CN107523603B - 一种酶法制备头孢克洛的方法 - Google Patents

Abstract

一种酶法制备头孢克洛的方法，包括如下步骤：用7‑氨基‑3‑氯‑头孢烯酸、D‑对苯甘氨酸甲酯盐酸盐、固定化头孢克洛合成酶与头孢克洛晶种制备得到头孢克洛粗粉，将头孢克洛粗粉溶解、脱色后加入头孢克洛晶种调节pH后第一次搅拌养晶，再调节pH后第二次搅拌养晶得到晶体混合液，晶体混合液抽滤得到晶体产物与结晶母液，晶体产物再依次经水洗、泡洗、抽滤、真空干燥后得到头孢克洛。本发明的酶法制备头孢克洛有两次搅拌养晶操作，在重结晶过程中让头孢克洛晶体缓慢的更多的析出，析出晶体的晶体均匀、晶形更好，制备得到的头孢克洛纯度大于99.7%，纯度非常高。

Description

一种酶法制备头孢克洛的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种制备头孢克洛的方法。

背景技术

头孢克洛是一种半合成的第二代口服头孢菌素类抗生素药物，头孢克洛自1979年获FDA批准，1982年在美国成功上市以来，因其具有广谱、高效和良好的临床安全性，它已成为目前治疗细菌感染的重要药物之一。头孢克洛的杀菌机制是使转肤酶失活，干扰细菌细胞壁最终阶段的合成，阻止粘肽原的交联，对葡萄球菌、链球菌属、肺炎球菌及大肠杆菌等革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有很强的杀灭作用。

头孢克洛在工业上的制备方法是采用7-氨基-3-氯-头孢烯酸（7-ACCA）与活化的D-苯甘氨酸通过化学缩合或酶法缩合制备得到。现有技术的化学缩合法，存在工艺复杂、成本高、污染大、溶剂残留高与收率低等问题，传统的酶法也存在纯度不够高等缺点，不利于头孢克洛的扩大生产及广泛应用，在利用酶法制备头孢克洛时如何提高头孢克洛的纯度有待进一步探索研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种酶法制备高纯度头孢克洛的方法，为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种酶法制备头孢克洛的方法，包括如下步骤：

一种酶法制备头孢克洛的方法，包括如下步骤：用7-氨基-3-氯-头孢烯酸、D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐、固定化头孢克洛合成酶与头孢克洛晶种制备得到头孢克洛粗粉，将头孢克洛粗粉溶解、脱色后加入头孢克洛晶种调节pH后第一次搅拌养晶，再调节pH后第二次搅拌养晶得到晶体混合液，晶体混合液抽滤得到晶体产物与结晶母液，晶体产物再依次经水洗、泡洗、抽滤、真空干燥后得到头孢克洛。

上述制备方法中，优选的，所述头孢克洛粗粉溶解时加入盐酸调节pH为0.5-0.7，再加入活性炭脱色，所述活性炭的添加量为7-氨基-3-氯-头孢烯酸质量的3%-5%，加入活性炭脱色的时间为20分钟。

上述制备方法中，优选的，加入头孢克洛晶种之前，保持溶液温度为15℃-20℃，并调节溶液pH为1.0。该温度及pH可让头孢克洛粗粉溶解更加充分，为下步重结晶除杂做准备。

上述制备方法中，优选的，所述第一次搅拌养晶时调节pH为1.5后在5℃-10℃下搅拌养晶30-60min，所述第二次搅拌养晶时缓慢调节pH为4.5后在0℃-5℃下搅拌养晶1-2小时，所述搅拌养晶时保持较低的转速。第一次搅拌养晶时pH为1.5是析晶点，该条件下养晶是为了后续晶体质量、纯度和晶型更好，第二次搅拌养晶时pH为4.5是等电点，此时头孢克洛溶解度最低，可以得到大量晶体，确保收率。两次搅拌养晶操作中pH值及温度的选取可使头孢克洛缓慢析出，保证头孢克洛晶体的晶形更好，纯度更高。

上述制备方法中，优选的，所述头孢克洛晶种的加入质量为7-氨基-3-氯-头孢烯酸质量的0.1%-0.3%，所述晶种为自制的纯度大于99%的头孢克洛晶种，此晶种可避免引入不必要的杂质。

上述制备方法中，优选的，所述头孢克洛粗粉的具体制备步骤如下：

（1）用弱碱性溶液将7-氨基-3-氯-头孢烯酸溶解得到母核溶液，在母核溶液中加入D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液得到反应液，调节反应液的pH为6.4-6.6，反应温度为14-16℃后，再加入固定化头孢克洛合成酶，搅拌反应18-20分钟后加入头孢克洛晶种，30min后向反应液持续滴加D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液2h，滴加速度为0.8-1.2mL/min，反应得到含有固定化头孢克洛合成酶与固体头孢克洛粗产物的混合液a，其中，持续控制反应液的pH为6.4-6.6，并保持反应温度为14-16℃直至7-氨基-3-氯-头孢烯酸的转化率大于98.5%，更优选的，持续控制反应液的pH为6.5，并保持反应温度为15℃直至7-氨基-3-氯-头孢烯酸的转化率大于99%；

（2）将步骤（1）中得到的混合液a，经100目筛网分离得到固定化头孢克洛合成酶和含有头孢克洛粗粉的混合液b，抽滤混合液b得到清液a与头孢克洛粗粉。

上述头孢克洛粗粉的制备方法中，优选的，所述步骤（1）中，所述母核溶液中7-氨基-3-氯-头孢烯酸的质量分数为15%-17%，所述D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液中D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐的质量分数为30%-50%，所述母核溶液中加入的D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐的量与母核溶液中7-氨基-3-氯-头孢烯酸的摩尔比为1:1.1-1:1.2，所述7-氨基-3-氯-头孢烯酸与加入的固定化头孢克洛合成酶的质量比为0.9-1:1，所述头孢克洛晶种的加入质量为7-氨基-3-氯-头孢烯酸质量的0.1%-0.3%。上述头孢克洛粗粉的制备方法的步骤（1）中，首先加入一部分D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液，以供转化反应开始进行，剩余大部分D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液后续滴加完成，此种加入方法可以控制转化反应速度，防止反应过快，以至产物爆析，包裹固定化酶，使转化反应无法继续进行，最终导致转化率过低。

上述头孢克洛粗粉的制备方法中，优选的，所述步骤（1）中，所述弱碱性溶液为3mol/L的氨水，所述固定化头孢克洛合成酶为自制产品。

上述头孢克洛粗粉的制备方法中，优选的，所述步骤（2）中得到的固定化头孢克洛合成酶经清液a洗涤，再过筛、抽滤，重复上述操作直至过筛、抽滤后的清液a变澄清，过滤清液a得到清液b。若清液中含有头孢克洛粗粉则清液不澄清，步骤（1）反应结束后得到的混合液a中主要有已析出的头孢克洛粗粉、未析出的头孢克洛、7-氨基-3-氯-头孢烯酸、D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐及固定化酶，将混合液a过筛后，头孢克洛粗粉与固定化酶分离，再将过筛得到的混合液b抽滤，将头孢克洛粗粉和含有未析出的头孢克洛、7-氨基-3-氯-头孢烯酸、D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐的清液a分离，最后用该清液a洗涤还包裹着很多头孢克洛粗粉的

固定化酶，再过筛、抽滤，多次重复直至清液a中不含有头孢克洛粗粉而变澄清，经过上述操作，可以将固定化酶中包裹的头孢克洛粗粉洗出，提高头孢克洛收率。

上述制备方法中，优选的，所述头孢克洛粗粉溶解时为将头孢克洛粗粉加入清液b中溶解。用清液b溶解头孢克洛粗粉可以充分回收清液b中的头孢克洛。

上述制备方法中，优选的，所述结晶母液经回收处理，具体方法如下：a.将晶体产物用水洗涤两次分别得到第一次水洗液与第二次水洗液，合并结晶母液及第一次水洗液，再滴加β-萘酚溶液，滴加完成后在4-6℃下搅拌1小时，抽滤收集得到头孢克洛萘酚的络合物a；b.向第二次水洗液中加入N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷，再在搅拌下向第二次水洗液中加入络合物a，快速调节pH至0.9-1.1，搅拌至澄清，静置分相；c.向分相后得到的上清液c中加入二氯甲烷，搅拌静置分相后分离得到上清液d，上清液d返回与清液b一起用于溶解头孢克洛粗粉。本发明结晶母液与水洗涤两次后得到的第一次水洗液与第二次水洗液经回收处理，可以回收利用结晶母液及水洗液中残留的头孢克洛，含头孢克洛的上清液d与清液b一起用于下批制备头孢克洛时溶解粗粉，这一回收再利用过程可以大大提高头孢克洛的收率，经济价值更高。在结晶母液及第一次水洗液中加入β-萘酚丙酮溶液可与结晶母液及第一次水洗液中残留的头孢克洛结合形成头孢克洛萘酚的络合物，当此络合物加入到第二次水洗液、DMF和二氯甲烷混合溶液中搅拌后会分层，二氯甲烷、丙酮与β-萘酚位于下层，DMF和头孢克洛在上清液层c中，再在此上清液层c中加入二氯甲烷搅拌后又会分层，二氯甲烷与DMF位于下层，头孢克洛在上清液层d中，通过上述操作可以高效回收结晶母液与水洗液中残留的头孢克洛。

上述制备方法中，优选的，所述β-萘酚溶液为将β-萘酚溶于丙酮溶液中所得到的溶液，所述丙酮的质量为β-萘酚质量的8-10倍，所述β-萘酚溶液的滴加量为以保证β-萘酚的质量为结晶母液及第一次水洗液中头孢克洛质量的19%-21%为准，所述N,N-二甲基甲酰胺的加入量为第二次水洗液体积的3.5%-4.0%，所述二氯甲烷加入量为第二次水洗液体积的18.5%-20%。

本发明的酶法制备头孢克洛，通过可重复利用的固定化头孢克洛合成酶催化合成产物，与化学法相比省略了很多繁复的步骤，缩短了工艺路线，降低了成本，本发明制备过程中通过活性炭脱色、两次搅拌养晶、水洗、丙酮泡洗等步骤减少了产品色素，有效地改善了色级，并除掉一些未反应完全的原料、副产物及其他杂质，得到纯度更高的头孢克洛精品。另外，本发明结晶母液与水洗涤两次后得到的第一次水洗液与第二次水洗液经回收处理，可以回收利用结晶母液及水洗液中残留的头孢克洛，可以大大提高头孢克洛的收率。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的酶法制备头孢克洛有两次搅拌养晶操作，在重结晶过程中让头孢克洛晶体缓慢的更多的析出，析出晶体的晶体均匀、晶形更好，制备得到的头孢克洛纯度大于99.7%，纯度非常高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1制备得到的头孢克洛的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种酶法制备头孢克洛的方法，包括如下步骤：

（1）在18℃下，用氨水将40g7-氨基-3-氯-头孢烯酸固体溶解得到母核溶液，在母核溶液中加入D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液得到反应液，其中，D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液中含D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐41.3 g，调节pH至6.5，降温至15℃，加入40g固定化头孢克洛合成酶，搅拌反应20分钟后加入0.1g头孢克洛作为晶种，30分钟后持续滴加D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液2h，滴加速度为1mL/min，反应过程中测定7-氨基-3-氯-头孢烯酸的残留量，并用6mol/L盐酸和3mol/L氨水控制反应过程中溶液的pH为6.5，并保持反应温度为15℃，当7-氨基-3-氯-头孢烯酸的转化率为99.5%时，停止反应，得到含有固定化头孢克洛合成酶与固体头孢克洛粗产物的混合液a；

（2）将步骤（1）得到的混合液a，经100目筛网分离得到固定化头孢克洛合成酶和含有头孢克洛粗粉的混合液b，抽滤混合液b得到头孢克洛粗粉与清液a，用清液a洗涤固定化头孢克洛合成酶，再过筛、抽滤，重复上述操作直至过筛、抽滤后的清液a变澄清，过滤清液a得到清液b，过筛后得到的酶回收利用；

（3）在25℃下，将步骤（2）得到的粗粉加入清液b中，搅拌为无结块的匀浆后，加入盐酸调pH为0.7并使其完全溶解，经1.6g活性炭脱色20分钟分离出活性炭，在温度15℃条件下，加浓氨水调节溶液pH为1.0，加入0.1g头孢克洛作为晶种后继续调节pH为1.5，降温至10℃，搅拌养晶30min，再缓慢调节pH为4.5，降温至5℃，搅拌养晶2小时得到晶体混合液，晶体混合液抽滤得到晶体产物与结晶母液，晶体产物再依次经水洗涤两次、用丙酮泡洗2次、抽滤、35℃下真空干燥后得到头孢克洛53.4g，高效液相色谱议测得其纯度为99.83%。

（4）结晶母液与水洗涤两次后得到的第一次水洗液与第二次水洗液经回收处理，具体步骤如下：a.合并结晶母液及第一次水洗液，再滴加结晶母液及第一次水洗液中含头孢克洛质量20%的β-萘酚（β-萘酚以β-萘酚丙酮溶液形式加入，β-萘酚丙酮溶液为将β-萘酚溶于其质量10倍的丙酮溶液中），20分钟滴加完后在5℃下搅拌1小时，抽滤收集得到头孢克洛萘酚的络合物a及抽滤滤液，抽滤滤液中残留含头孢克洛1.77g；b.向第二次水洗液中加入3mLDMF和20mL二氯甲烷，再在搅拌下向第二次水洗液中加入络合物a，用浓盐酸快速调节pH至1.0，搅拌至澄清，静置分相；c.向分相后得到的上清液c中加入20mL二氯甲烷，搅拌静置分相后分离得到上清液d，上清液d含头孢克洛5.7g，上清液d可与步骤（3）中的清液b一起用于下一批制备时溶解粗粉。

图1为本实施例制备得到的头孢克洛高效液相色谱图，其纯度为99.83%。质量收率为134%。质量收率为头孢克洛精品质量与投入的7-氨基-3-氯-头孢烯酸质量的比值。

实施例2：

一种酶法制备头孢克洛的方法，包括如下步骤：

（1）在18℃下，用氨水将40g7-氨基-3-氯-头孢烯酸固体溶解得到母核溶液，在母核溶液中加入D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液得到反应液，其中，D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液中含D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐41.3 g，调节pH至6.5，降温至15℃，加入40g固定化头孢克洛合成酶，搅拌反应20分钟后加入0.1g头孢克洛作为晶种，30分钟后持续滴加D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液2h，滴加速度为1mL/min，反应过程中测定7-氨基-3-氯-头孢烯酸的残留量，并用6mol/L盐酸和3mol/L氨水控制反应过程中溶液的pH为6.5，并保持反应温度为15℃，当7-氨基-3-氯-头孢烯酸的转化率为99%时，停止反应，得到含有固定化头孢克洛合成酶与固体头孢克洛粗产物的混合液a；

（2）将步骤（1）得到的混合液a，经100目筛网分离得到固定化头孢克洛合成酶和含有头孢克洛粗粉的混合液b，抽滤混合液b得到头孢克洛粗粉与清液a，用清液a洗涤固定化头孢克洛合成酶，再过筛、抽滤，重复上述操作直至过筛、抽滤后的清液a变澄清，过滤清液a得到清液b，过筛后得到的酶回收利用；

（3）在25℃下，将清液b与实施例1步骤（4）中得到的含头孢克洛5.7g的上清液d与步骤（2）得到的清液b混合，再加入步骤（2）得到的粗粉，搅拌为无结块的匀浆后，加入盐酸调pH为0.7并使其完1.0，全溶解，经1.6g活性炭脱色20分钟分离出活性炭，在温度15℃条件下，加浓氨水调节溶液pH为加入0.1g头孢克洛作为晶种后继续调节pH为1.5，降温至10℃，搅拌养晶30min，再缓慢调节pH为4.5，降温至5℃，搅拌养晶2小时得到晶体混合液，晶体混合液抽滤得到晶体产物与结晶母液，晶体产物再依次经水洗涤两次、用丙酮泡洗2次、抽滤、35℃下真空干燥后得到头孢克洛56g，高效液相色谱议测得其纯度为99.78%。

（4）结晶母液与水洗涤两次后得到的第一次水洗液与第二次水洗液经回收处理，具体步骤如下：a.合并结晶母液及第一次水洗液，再滴加结晶母液及第一次水洗液中含头孢克洛质量20%的β-萘酚（β-萘酚以β-萘酚丙酮溶液形式加入，β-萘酚丙酮溶液为将β-萘酚溶于其质量10倍的丙酮溶液中），20分钟滴加完后在5℃下搅拌1小时，抽滤收集得到头孢克洛萘酚的络合物a；b.向第二次水洗液中加入3mLDMF和20mL二氯甲烷，再在搅拌下向第二次水洗液中加入络合物a，用浓盐酸快速调节pH至1.0，搅拌至澄清，静置分相；c.向分相后得到的上清液c中加入20mL二氯甲烷，搅拌静置分相后分离得到上清液d，上清液d含头孢克洛7.3g，上清液d可与步骤（3）中的清液b一起用于下一批制备时溶解粗粉。

本实施例中制备得到的头孢克洛的纯度为99.78%，质量收率由实施例1中的134%提高至140%，且随着反应批次的增加，收率还有望继续提高。

Claims (5)

1.一种酶法制备头孢克洛的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）用弱碱性溶液将7-氨基-3-氯-头孢烯酸溶解得到母核溶液，在母核溶液中加入D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液得到反应液，调节反应液的pH为6.4-6.6，反应温度为14-16℃后，再加入固定化头孢克洛合成酶，搅拌反应18-20分钟后加入头孢克洛晶种，30min后向反应液持续滴加D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液2h，滴加速度为0.8-1.2mL/min，反应得到含有固定化头孢克洛合成酶与固体头孢克洛粗产物的混合液a，其中，持续控制反应液的pH为6.4-6.6，并保持反应温度为14-16℃直至7-氨基-3-氯-头孢烯酸的转化率大于98.5%；所述母核溶液中7-氨基-3-氯-头孢烯酸的质量分数为15%-17%，所述D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶液中D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐的质量分数为30%-50%，所述母核溶液中加入的D-对苯甘氨酸甲酯盐酸盐的量与母核溶液中7-氨基-3-氯-头孢烯酸的摩尔比为1:1.1-1:1.2，所述7-氨基-3-氯-头孢烯酸与加入的固定化头孢克洛合成酶的质量比为0.9-1:1，所述头孢克洛晶种的加入质量为7-氨基-3-氯-头孢烯酸质量的0.1%-0.3%；

（2）将步骤（1）中得到的混合液a，经筛网分离得到固定化头孢克洛合成酶和含有头孢克洛粗粉的混合液b，抽滤混合液b得到清液a与头孢克洛粗粉；

（3）将头孢克洛粗粉溶解、脱色后加入头孢克洛晶种调节pH后第一次搅拌养晶，再调节pH后第二次搅拌养晶得到晶体混合液，晶体混合液抽滤得到晶体产物与结晶母液，晶体产物再依次经水洗、泡洗、抽滤、真空干燥后得到头孢克洛；

所述结晶母液经回收处理，具体方法如下：a.将晶体产物用水洗涤两次分别得到第一次水洗液与第二次水洗液，合并结晶母液及第一次水洗液，再滴加β-萘酚溶液，滴加完成后在4-6℃下搅拌1小时，抽滤收集得到头孢克洛萘酚的络合物a；b.向第二次水洗液中加入N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷，再在搅拌下向第二次水洗液中加入络合物a，快速调节pH至0.9-1.1，搅拌至澄清，静置分相；c.向分相后得到的上清液c中加入二氯甲烷，搅拌静置分相后分离得到上清液d，上清液d返回用于溶解头孢克洛粗粉；

所述β-萘酚溶液为将β-萘酚溶于丙酮溶液中所得到的溶液，所述丙酮的质量为β-萘酚质量的8-10倍，所述β-萘酚溶液的滴加量为以保证β-萘酚的质量为结晶母液及第一次水洗液中头孢克洛质量的19%-21%为准，所述N,N-二甲基甲酰胺的加入量为第二次水洗液体积的3.5%-4.0%，所述二氯甲烷加入量为第二次水洗液体积的18.5%-20%。

2.根据权利要求1所述的酶法制备头孢克洛的方法，其特征在于，加入头孢克洛晶种之前，保持溶液温度为15℃-20℃，并调节溶液pH为1.0。

3.根据权利要求1所述的酶法制备头孢克洛的方法，其特征在于，所述第一次搅拌养晶时调节pH为1.5后在5℃-10℃下搅拌养晶30-60min，所述第二次搅拌养晶时缓慢调节pH为4.5后在0℃-5℃下搅拌养晶1-2小时。

4.根据权利要求1所述的酶法制备头孢克洛的方法，其特征在于，所述步骤（2）中得到的固定化头孢克洛合成酶经清液a洗涤，再过筛、抽滤，重复上述操作直至过筛、抽滤后的清液a变澄清，过滤清液a得到清液b。

5.根据权利要求4所述的酶法制备头孢克洛的方法，其特征在于，所述头孢克洛粗粉溶解时为将头孢克洛粗粉加入清液b中溶解。

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