CN109725160B

CN109725160B - 一种降钙素原(pct)检测试剂盒

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Publication number: CN109725160B
Application number: CN201811653771.5A
Authority: CN
Inventors: 甘宜梧; 李志明; 王美丽
Original assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Current assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Priority date: 2018-12-30
Filing date: 2018-12-30
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2038-12-30
Also published as: CN109725160A

Abstract

本发明涉及降钙素原（PCT）检测技术领域，特别涉及一种降钙素原（PCT）检测试剂盒及其制备、使用方法，试剂R1中含有缓冲液，氯化钾，乌来糖，2‑羟丙基‑β‑环糊精，山梨糖醇，PEG‑20000，N，N‑二乙基‑对十八烷基苯磺酰胺丙基铵基丙磺酸盐，防腐剂；试剂R2中含有缓冲液，乌来糖，2‑羟丙基‑β‑环糊精，山梨糖醇，兔抗人降钙素原（PCT）抗体包被胶乳颗粒（65nm），兔抗人降钙素原（PCT）抗体包被胶乳颗粒（145nm），兔抗人降钙素原（PCT）抗体包被胶乳颗粒（280nm），N，N‑二乙基‑对十八烷基苯磺酰胺丙基铵基丙磺酸盐，防腐剂；本发明显著改善了试剂的稳定性和线性范围，显著增强了试剂的灵敏度和准确度。

Description

一种降钙素原(PCT)检测试剂盒

技术领域

本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种降钙素原(PCT)检测试剂盒及其制备、使用方法。

背景技术

降钙素原(PCT)是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时降钙素原(PCT)不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。

降钙素原(PCT)反映了全身炎症反应的活跃程度。影响降钙素原(PCT)水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。另外，降钙素原(PCT)只是在少数患者的大型外科术后1-4d可以测到。

降钙素原(PCT)水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能紊乱综合征(MODS)，即使没有细菌感染或细菌性病灶。但是，在这些病例中降钙素原(PCT)水平通常低于那些有细菌性病灶的患者。从肠道释放细胞因子或细菌移位可能引起诱导。

目前，测定降钙素原(PCT)常用方法有放射免疫学分析法、ELISA法、免疫比浊法等。其中放射免疫学分析法检测耗时长(19～22h)，而且有放射性元素的污染使用受到限制；ELISA法，操作繁琐，灵敏度低，检测结果多为定性；免疫比浊法，操作简单、使用方便，但灵敏度和稳定性较差，线性范围比较窄。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种降钙素原(PCT)检测试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法，克服了普通免疫比浊法的灵敏度低、稳定性差、线性范围窄等缺点，可以有效检测降钙素原(PCT)的含量，具有灵敏度高，稳定性好、线性范围宽等优点；本发明的另一目的在于提供该检测试剂盒的制备和使用方法。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种降钙素原(PCT)检测试剂盒，其包括试剂R1和试剂R2，

所述试剂R1包括如下含量的组分：

所述试剂R2包括如下含量的组分：

优化的，试剂R1中缓冲液为25℃，pH为7.85的4-(N-吗啉基)丁磺酸(MOBS)缓冲液；试剂R2中缓冲液为25℃，pH为8.25的4-(N-吗啉基)丁磺酸(MOBS)缓冲液。

优化的，所述防腐剂为苯氧乙醇(PE-99)。

优化的，兔抗人降钙素原(PCT)抗体包被胶乳颗粒的制备方法为(65nm、145nm和280nm三种粒径的微球包被降钙素原抗体均按以下工序进行)：

1)羧基胶乳颗粒(65nm/145nm/280nm)缓冲体系更换：取适量胶乳颗粒，加适量BIS-TRIS-HCL缓冲液(pH5.0-5.5)，振荡混匀，然后离心(粒径为280nm的胶乳微球，12000rpm离心30min；粒径为145nm的胶乳微球15000rpm离心45min；粒径为65nm的胶乳微球20000rpm离心60min)，弃上清。加入少量BIS-TRIS-HCL缓冲液超声重悬，待用(一般1mg微粒加入BIS-TRIS-HCL缓冲液100μL)。

2)活化：每1mg胶乳颗粒加入0.1-0.5mg EDC和0.1mg NHS。以1mg胶乳颗粒为例，补充BIS-TRIS-HCL定容到200-500μL体积，40℃振荡反应(转速80-100rpm)半小时。

3)清洗：活化结束后，加适量BIS-TRIS-HCL，离心(14000rpm 30min)，去上清，加入200μL BIS-TRIS-HCL超声重悬，重复一次，加入HEPES pH8.0超声重悬，补满HEPES离心，加HEPES重悬后待用。

4)偶联：加入适量降钙素原(PCT)抗体，定容至250-400μL，混匀，于恒温振荡箱37℃反应4.5小时(转速120-150rpm)。

5)封闭：加入100μL 100mg/mL BSA，2-8℃封闭12小时。

6)清洗：离心(粒径为280nm的胶乳微球，12000rpm离心30min；粒径为145nm的胶乳微球15000rpm离心45min；粒径为65nm的胶乳微球20000rpm离心60min)，弃上清。然后加入适量PBS缓冲液，重悬，超声2分钟后，再次离心(粒径为280nm的胶乳微球，12000rpm离心30min；粒径为145nm的胶乳微球15000rpm离心45min；粒径为65nm的胶乳微球20000rpm离心60min)，去除上清，所得沉淀即为兔抗人降钙素原(PCT)抗体包被胶乳颗粒。

上述的降钙素原(PCT)检测试剂盒的使用方法为：使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为600nm，R1试剂和R2试剂的比例为3:1。

本发明检测的基本原理为：样本中的抗原降钙素原(PCT)与试剂中超敏化的兔抗人降钙素原(PCT)抗体胶乳颗粒形成不溶性免疫复合物，在波长600nm处检测其浊度变化，其变化程度与样本中降钙素原(PCT)浓度成正比。

本发明的有益效果在于：

1)本发明采用胶乳增强免疫比浊法，通过优化反应体系，试剂R1和试剂R2采用4-(N-吗啉基)丁磺酸(MOBS)缓冲液，并添加乌来糖、2-羟丙基-β-环糊精、山梨糖醇等多种稳定剂，优化各稳定剂的配比，显著改善了试剂的稳定性。

2)优选的新型表面活性剂N，N-二乙基-对十八烷基苯磺酰胺丙基铵基丙磺酸盐，可以促进并维持抗体稳定，防止体系浑浊，显著增强了试剂的稳定性和抗干扰能力。

3)采用胶乳增强免疫比浊法，并且65nm、145nm和280nm三种不同粒径的羧基胶乳微球联用，科学配比，大大增强了试剂的反应灵敏度和线性范围，并且试剂的重复性和抗干扰能力更强。

4)该试剂操作简便快速，适用于自动化分析，是一种更加稳定、灵敏、线性范围宽的降钙素原(PCT)试剂，试剂的准确度和稳定性良好，抗干扰性强，使用方便，完全可以满足临床需要。

附图说明

图1为各实施例校准曲线。

图2为试剂稳定性对比曲线图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

本实施例所提供的降钙素原(PCT)的检测试剂，包括试剂R1和试剂R2：

1)试剂R1的组分包括：

所述试剂R2包括如下含量的组分：

2)本实施例试剂的使用方法：

本实施例描述的降钙素原(PCT)检测试剂盒，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用终点法进行测定。将R1和R2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1。

表1试剂检测方法表

计算：降钙素原(PCT)含量(ng/mL)＝(ΔA测定÷ΔA标准)×C标准

实施例2

本实施例所描述的降钙素原(PCT)的检测试剂，包试剂R1和试剂R2(检测方法同实施例1)：

1)试剂R1的组分包括：

所述试剂R2包括如下含量的组分：

实施例3

1)试剂R1的组分包括：

所述试剂R2包括如下含量的组分：

对比例1

本对比例所描述的降钙素原(PCT)的检测试剂，包试剂R1和试剂R2(检测方法同实施例1)：

1)试剂R1的组分包括：

所述试剂R2包括如下含量的组分：

对比例2

1)试剂R1的组分包括：

所述试剂R2包括如下含量的组分：

对比例3

本对比例采用市场常见的国家食品药品监督管理局认可的降钙素原(PCT)检测试剂盒。该试剂盒未采用三种胶乳颗粒，也未添加新型表面活性剂N，N-二乙基-对十八烷基苯磺酰胺丙基铵基丙磺酸盐。

试验一

精密度试验：取具有溯源性的高值质控物(靶值45ng/mL)、低值质控物(靶值10ng/mL)各一份，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，进行对照检测，对每份质控物进行20次检测，将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。结果见表2。

表2-1高值质控物精密度试验数据表

表2-2低值质控物精密度试验数据表

由表2中变异系数可知，与对比例1-3相比，实施例1、实施例2/实施例3配方配制试剂检测数值更接近靶值，标准偏差和变异系数均较小，具有更高的批内精密度，这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法(三种不同粒径羧基纳米胶乳颗粒联用)，并且采用新型表面活性剂N，N-二乙基-对十八烷基苯磺酰胺丙基铵基丙磺酸盐，科学配比乌来糖、2-羟丙基-β-环糊精、山梨糖醇等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的批内精密度。

试验二

准确度对比试验：取具有溯源性的高值质控物(靶值45ng/mL)、低值质控物(靶值10ng/mL)各一份，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，制得降钙素原(PCT)检测试剂盒进行对照检测，各检测5次，计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果见表3。

表3-1高值质控物准确度试验数据表

表3-2低值质控物准确度试验数据表

由表3中检测结果可知，与对比例1-3相比，实施例1、实施例2、实施例3配方配制试剂检测数值更接近靶值，平均值与靶值的差值在1以内，具有更高的准确度，这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法(三种不同粒径羧基纳米胶乳颗粒联用)，并且采用新型表面活性剂N，N-二乙基-对十八烷基苯磺酰胺丙基铵基丙磺酸盐，科学配比乌来糖、2-羟丙基-β-环糊精、山梨糖醇等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的准确度。

试验三

试剂灵敏度的对比试验：取具有溯源性的校准品由低到高稀释出7个浓度样本，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，制得降钙素原(PCT)检测试剂进行对照检测，将检测结果与理论浓度相比较。结果见表4。

表4灵敏度对比试验数据表

由表4中检测结果可知，在样本浓度低至0.1ng/mL时，对比例1-3检测值为0.02-0.03，而实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂仍可以检测出样本的准确值；并且与对比例1-3相比，实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂检测接近线性下限的低值样本(0-1ng/mL)时的准确度更高。另外，在样本浓度在线性上限100ng/mL时，对比例检测值在82.12-85.11ng/mL之间，测试值明显偏低，而实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂仍可以检测出样本的准确值，这表明实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂拥有更高的分析灵敏度、准确度及更宽的线性范围。因此可以说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法(三种不同粒径羧基纳米胶乳颗粒联用)，并且采用新型表面活性剂N，N-二乙基-对十八烷基苯磺酰胺丙基铵基丙磺酸盐，科学配比乌来糖、2-羟丙基-β-环糊精、山梨糖醇等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的分析灵敏度、准确度和线性范围。

试验四

试剂校准曲线对比试验：用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，制得降钙素原(PCT)检测试剂进行校准检测。各浓度点的吸光度结果见表5，校准曲线见附录图1。

表5试剂校准对比试验数据表

由表5中检测结果可知，校准品浓度为20ng/mL时，对比例1-3的吸光度值为228.20-451.02，而实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂的吸光度为658.01-852.21；另外，在样本浓度在线性上限100ng/mL时，对比例吸光度值在3925.36-5421.32之间，远远低于实施例1-3配方配制试剂，这表明实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂拥有更高的分析灵敏度、更宽的线性范围。因此可以说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法(三种不同粒径羧基纳米胶乳颗粒联用)，并且采用新型表面活性剂N，N-二乙基-对十八烷基苯磺酰胺丙基铵基丙磺酸盐，科学配比乌来糖、2-羟丙基-β-环糊精、山梨糖醇等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的分析灵敏度和线性范围。

试验五

试剂的稳定性对比试验：对实施例1-3和对比例1-3中的试剂，分别均匀分装13组，每组的试剂量为R1为18mL，R2为6mL。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测降钙素原(PCT)质控品(靶值为45ng/mL)，检测结果如图2所示，实施例1-3试剂在2-8℃储存条件下比对比例更加稳定。

由检测结果可知，在保存13个月时，对比例1-3检测数值为34.94-36.64，与靶值相差8.36-10.06，并且检测值呈现明显的随储存时间延长而降低趋势；而实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂检测数值为45.31-45.85，与靶值相差0.31-0.85；这表明实施例1、实施例2实施例3配方配制试剂拥有更高的稳定性。这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法(三种不同粒径羧基纳米胶乳颗粒联用)，并且采用新型表面活性剂N，N-二乙基-对十八烷基苯磺酰胺丙基铵基丙磺酸盐，科学配比乌来糖、2-羟丙基-β-环糊精、山梨糖醇等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的稳定性。

综上所述，通过验证，本发明提供的试剂比对比例灵敏度高、重复性好、线性范围宽，能够达到市场对产品的应用要求，并且准确度高，是一种更加稳定、良好的降钙素原(PCT)检测试剂盒。

Claims

1.一种降钙素原（PCT）检测试剂盒，其特征在于：其包括试剂R1和试剂R2，

所述试剂R1包括如下含量的组分：

缓冲液 22mmol/L，

氯化钾 10-15g/L，

乌来糖 1-3g/L，

2-羟丙基-β-环糊精 5-10g/L，

山梨糖醇 10-20g/L，

PEG-20000 8-15g/L，

N，N-二乙基-对十八烷基苯磺酰胺丙基铵基丙磺酸盐 0.15-0.5g/L，

防腐剂 0.8g/L,

所述试剂R2包括如下含量的组分：

缓冲液 30mmol/L，

乌来糖 1-3g/L，

2-羟丙基-β-环糊精 5-10g/L，

山梨糖醇 10-20g/L，

粒径为65nm兔抗人降钙素原（PCT）抗体包被胶乳颗粒 0.25%-0.45%（W/V），

粒径为145nm兔抗人降钙素原（PCT）抗体包被胶乳颗粒 0.25%-0.45%（W/V），

粒径为280nm兔抗人降钙素原（PCT）抗体包被胶乳颗粒 0.12%-0.24%（W/V），

防腐剂 0.8g/L。

2.根据权利要求1所述的降钙素原（PCT）检测试剂盒，其特征在于：试剂R1中缓冲液为25℃，pH为7.85的4-(N-吗啉基)丁磺酸（MOBS）缓冲液；试剂R2中缓冲液为25℃，pH为8.25的4-(N-吗啉基)丁磺酸（MOBS）缓冲液。

3.根据权利要求1所述的降钙素原（PCT）检测试剂盒，其特征在于：所述防腐剂为苯氧乙醇。

4.根据权利要求1所述的降钙素原（PCT）检测试剂盒的制备方法，其特征在于：65nm、145nm和280nm粒径兔抗人降钙素原（PCT）抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：

1）羧基胶乳颗粒缓冲体系更换：取1mL胶乳颗粒，加5mlpH5.5BIS-TRIS-HCL缓冲液，振荡混匀，然后20000rpm离心60min，弃上清，加入5mLBIS-TRIS-HCL缓冲液超声重悬，待用，

2）活化：每 1mg 胶乳颗粒加入0.1-0.5mg EDC 和0.1mg NHS，以1mg胶乳颗粒为例，补充BIS-TRIS-HCL定容到 200-500μL 体积，40℃振荡反应，转速100rpm，振荡混匀半小时，

3）清洗：活化结束后，加适量BIS-TRIS-HCL，14000rpm离心30min，去上清，加入200μLBIS-TRIS-HCL超声重悬，重复一次，加入 HEPES pH8.0 超声重悬，补满 HEPES 离心，加HEPES 重悬后待用，

4）偶联：加入适量降钙素原（PCT）抗体，定容至 250-400μL，混匀，于恒温振荡箱37℃、转速150rpm，反应4.5小时，

5）封闭：加入100μL 100mg/mL BSA，2-8℃封闭12小时，

6）清洗：将封闭后的溶液20000rpm离心60min，弃上清，然后加入2mLPBS缓冲液，重悬，超声2分钟后，再次20000rpm离心60min，去除上清，所得沉淀即为兔抗人降钙素原（PCT）抗体包被胶乳颗粒。