CN106754595A

CN106754595A - 一株重组菌及其在催化莱鲍迪甙a生成莱鲍迪甙d中的应用

Info

Publication number: CN106754595A
Application number: CN201611142783.2A
Authority: CN
Inventors: 李艳; 周芳芳; 陈可泉; 严明; 郝宁; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Xinghua Green Biological Preparation Co ltd
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-12-13
Also published as: CN106754595B

Abstract

本发明公开了一株重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用，所述重组菌中同时含有番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因和马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因，将番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因克隆到pRSFDuet‑1的NdeI与XhoI位点之间，构建得到重组质粒pRSFDuet‑SL2，然后再将马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因克隆到pRSFDuet‑SL2的NcoI和EcoRI位点之间，构建得到重组质粒pRSFDuet‑SL2‑SUS1，将重组质粒pRSFDuet‑SL2‑SUS1转化到宿主细胞中，得到重组菌。将重组菌诱导表达后取粗酶液，加入到反应混合物中催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D，反应中使用重组菌破碎后的粗酶液，避免了酶的分离纯化，也无需制作冻干粉，反应液中不需添加UDP或UDP‑葡萄糖和任何细胞通透剂或其他化学试剂，环境友好性更佳。莱鲍迪甙D的产率高达10.8 g/L。

Description

一株重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用。

背景技术

随着人们对健康的关注意识日益提高，消费者对蔗糖的摄入量逐渐减少，食品工业致力于发展低热值高甜度的天然甜味剂。甜菊糖提取自原产于南美巴拉圭和巴西的多年生菊科草本植物甜叶菊，具有高甜度（为蔗糖的250～300倍）、低热量（仅为蔗糖的1/300）的特性，无毒副作用，无致癌物，食用安全，对高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病、龋齿等病症还有一定的药理作用和辅助疗效。它是继甘蔗糖、甜菜糖之外的第三种有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三糖源”。1998年，美国食品和药物管理局（FDA）同意将甜菊糖添加到食品饮料中。瑞士将甜菊糖列入本国药典作为糖浆剂、口服液或含片的主要甜味剂原料,取代了糖精钠等传统药用甜味剂。相对于日本、美国和瑞士，欧盟批准使用甜菊糖的时间稍晚一些。2008年欧盟正式批准其作为食品添加剂。

由于对甜菊糖的需求量不断增加，许多国家包括日本、新加坡、马来西亚、韩国、中国、以色列、印度、巴西和澳大利亚等都已在商业化种植甜叶菊。甜叶菊的叶子含有多种天然的甜味糖甙如甜菊甙、莱鲍迪A-F、杜尔可甙A和甜茶甙。其中，莱鲍迪甙D虽然不是甜菊糖总甙中的主要糖甙，但其后苦味显著低于莱鲍迪甙A（Chemosens Percept. 6(3): 109–117）。2008年，美国FDA签发了确认莱鲍迪甙A能以最低95%的纯度用作零卡路里甜味剂的“通常认为是安全的”（“GRAS”）通知。莱鲍迪甙D与莱鲍迪甙A结构相似，只相差一个葡萄糖基，甜菊糖苷相关的结构物质的毒性研究也证实莱鲍迪甙D食用安全，可用于食品药品等领域(Int. J. Toxicol. , 2013,32(4):261-273.)。因此，莱鲍迪甙D是比莱鲍迪甙A具有更好味质的潜在天然甜味剂。

植物来源的UDP-糖基转移酶能催化莱鲍迪甙A糖基化生成莱鲍迪甙D，如UGT91D2(US2014/0357588A1)、EUGT11(WO/2013/022989A2)和UGTSL2（US2014/0357588A1,Biomolecules 2014,4:374-389)等。糖基转移酶由于UDP-糖基转移酶所催化的转糖基反应中需要活化的糖基供体UDP-葡萄糖，为了降低成本，通常会采用再生UDP-葡萄糖再生体系，如在体系在加入UDP和蔗糖，在蔗糖合酶的作用下生成UDP-葡萄糖和果糖（Biotechnol.Adv.2016,34(2):88-111.）。专利CN201310353500.9和CN201410019981.4 在以莱鲍迪甙A为底物制备莱鲍迪甙M过程中莱鲍迪甙D为其中间产物或直接用作制备莱鲍迪甙M的底物。反应体系中使用重组细胞，需要添加甲苯或其它细胞通透剂；或使用重组细胞冻干粉，而冻干粉的制备耗能、成本高；此外都需要额外添加UDP作为UDP-葡萄糖再生体系的辅底物。专利CN201410019981.4中虽然对CN201310353500.9的工艺进行了优化、但还需要调配UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶的添加比例，重组菌用量大，产酶成本高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用，构建的重组菌可以共表达番茄来源的UDP-糖基转移酶UGTSL2和马铃薯来源的蔗糖合酶StSUS1，不需要分开表达和制备、也不需要调节两种酶之间的配比，应用于合成莱鲍迪甙D过程中直接使用重组菌破碎后的粗酶液，不需添加UDP或UDP-葡萄糖，以及细胞通透剂或其他化学试剂，简化了工艺过程，收率高。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一株重组菌，所述重组菌中同时含有番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因和马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因，所述番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因序列如SEQ.NO.1所示，其编码的番茄来源糖基转移酶UGTSL2的氨基酸序列如SEQ.NO.3所示，所述马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因序列如SEQ.NO.2所示，其编码的马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1氨基酸序列如SEQ.NO.4所示。

将番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因克隆到pRSFDuet-1的NdeI与XhoI位点之间，构建得到重组质粒pRSFDuet-SL2，然后再将马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因克隆到pRSFDuet-SL2的NcoI和EcoRI位点之间，构建得到重组质粒pRSFDuet-SL2-SUS1，将重组质粒pRSFDuet-SL2-SUS1转化到宿主细胞中，得到重组菌。

所述的重组菌在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用。

将重组菌诱导表达后取粗酶液，加入到反应混合物中催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D，所述反应混合物中包括莱鲍迪甙A、蔗糖和磷酸钠缓冲液。

所述重组菌的诱导表达条件为：将重组菌接种到LB培养基中，于20~37℃、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入诱导培养基中，于200rpm， 20~37℃培养2h，待OD₆₀₀达到0.2左右时转25℃诱导培养22h，离心收集菌体。

所述反应混合物中莱鲍迪甙A浓度为4~10g/L，蔗糖浓度为30~50g/L，粗酶液浓度为2~10g/L，采用磷酸钠缓冲液调节pH为6.4~8；进一步地，优选莱鲍迪甙A浓度为10g/L，蔗糖浓度为30g/L，粗酶液浓度为8g/L，采用磷酸钠缓冲液调节pH为7.2。

所述反应温度为20~55℃，反应时间为2~25 h。

所述LB培养基配方为0.5g/L酵母粉、0.5g/L氯化钠、1g/L胰蛋白胨、0.05g/L卡纳霉素。

所述诱导培养基配方为25g/L酵母粉、15g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠、2g/L葡萄糖、0.05~0.2g/L乳糖。诱导培养基中优选乳糖浓度为0.1g/L。

通过控制反应条件，在30℃，pH7.2，底物莱鲍迪甙A：蔗糖质量比1:3、酶浓度为8mg/mL、反应时间16h时，莱鲍迪甙D摩尔收率提高了1.7倍，达到86%。

有益效果：本发明构建的共表达番茄来源UDP-糖基转移酶UGTSL2和马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1的重组菌作为生物催化剂，不需要分开表达和制备UDP-糖基转移酶与蔗糖合酶，也不需要调节两种酶之间的配比。重组菌可以在-20℃或-80℃保存，反应中使用重组菌破碎后的粗酶液，避免了酶的分离纯化，也无需制作冻干粉，简化了工艺过程。在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D过程中，反应液中不需添加UDP或UDP-葡萄糖，显著降低成本。反应液中不需添加任何细胞通透剂或其他化学试剂，环境友好性更佳。莱鲍迪甙D的产率高达10.8g/L。

附图说明

图1：蔗糖合酶StSUS1与糖基转移酶UGTSL2偶联反应示意图；

图2：反应液样品HPLC检测结果图。

具体实施方式

以下实施例中，莱鲍迪甙D采用液相色谱检测，HPLC在安捷伦AgilentTechnologies 1290 Infinity 液相色谱仪上进行，色谱分析条件如下：

色谱柱：Agilent5TC-C18（Netheriands）250×4.6mm；流动相为0.1%甲酸：乙腈（70:30；V:V）；流速1min/mL；柱温55℃；检测波长：210nm。

莱鲍迪甙D标准品购自上海源叶生物科技有限公司。

实施例1 重组菌株S1的构建

番茄来源糖基转移酶UGTSL2的基因序列如SEQ.NO.1所示，马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因序列如SEQ.NO.2所示，经密码子优化后由南京金斯瑞公司合成。设计引物GGGAATTCCATATGGCGACCAACCTGCG和CCGCTCGAGTTAGTGGTGATGATGGTGATGTTTG扩增UGTSL2基因，将该基因亚克隆到pRSFDuet-1（Novagen）的NdeI与XhoI位点之间，构建重组质粒pRSFDuet-SL2；设计引物TAATAAGGAGATATACCATGGCCGAACGTGTCCTGACCC和AGGCGCGCCGAGCTCGAATTCTTATTCAGCTGCCAGCG，用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒（One Step Cloning Kit，Vazyme）将StSUS1基因亚克隆到pRSFDuet-SL2的NcoI和EcoRI位点之间，构建重组质粒pRSFDuet-SL2-SUS1。以pRSFDuet-SL2-SUS1为模板，设计引物CATGCCATGGCCGAACGTGTC和CCGGAATTCTTATTCAGCTGCCAGCG，将StSUS1基因亚克隆到pET22b(+)（Novagen）的NcoI和EcoRI位点之间，构建重组质粒pET22b-SUS1。将pRSFDuet-SL2-SUS1和pET22b-SUS1转化到大肠杆菌BL21（DE3），获得重组菌BL21（pRSFDuet-SL2-SUS1，pET22b-SUS1），简称S1。分子克隆操作中TransFast Taq DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司，T4 DNA连接酶及限制性内酶均购自大连TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。转化步骤参考《分子克隆实验指南》（（美）J.萨姆布鲁克等著；黄培堂等译；科学出版社有限责任公司；第三版，上册，P91），根据质粒的抗性筛选转化子，再提质粒经酶切验证以确认阳性克隆。

实施例2 重组菌S2的构建

以实施例1中构建的重组质粒pRSFDuet-SL2-SUS1为模板，设计引物AAGGAAAAAAGCGGCCGCTATGGCGACCAACCTGC和CCGGAATTCGTGGTGATGATGGTGATGTTTGCTC扩增UGTSL2基因，将其亚克隆到pET22b(+)（Novagen）的NotI与EcoRI位点之间，构建重组质粒pET22b-SL2。将pRSFDuet-SL2-SUS1和pET22b-SL2转化到大肠杆菌BL21（DE3），获得重组菌BL21（pRSFDuet-SL2-SUS1，pET22b-SL2），简称S2。

实施例3 重组菌S3的构建

将实施例1中构建的pRSFDuet-SL2和pET22b-SUS1转化到大肠杆菌BL21（DE3），获得重组菌BL21（pRSFDuet-SL2，pET22b-SUS1），简称S3。

实施例4 重组菌S4的构建

将实施例1中构建的pRSFDuet-SL2-SUS1转化到大肠杆菌BL21（DE3），获得重组菌BL21（pRSFDuet-SL2-SUS1），简称S4。

实施例5 诱导表达重组酶及粗酶液制备

将重组菌S1~S4分别接种到含有0.05g/L卡纳霉素的5mL LB培养基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化钠，1g/L胰蛋白胨），于37℃、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入含有100mL诱导培养基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，2g/L葡萄糖，0.05g/L乳糖）的500mL摇瓶中，于200rpm， 30℃培养2h，待OD₆₀₀达到0.2左右时转25℃诱导22h离心收集菌体。超声破菌，离心取上清液为粗酶液，置于4℃冰箱待用。

在50mL三角瓶中加入10mL的反应混合物，包含10g/L莱鲍迪甙A（购自曲阜海根甜菊制品有限公司）、50g/L蔗糖、50mM磷酸钠缓冲调节混合物的pH 为7.2，然后分别加入3mg/mL S1~S4的粗酶液，反应在30℃、200rpm条件下进行，反应2-25h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，采用高效液相色谱（HPLC）检测莱鲍迪甙浓度，结果见表1。

表1：

上述 4株菌诱导表达后取粗酶液进行反应，以采用重组菌S4诱导表达后获取粗酶液反应的反应液中莱鲍迪甙D的产量最高，为4.71 g/L。其次是采用菌株S2和S3粗酶的反应液，莱鲍迪甙D浓度为2.87和2.89 g/L，而采用菌株S1粗酶的反应液中莱鲍迪甙D浓度最低（0.98 g/L）。其原因可能是由于株菌S1—S3中都含有两个质粒，诱导表达时菌株负担大，目的蛋白大多以包含体形式存在，难以稳定控制两种重组酶的比例，使其偶联反应不能达到更高的产量。

实施例6 温度对重组菌S4的诱导表达的影响

将重组菌S4接种到含有0.05g/L卡纳霉素的5mL LB培养基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化钠，1g/L胰蛋白胨），37℃条件下、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入含有100mL诱导培养基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，2g/L葡萄糖，0.05g/L乳糖）的500mL摇瓶中，于200rpm，分别在30℃条件下培养2h，待OD₆₀₀达到0.2左右时，分别在20℃，25℃，30℃，37℃诱导22h离心收集菌体，超声破菌，离心取上清液为粗酶液，置于4℃冰箱待用。

分别取不同诱导温度下获取的粗酶液，在温度30℃，pH7.2，莱鲍迪甙A 10g/L，蔗糖30g/L，8mg/mL粗酶液的条件下进行反应，莱鲍迪甙D产量见表2。

表2

温度(℃)	莱鲍迪甙D（g/L）
		20	9.76
25	7.98
		30	5.90
37	0.45

在20℃条件下诱导产酶，其粗酶液合成莱鲍迪甙D产量最高，为9.76 g/L。

实施例7 乳糖浓度对重组菌S4的诱导表达的影响

将重组菌S4接种到含有0.05g/L卡纳霉素的5mL LB培养基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化钠，1g/L胰蛋白胨），37℃条件下、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入含有不同乳糖浓度的100mL诱导培养基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，2g/L葡萄糖，分别为0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L的乳糖浓度）的500mL摇瓶中，于200rpm，分别在30℃条件下培养2h，待OD₆₀₀达到0.2左右时，分别在20℃诱导22h离心收集菌体，超声破菌，离心取上清液为粗酶液，置于4℃冰箱待用。

分别取不同乳糖浓度诱导下获取的粗酶液，在温度30℃，pH7.2，莱鲍迪甙A 10g/L，蔗糖30g/L，8mg/mL粗酶液的条件下进行反应，莱鲍迪甙D产量见表3。

表3

乳糖浓度（g/L）	莱鲍迪甙D（g/L）
		0.02	10.07
0.05	8.0
		0.1	10.78
0.15	10.23
		0.2	10.12

由实施例6和7可以得到重组菌S4的最佳诱导条件为：诱导温度20℃，诱导剂乳糖浓度为0.1g/L。

实施例8

采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应，在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，50g/L蔗糖，pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲，3mg/mL粗酶液，反应在30℃和200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，分别在反应0、2、7、14和25 h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，测得不同时间反应液中莱鲍迪甙D的含量，结果见表4。

表4

时间（h）	莱鲍迪甙D (g/L)
		0	0.13
2	0.98
		7	3.37
14	5.69
		25	6.1

在25 h反应液中莱鲍迪甙D产量最高，这时反应液中莱鲍迪甙D的浓度为6.1 g/L。但14h已经达到了5.69 g/L，可见14 h后，反应进行缓慢，产物积累很少。

实施例9

采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应。在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，50g/L蔗糖，pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲，3mg/mL粗酶液，反应分别在20、30、37、45、55℃和200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，反应14h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，测得不同反应温度下反应液中莱鲍迪甙D的含量，结果见表5。

表5

温度(℃)	莱鲍迪甙D (g/L)
		20	2.75
30	3.82
		37	3.56
45	1.01
		55	0.24

可见在30℃条件下反应液中莱鲍迪甙D产量最高，这时反应液中莱鲍迪甙D的浓度为3.82g/L。

实施例10

采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应。在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，50g/L蔗糖，3mg/mL粗酶液，50mM磷酸钠缓冲pH分别配置为6.4、6.8、7.2、7.6和8，反应在30℃、200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，反应14h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，测得不同反应pH下反应液中莱鲍迪甙D的含量，结果见表6。

表6

pH	莱鲍迪甙D（g/L）
		6.4	2.83
6.8	5.55
		7.2	5.83
7.6	3.65
		8.0	3.31

测得在pH 7.2条件下反应液中莱鲍迪甙D产量最高，这时反应液中莱鲍迪甙D的浓度为5.83g/L。

实施例11

采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应。在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，质量比分别为1：1、1：3、1：5、1：7和1：10的蔗糖，pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲，3mg/mL粗酶液，反应在30℃、200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，反应14h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，测得不同底物浓度配比下反应液中莱鲍迪甙D的含量，结果见表7。

表7

莱鲍迪甙A:蔗糖	莱鲍迪甙D(g/L)
		1:1	3.60
1:3	4.07
		1:5	3.82
1:7	3.38
		1:10	3.50

当莱鲍迪甙A与蔗糖的质量比为1：3时反应液中莱鲍迪甙D产量最高，为4.07g/L。

实施例12

采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应。在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，50g/L蔗糖，pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲，粗酶液蛋白浓度分别为2、4、6、8和10 mg/mL，反应在30℃、200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，反应14h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，测得不同粗酶液浓度下反应液中莱鲍迪甙D的含量，结果见表8。

表8

酶浓度（g/L）	莱鲍迪甙D（g/L）
		2	1.45
4	3
		6	4.93
8	8.2
		10	8.2

当粗酶液蛋白浓度为8和10 mg/mL时反应液中莱鲍迪甙D产量最高，为8.2g/L。

由实施例8-12可知，最佳反应条件为：

采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应。在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，30g/L蔗糖，pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲，粗酶液蛋白浓度8 mg/mL，反应在30℃、200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，反应16h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，反应液中莱鲍迪甙D产量最高，为10.8 g/L，产率为86%。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京工业大学

<120> 一株重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgacca acctgcgtgt gctgatgttc ccgtggctgg cgtacggtca catcagcccg 60

tttctgaaca ttgcgaaaca gctggcggat cgtggcttcc tgatctacct gtgcagcacc 120

cgtattaacc tggagagcat cattaagaaa atcccggaaa agtatgcgga cagcatccac 180

ctgattgagc tgcaactgcc ggagctgccg gaactgccgc cgcactatca caccaccaac 240

ggtctgccgc cgcacctgaa cccgaccctg cacaaggcgc tgaaaatgag caagccgaac 300

tttagccgta tcctgcagaa cctgaaaccg gatctgctga tttacgacgt gctgcagccg 360

tgggcggagc acgttgcgaa cgaacaaaac attccggcgg gtaaactgct gaccagctgc 420

gcggcggtgt tcagctattt ctttagcttt cgtaagaacc cgggcgttga gttcccgttt 480

ccggcgatcc acctgccgga agtggaaaag gttaaaatcc gtgagattct ggcgaaagaa 540

ccggaggaag gtggccgtct ggatgagggt aacaagcaga tgatgctgat gtgcaccagc 600

cgtaccatcg aggcgaaata cattgactat tgcaccgaac tgtgcaactg gaaggtggtt 660

ccggtgggtc cgccgttcca agatctgatc accaacgatg cggacaacaa agagctgatt 720

gactggctgg gtaccaagca cgaaaacagc accgtgttcg ttagctttgg cagcgagtac 780

ttcctgagca aagaagatat ggaggaagtt gcgtttgcgc tggagctgag caacgtgaac 840

ttcatctggg ttgcgcgttt tccgaaaggc gaggaacgta acctggaaga tgcgctgccg 900

aagggcttcc tggagcgtat tggtgaacgt ggccgtgtgc tggacaagtt tgcgccgcag 960

ccgcgtatcc tgaaccaccc gagcaccggt ggcttcatta gccactgcgg ttggaacagc 1020

gcgatggaga gcatcgattt tggcgttccg atcattgcga tgccgatcca caacgaccaa 1080

ccgattaacg cgaaactgat ggtggagctg ggtgtggcgg ttgaaatcgt tcgtgacgat 1140

gacggtaaaa tccaccgtgg cgagattgcg gaaaccctga agagcgtggt taccggcgag 1200

accggcgaaa ttctgcgtgc gaaagtgcgt gaaatcagca aaaacctgaa gagcattcgt 1260

gatgaggaaa tggacgcggt tgcggaggaa ctgatccaac tgtgccgtaa cagcaacaag 1320

agcaaataa 1329

<210> 2

<211> 2418

<212> DNA

<213> 人工序列

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gctgcccacc gtaatgaaat cctgctgttt ctgagtcgta ttgaaagcca cggcaaaggt 120

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aaactgaacg aacatgcatt cgaagaactg ctgaaaagca cccaagaagc tatcgtcctg 240

ccgccgtggg tggcactggc aattcgtctg cgcccgggcg tttgggaata catccgtgtt 300

aacgtcaatg cgctggttgt ggaagaactg agtgtgccgg aatatctgca gtttaaagaa 360

gaactggtcg atggcgcgtc caacggtaat ttcgtgctgg aactggactt tgaaccgttc 420

accgcctcat ttccgaaacc gaccctgacg aaatcgattg gcaacggtgt tgaatttctg 480

aatcgtcatc tgagcgccaa aatgttccac gataaagaat ctatgacccc gctgctggaa 540

tttctgcgcg cacatcacta taaaggtaaa accatgatgc tgaacgatcg tattcagaac 600

agcaatacgc tgcaaaatgt gctgcgcaaa gcggaagaat acctgatcat gctgccgccg 660

gaaaccccgt acttcgaatt tgaacataaa ttccaggaaa ttggcctgga aaaaggctgg 720

ggtgatacgg cagaacgtgt gctggaaatg gtttgcatgc tgctggatct gctggaagct 780

ccggacagct gtaccctgga aaaatttctg ggtcgcattc cgatggtttt caacgtcgtg 840

atcctgtctc cgcacggcta ttttgcgcag gaaaatgtcc tgggttaccc ggataccggc 900

ggtcaggttg tctatattct ggaccaagtg ccggccctgg aacgtgaaat gctgaaacgc 960

atcaaagaac agggcctgga tattatcccg cgtattctga tcgtcacccg tctgctgccg 1020

gacgcagtgg gcaccacgtg cggtcaacgt attgaaaaag tgtatggcgc tgaacattca 1080

cacatcctgc gtgttccgtt tcgcaccgaa aaaggtattg tccgtaaatg gatctcgcgc 1140

tttgaagtgt ggccgtacat ggaaacgttc attgaagatg ttgcaaaaga aatctcagcg 1200

gaactgcagg ccaaaccgga cctgattatc ggcaactata gcgaaggtaa tctggcggcc 1260

tctctgctgg cccataaact gggcgtgacc caatgtacga ttgcacacgc tctggaaaaa 1320

accaaatatc cggattcgga catctactgg aaaaaattcg atgaaaaata ccatttcagc 1380

tctcagttca ccgcagatct gattgctatg aaccacacgg actttattat caccagtacg 1440

ttccaggaaa tcgcgggctc caaagatacc gtgggtcaat acgaaagtca tatggccttt 1500

acgatgccgg gcctgtatcg cgtggttcac ggtatcaacg ttttcgatcc gaaattcaac 1560

attgtctccc cgggtgcaga catcaatctg tatttttcat actcggaaac cgaaaaacgt 1620

ctgacggctt tccatccgga aatcgatgaa ctgctgtata gcgatgtgga aaacgacgaa 1680

cacctgtgcg ttctgaaaga tcgcaccaaa ccgattctgt ttacgatggc gcgtctggac 1740

cgcgttaaaa atctgaccgg cctggtcgaa tggtacgcca aaaacccgcg tctgcgcggt 1800

ctggtgaatc tggtcgtggt tggcggtgat cgtcgcaaag aatctaaaga cctggaagaa 1860

caggcggaaa tgaagaaaat gtacgaactg atcgaaaccc ataacctgaa tggccagttc 1920

cgttggatca gttcccaaat gaaccgtgtt cgcaatggcg aactgtatcg ctacatcgca 1980

gatacgaaag gtgcttttgt ccagccggcg ttttacgaag ccttcggcct gaccgtcgtg 2040

gaagcgatga cgtgcggtct gccgaccttc gcaacgaatc atggcggccc ggcagaaatt 2100

atcgttcacg gcaaaagtgg ttttcatatt gatccgtatc acggcgaaca ggcagctgat 2160

ctgctggccg actttttcga aaaatgtaaa aaagacccgt cacattggga aaccatttcg 2220

atgggcggtc tgaaacgcat cgaagaaaaa tatacctggc aaatttacag cgaatctctg 2280

ctgacgctgg cggccgtgta cggtttctgg aaacacgttt ctaaactgga tcgtctggaa 2340

attcgtcgct atctggaaat gttttatgcg ctgaaatacc gcaaaatggc ggaagccgtg 2400

ccgctggcag ctgaataa 2418

<210> 3

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Thr Asn Leu Arg Val Leu Met Phe Pro Trp Leu Ala Tyr Gly

1 5 10 15

His Ile Ser Pro Phe Leu Asn Ile Ala Lys Gln Leu Ala Asp Arg Gly

20 25 30

Phe Leu Ile Tyr Leu Cys Ser Thr Arg Ile Asn Leu Glu Ser Ile Ile

35 40 45

Lys Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ala Asp Ser Ile His Leu Ile Glu Leu

50 55 60

Gln Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn

65 70 75 80

Gly Leu Pro Pro His Leu Asn Pro Thr Leu His Lys Ala Leu Lys Met

85 90 95

Ser Lys Pro Asn Phe Ser Arg Ile Leu Gln Asn Leu Lys Pro Asp Leu

100 105 110

Leu Ile Tyr Asp Val Leu Gln Pro Trp Ala Glu His Val Ala Asn Glu

115 120 125

Gln Asn Ile Pro Ala Gly Lys Leu Leu Thr Ser Cys Ala Ala Val Phe

130 135 140

Ser Tyr Phe Phe Ser Phe Arg Lys Asn Pro Gly Val Glu Phe Pro Phe

145 150 155 160

Pro Ala Ile His Leu Pro Glu Val Glu Lys Val Lys Ile Arg Glu Ile

165 170 175

Leu Ala Lys Glu Pro Glu Glu Gly Gly Arg Leu Asp Glu Gly Asn Lys

180 185 190

Gln Met Met Leu Met Cys Thr Ser Arg Thr Ile Glu Ala Lys Tyr Ile

195 200 205

Asp Tyr Cys Thr Glu Leu Cys Asn Trp Lys Val Val Pro Val Gly Pro

210 215 220

Pro Phe Gln Asp Leu Ile Thr Asn Asp Ala Asp Asn Lys Glu Leu Ile

225 230 235 240

Asp Trp Leu Gly Thr Lys His Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe

245 250 255

Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp Met Glu Glu Val Ala Phe

260 265 270

Ala Leu Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Ala Arg Phe Pro

275 280 285

Lys Gly Glu Glu Arg Asn Leu Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe Leu

290 295 300

Glu Arg Ile Gly Glu Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln

305 310 315 320

Pro Arg Ile Leu Asn His Pro Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys

325 330 335

Gly Trp Asn Ser Ala Met Glu Ser Ile Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile

340 345 350

Ala Met Pro Ile His Asn Asp Gln Pro Ile Asn Ala Lys Leu Met Val

355 360 365

Glu Leu Gly Val Ala Val Glu Ile Val Arg Asp Asp Asp Gly Lys Ile

370 375 380

His Arg Gly Glu Ile Ala Glu Thr Leu Lys Ser Val Val Thr Gly Glu

385 390 395 400

Thr Gly Glu Ile Leu Arg Ala Lys Val Arg Glu Ile Ser Lys Asn Leu

405 410 415

Lys Ser Ile Arg Asp Glu Glu Met Asp Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile

420 425 430

Gln Leu Cys Arg Asn Ser Asn Lys Ser Lys

435 440

<210> 4

<211> 805

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ala Glu Arg Val Leu Thr Arg Val His Ser Leu Arg Glu Arg Val

1 5 10 15

Asp Ala Thr Leu Ala Ala His Arg Asn Glu Ile Leu Leu Phe Leu Ser

20 25 30

Arg Ile Glu Ser His Gly Lys Gly Ile Leu Lys Pro His Glu Leu Leu

35 40 45

Ala Glu Phe Asp Ala Ile Arg Gln Asp Asp Lys Asn Lys Leu Asn Glu

50 55 60

His Ala Phe Glu Glu Leu Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Val Leu

65 70 75 80

Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Ile Arg Leu Arg Pro Gly Val Trp Glu

85 90 95

Tyr Ile Arg Val Asn Val Asn Ala Leu Val Val Glu Glu Leu Ser Val

100 105 110

Pro Glu Tyr Leu Gln Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Ala Ser Asn

115 120 125

Gly Asn Phe Val Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Thr Ala Ser Phe

130 135 140

Pro Lys Pro Thr Leu Thr Lys Ser Ile Gly Asn Gly Val Glu Phe Leu

145 150 155 160

Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Met Phe His Asp Lys Glu Ser Met Thr

165 170 175

Pro Leu Leu Glu Phe Leu Arg Ala His His Tyr Lys Gly Lys Thr Met

180 185 190

Met Leu Asn Asp Arg Ile Gln Asn Ser Asn Thr Leu Gln Asn Val Leu

195 200 205

Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Ile Met Leu Pro Pro Glu Thr Pro Tyr

210 215 220

Phe Glu Phe Glu His Lys Phe Gln Glu Ile Gly Leu Glu Lys Gly Trp

225 230 235 240

Gly Asp Thr Ala Glu Arg Val Leu Glu Met Val Cys Met Leu Leu Asp

245 250 255

Leu Leu Glu Ala Pro Asp Ser Cys Thr Leu Glu Lys Phe Leu Gly Arg

260 265 270

Ile Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly Tyr Phe

275 280 285

Ala Gln Glu Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln Val Val

290 295 300

Tyr Ile Leu Asp Gln Val Pro Ala Leu Glu Arg Glu Met Leu Lys Arg

305 310 315 320

Ile Lys Glu Gln Gly Leu Asp Ile Ile Pro Arg Ile Leu Ile Val Thr

325 330 335

Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Gln Arg Ile Glu

340 345 350

Lys Val Tyr Gly Ala Glu His Ser His Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg

355 360 365

Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu Val Trp

370 375 380

Pro Tyr Met Glu Thr Phe Ile Glu Asp Val Ala Lys Glu Ile Ser Ala

385 390 395 400

Glu Leu Gln Ala Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser Glu Gly

405 410 415

Asn Leu Ala Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr Gln Cys

420 425 430

Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Asp Ile

435 440 445

Tyr Trp Lys Lys Phe Asp Glu Lys Tyr His Phe Ser Ser Gln Phe Thr

450 455 460

Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr Ser Thr

465 470 475 480

Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Asp Thr Val Gly Gln Tyr Glu Ser

485 490 495

His Met Ala Phe Thr Met Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His Gly Ile

500 505 510

Asn Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala Asp Ile

515 520 525

Asn Leu Tyr Phe Ser Tyr Ser Glu Thr Glu Lys Arg Leu Thr Ala Phe

530 535 540

His Pro Glu Ile Asp Glu Leu Leu Tyr Ser Asp Val Glu Asn Asp Glu

545 550 555 560

His Leu Cys Val Leu Lys Asp Arg Thr Lys Pro Ile Leu Phe Thr Met

565 570 575

Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Leu Thr Gly Leu Val Glu Trp Tyr

580 585 590

Ala Lys Asn Pro Arg Leu Arg Gly Leu Val Asn Leu Val Val Val Gly

595 600 605

Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Ala Glu Met

610 615 620

Lys Lys Met Tyr Glu Leu Ile Glu Thr His Asn Leu Asn Gly Gln Phe

625 630 635 640

Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asn Arg Val Arg Asn Gly Glu Leu Tyr

645 650 655

Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Lys Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala Phe Tyr

660 665 670

Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly Leu Pro

675 680 685

Thr Phe Ala Thr Asn His Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val His Gly

690 695 700

Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly Glu Gln Ala Ala Asp

705 710 715 720

Leu Leu Ala Asp Phe Phe Glu Lys Cys Lys Lys Asp Pro Ser His Trp

725 730 735

Glu Thr Ile Ser Met Gly Gly Leu Lys Arg Ile Glu Glu Lys Tyr Thr

740 745 750

Trp Gln Ile Tyr Ser Glu Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ala Val Tyr Gly

755 760 765

Phe Trp Lys His Val Ser Lys Leu Asp Arg Leu Glu Ile Arg Arg Tyr

770 775 780

Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Lys Met Ala Glu Ala Val

785 790 795 800

Pro Leu Ala Ala Glu

805

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggaattcca tatggcgacc aacctgcg 28

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgctcgagt tagtggtgat gatggtgatg tttg 34

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taataaggag atataccatg gccgaacgtg tcctgaccc 39

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggcgcgccg agctcgaatt cttattcagc tgccagcg 38

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catgccatgg ccgaacgtgt c 21

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccggaattct tattcagctg ccagcg 26

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaggaaaaaa gcggccgcta tggcgaccaa cctgc 35

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccggaattcg tggtgatgat ggtgatgttt gctc 34

Claims

1.一株重组菌，其特征在于，所述重组菌中同时含有番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因和马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因，所述番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因序列如SEQ.NO.1所示，所述马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因序列如SEQ.NO.2所示。

2.权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征在于，将番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因克隆到pRSFDuet-1的NdeI与XhoI位点之间，构建得到重组质粒pRSFDuet-SL2，然后再将马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因克隆到pRSFDuet-SL2的NcoI和EcoRI位点之间，构建得到重组质粒pRSFDuet-SL2-SUS1，将重组质粒pRSFDuet-SL2-SUS1转化到宿主细胞中，得到重组菌。

3.权利要求1所述的重组菌在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将重组菌诱导表达后取粗酶液，加入到反应混合物中催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D，所述反应混合物中包括莱鲍迪甙A、蔗糖和磷酸钠缓冲液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组菌的诱导表达条件为：将重组菌接种到LB培养基中，于20~37℃、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入诱导培养基中，于200rpm， 20~37℃培养2h，待OD₆₀₀达到0.2左右时转25℃诱导培养22h，离心收集菌体。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述反应混合物中莱鲍迪甙A浓度为4~10g/L，蔗糖浓度为30~50g/L，粗酶液浓度为2~10g/L，采用磷酸钠缓冲液调节pH为6.4~8。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述反应温度为20~55℃，反应时间为2~25h。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述LB培养基配方为0.5g/L酵母粉、0.5g/L氯化钠、1g/L胰蛋白胨、0.05g/L卡纳霉素。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述诱导培养基配方为25g/L酵母粉、15g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠、2g/L葡萄糖、0.05~0.2g/L乳糖。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应混合物中莱鲍迪甙A浓度为10g/L，蔗糖浓度为30g/L，粗酶液浓度为8g/L，采用磷酸钠缓冲液调节pH为7.2。