CN107613786A

CN107613786A - 产生糖苷的热处理

Info

Publication number: CN107613786A
Application number: CN201680031514.0A
Authority: CN
Inventors: J·C·安德松; R·J·布劳尔三世; T·L·卡尔松; B·弗罗雷斯; D·S·加斯帕德; K·T·莫滕松; R·尼高; N·保尔森; M·拉斯马森
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2018-01-19
Also published as: AU2019264515B2; EP3302097B1; CA2987587C; EP3302097A1; BR112017025705B1; US20200283814A1; WO2016196345A1; US20180163244A1; CA2987587A1; JP2018516081A; US11028423B2; US11761022B2; EP3302097A4; EP4063513A1; US10612065B2; BR112017025705A2; US20220081699A1; AU2016271125A1; AU2019264515A1

Abstract

公开了释放或富集由酵母产生的甜菊醇糖苷的方法。所公开的方法增强或提高所述甜菊醇糖苷的所述释放或富集。

Description

产生糖苷的热处理

序列表的引用

本申请包含对氨基酸序列和/或核酸序列的引用，所述引用作为于2016年5月27日创建并且具有92千字节大小的标题为“CAR0211WO_Sequence_Listing.txt,”的ASCII文本文件与此同时提交。所述序列表根据37 C.F.R.§1.52(e)(5)特此以引用的方式整体并入。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年5月29日提交的美国临时申请号62/168,142的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

背景

糖(诸如蔗糖、果糖和葡萄糖)被利用来为饮料、食物、药物、口腔卫生产品和化妆品提供令人愉快的味道。蔗糖尤其赋予大多数消费者所优选的味道。虽然蔗糖提供优异的甜味特征，但是它是含热量的。已经引入无热量或较低热量的甜味剂来满足消费者需求。消费者还希望这些甜味剂具有有利的味道特征。

甜菊糖是向日葵家族(菊科)中的香草和灌木的约240种物种的属，原产自亚热带和热带地区以及从北美洲西部至南美洲。物种甜叶菊(Stevia rebaudiana)通常称为甜叶(sweetleaf)、甜叶、糖叶或简单地甜菊糖，它由于其甜叶而被广泛地种植。基于甜菊糖的甜味剂可通过从叶提取一种或多种甜化合物来获得。这些化合物中的许多是甜菊醇(二萜化合物)的糖苷。这些二萜糖苷是糖的约150至450倍甜。甜菊醇糖苷通过甜味能量以及促成味质的其他感官特征(诸如苦味、残留余味等)而彼此不同。参见Kinghorn，A.D.，Stevia：Thegenus Stevia，Taylor&Francis，London(2002)。

甜菊醇糖苷的实例描述于PCT国际专利申请公开号WO2013/096420(参见，例如，图1中的列表)；以及Ohta等人，“Characterization of Novel Steviol Glycosides fromLeaves of Stevia rebaudiana Morita,”J.Appl.Glycosi.，57，199-209(2010)(参见，例如，第204页处的表4)中。在结构上，二萜糖苷的特征在于单基甜菊醇，并且通过在位置C13和C19处的碳水化合物残基的存在而不同，如WO 20013/096420的图2a-2k所呈现的。

通常，在干重基础上，甜菊糖的叶中存在的四种主要的甜菊醇糖苷是杜尔可甙A(0.3％)、莱苞迪甙C(0.6-1.0％)、莱苞迪甙A(3.8％)和甜菊糖苷(9.1％)。在甜菊糖提取物中识别到的其他糖苷包括莱苞迪甙B、莱苞迪甙D、莱苞迪甙E、莱苞迪甙F、莱苞迪甙G、莱苞迪甙H、莱苞迪甙I、莱苞迪甙J、莱苞迪甙K、莱苞迪甙L、莱苞迪甙M、莱苞迪甙N、莱苞迪甙O、甜菊双甙和覆盆子苷中的一种或多种。

虽然主要的甜菊醇糖苷莱苞迪甙A常用作饮料应用中的甜味剂，但是它具有异味问题。最近，存在对于具有更好的味道特性的某些次要的甜菊醇糖苷的关注。例如，莱苞迪甙M具有比其他甜菊醇糖苷更高的甜味强度并且更强效(例如，参见Prakash，I.等人(2013)Nat.Prod.Commun.，8：1523–1526和WO 2013/096420)。莱苞迪甙D尝起来是蔗糖的约200-220倍甜，并且在感官评价中甜味起效缓慢并且非常清新，即总体上比蔗糖更甜，与蔗糖相比甜残留余味更少(例如，参见Prakash，I.等人(2012)Int.J.Mol.Sci.，13:15126-15136)。

重组DNA技术使得使用广泛种类的宿主细胞(诸如酵母)生产所需的甜菊醇糖苷成为可能并且在商业上可行。然而，由于需要使坚硬的酵母细胞壁破裂或水解，从宿主细胞内回收细胞内表达的产物存在很大困难。细胞壁破坏的选择还可能影响回收产物的下游处理及其从酵母细胞或发酵液的后续纯化，从而影响工艺的效率和成本效益。

概述

公开了一种有效地回收通过重组酵母技术以成本有效的方式产生的所需甜菊醇糖苷的方法。

在本发明的一方面，公开了一种从宿主细胞释放甜菊醇糖苷的方法，其包括将包含产生甜菊醇糖苷的工程化宿主细胞的发酵培养基加热至50℃至95℃范围内的温度，持续5分钟至48小时，以将一种或多种甜菊醇糖苷从工程化宿主细胞释放到发酵培养基中。

在本发明的另一方面，公开了一种从宿主细胞释放甜菊醇糖苷的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含进行工程化以产生一种或多种甜菊醇糖苷的宿主细胞的发酵培养基；以及

b)通过将组合物加热至50℃至95℃范围内的温度、持续5分钟至48小时来从工程化宿主细胞释放一种或多种甜菊醇糖苷，

其中所述一种或多种甜菊醇糖苷从宿主细胞的细胞内部分释放到发酵培养基的细胞外部分。

在本发明的又一方面，公开了一种从组合物释放甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括将所述组合物加热至50℃至95℃范围内的温度、持续5分钟至48小时以从组合物中的工程化宿主细胞释放甜菊醇糖苷的步骤。

在本发明的另一方面，公开了一种释放甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化宿主细胞的组合物；以及

b)通过将组合物加热至50℃至95℃范围内的温度、持续5分钟至48小时来从工程化宿主细胞释放一种或多种甜菊醇糖苷。

在本发明的另一方面，公开了一种组合物，其包含产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化宿主细胞和通过将组合物加热至50℃至95℃范围内的温度、持续5分钟至48小时而从工程化宿主细胞释放的一种或多种甜菊醇糖苷。

此类方法实现将糖苷释放到组合物中，同时使细胞裂解最小化。

附图描述

图1示出代表性甲羟戊酸途径。

图2示出代表性非甲羟戊酸途径。

图3示出甜菊醇产生的代表性途径。

图4示出从甜菊醇生物合成甜菊醇糖苷的代表性途径。

图5A是热处理之前亮视场显微镜图像的数字图像。

图5B是热处理之后亮视场显微镜图像的数字图像。

详细描述

本文所描述的本公开的实施方案并不意图是详尽的或者将本发明限于在以下详细描述中公开的精确形式。相反，所选择并描述的实施方案的目的在于使得可有利于本领域的其他技术人员认识并理解本发明的原理和实践。本文所提及的所有出版物和专利均特此以引用的方式全部并入。在此所公开的出版物和专利仅出于其公开内容而提供。

宿主细胞(诸如酵母和真菌)可进行工程化以用于合成甜菊醇糖苷。在发酵期间，由宿主细胞产生的糖苷的仅一小部分可从细胞内释放到发酵培养基中。为了增加从宿主细胞(诸如酵母)释放的糖苷量，可使用机械和化学破坏方法。机械破坏(即细胞的破碎)将细胞内组分释放到周围的培养基中。结果是不仅所需重组产物、并且其他产物(诸如蛋白质、核酸、细胞代谢物、细胞碎片)的复杂混合物，从而使所需产物的回收复杂化。化学方法需要化学地更改细胞膜和/或细胞壁结构或使其可透过，以使产物从细胞内扩散。然而，化学处理必须与所需产物的生物体和释放相容。

公开了使用热处理的在发酵之后有效回收甜菊醇糖苷的方法。在给定的时间段和温度下向包含宿主细胞(例如，酵母和真菌)的发酵液或发酵培养基施加热。宿主细胞可产生所需的甜菊醇糖苷。当加热包含宿主细胞的发酵培养基时，所需糖苷可在最小的细胞裂解的情况下从宿主细胞释放，从而使发酵培养基或组合物富集所需糖苷。

在一些实施方案中，所公开的方法使用能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母。能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母可包含编码促进一种或多种甜菊醇糖苷在细胞中形成的酶的一种或多种外源性核酸。

如本文所用，术语“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷。示例性甜菊醇糖苷包括但不限于莱苞迪甙A、莱苞迪甙B、莱苞迪甙C、莱苞迪甙D、莱苞迪甙E、莱苞迪甙F、莱苞迪甙G、莱苞迪甙H、莱苞迪甙I、莱苞迪甙J、莱苞迪甙K、莱苞迪甙L、莱苞迪甙M、莱苞迪甙N、莱苞迪甙O、甜菊糖苷、甜菊双甙、杜尔可甙A和/或覆盆子苷。工程化酵母可产生天然存在的(“天然发生的”)甜菊醇糖苷或自然界中不存在的(非天然发生的)甜菊醇糖苷。如本文所用，术语“总甜菊醇糖苷”(TSG)计算为在干燥(无水)基础上组合物中的全部甜菊醇糖苷含量的总和。

在结构上，根据以下所示的基上的原子编号，甜菊醇糖苷具有中心分子部分(它是单一甜菊醇基)和吡喃葡萄糖基残基或连接到甜菊醇基的C₁₃和C₁₉原子的其他糖残基。即，吡喃葡萄糖基残基表示以下式中的基团R₁和R₂：

以下表A示出某些甜菊醇糖苷和对应的R₁和R₂基团：

表A

Glu：葡萄糖

Rha：鼠李糖

所公开的甜菊醇糖苷可在发酵过程中产生。发酵过程可使用进行工程化以用于产生一种或多种甜菊醇糖苷(诸如莱苞迪甙A(Reb A)、莱苞迪甙M(Reb M)和/或莱苞迪甙D(Reb D))的基因修饰生物体。甜菊醇糖苷的产生可使用具有提供合成甜菊醇糖苷的途径的一组酶的工程化微生物菌株来进行。

各种酵母或真菌宿主细胞可进行工程化以提供向一种或多种甜菊醇糖苷的途径。此类细胞可转化有编码用于甜菊醇糖苷合成的酶的一种或多种DNA构建体。可用于编码甜菊醇糖苷途径酶的外源性DNA构建体的宿主的示例性酵母和真菌包括但不限于假丝酵母、毕赤酵母(汉逊酵母)、克勒克酵母(有孢汉生酵母)、克鲁维酵母、红酵母、球拟酵母、接合酵母、酵母菌、耶氏酵母和酵母属(Saccharomyces)的属。示例性物种包括白假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母。另外，宿主细胞还可包含除了甜菊醇糖苷途径的那些基因修饰以外的可在发酵期间提供改善的性能的基因修饰。

“工程化宿主细胞”是指具有引入到细胞中(整合到细胞的基因组中或存在于染色体外的构建体(诸如细菌或附加体中的质粒)上)的至少一个外源性DNA序列的酵母和真菌。虽然本说明书可详细描述酵母细胞，但是应理解，本公开也可适于真菌细胞。

术语“外源性的”适用于分子(诸如核酸)或活性(诸如酶活性)。外源性分子被引入到宿主酵母或真菌中。外源性核酸可通过熟知的技术引入到宿主生物体中，并且可维持在宿主染色体物质外部(例如，维持在非整合载体上)或者可诸如通过重组事件整合到宿主的染色体中。通常，工程化酵母或真菌的基因组通过稳定地引入一种或多种重组基因而得以增加。外源性核酸可编码对于宿主生物体是同源的或异源的酶或其部分。外源性核酸可呈“重组基因或DNA构建体”的形式，这是指通过分子技术以一种或多种方式调控为呈并非天然地存在的形式的核酸。术语“非天然的”可用于表征诸如核酸或蛋白质的分子或在自然界中并非天然地存在的生物体。

术语“异源的”(例如，“非原生的”)适用于来自不同于所引用的分子或生物体的来源的分子或活性。因此，对于所引用的生物体是异源的基因或蛋白质是此生物体中不存在的基因或蛋白质。在本公开的上下文中，“异源糖基转移酶”是指不同于可对于宿主生物体是原生的任何糖基转移酶多肽的糖基转移酶多肽。例如，存在于第一物种中并且外源性地引入到不同于所述第一物种的宿主酵母或真菌生物体中的特定糖基转移酶基因对于所述宿主酵母或真菌生物体是“异源的”。

工程化酵母或真菌可使用对于转化体适于进行选择的营养缺陷型标记。宿主细胞可包含控制营养缺陷型的一种或多种基因(诸如LYS2、LEU2、HIS3、URA3、URA5和TRP1)的修饰(例如，缺失)。使用具有用于引入一种或多种外源性基因的所需遗传背景的宿主细胞，将一种或多种基因构建体引入到细胞中以整合到基因组中或稳定地维持并实现表达。用于将基因构建体引入到宿主细胞中的方法包括转化、转导、转染、共转染、电穿孔。具体地，酵母转化可使用乙酸锂方法、原生质体法等进行。待引入的基因构建体可以质粒的形式、或通过插入到宿主的基因中或通过与宿主的基因的同源重组来并入到染色体中。基因构建体引入到其中的转化的酵母可使用选择性标记(例如，如上所提及的营养缺陷型标记)来选择。进一步的确认可通过测量所表达的蛋白质的活性来进行。

包含甜菊醇途径基因的外源性核酸序列的转化可使用本领域中熟知的方法来确认。此类方法例如包括核酸分析(诸如针对基因产物的表达的RNA印迹法或聚合酶链反应(PCR)扩增或免疫印迹法)或测试所引入的核酸序列或其对应的基因产物的表达的其他合适的分析方法。本领域的技术人员应理解，外源性核酸以足以产生所需产物的量表达，并且还应理解，可使用本领域中熟知的和如本文所公开的方法优化表达水平以获得足够的表达。

萜类化合物(异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP))可充当工程化宿主细胞(例如，酵母)中的甜菊醇糖苷的化学前体。一些生物体(包括植物、昆虫和一些微生物物种)具有通过一系列化学中间体将乙酰辅酶A转化为IPP和DMAPP的甲羟戊酸(MVA)途径。一些生物体通过以甘油醛-3-磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)开始的非甲羟戊酸途径(还称为甲基D-赤藓糖醇-4-磷酸或MEP途径)产生IPP和DMAPP。

酵母酿酒酵母天然地表达甲羟戊酸途径的基因。甲羟戊酸途径基因包括：(a1)乙酰乙酰辅酶A硫解酶(EC 2.3.1.9)、(b1)3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A(HMG-CoA)合酶(EC4.1.3.5)；(c1)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.34)；(d1)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)；(e1)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)；以及(f1)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)。甲羟戊酸途径酶如下将乙酰辅酶A转化为IPP：乙酰辅酶A→乙酰乙酰辅酶A→3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A→甲羟戊酸→甲羟戊酸-5-磷酸→甲羟戊酸-5-焦磷酸→IPP。也参见图1

在一些实施方案中，工程化酵母可包含一种或多种修饰以增加从乙酰辅酶A到IPP和/或DMAPP的转变，从而提供用于向甜菊醇的途径的IPP和/或DMAPP的增加的库。所述修饰可例如包括诸如通过在提供增加的表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用提供与天然酶相比更高水平的酶活性的异源酶、变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸取代)或变体异源酶来放置编码对于酵母细胞是同源或异源的酶的核酸来增加一种或多种甲羟戊酸途径酶(a1)–(f1)的表达或活性。

可替代地，可使用非甲羟戊酸(MEP)途径来向甜菊醇糖苷产生提供作为前体的IPP和DMAPP。酵母酿酒酵母不天然地表达MEP途径的基因，但是可任选地进行工程化以提供MEP途径基因。理论上，MEP途径通常是在能量学上更有效的，因为它与MVA途径相比失去呈CO2形式的更少的碳(MEP途径：1CO2/IPP；MVA途径：4CO2/IPP；糖作为碳源)。

具体地，非甲羟戊酸(MEP)途径化合物异戊烯基二磷酸(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)通过以甘油醛-3-磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)引导的一系列中间体生成，并且多种酶负责此转化。参与从G3P和PYR向IPP和DMAPP的生物合成途径的酶包括：(a2)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、(b2)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(ispC)-、(c2)4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(IspD)、(d2)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(IspE)、(e2)2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、(f2)1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、(g2)4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)、以及(h2)异戊烯基-二磷酸异构酶(IDI)。参见图2

用于通过发酵产生甜菊醇糖苷的工程化酵母可具有一种或多种基因修饰以增加从G3P和PYR到IPP和/或DMAPP的转变，从而提供用于向甜菊醇的途径的IPP和/或DMAPP的增加的库。所述修饰可例如包括诸如通过在提供增加的表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用提供高水平的酶活性的异源酶、变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸取代的变体酶)或变体异源酶来放置编码对于酵母细胞是异源的酶的核酸来增加一种或多种酶(a2)–(h2)的表达或活性。

用于通过发酵产生甜菊醇糖苷的工程化酵母还可包含将IPP和/或DMAPP转化为甜菊醇的途径。例如，在一些方面，工程化酵母可包含表达以下酶的外源性核酸：(a3)香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)、(b3)柯巴基二磷酸合酶(CPS)、(c3)贝壳杉烯合酶(KS)、(d3)贝壳杉烯氧化酶(KO)、以及(e3)贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)。甲羟戊酸途径的酶如下将IPP和/或DMAPP转化为甜菊醇：IPP/DMAPP→香叶基香叶基二磷酸合酶→柯巴基二磷酸合酶→贝壳杉烯→贝壳杉烯酸→甜菊醇。(参见图3)编码对于酵母细胞是异源的酶(a3)-(e3)的外源性核酸可在提供增加的表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用提供高水平的酶活性的变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸取代的变体酶)或变体异源酶来放置。

本公开的用于通过发酵产生甜菊醇糖苷的方法可使用包含选自以下组中的一种或多种甜菊醇生物合成酶的工程化酵母：香叶基香叶基二磷酸合酶、柯巴基二磷酸合酶、贝壳杉烯合酶、贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)、甜菊醇合酶、脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)、乙酰乙酰辅酶A硫解酶、截短的HMG-辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、细胞色素P450还原酶等。

用于通过发酵产生甜菊醇糖苷的工程化酵母可具有将甜菊醇转化为甜菊醇糖苷的任何途径。如果工程化酵母中存在多于一种甜菊醇糖苷途径酶，则酵母可能够产生不同的甜菊醇糖苷。例如，酵母可能够产生两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于10种不同的甜菊醇糖苷物质。在一些实施方案中，Reb A、Reb D和/或Reb M通过工程化酵母细胞产生。

甜菊醇糖苷途径可包含介导糖基残基从活化的核酸糖向受体分子的转移的一种或多种尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)。在甜菊醇糖苷途径的情况下，单糖单元可转移到甜菊醇或甜菊醇糖苷分子上的羟基或羧基部分，或转移到连接到甜菊醇基的葡萄糖基团上的羟基。参见图4。UGT基于序列同源性被分类为家族和亚家族。参见Li等人，2001，J.Biol.Chem.276:4338-4343。编码UGT(各自包含42个氨基酸共有序列)的超过100个基因的超家族已经在模型植物拟南芥中识别到，并且编码UGT的基因也已经在若干其他高级植物物种中识别到。

示例性UDP-糖基转移酶可以是能够向甜菊醇和或甜菊醇糖苷底物添加至少一个葡萄糖单元以提供所需的甜菊醇糖苷的任何UDP-糖基转移酶。在一个实施方案中，工程化酵母可包含选自以下组的一种或多种UDP-糖基转移酶：UGT74G1(SEQ ID NO：1)、UGT85C2(SEQ ID NO：2)、UGT76G1(SEQ ID NO：3)、UGT91D2(SEQ ID NO：4)、以及与这些多肽具有基本上(例如，>85％、>75％、>65％、>55％、>45％和>35％)同一性的UGT。工程化酵母可包含编码这些UGT的一种或多种外源性核酸分子。

工程化酵母还可包含一种或多种UGT和UDP-葡萄糖再循环酶。能够向覆盆子苷添加至少一个葡萄糖单元以形成甜菊糖苷的示例性UDP-糖基转移酶是UGT91D2(SEQ ID NO：4)。能够向甜菊糖苷添加至少一个葡萄糖单元以形成莱苞迪甙A的示例性UDP-糖基转移酶是UGT76G1(SEQ ID NO：3)。能够向莱苞迪甙A添加至少一个葡萄糖单元以形成莱苞迪甙D的示例性UDP-糖基转移酶是UGT91D2(SEQ ID NO：4)。能够向莱苞迪甙D添加至少一个葡萄糖单元以形成莱苞迪甙M的示例性UDP-糖基转移酶是UGT76G1(SEQ ID NO：3)。

描述用于甜菊醇糖苷产生的工程化微生物的示例性出版物包括例如美国专利申请公开号2014/0357588、国际专利申请公开号WO2014/193934、WO 2014/193888和WO 2014/122227，所述专利特此以引用的方式全部整体并入。

在一个实施方案中，用于产生甜菊醇糖苷的工程化酵母表达以下酶：香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)、内部-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)、贝壳杉烯氧化酶(KO)、贝壳杉烯合酶(KS)；甜菊醇合酶(KAH)、细胞色素P450还原酶(CPR)、UGT74G1、UGT76G1、UGT91D2、UGT85C2和EUGT11。WO2014/122227描述了表达这些酶的工程化酵母菌株。UDP-葡萄糖基转移酶可以是编码多肽的基因，所述多肽例如UGT74G1(SEQ ID NO：1)、UGT85C2(SEQ ID NO：2)、UGT76G1(SEQ ID NO：3)、UGT91D2(SEQ ID NO：4)、以及EUGT11(SEQ ID NO：13)；这些基因编码能够进行多个反应的多肽，诸如a)编码能够进行甜菊醇糖苷的19-O-葡萄糖的C2'的β1,2糖基化的多肽的基因；(b)编码能够进行甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖的C2'的β1,2糖基化的多肽的基因；(c)编码能够进行甜菊醇糖苷的19-O-葡萄糖的C3'的β1,3糖基化的多肽的基因；(d)编码能够进行甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖的C3'的β1,3糖基化的多肽的基因；(i)编码能够进行甜菊醇或甜菊醇糖苷的13-OH的糖基化的多肽的基因；(j)编码能够进行甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-19羧基的糖基化的多肽的基因。例如，UGT85C2进行反应(i)；UGT74G1进行反应(j)；UGT91D2进行反应(a；微弱地)、(b)；UGT76G1进行反应(c)和(d)；EUGT11进行反应(a)、(b；稍差地)。

在一个实施方案中，工程化宿主细胞表达编码对宿主细胞是异源的以下蛋白质中的一种或多种的一种或多种外源性核酸：GGPPS多肽、内部-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽、贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽、贝壳杉烯合酶(KS)多肽；甜菊醇合酶(KAH)多肽、细胞色素P450还原酶(CPR)多肽、UGT74G1多肽、UGT76G1多肽、UGT91d2多肽、以及EUGT11多肽。

在另一个实施方案中，工程化酵母表达编码对宿主细胞是异源的以下蛋白质中的一种或多种的一种或多种外源性核酸：GGPPS多肽、截短的玉米CDPS多肽、拟南芥KS多肽、甜叶菊KO多肽、拟南芥ATR2多肽、水稻EUGT 11多肽、SrKAHe1多肽、甜叶菊CPR8多肽、甜叶菊UGT85C2多肽、甜叶菊UGT74G1多肽、甜叶菊UGT76G1多肽、甜叶菊UGT91D2变体或功能同源物、以及UGT91D2e-b多肽。

产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株使用如在WO 2011/153378、WO2013/022989、WO2014/122227和WO 2014/122328中所描述的方法来构建，所述专利中的每个以引用的方式整体并入。以下序列用于构建亲株(菌株A)：编码聚球蓝细菌属某种GGPPS多肽(SEQ ID NO:6)的重组基因、编码截短的玉米CDPS多肽(SEQ ID NO:7)的重组基因、编码拟南芥KS多肽(SEQ ID NO:8)的重组基因、编码重组甜叶菊KO多肽(SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10)的重组基因、编码拟南芥ATR2多肽(SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12)的重组基因、编码玉米EUGT 11多肽(SEQ ID NO:13)的重组基因、编码SrKAHe1多肽(SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15)的重组基因、编码甜叶菊CPR8多肽(SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17)的重组基因、编码甜叶菊UGT85C2多肽(SEQ ID NO:2)的重组基因、编码甜叶菊UGT74G1多肽(SEQ ID NO:1)的重组基因、编码甜叶菊UGT76G1多肽(SEQ ID NO:3)的重组基因、编码产生甜菊醇糖苷的甜叶菊UGT91D2(SEQ ID NO:4)变体(或功能同源物)UGT91D2e-b多肽的重组基因。

UGT91D2的UGT91D2e-b变体(来自PCT/US2012/050021的SEQ ID NO:5)包含在位置211处的亮氨酸的甲硫氨酸取代和在位置286处的缬氨酸的丙氨酸取代。(可使用在PCT/US2012/050021的表12和实施例11中所描述的另外的变体(除了T144S、M152L、L213F、S364P和G384C变体之外)，所述专利特此以引用的方式整体并入。)GeneArt密码子优化序列编码具有氨基酸修饰L211M和V286A的甜叶菊UGT91D2e-b(SEQ ID NO:4针对氨基酸序列；密码子优化核苷酸序列在SEQ ID NO:5中列出)。

菌株B衍生自以上所述的亲株并且另外地包含来自甜叶菊的密码子优化CPR1(对应于氨基酸SEQ ID NO:19的SEQ ID NO:18)。

在一个实施方案中，工程化酵母表达编码对酵母是异源的以下蛋白质中的一种或多种的一种或多种外源性核酸：GGPPS多肽、内部-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽、贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽、贝壳杉烯合酶(KS)多肽；甜菊醇合酶(KAH)多肽、细胞色素P450还原酶(CPR)多肽、UGT74G1多肽、UGT76G1多肽、UGT91D2多肽、以及EUGT11多肽。

在另一个实施方案中，工程化酵母表达编码对酵母是异源的以下蛋白质中的一种或多种的一种或多种外源性核酸：GGPPS多肽、截短的玉米CDPS多肽、拟南芥KS多肽、甜叶菊KO多肽、拟南芥ATR2多肽、水稻EUGT 11多肽、SrKAHe1多肽、甜叶菊CPR8多肽、甜叶菊UGT85C2多肽、甜叶菊UGT74G1多肽、甜叶菊UGT76G1多肽、甜叶菊UGT91D2变体或功能同源物、以及UGT91D2e-b多肽

工程化宿主细胞(例如，酵母细胞)可用于通过发酵产生所需的甜菊醇糖苷，诸如莱苞迪甙M、莱苞迪甙D和莱苞迪甙A。如在此所述的“发酵”是指通过需氧发酵产生所需的甜菊醇糖苷的培养基(诸如碳水化合物)的同化作用。术语“培养基”或语法等同物(诸如“培养基(media)”)是指工程化酵母或真菌可在其中维持、生长或发酵或其组合的液体组合物。“培养基”还可称为“培养液”或“细胞培养物”，并且形容术语“培养基”及其等同物的术语(诸如“发酵”)可用于更具体地定义发生在培养基中的细胞活动的类型。

培养基可关于存在于培养基中的组分及其量来限定，所述组分包括但不限于：(a)碳源，包括碳水化合物(诸如葡萄糖)和淀粉制品(诸如麦芽糖糊精)；(b)氮源，诸如酵母氮基、氢氧化铵、尿素、硫酸铵、酵母提取物或其任何组合；(c)盐，诸如磷酸钾(一价的、二价的)、硫酸镁、氯化钠、以及氯化钙；(d)维生素，诸如生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酸、对氨基苯甲酸、HCl吡哆醇、核黄素、HCl硫胺、以及柠檬酸；和/或(e)痕量金属，诸如硼酸、硫酸铜、氯化钴、氯化钙、碘化钾、氯化铁、硫酸镁、氯化锰、钼酸钠、以及硫酸锌。培养基还可关于其pH和用于控制培养基中的pH的生物相容性酸、碱和缓冲液来限定。

工程化酵母的发酵可使用可得自任何植物和植物部分(诸如块茎、根、茎、叶和种子)的含有淀粉和/或糖的植物物质来进行。含有淀粉和/或糖的植物物质可从谷物(诸如大麦、小麦、玉米、黑麦、高粱、小米、大麦、土豆、木薯或大米或其任何组合)获得。含有淀粉和/或糖的植物物质可诸如通过诸如研磨、麦芽制造或部分麦芽制造的方法进行处理。在一些实施方案中，发酵培养基包含处理的淀粉。例如，发酵培养基可包含部分水解的淀粉。部分水解的淀粉可包括高分子量糊精和高分子量麦芽糖糊精。可使用淀粉和淀粉降解产物的量在所需范围内的部分水解的淀粉制品。

发酵可在适于产生所需甜菊醇糖苷(诸如莱苞迪甙M、莱苞迪甙D和莱苞迪甙A)的条件下和培养基中进行。发酵条件通常使用氧气(需氧条件)、碳源和营养物(氮)基。发酵可使用分批补料或连续工艺来进行。发酵基本培养基包含葡萄糖(5g/L)、硫酸铵(5g/L)、磷酸二氢钾(3g/L)、硫酸镁(0.5g/L)、痕量元素、以及维生素(例如，参见，Verduyn，C.等人(1992)Yeast 8，501-517)。发酵培养基的pH可以是约pH 4至pH 5，并且发酵可在约30℃的温度下进行。在一些实施方案中，发酵可使用基础培养基中的第一生长阶段、接着使用含有葡萄糖的限定进料培养基(具有痕量金属、维生素和盐)的较长进料阶段来进行。

在其他实施方案中，发酵可使用大于5.0的pH来进行。在一些实施方案中，pH的范围可以是约5.5至8或5.8至7.5。在一些实施方案中，工程化酵母可初始地在较低pH(诸如小于6.0)下生长，并且发酵在较高pH(诸如大于5.0)下进行。用于产生所需甜菊醇糖苷的发酵的其他方法描述于标题为“Fermentation Methods for Producing Steviol GlycosidesUsing High pH and Compositions Obtained Therefrom,”美国专利申请号62/168,345的申请和标题为“Fermentation Methods for Producing Steviol Glycosides,”代理人案卷号N00291WO01(CAR0210/WO)并且与本申请同时提交的国际PCT申请中，所述申请各自特此以引用的方式整体并入。

任选地，发酵可在含有其他中间体的培养基中进行，所述其他中间体诸如甜菊醇、莱苞迪甙A、甜菊糖苷、覆盆子苷、甜菊单甙、甜菊双甙、杜尔可甙A、莱苞迪甙C、莱苞迪甙E等。

发酵步骤还可称为“甜菊醇糖苷产生步骤”。在一些实施方案中，发酵培养基在发酵步骤期间维持在小于40℃的温度下。在一些实施方案中，发酵培养基在发酵步骤期间维持在约25℃至35℃范围内的温度下。

在发酵之后但是在释放或富集所需甜菊醇糖苷的任何处理(例如，热处理)之前，发酵液可仅含有一小部分的所需糖苷，其中所需糖苷的大部分在工程化宿主细胞内。公开了通过使用热来使所需糖苷从宿主细胞释放或富集的方法。

热处理可在全部细胞发酵液上进行，所述细胞发酵液含有能够产生所需甜菊醇糖苷和所需甜菊醇糖苷产物的工程化酵母。在其他实施方案中，发酵之后但是在任何处理(例如，热处理)之前的工程化酵母可从发酵液分离并且转移到任何合适的组合物(诸如液体培养基)中。

含有转移的酵母细胞的发酵液或组合物可在50℃至95℃范围内的温度下加热。在其他实施方案中，加热在70℃至95℃的温度下进行。加热进行5分钟至48小时。在一些实施方案中，加热在70℃至95℃下持续5分钟至2小时、在95℃下持续5分钟至1小时、在75℃下持续5分钟至2小时或在50℃下持续24小时。在一些实施方案中，加热在70℃至95℃下持续5分钟或在70℃至95℃下持续2小时。

在一些实施方案中，热处理使甜菊醇糖苷释放到培养基中或使培养基的甜菊醇糖苷含量富集，使得细胞外糖苷含量大于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)糖苷含量的90％。在一些实施方案中，热处理步骤使甜菊醇糖苷释放到发酵培养基中，使得细胞外甜菊醇糖苷含量大于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)甜菊醇糖苷含量的80％、85％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，热处理步骤使甜菊醇糖苷释放到发酵培养基中，使得细胞外甜菊醇糖苷含量的范围是发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)甜菊醇糖苷含量的约80％至100％、85％至100％、90％至100％、90％至99％、92％至98％或90％至95％。

在一些实施方案中，发酵液或组合物的热处理使Reb A、Reb B、Reb M、Reb D或其组合释放。在一些实施方案中，热处理使Reb A富集，使得细胞外Reb A大于存在于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)Reb A的50％。在一些实施方案中，细胞外Reb A大于存在于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)Reb A的40％、45％、48％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，Reb A量可以在发酵期间产生的Reb A的总量的约30％至约100％、约50％至约100％、约80％至约90％的范围释放在细胞外。

在一些实施方案中，热处理使Reb D和/或Reb M富集，使得释放在细胞外的Reb D和/或Reb M大于存在于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)Reb D和/或RebM的33％。在一些实施方案中，细胞外Reb D、Reb M和/或Reb D和Reb M的总数大于存在于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)Reb D、Reb M和/或Reb D和Reb M的总数的40％、45％、48％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，释放在细胞外的Reb D和Reb M的组合量可以存在于发酵液或组合物中的Reb D和/或Reb M的总量的约30％至约100％、约50％至约100％、约80％至约90％的范围存在。

在其他实施方案中，释放的Reb D可以存在于发酵液或组合物中的Reb D的总量的约30％至约100％、约50％至约100％、约80％至约90％的范围存在于细胞外。

在其他实施方案中，释放的Reb M可以存在于发酵液或组合物中的Reb M的总量的约30％至约100％、约50％至约100％、约80％至约90％的范围存在于细胞外。

在一些实施方案中，释放的Reb B可以存在于发酵液或组合物中的Reb B的总量的约25％至约100％、约30％至约95％、约40％至约80％的范围存在于细胞外。在一些实施方案中，细胞外Reb B大于存在于发酵液或组合物中的总(即，细胞内和细胞外两者)Reb B的30％、33％、35％、40％、45％、48％、52％、55％、57％、60％、62％、65％、67％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，所公开的热处理不引起从Reb DM和/或Reb A向Reb B的显著降解。

在一些实施方案中，所公开的热处理引起所需糖苷的释放，但是不引起细胞的大量裂解。细胞裂解可例如通过在发酵和热处理之后释放到发酵液(例如，不含细胞)或组合物中的氮或磷或两者的量来测定。在一些实施方案中，发酵液或组合物的加热不增加不含细胞的发酵液或组合物中的氮和/或磷含量。在一些实施方案中，热处理之后不含细胞的发酵液或组合物中的细胞外氮含量增加不大于存在于全部细胞发酵液或组合物中的总(即，细胞外和细胞内两者)氮的45％。在一些实施方案中，热处理之后发酵液或组合物中的细胞外磷含量增加不大于存在于含有细胞的发酵液或组合物中的总(即，细胞外和细胞内两者)磷的70％。

在又其他的实施方案中，当在70℃至95℃下加热5分钟至2小时时，细胞外氮含量增加不大于存在于含有细胞的发酵液或组合物中的总氮的45％，并且/或者热处理之后发酵液或组合物中的细胞外磷含量增加不大于存在于含有细胞的发酵液或组合物中的总磷的70％。

在一些实施方案中，当发酵培养基或组合物在50℃至95℃下加热5分钟至48小时时，细胞外氮含量增加不大于存在于含有细胞的发酵液或组合物中的总氮的30％、33％、35％、37％、40％、42％、47％或50％。在一些实施方案中，当发酵培养基或组合物在50℃至95℃下加热5分钟至48小时时，细胞外磷含量增加不大于存在于含有细胞的发酵液或组合物中的总磷的50％、55％、60％、63％、65％、67％、73％、75％、77％或80％。

发酵液或组合物的各种组分(例如，甜菊醇糖苷、氮或磷)的细胞内和/或细胞外含量可如实施例1中所述进行测定。

发酵液或组合物的热处理还可基于细胞活力进行评估。当所需糖苷可从酵母细胞释放到发酵液或组合物中时，酵母活力降低，同时限制细胞裂解。细胞裂解可例如通过将全部细胞培养液铺板在马铃薯葡萄糖抗生素琼脂上或通过细胞活力计数器(例如，CellometerTM)来测定。

加热可通过使用热交换器(其中热转移到热水或蒸汽)来进行。在一些实施方案中，加热可使用具有保持回路的热交换器、直接蒸汽注射或利用施加到夹套容器的蒸汽的材料的批量加热来进行。在一些实施方案中，酵母可例如通过离心或过滤来浓缩，之后进行热处理。在其他实施方案中，离心的或过滤的酵母可转移到其他合适的培养基或组合物中并且然后用于加热。

在所需重组产物(例如，甜菊醇糖苷)从宿主细胞释放到培养基中、从而使所需产物富集之后，各种程序可用于进一步分离或纯化所需重组产物。此类程序包括离心、超滤、沉淀和层析程序。

在甜菊醇糖苷释放或富集之后，甜菊醇糖苷可通过如例如在国际专利申请公开号WO 2009/140394中所描述的制备型HPLC来进一步纯化，所述专利以引用的方式整体并入。

热处理之后的发酵液或组合物然后可进行离心或过滤以去除工程化细胞。发酵液可任选地进行处理(诸如通过膜透析)以去除低分子量组分(葡萄糖、基本营养物和盐)。

如果希望提供呈富集或纯化形式的具有甜菊醇糖苷(包括Reb A、Reb B、Reb M、Reb D或其组合)的组合物，或者希望Reb A、Reb B、Reb M、Reb D或其组合从其他甜菊醇糖苷分离或彼此分离，则可进行进一步的纯化。甜菊醇糖苷组分的此富集或纯化可在液体发酵培养基上进行，或者发酵培养基然后可在纯化之前进行干燥。例如，发酵培养基可使用冻干来进行干燥以形成可后续进行处理的干燥组合物(例如，粉末或薄片)，所述干燥组合物包含具有Reb A、Reb B、Reb M、Reb D及其组合的甜菊醇糖苷。

在一些实施方案中，富集包括Reb A、Reb B、Reb M和/或Reb D的甜菊醇糖苷的干燥发酵液或组合物可用作用于纯化的起始材料。例如，可向干燥发酵液添加溶剂或溶剂组合以使包含甜菊醇糖苷的物质溶解或悬浮。用于溶解甜菊醇糖苷的示例性组合是水和醇的混合物(例如，50:50乙醇:水)。为了促进溶解或重悬浮，可在高于室温的温度(诸如在40℃-60℃的范围内)下加热干燥培养液物质。干燥发酵液物质的机械破坏还可诸如通过超声处理来进行。溶解的或重悬浮的发酵液物质可使用微米或亚微米过滤系统进行过滤，之后诸如通过制备型层析进行进一步纯化。

富集甜菊醇糖苷化合物的干燥发酵液或组合物可经受其他纯化过程，诸如反相液相层析。可使用合适的树脂来将甜菊醇糖苷化合物保持在柱中，去除使用液体(诸如水)通过柱洗涤的亲水性化合物。甜菊醇糖苷(包括Reb A、Reb B、Reb M、Reb D及其组合)从柱的洗脱可使用合适的溶剂或溶剂组合(诸如乙腈或甲醇)来实现。

在一些实施方案中，甜菊醇糖苷(诸如Reb A、Reb B、Reb M、Reb D及其组合)可使用制备型液相层析(诸如高压液相层析(HPLC)或超高压液相层析(UHPLC))来进行纯化。具有Reb A、Reb B、Reb M、Reb D及其组合的甜菊醇糖苷组合物可在流动相(诸如水和溶剂(例如，甲醇、乙醇、乙腈)的混合物)中在所需比率(例如，60％水，40％甲醇，v/v)下溶解。还可加热所述组合物以增强甜菊醇糖苷物质的溶解，诸如在约50℃下加热。所述溶液还可在注射到柱中之前诸如使用0.2μm过滤器进行过滤。Phenomenex Kinetex XB-C18 5μm，芯壳二氧化硅固体支撑物和具有异丁基侧链和TMS封端的C18的固定相。通过柱的流动速率可基于柱特性(诸如约20mL/min)，最大压力为400bar。Reb A、Reb B、Reb M、Reb D及其组合可通过其从柱洗脱的时间来识别。在示例性流动条件下，Reb A、Reb B、Reb M、Reb D及其组合可在60分钟内从柱洗脱。本领域技术人员应认识到，Reb A、Reb B、Reb M、Reb D及其组合的洗脱时间可随着溶剂和/或装备的变化而改变。本领域技术人员还应理解，虽然以下所述的工艺采用某一顺序的所述步骤，但是此顺序可在一些情况下更改。

在一些实施方案中，富集包括Reb A、Reb M和/或Reb D的甜菊醇糖苷的发酵液或组合物可进行干燥并且用作用于进一步纯化的起始材料。具有Reb A、Reb M、Reb D及其组合的甜菊醇糖苷组合物可溶解在水中并且穿过吸附层析柱以去除组合物中的亲水性杂质。吸附的甜菊醇糖苷可从具有乙醇/水混合物的柱解吸。在去除乙醇之后，甜菊醇糖苷液流可使用离子交换层析进一步纯化以去除离子和有色体。可进行使用活性炭的附加处理。为了使特定的甜菊醇糖苷与其他甜菊醇糖苷进一步分离，可使用结晶步骤。晶体可富集有RebM、Reb D、Reb A或其他甜菊醇糖苷。晶体可在加热和真空下干燥或者可与水再次制浆并进行喷雾干燥。

实施例1

以氢氧化铵作为主要氮源的分批补料发酵中的Reb D、Reb M和Reb A的产生

为了制备接种物，在250rpm和30℃下在1升摇瓶中的150mL种瓶培养基中培养命名为菌株B的酵母菌株20-24小时。

表1-种瓶培养基

组分	式	浓度	单位
				Biospringer 0251酵母提取物	7.5	g/L
葡萄糖一水合物	C₆H₁₂O₆ ^*H₂O	22.0	g/L

为了进行发酵，将75mL种子培养物转移到具有0.75升起始体积的初始发酵培养基中(表2、表3和表4)。温度始终维持在30℃下。空气流速为1.75SLPM，并且自动地控制搅拌速率以在发酵期间以逐步方式从400rpm增加至900rpm。通过控制进料培养基的流动速率保持限制葡萄糖浓度(表5)。2阶段进料策略涉及初始指数阶段，其以u＝0.12l/h的生长速率在10小时处开始，而第二进料阶段(或进料阶段II)以0.180ml/min的恒定流动速率在33小时处开始。继续进料，直至通过120小时获得1.95升的最终体积为止。

使用12％NH₄OH在整个发酵期间将pH维持在pH 5下。通过利用具有10重量％消泡溶液的泡沫控制探针(Ivanhoe 1163B)来控制消泡剂添加。培养基基于Verduyn等人(Verduyn C，Postma E，Scheffers WA，Van Dijken JP.Yeast.1992年7月；8(7)：501-17)，具有如表2至表5所述的修改。

表2-初始发酵培养基

组分	式	浓度	单位
				葡萄糖一水合物	C₅H₁₂O₅*H₂O	22.0	g/L
硫酸铵	(NH₄)₂SO₄	5.0	g/L
				磷酸二氢钾	KH₂PO₄	3.0	g/L
七水硫酸镁	MgSO₄*7H₂O	0.5	g/L
				痕量金属储备液		10.0	ml/L
维生素储备液		12.0	ml/L

表3-痕量金属储备溶液

组分	式	浓度	单位
				依地酸二钠	C₁₀H₁₄N₂Na₂O₅*2H₂O	15	g/L
七水硫酸锌	ZnSO₄*7H₂O	4.5	g/L
				六水氯化锰(II)	MnCl₂*4H₂O	1.026	g/L
七水硫酸钴(II)	CoCl₂*6H₂O	0.32	g/L
				七水硫酸铜(II)	CuSO₄*5H₂O	0.3	g/L
二水钼酸钠	Na₂MoO₄*2H₂O	0.4	g/L
				二水氯化钙	CaCl₂*2H₂O	3	g/L
七水硫酸铁(II)	FeSO₄*7H₂O	3	g/L
				硼酸	H₃BO₃	1	g/L
碘化钾	Kl	0.1	g/L

表4-维生素储备溶液

组分	式	浓度	单位
				d-生物素	C₁₀H₁₅N₂O₃S	50	mg/L
泛酸钙	C₁₅H₃₂CaN₂O₁₀	1000	mg/L
				烟酸	C₅H₅NO₂	1000	mg/L
盐酸硫胺素	C₁₂H₁₇ClN₄OS·HCl	1000	mg/L
				盐酸吡哆醇	C₅H₁₁NO₃·HCl	1000	mg/L
对氨基苯甲酸	C₇H₇NO₂	200	mg/L
				肌醇	C₅H₁₂O₅	25000	mg/L

表5-发酵进料培养基

组分	式	浓度	单位
				葡萄糖一水合物	C₅H₁₂O₅*H₂O	660	g/L
尿素(仅在尿素处理中)	NH₂CONH₂	33	g/L
				消泡剂		1.3	g/L
硫酸钾	K₂SO₄	4.2	g/L
				硫酸钠	Na₂SO₄	0.336	g/L
七水硫酸镁	MgSO₄*7H₂O	6.12	g/L
				磷酸二氢钾	KH₂PO₄	10.8	g/L
痕量金属储备液		14.4	mL/L
				维生素储备液		14.4	mL/L

实施例2

甜菊醇糖苷的富集或释放和分析

使用如在实施例1中所述的从重组酵母发酵生成的发酵液。总甜菊醇糖苷(包括细胞内和细胞外浓度以及总氮含量(细胞内和细胞外)和总磷含量(细胞内和细胞外))的测量通过搅拌包含酵母细胞的发酵样品以确保酵母细胞混合并且不沉降到小瓶底部来进行。将100μL的混合发酵液移取到2mL微量离心管中。将900μL的61％甲醇(提取溶剂)添加到2ml微量离心管中并且通过放置在样品旋转器上搅拌10min以提取甜菊醇糖苷。然后将样品在微量离心机中在10K rpm下离心3min，并且将澄清的上清液移取到自动取样机小瓶中以用于分析。

在不同温度下加热发酵液(包含细胞)并且持续不同时间。使用热水浴来实现加热并且如下制备样品：针对所研究的各个温度和时间点，将1ml发酵液(包含细胞)放置到顶部空间小瓶中。将小瓶密封并放置到水浴中，并且使其在所研究的各个温度下平衡5分钟，之后将样品维持在所需温度下持续所需量的时间。在指定时间结束时，从水浴取出样品并且在4℃下冷却。向每个小瓶添加4ml无菌水，之后将样品转移到14ml无菌管。涡旋样品并且取出1ml以用于通过平板培养法测定细胞活力。将样品的剩余部分在室温下在4700rpm下离心30分钟以获得澄清的不含细胞的上清液。取出不含细胞的上清液以用于进一步分析，例如发酵培养基中的甜菊醇糖苷、氮和磷的细胞外含量(通过ICP测量磷，通过Antek测量氮，并且通过UHPLC测量糖苷)。

测定热处理之后释放到发酵液中的糖苷的量。通过超高效液相层析(UPLC)测量Reb A、Reb D和Reb M。不含细胞的上清液还用于评估释放到发酵液中的氮和磷。使用燃烧法和ANTEK^TM氮分析器分析氮水平(Antek 9000氮检测器利用与臭氧进行的氮燃烧和反应来产生亚稳二氧化氮，所述二氧化氮通过化学发光检测，并且使用电感耦合等离子体光谱测定法ICP、Perkin Elmer Optima 3200DV、在213.617nm处的UV检测分析磷水平，样品溶解在0.5％HNO₃中)。使用在室温下孵育5天的马铃薯葡萄糖抗生素Easy硅胶板(微生物实验室测试试剂盒)测定酵母活力。

用于糖苷分离的UPLC方法

使用具有Eclipse Plus C18保护(柱3mm x 5mm x 1.8um)的Eclipse C18 PlusRRHD柱(3mm x 150mm x 1.8um)分离甜菊醇糖苷。所使用的流动相是通道A：10mM磷酸盐缓冲液，pH 2.6和通道B乙腈。流动速率是0.6ml/min，柱温是40℃，并且检测在210nm的紫外吸收下进行。磷酸盐缓冲液与乙腈的比率改变的梯度洗脱分布在以下示出：

i.初始：80％A/20％B

ii.7分钟：70％A/30％B

iii.12分钟：70％A/30％B

iv.15分钟：45％A/55％B

v.18分钟：45％A/55％B

vi.20分钟：20％A/80％B

vii.25分钟：20％A/80％B

viii.27分钟：15％A/85％B

ix.30分钟：15％A/85％B

x.30.5分钟：80％A/20％B

xi.35分钟：80％A/20％B

示出为热处理之后从酵母细胞释放的细胞外Reb A、Reb D&M的％的UPLC结果在表6中示出。还示出细胞外氮和磷的％。

使用Leco氮分析器(Leco TruMac N，St.Joseph，MI)来测定包含细胞的发酵液中的总氮。向衬镍的陶瓷燃烧容器施加1ml的包含细胞的均匀混合的发酵液以用于氮燃烧分析。

通过在陶瓷坩埚中使用丙烷火炬使5mL均匀混合的发酵液灰化来测定包含细胞的发酵液中的总磷。将所得的灰在525℃下保持过夜，之后使用10ml的0.5％HNO₃使灰溶解。使用ICP测定硝酸溶液中的磷含量。

表6.

如可从表6所看到的，在较高温度下和较短时间内的热处理引起Reb A、Reb D和Reb M从酵母细胞内的释放的增加，同时影响热杀死，但是具有最小细胞裂解，如通过热处理之后培养基中的氮和磷的量所评估的。所述表还示出在较高温度(50℃、75℃和95℃和较长时间)下，Reb DM和Reb A可降解为Reb B，从而引起培养液中Reb DM含量较低并且Reb B含量增加。

热处理之后的活的酵母数在表7中示出。在50℃下需要2与24小时之间来杀死酵母，而在75℃或95℃下需要不大于5分钟来杀死酵母。

表7

实施例3

将来自二阶段工艺的命名为A的菌株的发酵液在75℃下加热一小时。二阶段进料速率在以下示出：

基于Nexcelom Cellometer方法通过荧光染料对酵母细胞进行染色。热处理之前活细胞在显微镜下显示绿色，并且热处理之后死细胞显示红色。亮视场显微镜图像显示热处理之后缺少碎片(将图5A与图5B进行比较)，从而指示酵母细胞甚至在热处理之后也是完整的。

序列表

<110> 嘉吉公司

<120> 产生糖苷的热处理

<130> CAR0211/WO

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 460

<212> PRT

<213> Stevia rebaudiana

<400> 1

Met Ala Glu Gln Gln Lys Ile Lys Lys Ser Pro His Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Pro Phe Pro Leu Gln Gly His Ile Asn Pro Phe Ile Gln Phe Gly Lys

20 25 30

Arg Leu Ile Ser Lys Gly Val Lys Thr Thr Leu Val Thr Thr Ile His

35 40 45

Thr Leu Asn Ser Thr Leu Asn His Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Ile

50 55 60

Glu Ile Gln Ala Ile Ser Asp Gly Cys Asp Glu Gly Gly Phe Met Ser

65 70 75 80

Ala Gly Glu Ser Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Gln Val Gly Ser Lys Ser

85 90 95

Leu Ala Asp Leu Ile Lys Lys Leu Gln Ser Glu Gly Thr Thr Ile Asp

100 105 110

Ala Ile Ile Tyr Asp Ser Met Thr Glu Trp Val Leu Asp Val Ala Ile

115 120 125

Glu Phe Gly Ile Asp Gly Gly Ser Phe Phe Thr Gln Ala Cys Val Val

130 135 140

Asn Ser Leu Tyr Tyr His Val His Lys Gly Leu Ile Ser Leu Pro Leu

145 150 155 160

Gly Glu Thr Val Ser Val Pro Gly Phe Pro Val Leu Gln Arg Trp Glu

165 170 175

Thr Pro Leu Ile Leu Gln Asn His Glu Gln Ile Gln Ser Pro Trp Ser

180 185 190

Gln Met Leu Phe Gly Gln Phe Ala Asn Ile Asp Gln Ala Arg Trp Val

195 200 205

Phe Thr Asn Ser Phe Tyr Lys Leu Glu Glu Glu Val Ile Glu Trp Thr

210 215 220

Arg Lys Ile Trp Asn Leu Lys Val Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met

225 230 235 240

Tyr Leu Asp Lys Arg Leu Asp Asp Asp Lys Asp Asn Gly Phe Asn Leu

245 250 255

Tyr Lys Ala Asn His His Glu Cys Met Asn Trp Leu Asp Asp Lys Pro

260 265 270

Lys Glu Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Leu Val Lys His Gly

275 280 285

Pro Glu Gln Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Leu Ile Asp Ser Asp Val

290 295 300

Asn Phe Leu Trp Val Ile Lys His Lys Glu Glu Gly Lys Leu Pro Glu

305 310 315 320

Asn Leu Ser Glu Val Ile Lys Thr Gly Lys Gly Leu Ile Val Ala Trp

325 330 335

Cys Lys Gln Leu Asp Val Leu Ala His Glu Ser Val Gly Cys Phe Val

340 345 350

Thr His Cys Gly Phe Asn Ser Thr Leu Glu Ala Ile Ser Leu Gly Val

355 360 365

Pro Val Val Ala Met Pro Gln Phe Ser Asp Gln Thr Thr Asn Ala Lys

370 375 380

Leu Leu Asp Glu Ile Leu Gly Val Gly Val Arg Val Lys Ala Asp Glu

385 390 395 400

Asn Gly Ile Val Arg Arg Gly Asn Leu Ala Ser Cys Ile Lys Met Ile

405 410 415

Met Glu Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala Val Lys Trp

420 425 430

Lys Asp Leu Ala Lys Val Ala Val His Glu Gly Gly Ser Ser Asp Asn

435 440 445

Asp Ile Val Glu Phe Val Ser Glu Leu Ile Lys Ala

450 455 460

<210> 2

<211> 481

<212> PRT

<213> Stevia rebaudiana

<400> 2

Met Asp Ala Met Ala Thr Thr Glu Lys Lys Pro His Val Ile Phe Ile

1 5 10 15

Pro Phe Pro Ala Gln Ser His Ile Lys Ala Met Leu Lys Leu Ala Gln

20 25 30

Leu Leu His His Lys Gly Leu Gln Ile Thr Phe Val Asn Thr Asp Phe

35 40 45

Ile His Asn Gln Phe Leu Glu Ser Ser Gly Pro His Cys Leu Asp Gly

50 55 60

Ala Pro Gly Phe Arg Phe Glu Thr Ile Pro Asp Gly Val Ser His Ser

65 70 75 80

Pro Glu Ala Ser Ile Pro Ile Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Glu

85 90 95

Thr Asn Phe Leu Asp Arg Phe Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Pro Asp

100 105 110

Pro Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Gly Phe Leu Ser Val Phe Thr Ile

115 120 125

Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gly Ile Pro Val Met Met Tyr Trp Thr Leu

130 135 140

Ala Ala Cys Gly Phe Met Gly Phe Tyr His Ile His Ser Leu Ile Glu

145 150 155 160

Lys Gly Phe Ala Pro Leu Lys Asp Ala Ser Tyr Leu Thr Asn Gly Tyr

165 170 175

Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Val Pro Gly Met Glu Gly Ile Arg Leu

180 185 190

Lys Asp Phe Pro Leu Asp Trp Ser Thr Asp Leu Asn Asp Lys Val Leu

195 200 205

Met Phe Thr Thr Glu Ala Pro Gln Arg Ser His Lys Val Ser His His

210 215 220

Ile Phe His Thr Phe Asp Glu Leu Glu Pro Ser Ile Ile Lys Thr Leu

225 230 235 240

Ser Leu Arg Tyr Asn His Ile Tyr Thr Ile Gly Pro Leu Gln Leu Leu

245 250 255

Leu Asp Gln Ile Pro Glu Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ile Thr Ser Leu

260 265 270

His Gly Tyr Ser Leu Val Lys Glu Glu Pro Glu Cys Phe Gln Trp Leu

275 280 285

Gln Ser Lys Glu Pro Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Thr

290 295 300

Thr Val Met Ser Leu Glu Asp Met Thr Glu Phe Gly Trp Gly Leu Ala

305 310 315 320

Asn Ser Asn His Tyr Phe Leu Trp Ile Ile Arg Ser Asn Leu Val Ile

325 330 335

Gly Glu Asn Ala Val Leu Pro Pro Glu Leu Glu Glu His Ile Lys Lys

340 345 350

Arg Gly Phe Ile Ala Ser Trp Cys Ser Gln Glu Lys Val Leu Lys His

355 360 365

Pro Ser Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Gly Ser Thr Ile

370 375 380

Glu Ser Leu Ser Ala Gly Val Pro Met Ile Cys Trp Pro Tyr Ser Trp

385 390 395 400

Asp Gln Leu Thr Asn Cys Arg Tyr Ile Cys Lys Glu Trp Glu Val Gly

405 410 415

Leu Glu Met Gly Thr Lys Val Lys Arg Asp Glu Val Lys Arg Leu Val

420 425 430

Gln Glu Leu Met Gly Glu Gly Gly His Lys Met Arg Asn Lys Ala Lys

435 440 445

Asp Trp Lys Glu Lys Ala Arg Ile Ala Ile Ala Pro Asn Gly Ser Ser

450 455 460

Ser Leu Asn Ile Asp Lys Met Val Lys Glu Ile Thr Val Leu Ala Arg

465 470 475 480

Asn

<210> 3

<211> 458

<212> PRT

<213> Stevia rebaudiana

<400> 3

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

20 25 30

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

35 40 45

Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

50 55 60

Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro

65 70 75 80

Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His

85 90 95

Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

100 105 110

Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr

115 120 125

Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu

130 135 140

Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln

145 150 155 160

Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile

195 200 205

Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro

225 230 235 240

Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro

260 265 270

Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln

290 295 300

Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp

305 310 315 320

Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val

325 330 335

Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala

340 345 350

Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu

355 360 365

Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn

370 375 380

Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val

405 410 415

Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln

420 425 430

Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu

435 440 445

Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

<210> 4

<211> 473

<212> PRT

<213> Stevia rebaudiana

<400> 4

Met Ala Thr Ser Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val

1 5 10 15

Ala Thr Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Tyr Leu Gln

20 25 30

Leu Ser Lys Leu Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser

35 40 45

Thr Thr Arg Asn Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile

50 55 60

Asn Val Val Gln Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp

65 70 75 80

Ala Glu Ala Thr Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Pro Tyr Leu Lys

85 90 95

Lys Ala Ser Asp Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln

100 105 110

His Ser Pro Asp Trp Ile Ile Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Trp Leu Pro

115 120 125

Ser Ile Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Ser Val Thr

130 135 140

Thr Pro Trp Ala Ile Ala Tyr Met Gly Pro Ser Ala Asp Ala Met Ile

145 150 155 160

Asn Gly Ser Asp Gly Arg Thr Thr Val Glu Asp Leu Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Lys Trp Phe Pro Phe Pro Thr Lys Val Cys Trp Arg Lys His Asp Leu

180 185 190

Ala Arg Leu Val Pro Tyr Lys Ala Pro Gly Ile Ser Asp Gly Tyr Arg

195 200 205

Met Gly Met Val Leu Lys Gly Ser Asp Cys Leu Leu Ser Lys Cys Tyr

210 215 220

His Glu Phe Gly Thr Gln Trp Leu Pro Leu Leu Glu Thr Leu His Gln

225 230 235 240

Val Pro Val Val Pro Val Gly Leu Leu Pro Pro Glu Ile Pro Gly Asp

245 250 255

Glu Lys Asp Glu Thr Trp Val Ser Ile Lys Lys Trp Leu Asp Gly Lys

260 265 270

Gln Lys Gly Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Ala Leu Val

275 280 285

Ser Gln Thr Glu Val Val Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly

290 295 300

Leu Pro Phe Val Trp Ala Tyr Arg Lys Pro Lys Gly Pro Ala Lys Ser

305 310 315 320

Asp Ser Val Glu Leu Pro Asp Gly Phe Val Glu Arg Thr Arg Asp Arg

325 330 335

Gly Leu Val Trp Thr Ser Trp Ala Pro Gln Leu Arg Ile Leu Ser His

340 345 350

Glu Ser Val Cys Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Ser Gly Ser Ile Val

355 360 365

Glu Gly Leu Met Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly

370 375 380

Asp Gln Pro Leu Asn Ala Arg Leu Leu Glu Asp Lys Gln Val Gly Ile

385 390 395 400

Glu Ile Pro Arg Asn Glu Glu Asp Gly Cys Leu Thr Lys Glu Ser Val

405 410 415

Ala Arg Ser Leu Arg Ser Val Val Val Glu Lys Glu Gly Glu Ile Tyr

420 425 430

Lys Ala Asn Ala Arg Glu Leu Ser Lys Ile Tyr Asn Asp Thr Lys Val

435 440 445

Glu Lys Glu Tyr Val Ser Gln Phe Val Asp Tyr Leu Glu Lys Asn Ala

450 455 460

Arg Ala Val Ala Ile Asp His Glu Ser

465 470

<210> 5

<211> 1422

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 5

atggctactt ctgattccat cgttgacgat agaaagcaat tgcatgttgc tacttttcca 60

tggttggctt tcggtcatat tttgccatac ttgcaattgt ccaagttgat tgctgaaaag 120

ggtcacaagg tttcattctt gtctaccacc agaaacatcc aaagattgtc ctctcatatc 180

tccccattga tcaacgttgt tcaattgact ttgccaagag tccaagaatt gccagaagat 240

gctgaagcta ctactgatgt tcatccagaa gatatccctt acttgaaaaa ggcttccgat 300

ggtttacaac cagaagttac tagattcttg gaacaacatt ccccagattg gatcatctac 360

gattatactc attactggtt gccatccatt gctgcttcat tgggtatttc tagagcccat 420

ttctctgtta ctactccatg ggctattgct tatatgggtc catctgctga tgctatgatt 480

aacggttctg atggtagaac taccgttgaa gatttgacta ctccaccaaa gtggtttcca 540

tttccaacaa aagtctgttg gagaaaacac gatttggcta gattggttcc atacaaagct 600

ccaggtattt ctgatggtta cagaatgggt atggttttga aaggttccga ttgcttgttg 660

tctaagtgct atcatgaatt cggtactcaa tggttgcctt tgttggaaac attgcatcaa 720

gttccagttg ttccagtagg tttgttgcca ccagaaattc caggtgacga aaaagacgaa 780

acttgggttt ccatcaaaaa gtggttggat ggtaagcaaa agggttctgt tgtttatgtt 840

gctttgggtt ccgaagcttt ggtttctcaa accgaagttg ttgaattggc tttgggtttg 900

gaattgtctg gtttgccatt tgtttgggct tacagaaaac ctaaaggtcc agctaagtct 960

gattctgttg aattgccaga tggtttcgtt gaaagaacta gagatagagg tttggtttgg 1020

acttcttggg ctccacaatt gagaattttg tctcatgaat ccgtctgtgg tttcttgact 1080

cattgtggtt ctggttctat cgttgaaggt ttgatgtttg gtcacccatt gattatgttg 1140

ccaatctttg gtgaccaacc attgaacgct agattattgg aagataagca agtcggtatc 1200

gaaatcccaa gaaatgaaga agatggttgc ttgaccaaag aatctgttgc tagatctttg 1260

agatccgttg tcgttgaaaa agaaggtgaa atctacaagg ctaacgctag agaattgtcc 1320

aagatctaca acgataccaa ggtcgaaaaa gaatacgttt cccaattcgt tgactacttg 1380

gaaaagaatg ctagagctgt tgccattgat catgaatctt ga 1422

<210> 6

<211> 297

<212> PRT

<213> Synechococcus sp.

<400> 6

Met Val Ala Gln Thr Phe Asn Leu Asp Thr Tyr Leu Ser Gln Arg Gln

1 5 10 15

Gln Gln Val Glu Glu Ala Leu Ser Ala Ala Leu Val Pro Ala Tyr Pro

20 25 30

Glu Arg Ile Tyr Glu Ala Met Arg Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Gly Lys

35 40 45

Arg Leu Arg Pro Ile Leu Cys Leu Ala Ala Cys Glu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

Ser Val Glu Gln Ala Met Pro Thr Ala Cys Ala Leu Glu Met Ile His

65 70 75 80

Thr Met Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asn Asp Asp

85 90 95

Phe Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Asp Ile

100 105 110

Ala Ile Leu Ala Gly Asp Ala Leu Leu Ala Tyr Ala Phe Glu His Ile

115 120 125

Ala Ser Gln Thr Arg Gly Val Pro Pro Gln Leu Val Leu Gln Val Ile

130 135 140

Ala Arg Ile Gly His Ala Val Ala Ala Thr Gly Leu Val Gly Gly Gln

145 150 155 160

Val Val Asp Leu Glu Ser Glu Gly Lys Ala Ile Ser Leu Glu Thr Leu

165 170 175

Glu Tyr Ile His Ser His Lys Thr Gly Ala Leu Leu Glu Ala Ser Val

180 185 190

Val Ser Gly Gly Ile Leu Ala Gly Ala Asp Glu Glu Leu Leu Ala Arg

195 200 205

Leu Ser His Tyr Ala Arg Asp Ile Gly Leu Ala Phe Gln Ile Val Asp

210 215 220

Asp Ile Leu Asp Val Thr Ala Thr Ser Glu Gln Leu Gly Lys Thr Ala

225 230 235 240

Gly Lys Asp Gln Ala Ala Ala Lys Ala Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Gly

245 250 255

Leu Glu Ala Ser Arg Gln Lys Ala Glu Glu Leu Ile Gln Ser Ala Lys

260 265 270

Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Gly Ser Gln Ala Glu Pro Leu Leu Ala Leu

275 280 285

Ala Asp Phe Ile Thr Arg Arg Gln His

290 295

<210> 7

<211> 827

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 7

Met Val Leu Ser Ser Ser Cys Thr Thr Val Pro His Leu Ser Ser Leu

1 5 10 15

Ala Val Val Gln Leu Gly Pro Trp Ser Ser Arg Ile Lys Lys Lys Thr

20 25 30

Asp Thr Val Ala Val Pro Ala Ala Ala Gly Arg Trp Arg Arg Ala Leu

35 40 45

Ala Arg Ala Gln His Thr Ser Glu Ser Ala Ala Val Ala Lys Gly Ser

50 55 60

Ser Leu Thr Pro Ile Val Arg Thr Asp Ala Glu Ser Arg Arg Thr Arg

65 70 75 80

Trp Pro Thr Asp Asp Asp Asp Ala Glu Pro Leu Val Asp Glu Ile Arg

85 90 95

Ala Met Leu Thr Ser Met Ser Asp Gly Asp Ile Ser Val Ser Ala Tyr

100 105 110

Asp Thr Ala Trp Val Gly Leu Val Pro Arg Leu Asp Gly Gly Glu Gly

115 120 125

Pro Gln Phe Pro Ala Ala Val Arg Trp Ile Arg Asn Asn Gln Leu Pro

130 135 140

Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ala Ala Leu Phe Ser Ala Tyr Asp Arg Leu

145 150 155 160

Ile Asn Thr Leu Ala Cys Val Val Thr Leu Thr Arg Trp Ser Leu Glu

165 170 175

Pro Glu Met Arg Gly Arg Gly Leu Ser Phe Leu Gly Arg Asn Met Trp

180 185 190

Lys Leu Ala Thr Glu Asp Glu Glu Ser Met Pro Ile Gly Phe Glu Leu

195 200 205

Ala Phe Pro Ser Leu Ile Glu Leu Ala Lys Ser Leu Gly Val His Asp

210 215 220

Phe Pro Tyr Asp His Gln Ala Leu Gln Gly Ile Tyr Ser Ser Arg Glu

225 230 235 240

Ile Lys Met Lys Arg Ile Pro Lys Glu Val Met His Thr Val Pro Thr

245 250 255

Ser Ile Leu His Ser Leu Glu Gly Met Pro Gly Leu Asp Trp Ala Lys

260 265 270

Leu Leu Lys Leu Gln Ser Ser Asp Gly Ser Phe Leu Phe Ser Pro Ala

275 280 285

Ala Thr Ala Tyr Ala Leu Met Asn Thr Gly Asp Asp Arg Cys Phe Ser

290 295 300

Tyr Ile Asp Arg Thr Val Lys Lys Phe Asn Gly Gly Val Pro Asn Val

305 310 315 320

Tyr Pro Val Asp Leu Phe Glu His Ile Trp Ala Val Asp Arg Leu Glu

325 330 335

Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr Phe Gln Lys Glu Ile Glu Gln Cys Met

340 345 350

Asp Tyr Val Asn Arg His Trp Thr Glu Asp Gly Ile Cys Trp Ala Arg

355 360 365

Asn Ser Asp Val Lys Glu Val Asp Asp Thr Ala Met Ala Phe Arg Leu

370 375 380

Leu Arg Leu His Gly Tyr Ser Val Ser Pro Asp Val Phe Lys Asn Phe

385 390 395 400

Glu Lys Asp Gly Glu Phe Phe Ala Phe Val Gly Gln Ser Asn Gln Ala

405 410 415

Val Thr Gly Met Tyr Asn Leu Asn Arg Ala Ser Gln Ile Ser Phe Pro

420 425 430

Gly Glu Asp Val Leu His Arg Ala Gly Ala Phe Ser Tyr Glu Phe Leu

435 440 445

Arg Arg Lys Glu Ala Glu Gly Ala Leu Arg Asp Lys Trp Ile Ile Ser

450 455 460

Lys Asp Leu Pro Gly Glu Val Val Tyr Thr Leu Asp Phe Pro Trp Tyr

465 470 475 480

Gly Asn Leu Pro Arg Val Glu Ala Arg Asp Tyr Leu Glu Gln Tyr Gly

485 490 495

Gly Gly Asp Asp Val Trp Ile Gly Lys Thr Leu Tyr Arg Met Pro Leu

500 505 510

Val Asn Asn Asp Val Tyr Leu Glu Leu Ala Arg Met Asp Phe Asn His

515 520 525

Cys Gln Ala Leu His Gln Leu Glu Trp Gln Gly Leu Lys Arg Trp Tyr

530 535 540

Thr Glu Asn Arg Leu Met Asp Phe Gly Val Ala Gln Glu Asp Ala Leu

545 550 555 560

Arg Ala Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Ser Val Tyr Glu Pro Cys Arg Ala

565 570 575

Ala Glu Arg Leu Ala Trp Ala Arg Ala Ala Ile Leu Ala Asn Ala Val

580 585 590

Ser Thr His Leu Arg Asn Ser Pro Ser Phe Arg Glu Arg Leu Glu His

595 600 605

Ser Leu Arg Cys Arg Pro Ser Glu Glu Thr Asp Gly Ser Trp Phe Asn

610 615 620

Ser Ser Ser Gly Ser Asp Ala Val Leu Val Lys Ala Val Leu Arg Leu

625 630 635 640

Thr Asp Ser Leu Ala Arg Glu Ala Gln Pro Ile His Gly Gly Asp Pro

645 650 655

Glu Asp Ile Ile His Lys Leu Leu Arg Ser Ala Trp Ala Glu Trp Val

660 665 670

Arg Glu Lys Ala Asp Ala Ala Asp Ser Val Cys Asn Gly Ser Ser Ala

675 680 685

Val Glu Gln Glu Gly Ser Arg Met Val His Asp Lys Gln Thr Cys Leu

690 695 700

Leu Leu Ala Arg Met Ile Glu Ile Ser Ala Gly Arg Ala Ala Gly Glu

705 710 715 720

Ala Ala Ser Glu Asp Gly Asp Arg Arg Ile Ile Gln Leu Thr Gly Ser

725 730 735

Ile Cys Asp Ser Leu Lys Gln Lys Met Leu Val Ser Gln Asp Pro Glu

740 745 750

Lys Asn Glu Glu Met Met Ser His Val Asp Asp Glu Leu Lys Leu Arg

755 760 765

Ile Arg Glu Phe Val Gln Tyr Leu Leu Arg Leu Gly Glu Lys Lys Thr

770 775 780

Gly Ser Ser Glu Thr Arg Gln Thr Phe Leu Ser Ile Val Lys Ser Cys

785 790 795 800

Tyr Tyr Ala Ala His Cys Pro Pro His Val Val Asp Arg His Ile Ser

805 810 815

Arg Val Ile Phe Glu Pro Val Ser Ala Ala Lys

820 825

<210> 8

<211> 785

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 8

Met Ser Ile Asn Leu Arg Ser Ser Gly Cys Ser Ser Pro Ile Ser Ala

1 5 10 15

Thr Leu Glu Arg Gly Leu Asp Ser Glu Val Gln Thr Arg Ala Asn Asn

20 25 30

Val Ser Phe Glu Gln Thr Lys Glu Lys Ile Arg Lys Met Leu Glu Lys

35 40 45

Val Glu Leu Ser Val Ser Ala Tyr Asp Thr Ser Trp Val Ala Met Val

50 55 60

Pro Ser Pro Ser Ser Gln Asn Ala Pro Leu Phe Pro Gln Cys Val Lys

65 70 75 80

Trp Leu Leu Asp Asn Gln His Glu Asp Gly Ser Trp Gly Leu Asp Asn

85 90 95

His Asp His Gln Ser Leu Lys Lys Asp Val Leu Ser Ser Thr Leu Ala

100 105 110

Ser Ile Leu Ala Leu Lys Lys Trp Gly Ile Gly Glu Arg Gln Ile Asn

115 120 125

Lys Gly Leu Gln Phe Ile Glu Leu Asn Ser Ala Leu Val Thr Asp Glu

130 135 140

Thr Ile Gln Lys Pro Thr Gly Phe Asp Ile Ile Phe Pro Gly Met Ile

145 150 155 160

Lys Tyr Ala Arg Asp Leu Asn Leu Thr Ile Pro Leu Gly Ser Glu Val

165 170 175

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Thr

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180 185 190

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Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg

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Gln Asn Trp Gln Asp Arg Ala Arg Gln Glu Val Leu Gln Val Phe Gly

355 360 365

Ser Ser Lys Pro Asp Phe Asp Gly Leu Ala His Leu Lys Val Val Thr

370 375 380

Met Ile Leu Leu Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Val Ile Glu Leu

385 390 395 400

Ile Arg Thr Ile His Lys Lys Thr Gln Leu Gly Lys Leu Ser Leu Pro

405 410 415

Glu Gly Val Glu Val Arg Leu Pro Thr Leu Leu Ile His His Asp Lys

420 425 430

Glu Leu Trp Gly Asp Asp Ala Asn Gln Phe Asn Pro Glu Arg Phe Ser

435 440 445

Glu Gly Val Ser Lys Ala Thr Lys Asn Arg Leu Ser Phe Phe Pro Phe

450 455 460

Gly Ala Gly Pro Arg Ile Cys Ile Gly Gln Asn Phe Ser Met Met Glu

465 470 475 480

Ala Lys Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Gln His Phe Thr Phe Glu Leu

485 490 495

Ser Pro Ser His Ala His Ala Pro Ser His Arg Ile Thr Leu Gln Pro

500 505 510

Gln Tyr Gly Val Arg Ile Ile Leu His Arg Arg

515 520

<210> 22

<211> 701

<212> PRT

<213> Siraitia grosvenorii

<400> 22

Met Lys Val Ser Pro Phe Glu Phe Met Ser Ala Ile Ile Lys Gly Arg

1 5 10 15

Met Asp Pro Ser Asn Ser Ser Phe Glu Ser Thr Gly Glu Val Ala Ser

20 25 30

Val Ile Phe Glu Asn Arg Glu Leu Val Ala Ile Leu Thr Thr Ser Ile

35 40 45

Ala Val Met Ile Gly Cys Phe Val Val Leu Met Trp Arg Arg Ala Gly

50 55 60

Ser Arg Lys Val Lys Asn Val Glu Leu Pro Lys Pro Leu Ile Val His

65 70 75 80

Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu Asp Gly Lys Lys Lys Val Ser Ile Phe

85 90 95

Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Ala

100 105 110

Asp Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Thr Phe Arg Val Val Asp

115 120 125

Leu Asp Asp Tyr Ala Ala Asp Asp Asp Gln Tyr Glu Glu Lys Leu Lys

130 135 140

Asn Glu Ser Phe Ala Val Phe Leu Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu

145 150 155 160

Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Ala Glu Gly Lys

165 170 175

Glu Arg Gly Glu Trp Leu Gln Asn Leu His Tyr Ala Val Phe Gly Leu

180 185 190

Gly Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile Ala Lys Val Ala Asp

195 200 205

Glu Leu Leu Glu Ala Gln Gly Gly Asn Arg Leu Val Lys Val Gly Leu

210 215 220

Gly Asp Asp Asp Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Ser Ala Trp Arg Glu

225 230 235 240

Ser Leu Trp Pro Glu Leu Asp Met Leu Leu Arg Asp Glu Asp Asp Ala

245 250 255

Thr Thr Val Thr Thr Pro Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val

260 265 270

Val Phe His Asp Ser Ala Asp Val Ala Ala Glu Asp Lys Ser Trp Ile

275 280 285

Asn Ala Asn Gly His Ala Val His Asp Ala Gln His Pro Phe Arg Ser

290 295 300

Asn Val Val Val Arg Lys Glu Leu His Thr Ser Ala Ser Asp Arg Ser

305 310 315 320

Cys Ser His Leu Glu Phe Asn Ile Ser Gly Ser Ala Leu Asn Tyr Glu

325 330 335

Thr Gly Asp His Val Gly Val Tyr Cys Glu Asn Leu Thr Glu Thr Val

340 345 350

Asp Glu Ala Leu Asn Leu Leu Gly Leu Ser Pro Glu Thr Tyr Phe Ser

355 360 365

Ile Tyr Thr Asp Asn Glu Asp Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ser Leu

370 375 380

Pro Pro Pro Phe Pro Ser Cys Thr Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr

385 390 395 400

Ala Asp Leu Leu Asn Ser Pro Lys Lys Ser Ala Leu Leu Ala Leu Ala

405 410 415

Ala His Ala Ser Asn Pro Val Glu Ala Asp Arg Leu Arg Tyr Leu Ala

420 425 430

Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu Tyr Ala Gln Ser Val Ile Gly Ser Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Leu Glu Val Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro

450 455 460

Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe

465 470 475 480

Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Met Ala Pro Ser Arg Ile His Val

485 490 495

Thr Cys Ala Leu Val Tyr Asp Lys Met Pro Thr Gly Arg Ile His Lys

500 505 510

Gly Val Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn Ser Val Pro Met Glu Lys Ser

515 520 525

His Glu Cys Ser Trp Ala Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys

530 535 540

Leu Pro Ala Glu Ser Lys Val Pro Ile Ile Met Val Gly Pro Gly Thr

545 550 555 560

Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Lys

565 570 575

Glu Ser Gly Val Glu Leu Gly Pro Ser Ile Leu Phe Phe Gly Cys Arg

580 585 590

Asn Arg Arg Met Asp Tyr Ile Tyr Glu Asp Glu Leu Asn Asn Phe Val

595 600 605

Glu Thr Gly Ala Leu Ser Glu Leu Val Ile Ala Phe Ser Arg Glu Gly

610 615 620

Pro Thr Lys Glu Tyr Val Gln His Lys Met Ala Glu Lys Ala Ser Asp

625 630 635 640

Ile Trp Asn Leu Ile Ser Glu Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp

645 650 655

Ala Lys Gly Met Ala Lys Asp Val His Arg Thr Leu His Thr Ile Met

660 665 670

Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asp Ser Ser Lys Ala Glu Ser Met Val Lys

675 680 685

Asn Leu Gln Met Asn Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp

690 695 700

Claims

1.一种从宿主细胞释放甜菊醇糖苷的方法，其包括将包含产生甜菊醇糖苷的工程化宿主细胞的发酵培养基加热至50℃至95℃范围内的温度，持续5分钟至48小时，以将一种或多种甜菊醇糖苷从所述工程化宿主细胞释放到所述发酵培养基中。

2.一种从宿主细胞释放甜菊醇糖苷的方法，其包括以下步骤：

c)提供包含进行工程化以产生一种或多种甜菊醇糖苷的宿主细胞的发酵培养基；以及

d)通过将所述发酵培养基加热至50℃至95℃范围内的温度、持续5分钟至48小时来从所述工程化宿主细胞释放所述一种或多种甜菊醇糖苷，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷从所述宿主细胞的细胞内部分释放到所述发酵培养基的细胞外部分中。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述加热选自70℃至95℃，持续5分钟至2小时。

4.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述加热选自70℃至95℃，持续5分钟。

5.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述加热是约50℃，持续24小时。

6.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述加热是约75℃，持续5分钟至2小时。

7.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述加热是约95℃，持续5分钟至1小时。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中与所产生的并且在细胞内和细胞外两者中存在的总甜菊醇糖苷相比，所释放的甜菊醇糖苷大于90％所选糖苷。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述加热不使细胞外氮含量增加至大于所述组合物的所述总氮组分的45％。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述加热不使细胞外磷含量增加至大于所述组合物的所述总磷组分的70％。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述组合物中所释放的甜菊醇糖苷可从所述工程化宿主细胞进一步分离或纯化。

12.一种从组合物回收甜菊醇糖苷的方法，其包括将包含进行工程化以合成甜菊醇糖苷的宿主细胞的组合物加热至70℃至95℃范围内的温度，持续5分钟至2小时，以将所述甜菊醇糖苷从所述组合物中的所述宿主细胞释放，其中所述组合物中的所述细胞外氮含量不增加至大于所述组合物的所述总氮含量的45％。

13.一种从组合物回收甜菊醇糖苷的方法，其包括将包含进行工程化以合成甜菊醇糖苷的宿主细胞的组合物加热至70℃至95℃范围内的温度，持续5分钟至2小时，以将所述甜菊醇糖苷从所述组合物中的所述宿主细胞释放，其中所述组合物中的所述细胞外磷含量不增加至大于所述组合物的所述总磷组分的70％。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其包括甜菊醇糖苷产生步骤，其中所述发酵培养基在所述甜菊醇糖苷产生步骤期间维持在小于40℃的温度下。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述工程化宿主细胞是酵母。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母选自由以下属组成的组：假丝酵母、毕赤酵母(汉逊酵母)、克勒克酵母(有孢汉生酵母)、克鲁维酵母、红酵母、球拟酵母、接合酵母、酵母菌、耶氏酵母和酵母属。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母来自酵母菌属或酵母属。

18.如权利要求18所述的方法，其中所述工程化酵母是酿酒酵母。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷选自莱苞迪甙M、莱苞迪甙D、莱苞迪甙A、莱苞迪甙B或其组合。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中与所产生的并且在细胞内和细胞外两者中存在的所述总糖苷相比，所释放的莱苞迪甙M、莱苞迪甙D、莱苞迪甙A、莱苞迪甙B或其组合大于所述莱苞迪甙M、莱苞迪甙D、莱苞迪甙A、莱苞迪甙B或其组合的90％。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中与所产生的并且在细胞内和细胞外两者中存在的所述总糖苷相比，所释放的莱苞迪甙M、莱苞迪甙D或其组合大于所述莱苞迪甙M、莱苞迪甙D或其组合的90％。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中释放在细胞外的Reb D和/或Reb M大于存在于所述发酵培养基或组合物中的所述总(即，细胞内和细胞外两者)Reb D和/或Reb M的33％。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所释放的Reb D可以存在于所述发酵培养基或组合物中的Reb D的所述总量的约30％至约100％的范围存在于细胞外。

24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所释放的Reb M可以存在于所述发酵培养基或组合物中的Reb M的所述总量的约30％至约100％的范围存在于细胞外。

25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述Reb A量可以在所述发酵期间产生的Reb A的所述总量的约30％至约100％、约50％至约100％、约80％至约90％的范围释放在细胞外。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述Reb B量可以在所述发酵期间产生的Reb B的所述总量的约25％至约100％、约30％至约95％、约40％至约80％的范围释放在细胞外。

27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述加热不使所述组合物或发酵培养基中的细胞外氮含量增加至大于所述组合物或发酵培养基的所述总氮含量的40％、45％或50％。

28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述加热不使所述组合物或发酵培养基中的细胞外磷含量增加至大于所述组合物或发酵培养基的所述总磷组分的65％、70％或75％。

29.一种组合物，其包含根据如前述权利要求中任一项所述的方法获得的甜菊醇糖苷。

30.一种组合物，其包含产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化宿主细胞和通过将所述组合物加热至50℃至95℃范围内的温度、持续5分钟至48小时来从所述工程化宿主细胞释放的一种或多种甜菊醇糖苷。

31.如权利要求30所述的组合物，其中所述甜菊醇糖苷选自莱苞迪甙M、莱苞迪甙D、莱苞迪甙A、莱苞迪甙B或其组合。

32.如权利要求30-31中任一项所述的组合物，其中与所产生的并且在细胞内和细胞外两者中存在的所述总糖苷相比，所释放的莱苞迪甙M、莱苞迪甙D、莱苞迪甙A、莱苞迪甙B或其组合大于所述莱苞迪甙M、莱苞迪甙D、莱苞迪甙A、莱苞迪甙B或其组合的90％。

33.如权利要求30-32中任一项所述的组合物，其中与所产生的并且在细胞内和细胞外两者中存在的所述总糖苷相比，所释放的莱苞迪甙M、莱苞迪甙D或其组合大于所述莱苞迪甙M、莱苞迪甙D或其组合的90％。

34.如权利要求30-33中任一项所述的组合物，其中释放在细胞外的Reb D和/或Reb M大于存在于所述发酵培养基或组合物中的所述总(即，细胞内和细胞外两者)Reb D和/或Reb M的33％。

35.如权利要求30-34中任一项所述的组合物，其中所释放的Reb D可以存在于所述发酵培养基或组合物中的Reb D的所述总量的约30％至约100％的范围存在于细胞外。

36.如权利要求30-35中任一项所述的组合物，其中所释放的Reb M可以存在于所述发酵培养基或组合物中的Reb M的所述总量的约30％至约100％的范围存在于细胞外。

37.如权利要求30-36中任一项所述的组合物，其中所述Reb A量可以在所述发酵期间产生的Reb A的所述总量的约30％至约100％、约50％至约100％、约80％至约90％的范围释放在细胞外。

38.如权利要求30-37中任一项所述的组合物，其中所述Reb B量可以在所述发酵期间产生的Reb B的所述总量的约25％至约100％、约30％至约100％、约80％至约90％的范围释放在细胞外。

39.如权利要求30-38中任一项所述的组合物，其中所述加热不使细胞外氮含量增加至大于所述组合物的所述总氮含量的45％。

40.如权利要求30-39中任一项所述的组合物，其中所述加热不使细胞外磷含量增加至大于所述组合物的所述总磷含量的70％。