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CN107108745A - 抗bace1的抗体和其用于神经疾病免疫疗法的用途 - Google Patents

抗bace1的抗体和其用于神经疾病免疫疗法的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供BAC1的拮抗性抗体和使用所述抗体来治疗神经病学疾病和病症的方法。

Description

抗BACE1的抗体和其用于神经疾病免疫疗法的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年11月19日提交的美国临时申请号62/081,966的优先权权益，所述美国临时申请出于任何目的以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请与呈电子格式的序列表一起提交。序列表以2015年11月16日创建的181,893字节大小的名称为“2015-11-16_01146-0040-00PCT_ST25.txt”的文件提供。所述序列表的电子格式中的信息以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明一般涉及作为例如抑制或降低BACE1活性的BACE1拮抗剂的抗体并且涉及包含所述抗体的组合物。另外的实施方案包括用于治疗和诊断多种神经病学疾病或病症的方法，以及减少患者中的APP和/或Aβ多肽的方法。
背景
淀粉状变性并非单一疾病实体，而是一组不同的进行性疾病过程，其特征在于积聚于一个或多个器官或身体系统中的蜡状淀粉样蛋白(称作淀粉状蛋白)的胞外组织沉积物。由于淀粉状蛋白沉积物积聚，其开始干扰所述器官或身体系统的正常功能。存在至少15种不同类型的淀粉状变性。主要形式是无已知前身的原发性淀粉状变性、在一些其它疾患后的继发性淀粉状变性和遗传性淀粉状变性。
多种老化疾病基于淀粉状蛋白样蛋白(amyloid-like protein)或与淀粉状蛋白样蛋白有关并且其特征部分地在于淀粉状或淀粉状蛋白样材料的胞外沉积物的累积，所述沉积物有助于所述疾病的发病以及进展。这些疾病包括但不限于神经病学病症，如阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease,AD)、路易体痴呆(Lewy body dementia)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛型帕金森-痴呆复合征(Guam Parkinson-Dementia complex)。基于淀粉状蛋白样蛋白(amyloid-like proteins)或与淀粉状蛋白样蛋白有关的其它疾病为进行性核上麻痹、多发性硬化、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeld Jacob disease)、帕金森氏病(Pakinson’s disease)、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化)、成年发病型糖尿病、老年性心脏淀粉状变性、内分泌肿瘤和其它疾病，包括黄斑变性。
多肽β-淀粉状蛋白(Aβ)有可能在阿尔茨海默氏病(AD)的发病中起重要作用。Vassar等,J.Neurosci.29:12787-12794(2009)。CNS中的Aβ多肽积聚导致突触功能障碍、轴索变性和神经元死亡。AD患者的脑显示突出的神经病理学病变的特征性病理，如神经纤维缠结(NFT)和富淀粉状蛋白老年斑。淀粉状蛋白斑的主要组分是Aβ。这些病变与中枢神经系统(CNS)神经元的群体的巨大损失相关并且其进展伴随与AD相关的临床痴呆。
Aβ是前体蛋白，β淀粉状蛋白前体蛋白(β-APP或APP)的蛋白水解产物。APP是I型跨膜蛋白，其依序由两种蛋白酶β-和γ-分泌酶裂解。被称作β-位点淀粉状蛋白前体蛋白裂解酶1(BACE1)的β-分泌酶首先裂解APP以暴露Aβ的N末端，由此产生被称作C99的膜结合片段。Vassar等,J.Neurosci.,29:12787-12794(2009)和UniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817(BACE1_HUMAN)。所述γ-分泌酶接着能够裂解C99以产生成熟Aβ多肽。Aβ由介于38个氨基酸至43个氨基酸长度范围内的异源C末端产生。Aβ的42个氨基酸的形式(Aβ42)是Aβ的成纤维形式并且在具有唐氏综合征的患者中过度产生并且已经表明在AD的早期发病中起作用。Vassar等,J.Neurosci.29:12787-12794(2009)。BACE1因此已成为治疗剂，因为其抑制作用将可能抑制APP和Aβ产生。
实际上，BACE1基因敲除小鼠(BACE1-/-)不产生脑Aβ，因此确认BACE1是负责在脑中产生Aβ的主要(如果并非唯一)酶。Roberds等,Human Mol.Genetics 10:1317-1324(2001)。此外，AD模型中的BACE1基因敲除小鼠不形成淀粉状蛋白斑；认知缺陷和胆碱能功能障碍也得到救助。McConlogue等,J.Biol.Chem.282:26326-26334(2007)；Ohno等,Neuron 41:27-33(2004)；和Laird等,J.Neurosci.25:11693-11709(2005)。另外，BACE1杂合敲除小鼠已经减少了斑块形成，指示BACE1活性的完全抑制并非斑块减少所必需。McConlogue等,J.Biol.Chem.282:26326-26334(2007)。
在患有神经病学疾病和病症(如AD)的患者中具有BACE1的有效治疗抑制剂以减少APP和Aβ产生将是有益的。本文中提供的本发明涉及所述抑制剂，包括其在多种方法中的用途。
本文所引用的所有参考文献(包括专利申请和公布)均以引用的方式整体并入。
概述
本发明提供BACE1拮抗剂抗体和使用所述抗体的方法。具体说来，所述抗体抑制或减少BACE1的活性。
在一些实施方案中，提供一种结合至BACE1的经分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)选自SEQ ID NO:1至6的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:22至25的HVR-H2序列；选自SEQ ID NO:50和51的HVR-H3序列；选自SEQ ID NO:62和63的HVR-L1序列；选自SEQ IDNO:69和70的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:75至78和98的HVR-L3序列；或
b)选自SEQ ID NO:7至21、218和222至224的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:26至49、232、219和225的HVR-H2序列；选自SEQ ID NO:52至61、220、221、226和227的HVR-H3序列；选自SEQ ID NO:64至68的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:69至74和217的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:79至97的HVR-L3序列。
在一些实施方案中，提供一种结合至BACE1的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自表1中的抗体的抗体的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，所述抗体选自6266和6266变体1-15。在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ IDNO:15、218和222至224的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:29、219和255的HVR-H2序列；选自SEQID NO:52、220、221、226和227的HVR-H3序列；SEQ ID NO:65的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:71、73和217的HVR-L2序列；和SEQ ID NO:80的HVR-L3序列。在一些实施方案中，所述抗体包含：
a)与选自SEQ ID NO:99至147、194至200和209至216的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变域序列；或
b)与选自SEQ ID NO:148至178、187至194和201至208的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域序列；或
c)如(a)中的重链可变域序列和如(b)中的轻链可变域序列。
在一些实施方案中，结合BACE1的经分离的抗体包含：
a)选自SEQ ID NO:99至147、194至200和209至216的重链可变域序列；或
b)选自SEQ ID NO:148至178、187至194和201至208的轻链可变域序列；或
c)如(a)中的重链可变域序列和如(b)中的轻链可变域序列。
在一些实施方案中，结合BACE1的经分离的抗体包含：
a)与选自SEQ ID NO:138、194至200和209至216的序列具有至少90％序列同一性的重链可变域序列；或
b)与选自SEQ ID NO:156、187至194和201至208的序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域序列；或
c)如(a)中的重链可变域序列和如(b)中的轻链可变域序列。
在一些实施方案中，结合BACE1的经分离的抗体包含：
a)选自SEQ ID NO:138、194至200和209至216的重链可变域序列；或
b)选自SEQ ID NO:156、187至194和201至208的轻链可变域序列；或
c)如(a)中的重链可变域序列和如(b)中的轻链可变域序列；或
d)选自6266和6266变体1-15的抗体的重链可变域序列和轻链可变域序列。
在一些实施方案中，所述经分离的抗体调节BACE1的活性。在一些实施方案中，所述抗体抑制BACE1的活性。在一些实施方案中，BACE1活性使用均相时间分辨荧光(HTRF)测定来测量。在一些实施方案中，BACE1活性使用表达BACE1底物的细胞系来测量。在一些实施方案中，所述BACE1底物是淀粉状蛋白前体蛋白(APP)。在一些实施方案中，BACE1活性在来自已经施用抗BACE1抗体的动物的组织中测量。在一些实施方案中，所述组织是脑组织。在一些实施方案中，所述动物选自小鼠、大鼠、兔、狗、猴和非人灵长类动物。
在一些实施方案中，所述抗体是BACE1活性的变构抑制剂。在一些实施方案中，所述抗体以如通过表面等离子体共振(SPR)所测量在0.1nM与10nM之间、或在0.1nM与8nM之间、或在0.1nM与7nM之间、或在0.1nM与5nM之间、或在0.5nM与5nM之间、或在0.1nM与3nM之间或在0.5nM与3nM之间的亲和力(KD)结合BACE1。在一些实施方案中，所述抗体实现如例如使用分离皮层神经元培养测定所测量大于60％、大于70％、大于75％或大于80％的BACE1活性的最大抑制。
本发明的抗体可呈多种形式。例如，本发明的抗体可为人抗体或嵌合抗体。在其它方面，本发明的抗体为全长抗体或其片段(例如，包含抗原结合组分的片段)。在一些实施方案中，所述抗体片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv。在一些实施方案中，所述抗体是全长IgG1抗体。在本发明的其它方面，所述抗体是单克隆抗体。另一方面，本发明的抗体可连接或缀合至试剂或部分，例如细胞毒性剂，以产生免疫缀合物。
在一些实施方案中，提供包含本发明的抗体和药学上可接受的载体的药物制剂。在另外的实施方案中，提供编码本发明的抗体的经分离的核酸，以及包含编码本发明的抗体的核酸的载体。另一方面，提供包含编码本发明的抗体的核酸的宿主细胞以及用于制造本发明的抗体的方法，所述方法包括在适用于所述抗体的制造的条件下培养包含编码本发明的抗体的核酸的宿主细胞。
在另一实施方案中，提供一种治疗患有神经病学疾病或病症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的本发明的抗体。
在另一个实施方案中，提供一种减少罹患神经病学疾病或病症或处于感染神经病学疾病或病症的风险中的患者的淀粉状蛋白斑或抑制淀粉状蛋白斑形成的方法，其包括向所述个体施用有效量的本发明的抗体。
在一些实施方案中，一种减少患者的Aβ蛋白的方法包括向所述患者施用有效量的本发明的抗体。在一些方面，所述患者罹患神经病学疾病或病症，或处于感染神经病学疾病或病症的风险中。
在另一实施方案中，提供一种抑制患者的轴索变性的方法，其包括向所述患者施用有效量的本发明的抗体。
在另一个实施方案中，一种诊断患者的神经病学疾病或病症的方法包括使从所述患者分离的生物样品与本发明的抗体在适用于所述抗体结合至BACE1多肽的条件下接触，和检测在所述抗体与所述BACE1多肽之间是否形成复合物。
在一些实施方案中，一种确定患者是否有资格接受使用抗BACE1抗体的疗法的方法包括使从所述患者分离的生物样品与本发明的抗体在适用于所述抗体结合至BACE1多肽的条件下接触，和检测在所述抗体与所述BACE1多肽之间是否形成复合物，其中在所述抗体与BACE1之间复合物的存在指示有资格接受使用抗BACE1抗体的疗法的患者。在一些方面，所述患者罹患神经病学疾病或病症，或处于感染神经病学疾病或病症的风险中。
在一些方面，可用于神经病学疾病或疾患的诊断；或用于预测患者对用BACE1抗体治疗的反应性，或确定患者用BACE1抗体治疗的资格的生物样品包括但不限于如血清、血浆、唾液、胃分泌液、粘液、脑脊髓液、淋巴液等流体或从生物体获得的组织或细胞样品，如神经元、脑、心脏或血管组织。
在本发明方法的一些方面，所述患者是哺乳动物。另一方面，所述患者是人。另一方面，所述神经病学疾病或病症选自由阿尔茨海默氏病(AD)、创伤性脑损伤、中风、青光眼、痴呆、肌肉萎缩症(MD)、多发性硬化(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、囊性纤维化、安格尔曼氏综合征(Angelman’s syndrome)、利德尔综合征(Liddle syndrome)、佩吉特氏病(Paget’s disease)、创伤性脑损伤、路易体病(Lewy body disease)、脊髓灰质炎后综合征、夏伊-德雷格综合征(Shy-Draeger syndrome)、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森氏病(Parkinson’sdisease)、多系统萎缩、纹状体黑质变性、核上性麻痹、牛海绵状脑病、痒病、克罗伊茨费尔特-雅各布综合征(Creutzfeldt-Jakob syndrome)、苦鲁病、格斯特曼-施特劳斯纳-辛克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、慢性消耗性疾病、致命性家族性失眠症、延髓性麻痹、运动神经元病、卡纳万病(Canavan disease)、亨廷顿氏病(Huntington’sdisease)、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大氏病(Alexander’s disease)、杜尔雷斯氏综合征(Tourette’s syndrome)、门克斯卷发综合征(Menkes kinky hair syndrome)、科凯恩综合征(Cockayne syndrome)、哈勒沃登-施帕茨病综合征(Halervorden-Spatzsyndrome)、拉福拉病(lafora disease)、雷特综合征(Rett syndrome)、肝豆状核变性、莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)和翁韦里希特-伦德伯格综合征(Unverricht-Lundborg syndrome)、痴呆(包括但不限于皮克氏病(Pick’s disease)和脊髓小脑性共济失调)组成的组。在一些方面，所述神经病学疾病或病症是阿尔茨海默氏病。在一些实施方面中，所述神经病学疾病或病症选自由阿尔茨海默氏病、中风、创伤性脑损伤和青光眼组成的组。
附图简述
图1A-1D示出本文所述的某些抗BACE1抗体的表位仓和重链HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。
图2A-2C示出本文所述的某些抗BACE1抗体的表位仓和轻链HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
图3A-3G示出本文所述的某些抗BACE1抗体的表位仓和重链可变区(VH)序列。
图4A-4F示出本文所述的某些抗BACE1抗体的表位仓和轻链可变区(VL)序列。
图5A-5D示出使用系统(ForteBio)测得的某些抗BACE1抗体对pH 7.5下的人BACE1(柱2)、pH 7.5下的鼠BACE1(柱3)、pH 5.0下的人BACE1(柱4)和pH 5.0下的鼠BACE1(柱5)的亲和力(KD)；和通过表面等离子体共振(BiacoreTM)测得的某些抗BACE1抗体对人BACE1的亲和力(KD)。关于某些抗体，示出在两种独立测定中测得的亲和力。
图6示出使用短底物测定由所述抗BACE1抗体调节BACE1活性。
图7A-7B示出使用长底物测定和短底物测定由所述抗BACE1抗体调节BACE1活性。
图8A-8C示出由所述抗BACE1抗体体外调节细胞中的APP加工。
图9示出所指示的抗BACE1抗体对内源性淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的加工的影响。使用来自野生型CD1小鼠的E16.5皮层神经元的培养物进行实验。
图10示出在用100mg/kg的所指示的抗BACE1抗体或对照IgG抗体处理的小鼠的脑(皮层)中观察到的Aβx-40水平。
图11示出在单一IV剂量之后食蟹猴中随时间变化的血清抗体浓度。
图12A-B示出抗体6266的亲和力成熟变体1-7的(A)轻链可变区序列和(B)重链可变区序列。
图13A-B示出抗体6266的亲和力成熟变体8-15的(A)轻链可变区序列和(B)重链可变区序列。
图14示出关于抗体6266的亲和力成熟变体的亲和力常数和熔融温度。
本发明实施方案的详述
I.定义
用于本文中的目的的“受体人框架”为包含源于如下文所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，所述VL受体人框架的序列与所述VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列同一。
“亲和力”是指在分子(例如抗体)与其结合搭配物(例如抗原)的单一结合位点之间的非共价相互作用的合计强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常见方法，包括本文所述的那些来测量。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述于下文中。
“亲和力成熟”抗体是指与亲本抗体相比在一个或多个高变区(HVR)中具有一种或多种变化的抗体，所述亲本抗体不具有所述变化，所述变化导致所述抗体对抗原的亲和力的改进。
术语“抗β-分泌酶抗体”、“抗BACE1抗体”、“结合至β-分泌酶的抗体”和“结合至BACE1的抗体”是指能够以充足亲和力结合BACE1的抗体，以致所述抗体适用作靶向BACE1的诊断和/或治疗剂。在一些实施方案中，抗BACE1抗体与无关、非BACE1蛋白的结合程度小于所述抗体与BACE1的结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)所测量。在某些实施方案中，结合至BACE1的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗BACE1抗体结合至在来自不同物种和同种型的BACE1之间保守的BACE1表位。
本文中的术语“抗体”以最广泛含义使用并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指并非完整抗体的分子，其包含完整抗体中结合所述完整抗体所结合的抗原的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参考抗体“结合至相同表位的抗体”是指在竞争测定中阻断所述参考抗体与其抗原的结合达50％或更多的抗体，并且相反地，所述参考抗体在竞争测定中阻断所述抗体与其抗原的结合达50％或更多。本文提供示例性竞争测定。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分是源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分是源于不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指由其重链具有的恒定域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的一些可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、道诺霉素或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶和其片段，如溶核酶；抗生素；毒素，如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文所公开的多种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
试剂(例如，药物制剂)的“有效量”是指在必需的剂量和时间段下有效实现所需的治疗或预防结果的量。
本文中术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中含有恒定区的至少一部分的C末端区。所述术语包括原生序列Fc区和变体Fc区。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226、或从Pro230延伸至所述重链的羧基末端。然而，所述Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可或可不存在。除非本文中另外规定，否则所述Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，所述系统还称为EU指数，如Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991所述。
“框架”或“FR”是指并非高变区(HVR)残基的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般依以下顺序出现于VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换地用于指具有基本上类似于原生抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中已经引入外源核酸的细胞，包括所述细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源于其的后代，而与传代数目无关。后代可能在核酸含量方面未与母细胞完全同一，但可含有突变。本文中包括如关于原始转化细胞中所筛选或选择具有相同功能或生物活性的突变型后代。
“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列或源于利用人抗体谱系或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体。人抗体的这一定义具体地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架。一般说来，人免疫球蛋白VL或VH序列是从可变域序列的亚群中选择。一般说来，序列的亚群是如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚群。在一些实施方案中，关于所述VL，所述亚群是如Kabat等,上述中的亚群κI。在一些实施方案中，关于所述VH，所述亚群是如Kabat等,同上中的亚群III。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将基本上包含至少一个并且一般地两个可变域中的全部，其中全部或基本上全部HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可包含源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”是指已经经历人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变域中在序列方面高变和/或形成在结构上定义的环(“高变环”)的各区。一般说来，原生四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般地包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或牵涉于抗原设别中。示例性高变环出现于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现于L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65和H3的氨基酸残基95-102处。(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。)除了VH中的CDR1，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其为接触抗原的残基。SDR含于CDR中被称作简化CDR或a-CDR的区内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58和H3的氨基酸残基95-102处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另外指示，否则可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等,同上编号。
“免疫缀合物”是缀合至一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，如猴)、兔和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。
“分离”抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)所测定。关于用于抗体纯度评估的方法的综述，参见例如Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。经分离的核酸包括含于细胞中的核酸分子，所述细胞通常含有所述核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
“编码抗BACE1抗体的经分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单一载体或独立载体中的所述核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的所述核酸分子。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指获自基本上均质抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的个别抗体是同一的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体，例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的产生期间出现，所述变体一般少量存在。与一般包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。因此，修饰语“单克隆”指示所述抗体的特征是获自抗体的基本上均质群体，并且不应解释为需要由任何特定方法产生所述抗体。例如，欲根据本发明使用的单克隆抗体可由多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分的转基因动物的方法，所述方法和用于制造单克隆抗体的其它示例性方法描述于本文中。
“裸抗体”是指未缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。所述裸抗体可存在于药物制剂中。
“原生抗体”是指具有变化结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，原生IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫键键结的两条同一轻链和两条同一重链构成。从N末端至C末端，各重链具有可变区(VH)(还称作可变重域或重链可变域)，随后是三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。同样，从N末端至C末端，各轻链具有可变区(VL)(还称作可变轻域或轻链可变域)，随后是恒定轻(CL)域。抗体的轻链可基于其恒定域的氨基酸序列被指派两种类型(称作κ(kappa)和λ(lambda))之一。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中惯常包括的说明书，其含有关于适应症、用法、施用、组合疗法、禁忌症和/或有关所述治疗产品的用途的警告的信息。
关于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”是定义为在比对序列和引入的间隙(必要时)以实现最大百分比序列同一性之后，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代，候选序列中与所述参考多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分率。用于达成确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以在本领域的技能内的多种方式实现，例如使用公开可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长内实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。所述ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创造，并且源代码已经由美国版权局(U.S.Copyright Office),Washington D.C.,20559的用户文档归档，其中其被登记在美国版权登记号TXU510087下。所述ALIGN-2程序由Genentech,Inc.,South San Francisco,California公开可得，或可由源代码编译。所述ALIGN-2程序应编译用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定并且不变化。
在其中ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情形中，给定氨基酸序列A相对、与、或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其或者可表述为具有或包含相对、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)计算如下：
100×分数X/Y
其中X为在A和B的序列比对程序ALIGN-2的比对中由所述程序评分为同一匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y为B中氨基酸残基的总数。应了解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体陈述，否则本文所用的所有％氨基酸序列同一性值均如前一段落中所述使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”是指呈允许其中所含的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对将施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分的制剂。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
除非另外指示，否则如本文所用，术语“BACE1”是指来自任何脊椎动物来源，包括如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)的哺乳动物的任何原生β分泌酶1(还称作β-位点淀粉状蛋白前体蛋白裂解酶1、膜相关天冬氨酸蛋白酶2、膜天冬氨酸蛋白酶2、天冬氨酰蛋白酶2或Asp2)。所述术语涵盖“全长”未加工BACE1以及由细胞中的加工产生的任何形式的BACE1。所述术语还涵盖BACE1的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性BACE1多肽的氨基酸序列在下文中以SEQ ID NO:179示出，并且是如Vassar等,Science 286:735-741(1999)中所报道的人BACE1同种型A的序列，所述文献以引用的方式整体并入本文。
MAQALPWLLLWMGAGVLPAHGTQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPRETDEEPEEPGRRGSFVEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILVDTGSSNFAVGAAPHPFLHRYYQRQLSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLVSIPHGPNVTVRANIAAITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSLEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWCCLRCLRQQHDDFADDISLLK(SEQ ID NO：179)
存在人BACE1的数种其它同种型，包括同种型B、C和D。参见UniProtKB/Swiss-ProtEntry P56817，其以引用的方式整体并入本文。同种型B以SEQ ID NO：180示出并且不同于同种型A(SEQ ID NO：179)，因为其缺少氨基酸190-214(即，SEQ ID NO：179的氨基酸190-214的缺失)。同种型C以SEQ ID NO：181示出并且不同于同种型A(SEQ ID NO：179)，因为其缺少氨基酸146-189(即，(SEQ ID NO：179的氨基酸146-189的缺失)。同种型D以SEQ ID NO：182示出并且不同于同种型A(SEQ ID NO：179)，因为其缺少氨基酸146-189和190-214(即，SEQ ID NO：179的氨基酸146-189和190-214的缺失)。
如本文所用，“治疗(treatment)”(和其语法变化形式，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指尝试改变所治疗的个体的自然病程的临床介入，并且可针对预防或在临床病理的过程期间进行。治疗的所需效应包括但不限于预防疾病的出现或复发、症状的减轻、疾病的任何直接或间接病理学后果的削弱、预防转移、降低疾病进展速率、疾病状态的改善或缓和和缓解或改进的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
术语“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链中牵涉于所述抗体与抗原的结合中的域。原生抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变域一般具有相似结构，其中各域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。)单一VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL域进行分离以分别筛选互补VL或VH域的文库。参见例如Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括呈自我复制核酸结构的载体以及并入其中已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导其可操作性连接的核酸的表达。所述载体在本文中称作“表达载体”。
术语“神经病症”或“神经病学疾病”是指或描述哺乳动物中的中枢和/或周围神经系统的疾病或病症。神经病学病症的实例包括但不限于疾病和病症的以下清单。神经病病症是特征在于不当或不受控神经信号传导或其缺乏的神经系统疾病或异常，并且包括但不限于慢性疼痛(包括伤害性疼痛(由身体组织的损伤引起的疼痛，包括癌症相关疼痛)、神经性疼痛(由神经、脊髓、或脑中的异常引起的疼痛)和精神性疼痛(完全地或主要与心理病症相关)、头痛、偏头痛、神经病和通常伴随如眩晕或恶心的所述神经病病症的症状和综合征。淀粉状变性是一组与CNS中的胞外蛋白沉积物相关的疾病和病症，包括但不限于继发性淀粉状变性、年龄相关淀粉状变性、阿尔茨海默氏病(AD)、轻度认知障碍(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰式)；关岛型帕金森-痴呆复合征、脑淀粉状血管病、亨廷顿氏病、进行性核上麻痹、多发性硬化；克罗伊茨费尔特-雅各布病、帕金森氏病、传染性海绵状脑病、HIV相关痴呆、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、包涵体肌炎(IBM)和与β-淀粉状蛋白沉积相关的眼部疾病(即，黄斑变性、玻璃疣相关的视神经病和白内障)。CNS的癌症的特征在于一个或多个CNS细胞(即，神经细胞)的异常增殖并且包括但不限于神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤、听神经瘤、软骨瘤、少突神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经节神经胶质瘤、神经鞘瘤、纤维神经瘤、神经母细胞瘤和硬膜外、髓内或硬膜内肿瘤。眼部疾病或病症是眼睛的疾病或病症，眼睛出于本文目的被视为经受BBB的CNS器官。眼部疾病或病症包括但不限于巩膜、角膜、虹膜和睫状体的病症(即，巩膜炎、角膜炎、角膜溃疡、角膜擦伤、雪盲、电弧眼、希杰森氏浅层点状角膜病变(Thygeson’s superficialpunctate keratopathy)、角膜新生血管、富克斯氏营养不良、圆锥形角膜、干燥性角膜结膜炎、虹膜炎和葡萄膜炎)、晶状体的病症(即，白内障)、脉络膜和视网膜的病症(即，视网膜脱离、视网膜分层剥离、高血压性视网膜病、糖尿病性视网膜病、视网膜病、早产儿视网膜病、年龄相关黄斑变性、黄斑变性(湿性或干性)、视网膜前膜、色素性视网膜炎和黄斑水肿)、青光眼、飞蚊症、视神经和视通路的病症(即，莱贝尔氏遗传性视神经病(Leber’s hereditaryoptic neuropathy)和视盘玻璃疣)、眼肌/双眼运动调节/屈光的病症(即，斜视、眼肌瘫痪、进行性外眼肌麻痹、内斜视、外斜视、远视、近视、散光、屈光参差、老花眼和眼肌麻痹)、视力障碍和失明(即，弱视、莱伯氏先天性黑朦(Lever’s congenital amaurosis)、盲点、色盲(color blindness)、色盲(achromatopsia)、夜盲、失明、河盲和小眼畸形/缺损)、红眼、阿盖尔-罗伯逊瞳孔(Argyll Robertson pupil)、角膜真菌病、干眼病和和无虹膜。CNS的病毒性或微生物感染包括但不限于由病毒(即，流行性感冒、HIV、脊髓灰质炎病毒、风疹、)、细菌(即，奈瑟氏菌属某种(Neisseria sp.)、链球菌属某种(Streptococcus sp.)、假单胞菌属某种(Pseudomonas sp.)、盲螈属某种(Proteus sp.)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎球菌属某种(Pneumococcus sp.)、脑膜炎球菌属某种(Meningococcussp.)、嗜血杆菌属某种(Haemophilus sp.)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))和其它微生物，如真菌(即，酵母、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans))、寄生虫(即，刚地弓形虫(toxoplasma gondii))或变形虫造成的感染，导致CNS病理生理学，包括但不限于脑膜炎、脑炎、脊髓炎、血管炎和脓肿，其可为急性或慢性的。CNS发炎是由对CNS的损伤引起的发炎，所述损伤可为物理损伤(即，归因于事故、手术、脑创伤、脊髓损伤、震荡)或归因于CNS的一种或多种其它疾病或病症(即，脓肿、癌症、病毒性或微生物感染)或与所述疾病或病症相关的损伤。如本文所用，CNS的缺血是指一组与脑中的异常血流或血管行为相关的病症或其原因，并且包括但不限于局灶性脑缺血、全脑缺血、中风(即，蛛网膜下出血和脑内出血)和动脉瘤。神经退行性疾病是一组与CNS中的神经细胞功能损失或死亡相关的疾病和病症，并且包括但不限于肾上腺脑白质营养不良、亚历山大氏病、阿耳珀氏病(Alper’s disease)、肌萎缩性侧索硬化、共济失调性毛细血管扩张、巴藤病(Batten disease)、科凯恩综合征、皮质基底节变性、由淀粉状变性引起或与淀粉状变性相关的变性、弗里德希氏共济失调(Friedreich’s ataxia)、额颞叶变性、肯尼迪氏病(Kennedy’s disease)、多系统萎缩、多发性硬化、原发性侧索硬化、进行性核上麻痹、脊髓性肌萎缩、横贯性脊髓炎、雷弗素姆氏病(Refsum’s disease)和脊髓小脑性共济失调。CNS的发作疾病和病症涉及CNS中的不当和/或异常导电，并且包括但不限于癫痫(即，失神发作、失张力发作、良性罗兰多癫痫(benign Rolandic epilepsy)、儿童失神、阵挛发作、复杂部分发作、额叶癫痫、热性惊厥、婴儿痉挛、青年型肌阵挛性癫痫、青年型失神癫痫、伦诺克斯-加斯托综合征(Lennox-Gastaut syndrome)、兰道-克莱夫勒综合征(Landau-KleffnerSyndrome)、德莱维特氏综合征(Dravet’s syndrome)、大田原综合征(Otahara syndrome)、韦斯特综合征(West syndrome)、肌阵挛发作、线粒体病症、进行性肌阵挛性癫痫、心因性发作、反射性癫痫、拉斯穆森氏综合征(Rasmussen's Syndrome)、简单部分发作、继发性全身性发作、颞叶癫痫、强直阵挛性发作、强直发作、精神运动性发作、边缘系统癫痫、部分性癫痫发作、全身性癫痫发作、癫痫持续状态、腹型癫痫、无动性发作、自主神经性发作、大规模双侧肌阵挛、月经性癫痫、跌落发作、情绪发作、局灶性发作、痴笑发作、贾克森扩布(Jacksonian March)、拉福拉病、运动发作、多灶性发作、夜间发作、光敏性发作、假性发作、感觉性发作、微小发作、森林发作、戒断发作和视反射发作)。行为病症是特征在于受折磨受试者的一部分上的异常行为的CNS病症并且包括但不限于睡眠病症(即，失眠、异常睡眠、夜惊、昼夜节律睡眠病症和嗜眠发作)、情绪病症(即，抑郁、自杀性抑郁、焦虑、慢性情感病症、恐惧症、惊恐发作、强迫症、注意力缺失过动症(ADHD)、注意力缺失症(ADD)、慢性疲乏综合征、旷野恐怖、创伤后应激病症、双极症)、饮食病症(即，厌食或贪食症)、精神病、发育行为病症(即，孤独症、雷特氏综合征、艾斯伯格综合症(Aspberger’s syndrome))、人格病症和精神病症(即，精神分裂症、妄想性病症等)。溶酶体贮积症是代谢病症，其在一些情况下与CNS相关或具有CNS特异性症状；所述病症包括但不限于泰-萨克斯病(Tay-Sachsdisease)、高歇氏病(Gaucher’s disease)、法布里病(Fabry disease)、粘多糖贮积病(I、II、III、IV、V、VI和VII型)、糖原贮积病、GM1-神经节苷脂贮积病、异染性脑白质病变、法伯氏病(Farber’s disease)、卡纳万氏脑白质病变(Canavan’s leukodystrophy)及1型和2型神经元蜡样脂褐质沉积症、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、庞贝病(Pompedisease)和克拉培氏病(Krabbe’s disease)。
II.组合物和方法
在一些方面，本发明部分地基于结合BACE1并且减少和/或抑制BACE1活性的抗体。在某些实施方案中，提供结合至BACE1的活性位点或外结合位点的抗体。
A.示例性抗BACE1抗体
在一些实施方案中，提供抗BACE1抗体。在一些实施方案中，本文中提供的抗BACE1抗体是BACE1活性的变构抑制剂。非限制性示例性抗BACE1抗体包括包含表1中列出的抗体的重链和轻链可变区的抗体。表1中列出的抗体的重链和轻链可变区分别在图3和4中示出。
表1：抗BACE1抗体
在一些实施方案中，本文所述的抗BACE1抗体(包括但不限于包含表1中列出的抗体的一个或多个HVR或所有六个HVR的抗体)是BACE1活性的变构抑制剂。在一些实施方案中，抗BACE1抗体以如通过表面等离子体共振(SPR)所测量小于10nM、小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM或小于3nM的亲和力(KD)结合BACE1。在一些实施方案中，抗BACE1抗体以如通过表面等离子体共振(SPR)所测量在0.1nM与10nM之间、或在0.1nM与8nM之间、或在0.1nM与7nM之间、或在0.1nM与5nM之间、或在0.5nM与5nM之间、或在0.1nM与3nM之间或在0.5nM与3nM之间的亲和力(KD)结合BACE1。在一些实施方案中，抗BACE1抗体实现如例如使用实施例2E中所述的分离皮层神经元培养测定所测量大于60％、大于70％、大于75％或大于80％的BACE1活性的最大抑制。
在一些方面，本发明提供包含选自表1中列出的抗BACE1抗体的抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR的抗BACE1抗体。图1和2分别示出那些抗体中每一者的重链和轻链HVR序列。在一些实施方案中，本发明提供一种包含选自表1中列出的抗BACE1抗体的抗体的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗BACE1抗体。
在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:1至6的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:22至25的HVR-H2序列；选自SEQ ID NO:50和51的HVR-H3序列；选自SEQ ID NO:62和63的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:69和70的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:75至78和98的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:7至21、218和222至224的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:26至49、232、219和225的HVR-H2序列；选自SEQ ID NO:52至61、220、221、226和227的HVR-H3序列；选自SEQ ID NO:64至68的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:69至74和217的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:79至97的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:15、218和222至224的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:29、219和255的HVR-H2序列；选自SEQ ID NO:52、220、221、226和227的HVR-H3序列；SEQ ID NO:65的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:71、73和217的HVR-L2序列；和SEQ ID NO:80的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含HVR-H1SEQ ID NO:15；HVR-H2序列SEQID NO:29；HVR-H3序列SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:65的HVR-L1序列；HVR-L2序列SEQ ID NO:71；和SEQ ID NO:80的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自抗体6266变体1-15的抗体的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在一些方面，本发明提供包含选自表1中列出的抗BACE1抗体的抗体的至少一个、至少两个或全部三个所选VH HVR序列的抗体。在一些实施方案中，本发明提供一种包含选自表1中列出的抗BACE1抗体的抗体的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的抗体。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:1至6的HVR-H1序列；选自SEQ IDNO:22至25的HVR-H2序列；和选自SEQ ID NO:50和51的HVR-H3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:7至21、218和222至224的HVR-H1序列；和选自SEQ ID NO:26至49、232、219和225的HVR-H2序列；和选自SEQ ID NO:52至61、220、221、226和227的HVR-H3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:15、218和222至224的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:29、219和255的HVR-H2序列；和选自SEQ ID NO:52、220、221、226和227的HVR-H3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含HVR-H1SEQ ID NO:15；HVR-H2序列SEQ ID NO:29；和HVR-H3序列SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自抗体6266变体1-15的抗体的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3。
在一些方面，本发明提供包含选自表1中列出的抗BACE1抗体的抗体的至少一个、至少两个或全部三个所选VL HVR序列的抗体。在一些实施方案中，本发明提供一种包含选自表1中列出的抗BACE1抗体的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:62和63的HVR-L1序列；选自SEQID NO:69和70的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:75至78和98的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:64至68的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:69至74和217的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:79至97的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:65的HVR-L1序列；HVR-L2序列SEQ ID NO:71、73或217；和SEQ ID NO:80的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:65的HVR-L1序列；HVR-L2序列SEQ ID NO:71；和SEQ ID NO:80的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自抗体6266变体1-15的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
另一方面，提供一种包含VH域的重链，所述VH域包含选自表1中列出的抗BACE1抗体的抗体的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列。在一些实施方案中，提供一种包含VH域的重链，所述VH域包含选自表1中列出的抗BACE1抗体的抗体的全部三个VH HVR序列。另一方面，提供一种包含VH域的重链，所述VH域包含选自SEQ ID NO:1至6的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:22至25的HVR-H2序列；和选自SEQ ID NO:50和51的HVR-H3序列。另一方面，提供一种包含VH域的重链，所述VH域包含选自SEQ ID NO:7至21、218和222至224的HVR-H1序列；和选自SEQ ID NO:26至49、232、219和225的HVR-H2序列；和选自SEQ ID NO:52至61、220、221、226和227的HVR-H3序列。在一些实施方案中，提供一种包含VH域的重链，所述VH域包含选自SEQ ID NO:15、218和222至224的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:29、219和255的HVR-H2序列；和选自SEQ ID NO:52、220、221、226和227的HVR-H3序列。在一些实施方案中，提供一种包含VH域的重链，所述VH域包含HVR-H1SEQ ID NO:15；HVR-H2序列SEQ ID NO:29；和HVR-H3序列SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，提供一种包含VH域的重链，所述VH域包含选自抗体6266变体1-15的抗体的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3。
另一方面，提供一种包含VL域的轻链，所述VL域包含选自表1中列出的抗BACE1抗体的抗体的至少一个、至少两个、或全部三个VL HVR序列。在一些实施方案中，提供一种包含VL域的轻链，所述VL域包含选自表1中列出的抗BACE1抗体的抗体的全部三个VL HVR序列。另一方面，提供一种包含VL域的轻链，所述VL域包含选自SEQ ID NO:62和63的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:69和70的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:75至78和98的HVR-L3序列。另一方面，提供一种包含VL域的轻链，所述VL域包含选自SEQ ID NO:64至68的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:69至74和217的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:79至97的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种包含VL域的轻链，所述VL域包含SEQ ID NO:65的HVR-L1序列；HVR-L2序列SEQ ID NO:71、73或217；和SEQ ID NO:80的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种包含VL域的轻链，所述VL域包含SEQ ID NO:65的HVR-L1序列；HVR-L2序列SEQ ID NO:71；和SEQ ID NO:80的HVR-L3序列。在一些实施方案中，提供一种包含VL域的轻链，所述VL域包含选自抗体6266变体1-15的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
另一方面，抗BACE1抗体包含与表1的抗BACE1抗体的VH具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中，抗BACE1抗体包含与选自SEQ ID NO:99至147、194至200和209至216的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中，抗BACE1抗体包含与选自SEQ ID NO:138、194至200和209至216的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中，抗BACE1抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:138具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗BACE1抗体保持结合至BACE1和/或抑制或减少BACE1活性的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:99至147中的任一者中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入、或缺失出现于HVR外部的区中(即，在FR中)。任选地，所述抗BACE1抗体包含SEQ ID NO:99至147、194至200和209至216中的任一者中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，所述VH包含表1中列出的抗BACE1抗体的一个、两个或三个HVR。在一些实施方案中，所述VH包含选自SEQ ID NO:1至6的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:22至25的HVR-H2序列；和选自SEQ ID NO:50和51的HVR-H3序列。在一些实施方案中，所述VH包含选自SEQ IDNO:7至21、218和222至224的HVR-H1序列；和选自SEQ ID NO:26至49、232、219和225的HVR-H2序列；和选自SEQ ID NO:52至61、220、221、226和227的HVR-H3序列。在一些实施方案中，所述VH包含选自SEQ ID NO:15、218和222至224的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:29、219和255的HVR-H2序列；和选自SEQ ID NO:52、220、221、226和227的HVR-H3序列。在一些实施方案中，所述VH包含HVR-H1SEQ ID NO:15；HVR-H2序列SEQ ID NO:29；和HVR-H3序列SEQ IDNO:52。在一些实施方案中，所述VH包含选自抗体6266变体1-15的抗体的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3。
另一方面，抗BACE1抗体包含与表1的抗BACE1抗体的VL具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列。另一方面，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含与选自SEQ ID NO:148至178、187至194和201至208的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:156具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗BACE1抗体保持结合至BACE1和/或抑制或减少BACE1活性的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:148至178、187至194和201至208中的任一者中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失出现于HVR外部的区中(即，在FR中)。任选地，所述抗BACE1抗体包含SEQ ID NO:148至178、187至194和201至208中的任一者中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，所述VL包含表1中列出的抗BACE1抗体的一个、两个或三个HVR。在一些实施方案中，所述VL包含选自SEQ ID NO:62和63的HVR-L1序列；选自SEQID NO:69和70的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:75至78和98的HVR-L3序列。在一些实施方案中，所述VL包含选自SEQ ID NO:64至68的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:69至74和217的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:79至97的HVR-L3序列。在一些实施方案中，所述VL包含SEQID NO:65的HVR-L1序列；HVR-L2序列SEQ ID NO:71、73或217；和SEQ ID NO:80的HVR-L3序列。在一些实施方案中，所述VL包含SEQ ID NO:65的HVR-L1序列；HVR-L2序列SEQ ID NO:71；和SEQ ID NO:80的HVR-L3序列。在一些实施方案中，所述VL包含选自抗体6266变体1-15的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
另一方面，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含如上文所提供的任何实施方案中的VH，和如上文所提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:99至106的VH序列和选自SEQ ID NO:148至152的VL序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:107至147、194至200和209至216的VH序列和选自SEQ ID NO:153至178、187至194和201至208的VL序列。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含表1中列出的抗BACE1抗体的VH和VL。在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:138、194至200和209至216的VH序列，和选自SEQ ID NO:156、187至194和201至208的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:156的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，提供一种抗BACE1抗体，其中所述抗体包含选自抗体6266变体1-15的抗体的VH和VL。
另一方面，本发明提供一种与本文所提供的抗BACE1抗体(如表1中列出的抗BACE1抗体)结合至相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供一种与包含选自SEQ ID NO:99至106的VH序列和选自SEQ ID NO:148至152的VL序列的抗BACE1抗体结合至相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供一种与包含选自SEQ ID NO:107至147、194至200和209至216的VH序列和选自SEQ ID NO:153至178、187至194和201至208的VL序列的抗BACE1抗体结合至相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供一种与分别包含SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:156的VH和VL序列的抗BACE1抗体结合至相同表位的抗体。
在另一实施方案中，提供一种与本文所述的任何抗BACE1抗体竞争结合(例如，结合至相同表位)的抗体。
在本发明的另一方面，根据任何上述实施方案的抗BACE1抗体是单克隆抗体，包括嵌合或人抗体。在一些实施方案中，抗BACE1抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双功能抗体或F(ab’)2片段。在另一实施方案中，所述抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或如本文所定义的其它抗体类别或同种型。
另一方面，根据任何上述实施方案的抗BACE1抗体可并入单独或呈组合形式的任何特征，如以下章节1-7中所述：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文所提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一些实施方案中，Kd是通过用目标的抗体的Fab形式和其抗原如以下测定所述进行的放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量。Fab对抗原的溶液结合亲和力是通过在滴定系列的未标记抗原存在下平衡Fab与最小浓度的(125I)标记的抗原，接着用抗Fab抗体涂覆的板捕获结合的抗原来测量(参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了确立用于所述测定的条件，多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中5μg/ml的捕获性抗Fab抗体(Cappel Labs)涂覆过夜，并且随后在室温(大约23℃)下用PBS中2％(w/v)的牛血清白蛋白阻断持续2至5小时。在非吸附剂板(Nunc#269620)中，100pM或26pM[125I]-抗原与目标的Fab的连续稀释液混合(例如，与Presta等,CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。目标的Fab接着孵育过夜；然而，所述孵育可持续较长时期(例如，约65小时)以确保达到平衡。其后，所述混合物转移至捕获板用于在室温下孵育(例如，持续一小时)。接着去除所述溶液并且所述板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤八次。当所述板已经干燥时，添加150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且所述板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数持续十分钟。选择给出小于或等于20％的最大结合的各Fab的浓度用于竞争结合测定。
根据另一实施方案，在25℃下使用表面等离子体共振测定使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)用固定的抗原CM5芯片在约10响应单位(RU)下测量Kd。简而言之，羧基甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)根据供应商的说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化。抗原用10mM乙酸钠(pH 4.8)稀释至5μg/ml(约0.2μM)，接着以5μl/分钟的流动速率注射以实现大约10响应单位(RU)的偶合蛋白。在抗原注射之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应基团。关于动力学测量，在25℃下以大约25μl/min的流动速率注射Fab(0.78nM至500nM)在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中的两倍连续稀释液。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(评估软件3.2版)通过同时拟合缔合和解离传感图来计算缔合速率(k缔合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(Kd)是计算为比率k解离/k缔合。参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定发现缔合速率超过106M-1s-1，那么所述缔合速率可通过使用荧光猝灭技术来测定，所述荧光猝灭技术测量在25℃下20nM抗抗原抗体(Fab形式)在PBS(pH 7.2)中在递增浓度的抗原存在下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或降低，所述荧光发射强度如光谱仪中所测量，所述光谱仪如停流装备分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌杯的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文所提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，和下文所述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含挽救受体结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双功能抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可为二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗体和四功能抗体也描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文所提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或如猴的非人灵长类动物的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，非人抗体经过人源化以减少对人的免疫原性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般说来，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR(例如，CDR)(或其部分)源于非人抗体，并且FR(或其部分)源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基由来自非人抗体(例如，产生HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和其制造方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述对FR改组的“导向选择”方法)中。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；源于轻链或重链可变区的特定亚群的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人生殖系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文所提供的抗体是人抗体。人抗体可使用本领域中已知的多种技术制造。人抗体一般描述于van Dijk和van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
人抗体可通过向已经经过修饰以响应抗原攻击产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。所述动物一般地含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置换内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机地整合至动物的染色体中。在所述转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座一般地已经去活化。关于用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584，其描述XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429，其描述技术；美国专利号7,041,870，其描述K-M技术，和美国专利申请公布号US 2007/0061900，其描述技术)。来自由所述动物产生的完整抗体的人可变区可例如通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰。
人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于人单克隆抗体的产生的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括描述于例如美国专利号7,189,826(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中的那些。人杂交瘤技术(三体瘤技术)还描述于Vollmers和Brandlein,Histology andHistopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findingsin Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人抗体也可通过分离选自人源性噬菌体展示文库的Fv克隆可变域序列而产生。所述可变域序列可接着与所需的人恒定域组合。用于从抗体文库选择人抗体的技术描述于下文中。
5.源于文库的抗体
本发明抗体可通过筛选组合文库中具有所需的一种或多种活性的抗体而分离。例如，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且筛选所述文库中具有所需的结合特征的抗体的方法。所述方法综述于例如Hoogenboom等Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)中并且进一步描述于例如McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的谱系独立地通过聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机地重组，所述噬菌体文库可接着针对抗原结合噬菌体进行筛选，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。噬菌体一般地展示呈单链Fv(scFv)片段或呈Fab片段的抗体片段。来自免疫来源的文库向免疫原提供高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。或者，可克隆(例如，从人)原生谱系以向多种非自身以及自身抗原提供单一来源的抗体而无需任何免疫化，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，原生文库也可通过从干细胞克隆未重排V-基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变CDR3区并且实现体外重排而以合成方式制备，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文所提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一是针对BACE1并且另一者是针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至BACE1的两个不同表位。双特异性抗体也可用于使细胞毒性剂局限于表达BACE1的细胞。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。
用于制造多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))，WO 93/08829，和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))，和“杵臼”工程化(参见例如美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可通过工程化针对制造抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应(WO 2009/089004A1)；使两种或更多种抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980，和Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来制造双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于制造双特异性抗体片段的“双功能抗体”技术(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体而制备。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化的抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合至BACE1以及另一不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(例如参见US2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文所提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可需要改进所述抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入至编码所述抗体的核苷酸序列中、或通过肽合成制备。所述修饰包括例如所述抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可产生缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，限制条件是所述最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
a)取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一种或多种氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的目标位点包括HVR和FR。保守取代在表2中的标题“保守取代”下示出。更多实质改变在表2中的标题“示例性取代”下提供并且如下文中参考氨基酸侧链类别进一步描述。氨基酸取代可引入至目标的抗体中并且产物针对所需活性进行筛选，例如保持/改进的抗原结合、降低的免疫原性、或改进的ADCC或CDC。
表2
原始残基 示例性取代 优选的取代
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可根据常见侧链特性进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别之一的成员换成另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人抗体)的一个或多个高变区残基。一般说来，所产生的选择用于进一步研究的变体将相对于亲本抗体具有某些生物特性的修饰(例如，改进)(例如，增加的亲和力、减少的免疫原性)和/或将具有基本上保持的亲本抗体的某些生物特性。一种示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)便利地产生。简而言之，一个或多个HVR残基发生突变并且所述变体抗体在噬菌体上展示并且针对特定的生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。
可在HVR中产生改变(例如，取代)，例如以改进抗体亲和力。所述改变可在HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中产生，其中所产生的变体VH或VL针对结合亲和力进行测试。通过构建第二文库并且从所述文库重新选择实现的亲和力成熟已经描述于例如Hoogenboom等Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,(2001).)中。在亲和力成熟的一些实施方案中，多样性被引入至选择用于通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变)中的任一者实现成熟的可变基因中。接着产生第二文库。接着筛选所述文库以识别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定点方法，其中数个HVR残基(例如，每次4-6个残基)随机化。牵涉于抗原结合中的HVR残基可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化特定地加以识别。通常尤其靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入、或缺失可出现于一个或多个HVR内，只要所述改变不会基本上减少所述抗体结合抗原的能力。例如，可在HVR中产生不会基本上减少结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代)。所述改变可在HVR“热点”或SDR外部。在上文所提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR未改变，或含有仅仅一种、两种或三种氨基酸取代。
用于识别抗体中可靶向用于诱变的残基或区的适用方法被称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，标靶残基(例如带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)的残基或基团被识别并且由中性或带负电氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定所述抗体与抗原的相互作用是否受到影响。进一步取代可在氨基酸位置处引入，证明对初始取代的功能性敏感性。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构识别所述抗体与抗原之间的接触点。所述接触残基和相邻残基可作为取代的候选物被靶向或消除。可筛选变体以确定其是否含有所需特性。
氨基酸序列插入包括介于一个残基至含有一百个或更多残基的多肽的长度范围内的氨基-和/或羧基末端融合，以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。所述抗体分子的其它插入变体包括所述抗体的N末端或C末端与酶(例如，针对ADEPT)的融合体或增加所述抗体的血清半衰期的多肽。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，本文所提供的抗体发生改变以增加或降低所述抗体的糖基化程度。糖基化位点添加至抗体或从抗体缺失可便利地通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点而实现。
在所述抗体包含Fc区的情况下，其所连接的碳水化合物可发生改变。由哺乳动物细胞产生的原生抗体一般地包含分支链、双触角寡糖，所述寡糖一般通过N-键联连接至所述Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright等TIBTECH 15:26-32(1997)。所述寡糖可包括多种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接至在所述双触角寡糖结构的“干”中的GlcNAc的海藻糖。在一些实施方案中，可进行本发明抗体中所述寡糖的修饰以便产生具有某些改进的特性的抗体变体。
在一些实施方案中，提供具有缺乏连接(直接地或间接地)至Fc区的海藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，所述抗体中海藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。海藻糖的量是通过如通过MALDI-TOF质谱法所测量，计算相对于连接至Asn 297的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，在糖链内Asn297处的海藻糖的平均量来测定，如例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中大约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，Asn297也可由于抗体中的微小序列变异而位于位置297上游或下游大约±3个氨基酸处，即在位置294与300之间。所述海藻糖基化变体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“去海藻糖基化”或“海藻糖缺乏”抗体变体的公布的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去海藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白海藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1，Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等，尤其在实施例11中)，和基因敲除细胞系，如α-1,6-海藻糖基转移酶基因FUT8基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗体变体进一步具备平分寡糖，例如其中连接至所述抗体的Fc区的双触角寡糖由GlcNAc平分。所述抗体变体可具有减少的海藻糖基化和/或改进的ADCC功能。所述抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)；和US 2005/0123546(Umana等)中。还提供在连接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。所述抗体变体可具有改进的CDC功能。所述抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，一种或多种氨基酸修饰可引入至本文所提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。所述Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但非所有效应子功能的抗体，这使其成为其中抗体的体内半衰期是重要的而某些效应子功能(如补体和ADCC)是非必需或有害的应用的所需候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗尽。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保所述抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页上的表3中。评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。或者，可使用非放射性测定(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于所述测定的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀手(NK)细胞。或者或另外，目标分子的ADCC活性可体内，例如在动物模型中评估，如Clynes等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的模型。也可进行C1q结合测定以确认所述抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Intl.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有减少的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一者或多者的取代的那些(美国专利号6,737,056)。所述Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括其中残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改进或减弱的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一种或多种改进ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334处(残基的EU编号)的取代。
在一些实施方案中，在Fc区中产生改变，其导致改变(即，改进或减弱)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)所述。
具有增加的半衰期和改进的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等)中，所述新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有一种或多种取代的Fc区，所述取代改进Fc区与FcRn的结合。所述Fc变体包括在一个或多个Fc区残基处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
还参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351，涉及Fc区变体的其它实例。
d)半胱氨酸工程化的抗体变体
在某些实施方案中，可需要产生半胱氨酸工程化的抗体(例如“硫代MAb”)，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基出现于抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可及位点处并且可用于使抗体缀合至其它部分(如药物部分或连接体-药物部分)以产生免疫缀合物，如本文中进一步描述。在某些实施方案中，以下残基中的任一者或多者可用半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化的抗体可如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，本文所提供的抗体可进一步经过修饰以含有本领域中已知并且可容易获得的另外的非蛋白部分。适用于抗体的衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧基甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(正-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇和其混合物。聚乙二醇丙醛可由于其在水中的稳定性而在制造方面具有优势。所述聚合物可具有任何分子量，并且可为分支链或无分支的。连接至抗体的聚合物的数目可变化，并且如果连接超过一种聚合物，那么其可为相同或不同分子。一般来说，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于多种考虑因素确定，所述考虑因素包括但不限于欲改进的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将在规定条件下用于疗法等。
在另一实施方案中，提供抗体和非蛋白部分的缀合物，所述非蛋白部分可通过暴露于辐射选择性地加热。在一些实施方案中，所述非蛋白部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。所述辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不伤害普通细胞，但加热所述非蛋白部分至接近抗体-非蛋白部分的细胞被杀死时所处的温度的波长。
B.重组方法和组合物
抗体可使用重组方法和组合物制造，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一些实施方案中，提供编码本文所述的抗BACE1抗体的分离的核酸。所述核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供一种或多种包含所述核酸的载体(例如，表达载体)。在另一实施方案中，提供包含所述核酸的宿主细胞。在一个所述实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下各物转化)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一些实施方案中，提供一种制造抗BACE1抗体的方法，其中所述方法包括在适用于所述抗体的表达的条件下培养如上文所提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
关于抗BACE1抗体的重组产生，例如如上文所述的编码抗体的核酸经过分离并且插入至一种或多种载体中用于宿主细胞中的进一步克隆和/或表达。所述核酸可容易地分离并且使用常规程序测序(例如，通过使用能够特异性结合至编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
用于抗体编码载体的克隆或表达的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中制造，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于细菌中抗体片段和多肽的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，描述大肠杆菌中抗体片段的表达。)在表达后，所述抗体可从细菌细胞浆中的可溶性部分中分离并且可进一步纯化。
除了原核生物以外，如丝状真菌或酵母的真核微生物也是用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于糖基化抗体的表达的合适宿主细胞也源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经识别多种杆状病毒菌株，其可结合昆虫细胞使用，尤其用于草地贪夜蛾细胞的转染。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，经过调适以在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可适用。适用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚胎肾系(如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人子宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC5细胞；和FS4细胞。其它适用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
C.测定
本文所提供的抗BACE1抗体可由本领域中已知的多种测定针对其物理/化学特性和/或生物活性进行识别、筛选或表征。
1.结合测定和其它测定
在一些方面，本发明抗体例如通过如ELISA、免疫印迹等已知方法测试其抗原结合活性。
另一方面，可使用竞争测定来识别与本文所述的任何抗BACE1抗体竞争结合至BACE1的抗体。在某些实施方案中，所述竞争抗体结合至由本文所述的任何抗体结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。用于定位抗体结合的表位的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”Methods in Molecular Biology第66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)中。
在一种示例性竞争测定中，固定的BACE1在包含结合至BACE1的第一标记抗体(例如，本文所述的抗BACE1抗体)和第二未标记抗体的溶液中孵育，所述第二未标记抗体针对其与所述第一抗体竞争结合至BACE1的能力进行测试。所述第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照组，固定的BACE1在包含所述第一标记抗体但不包含所述第二未标记抗体的溶液中孵育。在允许所述第一抗体结合至BACE1的条件下孵育之后，去除过量的未结合抗体，并且测量与固定的BACE1缔合的标记的量。如果与固定的BACE1缔合的标记的量在测试样品中相对于对照样品基本上减少，那么这指示所述第二抗体与所述第一抗体竞争结合至BACE1。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性测定
在一些方面，提供用于识别具有生物活性的其抗BACE1抗体的测定。生物活性可包括例如BACE1天冬氨酰蛋白酶活性的抑制或减少；或由BACE1引起的APP裂解的抑制或减少；或Aβ产生的抑制或减少。还提供具有所述体内和/或体外生物活性的抗体。
在某些实施方案中，针对所述生物活性测试本发明抗体。例如，可在如实施例中详细描述的均相时间分辨荧光HTRF测定中使用合成底物肽测试BACE1蛋白酶活性。
简而言之，均相时间分辨荧光(HTRF)测定可用于使用淀粉状蛋白前体蛋白BACE1裂解位点肽测量BACE1天冬氨酰蛋白酶活性。例如，Bi27肽(生物素-KTEEISEVNLDAEFRHDSGYEVHHQKL(SEQ ID NO:183),American Peptide Company))与用BACE反应缓冲液(50mM乙酸钠pH 4.4和0.1％CHAPS)中的抗BACE抗体预孵育的BACE1组合于384孔板(ProxiplateTM,Perkin-Elmer)中。所述蛋白水解反应混合物在环境温度下孵育75分钟并且通过添加5μL在检测缓冲液(200mM Tris pH 8.0、20mM EDTA、0.1％BSA和0.8M KF)中含有2nM链霉亲和素-D2和150nM用铕穴状化合物标记的抗淀粉状蛋白β抗体的HTRF检测混合物来猝灭。最终反应混合物在环境温度下孵育60分钟并且使用EnVision MultilabelPlate ReaderTM(Perkin-Elmer)在320nm的激发波长和615和665nm的发射波长下测量TR-FRET信号。
在一些实施方案中，可使用微流体毛细管电泳(MCE)测定测量BACE1蛋白酶活性。MCE测定反应可在标准酶反应中进行，通过添加酶的底物和含有人BACE1(胞外域)的4x化合物、淀粉状蛋白前体蛋白β分泌酶活性位点肽(FAM-KTEEISEVNLDAEFRWKK-CONH2(SEQ IDNO:186))、50mM NaOAc pH 4.4和0.1％CHAPS开始。在环境温度下孵育60分钟之后，各反应中的产物和底物使用在(both,Caliper Life Sciences)上分析的12道微流体芯片来分离。产物和底物的分离通过使用制造商的优化软件选择电压和压力来优化。由电泳图使用HTS Well分析仪软件(Caliper Life Sciences)计算底物转化。
另外，BACE1蛋白酶活性可在表达BACE1底物(如APP)的细胞系中(如本文实施例中所述)；或在表达BACE1底物(如人APP)的转基因小鼠中(如PCT公布号WO 2012/064836 A1中所述)体内测试。
另外，BACE1蛋白酶活性可用抗BACE1抗体在动物模型中测试。例如，多种神经病学疾病和病症的动物模型和用于检查与这些模型相关的病理学过程的相关技术可在本领域中容易地获得。多种神经病学病症的动物模型包括非重组和重组(转基因)动物。非重组动物模型包括例如啮齿动物，例如鼠模型。所述模型可通过使用标准技术将细胞引入至同基因小鼠中而产生，所述标准技术例如皮下注射、尾静脉注射、脾移植、腹膜内移植和在肾小囊下移植。体内模型包括中风/脑缺血模型、神经退行性疾病的体内模型，如帕金森氏病的小鼠模型；阿尔茨海默氏病的小鼠模型；肌萎缩性侧索硬化的小鼠模型；脊髓性肌萎缩的小鼠模型；局灶性和全脑缺血的小鼠/大鼠模型，例如常见颈动脉闭塞或中脑动脉闭塞模型；或在离体全胚胎培养物中。作为一个非限制性实例，存在多种本领域已知的针对阿尔茨海默氏病的小鼠模型((参见例如Rakover等,Neurodegener.Dis.(2007)；4(5):392-402；Mouri等,FASEB J.(2007)7月；21(9):2135-48；Minkeviciene等,J.Pharmacol.Exp.Ther.(2004)11月；311(2):677-82和Yuede等,Behav Pharmacol.(2007)9月；18(5-6):347-63)。所述多种测定可以如本领域中已知并且如文献中所述的已知体外或体内测定格式进行。多种所述动物模型也可从商业供应商，如Jackson Laboratory获得。
D.免疫缀合物
本发明还提供包含缀合至一种或多种细胞毒性剂的本文抗BACE1抗体的免疫缀合物，所述细胞毒性剂如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素。
在一些实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于美登素类(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0 425 235 B1)；阿里他汀，如单甲基阿里他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类，如道诺霉素或阿霉素(参见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷，如多西紫杉醇、紫杉醇、拉洛他赛、替司他赛和奥他赛；单端孢霉烯；和CC1065。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含缀合至酶活性毒素或其片段的如本文所述的抗体，所述毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌)、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含缀合至放射性原子以形成放射性缀合物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于放射性缀合物的产生。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当所述放射性缀合物用于检测时，其可包含用于闪烁研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(还称为磁共振成像，mri)的自旋标记，如再次碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白偶合剂制备，所述偶合剂如N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨二甲酯HCl)、活性酯(如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备。碳-14标记的1-异硫氰酸根苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。所述连接体可为促进细胞中的细胞毒性药物释放的“可裂解连接体”。例如，可使用酸不稳定连接体、肽酶敏感性连接体、光敏性连接体、二甲基连接体或含二硫化物连接体(Chari等,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC确切地涵盖但不限于用交联剂试剂制备的所述缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、和SVSB(丁二酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其可购得(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
E.用于诊断学和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文所提供的任何抗BACE1抗体均适用于检测生物样品中BACE1的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，如血清、血浆、唾液、胃分泌液、粘液、脑脊髓液、淋巴液、神经元组织、脑组织、心脏组织或血管组织。
在一些实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗BACE1抗体。另一方面，提供一种检测生物样品中BACE1的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使所述生物样品与如本文所述的抗BACE1抗体在允许所述抗BACE1抗体结合至BACE1的条件下接触，和检测在所述抗BACE1抗体与BACE1之间是否形成复合物。所述方法可为体外或体内方法。在一些实施方案中，使用抗BACE1抗体来选择有资格接受使用抗BACE1抗体的疗法的受试者，例如在BACE1是用于患者的选择的生物标志物的情况下。
可使用本发明抗体诊断的示例性病症包括神经退行性疾病(包括但不限于路易体病、脊髓灰质炎后综合征、夏伊-德雷格综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森氏病、多系统萎缩、纹状体黑质变性)、τ蛋白病(包括但不限于阿尔茨海默病和核上性麻痹)、朊病毒病(包括但不限于牛海绵状脑病、痒病、克罗伊茨费尔特-雅各布综合征、苦鲁病、格斯特曼-施特劳斯纳-辛克病、慢性消耗性疾病和致命性家族性失眠症)、中风、肌肉萎缩症、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、安格尔曼氏综合征、利德尔综合征、佩吉特氏病、创伤性脑损伤、延髓性麻痹、运动神经元病及神经系统异源退行性病症(包括但不限于卡纳万病、亨廷顿氏病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大氏病、杜尔雷斯氏综合征、门克斯卷发综合征、科凯恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、莱施-奈恩综合征和翁韦里希特-伦德伯格综合征)、痴呆(包括但不限于皮克氏病和脊髓小脑性共济失调)。
在某些实施方案中，提供标记的抗BACE1抗体。标记包括但不限于直接地检测的标记或部分(如荧光、发色团、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及例如通过酶反应或分子相互作用间接地检测的部分，如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团(如稀土螯合物或荧光素和其衍生物)，若丹明和其衍生物，丹磺酰基，伞形酮，荧光素酶(例如荧火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456))，荧光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，与使用过氧化氢来氧化染料前体的酶(如HRP、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶)偶合的杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等。
F.药物制剂
如本文所述的抗BACE1抗体的药物制剂是通过混合具有所需纯度程度的所述抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))而以冻干制剂或水溶性的形式制备。药学上可接受的载体一般在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子性表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一些方面，sHASEGP与一种或多种另外的粘多糖酶(如软骨素酶)组合。
示例性冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后者制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的制剂也可含有所治疗的特定适应症所必需的超过一种活性成分，优选的是具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些。所述活性成分合适地以有效用于预期目的的量组合存在。
活性成分可包埋于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶状药物递送系统中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或在巨乳液中的羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。所述技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成型物件的形式，例如膜、或微胶囊。
欲用于体内施用的制剂一般为无菌的。无菌性可例如通过经由无菌滤膜过滤而容易地实现。
G.治疗方法和组合物
本文所提供的任何抗BACE1抗体均可用于治疗方法中。
在一些方面，提供用作药剂的抗BACE1抗体。在其它方面，提供用于治疗神经病学疾病或病症(例如AD)的抗BACE1抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的抗BACE1抗体。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗具有神经病学疾病或病症的个体的方法中的抗BACE1抗体，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述抗BACE1抗体。在一个所述实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在其它实施方案中，本发明提供用于减少或抑制处于神经病学疾病或病症(例如AD)的风险中或罹患神经病学疾病或病症(例如AD)的患者中的淀粉状蛋白斑形成的抗BACE1抗体。在某些实施方案中，本发明提供用于减少或抑制个体中的Aβ产生的方法中的抗BACE1抗体，所述方法包括向所述个体施用有效的所述抗BACE1抗体。根据任何上述实施方案的“个体”优选地为人。在某些方面，用于本发明方法中的抗BACE抗体减少或抑制BACE1活性。例如，所述抗BACE1抗体减少或抑制BACE1裂解APP的能力。
另一方面，本发明提供抗BACE1抗体用于制造或制备药剂的用途。在一些实施方案中，所述药剂是用于治疗神经病学疾病或病症。在另一实施方案中，所述药剂是用于治疗神经病学疾病或病症的方法中，所述方法包括向具有神经病学疾病或病症的个体施用有效量的所述药剂。在一个所述实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。在另一实施方案中，所述药剂是用于抑制BACE1活性。在另一实施方案中，所述药剂是用于抑制个体中的Aβ产生或斑块形成的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药剂以抑制Aβ产生或斑块形成。根据任何上述实施方案的“个体”可为人。
另一方面，本发明提供一种用于治疗阿尔茨海默氏病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向具有AD的个体施用有效量的抗BACE1抗体。在一个所述实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。根据任何上述实施方案的“个体”可为人。
另一方面，本发明提供包含本文所提供的任何抗BACE1抗体的药物制剂，例如，用于任何上述治疗方法中。在一些实施方案中，药物制剂包含本文所提供的任何抗BACE1抗体和药学上可接受的载体。在另一实施方案中，药物制剂包含本文所提供的任何抗BACE1抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。
本发明抗体可单独或与其它试剂组合用于疗法中。例如，本发明抗体可与至少一种另外的治疗剂共同施用。
上文记录的所述组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括于同一或独立制剂中)，和独立施用，在所述情况下，本发明抗体的施用可在所述另外的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时和/或之后发生。本发明抗体也可与辐射疗法组合使用。
本发明抗体(和任何另外的治疗剂)可通过任何合适方式，包括肠胃外、肺内和鼻内施用，并且必要时用于局部治疗、病变内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可通过任何合适途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，部分地取决于施用是短暂的抑或长期的。本文中涵盖多种给药方案，包括但不限于经过多个时间点单次或多次施用、快速施用和脉冲输注。
本发明的某些实施方案提供所述抗体或其片段来跨血-脑屏障。某些神经退行性疾病与血-脑屏障的渗透性增加，使得所述抗体或其活性片段可容易地引入至脑中有关。当血-脑屏障保持完整时，存在数种本领域已知的用于跨血-脑屏障转运分子的方法，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法和基于受体和通道的方法。
跨血-脑屏障转运所述抗体或其片段的物理方法包括但不限于完全地回避血-脑屏障，或通过在血-脑屏障中产生开口。回避方法包括但不限于直接注射至脑中(参见例如Papanastassiou等,Gene Therapy 9:398-406(2002))和在脑中植入递送装置(参见例如Gill等,Nature Med.9:589-595(2003)；和Gliadel WafersTM,GuildfordPharmaceutical)。在所述屏障中产生开口的方法包括但不限于超声波(参见例如美国专利公布号2002/0038086)、渗透压(例如，通过施用高渗甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation,第1和2卷,Plenum Press,N.Y.(1989)))、通过例如缓激肽或渗透剂A-7渗透(参见例如美国专利号5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)、用含有编码所述抗体或其片段的基因的载体转染跨血-脑屏障的神经元(参见例如美国专利公布号2003/0083299)。
跨血-脑屏障转运所述抗体或其片段的基于脂质的方法包括但不限于在偶合至结合至血-脑屏障的血管内皮上的受体的抗体结合片段的脂质体中封装所述抗体或其片段(参见例如美国专利申请公布号20020025313)和在低密度脂蛋白粒子(参见例如美国专利申请公布号20040204354)或阿朴脂蛋白E(参见例如美国专利申请公布号20040131692)中涂覆所述抗体或其活性片段。
本发明抗体将以与良好医学规范一致的方式配制、给药和施用。在这种情况下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床疾患、病症的原因、药剂的递送位点、施用方法、施用的时间安排和医学从业者已知的其它因素。所述抗体无需但任选地用目前用于预防或治疗所讨论的病症的一种或多种药剂配制。所述其它试剂的有效量取决于存在于制剂中的抗体的量、病症或治疗的类型和上文所讨论的其它因素。这些一般以相同剂量并且用如上文所述的施用途径，或以本文所述的剂量的约1至99％，或以任何剂量并且通过凭经验/临床确定适当的任何途径使用。
关于疾病的预防或治疗，本发明抗体的适当剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于欲治疗的疾病的类型、抗体类型、疾病的严重程度和过程、抗体是针对预防性或治疗性目的施用、前一疗法、患者的临床病史和对抗体的响应和主治医师的判断。所述抗体合适地同时或经过一系列治疗施用于患者。视疾病的类型和严重程度而定，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可为施用于患者的初始候选剂量，无论例如通过一次或多次独立施用、或通过连续输注均如此。一种典型的每日剂量可能介于约1μg/kg至100mg/kg或更高范围内，视上文所提到的因素而定。关于经过数天或更久重复施用，视疾患而定，治疗一般将持续直至出现疾病症状的所需抑制。所述抗体的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg范围内。因此，约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg中的一种或多种剂量(或其任何组合)可施用于患者。所述剂量可间歇地施用，例如每周或每隔三周(例如，使得患者接受约二个至约二十个、或例如约六个剂量的所述抗体)。可施用初始较高上样剂量、随后一个或多个较低剂量。然而，其它剂量方案也可适用。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定监测。
应了解，任何上述制剂或治疗方法均可使用本发明的免疫缀合物替代抗BACE1抗体或连同抗BACE1抗体进行。
H.制造物件
在本发明的另一方面，提供含有适用于上述病症的治疗、预防和/或诊断的材料的制造物件。所述制造物件包含容器和在所述容器上或与所述容器缔合的标签或包装插页。合适容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可由多种材料，如玻璃或塑料形成。所述容器容纳单独或与有效用于治疗、预防和/或诊断所述疾患的另一组合物组合的组合物并且可具有无菌存取口(例如，所述容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂为本发明抗体。所述标签或包装插页指示所述组合物用于治疗所选择的疾患。此外，所述制造物件可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一细胞毒性或其它方面治疗剂。在本发明的这一实施方案中的制造物件可进一步包括包装插页，其指示所述组合物可用于治疗特定疾患。或者或另外，所述制造物件可进一步包括第二(或第三)容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可进一步包括从商业和用户观点来看可需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
应了解，任何上述制造物件均可包括替代抗BACE1抗体或连同抗BACE1抗体的本发明的免疫缀合物。
III.实施例
以下为本发明的方法和组合物的实施例。应了解已知上文所提供的一般描述，可实践多种其它实施方案。
实施例1：抗BACE1抗体的产生
使用基于酵母的人抗体展示文库产生特异性结合至BACE1的完全人抗体，所述针对人BACE1胞外域(BACE1-ECD)，即SEQ ID NO:179的氨基酸1-457进行选择。
如先前所述增殖各自具有约109的多样性的八个原生人合成酵母文库(参见例如：Xu等,2013,Protein Eng.Des.Sel.,26:663-70；WO2009036379；WO2010105256；WO2012009568)。关于前两轮选择，如所述(参见例如Siegel等,2004,J.Immunol.Methods,286:141-53)进行利用Miltenyi MAC系统的磁珠分选技术。简而言之，将酵母细胞(约1010个细胞/文库)在室温下在FACS洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)/0.1％牛血清白蛋白(BSA))中用200nM生物素化的BACE1-ECD孵育15min。在用50ml冰冷洗涤缓冲液洗涤一次之后，将细胞沉淀重悬于40mL洗涤缓冲液中，并且将链霉亲和素微珠(500μl)添加至酵母中并且在4℃下孵育15min。接着，将酵母沉淀，重悬于5mL洗涤缓冲液中，并且上样至MiltenyiLS柱上。在上样5mL之后，将所述柱用3ml FACS洗涤缓冲液洗涤3次。接着将所述柱从磁场中取出，并且将酵母用5mL生长培养基洗脱并且接着生长过夜。使用流式细胞术进行以下数轮分选。将大约1×108个酵母沉淀，用洗涤缓冲液洗涤三次，并且用降低浓度的生物素化的BACE1-ECD(100至1nM)在室温下在平衡条件下孵育。将酵母接着洗涤两次并且用LC-FITC(1:100稀释)和SA-633(1:500稀释)或EA-PE(1:50稀释)第二试剂在4℃下染色持续15min。在用冰冷洗涤缓冲液洗涤两次之后，将细胞沉淀重悬于0.4mL洗涤缓冲液中并且转移至滤器-盖帽分选管中。使用FACS ARIA分选仪(BD Biosciences)进行分选并且确定分选门以针对粘合剂进行选择。在最后一轮分选之后，将酵母涂覆并且拣选个别集落进行表征。
通过进行轻链和重链多样化(各自描述于下文)来进行选择抗体的优化。
轻链多样化：萃取重链质粒并且以大约1×106的多样性转化至重链文库中。如上文所述使用生物素化的BACE1-ECD滴定用一轮MACS分选和两轮FACS分选进行选择，因此针对较高亲和力进行选择。
重链多样化：CDRH3与具有1×108的多样性的CDRH1和CDRH2变体重新组合成预制文库并且如上文所述进行选择。通过使抗原抗体酵母复合物与亲本Fab或未生物素化的抗原一起孵育不同时间量来施加亲和力压力以针对最高亲和力抗体进行选择。另外的多样化循环利用重链和轻链的基于易错PCR的诱变。类似于先前循环针对所有三轮使用FACS分选进行选择并且针对Fab压力的时间增加。
从用于测序和进一步表征的选择过程选择七十八种抗体。针对所述七十八种抗体的重链和轻链HVR分别在图1和2中示出。重链和轻链可变区序列分别在图3和4中示出。
确定所述抗体在两个独立表位仓中。针对各抗体的表位仓(仓“2”或仓“3”)在图1至4中示出。
实施例2：抗BACE1抗体的表征
将在实施例1中选择的抗BACE1抗体使用下文所述的测定进行进一步表征。
A.使用系统的结合动力学
使用如下系统(ForteBio)确定在实施例1中针对人和鼠BACE1 ECD选择的所述78种抗BACE1抗体的结合亲和力。将抗BACE1抗体上样至抗人捕获(AHC)传感器(尖端)上，随后是测定缓冲液中的60秒基线。接着将尖端暴露于200nM人BACE1 ECD(在CHO细胞中产生或购自R&D Systems)或鼠BACE1 ECD(在CHO细胞中产生；SEQ ID NO:231)。将尖端转移至测定缓冲液中持续5分钟、30分钟或120分钟(视解离速率而定)用于解离速率测量。测定缓冲液为PBS+0.1％BSA，pH 7.5；或PBS+0.1％BSA，pH 5.0。使用1:1结合模型分析动力学。
此实验的结果在图5中示出。在KD之前具有“<”标号的测量值达到用于此测定运行的可测量解离速率的下限。
B.使用表面等离子体共振(BIAcoreTM)的结合动力学
使用BIAcoreTM-T100仪器通过表面等离子体共振(SRP)测量某些抗BACE1 IgG的结合亲和力。抗BACE1人IgG由涂覆于CM5生物传感器芯片上的小鼠抗人Fc抗体(GEHealthcare,目录号BR-1008-39)捕获以实现大约150个响应单元(RU)。关于动力学测量，将人BACE1(R&D Systems)于HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.05％v/v表面活性剂P20,GE Healthcare)中的两倍连续稀释液(125nM至0nM)在25℃下以30μl/min的流动速率注射。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(Langmuir binding model)(BIAcore评估软件3.2版)计算缔合速率(k缔合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(KD)计算为比率k解离/k缔合。
所述实验的结果在图5中示出。
C.表位框并
使用系统进行78种抗体的表位框并。简而言之，将第一抗体上样至多个AHC尖端上，随后是测定缓冲液(pH 7.5)中的60秒基线。接着将尖端暴露于200nM人BACE1持续180秒以允许抗原结合。将尖端转移至含有于测定缓冲液中的50μg/ml第二抗体的孔中持续90秒。如果所述第二抗体显示清楚结合，那么其被视为非竞争物(即，在不同于所述第一抗体的表位仓中)。如果所述第二抗体不显示清楚结合，那么其被视为竞争物(即，在与所述第一抗体相同的表位仓中)。通过比较在所述第一抗体存在下结合至BACE1的第二抗体与阻断自身的所述第一抗体来进行结合确定。为了选择第一抗体，进行类似于上述分析的分析，并且选择显示互相排斥结合的抗体。
针对各抗体的表位仓在图1至4中示出。所述78种抗体属于两个表位仓。
D.体外抑制测定
另外，使用HTRF测定体外评估抗体调节某些BACE底物上的BACE1蛋白水解活性的能力。
在第一测定中，将某些抗BACE1抗体在反应缓冲液(50mM乙酸钠pH 4.4，0.1％CHAPS)中稀释至大约0.6μM。将BACE1 ECD在反应缓冲液中稀释至0.3μM。将3μL BACE1和3μL抗BACE1抗体合并于384孔板的孔中并且孵育30分钟。添加3μL FRET短底物Mca-SEVNLDAEFRK(Dnp)RR-NH2(Mca：(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基，Dnp：2,4-二硝基苯基；R&DSystems)(SEQ ID NO:184)并且通过脉冲旋转进行混合。每10分钟监测裂解的底物的荧光性持续1小时(激发320nm，发射405nm)。一式四份测试各抗BACE1抗体。BACE1活性的调节被计算为((游离酶活性)–(IgG:酶活性))/(游离酶活性)。正值表示抑制并且负值表示活化。
此实验的结果在图6中示出。在这种短底物测定中，观察到酶抑制(正百分率)和酶活化(负值)。
在第二测定中，如下在HTRF测定中测试某些抗BACE1抗体。将2微升的375nM Bi27(生物素-KTEEISEVNLDAEFRHDSGYEVHHQKL(SEQ ID NO:183),American Peptide Company))与3μL用在BACE反应缓冲液(50mM乙酸钠pH 4.4和0.1％CHAPS)中的抗BACE抗体预孵育的125nM BACE1合并于384孔板(ProxiplateTM,Perkin-Elmer)中，所述Bi27是一种具有增加对BACE1裂解的敏感性的取代的淀粉状蛋白前体蛋白BACE1裂解位点肽。将所述蛋白水解反应混合物在环境温度下孵育75分钟并且通过添加5μL在检测缓冲液(200mM Tris pH 8.0、20mM EDTA、0.1％BSA和0.8M KF)中含有2nM链霉亲和素-D2和150nM 6E10抗淀粉状蛋白β抗体(Covance,Emoryville,CA)的HTRF检测混合物来猝灭。将最终反应混合物在环境温度下孵育60分钟并且使用EnVision Multilabel Plate ReaderTM(Perkin-Elmer)在320nm的激发波长及615和665nm的发射波长下测量TR-FRET信号。缺乏BACE1酶的反应和缺乏抗BAC E1抗体的反应用作对照组。另外，也与上述HTRF反应相同，进行使用短FRET肽(Rh-EVNLDAEFK-猝灭剂(SEQ ID NO:185),Invitr ogen)的反应。
BACE1的合成肽抑制剂OM99-2(目录号496000)用作对照。来自对照反应的所得荧光产物如上文、但在545nm的激发波长和585nm的发射波长下测量。使用GraphPad Prism 5TM(LaJolla,CA)分析所获得的数据。
所述实验的结果在图7中示出。“降低的”数据模式指示抑制，而“增加的”数据模式指示活化。
不意图受任何特定理论束缚，由变构抑制剂调节酶活性可在一些情况下导致活化或活性的抑制，视底物而定。例如，由变构抑制剂引起的构象改变可引起一种底物的较佳结合并且可干扰另一种底物的结合，导致不同的或甚至相反的活性调节。
E.原代培养物中的体内活性测定
为了确定所观察到的抗BACE1抗体对APP加工的体外抑制作用是否也存在于细胞环境中，进行体内研究。如下评估所述抗体抑制表达内源水平的野生型人淀粉状蛋白前体蛋白的小鼠皮层神经元的原代培养物中的Aβx-40产生的能力。简而言之，由E16.5CD1小鼠制备分离皮层神经元培养物。将神经元以2.5×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中并且在Neurobasal培养基(Life Technologies)中体外生长五天。将以8点稀释系列制备的50μl含抗BACE抗体或对照IgG1的新鲜培养基用神经元在37℃下孵育24小时。收集细胞上清液并且使用夹心ELISA测定小鼠Aβx-40的存在。简而言之，将对Aβx-40的C末端具有特异性的兔多克隆抗体(Millipore,Bedford,MA)涂覆于板上，并且生物素化的抗小鼠Aβ单克隆抗体M3.2(Covance,Dedham,MA)用于检测。所述测定具有在血浆中1.96pg/ml的定量值下限并且在脑中39.1pg/g的定量值下限。将Aβx-40值针对细胞活力归一化，如使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay,Promega)所测定。使用四参数非线性回归曲线-拟合程序(Prism,Graphpad)对数据作图。
此实验的结果在图8中示出。抑制百分比是指由各抗体可见的最大抑制(呈占对照的％)；如下测定抑制百分比：(基线Aβx-40–最小Aβx-40)/基线Aβx-40*100(基线Aβx-40是在任何治疗均不存在的情况下)。
用抗体6266和YW412.8.31进行相似实验。
此实验的结果在图9中示出。与抗体YW412.8.31展现的2.9nM的IC50和62％的最大抑制相比，抗体6266具有1.7nM的IC50和79％的最大抑制(参见PCT公布号WO 2012/064836A1)。
F.小鼠中的体内活性测定
将抗BACE1抗体调节淀粉状蛋白加工的能力也在野生型小鼠中进行评估。将单一剂量的对照IgG抗体或抗BACE1抗体(100mg/kg)通过腹膜内(IP)注射全身性递送至8周龄野生型C57Bl/6J小鼠中(每组n＝6)。24小时之后，在PBS灌注之后收集脑样品，并且将来自一个半脑的前脑在5M GuHCL、50mM Tris pH 8.0中均质化，并且进一步在酪蛋白阻断缓冲液(于PBS中的0.25％酪蛋白/0.05％叠氮化钠、20μg/ml抑酶肽/5mM EDTA,pH 8.0/10μg/ml亮肽素)中稀释用于Aβx-40分析。将脑中总小鼠Aβx-40的浓度使用夹心ELISA测定。简而言之，将对Aβ1-40的C末端具有特异性的兔多克隆抗体(Millipore,Bedford,MA)涂覆于板上，并且生物素化的抗小鼠Aβ单克隆抗体M3.2(Covance,Dedham,MA)用于检测。所述测定具有在血浆中1.96pg/ml的定量值下限并且在脑中39.1pg/g的定量值下限。
所述实验的结果在图10中示出。抗体5884的施用显示小鼠脑中Aβx-40水平的最大减少。抗体6226源于抗体5884，并且重链中仅两个位置处变化(在HVR-H1中)。
G.食蟹猴中的药物动力学
将抗体6266和抗体6310的PK曲线与抗体YW412.8.31的PK曲线相比较(参见PCT公布号WO 2012/064836 A1)。施用呈10mg/kg的单一静脉内(IV)剂量的抗体。将各抗体施用给四只猴。将血清中的抗体浓度在以下时间点测量：给药前7天、给药后15分钟和8小时及给药后1、3、7、10、14、17、21、28、35和42天。将食蟹猴血清中给药抗体的浓度用ELISA使用绵羊抗人IgG猴吸附的抗体涂层，随后添加在1:100的稀释度下开始的血清样品来测量，并且通过添加缀合至吸附用于检测的辣根过氧化物酶猴的山羊抗人IgG抗体来结束。所述测定具有0.78-50mg/mL的标准曲线范围和0.08mg/mL的检测极限。低于这一检测极限的结果被报告为低于可报告性(LTR)。
该实验的结果在图11中示出。与YW412.8.31相比，在抗体6266的食蟹猴药物动力学中未观察到显著差异。将抗体6310以YW412.8.31的大约两倍快被清除。
实施例3：6266抗体的亲和力成熟
使抗体6266进行如下亲和力成熟。
NNK步移文库设计和噬菌体淘选
关于文库随机化，CDR的各位置通过寡核苷酸定点诱变以“NNK”密码子随机化，其中N为四种天然核苷酸中的任一者，并且K为50％T(胸腺嘧啶)和50％G(鸟嘌呤)。所述NNK密码子可编码20种天然氨基酸中的任一者。独立地制备轻链和重链的文库，并且将各链的3个CDR中的每一者同时随机化。这产生各链中具有0至3种随机氨基酸变化的克隆，其中高达各CDR中一种突变。通过标准方法在噬菌体Fab片段展示载体中制备文库。通过在连续数轮选择中孵育所述噬菌体展示文库与5、0.5和0.1nM生物素化的BACE1来选择结合克隆，并且接着在室温或37℃下与100nM非生物素化的BACE1竞争以减少较低亲和力克隆与BACE1的结合。将结合的克隆捕获于涂覆有中性抗生物素蛋白的ELISA板上、洗涤并且在室温下在100mM HCl中洗脱20分钟。将洗脱的噬菌体用1/10体积的1MTris pH 8.0中和并且用于感染大肠杆菌以扩增用于下一轮选择。
深度测序和数据分析
对于深度测序，从所选择的轮分离噬菌粒DNA。将来自各样品的VH和VL区段通过18个循环的PCR扩增使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)扩增。将扩增子在2％琼脂糖凝胶上纯化。将扩增子用标准Illumina文库制备方法，使用TruSeq DNA Sample Prep(Illumina)制备。使衔接子连接的文库经受单一PCR循环并且在Illumina MiSeq上以双端200bp或300bp(视需要)测序以覆盖扩增子的完整长度。测序数据使用统计编程语言R和ShortRead程序包分析。对所识别的CDR序列进行质量控制，其中检查各CDR序列的正确长度并且使其仅携带多达一种NNK突变并且不携带非NNK突变。计算每个随机化位置的所有突变的频率会产生位置权重矩阵。通过使在分选样品中的给定位置处的给定突变的频率除以未分选样品中的同样突变的频率来计算针对所有单一突变的富集比率，如由Fowler和同事先前所述。双重突变的富集比率通过计算在两个给定位置处携带NNK突变的所有克隆的富集比率(忽略第三NNK突变)来获得。为了滤除取样效应，从分析中去除在分选或未分选样品中具有小于10的序列计数的突变对。通过在乘法模型中组合来自单一和双重突变的富集比率来计算上位性：富集AB＝富集Ax富集B。所用上位性因此定义为：上位性＝富集AB-富集Ax富集B。选择来自单一突变分析和来自双重突变分析的最高富集突变用于合成。
图12和13示出亲和力成熟抗体6266变体1至15的重链和轻链可变区序列。
使用表面等离子体共振的亲和力测定
使用用BIAcoreTM T200仪器进行的表面等离子体共振(SRP)测量测定通过单一循环动力学实现的抗BACE1Fab抗体的结合亲和力。简而言之，将S系列传感器芯片CM5用EDC和NHS试剂根据供应商的说明书活化，并且偶合抗His抗体以实现大约1000个响应单位(RU)，接着随后用1M乙醇胺阻断未反应基团。关于动力学测量，首先以10μl/min流动速率注射His标记的BACE1蛋白以在3种不同流式细胞(FC)处捕获大约100RU，FC1(参考物)除外，并且接着在同一循环中相继注射(流动速率：30μl/min)HBS-P缓冲液(0.01M HEPESpH 7.4、0.15MNaCl、0.005％表面活性剂P20)中Fab从低(0.08nM)至高(50nM)的5倍连续稀释液，其中注射之间无再生。记录传感图并且使其经受参考物和缓冲液扣除，随后通过BIAcoreTM T200评价软件(BIAcoreTM T200Evaluation Software,2.0版)进行评价。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(Langmuir binding model)计算缔合速率(k缔合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(Kd)被计算为比率k解离/k缔合。
通过差示扫描荧光(DSF)进行的热熔融温度(Tm)测定
DSF监测在荧光染料存在下蛋白的热去折叠并且通常通过使用实时PCR仪器(例如Bio-Rad CFX)进行。将SYPRO橙色染料(Invitrogen,目录号S6650)1:20稀释于PBS中。将1μl稀释的染料添加至孔中的24μl Fab蛋白(约100ug/ml)中。当所述温度在实时PCR仪器(Bio-Rad CFX)中从20℃增加至100℃时，对荧光强度作图并且使用例如Boltzmann等式计算过渡曲线的拐点(Tm)。参见Nature Protocols,2007,2:2212-2221。
图14示出针对亲和力成熟抗体6266变体1至15的缔合速率、解离速率、解离常数和熔融温度。所有变体均示出与抗体6266相比改进的亲和力(KD)。
虽然前述发明已经出于理解清楚的目的经由说明和实施例较详细地描述，但所述描述和实施例不应被视为限制本发明的范围。本文所引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地以引用的方式整体并入。
序列表
序列表
<110> 基因泰克公司（GENENTECH, INC.）
阿迪马布有限责任公司（ADIMAB LLC）
刘懿津（LIU, Yichin）
J·阿特瓦尔（ATWAL, Jasvinder）
C·P·C·赵（PUI CHI CHIU, Cecilia）
R·J·沃茨（WATTS, Ryan J.）
吴雁（WU, Yan）
E·克劳兰（KRAULAND, Eric）
M·费德豪斯（FELDHAUS, Michael）
<120> 抗BACE1的抗体和其用于神经疾病免疫疗法的用途
<130> 01146-0040-00PCT
<150> US 62/081,966
<151> 2014-11-19
<160> 232
<170> PatentIn 3.5版本
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1 5 10 15
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR2
<400> 45
Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR2
<400> 46
Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Gly
1 5 10 15
<210> 47
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR2
<400> 47
Gln Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR2
<400> 48
Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Gly
1 5 10 15
<210> 49
<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR2
<400> 49
Ser Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 50
<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR3
<400> 50
Ala Lys Gly Gly Ser Gln Trp Leu Tyr Ala Pro Gly Ser Trp Phe Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR3
<400> 51
Ala Lys Gly Ala Gly His Gly Ser Tyr Val Lys Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR3
<400> 52
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val
1 5 10
<210> 53
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR3
<400>53
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1 5 10
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<211> 13
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR3
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR3
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VH HVR3
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VH HVR3
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR3
<400> 60
Ala Arg Leu Gly His Gly Tyr Asn Tyr Phe Asp Leu
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<211> 12
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR3
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR1
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn Leu Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR1
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR1
<400> 66
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Ile Ala
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR1
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser His Leu Ala
1 5 10
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR1
<400> 68
Arg Ala Ser Arg Ser Val Asn Ser Tyr Leu Ala
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR2
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Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR2
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR2
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Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR2
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Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 77
Gln Gln Ser Ser Asn Phe Pro Phe Thr
1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 78
Gln Gln Ser Val Asn Phe Pro Phe Thr
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
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Gln Gln Ala Val Val Trp Pro Pro Arg Thr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 80
Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 81
Gln Gln Leu Tyr Thr Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 82
Gln Gln Ala Tyr Val Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 83
Gln Gln Ser Leu Thr Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 84
Gln Gln Val Tyr Thr Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 85
Gln Gln Leu Phe Leu Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 86
Gln Gln Ser Tyr Leu Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 87
Gln Gln Ser Phe Leu Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 88
Gln Gln Leu Leu Thr Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 89
Gln Gln Ser Phe Val Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 90
Gln Gln Leu Leu Leu Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 91
Gln Gln Ser Ile Val Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 92
Gln Gln Ser Leu Val Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 93
Gln Gln Ser Ile Thr Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 94
Gln Gln Ser Val Thr Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 95
Gln Gln Val Tyr Leu Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 96
Gln Gln Val Tyr Val Trp Pro Pro Arg Thr
1 5 10
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 97
Gln Gln Pro Leu Ser His Pro Arg Thr
1 5
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL HVR3
<400> 98
Asp Glu Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 99
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 99
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Ser Gln Trp Leu Tyr Ala Pro Gly Ser Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 100
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ala Gly His Gly Ser Tyr Val Lys Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 101
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 101
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ile Ser Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ala Gly His Gly Ser Tyr Val Lys Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 102
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Thr Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Ser Gln Trp Leu Tyr Ala Pro Gly Ser Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 103
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 103
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Thr Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Ser Gln Trp Leu Tyr Ala Pro Gly Ser Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 104
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 104
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Arg
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Thr Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Ser Gln Trp Leu Tyr Ala Pro Gly Ser Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 105
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 105
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ile Ser Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ala Gly His Gly Ser Tyr Val Lys Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 106
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 106
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ile Ser Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ala Gly His Gly Ser Tyr Val Lys Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 108
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 109
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
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65 70 75 80
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<220>
<223> 合成：VH序列
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1 5 10 15
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20 25 30
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VH序列
<400> 120
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<223> 合成：VH序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VH序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VH序列
<400> 125
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VH序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VH序列
<400> 128
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<223> 合成：VH序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VH序列
<400> 130
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 131
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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115 120
<210> 132
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 132
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Trp Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 133
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 133
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Trp Ser
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Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 134
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 134
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Trp Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 135
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 135
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Trp Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 136
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Trp Ser
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 137
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Gly Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Ser
50 55 60
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> 合成：VH序列
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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<220>
<223> 合成：VH序列
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<223> 合成：VH序列
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Thr Ser Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH序列
<400> 147
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VL序列
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VL序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 152
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<223> 合成：VL序列
<400> 153
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VL序列
<400> 154
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<213> 人工序列
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<223> 合成：VL序列
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Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 156
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 157
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
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100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 158
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 159
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 160
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 161
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 162
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 163
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 164
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<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 165
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 166
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 166
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Val Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 167
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 167
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 168
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 168
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Val Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 169
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 169
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Val Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 170
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 170
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 171
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 171
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Val Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 172
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 172
Gly Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 173
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 173
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 174
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 174
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Val Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 175
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 175
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Leu Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 176
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 176
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Val Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Ala Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 177
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 177
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 178
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VL序列
<400> 178
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Leu Ser His Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 179
<211> 501
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 人BACE1，同种型B
<400> 179
Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val
50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr
65 70 75 80
Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser
85 90 95
Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr
100 105 110
Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val
115 120 125
Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp
130 135 140
Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp
165 170 175
Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp
180 185 190
Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro
195 200 205
Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln
210 215 220
Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile
225 230 235 240
Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg
245 250 255
Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln
260 265 270
Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val
275 280 285
Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala
290 295 300
Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp
305 310 315 320
Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr
325 330 335
Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val
340 345 350
Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg
355 360 365
Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala
370 375 380
Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala
405 410 415
Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu
420 425 430
Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro
435 440 445
Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala
450 455 460
Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys Gln Trp
465 470 475 480
Cys Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp
485 490 495
Ile Ser Leu Leu Lys
500
<210> 180
<211> 476
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 人BACE1，同种型A
<400> 180
Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val
50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr
65 70 75 80
Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser
85 90 95
Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr
100 105 110
Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val
115 120 125
Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp
130 135 140
Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp
165 170 175
Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Leu Cys Gly
180 185 190
Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly
195 200 205
Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu
210 215 220
Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val
225 230 235 240
Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr
245 250 255
Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu
260 265 270
Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser
275 280 285
Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val
290 295 300
Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile
325 330 335
Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln
340 345 350
Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val
355 360 365
Met Gly Ala Val Ile Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala
370 375 380
Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu
385 390 395 400
Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu
405 410 415
Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr
420 425 430
Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu
435 440 445
Cys Leu Met Val Cys Gln Trp Cys Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln
450 455 460
His Asp Asp Phe Ala Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys
465 470 475
<210> 181
<211> 457
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 人BACE1，同种型C
<400> 181
Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val
50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr
65 70 75 80
Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser
85 90 95
Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr
100 105 110
Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val
115 120 125
Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp
130 135 140
Leu Pro Asp Asp Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln
145 150 155 160
Thr His Val Pro Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe
165 170 175
Pro Leu Asn Gln Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile
180 185 190
Ile Gly Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr
195 200 205
Pro Ile Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu
210 215 220
Ile Asn Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp
225 230 235 240
Lys Ser Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys
245 250 255
Val Phe Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu
260 265 270
Lys Phe Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln
275 280 285
Ala Gly Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu
290 295 300
Met Gly Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln
305 310 315 320
Gln Tyr Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys
325 330 335
Tyr Lys Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala
340 345 350
Val Ile Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg
355 360 365
Ile Gly Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr
370 375 380
Ala Ala Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly
385 390 395 400
Tyr Asn Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr
405 410 415
Val Met Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met
420 425 430
Val Cys Gln Trp Cys Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp
435 440 445
Phe Ala Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys
450 455
<210> 182
<211> 432
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 人BACE1，同种型D
<400> 182
Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val
50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr
65 70 75 80
Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser
85 90 95
Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr
100 105 110
Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val
115 120 125
Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp
130 135 140
Leu Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln Ser Glu Val Leu Ala
145 150 155 160
Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr
165 170 175
Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu
180 185 190
Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp
195 200 205
Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr
210 215 220
Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile
225 230 235 240
Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly
245 250 255
Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe
260 265 270
Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe
275 280 285
Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg Pro Val Glu Asp Val
290 295 300
Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser
305 310 315 320
Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu Gly Phe Tyr Val Val
325 330 335
Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala Val Ser Ala Cys His
340 345 350
Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu Gly Pro Phe Val Thr
355 360 365
Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser
370 375 380
Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe
385 390 395 400
Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys Gln Trp Cys Cys Leu Arg Cys
405 410 415
Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys
420 425 430
<210> 183
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Bi27肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5'末端生物素
<400> 183
Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg His
1 5 10 15
Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
20 25
<210> 184
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：FRET短底物(R&D Systems)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5'末端Mca ((7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Dnp：2, 4-二硝基苯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 3'末端NH2
<400> 184
Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg Lys Arg Arg
1 5 10
<210> 185
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：FRET短底物(Invitrogen)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5'末端Rh
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 3'末端猝灭剂
<400> 185
Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Lys
1 5
<210> 186
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：淀粉样蛋白前体蛋白β分泌酶活性位点肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5'末端FAM
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 3'末端CONH2
<400> 186
Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg Trp
1 5 10 15
Lys Lys
<210> 187
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12A轻链可变区：6266.1
<400> 187
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 188
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12A轻链可变区：6266.2
<400> 188
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 189
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12A轻链可变区：6266.3
<400> 189
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 190
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12A轻链可变区：6266.4
<400> 190
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 191
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12A轻链可变区：6266.5
<400> 191
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 192
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12A轻链可变区：6266.6
<400> 192
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 193
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12A轻链可变区：6266.7
<400> 193
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 194
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12B重链可变区：6266.1
<400> 194
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser His Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Ile Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 195
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12B重链可变区：6266.2
<400> 195
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser His Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Ile Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 196
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12B重链可变区：6266.3
<400> 196
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser His Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Ile Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 197
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12B重链可变区：6266.4
<400> 197
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser His Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Ile Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 198
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12B重链可变区：6266.5
<400> 198
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser His Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Ile Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Gln Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 199
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12B重链可变区：6266.6
<400> 199
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser His Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Ile Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Gln Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 200
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12B重链可变区：6266.7
<400> 200
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser His Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Ile Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Glu Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 201
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13A轻链可变区：6266.8
<400> 201
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 202
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13A轻链可变区：6266.9
<400> 202
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 203
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13A轻链可变区：6266.1
<400> 203
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 204
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13A轻链可变区：6266.11
<400> 204
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 205
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13A轻链可变区：6266.12
<400> 205
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 206
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13A轻链可变区：6266.13
<400> 206
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 207
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13A轻链可变区：6266.14
<400> 207
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 208
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13A轻链可变区：6266.15
<400> 208
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Leu Trp Pro Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 209
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13B重链可变区：6266.8
<400> 209
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Lys Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 210
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13B重链可变区：6266.9
<400> 210
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Lys Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 211
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13B重链可变区：6266.1
<400> 211
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 212
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13B重链可变区：6266.11
<400> 212
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 213
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13B重链可变区：6266.12
<400> 213
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Asn Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 214
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13B重链可变区：6266.13
<400> 214
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 215
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13B重链可变区：6266.14
<400> 215
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Phe Gly Val Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Trp Gly Met Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 216
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图13B重链可变区：6266.15
<400> 216
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Glu Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 217
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.3、6266.6、6266.7、6266.8、6266.11的VL HVR2
<400> 217
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Tyr
1 5
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.1、6266.2、6266.3、6266.4、6266.5、6266.6、6266.7的VH HVR1
<400> 218
Gly Thr Leu Ser His Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 219
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.1、6266.2、6266.3、6266.4、6266.5、6266.6、6266.7的VH HVR2
<400> 219
Asn Ile Ile Pro Gly Ile Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 220
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.5、6266.6的VH HVR3
<400> 220
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Gln Tyr Gly Met Leu Asp Val
1 5 10
<210> 221
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.7、6266.15的VH HVR3
<400> 221
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Glu Leu Asp Val
1 5 10
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.8、6266.9的VH HVR1
<400> 222
Gly Thr Leu Lys Gly Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 223
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.12的VH HVR1
<400> 223
Gly Thr Leu Asn Gly Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.13的VH HVR1
<400> 224
Gly Thr Leu Ser Gly Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 225
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.14的VH HVR2
<400> 225
Asn Ile Ile Pro Gly Phe Gly Val Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 226
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.8、6266.9的VH HVR3
<400> 226
Ala Arg Gly Gly Gly Thr Lys Tyr Gly Met Leu Asp Val
1 5 10
<210> 227
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6266.14的VH HVR3
<400> 227
Ala Arg Ser Gly Gly Thr Lys Trp Gly Met Leu Asp Val
1 5 10
<210> 228
<211> 501
<212> PRT
<213> 小鼠属某种
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 鼠BACE1，同种型1
<400> 228
Met Ala Pro Ala Leu His Trp Leu Leu Leu Trp Val Gly Ser Gly Met
1 5 10 15
Leu Pro Ala Gln Gly Thr His Leu Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Leu Ala Gly Pro Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Glu Ser Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val
50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr
65 70 75 80
Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser
85 90 95
Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr
100 105 110
Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val
115 120 125
Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp
130 135 140
Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp
165 170 175
Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp
180 185 190
Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Ile Pro
195 200 205
Asn Ile Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln
210 215 220
Thr Glu Ala Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile
225 230 235 240
Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg
245 250 255
Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln
260 265 270
Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val
275 280 285
Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala
290 295 300
Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp
305 310 315 320
Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr
325 330 335
Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val
340 345 350
Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg
355 360 365
Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala
370 375 380
Val Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala
405 410 415
Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu
420 425 430
Gly Pro Phe Val Thr Ala Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro
435 440 445
Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala
450 455 460
Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys Gln Trp
465 470 475 480
Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg His Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp
485 490 495
Ile Ser Leu Leu Lys
500
<210> 229
<211> 467
<212> PRT
<213> 小鼠属某种
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 鼠BACE1，同种型2
<400> 229
Met Ala Pro Ala Leu His Trp Leu Leu Leu Trp Val Gly Ser Gly Met
1 5 10 15
Leu Pro Ala Gln Gly Thr His Leu Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Leu Ala Gly Pro Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Glu Ser Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val
50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr
65 70 75 80
Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser
85 90 95
Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr
100 105 110
Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val
115 120 125
Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp
130 135 140
Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp
165 170 175
Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp
180 185 190
Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Ile Pro
195 200 205
Asn Ile Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln
210 215 220
Thr Glu Ala Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile
225 230 235 240
Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg
245 250 255
Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln
260 265 270
Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Thr Glu Lys Phe Pro Asp Gly Phe
275 280 285
Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr Pro Trp
290 295 300
Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val Thr Asn
305 310 315 320
Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg Pro Val
325 330 335
Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala Val Ser
340 345 350
Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu Gly Phe
355 360 365
Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala Val Ser
370 375 380
Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu Gly Pro
385 390 395 400
Phe Val Thr Ala Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro Gln Thr
405 410 415
Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala Ile Cys
420 425 430
Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys Gln Trp Arg Cys
435 440 445
Leu Arg Cys Leu Arg His Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp Ile Ser
450 455 460
Leu Leu Lys
465
<210> 230
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：人BACE1 ECD
<400> 230
Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val
50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr
65 70 75 80
Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser
85 90 95
Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr
100 105 110
Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val
115 120 125
Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp
130 135 140
Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp
165 170 175
Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp
180 185 190
Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro
195 200 205
Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln
210 215 220
Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile
225 230 235 240
Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg
245 250 255
Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln
260 265 270
Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val
275 280 285
Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala
290 295 300
Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp
305 310 315 320
Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr
325 330 335
Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val
340 345 350
Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg
355 360 365
Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala
370 375 380
Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala
405 410 415
Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu
420 425 430
Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro
435 440 445
Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Gly Arg Ala
450 455 460
<210> 231
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：鼠BACE1 ECD
<400> 231
Met Ala Pro Ala Leu His Trp Leu Leu Leu Trp Val Gly Ser Gly Met
1 5 10 15
Leu Pro Ala Gln Gly Thr His Leu Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Leu Ala Gly Pro Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Glu Ser Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val
50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr
65 70 75 80
Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser
85 90 95
Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr
100 105 110
Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val
115 120 125
Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp
130 135 140
Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp
165 170 175
Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp
180 185 190
Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Ile Pro
195 200 205
Asn Ile Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln
210 215 220
Thr Glu Ala Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile
225 230 235 240
Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Arg Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg
245 250 255
Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln
260 265 270
Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val
275 280 285
Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala
290 295 300
Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp
305 310 315 320
Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr
325 330 335
Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val
340 345 350
Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg
355 360 365
Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala
370 375 380
Val Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala
405 410 415
Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu
420 425 430
Gly Pro Phe Val Thr Ala Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro
435 440 445
Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Gly Arg Ala
450 455 460
<210> 232
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：VH HVR2
<400> 232
Asn Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly

Claims (46)

1.一种结合至BACE1的经分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)选自SEQ ID NO:1至6的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:22至25的HVR-H2序列；选自SEQID NO:50和51的HVR-H3序列；选自SEQ ID NO:62和63的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:69和70的HVR-L2序列；和选自SEQ ID NO:75至78和98的HVR-L3序列；或
b)选自SEQ ID NO:7至21、218和222至224的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:26至49、232、219和225的HVR-H2序列；选自SEQ ID NO:52至61、220、221、226和227的HVR-H3序列；选自SEQ ID NO:64至68的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:69至74和217的HVR-L2序列；和选自SEQID NO:79至97的HVR-L3序列。
2.如权利要求1所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自表1中抗体的抗体的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
3.如权利要求2所述的经分离的抗体，其中所述抗体选自6266和6266变体1-15。
4.如权利要求2所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO:15、218和222至224的HVR-H1序列；选自SEQ ID NO:29、219和255的HVR-H2序列；选自SEQ ID NO:52、220、221、226和227的HVR-H3序列；SEQ ID NO:65的HVR-L1序列；选自SEQ ID NO:71、73和217的HVR-L2序列；和SEQ ID NO:80的HVR-L3序列。
5.如权利要求1或权利要求2所述的经分离的抗体或其片段，其中所述抗体包含：
a)与选自SEQ ID NO:99至147、194至200和209至216的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变域序列；或
b)与选自SEQ ID NO:148至178、187至194和201至208的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域序列；或
c)如(a)中的重链可变域序列和如(b)中的轻链可变域序列。
6.如权利要求5所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)选自SEQ ID NO:99至147、194至200和209至216的重链可变域序列；或
b)选自SEQ ID NO:148至178、187至194和201至208的轻链可变域序列；或
c)如(a)中的重链可变域序列和如(b)中的轻链可变域序列。
7.如权利要求3或权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)与选自SEQ ID NO:138、194至200和209至216的序列具有至少90％序列同一性的重链可变域序列；或
b)与选自SEQ ID NO:156、187至194和201至208的序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域序列；或
c)如(a)中的重链可变域序列和如(b)中的轻链可变域序列。
8.如权利要求7所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)选自SEQ ID NO:138、194至200和209至216的重链可变域序列；或
b)选自SEQ ID NO:156、187至194和201至208的轻链可变域序列；或
c)如(a)中的重链可变域序列和如(b)中的轻链可变域序列；或
d)选自6266和6266变体1-15的抗体的重链可变域序列和轻链可变域序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体调节BACE1的活性。
10.如权利要求9所述的经分离的抗体，其中所述抗体抑制BACE1的活性。
11.如权利要求9或权利要求10所述的经分离的抗体，其中BACE1活性使用均相时间分辨荧光(HTRF)测定来测量。
12.如权利要求9或权利要求10所述的经分离的抗体，其中BACE1活性使用表达BACE1底物的细胞系来测量。
13.如权利要求12所述的经分离的抗体，其中所述BACE1底物是淀粉状蛋白前体蛋白(APP)。
14.如权利要求9或权利要求10所述的经分离的抗体，其中BACE1活性在来自已经施用所述抗BACE1抗体的动物的组织中测量。
15.如权利要求14所述的经分离的抗体，其中所述组织是脑组织。
16.如权利要求14或权利要求15所述的经分离的抗体，其中所述动物选自小鼠、大鼠、兔、狗、猴和非人灵长类动物。
17.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体是BACE1活性的变构抑制剂。
18.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体以如通过表面等离子体共振(SPR)所测量在0.1nM与10nM之间、或在0.1nM与8nM之间、或在0.1nM与7nM之间、或在0.1nM与5nM之间、或在0.5nM与5nM之间、或在0.1nM与3nM之间、或在0.5nM与3nM之间的亲和力(KD)结合BACE1。
19.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体实现如例如使用分离皮层神经元培养测定所测量大于60％、大于70％、大于75％或大于80％的BACE1活性的最大抑制。
20.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
21.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体是人抗体或嵌合抗体。
22.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体是抗体片段。
23.如权利要求22所述的经分离的抗体，其中所述抗体片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv。
24.如权利要求1至21中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体是全长IgG1抗体。
25.一种编码如权利要求1至24中任一项所述的抗体的经分离的核酸。
26.一种宿主细胞，其包含如权利要求25所述的核酸分子。
27.一种制造抗体的方法，其包括培养如权利要求26所述的宿主细胞，使得制得所述抗体。
28.一种免疫缀合物，其包含如权利要求1至24中任一项所述的抗体和细胞毒性剂。
29.一种药物制剂，其包含如权利要求1至24中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
30.一种治疗患有神经病学疾病或病症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的如权利要求1至24中任一项所述的抗体。
31.一种减少罹患神经病学疾病或病症或处于感染神经病学疾病或病症的风险中的患者中的淀粉状蛋白斑的方法，其包括向所述个体施用有效量的如权利要求1至24中任一项所述的抗体。
32.一种抑制罹患神经病学疾病或病症或处于发展神经病学疾病或病症的风险中的患者中的淀粉状蛋白斑形成的方法，其包括向所述个体施用有效量的如权利要求1至24中任一项所述的抗体。
33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述神经病学疾病或病症选自由阿尔茨海默氏病(AD)、创伤性脑损伤、中风、青光眼、痴呆、肌肉萎缩症(MD)、多发性硬化(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、囊性纤维化、安格尔曼氏综合征、利德尔综合征、佩吉特氏病、创伤性脑损伤、路易体病、脊髓灰质炎后综合征、夏伊-德雷格综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森氏病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、核上性麻痹、牛海绵状脑病、痒病、克罗伊茨费尔特-雅各布综合征、苦鲁病、格斯特曼-施特劳斯纳-辛克病、慢性消耗性疾病、致命性家族性失眠症、延髓性麻痹、运动神经元病、卡纳万病、亨廷顿氏病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大氏病、杜尔雷斯氏综合征、门克斯卷发综合征、科凯恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、莱施-奈恩综合征及翁韦里希特-伦德伯格综合征、皮克氏病和脊髓小脑性共济失调组成的组。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述神经病学疾病或病症选自由阿尔茨海默氏病、中风、创伤性脑损伤和青光眼组成的组。
35.一种减少患者中的淀粉状蛋白-β(Aβ)蛋白的方法，其包括向所述患者施用有效量的如权利要求1至24中任一项所述的抗体。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述患者罹患神经病学疾病或病症，或处于感染神经病学疾病或病症的风险中。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述神经病学疾病或病症选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、中风、创伤性脑损伤和青光眼。
38.一种诊断患者的神经病学疾病或病症的方法，其包括使从所述患者分离的生物样品与如权利要求1至24中任一项所述的抗体在适用于所述抗体结合至BACE1多肽的条件下接触，和检测在所述抗体与所述BACE1多肽之间是否形成复合物。
39.一种确定患者是否有资格接受使用抗BACE1抗体的疗法的方法，其包括使从所述患者分离的生物样品与如权利要求1至24中任一项所述的抗体在适用于所述抗体结合至BACE1多肽的条件下接触，和检测在所述抗体与所述BACE1多肽之间是否形成复合物，其中在所述抗体与BACE1之间复合物的存在指示有资格接受使用抗BACE1抗体的疗法的患者。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中所述生物样品选自由血清、血浆、唾液、胃分泌液、粘液、脑脊髓液、淋巴液、神经元组织、脑组织、心脏组织或血管组织组成的组。
41.如权利要求1至24中任一项所述的抗体，其用作药剂。
42.如权利要求1至24中任一项所述的抗体，其用于治疗选自由阿尔茨海默氏病(AD)、创伤性脑损伤、中风、青光眼、痴呆、肌肉萎缩症(MD)、多发性硬化(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、囊性纤维化、安格尔曼氏综合征、利德尔综合征、佩吉特氏病、创伤性脑损伤、路易体病、脊髓灰质炎后综合征、夏伊-德雷格综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森氏病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、核上性麻痹、牛海绵状脑病、痒病、克罗伊茨费尔特-雅各布综合征、苦鲁病、格斯特曼-施特劳斯纳-辛克病、慢性消耗性疾病、致命性家族性失眠症、延髓性麻痹、运动神经元病、卡纳万病、亨廷顿氏病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大氏病、杜尔雷斯氏综合征、门克斯卷发综合征、科凯恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、莱施-奈恩综合征和翁韦里希特-伦德伯格综合征、皮克氏病和脊髓小脑性共济失调组成的组的神经病学病症。
43.如权利要求1至24中任一项所述的抗体，其用于降低和/或抑制淀粉状蛋白-β(Aβ)蛋白产生。
44.如权利要求1至24中任一项所述的抗体用于制造药剂的用途。
45.如权利要求44所述的用途，其中所述药剂用于治疗选自由阿尔茨海默氏病(AD)、创伤性脑损伤、中风、青光眼、痴呆、肌肉萎缩症(MD)、多发性硬化(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、囊性纤维化、安格尔曼氏综合征、利德尔综合征、佩吉特氏病、创伤性脑损伤、路易体病、脊髓灰质炎后综合征、夏伊-德雷格综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森氏病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、核上性麻痹、牛海绵状脑病、痒病、克罗伊茨费尔特-雅各布综合征、苦鲁病、格斯特曼-施特劳斯纳-辛克病、慢性消耗性疾病、致命性家族性失眠症、延髓性麻痹、运动神经元病、卡纳万病、亨廷顿氏病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大氏病、杜尔雷斯氏综合征、门克斯卷发综合征、科凯恩综合征、哈勒沃登-施帕茨病综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、莱施-奈恩综合征及翁韦里希特-伦德伯格综合征、皮克氏病和脊髓小脑性共济失调组成的组的神经病学病症。
46.如权利要求44所述的用途，其中所述药剂用于减少和/或抑制淀粉状蛋白-β(Aβ)蛋白产生。
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