CN107636009A

CN107636009A - 具有改善的稳定性的胰高血糖素衍生物

Info

Publication number: CN107636009A
Application number: CN201580077186.3A
Authority: CN
Inventors: 金正国; 李钟旻; 金尚允; 裴城敏; 郑圣烨; 权世昌
Original assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: IL253206A0; KR102291020B1; PH12017501222A1; US20170360892A1; PH12017501222B1; EP3241841A4; EP3241841A1; DOP2017000156A; CR20170293A; WO2016108586A1; UA126960C2; GT201700150A; ZA201705015B; EP3575314C0; EP3575314A3; AR103322A1; US11135271B2; EP3575314A2; AU2015372818A1; KR20160082482A

Abstract

本发明涉及新型胰高血糖素衍生肽，以及含有该新型胰高血糖素衍生肽作为有效成分的用于预防或治疗低血糖症的组合物。根据本发明的胰高血糖素衍生物由于等电点(pI)的改变而具有改善的物理性质同时能够保证对胰高血糖素受体的活性，因此当用作降血糖剂时可以改善患者依从性，并且也适于与其它抗肥胖剂组合施用。因此，根据本发明的胰高血糖素衍生物可以有效地用于预防和治疗低血糖症或肥胖。

Description

具有改善的稳定性的胰高血糖素衍生物

技术领域

本发明涉及由于等电点(pI)的变化而具有改善的物理性质的新型胰高血糖素衍生物，以及用于含有胰高血糖素衍生物作为有效成分的预防或治疗低血糖症和肥胖的组合物。

背景技术

近年的经济进展和生活方式改变伴随着饮食习惯的重大变化。特别地，现今繁忙的人们由于高卡路里饮食和不充足的运动而超重和肥胖。据世界卫生组织(WHO)报道，全球超过十亿名成年人超重，其中超过三百万人经临床诊断为严重肥胖，且每年有25,000人死于超重或肥胖相关的疾病(World Health Organization，Global Strategy on Diet，Physical Activity and Health，2004)。

超重和肥胖造成血压和胆固醇水平增加，并引起多种疾病或使多种疾病恶化，如心脏疾病、糖尿病，关节炎等。此外，肥胖问题也成为儿童或青少年以及成年人中动脉粥样硬化、高血压、高脂血症或心脏病发生率增加的主要原因。然而，肥胖不容易治疗，因为其是与食欲控制和能量代谢机制相关的复杂疾病。因此，肥胖的治疗不仅需要患者自身的努力，而且还需要能够治疗与食欲控制和能量代谢相关的异常机制的方法。因此，已致力于开发用于治疗该异常机制的药物。

这些努力的结果，已经开发了诸如利莫那班(Rimonabant)(Sanofi-Aventis)、西布曲明(Sibutramin)(Abbott)、纳曲酮(Contrave)(Takeda)、和奥利司他(Orlistat)(Roche)等药物，但是它们的缺点是具有严重副作用或非常弱的抗肥胖效果。例如，据报道，利莫那班显示中枢神经系统疾病的副作用，西布曲明和纳曲酮显示心血管副作用，而奥利司他显示服用1年仅减少约4公斤体重。因此，尚未有对于肥胖患者可安全处方的肥胖治疗剂。

已经进行许多广泛的研究来开发针对肥胖的可以解决传统抗肥胖药物的问题的新型治疗剂。近来，胰高血糖素衍生物受到许多关注。由于其他药物或疾病，或激素或酶缺乏的结果而血糖水平下降时，由胰产生胰高血糖素。胰高血糖素刺激肝脏中的糖原降解，并且有助于葡萄糖释放以提升血糖水平至正常范围。除了增加血糖水平的作用外，胰高血糖素抑制食欲并激活脂肪细胞的激素敏感脂肪酶而促进脂肪分解，从而显示出抗肥胖效果。然而，使用胰高血糖素作为治疗剂受到限制，因其低溶解度和其在中性pH下沉淀的性质。

胰高血糖素衍生物之一是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，其作为在糖尿病患者中用于治疗高血糖症的治疗剂已在开发中。GLP-1具有刺激胰岛素合成和分泌、抑制胰高血糖素分泌、减缓胃排空、增加葡萄糖利用率以及抑制食物摄取的功能。

据报道由蜥蜴毒液制备并且与GLP-1具有约50％的氨基酸同源性的毒蜥外泌肽-4活化GLP-1受体，从而降低糖尿病患者的高血糖症。然而，据报道含有GLP-1的抗肥胖药物显示如呕吐和恶心等副作用。

因此，作为GLP-1的替代物，已有许多注意力集中于泌酸调节肽，其可以结合两种肽——GLP-1和胰高血糖素——两种受体。泌酸调节肽是由胰高血糖素前体(前胰高血糖素)制备的肽，且具有抑制食物摄入和增强GLP-1的饱的功能，以及具有如同胰高血糖素的脂解活性，从而在抗肥胖治疗中增加其效力。

然而，泌酸调节肽或其衍生物具有的严重缺点在于，因它们具有低效力和短的体内半衰期，应每天给予过量的药物以用于肥胖症治疗。

此外，当GLP-1和胰高血糖素的两种活性存在于单一肽时，其活性比(activityratio)变成固定的，因此难以使用多种比例的双重激动剂。因此，通过调节GLP-1和胰高血糖素的含量而能够使用各种活性比的组合疗法可更为有效。

然而，对于组合疗法，需要改善胰高血糖素的物理特性，其在中性pH下凝集并随时间而沉淀，因此显示不佳的溶解度。

在这些情况下，本发明人已经开发具有胰高血糖素氨基酸序列的部分修饰的胰高血糖素衍生物，用以通过改善胰高血糖素的物理性质来改善胰高血糖素对低血糖症和肥胖症的治疗效果，并发现这些胰高血糖素衍生物在中性pH下具有改善的溶解度和更高的稳定性，从而完成本发明。

公开内容

技术问题

本发明的目的是提供具有改善的物理性质的新型胰高血糖素衍生物。

本发明的另一目的是提供含有胰高血糖素衍生物作为有效成分、用于预防或治疗低血糖症的组合物。

本发明的又一目的是提供含有胰高血糖素衍生物作为有效成分、用于预防或治疗肥胖的组合物。

技术方案

为了实现上述目的，一方面，本发明提供新型胰高血糖素衍生物，其包含以下通式1的氨基酸序列，并且具有与天然胰高血糖素不相同的(即不同的)的等电点(pI)：

X1-X2-QGTF-X7-SDYS-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-X24-W-L-X27-X28-T(通式1)

其中，在通式1中，

X1是组氨酸、脱氨基-组氨酸、N-二甲基-组氨酸、β-羟基咪唑丙酸(β-hydroxyimidazopropionic acid)、4-咪唑乙酸(imidazoacetic acid)、β-羧基咪唑丙酸、色氨酸、酪氨酸、或被删除；

X2是α-甲基-谷氨酸、氨基异丁酸(Aib)、D-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或D-丝氨酸；

X7是苏氨酸或缬氨酸；

X12是赖氨酸或半胱氨酸；

X13是酪氨酸或半胱氨酸；

X14是亮氨酸或半胱氨酸；

X15是天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸；

X16是谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、α-甲基-谷氨酸或半胱氨酸；

X17是天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；

X18是天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸或半胱氨酸；

X19是丙氨酸或半胱氨酸；

X20是赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；

X21是天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；

X23是缬氨酸或精氨酸；

X24是缬氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或精氨酸；

X27是异亮氨酸或甲硫氨酸；和

X28是精氨酸或天冬酰胺

(条件是当通式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相同时，其被排除)。

根据本发明的胰高血糖素衍生物包括肽、肽衍生物或肽模拟物，其通过修饰天然胰高血糖素的部分氨基酸(一个或多个)而具有与天然胰高血糖素不同的pI而具有改善的物理性质。

如本文所使用的，术语“天然胰高血糖素”是指具有以下序列的天然人胰高血糖素His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO：1)。

关于根据本发明的通式1的序列，根据传统叙述方式，氨基酸从左侧N末端行进至右侧C末端。因此，当任何特定残基的“位置”指在通式1的序列中时，其应以与当指代天然胰高血糖素或其它分子中的任何位置时相同方式来解释。

在本发明的说明书全文中，不仅对于天然存在的氨基酸使用常规的单字母或三字母码，而且对于其它氨基酸，如α-氨基异丁酸(Aib)、Sar(N-甲基甘氨酸)和α-甲基-谷氨酸，通常允许使用那些三字母码。

此外，本文所述的氨基酸根据IUPAC-IUB命名规则缩写如下：

丙氨酸 A；精氨酸 R；

天冬酰胺 N；天冬氨酸 D；

半胱氨酸 C；谷氨酸 E；

谷氨酰胺 Q；甘氨酸 G；

组氨酸 H；异亮氨酸 I；

亮氨酸 L；赖氨酸 K；

甲硫氨酸 M；苯丙氨酸 F；

脯氨酸 P；丝氨酸 S；

苏氨酸 T；色氨酸 W；

酪氨酸 Y；和缬氨酸 V.

如本文所使用的，术语“肽”是指通过肽键连接的两个或更多个天然和非天然氨基酸或如α-氨基酸的氨基酸衍生物的化合物。如本文所使用的，术语“胰高血糖素衍生物”是指包括通式1的序列或其衍生物、其类似物或其修饰产物的肽。根据本发明的肽包括肽模拟物，其通过以取代等形式修饰胰高血糖素的部分氨基酸(一个或多个)而与天然胰高血糖素相比pI具有变化。在本发明的示例性实施方式中，胰高血糖素衍生物具有与天然胰高血糖素不同的等电点，同时保持胰高血糖素受体的活性。在本发明的更具体的示例性实施方式中，胰高血糖素衍生物是指具有在生理pH下改善的天然胰高血糖素的溶解度同时保持胰高血糖素受体活性的肽。

如本文所使用的，术语“pI”或“等电点”是指大分子如多肽在其不具有净电荷(0)的pH值。在具有多种带电官能团的多肽的情况下，在其中pH值与pI相同的点，全部多肽的净电荷为“0”。在高于pI的pH，多肽的净电荷将为负，而在低于pI的pH，多肽的净电荷将为正。

可通过本领域中使用的常规方法测量或估算pI值。例如，pI值可以在由聚丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖组成的固定化pH梯度凝胶上，通过等电点电泳而测量，或者例如可以使用pI/MW工具(http://expasy.org/tools/pi_tool.html；Gasteiger et al.，2003)在ExPASy服务器中由氨基酸序列进行估算。

在本发明的具体实施方式中，含有通式1的氨基酸序列的胰高血糖素衍生物包括在SEQ ID NO：1所示的天然胰高血糖素的氨基酸序列中通过氨基酸(一个或多个)的取代、添加、缺失或翻译后修饰(例如，甲基化、酰化、泛素化或分子内共价结合)所制备的任何肽，其显示因其pI与天然胰高血糖素的pI不同而改善的根据溶液pH的溶解度同时保持原有的(as they are)胰高血糖素受体活性，从而具有改善的体内化学稳定性。

在氨基酸的取代或添加过程中，不仅可以使用通常见于人蛋白质的20种氨基酸，而且可以使用非典型的或非天然存在的氨基酸及其衍生物。非典型氨基酸的商业来源可包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.、Genzyme Pharmaceuticals等。包括这些氨基酸和非典型肽序列的肽可从商业供应商，如American Peptide Company、Bachem(USA)、或Anygen(韩国)合成并购得。氨基酸衍生物，例如脱氨基-组氨酸、β-羟基咪唑丙酸、4-咪唑乙酸或β-羧基咪唑丙酸，可以以相同的方式获得。

由于胰高血糖素具有约7的pH，其不溶于pH 6至8的溶液并且在中性pH下倾向沉淀。在具有pH为3或更低的水溶液中，胰高血糖素在初始阶段溶解，但在1小时内由于形成凝胶而沉淀。由于凝胶化的胰高血糖素主要由β-片层原纤维组成，通过注射针或静脉内注射施用由此沉淀的胰高血糖素将阻塞血管，因而不适合用作注射剂。为了延迟沉淀过程，通常使用酸性(pH2-4)制剂，并且通过这样做，胰高血糖素可以在短时间保持相对非聚集状态。然而，在低pH下，胰高血糖素可以非常迅速地形成原纤维，因此这些酸性制剂必须在制备时注射。

本领域众所周知，蛋白质在溶液中的溶解度、活性和稳定性可根据pI而变化(Shaw，K.L.et al.，Protein Science 10，pp 1206-1215，2001)。

因此，本发明人通过修饰天然胰高血糖素的序列，从而改变其pI已经开发了具有延长的稳定性和功能效果的胰高血糖素衍生物。本发明的胰高血糖素衍生物与天然胰高血糖素相比具有改变的pI，特征在于，与天然胰高血糖素相比，其具有改善的根据给定溶液pH的溶解度和稳定性。

在本发明的具体实施方式中，胰高血糖素衍生物可以是肽，其中在通式1的氨基酸序列中：

X1是组氨酸或色氨酸、酪氨酸、或被删除；

X2是丝氨酸或氨基异丁酸(Aib)；

X7是苏氨酸或缬氨酸；

X12是赖氨酸或半胱氨酸；

X13是酪氨酸或半胱氨酸；

X14is亮氨酸或半胱氨酸；

X15是天冬氨酸或半胱氨酸；

X16是谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或半胱氨酸；

X17是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；

X18是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或半胱氨酸；

X19是丙氨酸或半胱氨酸；

X21是天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；

X23是缬氨酸或精氨酸；

X24是缬氨酸，亮氨酸或谷氨酰胺；

X27是异亮氨酸或甲硫氨酸；和

X28是精氨酸或天冬酰胺

更优选地，本发明的胰高血糖素衍生物可以是包含SEQ ID NOS：2至34所示的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列的肽。

包含本发明的胰高血糖素衍生物的肽可以通过标准合成方法、重组表达系统或本领域任何其它方法所制备。因此，根据本发明的胰高血糖素类似物可以通过包括下述方法的许多方法合成：

(a)通过逐步的固相或液相方法或通过片段组装，接着分离和纯化最终肽产物的合成肽的方法；或者

(b)在宿主细胞中表达编码肽的核酸构建体并从宿主细胞培养物回收表达产物的方法；或者

(c)进行编码肽的核酸构建体体外无细胞表达并从其中回收表达产物的方法；或者

(d)通过方法(a)、(b)和(c)的任意组合获得肽片段，通过连接该肽片段而获得肽，以及随后回收肽的方法。

在本发明的示例性方面，已证实本发明的胰高血糖素衍生物具有与天然胰高血糖素相比不同的pI(参见表1)。结果，与天然胰高血糖素相比，本发明的胰高血糖素衍生物具有根据给定溶液pH的改善的溶解性和更高的稳定性。因此，当本发明的胰高血糖素衍生物用作降血糖剂时可以增加患者依从性，并且也适用于与其它抗肥胖剂组合施用的联合给药，因此可有效地用于预防和治疗低血糖症和肥胖。

在这方面，本发明的胰高血糖素衍生物可以提供对于低血糖症、肥胖或其相关疾病的有吸引力的治疗选择。

例如，本发明的胰高血糖素衍生物是主要胰岛素响应-控制激素，并且可以有效地用于治疗糖尿病患者的严重低血糖症。

此外，本发明的胰高血糖素衍生物可以用作这样的药物——其不仅用于预防体重增加、促进体重减轻、减轻超重以及包括病态肥胖的肥胖症(例如，通过控制食欲、摄取、食物摄取、卡路里摄入和/或能量消耗)，而且还用于治疗肥胖相关的炎症、肥胖相关的胆囊疾病和肥胖诱导的睡眠呼吸暂停，但不限于此——并且可以用于治疗其相关疾病或健康状况。本发明的胰高血糖素衍生物也可用于治疗可能与肥胖相关的健康状况，如代谢综合征、高血压、动脉粥样硬化(atherosclerosis)引起的血脂异常、动脉硬化(arteriosclerosis)、动脉硬化(arterial chlerosis)、冠心病、中风等。然而，根据本发明的胰高血糖素衍生物的效果可全部或部分地通过上述体重相关效应(effect)介导，或可以不依赖该效应。

同时，为了改善本发明的胰高血糖素衍生物的治疗效果，可以使用本领域的典型技术来修饰胰高血糖素衍生物，包括用聚合物如聚乙二醇(PEG)和糖链的修饰，或与白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸和免疫球蛋白等的融合等。例如，本发明化合物中的至少一个氨基酸侧链可以连接至聚合物以增加其体内溶解度和/或半衰期，和/或增加其生物利用度。已知这些修饰降低治疗性蛋白质和肽的清除率。

对于这些聚合物，可溶性(两亲性或亲水性)、无毒性和药学上惰性的聚合物是合适的，并且优选地，它们可以包括PEG、PEG的均聚物或共聚物、单甲基取代的聚合物(mPEG)、和聚-氨基酸如聚-赖氨酸、聚-天冬氨酸和聚-谷氨酸。

如上所述的胰高血糖素衍生物的变体也属于本发明的范围。

另一方面，本发明提供编码上述胰高血糖素衍生物的多核苷酸。

如本文中使用的，术语“同源性”，对于多核苷酸，意指与野生型氨基酸序列和野生型核酸序列的相似程度，并且包括与编码胰高血糖素衍生物的多核苷酸序列具有75％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高同一性的基因序列。同源性评估可以用肉眼或使用商业可得的程序完成。使用商业可得的计算机程序，介于两个或更多个序列之间的同源性可以表示为百分比(％)，并且可以评估介于相邻序列之间的同源性(％)。编码胰高血糖素衍生物的多核苷酸可以插入至载体并表达以获得大量的胰高血糖素衍生物。

对于这些重组表达，通常将本发明的多核苷酸插入至合适载体以构建含有这些多核苷酸的克隆载体或重组载体，并且这些载体也属于本发明的范围。

如本文所使用的，术语“重组载体”是指包含编码目标肽的多核苷酸序列的DNA构建物，其可操作地连接至合适的调控序列，使得目标肽，例如胰高血糖素衍生物，能在宿主细胞中表达。调控序列包括能够启动转录的启动子、用于调节转录的任何操纵子序列、编码合适mRNA核糖体-结合结构域的序列、以及调控转录和翻译终止的序列。重组载体在转化为合适的宿主细胞后，可以无论宿主基因组如何地进行复制或起作用，或者可以整合至宿主基因组本身。

本发明中使用的重组载体可以不受具体限制，只要该载体可在宿主细胞中复制，并且其可以使用本领域已知的任何载体构建。载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等；作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。可以在本发明中使用的载体没有特别限制，可以使用任何已知的表达载体。

重组载体被用于转化产生本发明的胰高血糖素衍生物的宿主细胞。此外，这些转化的细胞，作为本发明的一部分，可以用于扩增核酸片段和载体，或者可以是在本发明的胰高血糖素衍生物的重组生产中使用的培养的细胞或细胞系。

如本文所使用的，术语“转化”是指将包含编码目标蛋白的多核苷酸的重组载体导入宿主细胞，由此能够在宿主细胞中表达该多核苷酸编码的蛋白质的过程。对于转化的多核苷酸，不论其是否插入至宿主细胞的染色体并位于其中或位于染色体外，只要其可以在宿主细胞中表达即可，且这两种情况都包括。

此外，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式插入，只要其可以被导入宿主细胞并在其中表达即可。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式导入宿主细胞。表达盒可以常规地包括可操作地连接至多核苷酸的启动子，转录终止信号，核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。另外，多核苷酸可以其原样导入宿主细胞，并在宿主细胞中可操作地连接至其表达必需的序列，但不限于此。另外，如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指介于启动子序列(其起始和介导编码本发明的目标蛋白的多核苷酸的转录)与上述基因序列之间的功能性连接。

将用于本发明的合适宿主不受具体限定，只要其能够表达本发明的多核苷酸。合适的宿主的实例可以包括属于埃希氏杆菌属的细菌如大肠杆菌(E.coli)，属于芽孢杆菌属的细菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，属于假单胞菌杆菌属的细菌如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，酵母如毕赤酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，昆虫细胞如秋粘虫(Spodoptera frugiperda)(Sf9)，以及动物细胞如CHO、COS和BSC。

另一方面，本发明提供用于预防或治疗低血糖症或肥胖的含有胰高血糖素衍生物的药物组合物。

如本文所使用的，术语“预防”是指通过施用胰高血糖素衍生物或药物组合物而导致肥胖症发作的抑制或延迟的任何作用，术语“治疗”是指通过施用胰高血糖素衍生物或药物组合物而导致肥胖症状的改善或有利改变的任何作用。

如本文所使用的，术语“施用”是指通过适当的方式将特定材料导入患者，组合物可以通过任何常见途径施用，只要该组合物可以到达目标组织。例如，可以经腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内、直肠内等进行施用。

如本文所使用的，术语“低血糖症”是指糖尿病的急性症状，其中血糖水平低于正常人，通常是指当血糖水平为50mg/dL或更低的状态。在服用口服降糖剂者吃得少于正常或已进行的活动或运动多于平常时，通常引起低血糖症。此外，低血糖症可因使用降葡萄糖水平药物、严重的身体疾病、如肾上腺皮质激素和胰高血糖素的激素缺乏、在产生胰岛素的胰中的肿瘤、胰岛素自身免疫综合征、胃切除术患者、先天性碳水化合物代谢异常等。

低血糖症的症状包括虚弱、发抖、皮肤苍白、冷汗、眩晕、兴奋、焦虑、胸闷、空腹、头痛、疲劳等。在持续性低血糖的情况下，可能导致惊厥或癫痫发作，并可引起休克而后晕倒。

如本文所使用的，术语“肥胖”是指体内具有过多体脂肪的医学状况，当人具有的体重指数(BMI；身体质量(kg)除以身高(m)的平方)为25或更高时被诊断为具有肥胖。通常，肥胖因长时间能量失衡而发生，其中能量摄入超过能量消耗。肥胖是影响全身的代谢疾病，其增加糖尿病、高脂血症、性功能障碍、关节炎和心血管疾病的风险，并且在某些情况下，其也与癌症的发生有关。

本发明的药物组合物可含有药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。如本文所使用的，术语“药学上可接受的”是指具有足量以显示治疗效果并且不引起不利作用的性质，并且基于医药领域所熟知的因素(如疾病的种类、患者的年龄、体重、健康状况、性别、药物敏感性、施用途径、施用方法、施用频率、治疗持续时间、预混合或组合同时施用的药物等)可以由本领域技术人员容易地确定。

含有本发明的胰高血糖素衍生物的本发明的药物组合物可进一步含有药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可包括，对于口服施用，粘合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、调味剂等；对于注射剂，缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等，其可以组合使用；和对于局部施用，基剂(base)、赋形剂、润滑剂、防腐剂等，但不限于此。

根据本发明的组合物的制剂类型可以通过与如上所述的药学上可接受的载体结合而不同地制备。例如，对于口服施用，组合物可以配制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、浆剂、晶片等。对于注射剂，组合物可以配制成单剂量安瓿或多剂量容器。组合物还可以配制成溶液、悬浮剂、片剂、胶囊和缓释制剂。

同时，合适的载体、赋形剂和稀释剂的实例可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。另外，组合物可进一步含有填料、抗凝剂、润滑剂、保湿剂、调味剂、防腐剂等。

此外，本发明的药物组合物可以以选自以下的任何制剂类型制备：片剂、丸剂、粉剂、粒剂、胶囊剂、悬浮剂、用于内部使用的液体药物、乳剂、浆剂、无菌注射溶液、非水溶剂、冻干制剂和栓剂。

此外，组合物可以配制成适合于患者身体的单一剂型，并且优选根据医药领域中的典型方法配制成用于肽药物的制剂，使得通过经口服或肠胃外途径施用，如经由皮肤、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、鞘内、心室内、肺内、经皮、皮下、腹腔内、鼻内、胃内、局部、舌下、阴道内或直肠内，但不限于此。

此外，胰高血糖素衍生物可以通过与多种药学上可接受的载体如生理盐水或有机溶剂混合而使用。为了增加稳定性或吸收性，可以使用碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质或其它稳定剂。

本发明的药物组合物的施用剂量和频率由有效成分(一种或多种)的种类以及各种因素如待治疗的疾病，施用途径，患者的年龄、性别和体重以及疾病的严重程度决定。

本发明组合物的总有效剂量可以以单一剂量施用给患者，或者可以根据分级(fractionated)治疗方案多剂量施用长的时期。在本发明的药物组合物中，有效成分(一种或多种)的含量可以根据疾病严重性而变化。优选地，本发明的肽的每日总剂量可以为每1kg患者体重约0.0001μg至500mg。然而，胰高血糖素衍生物的有效剂量，除了药物组合物的施用途径和治疗频率之外，还考虑多种因素——包括患者年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重性、饮食和排泄率——来确定。在这方面，本领域技术人员可以容易地确定适用于本发明的药物组合物的具体用途的有效剂量。根据本发明所述的药物组合物没有特别限定于制剂以及施用途径和模式，只要其显示本发明的效果。

本发明的药物组合物显示优异的体内药效和效价的持续时间，从而显著降低其施用次数和频率。

特别地，由于本发明的药物组合物含有作为有效成分的胰高血糖素衍生物，该胰高血糖素衍生物具有与天然胰高血糖素不同的改变的pI，其显示根据给定溶液pH的改善的溶解性和高稳定性，因而本发明的药物组合物可以有效地用于制备用于治疗低血糖症或肥胖的稳定的胰高血糖素制剂。

此外，本发明的药物组合物可以单独施用或与对肥胖显示预防或治疗效果的其它药物制剂(一种或多种)组合施用。此外，本发明的药物组合物可进一步含有对肥胖显示预防或治疗效果的药物制剂。

对肥胖显示预防或治疗效果的药物制剂没有具体限定，可以包括GLP-1受体激动剂、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)受体拮抗剂、瘦素受体激动剂、DPP-IV抑制剂、Y5受体拮抗剂、黑色素浓缩激素(melanin-concentrating hormone)(MCH)受体拮抗剂、Y2/3/4受体激动剂、MC3/4受体激动剂、胃/胰脂肪酶抑制剂、5HT2c激动剂，β3A受体激动剂、支链淀粉受体激动剂、生长素释放肽拮抗剂和生长素释放肽受体拮抗剂、FGF1、FGF21受体激动剂、缩胆囊素(CCK)受体激动剂、胰多肽(PP)受体激动剂、多巴胺重吸收抑制剂等。

又另一方面，本发明提供用于预防或治疗低血糖症或肥胖的方法，包括将胰高血糖素衍生物或含有胰高血糖素衍生物的药物组合物施用至受试者。

如本文所使用的，术语“受试者”是指疑似患有低血糖症或肥胖的那些，其为具有低血糖症或肥胖，或具有低血糖症或肥胖的可能性的哺乳动物，包括人、小鼠和家畜动物。然而，包括但不限于用本发明的胰高血糖素衍生物或药物组合物治疗的任何受试者。含有本发明的胰高血糖素衍生物的药物组合物可以施用给疑似患有低血糖症或肥胖的受试者，从而有效治疗受试者。低血糖症和肥胖与上述相同。

本发明的治疗方法可以包括以药学有效量施用含有胰高血糖素衍生物的药物组合物。优选地，每日总剂量应根据医师的适当医学判断确定并施用一次或数次。鉴于本发明的目的，对于任何特定患者的特定治疗有效剂量可以根据各种因素而变化，所要实现的反应的种类和程度，包括其它剂(一种或多种)是否与其或不与其一起使用的特定组合物，患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食，施用的时间和途径，组合物的分泌速度，治疗的持续时间，与特定组合物组合或同时使用的其他药物(一种或多种)以及医学领域众所周知的类似因素。

又另一方面，本发明提供胰高血糖素衍生物在制备用于预防或治疗低血糖症或肥胖的药物中的用途。

有益效果

本发明的新型胰高血糖素衍生物通过具有不同于天然胰高血糖素的pI而具有根据给定溶液pH的优异稳定性和溶解性。因此，当本发明的新型胰高血糖素衍生物用作治疗低血糖症的治疗剂时，它们可以增加患者依从性。此外，本发明的新型胰高血糖素衍生物适用于与其它抗肥胖剂组合施用，因此其可以有效地用于预防或治疗低血糖和肥胖。

发明详述

下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明性目的，并不意图限制本发明的范围。

实施例1：具有针对胰高血糖素的cAMP应答的细胞系的产生

使用与人胰高血糖素受体基因的cDNA(OriGeneTechnologies，Inc.，USA)中的开放阅读框(ORF)对应的区域作为模板，和下述SEQ ID NOS：35和36的正向和反向引物——包括HindIII和EcoRI各限制性位点——进行PCR。

具体的，使用以下条件，PCR进行总共30个循环：95℃变性60秒，在55℃退火60秒，以及68℃延伸30秒。由此获得的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，通过洗脱从其获得大小为450bp的带。

正向引物：5’-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3’(SEQ ID NO：35)

反向引物：5’-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3’(SEQ ID NO：36)

将PCR产物克隆到已知的动物细胞表达载体x0GC/dhfr，以制备重组载体x0GC/GCGR。利用Lipofectamine，以重组载体x0GC/GCGR转染在DMEM/F12(10％FBS)培养基中培养的CHO DG44细胞系，并选择性地在含有1mg/mL G418和10nM甲氨蝶呤的选择培养基中培养。通过限制稀释法从其中选择单克隆细胞系，并从其中最终选择显示以浓度依赖性方式针对胰高血糖素的优异cAMP应答的细胞系。

实施例2：胰高血糖素衍生物的合成

本领域熟知，溶液中蛋白质的溶解度、活性和稳定性可以根据pI而变化(Shaw，K.L.et al.，Protein Science 10，pp 1206-1215，2001)。为了制备具有改善的物理性质的胰高血糖素衍生物，由SEQ ID NO：1表示的天然胰高血糖素的氨基酸序列用具有正电荷和负电荷的氨基酸残基取代，因此合成如下表1所示的胰高血糖素衍生物。

[表1]

关于表1所示的SEQ ID NO：8至31和33至34，由X表示的氨基酸表示非天然氨基酸，氨基异丁酸(Aib)；在SEQ ID NO：32的氨基酸序列中的“-”意指相应位置上不存在氨基酸残基；以及两个粗体和下划线的氨基酸残基表示在两个氨基酸残基之间形成环。

实施例3：胰高血糖素衍生物的pI的测量

为了测量实施例2中合成的胰高血糖素衍生物的改善的物理性质，使用pI/Mw工具(http://expasy.org/tools/pi_tool.html；Gasteiger et al.，2003)在ExPASy服务器中基于氨基酸序列计算pI值。

[表2]

如上表2所示，当SEQ ID NO：1的天然胰高血糖素具有6.8的pI时，根据本发明的胰高血糖素衍生物显示在约4至约9的范围内的pI值，因此显示改善的物理性质。由于根据本发明的胰高血糖素衍生物具有与天然胰高血糖素不同的pI值，因此它们可显示改善的根据给定溶液pH条件的溶解度和更高的稳定性。

因此，当根据本发明的胰高血糖素衍生物用作用于治疗低血糖症的治疗剂时，其可以提高患者的依从性，并且也适用于与其它抗肥胖剂——例如GLP-1受体拮抗剂，葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)受体拮抗剂等——组合施用，因此可以有效地用作用于治疗低血糖症或肥胖的治疗剂。

本领域普通技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其他具体形式实施。所述实施方式仅在各方面说明，而不是限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述的说明所界定。来自权利要求书的等同物的含义和范围内的所有变化皆包括在本发明的范围内。

Claims

1.胰高血糖素衍生物，其包括下述通式1的氨基酸序列，并具有与天然胰高血糖素不同的等电点(pI)：

其中，通式1中，

X1是组氨酸、脱氨基-组氨酸、N-二甲基-组氨酸、β-羟基咪唑丙酸、4-咪唑乙酸、β-羧基咪唑丙酸、色氨酸、酪氨酸、或被删除；

X7是苏氨酸或缬氨酸；

X12是赖氨酸或半胱氨酸；

X13是酪氨酸或半胱氨酸；

X14是亮氨酸或半胱氨酸；

X15是天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸；

X18是天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸或半胱氨酸；

X19是丙氨酸或半胱氨酸；

X21是天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；

X23是缬氨酸或精氨酸；

X24是缬氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或精氨酸；

X27是异亮氨酸或甲硫氨酸；和

X28是精氨酸或天冬酰胺

2.权利要求1所述的胰高血糖素衍生物，其中，通式1的氨基酸序列中，

X1是组氨酸或色氨酸、酪氨酸、或被删除；

X2是丝氨酸或氨基异丁酸(Aib)；

X7是苏氨酸或缬氨酸；

X12是赖氨酸或半胱氨酸；

X13是酪氨酸或半胱氨酸；

X14 is亮氨酸或半胱氨酸；

X15是天冬氨酸或半胱氨酸；

X16是谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或半胱氨酸；

X18是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或半胱氨酸；

X19是丙氨酸或半胱氨酸；

X21是天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；

X23是缬氨酸或精氨酸；

X24是缬氨酸，亮氨酸或谷氨酰胺；

X27是异亮氨酸或甲硫氨酸；和

X28是精氨酸或天冬酰胺

3.权利要求1所述的胰高血糖素衍生物，其中所述胰高血糖素衍生物具有胰高血糖素受体刺激活性。

4.权利要求1所述的胰高血糖素衍生物，其中所述胰高血糖素衍生物包括选自由SEQID NO：2至34所示的氨基酸序列的氨基酸序列。

5.多核苷酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的胰高血糖素衍生物。

6.用于预防或治疗低血糖症的药物组合物，其包括根据权利要求1-4中任一项所述的胰高血糖素衍生物作为有效成分。

7.用于预防或治疗肥胖的药物组合物，其包括根据权利要求1-4中任一项所述的胰高血糖素衍生物作为有效成分。

8.根据权利要求6所述的药物组合物，进一步包括药学上可接受的载体。

9.根据权利要求7所述的药物组合物，进一步包括药学上可接受的载体。

10.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述药物组合物单独施用或与具有预防或治疗肥胖效果的药剂组合施用。

11.根据权利要求7所述的药物组合物，进一步包括具有预防或治疗肥胖效果的药剂。

12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述具有预防或治疗肥胖效果的药剂选自GLP-1受体激动剂、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)受体拮抗剂、瘦素受体激动剂、DPP-IV抑制剂、Y5受体拮抗剂、黑色素浓缩激素(MCH)受体拮抗剂、Y2/3/4受体激动剂、MC3/4受体激动剂、胃/胰脂肪酶抑制剂、5HT2c激动剂，β3A受体激动剂、支链淀粉受体激动剂、生长素释放肽拮抗剂、生长素释放肽受体拮抗剂、FGF1、FGF21受体激动剂、缩胆囊素(CCK)受体激动剂、胰多肽(PP)受体激动剂、多巴胺重吸收抑制剂、和其组合。

13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述具有预防或治疗肥胖效果的药剂选自GLP-1受体激动剂、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)受体拮抗剂、瘦素受体激动剂、DPP-IV抑制剂、Y5受体拮抗剂、黑色素浓缩激素(MCH)受体拮抗剂、Y2/3/4受体激动剂、MC3/4受体激动剂、胃/胰脂肪酶抑制剂、5HT2c激动剂，β3A受体激动剂、支链淀粉受体激动剂、生长素释放肽拮抗剂、生长素释放肽受体拮抗剂、FGF1、FGF21受体激动剂、缩胆囊素(CCK)受体激动剂、胰多肽(PP)受体激动剂、多巴胺重吸收抑制剂、和其组合。

14.预防或治疗低血糖症或肥胖的方法，包括给需要其的受试者施用根据权利要求1至4中任一项所述的胰高血糖素衍生物或含有所述胰高血糖素衍生物的药物组合物。

15.权利要求1-4中任一项所述的胰高血糖素衍生物或含有所述胰高血糖素衍生物的药物组合物在制备用于预防或治疗肥胖的药物中的应用。