实施例血清中GP73定量检测试剂方法简单、快速，成本低，临床应用结果表明GP73可作为辅助临床诊断肝硬化的一种标志物，对肝炎、肝纤维化及肝硬化的进展也有监测作用，具有良好的临床应用价值。

实施例7 磁珠化学发光法检测GP73试剂盒的制备及使用

以磁性纳米微球作为固相载体建立的磁性免疫检测技术是近年来国内外重要的免疫检测技术。表面进行化学修饰的磁性微球通过共价键偶联抗体分子；其巨大的比表面积能偶联更多的抗体，并充分暴露抗体的抗原结合位点而减少位阻效应；并且，纳米磁性微球具有超顺磁性，在无外加磁场时均匀分散在溶液中，使抗原-抗体反应更加快速、高效。

本实施例用一种生物素标记的GP73C端单克隆抗体偶联链霉亲和素修饰的磁珠，加入待测血清，与另一株GP73C端抗体的酶结合物反应，再与化学发光底物鲁米诺作用，根据发光值判断结果。

具体操作如下：

1.加样

分别在相应孔中加入50μl磁珠、20μl校准品或血清样本以及50μl酶结合物，充分振荡混匀30秒。

2.温育

用封板膜封板后置37℃恒温水浴箱温育15分钟。

3.洗涤

小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤6遍，每次每孔应加入至少300μl洗涤液。

4.加入底物

每孔加入50μl化学发光底物A液，再加入50μl化学发光底物B液，加底物时应避免产生气泡，振荡混匀30秒，用封板膜封板后置37℃避光温浴5分钟。

5.测定

开启化学发光检测仪及主控制计算机，设定测定模式与参数。于加底物后的第5分钟测定各孔的发光值RLU，每孔测定时间为1秒。

6.校准曲线拟合及样本浓度计算

根据各校准品测定的RLU，使用双对数拟和方程，建立GP73浓度—RLU的回归方程，以各校准品浓度的对数为纵坐标(Y轴)，各校准品化学发光值(需减去S0的化学发光值)的对数为横坐标(X轴)作图。将各样本RLU值带入校准曲线，计算得到样本GP73浓度值。

实施例8 岩藻糖基化GP73在肝硬化诊断中的实验结果

糖基化作用(glycosylation)是蛋白质翻译后修饰中最常见的方式之一，约50％的蛋白质都具有糖基化修饰。研究表明，在许多疾病的发生、发展过程中，糖蛋白的糖基化程度都发生了改变。伴随着肝脏病变的发展，GP73会不同程度的发生核心岩藻糖基化。根据小扁豆凝集素能与核心岩藻糖化糖蛋白特异结合的这一特性，利用偶联有小扁豆凝集素的琼脂糖凝胶亲和吸附离心管洗脱获得Fuc-GP73(岩藻糖基化GP73)，结合ELISA法进行定量检测患者血清中Fuc-GP73含量。

具体方法如下：

1.偶联有LCA的琼脂糖凝胶的制作步骤

(1)将1.7g Sepharose CL 6B浸泡于1mmol/L HCL至膨胀，移入砂芯漏斗，以350mL浓度为1mmol/L HCL洗涤25分钟。

(2)称取5mg LCA,溶于17mL的偶联缓冲液，与经洗涤的Sepharose CL 6B合并，用带塞的20mL试管上下颠倒混匀，室温下静置2.5小时。装柱，以15mL偶联缓冲液洗去未偶联的LCA.

(3)用0.2mol/L甘氨酸封闭已偶联的LCA.

(4)依次用15mL浓度为0.1mol/L醋酸缓冲液和浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液洗涤3次，再以PBS-BSA洗涤1次，4℃暂存备用。

2.Fuc-GP73的纯化步骤

(1)将待测血清完全离心；取出4℃保存的预装离心柱，弃去下层收集管中液体。

(2)血样稀释:吸取200μL血清于试管中，并加入300μL清洗液稀释，轻轻震荡混匀。

(3)加样:吸取400μL稀释后标本加入上部离心管，置于37℃恒温箱中，此步骤无需盖离心管盖子，等待稀释液全部流入下层收集管中约25分钟。

(4)将下部收集管中的液体弃去。

(5)向上部离心管中加入500μL清洗液，等待清洗液全部流入下部收集管中(约5分钟)，盖上离心管盖，室温下3000转离心1分钟。

(6)将下层收集管中液体弃去。

(7)重复(5)(6)步骤一次。

(8)向上部离心管中加入400μL，等待有洗脱液滴入下层收集管时，盖上离心管盖，置于37℃恒温箱中温育30分钟。

(9)取出离心管，室温下3000转离心1分钟。

(10)收集流入下层收集管中液体(含有GP73异质体),备用。

(11)检测收集液中GP73异质体含量，步骤同ELISA法检测血清中GP73含量。

检测156例肝硬化、160例慢性肝炎及205例健康体检人群血清Fuc-GP73含量。结果表明：肝硬化组Fuc-GP73水平显著高于慢性肝炎(P<0.01)及健康对照组。通过绘制ROC曲线计算Fuc-GP73检测肝硬化曲线下面积为0.908，敏感度为76.9％，特异性为93.1％，阳性判断值为2.55ng/ml。

以上对本发明创造的若干个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明创造的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明创造的实施范围。凡依本发明创造申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明创造的专利涵盖范围之内。

序列表

<110>天津金虹生物科技开发有限公司

<120>一种GP73 C端抗原的制备及其应用

<130> 2017

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Gln Ala Ala Leu Ser Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Met Glu Gly

1 5 10 15

Pro Glu Arg Asp Gln Leu Val Ile Pro Asp Gly Gln Glu Glu Glu Gln

20 25 30

Glu Ala Ala Gly Glu Gly Arg Asn Gln Gln Lys Leu Arg Gly Glu Asp

35 40 45

Asp Tyr Asn Met Asp Glu Asn Glu Ala Glu Ser Glu Thr Asp Lys Gln

50 55 60

Ala Ala Leu Ala Gly Asn Asp Arg Asn Ile Asp Val Phe Asn Val Glu

65 70 75 80

Asp Gln Lys Arg Asp Thr Ile Asn Leu Leu Asp Gln Arg Glu Lys Arg

85 90 95

Asn His Thr Leu

100

Claims (10)

1.一种GP73C端蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种制备如权利要求1所述的GP73C端蛋白的方法，其特征在于，首先，采用PCR方法扩增出编码表达GP73C端的DNA序列；然后，将该序列插入到表达载体的多克隆位点，构建重组表达质粒；之后，转化到表达宿主菌，构建得到工程菌株，工程菌株经诱导表达；最后，分离纯化得到GP73C端重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种GP73C端蛋白的制备方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

(1)PCR扩增：采用含BamHI、EcoRI酶切位点的引物PCR扩增GP73C端基因(1019～1336bp)，酶切纯化后与经BamHI、EcoRI酶切后的PGEX-4T-2质粒连接，转化入大肠杆菌BL21；

(2)确定表达形式：随机挑选阳性克隆，25℃采用1％异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)化学诱导，1％NP-40裂解，-80℃反复冻融3次，离心，取上清和沉淀分别进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，确定表达形式；

(3)扩大培养及纯化：选取阳性克隆进行扩大培养，1％NP-40裂解，-80℃反复冻融3次，采用层析法纯化GP73C端抗原。

4.根据权利要求3所述的一种GP73C端蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的上游引物为GC GCT GGA TCC CAG CTG GCC TCA(5’-3’，下游引物为GC GAA TTC TGA TGTGAGATGATT。

5.一种应用如权利要求1所述的GP73C端蛋白制备单克隆抗体方法，其特征在于，用表达合成的GP73C端重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备并筛选杂交瘤细胞株，制备腹水并纯化单克隆抗体。

6.权利要求5中制备得到的单克隆抗体在制备诊断肝脏疾病试剂中的应用。

7.权利要求5中制备得到的单克隆抗体在制备诊断肝脏疾病试剂盒中的应用。

8.如权利要求7中的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的检测过程包括单克隆抗体通过ELISA法检测血清中GP73含量/岩藻糖基化GP73含量的过程。

9.如权利要求7中的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的检测过程包括单克隆抗体通过磁珠化学发光法检测GP73含量试剂盒方面的过程。

10.如权利要求8中的试剂盒，其特征在于，ELISA法检测血清中GP73含量的过程，为用两株针对GP73C端蛋白不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色检测GP73蛋白，通过校准品制备的标准曲线确定GP73蛋白的含量。