NO175024B - Agglutineringsreagens og dets anvendelse for detektering av et antigen, antistoffer eller andre analytter, samt prövesett omfattende reagensen - Google Patents

Abstract

I en ny erytrocytt-agglutineringsanalyse omfatter agglutineringsreagens en erytrocytt-bindingsdel knyttet til en spesifikk analytt-bindende del eller til en analyttanalog der reagensen ikke forårsaker agglutinering ved inkubering med endogene erytrocytter i fravær av analytt- eller analytt-bindende reagens.Blandinger av reagenser kan benyttes som agglutineringsreagenser. Reagensene og deres bruk 1 direkte eller indirekte analyser er beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et reagens og en fremgangsmåte for detektering av et antigen, antistoff eller en annen analytt i human- eller animalblod ved erytrocyttagglutinering. Oppfinnelsen angår også et sett inneholdende reagenset.

Analysering av blodprøver med henblikk på et spesielt antigen eller antistoff har tradisjonelt involvert separering av cellulære komponenter fra serumkomponentene i blodet ved sentrifugering og/eller koagulering før analyse.

Dette presenterer diverse potensielle problemer. For det første er en slik analyse ikke egnet for prøving som gjennomføres under feltbetingelser. I mange veterinærsitua-sjoner er en hurtig prøve i felten mer ønskelig enn den alternative transport av prøver til laboratorier for separering og analyse. Videre må veterinærer som ikke har tilgang til en sentrifuge hyppig analysere blodprøver med henblikk på nærvær av infektiøse stoffer som "heartworm". Videre presenterer analyser som benyttes for detektering av sykdommer i land i den tredje verden en situasjon der enkelhet og lav omkostning er vesentlige faktorer.

Ved visse patologiske tilstander er for det andre separering av blodprøvene vanskelige. Blod som tas fra pasienter som lider av tilstander som Waldenstrøms makroglobulinemi er vanskelige å separere i serum- og cellefraksjoner, noe som gjør en analyse som kan gjennomføres på fullblod meget ønskelig.

For det tredje blir blodprøver ofte benyttet for prøving på nærvær . av sterkt smittsomme og potensielt farlige sykdoms-tilstander. I disse tilfeller er det å foretrekke at det skjer minst mulig behandling og håndtering av prøvene for å minimalisere risikoen for personalet som gjennomfører analysen. Videre har visse tilstander gjort det ønskelig på stedet å tilveiebringe fingerspissanalyser. Slike analyser må nødvendigvis være tilpasset gjennomføring på fullblod.

Immunoanalyser har revolusjonert humandiagnostikk og veterinærmedisin efter innføringen av teknikker som radio-immunoanalyse, først angitt av Yalow og Berson (1959) "Nature", 184» 1648 og enzymimmunoanalyse eller EIA som først ble beskrevet av Engvall og Perlman (1971) "Immunochem.", 8, 871 og Van Weeman og Schuurs (1971) "FEBS Letters", 15, 232.

Mens slike analyser er basert på antistoff-antigen-interak-sjon er de benyttede detekteringssystemer vanligvis kom-plekse. Reagensene som benyttes er generelt enzym- eller radiomerkede antigener, antistoffer eller komplekser derav som krever enten inkubering med spesifikke substrater og måling av et farvesluttpunkt enten visuelt eller ved hjelp av et kolorimeter eller måling av en radioaktiv nedbrytning med strålingstellere for å detektere nærværet av den analytt som prøves. Disse analyser involverer også diverse vasketrinn. De fleste immunoanalyser for detektering av analytter i blod er hyppig av denne type. Mens således disse analyser er sensitive er de også langvarige og involverer prosedyrer som kan kreve kostbar instrumentering for detektering av den angjeldende analytt.

Et alternativ til disse analyser tilveiebringes ved immunoanalyser av den type som er beskrevet av Gupta et al., (1985) "Journal of Immunological Methods", 80, 177-187. Dette er immunoanalyser der erytrocytter og anti-erytrocytt-antistoffer benyttes i indikatorsystemet. I disse analyser blir eksogene erytrocytter slik som saue-erytrocytter benyttet.

I de senere år har det vært mulig å binde antistoffer til latekskuler for derved å tilveiebringe en hurtig agglutineringsanalyse. Dette medfører imidlertid separering av serum-plasmafase fra den cellulære fase og krever som et resultat bruken av et sentrifuge- eller filtreringssystem. Lateksagglutineringsanalyser er beskrevet i Casletan. et al., "J. Clin. Pathol.", (1968), 21, 638 og Slnger & Plotz. "AM. J. Med." [1956 (desember)], 888.

Både direkte og indirekte agglutineringsimmunoanalyser er velkjente i denne teknikk. I disse analyser blir agglutineringen av partikler hvortil antigen eller antistoff er bundet, benyttet for å indikere nærværet eller fraværet av det tilsvarende antistoff eller antigen. En varietet av partikler inkludert partikler av lateks, trekull, kaolinitt eller bentonitt så vel som både mikrobielle og røde blodlegemer har vært benyttet som agglutinerbare bærere, se TJS-PS 4 308 026 i navnet Mochida. Bruken av erytrocytter som indikatorpartikler er sterkt kritisert av Patel i TJS-PS 3 882 225 som sier at det er vanskelig å standardisere indikator-erytrocytter.

Molinaro beskriver i US-PS 4 130 634 en analyse for et antigen som benytter antistoff-belagte røde blodlegemer. Molinaro fremhever at metoden som benyttes for å koble antistoffet til erytrocytten ikke må ødelegge antistoffets reaktivitet. Han gjør det helt klart at antistoffer som er spesifikke for erytrocytten ikke er brukbare i denne analyse. Han nevner imidlertid muligheten for å benytte et hybrid-antistoff med et bindingssete som er spesifikt for antigenet og det andre spesifikt for det røde blodlegemet.

Chang beskriver i US-PS 4 433 059 et agglutineringsimmuno-analysereagens der to antistoffer kovalent er bundet "hale-hale", det vil si at man ikke endrer deres spesifisitet. Et antistoff er spesifikt for et antigen båret av en indikator-substans slik som en erytrocytt. Dette antistoff er fortrinnsvis univalent for å unngå ikke-spesifikk agglutinering. Det andre antistoff er divalent og er spesifikt for analytten. Ved preparering for analyse blir friske erytrocytter belagt med konjugat. De dobbelte antistoffkonjugatbelagte RBCer blir så inkuberte med testserum. Chang betrakter ikke analyse av fullblodprøver ved bruk av et ikke-autoaggluti-nerende anti-RBC-antistoff og endogene erytrocytter.

Chu beskriver i US-PS 4 493 793 konstruksjonen av et lecitin-antistoff eller lecitin-antigen kovalent koblet konjugat. Hans tabell I beskriver karbohydratspesifisitetene for flere lecitiner. Han beskriver ikke kobling av et slikt konjugat til en erytrocytt, hverken via lecitin- eller antistoff-reseptoren.

Andre "hale-hale"-immunologiske konjugater er kjent, se for eksempel US-PS 4 676 980 som beskriver konstruksjon av et "hale-hale"-konjugat av et målcelleoverflateantigen spesifikt antistoff og av et cytotoksisk effektorcellereseptor spesifikt antistoff. Diverse kryssbindingsmetoder beskriver. Dette konjugat er ment for bruk i immunoterapien, idet det vil bringe cellulaerimmunsystemet i pasienten til å lysere målcellen. Målcellen vil selvfølgelig ikke være en erytrocytt som er endogen mot verten.

Li antyder i US-PS 4 661 444 fremstilling av et "hale-hale"-konjugat av et analyttbindende antistoff og av et antistoff spesifikt for idiotypen av det første antistoff. Dette konjugat skulle benyttes i forbindelse med et uoppløselig-gjort analyttbindende antistoff i en immunoanalyse.

Wardlaw beskriver i US-PS 4 695 553 bruken av et monoklonalt antistoff mot et universelt erytrocytt-antigen som et RBC-agglutineringsmiddel for å klarere grenseflaten mellom røde blodlegemer og hvite blodlegemer i sentrifugert fullblod. Han foretrekker bruken av antistoffer mot glykoforin eller mot fl-ant igen, men nevner også muligheten for å benytte en blanding av lecitiner. Guesdon beskriver i US-PS 4 668 637 bruken av anti-røde blodlegeme-antistoffer eller av lecitiner for erytroadsorpsj on.

Bigbee, ["Molecular Immunology", 20: 1353-1362 (1983)] beskriver f reinstill ing og prøving av fire monoklonale antistoffer mot glykoforin A. Det generelle konsept ved i en immunoanalyse å benytte et antistoff som reagerer med en antigenisk determinant valgt blant alle deltagere fra en analyttklasse av interesse (mikroorganismer) er angitt av McLaughlin i US-PS 4 683 196.

Et antall patenter behandler antistoffer som er brukbare ved blodtyping. Se for eksempel Lloyd i US-PS 4 678 747; Graham, jr., US-PS 4 358 436; Liu, US-PS 4 550 017, Steplewski, US-PS 4 607 009; Lennox, W083/03477. Disse antistoffer er brukbare for blodtyping på grunn av at de binder til antigener som kun finnes i visse blodcellepopulasjoner, mens det for oppfin-nelsens formål er ønskelig å benytte antistoffer (eller blandinger derav) som binder til i det vesentlige alle erytrocytter.

Zuk erkjenner i US-PS 4 594 327 ønskeligheten av å gjennom-føre en immunoanalyse direkte på fullblodprøver. Ved denne metode blir prøven bragt i kontakt med både et uoppløselig-gjort analytt spesifikt immunoreagens og med et rødblod-legeme-bindende middel som et RBC-spesifikt antistoff eller et lecitin. Den analytt-spesifikke immunoreagens og RBC-bindingsmidlet er ikke koblet sammen og analysen som beskrives er ikke en agglutineringsanalyse.

Problemet, i en agglutineringsimmunoanalyse, med ikke-spesifikk agglutinering av erytrocytter ved anti-erytrocytt-antistoffer som er endogene mot blodprøven, ble bemerket av Czismas i US-PS 3 639 558. Han foreslo å fjerne alle naturlig forekommende antigeniske seter på partikkelen ved belegning av partikkelen med protein.

Theofilopoulos i US-PS 4 342 566; Duermeyer i US-PS 4 292 403 og Goldenberg i US-PS 4 331 647 er av interesse da de viser bruken av spesifikke bindende fragmenter av antistoffer som erstatninger for intakte antistoffer i analyser. Konstruksjonen av heterobifunksjonelle antistoffer er beskrevet av Auditore-Hargreaves i US-PS 4 446 233; Paulus i US-PS 4 444 878; og Reading i US-PS 4 474 893. Mochida beskriver i US-PS 4 200 436 bruken av monovalente antistoffer eller bindende fragmenter derav i visse immunoanalyser. Forrest beskriver i US-PS 4 659 878 at monovalente antistoffer ikke kan danne dimerer eller mer utstrakte komplekser med antigenet; slike aggregater ble sagt å være i stand til å interferere med bindingen av antigen-antistoff-komplekset til en fastfasebærer.

Foreliggende oppfinnere har erkjent at det har foreligget et behov for en metode som kan benyttes i laboratoriet og i felten, spesielt i land i den tredje verden der det foreligger en stor mangel på muligheter for medisinsk prøving med henblikk på analyse av forskjellige typer analytter i fullblod. Som antydet ovenfor krever kjente metoder separering av blodceller fra serum eller plasma og er derfor mange ganger vanskelig og ofte umulig å gjennomføre i felten.

Hvis erytrocytt-bindende molekyler kobles til spesifikke analyttbindende molekyler kan det resulterende konjugat benyttes til å binde både endogene erytrocytter og analytter som er tilstede i en blodprøve. Foreliggende oppfinnelse resulterer fra den erkjennelse at når et slikt kompleks eksponeres mot en blodprøve vil agglutinering av erytrocytter som er endogene mot prøven, tjene som indikator for nærværet av den relevante analytt (vanligvis et antigen eller antistoff) på grunn av kryssbinding av erytrocyttene med analytt.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en agglutineringsreagens for detektering av en analytt i en blodprøve omfattende et erytrocytt-bindende molekyl forbundet til et analytt-bindende molekyl der det erytrocytbindende molekyl er forbundet med det analyt-bindende molekyl på en slik måte at bindingsegenskapene for de bindende molekyler ikke endres ved forbindelsen og det erytrocytt-bindende molekyl er i stand til å binde erytrocytter endogent til blodprøven men ikke agglutinerer endogene erytrocytter i fravær av analytt, og denne reagens karakteriseres ved at det erytrocytt-bindende molekyl er valgt blant et anti-erytrocyt-antistoff, et F(ab)2~ eller Fab' fragment derav, mellitin, et lecitin, et molekyl med spesifikk affinitet for erytrocytt-overflaten og et spesifikt bindende fragment av en hvilken som helst av disse.

Oppfinnelsen angår også anvendelsen av en reagens som beskrevet i det foregående avsnitt for detektering av en analytt i en blodprøve inneholdene eretrocytter ved blanding av prøven med reagensen, og observere hvorvidt eretrocyttene agglutineres og korrelering av agglutineringen med mengden av analytt som er tilstede i prøven.

Oppfinnelsen angår videre en agglutineringsreagens for inndirekte detektering av en analytt i en blodprøve, der erytrocytt-bindemolekylet er forbundet med analyttanalogen på en slik måte at bindingsegenskapene for erytrocytbindemolekylet ikke endres ved forbindelsen og der erytrocyttbindemolekylet er i stand til å binde erytrocytter endogent til prøven men ikke agglutinerer endogene erytrocytter i fravær av analytt-bindereagens, og denne reagens karakteriseres ved at man benytter et erytrocytt-bindemolekyl valgt blant

et anti-erytrocyt-antistoff, et F(ab)2~ eller Fab' fragment derav, mellitin, et lecitin, et molekyl med spesifikk affinitet for erytrocytt-overflaten og et spesifikt bindende fragment av en hvilken som helst av disse.

Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av en agglutineringsreagens som beskrevet i det foregående avsnitt for bestemmelse av nærværet eller mengden av en analytt i en blodprøve omfattende inkubering av prøven med agglutineringsreagensen og en oppløselig analyttbindende reagens hvorved agglutineringsreagensen konkurrerer med prøveana-lytten om analyttbindingssetene i den analyttbindende reagens, observering av hvorvidt agglutinering inntrer og bestemmelse av nærværet eller mengden av analytten fra den inverse verdi av agglutineringsgraden.

Til slutt angår oppfinnelsen et agglutineringsprøvesett som karakteriseres ved at det inneholder en reagens som beskrevet ovenfor og et sekundært bindemolekyl som binder til en ny epitop som dannes ved binding av analyttbindemolekylet til analytten, eller et agglutineringsprøvesett som karakteriseres ved at det omfatter en reagens som beskrevet ovenfor og en referanseoppløsning inneholdende en kjent mengde analytt.

Fordeler ved endogene RBCer

i) Forenkler dagens analyseprosedyrer;

intet behov for sentrifugering av prøve; fullblod samlet i nærvær av et egnet antikoaguleringsmiddel benyttes i stedet for serum eller plasma;

for prøver fra pasienter med infektiøse sykdommer slik som AIDS eller hepatitt er det en minimal prøvebehand-ling;

egnet for massebedømmelsesprogrammer som gjennomført av WHO i land i den tredje verden der mulighetene er begrenset;

analysen er meget robust; det er kun et enkelt reagens som er stabilt i nærvær av et bakteriostatisk middel slik som 0,01$ (vekt/volum) natriumazid;

- kan benyttes som en feltprøve av veterinærer når de egnede animal røde blodceller benyttes for immunisering for å gi arts-spesifikke MAb; prøven er meget hurtig, agglutineringen skjer i løpet av mindre enn tre minutter; metoden kan benyttes for å overvåke terapeutiske medikamenter og pasientreaksjon; den har også den mulige anvendelse som en selvprøve- analyse; det eneste utstyr som trenges er en blandepinne, et blandeglass eller en plastslide, en lanse og eventuelt et mikrokapillærrør. i i) Fordeler i forhold til eksogene erytrocytter Inkluderer: ingen forbehandling av erytrocytter. TJS-PS 4 433 059

benytter blodgruppe 0 minus-celler som er spunnet ned, omsatt med antistoffkonjugat i 15-30 minutter og vasket tre ganger i PBS. TJS-PS 4 668 647 benyttet saue-røde-blodlegemer som var vasket og resuspendert i PBS. Ef ter omsetning som skjer på en fast bærer, ble cellene så fiksert;

ingen forbehandling av prøver. TJS-PS 4 433 059 noterer at prøver måtte varme-inaktiveres for å unngå interferens på grunn av komplementet. Kanin-serum og bovin-albumin må også tilsettes for å minimalisere andre ikke-spesifikke reaksjoner. Intet av dette er nødvendig ifølge foreliggende system der ufortynnet fullblod fra pasienter kan omsettes direkte med reagenset. Dette reagenset inneholder ikke-relatert monoklonalt antistoff for å forhindre enhver anti-muse-reaksjon som eventuelt kunne inntre.

Således er det mulig å unngå den møysommelige separering av celler fra serum og sensitisering og fiksering av eksogene erytrocytter som er ment for bruk som indikatorpartikler i agglutineringsanalyser. De endogene erytrocytter sensitiseres av reagenset.

Et annet nytt aspekt ved søkerens agglutineringsreagenser og analyser er valget av et erytrocytt-bindemolekyl slik at inkubering av konjugat med endogene erytrocytter ikke forårsaker agglutinering av erytrocyttene hvis ikke analytt også er tilstede, slike erytrocytt-bindemolekyler kalles her "ikke-autoagglutinering".

Erytrocytt-bindende molekyler er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff og, spesielt i human systemet, et antiglykoforin-antistoff. Det antas at dette antistoffet er ikke-auto-agglutinerende av steriske grunner; enten er bindingssetene for det intakte antistoff i stand til kun å binde ved siden av hverandre liggende epitoper på den samme erytrocytt eller kun en av de to bindingsseter kan bindes til glykoforin på en gang.

Foreliggende analyse kan detektere små antigener uten å gjenta determinanter, ved bruk av to konjugater, et som bærer et analytt-spesifikt bindende molekyl, og det andre, et bindende molekyl som er spesifikt for en ny epitop som dannes ved binding av det første konjugat til analytten. Dette tillater kryssbinding i nærvær av antigenet som skal måles.

Oppfinnelsen skal forklares under henvisning til de led-sagende tegninger. Figur 1 viser skjematisk erytrocytter som oppviser positive og negative agglutineringsresultater med antistoff-komplekser i nærvær henholdsvis fravær av antigen; Figur 2 viser skjematisk erytrocytter som oppviser positive og negative agglutineringsresultater med et kompleks av antistoff og et antigen i nærvær og fravær av henholdsvis anti-antigen-antistoffer; Figur 3 viser skjematisk (a) erytrocyttagglutinering og (b)

inhibering av erytrocyttagglutinering på grunn av nærværet av analytt eller antigen; og

Figur 4 viser skjematisk mekanismen for agglutinering/ikke-agglutinering i forbindelse med foreliggende søknads overlapping.

I agglutineringsreaksjonen som her beskrives blir det tilveiebragt et reagens som omfatter en erytrocytt-bindedel, tilveiebragt av et erytrocytt-bindende molekyl bundet til en analyttbindende del tilveiebragt av et analyttbindende molekyl, eller til en analyttanalog, uten i det vesentlige å endre bindingsegenskapene for de bindende deler. Reagensen er ikke-agglutinerende ved inkubering med endogene erytrocytter i fravær av analytt.

Erytrocyttmembraner inneholder forskjellige antigeniske overflateaktive bestanddeler inkludert proteiner, glykoproteiner, glykolipider og lipoproteiner. Antistoffer som erkjenner disse bestanddeler kan fremstilles ved konvensjonelle teknikker ved bruk av membraner, eller rensede bestanddeler derav, som immunogener. Disse antistoffer kan være monoklonale eller polyklonale av natur. Enten kan det intakte antistoff eller et spesifikt bindende fragment derav benyttes som erytrocytt-bindende molekyler, EBM. Antistoffet eller antistoff-fragmentet kan være polyvalent, divalent eller univalent.

I tillegg blir glykoproteiner, glykolipider og andre karbohydratstrukturer på overflaten av erytrocyttene erkjent via kjente kjemikalier som lecitiner som har en affinitet for karbohydrater. Disse lecitiner kan også benyttes som EBM'er. Andre reseptormolekyler med spesifikk aktivitet for erytro-cyttoverflaten kan også benyttes. Disse kan også inkludere molekyler med en affinitet mot 1ipid-bisjiktet i membranen. Eksempler på slike molekyler er protamin, membranbindedelen av bievenomet, melittin og andre meget basiske peptider.

De foretrukne EBM'er ifølge oppfinnelsen vil erkjenne erytrocyttmembranbestanddeler som finnes på alle eller så å si alle erytrocytter slik at erytrocytter som er endogene mot blodprøven kan benyttes i agglutineringspartiklene. Slike bestanddeler inkluderer de såkalte "offentlige antigener".

Erytrocyttmembraner er lipid-bisjikt med et antall proteiner enten på overflaten eller med en hydrofobisk del som tillater at proteinene kan forankre seg eller gå gjennom membranet og kan ha en del av molekylet inne i cellen.

Glykoforin A er et eksempel på et molekyl som traverserer cellemembranet. Blodgruppe-spesifisiteten gis av karbohydrat-eller glykolipiddeler som er bundet til membranproteinene. Det er således viktig at et EBM bør erkjenne enten protein-delen av en membran-glykoproteinbestanddel som er felles for alle erytrocytter fra en spesiell art eller en annen felles struktur. Evnen til et bivalent EBM til å agglutinere røde blodlegemer vil avhenge av steriske faktorer som mobiliteten for molekylet og posisjonen for bindingssetet over det lipide bisj ikt.

Proteinene av erytrocyttmembraner inkluderer: -glykoforin A (MN, En<a>, Wr<b>), glykoforin B (Ss, 'N' , U) og i mindre bestanddeler, integral membranprotein 1 (Rhesus), membran-bundet glykoprotein C4 (Chido & Rodgers), integralt membran-glykoprotein (anionkanal), glykolipider (Lewis), glykosfingo-lipider ABH, li, P, Tk), ankyrin, pektrin, protein 4-1, F-actin, [De dermed forbundne blodgruppefaktorer er angitt i parentes.]

Det skal henvises til de følgende publikasjoner:

1. Det røde cellemembran av S.B. Shonet & E. Beutler i "Eematology", 3. utg. Utgiver: Williams, Beutler, Erslev & Lichtman, 1983. (Oppsummering av alle erytrocytt-antigener ); 2. Rød-cellemembranskjelettet av V.T. Marchesi, "Blood", 61, 1-11, 1983 (Oppsummering av skjelettproteiner.)

Et spesielt foretrukket EBM er et som erkjenner glykoforin. Når erytrocyttsialoglykopeptider ekstraheres fra membraner er hovedfraksjonen, ca. 75$ av det totale, glykoforin. Dette molekyl omfatter 131 aminosyrer med 16 oligosakkaridkjeder. Dette er således en rikelig del som kunne tillate antistoffbinding uten agglutinering av de røde blodlegemer. Midlet er også lett tilgjengelig i relativt ren kommersiell form fra Sigma Chemical Company. (Se "Fractionation of the Major Sialoglycopeptides of the Human Red Blood Cell Membrane", H. Furthmayr, M. Tomita & V.T. Marchesi, BBRC 65» 1975,113-122).

Når erytrocytt-blndemolekylet er multlvalent slik tilfellet er i et normalt antistoff, er det ønskelig at molekylet erkjenner en erytrocytt-membranbestanddel som er rikelig og godt fordelt, og bindesetet bør være i en slik posisjon at kryssbinding mellom celler inhiberes ved sterisk hindring for derved å unngå for tidlig rød-celleagglutinering.

Alternativt kan kryssbinding inhiberes ved seleksjon av et EBM som erkjenner en overflatebestanddel tilstede i tilstrekkelig mengde til at epitopene er tilstrekkelig nær til at bindingssetene på EBM kan bindes av det ene RBC.

Det er foretrukket, men ikke nødvendig at et enkelt EBM benyttes som erkjenner i det vesentlige alle erytrocytter. Flere EBM'er kan benyttes, enten i det samme eller i separate konjugater, hvert av hvilke erkjenner en spesiell gruppe erytrocytter, men som i aggregat erkjenner i det vesentlige alle erytrocytter.

Mens det er foretrukket at dette EBM erkjenner en naturlig overflatebestanddel av erytrocytten er det mulig å belegge erytrocyttene med en ligand som erkjennes av dette EBM eller å behandle erytrocyttene for å eksponere en vanligvis kryptisk ligand.

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til detektering av noen spesiell analytt. Analytten kan være et stoff som vanligvis finnes i blod som blodprotein eller et hormon, eller det kan være et fremmed stoff som et medikament (inkludert både terapeutiske og misbruksmedikamenter) eller en organisme som en virus (ved erkjennelse av et virusbelagt protein), bakterier, protozoer, fungi eller multicellulære parasitter (for eksempel "heartworm").

Analytten kan ha gjentagende epitoper, erkjennbare av et analyttbindende molekyl, eller unike epitoper der en blanding av analyttbindende molekyler er nødvendig. Imidlertid kan analytter som kun kan bindes av et ABM ad gangen, også detekteres.

Det analyttbindende molekyl (ABM) kan være et hvilket som helst stoff med en preferensiell affinitet for analytten, inkludert monoklonale eller polyklonale antistoffer, lecitiner, enzymer eller andre bindende proteiner eller stoffer (eller bindende fragmenter derav). Der analytten er et antigen, er dette ABM vanligvis et antistoff. Der omvendt analytten er et antistoff, er dette ABM vanligvis et antigen som erkjennes av antistoffet. Når analytten som skal detekteres ikke har noen repeterende epitoper, er to eller flere av ABM'er nødvendige med forskjellige spesifisiteter for analytten. Reagenset vil i dette tilfellet være enten en blanding av EBM bundet til ABM1 og EBM bundet til ABM2, eller EBM med begge ABM'er bundet til seg.

Analyttbindingsmolekylet behøver ikke binde analytten direkte. For eksempel kan i en analyse på veksthormon et ABM være rettet mot et veksthormon-bindende protein hvis det sistnevnte er kjent å være tilstede i prøven, eller separat tilveiebragt.

EBM og ABM kan kobles direkte eller indirekte og ved kovalente eller ikke kovalente midler (eller en kombinasjon derav). Der flere EBM'er eller ABM'er benyttes, kan disse kobles sammen med ett eller flere ABM'er koblet direkte til et EBM. Den følgende tabell oppsummerer noen av de kovalente koblingsmetoder som er kjent i denne teknikk.

Heterobifunskjonell

1. SPDP

(N-succinimidyl-3,2-(pyridylditio )propionat)

Neurath et al., 1981, "J. Virol. Meth.", 3, 155-165.

2. MBS

(m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester)

Kitagaw et al., 1976, "J. Biochem.", 79, 223-236.

3. SIAB

(N-succinimidyl-4-j odoacetylaminobenzoat)

Weltman et al., 1983, "Bio. Techniques", 1, 148-152.

Selektiv bifunks. ionell

p-isotiocyanatobenzoylklorid

US-PS 4 680 338

Bifunks. ionell

1. BSOCOES

Bis[2-(succinimidooksykarbonyloksy)etyl]sulfon

Zarling et al., 1980, "J. Immunol.", 124. 913-920

2. BS

Bis(sulfosuccinimidyl)suberat

Staros, 1982, "Biochemistry", 21, 3950-3955.

Andre

1. Glutaraldehyd

Avrameas, 1969, "Immunochem.", 6, 43

2. Periodatoksydasjon

Nakane og Kawoi, 1974, "J. Histohem. Cytochem.", 22, 1084-1091.

3. Karbodiimid

Av de foregående metoder for kovalent kobling er konjugering med SPDP fortrukket.

EBN og ABM kan også kobles ikke-kovalent, for eksempel ved (a) å binde biotin til en og avidin (eller strepavidin) til

den andre,

(b) å binde et anti-antistoff til en, som så binder den

andre,

(c) å binde protein A til en, som så binder Fc-delen av den andre, og (d) å binde et sukker til en og et tilsvarende lecitin til

den andre.

Det skal være klart at ved kobling av EBM og ABM bør bindingsegenskapene endres så lite som mulig. Det kan være fordelaktig å tilveiebringe en avstandsdel mellom EBM og ABM for å redusere sterisk hindring.

EBM/ABM-konjugatet kan være et chimert antistoff. En metode for å konstruere et slikt konjugat er den følgende: (a) preparering av F(ab)2_fragmenter av et valgt antistoff ved pepsin-nedbrytning; (b) å redusere og å behandle fragmentene med Ellman's reagens for å gi Fab'-fragmenter av det valgte antistoff; (c) tiolysering av et valgt spesifikt antistoff eller et

valgt erytrocytt-antistoff; og

(d) kobling av det tioylerte Fab'-fragment til Ellman's reagensbehandlet Fab'-fragment før å gi et chimert anti-erytrocytt-antistoff-antigen spesifikt antistoffkonjugat.

En annen metode er som angitt nedenfor:

(a) behandling av et anti-erytrocytt monoklonalt antistoff-produserende hybridom og et antigen-spesifikt monoklonalt antistoff-produserende hybridom med en distinkt sete-spesifikk irreversibel inhibitor av makromolekylær biosyntese; (b) kondensering av to forskjellige monoklonale antistoff-produserende hybridomer med polyetylenglykol; (c) kloning av kondenserte celler enten i myk agarose eller ved begrensing av fortynningen; (d) å utvelge klonede heterohybridomer som sekreterer chimert anti-erytrocytt antistoff-antigen-spesifikt antistoff med en utvalgsanalyse som passer på antistoffet; (e) rensing av antistoffproduktet ved affinitetsrensing for å befri det for ikke-hybrid-antistoffer.

Fortrinnsvis velges inhibitoren blant emetin, actinomycin D, hydroksyurea, ouabain, cykloheksimid, edin og sparsomycin.

Det chimere antistoff kan være to halvmolekyler, ett med spesifisitet for erytrocytter (EBM) og det andre med spesifisitet for analytt (ABM). I dette tilfellet kobler disulfidbindingene i antistoffet ABM til EBM og danner konjugatet. Alternativt kan de to halvmolekyler være spesifikke for den samme eller to forskjellige epitoper av analytten. I dette andre tilfellet er de chimere antistoff virkelig to ABM'er og må kobles til et EBM for å gi et trefaktorkonjugat. Disse konjugater kan dannes på annen måte slik som ved å binde EBM og to ABM'er til en makromolekylær avstandsgiver.

Den enkleste agglutineringsreagens man tenker på er en som består av et enkelt konjugat av et EMB til en ABM. Dette reagens er egnet for detektering av antigener med gjentagende epitoper.

Antigene analytter som er store nok til å tillate samtidig binding av to antistoffmolekyler, men som mangler repeterende epitoper er kjente. Disse inkluderer mange peptid- og proteinhormoner. For at agglutinering skal skje må antigenet samvirke med reagenset slik at minst noen molekyler av antigen virker som en bro mellom proksimate erytrocytter. For analysering av slike analytter er det foretrukket å benytte et reagens bestående av to eller flere distinkte konjugater, for eksempel ABM1/EMB + ABM2/EBM der ABM1 og ABM2 binder til forskjellige ikke overlappende epitoper av analytten. Man kan i stedet bruke et mer komplekst enkelt konjugat, ABM1/ABM2/EBM, der romkonformasjonen sannsynligvis ikke vil favorisere binding av begge ABM'er på det samme konjugat-molekyl til det samme analyttmolekyl.

Både direkte og indirekte agglutineringsanalyser er kjente. Ved den konvensjonelle direkte analyse for et antigen blir røde blodlegemer belagt med antistoff og omsatt med prøven. Multifunksjonelle antigener virker som broer mellom de belagte røde blodlegemer og gir et agglutinat. Ved den konvensjonelle indirekte analyse blir røde blodlegemer belagt med antigen og bragt i kontakt med både et oppløselig antistoff og med prøven. Prøve-antigen inhiberer kompetitivt binding av de av antistoffet sensitiserte røde blodlegemer og således agglutineringen. Det er også mulig i tillegg å benytte et antistoff, sensitisert RBC, det henvises til Mochida's US-PS 4 308 026.

Reagenset ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes i enten en direkte eller en indirekte agglutineringsanalyse-ramme. Til forskjell fra forskjellige konvensjonelle analyser er det imidlertid ikke nødvendig å forbelegge erytrocytter med antistoff eller antigen. Tvert om kan reagenset tilsettes til en blodprøve inneholdende endogene erytrocytter hvorefter den vil sensitisere cellene og gjøre disse i stand til å binde prøveanalytt (en direkte analyse) eller å konkurrere med prøveanalytten om et oppløselig analyttbindingsmolekyl (en indirekte analyse).

For enkelte små sirkulerende molekyler som syntetiske eller naturlige steroider som digoksin, teofyllin og så videre, eller misbruksmedikamenter som fenobarbital, cannabinoider, opioider og så videre, kan den angjeldende analytt være for liten til å gi de to nødvendige antigeniske epitoper for antistoffbinding (eller andre "epitoper" for erkjennelse av andre bindingsmolekyler) til å tillate kryssbinding eller efterfølgende erytrocyttagglutinering.

For analyse av små molekyler, for eksempel ved medikament-overvåking eller også for ethvert annet antigen, er en agglutineringsinhiberingsanalyse foretrukket. I dette tilfellet er en totrinnsprøve å vente. Det første trinn ville være tilsetning av et reagens bestående av analytt eller en analytt-analog koblet til det ikke-agglutinerende EBM, og det andre trinn vil være tilsetning av et ikke-konjugert ABM. De to trinn kan snues. Hvis analytt er tilstede i blodprøven, vil den spesifikke binding av ABM til EBM-analyttanalog-konjugatet inhiberes, noe som fører til tap av agglutinering. Ellers vil agglutinering inntre.

Uttrykket "analyttanalog" inkluderer både analytt og ethvert stoff som også spesifikt bindes av ABM når slik binding kompetitivt inhiberes av analytten. Analyttanalogen kan være et anti-idiotypisk antistoff dyrket mot antigenbindingssetet i et analyttbindingsantistoff.

For detektering av slike små molekyler ved direkte agglutineringsanalyse kan minst to spesifikke monoklonale antistoffer benyttes. Et monoklonalt antistoff som er i stand til binding direkte til det lille sirkulerende antigen vil kobles til erytrocyttbindingsmolekylet. Det andre (sekundære) monoklonale antistoff vil inkuberes med det ovenfor angitte konjugat og analytt og vil være i stand til binding til en ny antigenisk determinant bestående av et overlappende område av det første monoklonale antistoff og antigenet som foreligger kun når det første monoklonale antistoff binder antigen. Således virker det andre monoklonale antistoff som erytrocytt-"bro" og dette forårsaker til slutt kryssbinding mellom forskjellig røde blodlegemer og tillater at det inntrer agglutinering. Denne metode er selvfølgelig ikke begrenset til monoepitopiske analytter.

På grunn av romkonformasjonen kan det være vanskelig for et enkelt sekundært antistoffmolekyl samtidig å binde to konjugat:analytt-komplekser. Således kan det være foretrukket å konjugere det sekundære antistoff med et erytrocyttbindende molekyl.

Når man sier at en prøve skal inkuberes med et antall reagenser er det her ment at kontakten kan være samtidig eller sekvensiell uten begrensning til noen spesiell rekkefølge av varighet og kontakt.

Eksempel 1: Fremstilling av erytrocyttbindende molekyl

(antiglykoforin-antistoff)

Immunisering oa bedømmelse

Mus ble immunisert med human røde blodlegemer og monoklonale antistoffer fremstilt ved kondensasjon av miltceller av immuniserte dyr med musemyelomceller. Antistoffene ble bedømt både ved spinagglutineringsanalyse og enzymimmunoanalyse der glykoforin var bundet til en mikrotiterplate. Spinaggluti-neringen ble gjennomført ved en modifikasjon av metoden ifølge Wyatt & Street, "Aust. J. Med. Lab. Sei.", 4, 48-50. 50 pl cellekultursupernatant ble blandet med 50 jjI av en 1 ig rød-blodlegemesuspensjon i en mikrotiterplate. For dette eksempel ble det antistoffer som binder glykoforin, men ikke agglutinerte. Reaksjonen av monoklonalt antistoff og glykoforin ble bestemt ved enzymimmunoanalyse. Mikroplater ble belagt med 10 jjg pr. ml human glykoforin [Sigma kat. nr. G 7389] og vasket, derefter inkubert med seriefortynninger av monoklonalt antistoff. Efter ytterligere vasking ble nærværet av bundet antistoff bestemt ved tilsetning av enzym-merkede anti-muse-antistoffer fulgt av tilsetning av substrat. Titeren ble bestemt til den største fortynning av den monoklonale som ga en A420-avlesning på over 0,1 OD-enheter over bakgrunnen.

Av 384 brønner ble 40 primære kloner valgt. Disse ga enten en positiv spinagglutinatanalyse, en respons på glykoforin på EIA eller begge deler.

Efterfølgende absorpsjonsstudier ble gjennomført for å bekrefte at antistoffene erkjente et glykoforin-område eksponert på overflaten av det røde blodlegemet.

Resultatene av disse analyser på ascitigfluider er angitt nedenfor.

RAT 1C3/86 er deponert under Budapest-avtalens regler under betegnelsen G 26.4.IC3/86, ATCC HB 9893 ved Amercian Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA den 7. september 1988.

Rensing av RAT 1C3/ 86

Monoklonale antistoffer ble renset for homogenisering fra ascittfluider ved kromatografi på hydroksylapatitt (Stanker et al., "J. Immunol. Methods", 76, 157, 1985).

Eksempel 2: Fremstilling av HIV-peptid - Ab-konjugat. Spredningen av human immunomangel virus (HIV-l) er blitt et vesentlig verdensomspennende helseproblem. I dag er det ikke i sikte noen helbredelse eller vaksine for denne sykdom. Diagnose av infiserte individer er hovedfaktor i forsøkene på å hindre spredning av denne virus. Videre har behovet for å forhindre blodproduktforurensning og å beskytte helse-personale øket behovet for en enkel, hurtig, rimelig og spesifikk prøve for påvisning av anti-HIV-antistoffer.

I det foreliggende tilfellet har man gjort bruk av pasientens egnede røde blodlegemer for å tilveiebringe et potensielt detekteringssystem for anti-HIV-antistoffer. Dette er oppnådd ved utvalg av et mot human røde blodlegemer ikke agglutinerende monoklonalt antistoff. Kjemiske kryssbinding av dette antistoff med et syntetisk HIV-peptid-antigen tillot spesifikk agglutinering av pasientens røde blodlegemer i nærvær av antistoffer mot dette antigen. Det syntetiske peptid-antigen avledet fra gp41 av HIV-1 (restene 579-602) ble valgt på basis av Welling-prosedyren, "FEBS LETT.", 188: 215 (1985 ) og tilsvarer det området som er identifisert som en hovedepitop erkjent av antistoffer fra omtrent 98% av AIDS-pasientene, [Wang et al., "Proe. Nat. Acad. Sei. USA", 83; 6259 (1986)].

Syntetiske peptider ble syntetisert ved bruk av Merrifield-prosedyren [R.S. Hodges og R.B. Merrifield, "Anal. Biochem.", 65, 241 (1975)] ved hjelp av en Applied Biosystems-modell 430-syntesizer ved bruk av doble koblingscykler tilveiebragt fra produsenten. N-t-butyloksykarbonylaminosyrederivatene var oppnådd fra Protein Research Foundation (Osaka, Japan). Sidekjedebeskyttelsen var den samme som levert av Applied Biosystems bortsett fra det i stedet for arginin ble benyttet omega-N02-derivatet. Kjedekonstruksjonen ble overvåket ved bruk av ninhydrin [V. Sarin et al., "Anal. Biochem.", 117, 147 (1981)]. De monterte peptider ble samtidig spaltet og avbeskyttet ved bruk av vandig HF inneholdende 10% anisol (volum/volum) [J.M. Stewart og J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", s. 44 og 66, W.H. Freeman, San Francisco

(1966)]. Råpeptidet ble felt ut med dietyleter, vasket med etylacetat og ekstrahert med 60% acetonitril i 0,1% trifluoreddiksyre (volum/volum). Syntetiske peptider ble renset ved preparativ reversfasekromatografi (Amicon C^g-harpiks, 250 Å porestørrelse, 25 mm x 400 mm), med eluering med en gradient av 1000 ml 0 til 60% acetonitril i 0,1% trifluoreddiksyre. Det syntetiske peptid var omtrent 95% rent bedømt ved analytisk reversfase-HPLC og ved kvantitativ aminosyreanalyse fulgt av sur hydrolyse.

1. SPDP- merking av ervtrocvttbindingen Ab ( RAT 1C3/ 86)

Til 0,25 ml 13,8 mg/ml RAT 1C3/86 ble det satt 12,5 pl 2 mg/ml SPDP i dimetylformamid og reaksjonen ble tillatt å skride frem i en time ved 25°C. Ikke-omsatt SPDP ble fjernet ved gelfiltrering på Sephadex G 25 og nivået av SPDP-merking (1,4 mol/ml) ble bestemt.

2. Reduks. ion av peptid 3. 2

Peptid 3.2 (sekvens RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGK, tilsvarende resten 579-601 av hovedbeleggsproteinet av HIV-1) ble oppløst i 1 ml 100 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pE 8,0 og omsatt med 10 yil 2-merkaptoetanol i 45 minutter ved 40°C. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 4 dråper trifluoreddiksyre og 1 ml vandig 0,1 %-ig TFA. Blandingen ble ført til en Sep-pak (Waters) C 18-patron som var behandlet med 20 ml 60 %-ig acetonitril, 0,1% TFA og ekvilibrert med 0,1% TFA. Det reduserte peptid ble sirkulert gjennom Sep-pak to ganger før vasking med 20 ml 0,1% TFA. Det reduserte peptid ble eluert fra Sep-pak med 2 x 2 ml 60 %-ig acetonitril, 0,1% TFA. Prøven ble rotasjonsfordampet til tørr tilstand før kobling.

3. Konjugering

Peptidet ble oppløst i 0,2 ml av en buffer inneholdende 100 mM kaliumfosfat, 10 mM natriumklorid og 4M guanidin-ECl med pE 7,4 og blandet med 2,2 mg SPDP av merket antistoff i den samme buffer, men uten guanidin-ECl. Kolben ble inkubert over natt ved 25°C.

Substitueringsgraden for antistoffet påvirket oppløseligheten for konjugatet: 20 mol peptid pr. mol konjugat ble uopp-løselig.

Området 5 til 7 mol peptid pr. mol antistoff var optimalt. Konjugatets kapasitet til å binde røde blodlegemer ble overvåket ved bruk av agglutineringsprøven med kanin-antimus-antistoff og med HIV-positivt fullblod.

4. Gelfiltreringskromatografi

Ikke-omsatt peptid og SPDP-biprodukter ble fjernet ved gelfiltrering på en Superose 6-kolonne fra Pharmacia i fosfatbufret saltoppløsning og antistoffholdige fraksjoner ble samlet og lagret ved 4°C efter tilsetning av 0,01% natriumazid som preserveringsmiddel.

5. Fremstilling av reagens for analyse

2 volumer konjugater ble blandet med et volum av 10 mg/ml oppløsning av et ikke-relatert monoklonalt antistoff (Bruce 5) fremstilt som beskrevet av Bundesen et al., "Vet. Immun.", "Immunopath.", 8, 245-260, 1985.

Analyseprosedyre

For analyse ble 10 jjI heparinisert fullblod anbragt på en glassplate. 30 pl reagens ble tilsatt og blandet. Platen ble rystet opp til 3 minutter og nærværet eller fraværet av agglutinering ble notert.

Ni uavhengige peptid/antistoff-konjugater ble fremstilt og funnet å være aktive med henblikk på agglutinering av seropositive pasienters røde blodlegemer. Aktivt konjugat ble også fremstilt ved bruk av m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester som tverrbindingsmiddel.

Resultatene var i det minste sammenlignbare hva angår nøyaktighet med de som ble observert med en enzym-immunoanalyse ved bruk av et tilsvarende antigen (tabell 1). Sammenligningsprøving av blodprøver ble gjennomført ved hjelp av ELISA for å bekrefte positive og negative resultater oppnådd med erytrocyttanalysen.

Kontrollblodprøver omfattet ELISA-negative blodprøver og ELISA-positive prøver fra infiserte pasienter. EIV-positive pasienter ble bekreftet Western-blott positive ved hjelp av Victorian State Reference Laboratory. Fairfield-hospital-pasienter var negative enten via Western-blott eller EIA (Abbott Laboratories). Bloddonorer ble prøvet via EIA (Genetic Systems). Falske positive eller negative verdier er gitt i parentes og ble verifisert ved EIA eller Western-blott-analyser.

For å bedømme spesifisiteten for prøven ble en serie syntetiske peptider tilsvarende andre områder av EIV-1-konvoluttproteinene prøvet med henblikk på kapasiteten til å inhibere agglutineringsreaksjon (tabell 2). Intet ikke-relatert peptid konkurrerte og det syntetiske gp41-fragment, restene 572 til 591, som mangler den essensielle karboksy-terimal epitopregion, inhiberte ikke agglutinering. Inhi-beringen av agglutinering med fritt syntetisk antigen var brukbart med henblikk på å bekrefte de leilighetsvis svake positive prøver. Hvis tilsetning av syntetisk peptid ikke inhiberte agglutinering, ville dette ha vært indikerende på en falsk positiv relatert til anti-rød-blodlegeme-antistoffet.

0,125 mg/ml syntetisk peptid ble tilsatt til det konjugerte antistoff før tilsetning av fullblod. Agglutineringsprøven ble gjennomført som beskrevet ovenfor. De vanlige sekvenser er understreket.

Eksempel 3: Fremtiling av chimere antistoffer (antiglykoforin/antihuman D-dimer) og bruk i en analyse for D-dimer.

Monoklonale antistoffer RAT 1C3/86 (antihuman røde blodlegemer) og DD-1C3/108 (antihuman D-dimer som beskrevet av Rylatt et al., 1983, "Thrombosis Res.", 31, 767-778) ble brutt ned med pepsin i det vesentlige som beskrevet av Hackman et al., 1981, "Immunology", 15, 429-436 og renset ved kromatografi på en TSK-3000 SW-kolonne. 2 mg RAT 1C3/108 ble brutt ned i 45 minutter med 1% vekt/vekt pepsin i en buffer inneholdende 0,1M eddiksyre, 70 mM natriumklorid med pH 3,5. I mellomtiden ble 2 mg DD-1C3/108 brutt ned med 1% vekt/vekt pepsin i 2 timer i den samme buffer. Reaksjonene ble avsluttet ved tilsetning av 1,5M Tris for å heve pH-verdien til 8. F(ab)2-fragmentene ble renset ved gelfiltreringskromatografi på en TSK-3000 SW-kolonne.

Reduksjonen av F(ab)2 og efterfølgende blokkering av Fab-fragmentet ble gjennomført som beskrevet av Brennan et al., 1985,"Science" , 229, 81-83. Et 3 mg/ml F(ab)2-preparat ble behandlet med 1 mM merkaptoetylamin i nærvær av 10 mM natriumarsenitt i 16 timer ved 25°C. Fab-fragmentene ble stabilisert ved omsetning med 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzo-syre) (Ellman's reagens) i 3 timer ved 25° C. Fab-fragmentet ble så renset ved gelfiltreringskromatografi på en TSK-3000 SW-kolonne.

Tiolformen av DD-1C3/108 ble regenerert ved omsetning med 10 mM merkaptoetylamin i 30 minutter ved 25°C. Overskytende reagens ble fjernet ved gelfiltreringskromatografi på en TSk-3000 SW-kolonne. En blanding av tiolen DD-1C3/108 og Ellman's reagens-behandlet RAT 1C3/86 ble inkubert i 16 timer ved 25<0>C som beskrevet av Brennan et al. Til slutt ble det chimere antistoff renset ved ytterligere gelfiltreringskromatografi på en TSK-3000 SW-kolonne.

Fremstilling av reagens

2 volumer 0,1 mg/ml chimert antisoff ble blandet med 1 volum 7,5 mg/ml ikke-relatert monoklonalt antistoff (Bruce 5).

Analyseprosedyre

For analyse ble 10 pl heparinisert fullblod anbragt på en glassplate. 30 pl reagens ble tilsatt og blandet. Platen ble rystet i 3 minutter og i nærvær av D-dimeren ble agglutinering observert.

Eksempel 4: Fremstilling av SPDP-konjugert digoksin/antiglykoforin-antistoffkonjugat.

Fremstilling av digoksin/ Ab- konjugat

1) Fremstilling av perjodatoksydert digoksin.

2 ml 100 mM natriumperjodat ble langsomt og dråpevis satt

til 40 ml digoksin fra Sigma, suspendert i 2 ml 95 %-ig etanol hvorefter reaksjonen ble tillatt å fortsette i 30 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 60 jjI IM etandiol. Til slutt ble mellomproduktet i form av en Schiffs base stabilisert ved tilsetning av 2 ml 40 mM cystin (30 minutter, 37°C) og efterfølgende reaksjon med 1 ml 15 mg/ml natriumborhydrid (16 timer, 25°C).

2) Reduksjon av cystein/digoksin-konjugat.

3 ml cystin/digoksin-konjugat ble redusert ved tilsetning

av 40 pl merkaptoetanol (40 minutter, 37°C) og produktet renset ved kromatografi på en Waters Sep-Pak C 18-patron som beskrevet ved reduksjonen av peptider i eksempel 1. Efter rotasjonsfordamping ble prøven omsattmed SPDP-merket RAT 1C3/86 som var merket med 5 propylditiopyridin-grupper/antistoff som beskrevet i eksempel 1 (16 timer, 25°C). Til slutt ble digoksin/antistoff-konjugat renset ved gelfiltreringskromatografi på Superose 12.

Eksempel 5: Fremstilling av HIV-peptid/antiglykoforin

F(ab)g-konj ugat.

Et alternativt reagens for detektering av anti-HIV-antistoffer benytter et F(ab^-derivat av antiglykoforin-antistoffet.

RAT 1C3/86 (2 mg/ml i 70 mM acetet, 100 mM natriumklorid, pH 3,5) ble brutt ned med 10 pg/ml pepsin (Sigma P6887) i 40 minutter ved 37°C og reaksjonen avsluttet ved tilsetning av 1/10 volum 1,5M Tris-base. Efter dialyse over natten til en buffer inneholdende 5 mM natriumf osf at med pH 8,0, ble antistoff-fragmentet renset ved ioneutbyttingskromatografi på DEAE-cellulose ved en 5-300 mM gradient natriumfosfat med pH 8,0.

SPDP-merking av F(ab^-fragmentet, reduksjon av peptid 3.2, konjugering av peptid 3.2 ti F(ab)2 RAT 1C3/86, rensing av peptidkonjugatet, fremstilling av reagens for analyse og prøveprosedyren ble gjennomført som beskrevet for hele antistoffkonjugatet.

F(ab)2~konjugatene av andre erytrocytt- eller analytt-bindingsantistoffer kan på tilsvarende måte fremstilles og kan kobles til molekyler forskjellig fra HIV-peptidet.

Eksempel 6: Fremstilling av HIV-peptidet/antiglykoforin

Fab'-konjugat.

Et annet alternativt reagens benytter et univalent Fab'-fragment som EBM.

F(ab)2 RAT 1C3/86 i fosfatbufret saltoppløsning ble inkubert med 10 mM merkaptoetanol i 1 time ved romtemperatur. Derefter ble 15 mM jodacetamid tilsatt og reaksjonen tillatt å skride frem i 15 minutter i mørke. Til slutt ble reaksjonen avsluttet ved dialyse til 100 volumer fosfatbufret salt-oppløsning.

SPDP-merking av den s-karboksymetylerte Fab', reduksjon av peptid 3.2, konjugering av peptid 3.2 til Fab'-TNB (tionitro-benzoyl) RAT-fragmentet av RAT 1C3/86, rensing av peptidkonjugatet, preparering av et reagens for analyse og prøveprosedyre ble gjennomført som beskrevet for hele antistoff-konjugatet.

Eksempel 7: Fremstilling av melittin som alternativ EBM.

Et peptid fra bievenom, melittin (CVLTTGLPALISWIKRKRQQ), ble benyttet som et alternativ til det erytrocytt-bindende monoklonale antistoff. Dette peptid binder til erytrocytt-overflaten uten lysering av cellen (deGrado W.F., Kezdy, F.J., Kaiser E.T. , "J. Am. Chem. Soc", 1981, 103, 679-81 ). Peptidet ble syntetisert ved Merrifield-prosedyren (Hodges, Merrifield, "Anal. Biochem." 1975, 65, 241).

En fordel ved å benytte melittin som EBM er at det og en peptidtype ABM kan syntetiseres som en enkelt enhet.

Eksempel 8: Anvendelse av avidin-biotin-binding for å koble

EBM og ABM.

ABM og EBM behøver ikke å være kovalent koblet. Et alternativ er avidin-biotin-binding.

Fremstiling av biotin- merket melittin

10 mg melittinpeptid ble redusert med merkaptoetanol som beskrevet for 3.2-peptidet i eksempel 1. Efter rotasjonsfordamping ble prøvene suspendert igjen i 2 ml 0,1M Tris-HCl, 5 mM EDTA, pE 8,0 og omsatt med 1 ml dimetylsulfoksyd (DMSO),

inneholdende 4,3 mg N-jodacetyl-N-biotinylheksylendiamin (Pierce). Det hele ble tillatt omsetning i 15 minutter ved romtemperatur og det biotinylerte derivat separert fra biprodukter på en Sephadex G10-kolonne.

Fremstilling av avidin- merket peptid 3. 2

Dette 3.2-peptid kobles til avidin på samme måte som det ble koblet til antistoffet i eksempel 1.

Analyse

Sub-agglutineringsdoser av det avidin-merkede peptid tilsettes til de røde blodlegemer.

Bemerkninger

Det skal være klart at avidinerte og biotinylerte molekyler kan byttes ut mot hverandre.

Claims (15)

1. Agglutineringsreagens for detektering av en analytt i en blodprøve omfattende et erytrocytt-bindende molekyl forbundet til et analytt-bindende molekyl der det erytrocytbindende molekyl er forbundet med det analyt-bindende molekyl på en slik måte at bindingsegenskapene for de bindende molekyler ikke endres ved forbindelsen og det erytrocytt-bindende molekyl er i stand til å binde erytrocytter endogent til blodprøven men ikke agglutinerer endogene erytrocytter i fravær av analytt, karakterisert ved at det erytrocytt-bindende molekyl er valgt blant et anti-erytrocyt-antistoff, et F(ab)2~ eller Fab' fragment derav, mellitin, et lecitin, et molekyl med spesifikk affinitet for erytrocytt-overflaten og et spesifikt bindende fragment av en hvilken som helst av disse.

2. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet eller F(ab)2~ eller Fab'-fragmentet derav bringes mot glykoforin A, glykoforin B, integralt membran protein 1, membranforbundet glykoprotein C4, integralt membran glykoprotein, ankyri, spectrin, glykolipid, glykos-fingolipid, protein 4-1 eller F-aktin, eller er fremstilt ved cellelinjen G26.4IC3/86, under depot ATCC med depotnummer HB9893.

3. Reagens ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det omfatter et heterobifunksjonelt hybrid-antistoffkonjugat eller et fragment avledet fra et anti-erytrocyt-antistoff og et analyt-bindende molekyl avledet fra et anti-analytt-antistoff.

4 . Reagens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det erytrocytbindende molekyl omfatter et univalent fragment avledet fra et anti-erytrocyt antistoff og at det analytt-bindende middel omfatter et univalent fragment avledet fra et anti-analytt-antistoff.

5 . Reagens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det videre omfatter et sekundært antistoff eller et spesifikt bindende fragment derav som spesifikt erkjenner en overlappende epitop dannet ved binding av analytt-bindedelen til analytten.

6. Reagens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at det analytt-bindende molekyl er et HIV-l-peptid eller hepatitt-virus-peptid, digoksin eller antistoff eller F(ab)2~ eller Fab'-fragment derav, satt mot human D-dimer, veksthormon eller hepatittis-virus eller et anti-idiotopisk antistoff.

7. Anvendelsen av en reagens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 for detektering av en analytt i en blodprøve inneholdene eretrocytter ved blanding av prøven med reagensen, og observere hvorvidt eretrocyttene agglutineres og korrelering av agglutineringen med mengden av analytt som er tilstede i prøven.

8. Anvendelse ifølge krav 7, ved ytterligere tilsetning av et sekundært antistoff som binder til en ny epitop dannet ved bindingen av den analytt-bindede del til analytten.

9. Agglutineringsreagens for inndirekte detektering av en analytt i en blodprøve, der erytrocytt-bindemolekylet er forbundet med analyttanalogen på en slik måte at bindingsegenskapene for erytrocytbindemolekylet ikke endres ved forbindelsen og der erytrocyttbindemolekylet er i stand til å binde erytrocytter endogent til prøven men ikke agglutinerer endogene erytrocytter i fravær av analytt-bindereagens, karakterisert ved at man benytter et erytrocytt-bindemolekyl valgt blant et anti-erytrocyt-antistoff, et F(ab)g- eller Fab' fragment derav, mellitin, et lecitin, et molekyl med spesifikk affinitet for erytrocytt-overflaten og et spesifikt bindende fragment av en hvilken som helst av disse.

10. Anvendelsen av en agglutineringsreagens ifølge krav 9 for bestemmelse av nærværet eller mengden av en analytt i en blodprøve omfattende inkubering av prøven med agglutineringsreagensen og en oppløselig analyttbindende reagens hvorved agglutineringsreagensen konkurrerer med prøveana-lytten om analyttbindingssetene i den analyttbindende reagens, observering av hvorvidt agglutinering inntrer og bestemmelse av nærværet eller mengden av analytten fra den inverse verdi av agglutineringsgraden.

11. Anvendelse ifølge krav 7 eller 10, der analytten er et antigen, antistoff eller hapten og det analyttbinde molekyl er et antistoff.

12. Anvendelse ifølge krav 11, av en analytt iform av et HIV-antistoff.

13. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 7, 8, 10,

11 eller 12, der erytrocytt-bindemolekylet er et antistoff for glykoforin eller et spesielt bindende fragment derav.

14 . Agglutineringsprøvesett, karakterisert ved at det omfatter en reagens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 eller 9 og et sekundært bindemolekyl som binder til en ny epitop som dannes ved binding av analytt-bindemolekylet til analytten.

15 . Agglutineringsprøvesett, karakterisert ved at det omfatter en reagens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 eller 9 og en referanse-oppløsning inneholdende en kjent mengde analytt.