CN107602687B - 肌钙蛋白的保存剂及保存组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肌钙蛋白的保存剂及保存组合物，保存剂中含有溶剂以及在溶剂中的1‑苯基‑2,3‑二甲基‑4‑二甲氨基吡唑酮、三(2‑羧乙基)膦盐酸盐、十六烷基二甲基烯丙基氯化铵、离子螯合剂、蛋白保护剂和糖类物质。经过多次实验研究，反复测试和验证，上述配方的保存剂能够提高肌钙蛋白的稳定性，在该保存剂中保存的肌钙蛋白不容易变性，适合肌钙蛋白的长期保存。

Description

肌钙蛋白的保存剂及保存组合物

技术领域

本发明涉及生物试剂领域，特别是涉及一种肌钙蛋白的保存剂及保存组合物。

背景技术

肌钙蛋白是一种横纹肌的结构蛋白，存在于肌原纤维的细丝中，与原肌球蛋白一起通过调节钙离子对横纹肌肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用。肌钙蛋白能够调节心肌和骨骼肌的收缩和舒张。肌钙蛋白分子呈球形，一般分为三种亚型：肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白T(TnT)和肌钙蛋白C(TnC)。

由于肌钙蛋白特异地分布于心肌组织中，因此常将肌钙蛋白作为心肌损伤的高敏感和特异性标志物，心肌肌钙蛋白对于检测急性冠状动脉综合征患者心肌缺血及危险分级具有重要意义。目前，心肌肌钙蛋白已成为诊断心肌梗死的首要标志物，也是独立于心电图之外可用于判断梗死灶范围大小及预后的重要血清学指标。

临床上对肌钙蛋白的检测方法主要是免疫方法，根据其技术特点不同由可以分为：酶联免疫吸附免疫法、化学发光免疫法、荧光分析免疫法，金标免疫法、免疫比浊法、飞行质谱法和生物传感器法等。无论采用那一种免疫方法来对临床样本(包括血清、血浆、全血)中的肌钙蛋白浓度的测定，例如用化学发光法或者ELISA方法检测肌钙蛋白蛋白时，都需要用相应的肌钙蛋白标准品对检测方法进行校准。

然而，肌钙蛋白标准品保存的过程中，由于蛋白酶水解作用、磷酸化作用、肝素的作用，标准品中的肌钙蛋白容易被蛋白酶水解，存在稳定性较差的问题。很多诊断试剂开发厂家在开发肌钙蛋白项目时也会遇到肌钙蛋白保存稳定性较差的问题。

综上，用传统的试剂保存肌钙蛋白时，肌钙蛋白容易变性，不适合肌钙蛋白的长期保存。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够使得肌钙蛋白不容易变性的保存剂。

此外，还提供一种能够用于保存肌钙蛋白的保存组合物。

一种肌钙蛋白的保存剂，所述保存剂中含有溶剂和如下组分：

其中，所述离子螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的至少一种，所述蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白和明胶中的至少一种，所述糖类物质选自甘露醇、葡萄糖和蔗糖中的至少一种。

上述肌钙蛋白的保存剂，含有溶剂以及在溶剂中的1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、十六烷基二甲基烯丙基氯化铵、离子螯合剂、蛋白保护剂和糖类物质。经过多次实验研究，反复测试和验证，上述配方的保存剂能够提高肌钙蛋白的稳定性，在该保存剂中保存的肌钙蛋白不容易变性，适合肌钙蛋白的长期保存。

在其中一个实施例中，所述保存剂中还含有浓度为5mg/mL～16mg/mL的无机盐，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁和硫酸钾中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述保存剂中还含有体积分数为0.5％～8％的促溶剂，所述促溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述保存剂中还含有浓度为1mg/mL～10mg/mL的pH值缓冲剂，所述pH值缓冲剂中含有磷酸氢二钠和柠檬酸，所述磷酸氢二钠和所述柠檬酸的摩尔比为1～3:0.6～1。

在其中一个实施例中，所述保存剂的pH值为5.2～5.6。

在其中一个实施例中，所述保存剂中还含有浓度为0.1mg/mL～1mg/mL的抑菌剂。

在其中一个实施例中，所述溶剂为水。

一种肌钙蛋白的保存组合物，按质量份数计，所述保存组合物包括：

其中，所述离子螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的至少一种，所述蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白和明胶中的至少一种，所述糖类物质选自甘露醇、葡萄糖和蔗糖中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述保存组合物还包括5份～16份的无机盐，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁和硫酸钾中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述保存组合物还包括1份～10份的pH值缓冲剂，所述pH值缓冲剂中含有磷酸氢二钠和柠檬酸，所述磷酸氢二钠和所述柠檬酸的摩尔比为1～3:0.6～1。

附图说明

图1为用实施例1的保存剂稀释肌钙蛋白I(TnI)标准品制作的标准曲线；

图2为用对比例1的试剂稀释肌钙蛋白I(TnI)标准品制作的标准曲线；

图3为低浓度的肌钙蛋白I分别在对比例1的试剂和实施例1的保存剂中保存后浓度随时间变化的对比图；

图4为高浓度的肌钙蛋白I分别在对比例1的试剂和实施例1的保存剂中保存后浓度随时间变化的对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的肌钙蛋白的保存剂，该保存剂中含有溶剂以及如下组分：

其中，离子螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的至少一种，蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白和明胶中的至少一种，糖类物质选自甘露醇、葡萄糖和蔗糖中的至少一种。

在其中一个实施方式中，溶剂为水，各组分均匀溶解在水中，从而形成该肌钙蛋白的保存剂。

具体地，1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮在强酸强碱环境下能保持稳定，但对光和氧化剂较肌钙蛋白要敏感，有效保护肌钙蛋白中的吡唑结构不被氧化，使得置于该保存剂中的肌钙蛋白稳定性增强，不容易变性。

三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)溶解性好，且带有异氰酸酯基官能团，能够对二硫化物的选择性还原，防止肌钙蛋白发生降解，增强稳定性。

十六烷基二甲基烯丙基氯化铵在溶液中能够促进肌钙蛋白分散，提高肌钙蛋白的分散性和均一性，避免肌钙蛋白结团和沉淀。

保存剂中的1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮(0.1mg/mL～50mg/mL)和三(2-羧乙基)膦盐酸盐(0.5mg/mL～30mg/mL)两者按一定浓度比例配合，使得储存在保存剂中的肌钙蛋白被氧化或降解的几率减少，肌钙蛋白不容易变性。

进一步地，保存剂中的1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮(0.1mg/mL～50mg/mL)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐十六烷基二甲基烯丙基氯化铵(0.5mg/mL～30mg/mL)和十六烷基二甲基烯丙基氯化铵(0.1mg/mL～1mg/mL)三者按一定浓度比例配合，使得肌钙蛋白能够均匀分散在保存剂中，且储存在该保存剂中的肌钙蛋白被氧化或降解的几率减少，提高长期保存肌钙蛋白的稳定性。

具体地，离子螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的至少一种。离子螯合剂可以和溶液中的金属离子的螯合，抑制蛋白水解酶的活性，避免肌钙蛋白被水解。

具体地，蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白和明胶中的至少一种。蛋白保护剂可以减少保存剂中的肌钙蛋白被氧化。特别是针对低浓度的肌钙蛋白具有良好的保护作用。

具体地，糖类物质选自甘露醇、葡萄糖和蔗糖中的至少一种。糖类物质分子量较小，对于小分子物质具有维稳的作用。

在其中一个实施方式中，该保存剂中还含有浓度为5mg/mL～16mg/mL的无机盐，无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁和硫酸钾中的至少一种。一定浓度的无机盐能够调节溶液中的盐离子浓度，使得肌钙蛋白不容易变性。

在其中一个实施方式中，该保存剂中还含有体积分数为0.5％～8％的促溶剂，促溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。一定体积分数的促溶剂能够促进1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、十六烷基二甲基烯丙基氯化铵等物质在溶剂中溶解，提高保存剂的均匀性，从而适宜长期稳定的保存肌钙蛋白。

在其中一个实施方式中，保存剂中还含有浓度为1mg/mL～10mg/mL的pH值缓冲剂。pH值缓冲剂中含有磷酸氢二钠和柠檬酸，磷酸氢二钠和柠檬酸的摩尔比为1～3:0.6～1。pH值缓冲剂使得保存剂维持一定的pH值，防止肌钙蛋白因pH变化而变性。含有磷酸氢二钠和柠檬酸的pH值缓冲剂对溶液的pH变化缓冲作用好，使得保存剂维持在相对稳定的pH值范围内，不因外部环境变化而产生大变动。

具体地，在制备保存剂的过程中，先将磷酸氢二钠和柠檬酸分别配置成溶液的形式，再按体积添加，提高配置的保存剂的浓度准确性。

进一步地，保存剂的pH值为5.2～5.6。通过发明人的大量的研究和试验证明，在pH值为5.2～5.6的条件下，肌钙蛋白的稳定性好。

具体地，保存剂中含有浓度为1mg/mL～10mg/mL的pH值缓冲剂。pH值缓冲剂中含有磷酸氢二钠和柠檬酸，磷酸氢二钠和柠檬酸的摩尔比为1～3:0.6～1，使得保存剂的pH值能够稳定维持在5.2～5.6之间，提高保存的肌钙蛋白的稳定性。

当然，可以理解，在其它实施方式中，pH值缓冲剂也还可以是其他的缓冲溶液，如氢氧化钠等。

在其中一个实施方式中，保存剂中还含有浓度为0.1mg/mL～1mg/mL的抑菌剂。抑菌剂能够防止肌钙蛋白发生霉变。

具体地，抑菌剂选自叠氮钠和PC-300中的至少一种。

在其中一个实施方式中，保存剂中含有浓度为1mg/mL～30mg/mL的1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮、浓度为1mg/mL～10mg/mL的三(2-羧乙基)膦盐酸盐、浓度为0.3mg/mL～1mg/mL的十六烷基二甲基烯丙基氯化铵、浓度为0.3mg/mL～1mg/mL的离子螯合剂、浓度为3mg/mL～8mg/mL的蛋白保护剂、浓度为8mg/mL～20mg/mL的糖类物质、浓度为6mg/mL～10mg/mL的无机盐、体积分数为1％～5％的促溶剂、浓度为1mg/mL～10mg/mL的pH值缓冲剂、浓度为0.1mg/mL～1mg/mL的抑菌剂。

具体地，该肌钙蛋白的保存剂适用于肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白T(TnT)和肌钙蛋白C(TnC)的保存。无论是天然的于肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白T(TnT)和肌钙蛋白C(TnC)，还是通过基因工程获得的肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白T(TnT)和肌钙蛋白C(TnC)均能在该保存剂中稳定长期保存。

上述肌钙蛋白的保存剂，含有溶剂以及在溶剂中的1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、十六烷基二甲基烯丙基氯化铵、离子螯合剂、蛋白保护剂和糖类物质。经过多次实验研究，反复测试和验证，上述配方的保存剂能够提高肌钙蛋白的稳定性，在该保存剂中保存的肌钙蛋白不容易变性，适合肌钙蛋白的长期保存。

一实施方式的肌钙蛋白的保存组合物按质量份数计，该保存组合物包括：

其中，离子螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的至少一种，蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白和明胶中的至少一种，糖类物质选自甘露醇、葡萄糖和蔗糖中的至少一种。

该保存组合物能够按一定浓度溶解在水中，从而形成肌钙蛋白的保存剂。

在其中一个实施方式中，该保存组合物中还包括5份～16份的无机盐，无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁和硫酸钾中的至少一种。

在其中一个实施方式中，该保存组合物中还包括1份～10份的pH值缓冲剂。具体地，pH值缓冲剂中含有磷酸氢二钠和柠檬酸，磷酸氢二钠和柠檬酸的摩尔比为1～3:0.6～1。

在其中一个实施方式中，组合物中还包括0.1份～1份的抑菌剂。抑菌剂选自叠氮钠和PC-300中的至少一种。

具体地，组合物中的1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、十六烷基二甲基烯丙基氯化铵、离子螯合剂、蛋白保护剂、糖类物质、无机盐、pH值缓冲剂、抑菌剂等的作用可以参见上文的描述，在此不作赘述。

上述组合物中含有1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、十六烷基二甲基烯丙基氯化铵、离子螯合剂、蛋白保护剂和糖类物质。经过多次实验研究，反复测试和验证，上述配方的组合物各组分相互配合能够提高肌钙蛋白的稳定性，使得肌钙蛋白不容易变性。

以下结合具体实施例进行说：

以下实施例中，如未特殊说明，各实施例不包括未提及的除不可避免的杂质以外的其他组分。所有组分均可购买获得。

实施例1

一种肌钙蛋白的保存剂，配方见表1。

表1：实施例1的保存剂的配方

将上述各组分溶解在水中，得到肌钙蛋白的保存剂，微调pH值至5.5。

将肌钙蛋白I溶解在该保存剂中，测的肌钙蛋白I的浓度为1000pg/mL，七天后再次检测，肌钙蛋白的浓度为995pg/mL。说明肌钙蛋白能够稳定储存在该保存剂中，肌钙蛋白不容易变性，稳定性好。

实施例2

一种肌钙蛋白的保存剂，配方见表2。

表2：实施例2的保存剂的配方

将上述各组分溶解在水中，得到肌钙蛋白的保存剂，微调pH值至5.6。

将肌钙蛋白T溶解在该保存剂中，测的肌钙蛋白T的浓度为1000pg/mL，七天后再次检测，肌钙蛋白的浓度为950pg/mL。说明肌钙蛋白能够稳定储存在该保存剂中，肌钙蛋白不容易变性，稳定性好。

实施例3

一种肌钙蛋白的保存剂，配方见表3。

表3：实施例3的保存剂的配方

将上述各组分溶解在水中，得到肌钙蛋白的保存剂，微调pH值至5.4。

将肌钙蛋白C溶解在该保存剂中，测的肌钙蛋白C的浓度为1000pg/mL，七天后再次检测，肌钙蛋白的浓度为960pg/mL。说明肌钙蛋白能够稳定储存在该保存剂中，肌钙蛋白不容易变性，稳定性好。

实施例4

一种肌钙蛋白的保存剂，配方见表4。

表4：实施例4的保存剂的配方

将上述各组分溶解在水中，得到肌钙蛋白的保存剂，微调pH值至5.4。

将肌钙蛋白I溶解在该保存剂中，测的肌钙蛋白I的浓度为1000pg/mL，七天后再次检测，肌钙蛋白的浓度为970pg/mL。说明肌钙蛋白能够稳定储存在该保存剂中，肌钙蛋白不容易变性，稳定性好。

对比例1

一种保存剂，配方见表5。

表5：对比例1的保存剂的配方

组分	用量	浓度
			牛血清白蛋白	500mg	5mg/mL
氯化钠	900mg	9mg/mL
			磷酸氢二钠	500mg	5mg/mL
PC-300	100mg	1mg/mL
			水	加至100mL	/

测试例一

用实施例1的保存剂稀释肌钙蛋白I(TnI)标准品，稀释浓度分别为5000pg/mL、2500pg/mL、500pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、10pg/mL、0pg/mL。

采用双抗体夹心法原理检测实施例1的保存剂稀释的肌钙蛋白I标准品，并制备标准曲线。

具体方法如下：

(1)用肌钙蛋白I抗体包被羧基磁珠(包被浓度为50μg/mg)，得到磁珠偶联抗体。将磁珠偶联抗体稀释至0.4mg/mL。

(2)用辣根过氧化物酶标记肌钙蛋白I抗体(标记摩尔比为1:1)，得到抗体-酶结合物，将抗体-酶结合物稀释至1μg/mL。

(3)取各个稀释浓度的肌钙蛋白I(TnI)标准品50μL，分别加入50μL磁珠偶联抗体和50μL抗体-酶结合物，混匀后在37摄氏度反应15分钟。在磁场中，用清洗液清洗取出未反应的酶标记抗体。加入发光底物A(主要成分为鲁米诺)和底物B(主要成分为过氧化脲)，各50μL。混匀后1分钟检测发光强度，每个浓度重复测试3次取均值计算，以浓度为纵坐标以发光值为横坐标作图，得到检测肌钙蛋白I的标准曲线如图1所示。将0pg/mL的点重复测试20次，取发光值均值+2SD所对应的发光值，代入上述标准曲线中，计算得到的浓度为分析灵敏度，测试得到的灵敏度为5.2pg/mL。说明实施例1的保存剂用于稀释肌钙蛋白时，稳定性好，本底低，不影响肌钙蛋白的检测。

用对比例1的保存剂稀释肌钙蛋白I(TnI)标准品，稀释浓度分别为5000pg/mL、2500pg/mL、500pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、10pg/mL、0pg/mL。采用相同的方法检测对比例1的试剂稀释的肌钙蛋白I标准品，并制备标准曲线，结果如图2所示。将0pg/mL的点重复测试20次，取发光值均值+2SD所对应的发光值，代入上述标准曲线中，计算得到的浓度为分析灵敏度，测试得到的灵敏度为5.8pg/mL。

对比图1和图2，用实施例1的保存剂稀释的肌钙蛋白I标准品测试得到的灵敏度为5.2pg/mL，而用对比例1的试剂稀释的肌钙蛋白I标准品测试得到的灵敏度为5.8pg/mL。实施例1的保存剂用于稀释肌钙蛋白I时，本底低，检测更加灵敏。

测试例二

稳定性评估

评价用本发明的保存剂保存的肌钙蛋白I标准品的稳定性情况。

分别用实施例1～实施例4的保存剂以及对比例1的试剂稀释保存肌钙蛋白I标准品，每组分为两个浓度：50pg/mL和2500pg/mL。每个浓度分装20个管，密封。取其中一半放置到37度恒温孵育箱中做热处理实验，剩下一半放置到负20度的冰箱中保存。

分别在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天考核热处理加速稳定性，取放置到37度恒温孵育箱中样品，检测肌钙蛋白I的浓度，然后和在负20度中放置的样品的浓度进行比较，计算变化偏差。

偏差＝(热处理后样品中蛋白浓度－负20度样品中蛋白浓度)/负20度样品中蛋白浓度

结果如下表6所示，其中低浓度表示50pg/mL组，高浓度表示2500pg/mL组。表中的百分数表示相应的偏差，每个数据均为10次重复的平均计算结果。

表6：肌钙蛋白I标准品热处理后的浓度变化

其中低浓度(50pg/mL)的肌钙蛋白I分别在对比例1和实施例1的保存剂中保存后，浓度随时间的变化对比图如图3所示。

高浓度(2500pg/mL)的肌钙蛋白I分别在对比例1和实施例1的保存剂中保存后，浓度随时间的变化对比图如图4所示。

从表1可以看出，在实施例1、2、3、4的保存剂下，热处理后肌钙蛋白I的浓度偏差均在±10％范围内，肌钙蛋白I的保存稳定性与对比例1相比具有明显的优势。特别是对高浓度的肌钙蛋白I长期保存时，依然能够保持肌钙蛋白I的稳定性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种肌钙蛋白的保存剂，其特征在于，所述保存剂中含有溶剂以及如下组分：

1-苯基-2,3-二甲基-4-二甲氨基吡唑酮 0.1mg/mL~50mg/mL；

三(2-羧乙基)膦盐酸盐 0.5mg/mL~30mg/mL；

十六烷基二甲基烯丙基氯化铵 0.1mg/mL~1mg/mL；

离子螯合剂 0.1mg/mL~1.5mg/mL；

蛋白保护剂 1mg/mL~10mg/mL；及

糖类物质 5mg/mL~40mg/mL；

其中，所述离子螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的至少一种，所述蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白和明胶中的至少一种，所述糖类物质选自甘露醇、葡萄糖和蔗糖中的至少一种;

所述保存剂的pH值为5.2~5.6。

2.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于，所述保存剂中还含有浓度为5mg/mL~16mg/mL的无机盐，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁和硫酸钾中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于，所述保存剂中还含有体积分数为0.5%~8%的促溶剂，所述促溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于，所述保存剂中还含有浓度为1mg/mL~10mg/mL的pH值缓冲剂，所述pH值缓冲剂中含有磷酸氢二钠和柠檬酸，所述磷酸氢二钠和所述柠檬酸的摩尔比为1~3:0.6~1。

5.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于，所述保存剂中还含有浓度为0.1mg/mL~1mg/mL的抑菌剂。

6.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于，所述溶剂为水。

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