CN109750071A

CN109750071A - 一种生物催化合成莱鲍迪苷m的方法

Info

Publication number: CN109750071A
Application number: CN201910095402.7A
Authority: CN
Inventors: 贾红华; 李艳; 陈量量; 潘华祎; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-05-14

Abstract

本发明公开了一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，首先，利用番茄来源UDP‑糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以甜菊甙为原料糖基化反应合成莱鲍迪苷E；随后，利用甜叶菊来源UDP‑糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以莱鲍迪苷E为原料进一步糖基化反应合成莱鲍迪苷M。本发明的方法利用分子克隆技术，获得异源表达UDP‑糖基转移酶和蔗糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌，经发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，利用粗提液中UDP及额外添加的蔗糖在蔗糖合成酶分解作用下获得UDP‑葡萄糖作为糖基化反应的原材料，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M。原料成本更为低廉，工艺步骤简单，具有重要的应用价值。

Description

一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法。

背景技术

甜叶菊作为一种原产于南美洲的多年本草生植物，其茎叶中可提取出丰富的甜菊糖甙，几个世纪以来，一直被南美洲人们用作为天然甜味剂^[1]。自1976年我国从日本引进甜叶菊种植成功后，80年代后开始向全国推广种植。目前福建、安微、江苏等地已有大面积种植，总面积达100万亩，已成为全球最大的甜菊糖生产国和出口国^{[2, 3]}。甜菊糖作为目前已知的最甜的甜味剂，其甜度是蔗糖的250~450倍，而热量只有蔗糖的1/300，略带有轻微涩味。其溶解度不低，且在酸和盐的溶液中能稳定存在，保存时间长、不会结块。除此之外，甜菊糖还具备对高血压、肥胖症、糖尿病等辅助药理作用^{[4, 5]}，因此，越来越受到人们的关注。

甜菊糖是甜菊糖甙的总称，目前已从甜叶菊中分离鉴定出超过35种甜菊糖甙^[6]。甜菊糖甙结构围绕一个双萜甜菊醇为骨架，在C13位羟基和C19位羧基分别连接了不等的葡萄糖基团，其中，骨架上C16-C17之间的碳碳双键是提供甜菊糖甙甜味及功能的药理性基团^{[6, 7]}。莱鲍迪苷M，于2009年报道首次从甜叶菊新品种的叶子中被提取鉴定，其甜度为蔗糖的400倍，优于现市场上在售的莱鲍迪苷A，口感也更为干净。尽管研究人员培育了高产莱鲍迪苷M的甜叶菊新品种，但其在干叶片中的含量仍低（~0.4-0.5%），单纯使用物理手段直接从叶片中提取制备高纯度的莱鲍迪苷M，经济效益是及其低下的。

专利申请CN 201310353500.9（一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法）与专利申请CN201410019981.4（一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法）中采用的是以莱鲍迪苷A或者莱鲍迪苷D为底物原料，经UDP-葡萄糖基转移酶（来自甜菊的UGT-A和/或来自水稻的UGT-B）及蔗糖合成酶偶联催化实现的，其底物莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D的成本均远远高于甜菊甙。

专利申请CN 201410553617.6（莱鲍迪苷M的合成方法及其中间产物和合成方法）和专利申请CN 201410314371.7（一种制备莱鲍迪苷M的工艺方法）中均涉及到部分化学试剂或化学反应，且合成步骤烦琐。本方法通过生物酶催化手段，以甜菊甙纯品为原料，搭建新的莱鲍迪苷M合成路径，经两步糖基化反应制备莱鲍迪苷M，原料成本更为低廉，工艺步骤简单，具有重要的应用价值。

参考文献

[1]杨远志, 李发财, 琚争艳, 等. 甜菊糖的应用现状及发展前景 [J]. 发酵科技通讯, 2011, 40(1): 40-44.

[2]倪军明, 李军平. 甜菊糖工业发展现状与前景 [J]. 现代食品科技, 2004, 20(3): 156-158.

[3]唐志发. 甜菊糖的崛起与发展战略 [J]. 中国食品工业, 1999, 2: 52-55.

[4]KOVYLYAEVA G I, BAKALEINIK G A, STROBYKINA I Y, et al. Glycosides fromStevia rebaudiana [J]. Chemistry of Natural Compounds, 2007, 43(1): 81-85.

[5]KINGHORN A D, KINGHORN A D. Stevia: the genus Stevia [J]. Crc Press,2002.

[6]OLSSON K, CARLSEN S, SEMMLER A, et al. Microbial production of next-generation stevia sweeteners [J]. Microb Cell Fact, 2016, 15(1): 207-220.

[7]UPRETI M, DUBOIS G, PRAKASH I. Synthetic study on the relationshipbetween structure and sweet taste properties of steviol glycosides [J].Molecules, 2012, 17(4): 4186-4196.

发明内容

本发明的目的是针对目前制备莱鲍迪苷M经济效率低下的问题，提供一种生物催化合成莱鲍迪苷M的新路线，首先利用糖基转移酶UGTSL2糖基化作用，催化甜菊甙合成莱鲍迪苷E，随后利用糖基转移酶UGT76G1催化莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷M，为莱鲍迪苷M的制备及精制提供有力基础。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，利用分子克隆技术，获得异源表达UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌，经自诱导发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，无需添加UDP-葡萄糖和UDP，利用粗提液中UDP及额外添加的蔗糖，建立循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M。

所述自诱导发酵中诱导剂为乳糖，乳糖在发酵培养液中浓度为0.01~0.5%。

该方法具体分为两步进行，如图2所示，（1）首先，原料甜菊甙经UDP-糖基转移酶UGTSL2和蔗糖合成酶StSUS1双酶催化生成中间产物莱鲍迪苷E；（2）中间产物莱鲍迪苷E经UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶StSUS1双酶催化生成最终产物莱鲍迪苷M。

所述UDP-糖基转移酶UGT-A为番茄来源糖基转移酶UGTSL2，为NCBI ReferenceSequence: NC_015448. 3，基因序列见SEQ.No.1所示，氨基酸序列（Uniprot number:K4D508）见SEQ.No.4所示；所述UDP-糖基转移酶UGT-B为甜叶菊来源糖基转移酶UGT76G1，为NCBI Reference Sequence: AY345974. 1，基因序列见SEQ.No.2所示，氨基酸序列（Uniprot number: Q6VAB4）见SEQ.No.5所示；所述蔗糖合成酶SUS为马铃薯来源蔗糖合成酶StSUS1，为NCBI Reference Sequence: M18745，基因序列见SEQ.No.3所示，氨基酸序列（Uniprot number: P10691）见SEQ.No.6所示。

步骤1中的基因工程菌为含有UDP-糖基转移酶UGTSL2和蔗糖合成酶StSUS1共表达载体的重组大肠杆菌，UGTSL2基因片段插入在质粒载体的Nde I和Xho I酶切位点之间，StSUS1基因片段插入在质粒载体的Nco I和EcoR I酶切位点之间，最终提供了可外源共表达糖基转移酶UGTSL2和蔗糖合成酶StSUS1的重组质粒，pRSFDuet-UGTSL2-StSUS1。

步骤2中的基因工程菌为含有UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶StSUS1共表达载体的重组大肠杆菌，UGT76G1基因片段插入在质粒载体的Nde I和Xho I酶切位点之间，StSUS1基因片段插入在质粒载体的Nco I和EcoR I酶切位点之间，最终提供了可外源共表达糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶StSUS1的重组质粒，pRSFDuet-UGT76G1-StSUS1；

将重组质粒热击转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，转化产物涂布于含有50mg/L的卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，获得共表达的重组大肠杆菌基因工程菌。

步骤1）和步骤2）构建得到的重组大肠杆菌基因工程菌诱导表达条件为：将重组大肠杆菌接种到LB培养基中，于16~37℃、200rpm振荡培养8~10 h，再将培养菌液按2%接种量接入TB培养基中，其中诱导剂乳糖在TB培养液中浓度为0.01~0.5%，于16~37℃诱导培养16~36 h，离心收集菌体。

所述细胞粗提液为发酵得到的菌体经超声或低温高压破碎所获得的含有UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的粗酶液，粗提液中含有微量的UDP。

所述循环反应催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M的体系为：底物甜菊甙的起始反应浓度为2~60 g/L，蔗糖与甜菊甙的质量比为1~10，由共表达UGTSL2和StSUS1的基因工程菌制备的粗酶液在反应体系中的总蛋白浓度为1~25 mg/mL，加水定容至1~100 mL，pH值为6~8，于20~50℃反应1~48 h；随后添加共表达UGT76G1和StSUS1的基因工程菌制备的总蛋白浓度为1~25 mg/mL粗酶液，继续反应1~48 h。

有益效果：

本发明采用生物酶法，通过糖基转移酶UGTSL2糖基化反应催化甜菊甙首先合成中间产物莱鲍迪苷E，再利用糖基转移酶UGT76G1转糖基作用催化莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷M。其中，莱鲍迪苷E经甜菊甙催化合成产率可达65%；莱鲍迪苷M经莱鲍迪苷E催化合成产率可达65%以上。

附图说明

图1 莱鲍迪苷E（A）和莱鲍迪苷M（B）的结构式；

图2 UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶偶联催化甜菊甙合成莱鲍迪苷M；

图3 莱鲍迪苷E（A）和莱鲍迪苷M（B）的LC-MS鉴定结果。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：重组大肠杆菌基因工程菌的构建

1）、共表达UGTSL2和StSUS1的重组大肠杆菌基因工程菌的获得

UGTSL2和StSUS1基因全序列由南京金斯瑞公司合成，并构建到质粒pRSFDuet-1上，其中，UGTSL2基因片段插入在质粒载体RSFDuet-1（Novagen公司）的Nde I和Xho I酶切位点之间，StSUS1基因片段插入在质粒载体pRSFDuet-1（Novagen公司）的Nco I和EcoR I酶切位点之间，最终提供了可外源共表达糖基转移酶UGTSL2和蔗糖合成酶StSUS1的重组质粒，pRSFDuet-UGTSL2-StSUS1。

添加40 uL ddH₂O至重组质粒pRSFDuet-UGTSL2-StSUS1干粉中，充分溶解，取5 ul热击转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，转化产物涂布于含有50 mg/L的卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，获得重组大肠杆菌基因工程菌。

2）、共表达UGT76G1和StSUS1的重组大肠杆菌基因工程菌的获得

UGT76G1和StSUS1基因全序列由南京金斯瑞公司合成，并构建到质粒pRSFDuet-1上，其中，UGT76G1基因片段插入在质粒载体pRSFDuet-1（Novagen公司）的Nde I和Xho I酶切位点之间，StSUS1基因片段插入在质粒载体pRSFDuet-1（Novagen公司）的Nco I和EcoR I酶切位点之间，最终提供了可外源共表达糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶StSUS1的重组质粒，pRSFDuet-UGT76G1-StSUS1。

添加40 uL ddH₂O至重组质粒pRSFDuet-UGT76G1-StSUS1干粉中，充分溶解，取5ul热击转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，转化产物涂布于含有50 mg/L的卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，获得重组大肠杆菌基因工程菌。

实施例2：基因工程菌双酶的共表达

将含有质粒pRSFDuet-UGTSL2-StSUS1（或pRSFDuet-UGT76G1-StSUS1）的重组基因工程菌接种到含有50 mg/L卡那霉素抗性的LB培养基（0.5 g/L酵母粉，1 g/L氯化钠，1 g/L胰蛋白胨），于37℃、200 rpm振荡过夜培养，再将培养菌按2%接种量接入含有100 mL TB培养基（2.5 g/L酵母粉，1 g/L氯化钠，1.5 g/L胰蛋白胨，0.2 g/L葡萄糖，0.05 g/L乳糖）的500mL摇瓶中，于200 rpm，37℃培养2 h，随后转移至25℃继续培养24 h，离心收集菌体。超声破碎菌体，离心取上清液即为细胞粗提液，置于4℃保存待用。

实施例3：酶法催化甜菊甙合成莱鲍迪苷E

1）、催化反应体系

添加20 g/L甜菊甙、60 g/L蔗糖、3 mM Mg²⁺及适量共表达UGTSL2和StSUS1的细胞粗提液（~6 mg/mL总蛋白）于50 mM磷酸钾缓冲（pH 7.2）中，总体积定量20 mL。30℃，200 rpm反应24 h，定时取样500 uL，置于95℃水浴加热15 min，12000 rpm室温离心1 min，分离上清液至新1.5 mL EP管中，4℃保存，待HPCL检测。就结果来看（表1），糖基转移酶UGTSL2偶联蔗糖合成酶StSUS1催化甜菊甙合成莱鲍迪苷E是可行的，且于反应24 h时，甜菊甙的转化率已达到94.12%，莱鲍迪苷E的产率为66.32%。

2）、PHLC检测方法

色谱柱：Agilent TC-C18（4.6*250mm，5um，120A）；紫外检测波长：210 nm；柱温：55℃；流动相A为含0.1%甲酸的乙腈，流动相B为含0.1%甲酸的娃哈哈水，液相检测条件：0.000min (25% A, 75% B), 15.000 min (47% A, 53% B), 20.000 min (100% A, 0% B),20.010-25.000 min (100% A, 0% B), 25.010 min (25% A, 75% B), 25.010-30.000min (25% A, 75% B)；样品进样10 uL，流速1 mL/min。

表1：UGTSL2-StSUS1催化甜菊甙合成莱鲍迪苷E

实施例4：酶法催化莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷M

1）、催化反应体系

添加18 g/L蔗糖及适量共表达UGTSL2和StSUS1的细胞粗提液（~5 mg/mL总蛋白）于含有3 g/L或6 g/L莱鲍迪苷E的实施例3所述的终止反应后的溶液中。30℃，200 rpm反应24h，定时取样500 uL，置于95℃水浴加热15 min，12000 rpm室温离心1 min，分离上清液至新1.5 mL EP管中，4℃保存，待HPCL检测。就结果来看（表2），不同底物浓度下，糖基转移酶UGT76G1偶联蔗糖合成酶StSUS1催化莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷M反应12 h时，莱鲍迪苷E的转化率均已达到90%以上，24h时，莱鲍迪苷E已经全部转化完全。催化3 g/L莱鲍迪苷E 24h时，莱鲍迪苷M的产率可达到80%；催化6 g/L莱鲍迪苷E 24h时，莱鲍迪苷M的产率为36%。

2）、PHLC检测方法

表2：UGT76G1-StSUS1催化莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷M

实施例5：酶法催化甜菊甙合成莱鲍迪苷M

1）、催化反应体系

添加10 g/L甜菊甙、30 g/L蔗糖、3 mM Mg²⁺及适量共表达UGTSL2和StSUS1的细胞粗提液（~6 mg/mL总蛋白）于50 mM磷酸钾缓冲（pH 7.2）中，总体积定量20 mL。30℃，200 rpm反应12 h，定时取样500 uL，置于95℃水浴加热15 min，12000 rpm室温离心1 min，分离上清液至新1.5 mL EP管中，4℃保存，待HPCL检测。

上述反应12h后，在反应液中直接继续添加20 mL共表达UGT76G1和StSUS1的细胞粗提液（~6 mg/mL总蛋白），于30℃，200 rpm继续反应12 h，定时取样500 uL，置于95℃水浴加热15 min，12000 rpm室温离心1 min，分离上清液至新1.5 mL EP管中，4℃保存，待HPCL检测。

结果见表3，甜菊甙经糖基转移酶和蔗糖合成酶共同催化作用下合成莱鲍迪苷M是可行的，该两步法中，第一步甜菊甙经UGTSL2和StSUS1催化作用下转化可达到95%，中间产物莱鲍迪苷E的产率达到65%；第二步中间产物莱鲍迪苷E经UGT76G1和StSUS1催化作用下转化率达90%以上，产物莱鲍迪苷M的产率为67%。最终，以10 g/L甜菊甙为起始原料酶法合成莱鲍迪苷M实验中，莱鲍迪苷M的产率为43.5%。

2）、PHLC检测方法

表3 两步酶催化法甜菊甙合成莱鲍迪苷M

酶	时间(h)	甜菊甙浓度(g/L)	莱鲍迪苷E浓度(g/L)	莱鲍迪苷M浓度(g/L)
					（步骤一）UGTSL2-StSUS1	12	0.5 g/L	6.5 g/L
（步骤二）UGT76G1-StSUS1	24		0.2 g/L	2.2 g/L

*在步骤二时，因添加共表达UGT76G1和StSUS1的粗酶液，反应液体积增加一倍，在计算转化率及产率时，以质量作为衡量标准。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法

<141> 2019-01-30

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatctctcat ttcactctat acatagagaa atcccaaatc aacttatttc aatatggaca 60

catttcacca tttctaaaca tagccaagca actcgcggat agaggattct tgatttacct 120

ctgttccacg cgaatcaatc ttgaatccat catcaagaaa atccctgaaa agtatgctga 180

ttcgattcat cttatcgaac ttcaattgcc agaattaccc gaacttcctc ctcattacca 240

tacgacgaat ggcctcccac cccatctcaa tcccaccctt cataaggccc tgaaaatgtc 300

caaaccaaac ttttcgagaa tcttgcaaaa tctgaaacct gatttattga tttacgatgt 360

attgcagccg tgggctgaac atgttgcgaa tgaacaaaac attccagcag gtaagctgct 420

aacttcgtgt gcagctgtgt tttcgtattt tttcagcttt cgaaagaatc caggggttga 480

attccctttc cctgctattc atctcccgga agttgagaaa gtaaagatca gagaaatact 540

cgcgaaagaa cctgaagaag ggggtcgtct agacgaggga aataagcaaa tgatgttgat 600

gtgtacgtct agaactatcg aggctaaata catagattac tgcactgaat tgtgcaattg 660

gaaagttgtt ccagttggtc caccattcca agatttgatc actaatgatg cggacaacaa 720

ggagcttatc gattggcttg gaacaaaaca tgaaaattca actgttttcg tctcctttgg 780

gagtgagtat ttcttgtcaa aagaagatat ggaagaagta gctttcgcgc tggagttaag 840

taatgttaat ttcatatggg ttgcaagatt tccgaaaggt gaagagcgaa atctcgaaga 900

tgcattacca aaaggttttc ttgaaagaat tggagaaagg ggaagagttt tggacaaatt 960

tgcaccacaa ccaagaattc taaatcatcc gagcaccgga ggatttataa gtcattgtgg 1020

ttggaattca gcaatggaaa gtatagattt cggggttcct ataatcgcaa tgcctattca 1080

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tagagatgat gatgggaaaa ttcacagagg agaaatcgcg gaaactctta aaagtgtcgt 1200

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atctataaga gatgaagaga tggatgctgt tgctgaagag ctaattcaac tttgtaggaa 1320

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tgtggtgctt tgtttgtctt cgaaatatat cgaggttgaa 1420

<210> 2

<211> 1616

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 2418

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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gaactgcagg ccaagccaga tttgataatc ggaaactaca gtgagggcaa tcttgctgct 1260

tctttgctag ctcacaagtt aggcgtaacg cagtgcacca ttgcccacgc gttggagaaa 1320

acgaagtatc ctgattccga catttactgg aaaaagtttg atgaaaaata ccatttctcg 1380

tcccagttta ccgctgatct cattgcaatg aatcacactg atttcatcat caccagcacc 1440

ttccaggaga tagcaggaag caaggacact gtgggacaat atgagagcca tatggcattc 1500

acaatgcctg gattgtacag agttgttcac ggcattaatg tgttcgaccc caaattcaac 1560

attgtctcac ctggagctga tattaacctc tacttctcgt actccgaaac ggagaagaga 1620

cttacagcat ttcaccctga aattgatgag ctgctgtata gtgatgttga gaatgacgaa 1680

catctgtgcg tgctcaagga caggactaaa ccaattttat tcacaatggc gaggttggat 1740

cgtgtgaaga atttaactgg acttgttgag tggtacgcca aaaatccacg gctaagggga 1800

ttggttaacc tggttgtagt tggcggagat cgaaggaagg aatccaaaga tttggaagag 1860

caggcagaga tgaagaagat gtatgagcta attgagactc ataatttgaa tggccaattc 1920

agatggattt cttcccagat gaaccgagtg aggaatggtg agctctaccg atacattgct 1980

gacactaagg gagctttcgt tcagcctgca ttctacgagg cttttggtct gactgttgtc 2040

gaagcaatga cttgtggttt gcctacattt gcaactaatc acggtggtcc agctgagatc 2100

atcgttcatg gaaagtccgg cttccacatt gatccatatc acggtgagca agctgctgat 2160

ctgctagctg atttctttga gaaatgcaag aaagatcctt cacattggga aaccatttcg 2220

atgggtggcc tgaagcgcat cgaagagaag tacacttggc aaatctactc cgaaagccta 2280

ttgacactgg ctgctgttta tgggttctgg aaacatgttt ctaagcttga tcgtctagaa 2340

atccgtcgct atcttgaaat gttttatgct ctcaagtacc gtaagatggc tgaagctgtt 2400

ccattggctg ctgagtga 2418

<210> 4

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Thr Asn Leu Arg Val Leu Met Phe Pro Trp Leu Ala Tyr Gly

1 5 10 15

His Ile Ser Pro Phe Leu Asn Ile Ala Lys Gln Leu Ala Asp Arg Gly

20 25 30

Phe Leu Ile Tyr Leu Cys Ser Thr Arg Ile Asn Leu Glu Ser Ile Ile

35 40 45

Lys Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ala Asp Ser Ile His Leu Ile Glu Leu

50 55 60

Gln Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn

65 70 75 80

Gly Leu Pro Pro His Leu Asn Pro Thr Leu His Lys Ala Leu Lys Met

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Ser Lys Pro Asn Phe Ser Arg Ile Leu Gln Asn Leu Lys Pro Asp Leu

100 105 110

Leu Ile Tyr Asp Val Leu Gln Pro Trp Ala Glu His Val Ala Asn Glu

115 120 125

Gln Asn Ile Pro Ala Gly Lys Leu Leu Thr Ser Cys Ala Ala Val Phe

130 135 140

Ser Tyr Phe Phe Ser Phe Arg Lys Asn Pro Gly Val Glu Phe Pro Phe

145 150 155 160

Pro Ala Ile His Leu Pro Glu Val Glu Lys Val Lys Ile Arg Glu Ile

165 170 175

Leu Ala Lys Glu Pro Glu Glu Gly Gly Arg Leu Asp Glu Gly Asn Lys

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Gln Met Met Leu Met Cys Thr Ser Arg Thr Ile Glu Ala Lys Tyr Ile

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225 230 235 240

Asp Trp Leu Gly Thr Lys His Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe

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Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp Met Glu Glu Val Ala Phe

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Glu Arg Ile Gly Glu Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln

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325 330 335

Gly Trp Asn Ser Ala Met Glu Ser Ile Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile

340 345 350

Ala Met Pro Ile His Asn Asp Gln Pro Ile Asn Ala Lys Leu Met Val

355 360 365

Glu Leu Gly Val Ala Val Glu Ile Val Arg Asp Asp Asp Gly Lys Ile

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His Arg Gly Glu Ile Ala Glu Thr Leu Lys Ser Val Val Thr Gly Glu

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Gln Leu Cys Arg Asn Ser Asn Lys Ser Lys

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<210> 5

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

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Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

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Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

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Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro

65 70 75 80

Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His

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Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

100 105 110

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Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu

130 135 140

Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln

145 150 155 160

Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

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Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

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Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp

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<210> 6

<211> 805

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Glu Arg Val Leu Thr Arg Val His Ser Leu Arg Glu Arg Val

1 5 10 15

Asp Ala Thr Leu Ala Ala His Arg Asn Glu Ile Leu Leu Phe Leu Ser

20 25 30

Arg Ile Glu Ser His Gly Lys Gly Ile Leu Lys Pro His Glu Leu Leu

35 40 45

Ala Glu Phe Asp Ala Ile Arg Gln Asp Asp Lys Asn Lys Leu Asn Glu

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His Ala Phe Glu Glu Leu Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Val Leu

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Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Ile Arg Leu Arg Pro Gly Val Trp Glu

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Tyr Ile Arg Val Asn Val Asn Ala Leu Val Val Glu Glu Leu Ser Val

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Pro Glu Tyr Leu Gln Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Ala Ser Asn

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Gly Asn Phe Val Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Thr Ala Ser Phe

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180 185 190

Met Leu Asn Asp Arg Ile Gln Asn Ser Asn Thr Leu Gln Asn Val Leu

195 200 205

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Tyr Ile Leu Asp Gln Val Pro Ala Leu Glu Arg Glu Met Leu Lys Arg

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325 330 335

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370 375 380

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Asn Leu Ala Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr Gln Cys

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Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr Ser Thr

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His Leu Cys Val Leu Lys Asp Arg Thr Lys Pro Ile Leu Phe Thr Met

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Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Lys Met Ala Glu Ala Val

785 790 795 800

Pro Leu Ala Ala Glu

805

Claims

1.一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，利用分子克隆技术，获得异源表达UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的基因工程菌，经自诱导发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，利用粗提液中本身含有的微量UDP及额外添加的蔗糖，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M。

2.根据权利要求1所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M包括如下两步骤：

（1）UDP-糖基转移酶UGT-A和蔗糖合成酶SUS共表达双酶催化甜菊甙合成中间产物莱鲍迪苷E；

（2）UDP-糖基转移酶UGT-B和蔗糖合成酶SUS共表达双酶催化莱鲍迪苷E合成最终产物莱鲍迪苷M。

3.根据权利要求2所述一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述UDP-糖基转移酶UGT-A为番茄来源糖基转移酶UGTSL2，基因序列见SEQ.No.1所示，氨基酸序列见SEQ.No.4所示；所述UDP-糖基转移酶UGT-B为甜叶菊来源糖基转移酶UGT76G1，基因序列见SEQ.No.2所示，氨基酸序列见SEQ.No.5所示；所述蔗糖合成酶SUS为马铃薯来源蔗糖合成酶StSUS1，基因序列见SEQ.No.3所示，氨基酸序列见SEQ.No.6所示。

4.根据权利要求1所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述细胞粗提液为发酵得到的菌体经超声或低温高压破碎所获得的含有UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的粗酶液。

5.根据权利要求1所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述循环反应体系为： UDP-葡萄糖与甜菊甙经UGTSL2和StSUS1催化生成莱鲍迪苷E； UDP-葡萄糖与莱鲍迪苷E经UGT76G1和StSUS1催化生成莱鲍迪苷M。

6.根据权利要求1所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述基因工程菌诱导表达条件为：将重组菌接种到LB培养基中，于16~37℃、200rpm振荡培养8~10 h，再将培养菌液接入TB培养基中，其中诱导剂在TB培养液中浓度为0.01~0.5%，于16~37℃诱导培养16~36 h，离心收集菌体。

7.根据权利要求2所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述的两步催化法为：在含有底物甜菊糖、蔗糖的反应液中，首先添加共表达UGTSL2和StSUS1的粗酶液，催化合成中间产物莱鲍迪苷E；反应一段时间后再向其中添加共表达UGT76G1和StSUS1的粗酶液，直接催化莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷M。

8.根据权利要求2所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，步骤1）中，底物甜菊甙的起始反应浓度为2~60 g/L，蔗糖与甜菊甙的质量比为1~10，两种粗酶液在反应体系中的总蛋白浓度均为1~25 mg/mL。

9.根据权利要求2所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述催化反应采用水相反应体系，水溶液pH值为6~8。

10.根据权利要求2所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述催化反应的反应温度为20~50℃，前后两阶段反应时间均为1~48 h。