CN107207584B

CN107207584B - 人偏肺病毒(hmpv)的m抗原的特异性单克隆抗体及其在诊断方法中的用途

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Publication number: CN107207584B
Application number: CN201580073977.9A
Authority: CN
Inventors: S·M·布埃纳拉米耶; A·M·卡莱伊斯帕拉; J·E·莫拉阿拉尔孔
Original assignee: Pontificia Universidad Catolica de Chile
Current assignee: Pontificia Universidad Catolica de Chile
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2015-02-02
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2035-02-02
Also published as: US20170343546A1; KR20170086668A; GB2547603A; CL2014003373A1; RU2698052C2; GB2568617A; CN107207584A; CA2970482A1; UY36431A; RU2017120228A3; ZA201804550B; EP3495386A1; MX2017007611A; US9995747B2; GB2547603B; GB201709129D0; DE112015005539T5; BR112017012511A2; RU2017120228A; CO2017005781A2

Abstract

本发明涉及鼠类单克隆抗体，其相应于由被命名为3G8/C11和7G4/A12的杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体，并且针对hMPV的M抗原进行反应。这些抗体相互之间不竞争与所述抗原的结合位点，也不对于与所述抗原的同时结合施加障碍。所述单克隆抗体可以用于hMPV感染的检测、诊断和/或测定的检定试验。

Description

人偏肺病毒(HMPV)的M抗原的特异性单克隆抗体及其在诊断方法中的用途

发明领域

本发明涉及识别呼吸道病毒人偏肺病毒(hMPV)的M蛋白的单克隆抗体或其片段，其可用于开发在人中的hMPV感染的诊断方法。

发明背景

人偏肺病毒(此后，hMPV)是与上和下呼吸道的急性呼吸系统疾病相关的代表性住院百分比和发病率的病因学因子，特别是在婴儿、老年人和无免疫应答的个体中。由该病毒引起的感染与宽范围的病理学状况相关，其中细支气管炎和肺炎属于具有较大社会经济影响的情形。另外，已经将hMPV感染与胃肠炎和角膜结膜炎相关联。例如， Calvo等人(2008)在3年的时间段中证明，由呼吸道病毒(呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)和hMPV)引起的急性呼吸道感染的累积发病率对于64.5％的小于2岁的儿童的住院负有责任，其中对于所述病毒中的每一种而言发病率分别为35.4％、19.3％和9.8％。 hMPV与其他具有高发病率的呼吸道病毒所共有的一个令人感兴趣的特征为在整个幼年期间产生反复感染，这是一种可能与在生命的最初几个月期间在建立针对初次感染的保护性免疫应答方面的失败相关的现象。迄今为止，还没有关于hMPV感染引起的特别的经济影响的研究，然而，由hMPV造成的住院发生率据估计为由人呼吸道合胞病毒 (hRSV)造成的住院发生率的1/3。在发达国家中进行的研究估计， hRSV感染的个体花费为大约3,000欧元($1,860,000智利比索)，其中具有直至8,400欧元($5,200,000智利比索)的上限。考虑到需要住院的病理学过程具有相似的特征，暗示了关于个体住院的花费是近似的。

虽然病毒hMPV和hRSV分别被分组在偏肺病毒属 (Metapneumovirus)和肺病毒属(Pneumovirus)中，但病毒hMPV 被归类为副粘病毒科(Paramyxoviridae)的肺病毒亚科(Pneumovirinae)，这是与hRSV被归类为的相同的分类。hMPV的基因组由负义的不分节段的单链核糖核酸(ssRNA)组成，因此病毒蛋白质以3’至5’的方向(关于其序列)按下列形式进行安排：N、P、 M、F、M2(ORF1和ORF2)、SH、G和L。这些蛋白质中的五个负责遗传物质的包装和确定病毒颗粒的特有结构，它们分别相应于核衣壳蛋白N和基质蛋白M，以及跨膜糖蛋白F、G和SH。其他四个蛋白质M2-1、M2-2、P和L参与病毒的复制和转录。存在两种亚型的hMPV，它们基于主要在F和G蛋白中的序列差异而被划分为A 和B(关于两个抗原组)。虽然这些蛋白质具有一定程度的差异，但是相对于由病毒基因组所编码的其他蛋白质而言，存在高度的同一性。

目前，为了检测hMPV，使用了三种技术：RT-PCR，其直接从鼻咽拭子的样品扩增F和N基因的区段；呼吸道病毒鉴定组盒 (respiratory panel)(同时鉴定各种不同类型的呼吸道病毒的直接免疫荧光方法，其常规地在临床实验室中使用)；和在LLC-MK2细胞中的体外培养，以便观察致细胞病变效应。这些技术具有不大于70％的灵敏度，并且结果在两者之间是不一致的。低灵敏度和这些技术之间的不一致所产生的问题之一涉及下述情形：对于呼吸道病毒鉴定组盒来说阴性的呼吸道感染通常用抗生素进行了治疗，以避免可能的细菌超感染。由此，目前由可得的技术所交出的假阴性未接受适当的治疗并且使患者暴露于不必要的抗生素治疗，这还在所述患者中增加了产生抗生素抗性的可能性。

因此，极其重要的是拥有对于hMPV的有效且快速的诊断测试。面对这样的问题，本发明的单克隆抗体看起来是对于满足所述需求来说必需的备选方案，因为其使得能够特异性地识别在被hMPV感染的患者的样品中的病毒抗原。由此，本发明包括产品，例如单克隆抗体，以及使用它们来在被hMPV感染的患者中进行快速、有效且准确的检测和诊断的备选方法，所述检测和诊断具有在临床样品中100％的特异性并且能够通过ELISA而检测出等价于1.5ng特定抗原的浓度。这允许临床医生决定能够先于疾病演变的提早和适当的治疗。

发明简述

本发明涉及两种针对人偏肺病毒(hMPV)的单克隆抗体。具体而言，本发明牵涉两种鼠类单克隆抗体，其相应于由被命名为3G8/C11 和7G4/A12的杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体，并且针对hMPV 的M抗原进行反应。这些抗体相互之间不竞争与所述抗原的结合位点，也不对于与所述抗原的同时结合施加障碍。所述单克隆抗体可以用于hMPV感染的检测、诊断和/或测定的检定试验。可以同时使用这些抗体以增加在其中存在少量抗原的临床样品中的检测灵敏度。例如，如在图6中所显示的，来自于杂交瘤3G8/C11的抗体能够在临床样品中有效地捕获hMPV的M蛋白。随后，用由杂交瘤7G4/A12所产生的抗体(其缀合有对生色底物起作用的酶)来检测这些被捕获且经固定的蛋白质。该特性使得能够将具有不同标记的这两种抗体相组合以用于在其中存在少量抗原的样品中检测同一种抗原。

本发明提供了离体或体外诊断和检测hMPV的病毒抗原M的方法，在所述方法中在检定试验例如ELISA、荧光显微镜检术和免疫印迹中使用由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12所产生和分泌的单克隆抗体。待分析的样品尤其可以为：在体外被hMPV感染的细胞、鼻分泌物、鼻灌洗物、咽分泌物和/或支气管灌洗物或分泌物。本发明提供了在生物学样品和细胞培养物中检测hMPV的方法，其中使用由上面提及的杂交瘤细胞系所产生和/或分泌的单克隆抗体，所述单克隆抗体偶联在任何类型的固体支持物(例如硝酸纤维素、尼龙膜、磁珠、荧光珠或其他支持物)上；或者偶联至任何其他分子，例如酶、蛋白质、荧光团、放射性同位素或任何其他化学化合物。本发明可以在关于hMPV 的检测试剂盒中进行使用，所述试剂盒包含由所提及的杂交瘤所产生的抗体。此外，本发明在其范围内包括掺入任何类型的以化学方式结合的分子或底物，例如标记物、荧光团、生物素、放射性同位素、金属、酶和/或任何与由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12所分泌的单克隆抗体相偶联的化学元素，其中所述以化学方式结合的分子或底物使得能够对所述抗体进行可视化或检测。由此，本发明还提供了抗体，其特异性地识别与不同于所述抗体的分子或底物或标记物相偶联的M蛋白，作为在生物学样品中进行检测、分析和/或诊断的方法的一部分。

附图描述

图1：借助于间接ELISA检定试验，用由杂交瘤3G8/C11和 7G4/A12所产生的单克隆抗体来检测hMPV M蛋白。用50ng的经纯化的重组hMPV M蛋白或用1×10⁶pfu的hMPV活化平板。作为阴性对照，用1×10⁶pfu的呼吸道合胞病毒(RSV)或用50ng的蛋白质BSA活化其他孔；还包括没有抗原、具有一抗、具有缀合有HRP 的抗小鼠IgG的对照孔(没有活化)，和既没有抗原也没有一抗、仅具有抗小鼠IgG抗体的孔(HRP)。随后，将所述孔与以170ng的量的来自于杂交瘤3G8/C11的抗-M抗体(A)、以170ng的量的来自于杂交瘤7G4/A12的抗体(B)和以680ng的量进行使用的商业抗体“抗人偏肺病毒75.1抗体”(克隆1B7，目录号MAB8510(EMDMillipore))(C)一起进行温育。在该图中所显示的数据表示在450 nm处检测到的吸光度，其是通过由存在于抗小鼠IgG的二抗(其与由杂交瘤3G8/C11所分泌的抗体、由杂交瘤7G4/A12所分泌的抗体和 Millipore的MAB8510特异性地结合)上的辣根过氧化物酶(HRP) 所催化的底物四甲基联苯胺至有色化合物的转化而发出的。所述值相应于在至少两个独立的实验中由每个样品所发出的吸光度的平均值±标准偏差。^**P<0.01，和^***P<0.0001，通过相比于阴性对照而言的单向ANOVA检验和经由Dunnett多重比较的验证；ns，相比于阴性对照而言没有显著差异。

图2：测定由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12所产生的单克隆抗体在检测hMPV M蛋白方面的灵敏度。用以50ng的M蛋白开始和以0.04 ng的M蛋白结束的1:2系列稀释物(A)或者从1×10⁵pfu的hMPV 的接种物开始并直至1:5120的稀释度的1:2系列稀释物(B)和从1 ×10⁶pfu的hMPV的接种物开始并直至1:64的稀释度的1:2系列稀释物(C)活化ELISA平板。包括没有活化的孔作为阴性对照。在该图中所显示的数据表示在450nm处的吸光度，其是通过由存在于以 170ng的量的来自于杂交瘤3G8/C11和7G4/A12的抗-M抗体上的辣根过氧化物酶(HRP)所催化的底物四甲基联苯胺至有色化合物的转化而发出的(A和B)。商业抗-hMPV M抗体以较大的量(680ng) 进行使用(C)。所述值相应于在至少两个独立的实验中由每个样品所发出的吸光度的平均值。

图3：由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12所产生的抗-hMPV M单克隆抗体的系列稀释物用于检测经纯化的hMPV的抗原的检定试验。用 50ng的重组hMPV M蛋白活化ELISA平板，并且用从3.4μg/ml的浓度(170ng)开始的抗-M抗体3G8/C11或7G4/A12的1:2系列稀释物来检测该抗原。将所述数据表示为在至少两个独立的实验中以两次重复的每个样品的在450nm处发出的吸光度的值的平均值。

图4：借助于斑点印迹来证实由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12所分泌的单克隆抗体的特异性。将由杂交瘤3G8/C11或7G4/A12所产生的抗-hMPV M抗体与包含下列经固定的样品(以斑点或点渍的形式) 的硝酸纤维素膜一起温育1小时：RSV(1×10⁶PFU)，hMPV(1×10⁶PFU)，BSA(1μg)，hMPV M蛋白(1μg、500ng和50ng)，和20μg的未感染和被hMPV感染的LLC-MK2细胞的提取物。在温育后，洗涤所述膜并将其与缀合有蛋白质HRP的抗小鼠IgG的二抗一起温育1小时。在温育后，通过捕获经由商业底物“增强化学发光 Western印迹检测系统(enhanced chemiluminescence Western blot detection system)”(ECL,Amersham,Uppsala,Sweden)的催化而产生的化学发光来实现单克隆抗体与抗原的结合的可视化。观察到，由杂交瘤3G8/C11或7G4/A12所产生的抗体仅与其中存在hMPV M 蛋白、病毒hMPV和被hMPV感染的细胞的斑点相结合，从而证实了这些抗体的特异性。

图5：在被hMPV感染的LLC-MK2细胞中通过免疫荧光法来检测hMPV M蛋白。使LLC-MK2细胞在体外进行生长，直至达到汇合 (70-90％)，以便用hMPV感染48小时。随后，用低聚甲醛进行固定并准备用于间接免疫荧光法。为此，使用源自杂交瘤3G8/C11的单克隆抗体、源自杂交瘤7G4/A12的单克隆抗体或Millipore的商业抗体MAB8510作为一抗。作为二抗，使用与荧光团Alexa Fluor 488(其在519nm处发射荧光(强信号))相缀合的商业抗小鼠IgG抗体。用荧光团TOPRO-3碘化物(其在661nm处发射荧光(实心圆))对细胞核进行染色。当使用所述三种一抗中的任一种时，仅在被感染的细胞中观察到在细胞质中的强的反应性(白色箭头)。

图6：借助于夹心ELISA来在临床样品中检测hMPV，其中使用由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12所分泌的单克隆抗体的组合。用170ng 的由杂交瘤3G8/C11所分泌的抗体(其作为捕获抗体起作用)活化 ELISA平板。将用该捕获抗体活化的孔与50μl的具有病毒性呼吸道病情的患者的鼻咽拭子(NPS)样品一起进行温育。作为阴性对照，分析了10个来自健康患者的样品。使用20个来自对于hMPV来说阳性的患者的样品，和作为特异性的对照，包括了20个来自对于呼吸道合胞病毒来说阳性的患者的样品。作为阳性对照，包括了向其中添加了经纯化的hMPV M蛋白的孔。为了检测被抗体3G8/C11捕获的蛋白质，使用以1:2000的稀释度的与辣根过氧化物酶相缀合的由杂交瘤 7G4/A12所产生的抗体(75ng/孔)。所显示的数据为每个样品的在 450nm处发出的吸光度的值的平均值±标准偏差(^**P<0.01，^***P <0.0001，和ns表示没有显著差异；借助于相比于对于RSV来说阳性的患者或健康患者而言的单向ANOVA检验)。

发明详述

本发明涉及同种型IgG2A的两种单克隆抗体或其片段，其特异性地识别人偏肺病毒(hMPV)的M蛋白(在此也称为抗-M抗体)。

单克隆抗体是一种以特异性地识别单一抗原为特征的均质抗体类型。单克隆抗体由单一的杂交细胞(杂交瘤)产生，所述杂交细胞产生自B淋巴细胞克隆与肿瘤浆细胞的融合。特异性地和以高亲和力与抗原结合的特性推动了开发单克隆抗体作为具有很大用处的工具以用于检测产生很大的科学、临床和工业用途的价值的分子。目前，单克隆抗体由于其特异性和可重现性(这使得能够更好地为研究建立基础) 而被广泛使用，不仅在基础研究中而且在应用研究中。然而，在生物医学领域中，单克隆抗体具有巨大的实际应用，要么用于许多感染性疾病的诊断和治疗，要么作为用于其他病理学状况的疗法。尽管确信单克隆抗体在所有类型的检测和诊断技术中使用，但是在用于体外诊断的试剂盒的设计中获得了最好的结果。为此，目前存在多种多样的快速检测试剂盒，例如妊娠测试，其基于通过使用抗-hCG抗体来测定尿中的绒毛膜促性腺激素(hCG)的水平。此外，用于治疗用途的单克隆抗体变得大为重要。目前，存在通过使用商业单克隆抗体(尤其是例如，阿仑珠单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、利妥昔单抗、曲妥珠单抗)的用于各种不同病理学状况的治疗性治疗。

本发明的发明人已开发出了两种特异性地识别hMPV M蛋白的单克隆抗体。如已经指出的，这些抗体由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12 产生。由杂交瘤3G8/C11所产生的抗体的两条链的可变区的氨基酸序列描述在SEQ ID No:1(对于重链)和SEQ ID No:2(对于轻链)中。编码它们的核苷酸序列分别描述在SEQ ID No:3和SEQ ID No:4中。类似地，由杂交瘤7G4/A12所产生的抗体的两条链的可变区的氨基酸序列描述在SEQ ID No:5(对于重链)和SEQID No:6(对于轻链) 中。编码它们的核苷酸序列分别描述在SEQ ID No:7和SEQ ID No:8中。

技术人员可以从这些可变序列开始来构建包含它们的嵌合抗体，包括要么仅所述可变区之一要么以所有可能组合的混合物。所有这些实施方案在本发明的范围之内。也就是说，本发明包括这样的抗体，其包含下列序列中的至少一个：序列SEQ ID No:1、SEQ IDNo:2、 SEQ ID No:5和SEQ ID No:6，以及相关于所述氨基酸序列中的任一个而言具有直至90％、95％或99％同源性或同一性的相似序列。以及还包括这样的核苷酸序列，其包含下列序列中的至少一个：序列SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8及其互补的反面序列，以及相对于所述核苷酸序列中的任一个而言具有直至 80％、85％、90％、95％和99％同源性或同一性的相似序列。在核苷酸序列中所考虑的最高的同源性程度基于遗传密码的简并性。如此，本发明还包括编码特异性地识别hMPV M蛋白的单克隆抗体或其片段的核苷酸序列的套组。

如在图1和4中所显示的，这些抗体不与在有关病毒中存在的其他蛋白质或分子或者来自具有其他与呼吸道感染相关联的病毒的患者的样品进行反应。这明显地降低了当在诊断方法中使用它们时假阴性的可能性。

下面，描述了实施例，其使得能够证明本发明的单克隆抗体的各种不同的应用。

实施例1：编码由杂交瘤3G8/C11所分泌的抗-hMPV M抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的核苷酸序列的测定

在37℃和10％CO₂下，使杂交瘤3G8/C11在补充有3.7g/L碳酸氢钠和10％胎牛血清的DMEM-高葡萄糖培养基中进行生长，直至 700,000个细胞/ml的细胞密度。通过用复合试剂Trizol(Invitrogen) 进行处理，获得3.5×10⁶个细胞的总RNA。用Impron II试剂盒(Promega)借助于反转录反应来将0.5μg RNA用于产生cDNA。借助于PCR来扩增编码免疫球蛋白的κ和λ链的基因的可变区。为此，使用Novagen的Ig Primer set试剂盒(目录号：69831-3)的通用引物，并且遵循制造商的说明书。轻链可变区用引物MuIgκVL5'-B：5’ GGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3’(SEQ ID NO:9)和MuIgκVL5'-C：5’ ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT 3’ (SEQ ID NO:10)来进行扩增，而重链可变区用引物MuIgVH5'-A： 5’GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT 3’(SEQ ID NO:11)和MuIgVH5'-F：5’ ACTAGTCGACATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT 3’(SEQ ID NO:12)来进行扩增。按照制造商的说明书将PCR产物克隆到克隆载体pTOPO-TA(Invitrogen)中，并且由智利天主教教皇大学 (Pontificia Universidad Católica de Chile)的测序服务机构在ABI prism 3130xl测序仪(Applied Biosystem)上进行测序。通过使用生物信息学程序Vector NTI(Invitrogen)来获得推导出的氨基酸序列。

实施例2：编码由杂交瘤7G4/A12所分泌的抗-hMPV M抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的核苷酸序列的测定

在37℃和10％CO₂下，使杂交瘤7G4/A12在补充有3.7g/L碳酸氢钠和10％胎牛血清的DMEM-高葡萄糖培养基中进行生长，直至 700,000个细胞/ml的细胞密度。用Trizol(Invitrogen)获得3.5×10⁶个细胞的总RNA，并且用Impron II试剂盒(Promega)借助于反转录反应来将0.5μg RNA用于产生cDNA。借助于PCR来扩增编码免疫球蛋白的κ和λ链的基因的可变区。为此，使用Novagen的Ig Primer set试剂盒(目录号：69831-3)的通用引物，并且遵循制造商的说明书。轻链可变区用引物MuIgκVL5'-B：5’ GGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3’(SEQ ID NO:9)和MuIgκVL5'-C：5’ ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT 3’ (SEQ ID NO:10)来进行扩增，而重链可变区用引物MuIgVH5'-A： 5’GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT 3’(SEQ ID NO:11)和MuIgVH5'-F：5’ ACTAGTCGACATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT 3’(SEQ ID NO:12)来进行扩增。按照制造商的说明书将PCR产物克隆到克隆载体pTOPO-TA(Invitrogen)中，并且由智利天主教教皇大学 (Pontificia UniversidadCatólica de Chile)的测序服务机构在ABI prism 3130xl测序仪(Applied Biosystem)上进行测序。通过使用生物信息学程序Vector NTI(Invitrogen)来获得推导出的氨基酸序列。

实施例3：检测hMPV抗原的检定试验，借助于间接ELISA检定试验来测定抗-hMPV M单克隆抗体对于经纯化的hMPV抗原的特异性

该检定试验的目标为证明由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12所产生的抗体对于hMPV M蛋白的特异性。抗原的检测借助于间接ELISA技术来进行，其中在37℃下用50ng经纯化的抗原来活化ELISA平板1 小时。类似地，用1×10⁶噬斑形成单位(pfu)的hMPV来活化平板。作为阴性对照，包括了呼吸道合胞病毒(RSV)，其在温育hMPV所处的相同条件下，和还包括了在独立的孔中的50ng蛋白质BSA。随后，将平板用磷酸盐缓冲盐水(PBS)/0.05％Tween洗涤两次。之后，在37℃下将平板用PBS/10％FBS封闭2小时。随后，重复洗涤，并接着将在PBS/10％FBS中稀释的终浓度为3.4μg/ml的每一种所述抗体(3G8/C11和7G4/A12)在环境温度下温育1小时(每种抗体在独立的平板中)。在相同的条件下，在不同的平板中，进行对照检定试验，其中以13.6μg/ml的浓度使用识别hMPV M蛋白的商业单克隆抗体(抗人偏肺病毒75.1抗体，克隆1B7，目录号MAB8510，EMD Millipore)。在温育时间过后，重复洗涤，并且在环境温度下向每一个所述孔中添加以在PBS/10％FBS中进行1:2000稀释(25ng/孔) 的用辣根过氧化物酶(HRP)进行标记的抗小鼠IgG的二抗1小时。最后，进行洗涤，并且用50μl的柠檬酸盐缓冲液/四甲基联苯胺(TMB， 3-3’-5-5’-四甲基联苯胺，1mg/ml，Becton Dickinson)来进行揭示。为了检测该反应，添加50μl的2N H₂SO₄并且在ELISA阅读器上于 450nm处读取结果。为了确定二抗的反应在识别一抗方面是特异性的以及所获得的信号不是由于二抗与病毒抗原的非特异性结合而引起的，制作这样的对照，其中仅使用二抗，既没有一抗也没有样品(没有活化的孔)。用于确定一抗的反应对于所述抗原来说是特异性的其他对照在于在未用所述抗原进行活化的ELISA平板(没有抗原的孔) 上使用所述抗体或者在具有50ng蛋白质BSA或不同病毒(RSV)的 ELISA平板上使用所述抗体。结果显示，本发明的单克隆抗体能够特异性地识别50ng经纯化的抗原，因为既不识别蛋白质BSA，也不识别来自其他有关病毒的蛋白质(图1A和1B)。另一方面，观察到，在该检定试验中用作对照的商业抗体(图1C)虽然对于病毒检测来说是特异性的，但在我们实验室中检测经纯化的重组hMPV M蛋白方面不是有效的。

实施例4：用于测定所述单克隆抗体关于检测病毒抗原的灵敏度的检定试验

进行检定试验以测定来自于杂交瘤3G8/C11和7G4/A12的抗 -hMPV M单克隆抗体借助于间接ELISA所能够检测到的蛋白质和病毒的最大稀释度。为此，采用在实施例3中所描述的相同技术。用11 个以50ng经纯化的抗原开始的hMPV M蛋白的1:2系列稀释物活化平板。关于病毒，用从1×10⁵pfu的病毒开始的1:2系列稀释物活化平板。抗-M抗体3G8/C11或7G4/A12以3.4μg/ml的浓度进行使用 (170ng/孔)，它们稀释在PBS/10％FBS中。随后，添加以1:2000 的稀释度的抗小鼠IgG的检测抗体(25ng/孔)。结果显示，抗-M抗体3G8/C11能够识别直至190皮克(pg)的hMPV M蛋白。来自于杂交瘤7G4/A12的抗-M抗体更为灵敏，并且检测到直至90pg的 hMPV M蛋白(图2A)。

关于以其检测到高稀释度的hMPV的能力所表现的抗体的灵敏度，可以观察到，来自于杂交瘤3G8/C11的抗-M抗体可以检测到直至1:60的病毒稀释度，而来自于杂交瘤7G4/A12的抗体能够检测到在以1:2560的稀释度的病毒中的蛋白质，这等价于大约390个病毒颗粒(图2B)。

通过从1×10⁶pfu开始进行1:2稀释来评价Millipore的商业抗体检测所述病毒的能力。可以确定，该抗体能够检测到1×10⁶pfu和两个更大的稀释度，即直至总病毒的1:4的稀释度(图2C)。

在所有检定试验中包括使得能够排除所述抗体的如此多的非特异性反应的对照，其包含除了样品(hMPV M蛋白或病毒)之外的所述检定试验的所有组分。

实施例5：用于测定所述单克隆抗体关于检测病毒抗原的效力的检定试验

进行检定试验以测定允许检测出病毒抗原的来自于杂交瘤 3G8/C11和7G4/A12的抗-hMPV M单克隆抗体的最大稀释度。为此，采用实施例4的相同的间接ELISA技术。用50ng经纯化的抗原活化平板，并且抗-M抗体3G8/C11或7G4/A12以在PBS/10％FBS中的 1:2稀释物来进行使用，从工作浓度(3.4μg/ml)开始直至第11个稀释度。在图3中观察到，在所有的在该检定试验中所使用的稀释度下，抗-M抗体3G8/C11和7G4/A12都能够检测出hMPV M蛋白。

在该检定试验中所包括的阴性对照相应于不包含样品(M蛋白) 的孔，用PBS/10％FBS进行封闭，不添加一抗(抗-M的3G8/C11或抗-M的7G4/A12)，并且仅包含缀合有HRP的抗小鼠IgG抗体。

实施例6：抗-hMPV M单克隆抗体对于经纯化的hMPV抗原的特异性的检定试验，借助于斑点印迹检定试验

该检定试验的目标为通过使用免疫印迹方法来证实由杂交瘤 3G8/C11和7G4/A12所产生的抗体对于hMPV M蛋白的特异性。抗原的检测借助于斑点印迹技术来进行，其中使用硝酸纤维素膜作为固体支持物以用于使存在于悬浮液滴中的抗原固定。为此，在硝酸纤维素膜上放置20μl，其各自包含：1×10⁶pfu的RSV，1×10⁶pfu的 hMPV，经纯化的hMPV M蛋白(1μg、500ng和50ng)，20μg的被hMPV感染的LLC-MK2细胞的提取物，和20μg的未感染的 LLC-MK2细胞的提取物。作为阴性对照，施加包含在20μl中的500 ng BSA。允许施加在膜上的溶液在空气中干燥15分钟。随后，在25℃下用在包含0.05％Tween-20的PBS中的5％BSA将膜封闭1小时。将膜与在封闭溶液中的3.4μg/ml的来自于杂交瘤3G8/C11或杂交瘤 7G4/A12的抗-M单克隆抗体一起在25℃下温育1小时。之后，通过在25℃下用PBS-0.05％Tween-20洗涤三次来移去未粘附至抗原的过量的抗体。结合至抗原的抗体的检测借助于与HRP相缀合的抗小鼠 IgG抗体(Invitrogen,Life Technologies#62-6520)来进行。将这在 25℃下在封闭溶液中温育1小时，以便随后通过在25℃下用 PBS-0.05％Tween-20洗涤三次来去除未结合的过量的抗体。通过捕获经由由与抗小鼠IgG抗体相结合的酶HRP介导的商业底物“增强化学发光Western印迹检测系统”(ECL,Amersham,Uppsala,Sweden) 的催化而产生的化学发光来实现单克隆抗体与抗原的结合的可视化。化学发光的捕获用照片文件资料系统MyECL(Thermo Fisher)来进行。如在图4中所观察到的，来自于杂交瘤3G8/C11和7G4/A12的抗体仅与包含hMPV或M蛋白的“斑点”相结合，而不与包含无关蛋白质、其他病毒或未感染的细胞的“斑点”非特异性地相结合。

实施例7：借助于免疫荧光法来检测在LLC-MK2细胞中的hMPV感染，其中使用抗-hMPV M单克隆抗体

进行该检定试验以通过使用所描述的发明来扩大使得能够检测 hMPV感染的技术谱。通过荧光显微镜检术来进行检定试验，其中将被hMPV感染的或未感染的LLC-MK2细胞与源自杂交瘤3G8/C11 或7G4/A12的抗-hMPV M单克隆抗体一起进行温育。所采用的实验方案如下：在25℃下用在PBS中稀释的4％低聚甲醛固定细胞10分钟。之后，用PBS洗涤细胞，并且在25℃下用在PBS/10％FBS中稀释的0.2％皂苷使细胞透化30分钟。在25℃下添加在PBS/10％FBS 中稀释的浓度为3.4μg/ml的源自杂交瘤3G8/C11或7G4/A12的单克隆抗体1小时。随后，用PBS进行两次洗涤，并且在暗处在25℃下添加以在PBS/10％FBS中的1:200稀释物的与荧光团Alexa fluor 488 相缀合的抗小鼠IgG的二抗(Life Technologies)1小时。重复洗涤，并且在暗处在25℃下用以1:5000的稀释度的TOPRO-3碘化物 642/661(Invitrogen,#T3605)对细胞核染色15分钟。最后，用PBS 进行洗涤，并且安放上盖玻片以便随后在落射荧光显微镜中对其进行观察。所获得的结果显示，构成本发明的抗体对于下述方面也是有用的：能够借助于免疫荧光法特异性地识别被感染的细胞，而不与未感染的细胞非特异性地相结合(图5)。

实施例8：借助于捕获ELISA或夹心ELISA技术来进行的被hMPV 感染的患者的样品的临床诊断，其中使用来自于杂交瘤3G8/C11和 7G4/A12的抗-hMPV M单克隆抗体

由于在从鼻咽拭子获得的临床样品中病毒蛋白质的可得性和浓度是低的，因而必需改进检测方法，并且采用捕获ELISA或夹心ELISA 方法，其中使用来自于杂交瘤3G8/C11的抗-M抗体作为捕获抗体和使用缀合有HRP的抗-M克隆7G4/A12作为检测抗体。为了该检定试验，在37℃下用3.4μg/ml(170ng/孔)的在PBS中稀释的来自于杂交瘤3G8/C11的抗-M抗体活化ELISA平板的孔1小时。用PBS-0.05％ Tween 20进行2次洗涤，并且随后在37℃下用200μL的PBS/10％FBS 将平板封闭2小时。再次进行洗涤，并且在4℃下将每个孔与50μL 的来自根据诊断方法“D³Ultra DFA Respiratory Virus Screening and ID Kit DHI(Diagnostics Hibryds)USA”(其常规地称为“病毒鉴定组盒”(viral panel))对于hMPV来说阳性的患者的鼻咽抽出物一起温育过夜，所述鼻咽抽出物如后面“*”所描述的那样进行处理。作为对照，包括了：1)特异性的对照(50μL的借助于病毒鉴定组盒被诊断为具有RSV的患者的样品)，2)阳性对照(50ng的重组hMPV M蛋白)，和3)相应于健康患者(对于病毒来说阴性的，借助于病毒鉴定组盒)的样品的阴性对照。次日进行洗涤，并且将每个孔与50 μL的缀合有HRP的来自于杂交瘤7G4/A12的抗-M抗体一起在环境温度下温育1小时。洗涤平板多于2次，并且用50μL TMB溶液来进行揭示，将其在暗处温育10至15分钟。用50μL的2N H₂SO₄来终止反应。平板的读取在经认证用于临床诊断的Epoch ELISA阅读器上进行。对于该检定试验所获得的结果显示在图6中，其中可以观察到，使用来自于杂交瘤3G8/C11的抗体作为捕获抗体并且使用来自于杂交瘤7G4/A12的抗体-HRP作为检测抗体的夹心ELISA技术使得能够检测在被hMPV感染的患者(其事先在经认证的临床实验室中通过使用病毒鉴定组盒经由直接免疫荧光法进行了证实)的样品中的抗原。在该检定试验中所包括的患者数目为20，其中18名患者通过ELISA被检测为阳性，具有超过0.1的光密度(OD)。该检定试验还证明了来自于杂交瘤3G8/C11和7G4/A12的抗体所具有的多功能性，因为它们能够同时与抗原相结合，而相互之间既不竞争也不干扰，从而使得能够捕获和随后检测在患者样品中的M蛋白。

^*：临床样品的处理。从包含在通用运输介质中的鼻咽拭子开始来获得用于所述检定试验的样品。将样品在4℃下以2,000rpm离心10 分钟。随后，将上清液(SN1)与粒状沉淀分开；将后者与100μL的 RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS和蛋白酶抑制剂混合剂)一起在4℃下温育15分钟，其中每5分钟进行涡旋搅动。接着，将其在4℃下以2,000 rpm离心10分钟。最后，取出所获得的上清液(SN2)并与SN1相混合。

在本描述性记事录中所描述的实施例证明了这些由杂交瘤细胞系 3G8/C11和7G4/A12所分泌的抗-hMPV M单克隆抗体所具有的特异性、效力、灵敏度和多功能性。在此所呈现的实施例是所述抗-hMPV M单克隆抗体的一些用途的证明，而决不是限制本发明的范围。

序列表

<110> [PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE]

<120> 人偏肺病毒（HMPV）的M抗原的特异性单克隆抗体及其在诊断方法中的用途

<130> [PAT3086/2013]

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 154

<212> PRT

<213> 鼠类

<400> 1

Met Glu Cys Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Pro Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Ser Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Ile Arg Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

130 135 140

Leu Val Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Phe

145 150

<210> 2

<211> 47

<212> PRT

<213> 鼠类

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Phe Ser Phe Phe Phe His Ile Leu

1 5 10 15

Pro Leu Lys Cys Ser Phe Ser Ser Leu Ser Ser Ser Lys Ser Leu Leu

20 25 30

Pro Ser Ser His His Pro Val Ser Leu Gly Ile Thr Ser Glu Phe

35 40 45

<210> 3

<211> 462

<212> DNA

<213> 鼠类

<400> 3

atggaatgca gctgggtctt cctcttcttg gcagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60

gtccaaccgc agcagtctgg gcctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt caggctatac cttcaccagc tcctggatgc actgggtgaa acagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggcatgatt gatccttcca atagtgaaac taggttaaat 240

cagaaattca aggacaaggc cacattgaat gtagacaaat cctccaacac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaat aagggactgg 360

tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg cagccaaaac gacaccccca 420

tccgtttatc ccttggtccc tggaagcttg ggaatcgaat tc 462

<210> 4

<211> 142

<212> DNA

<213> 鼠类

<400> 4

atggagacag acacactcct gctattttct ttcttctttc atatattacc tctcaagtgc 60

agtttctcct ccctctcctc ctctaagtcc cttcttccat cttcccacca tccagtaagc 120

ttgggaatca ctagtgaatt cg 142

<210> 5

<211> 156

<212> PRT

<213> 鼠类

<400> 5

Met Glu Trp Ser Trp Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly Val Asn Ser Glu Val

20 25 30

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val

35 40 45

Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Thr Gln Ser Pro Ala

50 55 60

Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala

65 70 75 80

Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln

85 90 95

Gln Lys Pro Gly Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Ala Ala

100 105 110

Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro

115 120 125

Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Val Thr Val Ser Ala Ala Lys

130 135 140

Thr Thr Pro Pro Pro Val Tyr Ala Leu Gly Pro Trp

145 150 155

<210> 6

<211> 124

<212> PRT

<213> 鼠类

<400> 6

Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser

1 5 10 15

Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr

20 25 30

Arg Ala Ser Glu Gln Gly Leu Glu Trp Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu

50 55 60

Ser Ser Leu Thr Ser Tyr Gln Gln Thr His Pro Pro Thr Gln Pro Thr

65 70 75 80

Cys Asn Ser Ala Ala Trp His Leu Arg Thr Leu Pro Ser Ile Thr Val

85 90 95

Arg Ala Ala Ser Thr Cys Gly Leu Trp Thr Thr Gly Val Lys Glu Leu

100 105 110

Tyr Ser Ser Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Lys Leu

115 120

<210> 7

<211> 468

<212> DNA

<213> 鼠类

<400> 7

atggaatgga gctggttatg ggtactgctg ctctgggttc caggttccgt cttcctcttc 60

ctgatggcag tggttacagg ggtcaattca gaggttcaac tgcagcagtc tgggacagaa 120

cttgtgaagc caggggcctc agtcaaattg tcctgcacag cttctggctt caacattaca 180

cagtctcctg cttccttagc tgtatctctg gggcagaggg ccaccatctc atacagggcc 240

agcaaaagtg tcagtacatc tggctatagt tatatgcact ggaaccaaca gaaaccagga 300

atggaatgga gctgggtctt cctcttcttg gcagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 360

gtccaactgc agcagtctgg gcctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt ggtcactgtc 420

tctgcagcca aaacaacacc cccacccgtc tatgcccttg gcccctgg 468

<210> 8

<211> 372

<212> DNA

<213> 鼠类

<400> 8

atggagtcag acacactgct gactggtgac attgtgctga cacagtctcc tgcttcctta 60

gctgtatctc tggggcagag ggccaccatc tcatacaggg ccagcgaaca gggcctggag 120

tgggacccga agttccaggg caaggccact ataacagcag acacatcctc caacacagcc 180

tacctgcaac tcagcagcct gacatcttac cagcagacac atcctccaac acagcctacc 240

tgcaactcag cagcctggca tctgaggaca ctgccgtcta ttactgtgcg agcggcttct 300

acttgcggac tatggactac tggggtcaag gaactgtatt catcttccat cttcccacca 360

tccagtaagc tt 372

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 鼠类

<400> 9

gggaattcat ggagacagac acactcctgc tat 33

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 鼠类

<400> 10

actagtcgac atggagwcag acacactsct gytatgggt 39

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 鼠类

<400> 11

gggaattcat grasttskgg ytmarctkgr ttt 33

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 鼠类

<400> 12

actagtcgac atgaacttyg ggytsagmtt grttt 35

Claims

1.与呼吸道病毒人偏肺病毒(hMPV)的M蛋白相结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体为：

由杂交瘤3G8/C11所产生的单克隆抗体，其重链可变区序列为SEQ ID NO:1且轻链可变区序列为SEQ ID NO:2；和/或

由杂交瘤7G4/A12所产生的单克隆抗体，其重链可变区序列为SEQ ID NO:5且轻链可变区序列为SEQ ID NO:6。

2.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还结合有从由荧光团、生物素、放射性同位素、金属和酶组成的组中选择的标记物。

3.编码根据权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的套组，其特征在于，所述核苷酸序列的套组为：

编码由杂交瘤3G8/C11所产生的单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的套组，其包括编码重链可变区序列的核苷酸序列SEQ ID NO:3和编码轻链可变区序列的核苷酸序列SEQ ID NO:4；和/或

编码由杂交瘤7G4/A12所产生的单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的套组，其包括编码重链可变区序列的核苷酸序列SEQ ID NO:7和编码轻链可变区序列的核苷酸序列SEQ ID NO:8。

4.根据权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备诊断试剂盒中的用途，所述诊断试剂盒用于在生物学样品中检测hMPV。

5.根据权利要求4的用途，其特征在于，所述生物学样品选自由下列各项组成的组：在体外被hMPV感染的细胞、鼻分泌物、鼻灌洗物、咽分泌物和/或支气管灌洗物或分泌物。

6.根据权利要求4或5的用途，其特征在于，所使用的技术相应于ELISA、免疫荧光法、免疫组织化学、免疫层析、流式细胞术、细胞分选仪、免疫沉淀法和/或Western印迹。

7.根据权利要求4或5的用途，其特征在于，根据权利要求1或2的单克隆抗体或其抗原结合片段缀合有允许其检测的标记物。

8.根据权利要求7的用途，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段结合有从由荧光团、生物素、放射性同位素、金属和酶组成的组中选择的标记物。

9.用于检测hMPV的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包含根据权利要求1或2的单克隆抗体。

10.根据权利要求9的诊断试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体附着在固体支持物上。

11.根据权利要求10的诊断试剂盒，其特征在于，所述固体支持物为由从由硝酸纤维素、纤维素、聚乙烯和尼龙组成的组中选择的化合物之一所形成的膜。

12.根据权利要求9至11中任一项的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒相应于免疫层析测试、luminex、流式细胞术、免疫荧光法、放射免疫分析、Western印迹、斑点印迹、ELISA、免疫扩散法或免疫沉淀法。