CN106999608A

CN106999608A - 为了治疗脂质相关病症而下调mir‑132

Info

Publication number: CN106999608A
Application number: CN201580063418.XA
Authority: CN
Inventors: H·索雷克; G·汉宁; D·S·格林伯格
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 2014-09-21
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2017-08-01
Also published as: WO2016042561A2; WO2016042561A3; US10174320B2; US20190078090A1; EP3230453A2; EP3230453B1; US20170283800A1

Abstract

本发明公开了一种治疗有需要的受试者的脂质相关病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与人miR‑132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂，从而治疗所述受试者的所述脂质相关病症。

Description

为了治疗脂质相关病症而下调MIR-132

发明领域和背景

本发明在其一些实施方案中涉及一种治疗脂质相关病症并且更具体地但是非排他性地来说是脂肪性肝病的方法。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在美国影响着30％的成人，并且是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝细胞癌的关键诱因。NAFLD伴随有高脂血症，并且与胰岛素抗性、肥胖症和2型糖尿病息息相关。然而，对引发该发病机理的机制尚未完全了解，而且可利用的治疗干预具有有限的效力。NAFLD以甘油三酯脂滴积聚在肝脏肝细胞的细胞质中为特征，但是对促成该积聚的过程仍然不是很了解。

在肝脏和大脑二者中，代谢的控制由复杂的转录系统支配，其中微小RNA(miRNA)充当重要调控剂。将miRNA前体(由主要转录物生成的茎-环分子)切割成22个bp的成熟双股形式，其中之一指导与经常在靶基因的3'未翻译区域(3'-UTR)中发现的部分互补序列发生复合。miRNA 5'端‘种子’区域决定着靶标特异性，并且在mRNA切割与翻译阻遏之间进行抉择。泛主互补使得一个miRNA能够靶向不止一个mRNA，并且实现基因网络级别调控。在哺乳动物免疫系统中，miRNA控制分化以及先天性和适应性免疫反应。每一个miRNA可以靶向若干个mRNA，经常在其3'-UTR上的特异性位置，并且可以用变阻器样的方式调节整个途径。miRNA快速起作用，并且有效地阻断其多靶标转录物的表达，而且在网络级别上运作，这表明其特别适合于分层次地控制整个生理学系统的快速可调节生理学性质。此外，由于生理学系统的多级调控，所以极低浓度的特异性miRNA可以调节多个输入，诸如神经元途径和免疫途径二者。

miR-132已经被鉴别为这类途径的高层次调节剂(Soreq和Wolf,2011,Trends MolMed 17(10):548-555；Shaltiel等,2013,Brain Struct Funct 218(1):59-72；Greenberg和Soreq,2014,Curr Pharm Des)。

WO 2013034653教导了施用抗miR-132剂来治疗各种疾病，包括肝病。

Westenskow等(Invest Ophthalmol Vis Sci 2012；53:E-Abstract 4120)教导了施用抗miR-132剂来治疗眼病。

美国专利申请号20120178791教导了施用抗miR-132剂来治疗HCMV。

发明概要

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种治疗有需要的受试者的脂肪性肝病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂，从而治疗所述脂肪性肝病。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种治疗有需要的受试者的肥胖症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂，从而治疗所述受试者的所述肥胖症。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种制品，所述制品包含与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂和抗脂质剂。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂，其用于治疗受试者的肥胖症。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂，其用于治疗受试者的脂肪性肝病。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种治疗有需要的受试者的与体重减轻相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的人miR-132或其模拟物，从而治疗所述疾病。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂下调所述人miR-132的量。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂下调所述人miR-132的活性。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂是双股的。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂是单股的。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂包含如SEQ ID NO:8(5'-CGACCATGGCTGTAGACTGTTA-3')所示的核酸序列或其至少15个连续碱基。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂包含如SEQ ID NO:7(ATGGCTGTAGACTGTT)或SEQ ID NO:10(CGACCATGGCTGTAG)所示的核酸序列。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂的长度是至少12个核苷酸。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂的长度是至少12至30个核苷酸。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂包含选自以下的经修饰的核苷酸间键联：氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、烷基膦酸酯和亚甲基甲基亚胺基。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂包含选自以下的经修饰的核酸单元：锁核酸单元、2'-O-烷基核糖核酸单元、2'胺核糖核酸单元、肽核酸单元、2'氟核糖核酸单元、吗啉代核酸单元、环己烷核酸单元和三环核酸单元。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂的每一个核苷酸都是锁核酸。

根据本发明的一些实施方案，所述核酸单元包含选自以下的经修饰的核酸单元：锁核酸单元、2'-O-甲基核糖核酸单元和2'O-甲氧基-乙基核糖核酸单元。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂包含锁核酸、2'-O-甲基核糖核酸或混合的核酸-锁核酸。

根据本发明的一些实施方案，所述施用每天实施一次。

根据本发明的一些实施方案，所述施用每周实施一次。

根据本发明的一些实施方案，所述施用每两周实施一次。

根据本发明的一些实施方案，全身性施用所述多核苷酸剂。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂的剂量在每次施用1μg/kg体重至100mg/kg体重之间。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂的剂量在每次施用10μg/kg体重至100mg/kg体重之间。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂的剂量在每次施用100μg/kg体重至100mg/kg体重之间。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂的剂量在每次施用100μg/kg体重至10mg/kg体重之间。

根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸剂的剂量在每次施用1mg/kg体重至10mg/kg体重之间。

根据本发明的一些实施方案，所述受试者未患眼病。

根据本发明的一些实施方案，所述受试者未患神经退行性疾病。

根据本发明的一些实施方案，所述受试者未患癌症。

根据本发明的一些实施方案，所述脂肪性肝病选自以下项：高甘油三酯血症、脂肪性肝炎、动脉粥样硬化和高胆固醇血症。

根据本发明的一些实施方案，所述高胆固醇血症是家族性高胆固醇血症。

根据本发明的一些实施方案，所述疾病选自以下项：癌症、甲状腺机能亢进症和厌食症。

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和/或科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本文中所描述的那些类似或等效的方法和材料可以用于实践或测试本发明的实施方案，但以下描述了示例性方法和/或材料。在矛盾的情况下，将以本专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅仅是说明性的，而并不意在必然具有限制性。

附图中若干视图的简述

本文中参考附图仅以举例的方式描述了本发明的一些实施方案。现在详细地具体参考附图，应强调的是，所示出的细节只是举例并且用于对本发明的实施方案进行说明性讨论的目的。就这一点而言，针对附图的描述使得本领域技术人员显而易知如何可以实践本发明的实施方案。

在附图中：

图1A至图1F说明外周miRNA-132过量导致多种组织中的多种靶标减少。(A)所报告的MiRNA-132靶标和其生物功能的实例。(B)经过工程改造的多西环素可诱导的miRNA-132载体的示意性图示：将反向四环素控制型转录激活因子(rtTA)-β-球蛋白多聚A插入在Gt(ROSA)26Sor启动子和ColA1基因座的下游。在miR-132/dTg交配转基因小鼠的后代中，在Tet响应性P_紧密启动子下表达前miRNA-132，继而表达SV40多聚A。rtTA蛋白(橙色正方形)在存在多西环素时反式结合TRE_mod元件，从而允许前miRNA-132转录。(C)在rtTA/miR-132dTg小鼠的心脏、肠、肝脏、脾脏中观察到但是在海马体中没有观察到过量miRNA-132水平(对于rtTA，n＝12；对于miRNA-132，n＝5)。(D)miRNA-132靶标Sirt1、Pten和FoxO3的mRNA水平在miRNA-132tg小鼠的肝脏中降低。(n＝3)。(E)miRNA-132tg小鼠的肝脏中的Sirt1和Pten的蛋白质印迹和定量减少(n＝6)。(F)miRNA-132tg组织中的AChE活性受到遏制(n＝4)。所有数据都代表3个实验，*p<0.05，**p<0.01，并且是通过学生t检验来测定，值表达为平均值+平均值标准估计(s.e.m)。

图2A至图2H说明miRNA-132过量与肝脏脂肪变性和脂质体内平衡受损相关。(A)miR-132dTg小鼠与其rtTA同窝出生者相比随年龄增长增加更多体重；有(下面)和无(上面)多西环素诱导，并且在两个独立的转基因谱系中(n＝3)。(B-G)miR-132dTg小鼠与rtTA同窝出生者相比的脂质积聚：(B)脂肪肝的代表性图像。(C，D)用苏木精/伊红和油性红O染色的肝脏切片。(E)8个月龄时肝脏甘油三酯贮存增加(n＝3)。(F)8个月时肝脏和血清中的游离脂肪酸水平不变(n＝3)。(G)血清中的LDL/VLDL升高但HDL水平不升高(n＝3)。(H)与rtTA相比，miR-132dTg小鼠中的促脂肪变性转录物升高和抗脂肪变性转录物减少，这是通过Fluidigm分析获得，针对多个管家基因、然后针对rtTA对照进行正规化。(n＝3)。所有数据都代表2个实验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，并且是通过学生t检验来测定。线条示出了平均值±s.e.m。

图3A至图3O说明了MiRNA-132遏制减少了肝脏重量、脂肪空泡、甘油三酯、LDL/VLDL和胰岛素。(A)实验设计：给饲喂高脂饮食(DIO)持续11周的C57Bl/6J小鼠注射AM132或对照寡核苷酸，持续3天，并且在指出时处死。(B)将DIO小鼠的重量与常规食物饮食(RCD)相比较。(n＝20)(C，D)DIO和RCD小鼠在不进行治疗的情况下(n＝4)和抗miRNA-132(AM132)治疗后7天(n＝4)的内源性肝脏miRNA-132水平。(E)治疗后的代表性DIO小鼠肝脏切片。(F)苏木精/伊红染色的肝脏切片。(G，K)油性红O染色的显微照片和定量结果(n＝3)。(H-I)经过AM132治疗的DIO小鼠的肝脏重量和肝脏重量/体重减少。(n＝4-9)(J)AM132治疗导致肝脏甘油三酯逐渐暂时减少。(n＝4-9)(L)经过AM132治疗的小鼠血清中的LDL/VLDL减少但HDL不减少(n＝4-9)。(M)DIO-经过AM132治疗的小鼠的空腹胰岛素水平与对照组相比降低。(n＝8)。(N)上面：AM132治疗的DIO小鼠中的计算血清HOMA-IR值(n＝8)。(O)治疗后7天，AM132治疗的DIO小鼠的葡萄糖耐受性稍微有所改善(n＝8)。下面：经过AM132治疗的小鼠的胰岛素耐受性与对照组相比不变(n＝8)。所有数据都代表3个实验，AM132与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，并且是通过学生t检验来测定。线条示出了平均值±s.e.m。染色包括10个区域/次染色。

图4A至图4D说明miRNA-132遏制能上调其肝脏靶标。(A)AM132治疗的DIO小鼠中的肝脏miRNA-132靶标转录物升高。进行Fluidigm反应，针对多个管家基因、然后针对对照治疗进行正规化(n＝4)。(B)经过AM132治疗的小鼠中的肝脏Sirt1和Pten的蛋白质印迹和定量升高。(C)肝脏切片中的免疫荧光以及定量FoxO3和P300升高，精氨酸酶1充当肝细胞标记物(n＝3-4)。在不含脂肪空泡的区域中进行定量。(D)治疗后7天，经过AM132治疗的小鼠中的促脂肪变性转录物增加和抗脂肪变性代谢转录物减少(n＝4)。所有数据都代表3个实验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，并且是通过学生t检验来测定。所有数据都示出为平均值±s.e.m。

图5A至图5E说明在DIO小鼠中敲低FoxO3和Pten来模拟miRNA-132的肝脏影响。(A)实验设计：对于FoxO3、Pten、P300、Sirt1或负对照，对C57Bl/6J小鼠进行DIO饲喂，持续9周，继而单次静脉内注射10mg/kg反义GapmeR。治疗后7天将小鼠处死。(B)FoxO3和Pten AS治疗的小鼠的肝脏重量和肝脏重量/体重升高，并且P300AS治疗的小鼠的肝脏重量和肝脏重量/体重减小(n＝4)。(C)肝脏切片的苏木精/伊红染色。(D)FoxO3和Pten反义治疗的小鼠的LDL/VLDL增加和HDL不变(n＝4)。(E)获自Fluidigm反应、针对多个管家基因然后针对负对照治疗的小鼠进行正规化的靶标mRNA水平(n＝4)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，并且通过双向ANOVA来测定。线条示出了平均值±s.e.m。

图6A至图6G说明AM132选择性地降低LDLR-/-小鼠的LDL/VLDL水平。(A)实验设计：通过连续3天每天一次静脉内注射3.3mg/kg AM132来治疗LDL/VLDL水平升高的饲喂RCD的瘦型LDLR-/-小鼠，或不加治疗。治疗后7天测量所有参数。(B)AM132治疗后7天，LDLR-/-小鼠中的肝脏miR-132水平降低。(C)肝脏重量和肝脏重量/体重不变(n＝3-4)。(D)经过AM132治疗的LDLR-/-小鼠中的血清LDL/VLDL减少但HDL不减少(n＝3-4)。(E)用AM132治疗的LDLR-/-小鼠中的肝脏甘油三酯稍微减少(n＝3-4)。(F)miR-132靶标和代谢转录物(G)在经过AM132治疗的LDLR-/-小鼠的肝脏中的表达(n＝3-4)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过学生t检验测定。所有数据都是平均值±s.e.m。

图7A至图7F.(A)miR-132dTg小鼠与其rtTA同窝对照相比的代表性巢式实时PCR基因分型结果。(B)转基因小鼠后代的比率。(C)在miR-132-dTg小鼠的心脏、肠、肝脏、脾脏中观察到但是在海马体中没有观察到过量miRNA-132水平(对于rtTA，n＝12；对于miRNA-132，n＝5。在所有情况下，P<0.05)。(D)具有AChE、Pten、Sirt1和FoxO3转录物的miRNA-132潜在结合位点序列的预测结构。(E)miRNA-132小鼠的各种组织中的miRNA-132靶标：AChE-S、IRAK4和P300的非显著变化的mRNA水平。(对于rtTA，n＝5；对于miRNA-132，n＝7。在所有情况下，不显著)。(F)两个其他转基因miR-132dTg谱系的脂肪肝的代表性图像。

图8A至图8E.(A)用AM132而不是充当对照的AM608治疗的小鼠的肝脏重量和肝脏重量/体重减少(n＝3-9)。(B)用AM132治疗的小鼠的肝脏甘油三酯逐渐暂时减少。(n＝3-9)(C-D)用AM132治疗的小鼠血清中的LDL/VLDL水平降低但HDL水平不降低(n＝3-9)。(D)用AM132或对照物治疗的DIO小鼠血清中的天冬氨酸转氨酶(AST)活性不变(n＝3-4)。(E)用AM132或对照物治疗的DIO小鼠的空腹葡萄糖水平不变(n＝8)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，并且通过双向ANOVA来测定。线条示出了平均值±s.e.m。

图9A至图9D.用AM132治疗的瘦型RCD饲喂小鼠表现出持续肝脏重量和肝脏重量:体重值(A)、AST活性(B)、肝脏甘油三酯(C)、LDL/VLDL和HDL(D)，n＝5，单向ANOVA，在所有情况下不显著)。

图10A至图10F.给DIO小鼠饲喂高脂饮食11周，用0.8、1.6、3.3或10mg/kg AM132或对照物治疗连续1或3天，并且在治疗后7天处死。(A)小鼠肝脏的代表性照片。(B)用减少剂量的AM132或对照物治疗的小鼠的肝脏重量和肝脏重量/体重的定量。(n＝4-5)。(C)肝脏切片的苏木精和伊红染色。代谢生物标记物：用减少剂量的AM132或对照物治疗的小鼠的肝脏甘油三酯(D，n＝4)、血清LDL/VLDL(E)和HDL(F)，n＝4)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，并且通过单向ANOVA来测定。线条示出了平均值±s.e.m。

图11A至图11B说明在不同的保护化学物质下所见的AM132作用，表明顺序依赖性。基于LNA的寡核苷酸与2-O-甲基和完全硫代磷酸酯化骨架寡核苷酸之间的比较证明了受到不同保护的寡核苷酸对肝脏重量和肝脏重量/体重(A)或对LDL/VLDL和HDL(B)的影响之间的不显著差异(n＝5-6)。***p<0.001，通过单向ANOVA测定。线条示出了平均值±s.e.m。

图12A至图12E示出了在C2C12细胞培养实验中测试特定GapmeR遏制不同的miRNA-132靶标的潜力的结果。(A-D)在C2C12小鼠成肌细胞细胞系中体外验证不同的miRNA-132靶标转录物的敲低效率：使用HiPerfect(Qiagen)转染细胞，并且在转染后48小时提取RNA。使用位于GapmeR区域外的多个引物，通过qRT-PCR定量在细胞提取的RNA制剂中进行验证。示出了Sirt1(A)、FoxO3(B)、Pten(C)和P300(D)的敲低。(E)如图6中所描述用靶反义GapmeR治疗的小鼠的肝脏甘油三酯水平。

图13A至图13B.给小鼠饲喂高脂饮食11周，用10mg/kg AM132或对照物进行治疗。2周后，给这些小鼠再次注射相同的寡核苷酸和剂量。在第二次注射之后11天，将小鼠处死。经过AM132治疗的小鼠的肝脏重量(图13A)和肝脏重量/体重(图13B)显著降低，类似于单次注射AM-132的小鼠。

本发明的具体实施方案的描述

本发明在其一些实施方案中涉及一种治疗脂质相关病症且更具体地但是非排他性地来说是脂肪性肝病的方法。

在详细地解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解，本发明在其应用方面未必局限于以下描述所示的或实施例中所例示的细节。本发明能够具有其他实施方案，或者以各种方式实践或进行。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种具有重大健康牵涉但没有完全理解诱导机制的广布病状。本发明的诸位发明人现在已经证明，微RNA(miRNA)-132的过度表达会导致反义寡核苷酸可遏制的NAFLD样表型。具有可诱导的外周miRNA-132过度表达的转基因小鼠呈现出增加的体重、LDL/VLDL和甘油三酯水平、增加的肝脏促脂肪变性转录物和减少的肝脏miRNA-132靶标(图2A至图2H)。引人注目的是，饮食诱导的肥胖小鼠表现出增加的肝脏miRNA-132加上NAFLD标志，并且静脉内注射抗miRNA-132寡核苷酸在一周内完全逆转肝脏miRNA-132过量和NAFLD参数，通过提升脂解作用而减轻肝肿大、甘油三酯和脂肪空泡(图3A至图3O)。此外，在人高脂血症的鼠类模型，即瘦型LDLR-/-小鼠中敲低miRNA-132降低了LDL/VLDL水平(图6A至图6G)。

由本发明的诸位发明人揭露的miRNA-132在脂质体内平衡中的新颖肝脏调控作用表明，其遏制将在家族性和非家族性非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中充当有用的治疗干预。

因此，根据本发明的第一个方面，提供了一种治疗有需要的受试者的脂肪性肝病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂。

如本文中所使用，术语“脂肪性肝病”是指至少部分由异常肝脏脂质沉积引起的疾病或病理学病状。脂肪性肝病包括例如酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝病和妊娠期急性脂肪肝。脂肪性肝病可以是例如大泡性脂肪变性或小泡性脂肪变性。

根据一个具体实施方案，所述疾病是非酒精性脂肪性肝病。

非酒精性脂肪性肝病可以是原发性或继发性非酒精性脂肪性肝病。

非酒精性脂肪性肝病可以是家族性的(例如，由于LDL受体中的突变导致的遗传性肝病)或非家族性的。

根据一个具体实施方案，所述家族性脂肪性肝病是家族性高脂血症。

在一些实施方案中，患有家族性高脂血症的受试者在编码LDL受体蛋白的LDLR基因中具有突变，所述受体蛋白在正常情况下从循环中移除LDL或载脂蛋白B(ApoB)，所述ApoB是LDL中与所述受体结合的部分。

在一个实施方案中，患有脂肪性肝病的受试者具有小于30的身体质量指数(BMI)。

在一个实施方案中，患有脂肪性肝病的受试者具有小于25的身体质量指数(BMI)。

在又另一个实施方案中，所述受试者未患有肥胖相关的共患病。

另外，在本发明中，非酒精性脂肪性肝病意在包括单纯脂肪变性、糖尿病相关的肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、胆汁淤积以及由此类疾病的进展引起的肝脏纤维化和肝硬化。

根据一个具体实施方案，因脂肪性肝病而接受治疗的受试者未患有神经退行性疾病。

根据一个具体实施方案，因脂肪性肝病而接受治疗的受试者未患有眼病。

根据一个具体实施方案，因脂肪性肝病而接受治疗的受试者未患有癌症。

如所提到的，本发明的诸位发明人证明miRNA 132的过度表达导致体重增加。因此，本发明的诸位发明人设想施用miRNA(而不是miRNA抑制剂)可以用来治疗与体重损失相关的疾病。此类疾病包括但不限于厌食症、贪食症、甲状腺机能亢进症、与癌症和/或化学治疗剂相关的身体消瘦。

术语“微RNA”、“miRNA”和“miR”是同义词，并且是指长度约19至28个核苷酸的非编码单股RNA分子的集合，其调控基因表达。在很宽范围的生物体中发现了miRNA，并且已经被证明在发育、体内平衡和疾病病因学中起作用。

以下是miRNA活性机制的简要描述。

编码miRNA的基因被转录，从而引起称为原miRNA的miRNA前体的产生。原miRNA典型地是包含多个原miRNA的多顺反子RNA的一部分。替代地，其可以由自身具有启动子的单个基因组成，如miRNA-132的情况，或者是由编码基因的内含子产生。原miRNA可以形成具有茎和环的发夹。所述茎可能包含错配的碱基。

原miRNA的发夹结构被RNA酶III核酸内切酶Drosha识别。Drosha典型地识别原miRNA中的末端环，并且使大约两个螺旋转角切割至茎中，以产生具有60至70个核苷酸的前体，称为前miRNA。Drosha利用RNA酶III核酸内切酶特有的交错切割来切割原miRNA，从而产生具有5'磷酸和约2个核苷酸的3'突出的前miRNA茎环。据估计，茎的大约一个螺旋转弯(约10个核苷酸)延伸超出Drosha切割位点对于高效处理是必需的。所述前miRNA然后通过Ran-GTP和输出受体Ex-portin-5从细胞核转运至细胞质。

前miRNA的双股茎然后被也是RNA酶III核酸内切酶的Dicer识别。Dicer还可以识别茎环基部的5'磷酸和3'突出。Dicer然后从茎环基部切掉末端环和两个螺旋转弯，从而留下额外的5'磷酸和约2个核苷酸的3'突出。所得siRNA样双链体(可能包含错配)包含成熟miRNA和称为miRNA*的类似大小的片段。所述miRNA和miRNA*可能来源于原miRNA和前miRNA的相对的臂。miRNA*序列可以在克隆的miRNA库中找到，但频率典型地低于miRNA。

虽然miRNA最初呈现为与miRNA*的双股物质，但miRNA最终作为单股RNA被并入核糖核蛋白复合体中，被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)。各种蛋白质都可以形成RISC，这可能导致miRNA/miRNA*双链体特异性、靶标基因结合位点、miRNA活性(阻遏或激活)的变异性，以及miRNA/miRNA*双链体中哪条股链被装载至RISC中。

当miRNA:miRNA*双链体的miRNA股链被装载至RISC中时，miRNA*被移除并且被降解。被装载至RISC中的miRNA:miRNA*双链体的股链是5'端配对不太紧密的那条。在miRNA:miRNA*的两端具有大致相同的5'端配对的情况下，miRNA与miRNA*二者都可能具有基因沉默活性。

RISC基于miRNA与mRNA之间的高水平互补性，尤其是通过miRNA的核苷酸2至7来鉴别目标核酸。

许多研究已经考察了能实现有效翻译抑制的miRNA与其mRNA靶标之间的碱基配对要求(查阅Bartel 2004,Cell 116-281)。在哺乳动物细胞中，miRNA的前8个核苷酸可能是重要的(Doench和Sharp 2004 GenesDev 2004-504)。然而，微RNA的其他部分也可能参与mRNA结合。此外，3'的充分碱基配对可以补偿5'的不充分配对(Brermecke等,2005 PLoS 3-e85)。分析miRNA在整个基因组上的结合的计算研究已经表明了miRNA 5'的碱基2至7在靶标结合中的特殊作用，但是第一个核苷酸(被发现通常是“A”)的作用也得到了认可(Lewis等2005 Cell 120-15)。类似地，核苷酸1至7或2至8被Krek等(2005,Nat Genet 37-495)用来鉴别和验证靶标。

mRNA中的靶位点可能在5'UTR、3'UTR或在编码区中。有趣的是，多个miRNA可以通过识别同一个或多个位点来调控同一个mRNA靶标。大部分遗传学鉴别的靶标中存在多个miRNA结合位点可以表明，多个RISC的协同作用能提供最有效的翻译抑制。

miRNA可以通过两种机制中的任一种来指导RISC下调基因表达：mRNA切割或翻译阻遏。如果mRNA与miRNA具有一定程度的互补性，那么miRNA就可以指定对mRNA的切割。当miRNA引导切割时，切口典型地在与miRNA的残基10和11配对的核苷酸之间。替代地，如果miRNA与miRNA不具有必需程度的互补性，那么miRNA可能阻遏翻译。翻译阻遏在动物中可能更为普遍，因为动物(与人相比)在miRNA与结合位点之间可能具有更低程度的互补性。

应该指出，任一对miRNA和miRNA*的5'和3'端都可能存在变异性。这种变异性可能是由于Drosha和Dicer的酶处理对于切割位点的变异性所致。miRNA和miRNA*的5'和3'端的变异性还可能是由于原miRNA和前miRNA的茎结构中的错配所致。茎股链的错配可能导致一群不同的发夹结构。茎结构中的变异性还可能导致Drosha和Dicer的切割产物的变异性。

术语“微RNA模拟物”或“miRNA模拟物”是指能够进入RNAi途径并且调控基因表达的合成非编码RNA。miRNA模拟物模仿内源miRNA的功能，并且可以被设计为成熟双股分子或模拟前体(例如，或前miRNA)。miRNA模拟物可以由经修饰或未修饰的RNA、DNA、RNA-DNA混杂物或替代核酸化学物质(例如LNA或2'-O,4'-C-亚乙基桥连核酸(ENA))构成。对于成熟双股miRNA模拟物，双链体区域的长度可以在13至33、18至24或21至23个核苷酸之间变化。miRNA还可以包含总共至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。miRNA的序列可能是前miRNA的前13至33个核苷酸。miRNA的序列还可能是前miRNA的后13至33个核苷酸。miRNA的序列可以包含如SEQ ID NO:9所示的序列或其变体。

miRNA模拟物的制备可以通过本领域中已知的任何方法来实现，诸如化学合成或重组方法。

从上文所提供的描述中应了解，使细胞与miRNA接触可以通过用例如成熟双股miRNA、前miRNA或原miRNA转染细胞来实现。

前miRNA序列可以包含45至90、60至80或60至70个核苷酸。

原miRNA序列可以包含45至30,000、50至25,000、100至20,000、1,000至1,500或80至100个核苷酸。

因为本发明的诸位发明人证明了miRNA 132的过度表达导致体重增加，所以本发明的诸位发明人进一步设想使用miRNA 132抑制剂来治疗肥胖和减轻体重。

因此，根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗有需要的受试者的肥胖的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂，从而在所述受试者中治疗肥胖。

根据一个实施方案，所述肥胖受试者具有大于30的身体质量指数(BMI)。BMI在25与30之间的受试者被视为过重，并且在一个实施方案中，利用本文中所公开的试剂加以治疗。通过个体的体重(千克)除以其身高(米)的平方来计算身体质量指数(BMI)。身体质量指数不区分脂肪质量与瘦肉质量，并且肥胖受试者典型地具有过量脂肪组织。

因此，在本发明的一个实施方案中，肥胖受试者具有大于30的BMI。在一个实施方案中，所述受试者具有25或超过25，例如26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40或更大的BMI，并且未患有肥胖相关的共患病。在一个实施方案中，所述患者是病态肥胖并且具有40或超过40的BMI。在一个实施方案中，所述受试者是肥胖的和/或受与肥胖相关的并发症困扰。在一个实施方案中，所述受试者是肥胖的和/或受与肥胖相关的并发症困扰，所述并发症现在已经被克服。在一个实施方案中，所述受试者具有超过25并且优选地超过30的身体质量指数(BMI)。

根据一个具体实施方案，治疗肥胖的受试者未患有神经退行性疾病。

根据一个具体实施方案，治疗肥胖的受试者未患有眼病。

根据一个具体实施方案，治疗肥胖的受试者未患有癌症。

应了解，为了治疗肥胖，应该小心地配制多核苷酸剂，以使其不会积聚在肝脏中并且具有局部作用。

如本文中所使用，术语miRNA-132是指包含如SEQ ID NO:9(UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG)所示的核酸序列的RNA。

在一些实施方案中，本发明的这个方面的miR-132抑制剂是miRNA拮抗剂。“miRNA拮抗剂”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或二者或其修饰形式的单股、双股、部分双股或发夹结构化寡聚物或聚合物，其对于其miRNA靶标是反义的。

miRNA拮抗剂和其他miRNA抑制剂的实例描述于WO2009/20771、WO2008/91703、WO2008/046911、WO2008/074328、WO2007/90073、WO2007/27775、WO2007/27894、WO2007/21896、WO2006/93526、WO2006/112872、WO2007/112753、WO2007/112754、WO2005/23986或WO2005/13901中，所有各案都以引用的方式并入在此。

可以从Applied Biosystems购得定制设计的抗miR分子。因此，在一些实施方案中，miRNA拮抗剂是Ambion抗miR抑制剂。这些分子设计用于特异性地抑制细胞中天然存在的成熟miRNA分子的经过化学修饰和优化的单股核酸。

还可以从Thermo Scientific购得定制设计的Dharmacon Meridian微RNA发夹抑制剂。这些抑制剂包括化学修饰和二级结构基元。举例来说，Vermeulen等在美国专利公布2006/0223777中报告了能提高这些分子的效力的二级结构元件的鉴别。具体来说，在反向互补序列核心周围并入高度结构化的双股侧接区域显著增强了抑制剂功能，并且允许在亚纳摩尔浓度下发生多miRNA抑制。在miRNA拮抗剂设计中设想了其他此类改善以用于所公开的方法中。

在优选实施方案中，所公开的miRNA拮抗剂包括具有足够所述miRNA拮抗剂与miR-132形成双链体的核苷酸长度和miR-132互补性的区域。鉴于miR-132的序列，可以根据Watson和Crick碱基配对规则来设计miRNA拮抗剂。

因此，所述miRNA拮抗剂可以是具有与miR-132中的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸互补的单股核酸序列的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸与miR-132在生理条件下形成双链体。在某些实施方案中，所述单股核酸序列在严格条件下与具有SEQ ID NO:9的序列的寡核苷酸杂交。

在优选实施方案中，反义寡核苷酸含有一个或多个能增加所述反义寡核苷酸在存在核酸酶时的稳定性的核苷酸修饰。举例来说，反义寡核苷酸的一个或多个核苷酸单元可以是锁核酸(LNA)单元。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的一个或多个核苷酸单元是2'被取代的核苷酸类似物。另外，反义寡核苷酸的核苷酸单元之间的一个或多个核苷间键联可以是硫代磷酸酯核苷间键联。应理解，反义寡核苷酸可以包括一种或多种不同类型的修饰。因此，反义寡核苷酸可以具有LNA单元、2'被取代的核苷酸类似物和硫代磷酸酯核苷间键联。适合于改善诸如RNA分子等核酸的治疗用途的其他修饰也可以用于所公开的反义寡核苷酸。

1.长度：miRNA拮抗剂可以包括具有至少8个连续核苷酸的长度的反义寡核苷酸。因此，反义寡核苷酸可以具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸。所述寡核苷酸的长度优选地少于30个连续核苷酸。所述寡核苷酸的长度可以少于25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个连续核苷酸。

2.互补性：所公开的miRNA拮抗剂可以包括具有至少部分且在一些实施方案中完全与miR-132互补的区域的反义寡核苷酸。在miRNA拮抗剂与靶标之间不必存在完全互补性，但一致性必须足以使得所述反义寡核苷酸能够与miR-132形成双链体并且随后降低其活性。

所公开的miRNA拮抗剂可以包括具有与miR-132存在至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性的区域的反义寡核苷酸。

优选地，所公开的miRNA拮抗剂有至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸与miR-132核苷酸序列互补。在一个实施方案中，所公开的miRNA拮抗剂具有与miR-132互补的核苷酸序列。因此，在一个实施方案中，所公开的miRNA拮抗剂有至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸与miR-132互补。

在一些实施方案中，互补性区域中将存在核苷酸错配。在一个优选实施方案中，互补性区域将具有不超过1、2、3、4或5个错配。

在一些实施方案中，miRNA拮抗剂与miR-132“精确互补”。因此，在一个实施方案中，所述miRNA拮抗剂可以与miR-132粘接，以形成仅仅由精确互补区域中的Watson-Crick碱基对组成的混杂物。因此，在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂特异性地辨别单核苷酸差异。在这种情况下，如果在单核苷酸差异区域中发现精确互补，那么所述miRNA拮抗剂仅抑制miR-132活性。

3.修饰：所公开的miRNA拮抗剂和miRNA包括核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或二者或其修饰形式的寡聚物或聚合物。该包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(骨架)键联组成的寡核苷酸以及具有以类似方式运作的非天然存在的部分的寡核苷酸。此类被修饰或被取代的寡核苷酸往往优于天然形式，这是因为具有理想的性质，举例来说，诸如增强的细胞吸收、提高的对核酸靶标的亲和力和/或增加的在核酸酶存在时的稳定性。

所公开的多核苷酸剂可以包括未修饰的RNA和DNA以及已经被修饰例如以提高功效的RNA和DNA，和核苷替代物的聚合物。“未经修饰”的RNA是指一种分子，其中核酸的组分，即糖、碱基和磷酸部分，与天然存在的那些，优选地与人体中天然存在的那些相同或基本上相同。如本文中所使用，“修饰的”RNA是指一种分子，其中核酸的一个或多个组分，即糖、碱基和磷酸部分，与天然存在的不同，优选地与人体中存在的不同。虽然它们被称为“修饰的RNA”，但它们当然，由于修饰的原因，将包括严格来说不是RNA的分子。

可以修饰所公开的多核苷酸剂以提高对核酸酶的抗性。所公开的多核苷酸剂可以包括使其稳定化以对抗核酸酶降解的核苷酸修饰。寡聚物可以是总聚体(totalmer)、混合聚体(mixmer)、间隙聚体(gapmer)、尾部聚体(tailmer)、头部聚体(headmer)或嵌段聚体(blockmer)。“总聚体”是只包含非天然存在的核苷酸的单股寡核苷酸。

术语“间隙聚体”是指由侧接至少5个天然存在的核苷酸(即，未修饰的核酸)的经修饰核酸区段组成的寡核苷酸。

术语“嵌段聚体”是指侧接具有至少5个天然存在核苷酸的核酸片段的中心型经修饰核酸区段。

术语“尾部聚体”是指具有处在5'端的至少5个天然存在核苷酸，继而是处在3'端的经修饰核酸区段的寡核苷酸。

术语“头部聚体”是指具有处在5'端的经修饰核酸区段，继而是处在3'端的至少5个天然存在核苷酸的寡核苷酸。

术语“混合聚体”是指包含天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸二者的寡核苷酸。然而，与间隙聚体、尾部聚体、头部聚体和嵌段聚体不同，不存在具有超过5个天然存在的核苷酸的连续序列，诸如DNA单元。

经修饰的核酸和核苷酸替代物可以包括以下项中的一项或多项：(i)替换一个或两个非连接磷酸酯氧和/或一个或多个连接磷酸酯氧；(ii)替换核糖的成分，例如核糖上的2'羟基，或用除核糖以外的结构完全替换核糖；(iii)用“去磷酸”接头完全替换磷酸酯部分；(iv)修饰或替换天然存在的碱基；(v)替换或修饰核糖-磷酸酯骨架；或(vi)修饰RNA的3'端或5'端，例如在RNA的3'端或5'端去除、修饰或替换末端磷酸酯基团，或者缀合一个部分，诸如荧光标记部分。

可以通过用不同的取代基替换氧原子之一来修饰核酸中的磷酸酯基团。对RNA磷酸酯骨架的这种修饰的一个结果可以是增强寡核糖核苷酸对核酸酶降解的抗性。因此，在一些实施方案中，可能需要引入能产生不带电接头或具有不对称电荷分布的带电接头的变化。

经修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替换。

还可以通过用氮(桥连氨基磷酸酯)、硫(桥连硫代磷酸酯)和碳(桥连亚甲基膦酸)替换连接氧来修饰磷酸酯接头。替换可以发生在末端氧上。

可以用不含磷的连接子来替换磷酸酯基团。可以替换磷酸酯基团的部分的实例包括硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸、磺酰胺、硫甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚胺基、亚甲基甲基亚胺基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基和亚甲基羟甲基亚胺基。优选替换包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。

经修饰的RNA可以包括对核糖核酸的全部或一些糖基的修饰。举例来说，可以用许多不同的“氧”或“脱氧”取代基来修饰或替换2'羟基(OH)。

“氧”-2'羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OR；“锁”核酸(LNA)，其中2'羟基例如通过亚甲基桥连接至相同核糖的4'碳；胺、O-胺和氨基烷氧基、O(CH₂)胺(例如胺＝NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)。仅含甲氧基乙基(MOE)(OCH₂CH₂OCH₃，一种PEG衍生物)的寡核苷酸表现出与用稳固硫代磷酸酯修饰加以修饰的那些相当的核酸酶稳定性。

“脱氧”修饰包括氢(即，脱氧核糖)；卤代(例如氟代)；氨基(例如NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH₂CH₂NH)_nCH₂CH₂-胺(胺＝NH₂；烷基烷基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)、--NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；和烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可以任选地被例如氨基官能度取代。

因此，所公开的多核苷酸剂可以包括2'-脱氧、2'-脱氧-2'-氟代、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O--N-甲基乙酰胺基(2'-O-NMA)。在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂包括至少一个2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且在一些实施方案中，所述miRNA拮抗剂的所有核苷酸都包括2'-O-甲基修饰。

糖基还可以含有一个或多个具有与核糖中的相应碳相反的立体化学构象的碳。因此，经修饰的RNA可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。

经修饰的RNA还可以包括“无碱基”糖，所述糖在C-1'处缺乏核碱基。这些无碱基糖还可以进一步在一个或多个组成糖原子上含有修饰。所述修饰还可能导致寡核苷酸剂的一个或多个位点上的核糖结构完全替换为另一个实体(SRMS)。

可以修饰寡核苷酸的3'和5'端。此类修饰可以在分子的3'端、5'端或两端进行。它们可以包括对整个末端磷酸酯或者磷酸酯基团的一个或多个原子的修饰或替换。举例来说，可以将寡核苷酸的3'和5'端与其他功能性分子实体，诸如标记部分，例如荧光团(例如芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)或保护基团(例如基于硫、硅、硼或酯)缀合。功能性分子实体可以通过磷酸酯基团和/或间隔基与糖连接。间隔基的末端原子可以连接至或替换磷酸酯基团的连接原子或者糖的C-3'或C-5'O、N、S或C基团。替代地，间隔基可以连接至或替换核苷酸替代物(例如PNA)的末端原子。这些间隔基或接头可以包括例如--(CH₂)_n--、--(CH₂)_nN--、--(CH₂)_nO--、--(CH₂)_nS--、--O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OH(例如n＝3或6)、无碱基糖、酰胺、羧基、胺、氧胺、氧亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺酰胺或吗啉代或者生物素和荧光素试剂。

末端修饰的其他实例包括染料、螯合剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、特沙弗林、Sapphyrin)、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切核酸酶(例如EDTA)、亲脂性载体(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶草氧基己烷基、十六烷基甘油、冰片、薄荷脑、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)胆石酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩嗪)和肽缀合物(例如触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]₂、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)。

末端修饰包括在3'-最末端键联处添加甲基膦酸酯；3'C5-氨基烷基-dT；3'阳离子基团；或抑制3'-5'外切核酸酶降解的另一个3'缀合物。

可用于调节活性的末端修饰包括用磷酸酯或磷酸酯类似物修饰5'端。举例来说，在一些实施方案，寡核苷酸剂被5'磷酸化或在5'末端包括磷酰基类似物。5'磷酸酯修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的那些。合适的修饰包括：5'-单磷酸((HO)₂(O)P--O-5')；5'-二磷酸((HO)₂(O)P--O--P-(HO)(O)--O-5')；5'-三磷酸((HO)₂(O)P--O--(HO)(O)P--O--P(HO)(O)--O-5')；5'-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P--O--(HO)(O)P--O--P(HO)(O)--O-5')；5'-腺苷帽(Appp)，和任何经修饰或未修饰的核苷酸帽结构(N--O-5'-(HO)(O)P--O--(HO)(O)P--O--P(HO)(O)--O-5')；5'-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)₂(S)P--O-5')；5'-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P--O-5')、5'-硫代磷酸酯((HO)₂(O)P--S-5')；氧/硫替换的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何其他组合(例如5'-α-三硫代磷酸酯、5'-γ-三硫代磷酸酯等)、5'-氨基磷酸酯((HO)₂(O)P--NH-5'、(HO)(NH₂)(O)P--O-5')、5'-烷基膦酸酯(R＝烷基-甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)--O-5'-、(OH)₂(O)P-5'-CH₂--)、5'-烷基醚磷酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH₂--)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)--O-5'-)。

腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是RNA中最常见的碱基。可以修饰或替换这些碱基以提供具有改进性质的RNA。举例来说，可以用这些碱基或用合成的和天然的核碱基(例如肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、次黄苷、异鸟苷或杀结核菌素)和任何一种以上修饰来制备耐核酸酶的寡核苷酸(即，寡核糖核苷酸)。替代地，可以使用任何以上碱基，例如“不寻常碱基”和“通用碱基”的经取代或经修饰类似物。实例包括2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、8-卤代、氨基、硫醇、硫代烷基、羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟代甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)、二氢尿嘧啶、3-脱氮-5-氮杂胞嘧啶、2-氨基嘌呤、5-烷基尿嘧啶、7-烷基鸟嘌呤、5-烷基胞嘧啶、7-脱氮腺嘌呤、N6,N6-二甲基腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-氨基-烯丙基-尿嘧啶、N3-甲基尿嘧啶、取代的1,2,4-三唑、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N₄-乙酰基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、N-甲基鸟嘌呤或O-烷基化碱基。

所公开的多核苷酸剂可以包括可用于增加核酸酶抗性的核苷酸间键联(例如手性硫代磷酸酯键联)。

硫代磷酸酯(或S-寡聚物)是正常DNA或RNA的变体，其中一个非桥连氧被硫替换。核苷酸间键的硫化急剧降低了内切和外切核酸酶(包括5'→3'和3'→5'DNA POL1外切核酸酶、核酸酶S1和P1、RNA酶、血浆核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶)的作用。另外，使脂质双层交联的潜力增加。由于这些重要的改进，硫代磷酸酯已经越来越多地应用在细胞调控中。

通过两个主要途径来制造硫代磷酸酯：通过二硫化碳中元素硫的溶液对氢膦酸酯的作用，或通过用四乙基秋兰姆二硫化物(TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(BDTD)硫化亚磷酸三酯这一最新方法。

一种增强抗性的方式是鉴别切割位点并且修饰此类位点以抑制切割。举例来说，二核苷酸5'-UA-3'、5'-UG-3'、5'-CA-3'、5'-UU-3'或5'-CC-3'可以充当切割位点。因此，增强的核酸酶抗性可以通过修饰5'核苷酸，从而产生例如以下项来实现：至少一种5'-尿嘧啶-腺嘌呤-3'(5'-UA-3')二核苷酸，其中所述尿嘧啶是2'-修饰的核苷酸；至少一种5'-尿嘧啶-鸟嘌呤-3'(5'-UG-3')二核苷酸，其中所述5'-尿嘧啶是2'-修饰的核苷酸；至少一种5'-胞苷-腺嘌呤-3'(5'-CA-3')二核苷酸，其中所述5'-胞苷是2'-修饰的核苷酸；至少一种5'-尿嘧啶-尿嘧啶-3'(5'-UU-3')二核苷酸，其中所述5'-尿嘧啶是2'-修饰的核苷酸；或至少一种5'-胞苷-胞苷-3'(5'-CC-3')二核苷酸，其中所述5'-胞苷是2'-修饰的核苷酸。因此，所公开的多核苷酸剂可以包括至少2种、3种、4种或5种此类二核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸剂的所有嘧啶都带有2'-修饰，并且所公开的多核苷酸剂因此对内切核酸酶具有增强的抗性。

miRNA拮抗剂可以具有二级结构，但它优选地在生理条件下，至少在miRNA拮抗剂中与miRNA互补的miRNA拮抗剂区域内，基本上是单股的。基本上是单股的miRNA拮抗剂在以下程度上是单股的：少于约50％(例如少于约40％、30％、20％、10％或5％)的miRNA拮抗剂与其自身形成双链体。因此，miRNA拮抗剂在生理条件下优选地不会在互补区内形成发夹环、凸起或内环。

在一个优选实施方案中，miRNA拮抗剂不包括有义股链。在一些实施方案中，miRNA拮抗剂是部分双股的，但至少在miRNA拮抗剂中与miRNA互补的miRNA拮抗剂区域内是单股的。术语“部分双股”是指其中一个股链含有的核苷酸比其互补股链少的双股结构。一般来说，此类部分双股试剂将具有少于75％的双股结构，优选地少于50％，且更优选地少于25％、20％或15％的双股结构。

在一个优选的实施方案中，多核苷酸剂适于体内递送至细胞，例如至生物体中的细胞。在另一个实施方案中，多核苷酸剂适于体外递送至细胞，例如至培养物或悬浮液中的细胞系中的细胞。多核苷酸剂可以包括选择用于提高试剂的稳定性、分布或细胞摄取的配体。举例来说，配体可以是能增强多核苷酸剂进入细胞中的亲脂性部分，例如胆固醇。

多核苷酸剂还可以被阳离子脂质颗粒包封。阳离子脂质饱和影响着包封的核酸的细胞内递送。阳离子脂质包括1,2-双十八烷氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)和1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基-3-氛基丙烷(DLenDMA)。

在一些实施方案，所公开的多核苷酸剂可以包括氨基糖苷配体，其可以致使miRNA拮抗剂具有改进的杂交性质或改进的序列特异性。示例性氨基糖苷包括糖基化聚赖氨酸；半乳糖基化聚赖氨酸；新霉素B；妥布霉素；卡那霉素A；和氨基糖苷的吖啶缀合物，诸如Neo-N-吖啶、Neo-S-吖啶、Neo-C-吖啶、Tobra-N-吖啶和KanaA-N-吖啶。使用吖啶类似物可以增加序列特异性。举例来说，与DNA相比，新霉素B对RNA的亲和力较高，但序列特异性较低。在一些实施方案中，氨基糖苷配体的胍基类似物(胍基糖苷)被栓系至寡核苷酸剂。在胍基糖苷中，氨基酸上的胺基团与胍基交换。胍基类似物的连接可以增强寡核苷酸剂的细胞渗透性。

可以在细胞内从具有编码多核苷酸剂的核酸的表达载体表达所公开的多核苷酸剂。核酸序列可以可操作地连接至表达控制序列，诸如启动子。本领域技术人员应认识到，可以在真核细胞中从适当的DNA/RNA载体表达任何核酸。

因此，可以从插入DNA或RNA载体中的转录单元表达所公开的多核苷酸剂。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达寡核苷酸剂的病毒载体可以基于但不限于以下项来构建：腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或甲病毒。能够表达寡核苷酸剂的重组载体可以如以上所描述来递送，并且可以保留在靶细胞中。替代地，可以使用病毒载体来提供核酸分子的瞬时表达。此类载体在必要时可以重复施用。一旦表达，所公开的miRNA拮抗剂与miR-132相互作用并抑制其活性。在优选的实施方案中，miRNA拮抗剂的至少一部分与内源miR-132形成双链体，其阻止内源miR-132与其靶mRNA(例如，FoxO3、Pten、Sirt1、P300和Cyp2e1)结合，由此造成靶mRNA的翻译增加。表达寡核苷酸剂的载体的递送可以是全身性的，诸如通过静脉内或肌肉内施用、通过施用至从受试者移出的靶细胞继而再引入受试者中，或通过允许引入所期望的靶细胞中的任何其他手段(综述参见Couture等,Trends inGenetics 12:510,1996)。

根据一个具体实施方案，本发明的这个方面的miRNA拮抗剂包含SEQ ID NO:8的至少15个连续碱基。

根据一个具体实施方案，本发明的这个方面的miRNA拮抗剂包含如SEQ ID NO:7所示的序列。

根据一个具体实施方案，本发明的这个方面的miRNA拮抗剂由如SEQ ID NO:7所示的序列组成。

在另一个实施方案中，所述miRNA拮抗剂(例如SEQ ID NO:7)具有2-O-甲基和完全硫代磷酸酯化骨架。

在另一个实施方案中，所述miRNA拮抗剂包含锁核酸(LNA)。在一个实施方案中，所述miRNA拮抗剂(例如SEQ ID NO:7)包含LNA。在另一个实施方案中，所述miRNA拮抗剂(例如SEQ ID NO:10)包含呈如SEQ ID NO:11所示的模式的LNA。

本文中所公开的多核苷酸剂可以本身或作为药物组合物的一部分来施用。

制备药物组合物的方法在本领域的技术范围内，例如，如以下文献中所描述：Remington's Pharmaceutical Science,第18版,MackPublishing Company,Easton,Pa.(1990)；和The Science and Practice ofPharmacy,2003,Gennaro等。

在一个实施方案中，所述制剂包括多核苷酸剂，例如miRNA拮抗剂(例如，以重量计0.1％至90％)或其生理学上可接受的盐与生理学上可接受的载体介质的混合物。优选的生理学上可接受的载体介质是注射用的水、缓冲水、生理盐水、0.4％生理盐水或0.3％甘氨酸。

药物制剂还可以包括常规药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂和pH值调节剂。合适的添加剂包括生理学上生物相容的缓冲剂(例如，氨基丁三醇盐酸盐)、螯合剂(诸如例如DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合剂复合物(例如，钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)的添加或任选地，钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)的添加。药物组合物可以呈液体形式经包装以供使用，或可以冻干。

对于固体组合物，可以使用常规无毒固体载体；例如，药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。举例来说，用于口服施用的固体药物组合物可以包括上文所列出的任何载体和10％至95％，优选地25％至75％的一种或多种单股寡核苷酸剂。

配制的化合物可以呈现多种状态。在一些实例中，组合物是至少部分结晶的、均匀结晶的和/或是无水的(例如少于80％、50％、30％、20％或10％水)。在另一个实例中，多核苷酸剂(例如miRNA拮抗剂)在水相中，例如在包括水的溶液中，此形式对于经由吸入施用来说是优选的形式。

多核苷酸剂可以并入递送媒介物，例如脂质体(特别是针对水相)或颗粒(例如微粒)中。一般来说，化合物是以与预定施用方法相容的方式进行配制。

多核苷酸制剂可以包括脂质体，诸如含有聚(乙二醇)脂质的表面经修饰的脂质体(经PEG修饰，或长循环脂质体或隐形脂质体)。这些制剂提供了一种增加药物在靶组织中的积聚的方法。这类药物载体能抵抗被单核细胞吞噬系统(MPS或RES)调理和消除，从而实现更长的血液循环时间和增强组织对包封的多核苷酸剂的暴露。

长循环脂质体能增强DNA和RNA的药物动力学和药效学，特别是与已知会积聚在MPS组织中的常规阳离子脂质体相比。与阳离子脂质体相比，长循环脂质体还可能以更大的程度保护药物免受核酸酶降解影响，这是基于其能够避免在诸如肝和脾等代谢侵袭性MPS组织中积聚。

可用作载体的药物赋形剂的类型包括稳定剂，诸如人血浆白蛋白(HSA)；增积剂，诸如碳水化合物、氨基酸和多肽；pH值调节剂或缓冲剂；盐，诸如氯化钠；等等。这些载体可以呈结晶或非晶形式，或者可以是这二者的混合物。特别有价值的增积剂包括相容性碳水化合物、多肽、氨基酸或其组合。合适的碳水化合物包括单糖，诸如半乳糖、D-甘露糖和山梨糖；二糖，诸如乳糖和海藻糖；环糊精，诸如2-羟丙基β-环糊精；和聚糖，诸如棉子糖、麦芽糖糊精和葡萄聚糖；醛醇，诸如甘露醇和木糖醇。碳水化合物的优选组包括乳糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖糊精和甘露醇。

组合：多核苷酸剂可以与另一种试剂，例如另一种治疗剂或稳定寡核苷酸剂的试剂，例如与所述寡核苷酸剂形成复合物的蛋白质组合进行配制。再其他试剂包括螯合剂(例如EDTA，例如，用于移除诸如Mg²⁺等二价阳离子)、盐和RNA酶抑制剂(例如，宽特异性RNA酶抑制剂，诸如RNAsin)。在一个实施方案中，所述miRNA拮抗剂制剂包括另一种miRNA拮抗剂，例如可以下调第二miRNA的表达的第二miRNA拮抗剂。在一些实施方案中，所述试剂是针对同一靶核酸但是针对不同的靶序列。在另一个实施方案中，每一种miRNA拮抗剂是针对不同的靶标。在另一个实施方案中，所述另一种试剂下调FoxO3、Pten、P300和/或Sirt1(例如siRNA、反义等)的量或活性。

多核苷酸剂可以与一种或多种其他化合物，尤其是诸如他汀类、胆汁酸螯合剂、胆固醇吸收抑制剂(诸如贝特类)、烟酸等参与抑制胆固醇合成或吸收的其他化合物(即，抗脂质剂)组合进行配制。

抗脂质剂的其他实例包括但不限于磷酸二酯酶抑制剂、腺苷酸环化酶活化剂、脂解刺激剂、β-肾上腺素能受体激动剂、α-2-肾上腺素能受体拮抗剂和其组合。

在另一个实施方案中，所述至少一种其他抗脂质剂包含选自以下项的至少一种试剂：黄嘌呤类似物、毛喉素、毛喉鞘蕊花提取物、霍桑提取物、可乐果提取物、异丙基肾上腺素、育亨宾碱、银杏提取物、紫苏子油和其组合。

替代地，所述多核苷酸剂可以包装在制品中，所述制品包含单独包装的一种或多种如上文中所描述的其他化合物(例如抗脂质剂)。

施用方法：本发明的多核苷酸剂可以用多种方式施用，这取决于需要局部治疗还是全身治疗和欲治疗的区域。施用可以是局部的(包括眼部、鼻内、经皮、肺内)、口服或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌肉内注射或者鞘内施用或心室内施用。

核酸分子可以通过本领域技术人员已知的多种方法施用至细胞，包括但不局限于包封在脂质体中、通过离子电泳或通过并入诸如水凝胶、生物可降解纳米胶囊和生物粘附微球体等其他媒介物中或通过蛋白质载体。

多核苷酸剂(例如miRNA拮抗剂)可以作为裸寡核苷酸剂连同递送试剂一起或者作为表达寡核苷酸剂的重组质粒或病毒载体而施用至受试者。

多核苷酸剂组合物可以通过适合于递送所述试剂至存在不希望的miR-132表达的区域处或附近的组织(例如肝脏)的细胞的任何手段而施用至受试者。示例性递送方法包括通过基因枪、电穿孔或其他合适的肠胃外施用途径进行施用。

合适的肠胃外施用途径包括血管内施用(例如静脉内团注、静脉内输注、动脉内团注、动脉内输注和导管滴注至血管中)；组织周和组织内注射(例如眼球内注射、视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(诸如通过渗透泵)；通过导管或其他安置装置(例如，包含多孔、无孔或凝胶状材料的植入物)直接施用。

本发明的多核苷酸剂可以提供在持续释放组合物中。立即或持续释放组合物的使用取决于所治疗的病状的性质。如果所述病状由急性或超急性病症组成，则利用立即释放形式进行治疗将优于延长释放组合物。替代地，对于某些预防性或长期治疗，持续释放组合物可能是适当的。

本发明的多核苷酸剂可以以单次剂量或多次剂量施用。在通过输注来施用多核苷酸的情况下，输注可以是单次持续剂量，或可以通过多次输注进行递送。

多核苷酸剂可以以约或至少约0.005、0.05、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000μg、ng或mg或更多或其中可导出的任何范围的剂量施用至患者。替代地，指定量可以是作为每日平均剂量、每周平均剂量或每月平均剂量施用的量，或者其可以用mg/kg来表示，其中kg是指患者体重并且mg在上文已说明。在其他实施方案中，指定量是以上所论述的任何数值，但是表示为mg/m²(就肿瘤大小或患者表面积而论)。

多核苷酸剂的剂量不受特别限制。举例来说，它是大约0.1ng至大约100mg/kg/天，并且优选地是大约1ng至大约10mg/kg/天。一般来说，miRNA的效果在施用之后1至3天呈现。因此，优选所述试剂以每天一次至每三天一次的频率施用。当使用表达载体时，可以大约每周一次进行施用。

在某些实施方案中，本发明的组合物可以包含例如至少约0.1％的活性化合物(即，多核苷酸剂)。在其他实施方案中，活性化合物可以包含例如在约2％至约75％之间的单位重量，或在约25％至约60％之间，和其中可导出的任何范围。在其他非限制性实例中，剂量还可以包含每次施用约1μg/kg/体重、约5μg/kg/体重、约10μg/kg/体重、约50μg/kg/体重、约100μg/kg/体重、约200μg/kg/体重、约350μg/kg/体重、约500μg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、约10mg/kg/体重、约50mg/kg/体重、约100mg/kg/体重、约200mg/kg/体重、约350mg/kg/体重、约500mg/kg/体重至约1000mg/kg/体重或更多和其中可导出的任何范围。在本文中所列出的数值的可导出范围的非限制性实例中，基于以上所描述的数值，可以施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等范围。

如本文中所使用，术语“约”是指±10％。

术语“包含”、“包括”、“具有”和其同根词意指“包括但不限于”。

术语“由…组成”意指“包括且局限于”。

术语“基本上由…组成”意指组合物、方法或结构可能包括额外的成分、步骤和/或部分，唯一的条件是所述额外的成分、步骤和/或部分实质上不改变要求保护的组合物、方法或结构的基础和新型特征。

除非上下文另外清楚指出，否则如本文中所使用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数个参考物。举例来说，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

贯穿本申请，可以用范围的格式来呈现本发明的各种实施方案。应当理解，以范围的格式进行描述仅仅是为了方便和简洁，而不应该被视为不可改变地限制本发明的范围。因此，范围的描述应当被视为具有具体公开的所有可能的子范围以及在该范围内的单独数值。举例来说，诸如1至6等范围的描述应当被视为具有诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等具体公开的子范围以及在该范围内的单独数值，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这都适用。

每当本文中指示数值范围时，其意在包括所指示范围内的任何引用数值(分数或整数)。短语“在”第一个指示数字与第二个指示数字“之间的范围”和“从”第一个指示数字“至”第二个指示数字的“范围”在本文中可互换使用，并且意在包括第一指示数字和第二指示数字以及其之间的所有分数和整数。

如本文中所用，术语“方法”是指用于实现给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知或者容易从已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文中所使用，术语“治疗”包括废除、基本上抑制、减缓或逆转病状的进展、基本上改善病状的临床或美学症状，或者基本上预防病状的临床或美学症状的出现。

应了解，为了清楚起见而在独立的实施方案的上下文中加以描述的本发明的某些特征还可以组合在单个实施方案中提供。反之，为了简洁起见而在单个实施方案的上下文中加以描述的本发明的各种特征还可以单独或在任何合适的子组合中或在适合时在任何其他所描述的本发明实施方案中提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不应被视为那些实施方案的基本特征，除非所述实施方案在没有那些要素的情况下不起作用。

如上文所划定和如以下权利要求书部分中要求保护的本发明的各种实施方案和方面可以在以下实施例中找到实验支持。

实施例

现在参考以下实施例，所述实施例连同以上描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。

一般来说，本文中所使用的命名法和本发明中所利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中得到了透彻解释。参见例如“Molecular Cloning:A laboratory Manual”,Sambrook等,(1989)；“Current Protocolsin Molecular Biology”第I-III卷,Ausubel,R.M.编(1994)；Ausubel等,“CurrentProtocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等,“Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York；Birren等(编)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,第1-4卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(1998)；如美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057所示的方法；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”,第I-III卷,Cellis,J.E.编(1994)；“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”,Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；“Current Protocols in Immunology”,第I-III卷,Coligan J.E.编(1994)；Stites等(编),“Basic and Clinical Immunology”(第8版),Appleton和Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编),“Selected Methods inCellular Immunology”,W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；专利和科学文献中全面地描述了可利用的免疫测定法，参见例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“OligonucleotideSynthesis”,Gait,M.J.编(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”,Hames,B.D.和HigginsS.J.编(1985)；“Transcription and Translation”,Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1984)；“Animal Cell Culture”,Freshney,R.I.编(1986)；“Immobilized Cells andEnzymes”IRL Press,(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”,Perbal,B.,(1984)；和“Methods in Enzymology”第1-317卷,Academic Press；“PCR Protocols:AGuide To Methods And Applications”,Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等,“Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual”,CSHL Press(1996)；所有文献都以引用的方式并入本文中，就如同在本文中进行充分阐述一样。贯穿本文档提供了其他一般参考文献。相信其中的程序在本领域中是众所周知的，并且是为了方便读者而提供。其中所含有的所有信息都以引用的方式并入本文中。

材料和方法

组成性miRNA-132过度表达小鼠：通过以下方式生成组成性miRNA-132转基因小鼠：显微注射获自GeneCopoeia(Germantown，MD USA)的片段miRNA-132表达载体，使用SfiI和ClaI使所述载体线性化，以产生具有902个碱基对的序列，注射至CB6/F1E0.5合子，并且移植至ICR假孕雌性。使用以下引物，按照P21、E10.5和E14.5来进行PCR：正向引物：GGAATCGCGGGCCCAGTGTC(SEQ ID NO:1)，反向引物：GGGCGGAGAATGGGCGGAAC(SEQ ID NO:2)。

诱导性miRNA-132过度表达小鼠：通过以下方式生成诱导性miRNA-132转基因小鼠：将小鼠miRNA-132前体序列克隆至pTRE-tight质粒(Clontech，CA，USA)的EcoRI和XbaI位点中。使用XhoI位点使载体线性化，并且将具有735个碱基对的序列显微注射至CB6/F1E0.5合子，并且移植至ICR假孕雌性。生成了6个转基因首建者，并且与插入在Gt(ROSA)26Sor启动子和ColA1基因座下游的反向四环素控制型转录激活因子(rtTA)-β-球蛋白多聚A交配，B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(rtTA*M2)Jae}/J是获自Jackson Laboratory(ME，USA)。使用微RNA定量系统(Quanta Biosciences，MD，USA)来验证MiRNA-132表达。从6个系中选出最高表达系。为了诱导miRNA-132的表达，将2mg/ml多西霉素(Sigma-Aldrich，Israel)和10mg/ml蔗糖加入到饮用水中，并且每3天更换一次，持续14天。在恒温(22±1℃)和12小时光/暗循环下分组圈养小鼠。

小鼠基因分型：使用巢式定量实时PCR，针对miRNA-132转基因对pTRE-miR-132xrtTA小鼠进行基因分型。使用以下引物进行初始PCR步骤：正向引物：TACTGTGGGAACCGGAGGTA(SEQ ID NO:3)，反向引物：TGAAATTTGTGATGCTATTGCTTT(SEQ IDNO:4)。通过定量实时反转录酶(ABI prism 7900HT，SYBR绿标准混合物，AppliedBiosystems，CA，USA)，使用以下引物来测定PCR产物水平：正向引物：ACAGTCTACAGCCATGGTCGC(SEQ ID NO:5)，反向引物：CGCTCTGTATCTGCCCAAACC(SEQ ID NO:6)。

LDLR-/-小鼠：给9至10周龄LDLR敲出小鼠(LDLR-/-，库存编号002207，JacksonLaboratories，USA)饲喂常规食物饮食(TD-2918，Harlan Teklad，Israel)，所述常规食物饮食由18％的脂肪卡路里组成，并且有24％和58％的卡路里分别来源于蛋白质和碳水化合物(能量密度3.1kcal/g)。连续3天每天一次给LDLR-/-经静脉内注射3.3mg/kg与成熟miRNA-132(AM 132)互补的LNA寡核苷酸或灵长类特有的抗miRNA-608(AM608)的控制序列(Exiqon，Vedbaek，Denmark)。治疗后7天将小鼠处死，并且收集血液和组织样品。

饮食：给诱导性miRNA-132转基因小鼠和C57Bl/6j对照小鼠(Harlan，Israel)饲喂常规食物饮食(RCD；TD-2918，Harlan Teklad，Israel)，所述常规食物饮食由18％的脂肪卡路里组成，并且有24％和58％的卡路里分别来源于蛋白质和碳水化合物(能量密度3.1kcal/g)。在其他实验中，给C57Bl/6j小鼠饲喂高脂饮食(HFD；TD-97070，HarlanTeklad，WI，USA)，所述高脂饮食由59.9％的脂肪卡路里组成，并且有18.8％和21.3％的卡路里分别来源于蛋白质和碳水化合物(能量密度5.1kcal/g)。脂肪酸分布(占总脂肪的％)：45％饱和、24％反式、24％单不饱和(顺式)、7％多不饱和(顺式)。

寡核苷酸：给9或11周HFD之后的DIO C57bl/6J小鼠(18周龄)或年龄相匹配的对照物(在RCD饲喂的小鼠的情况下)经静脉内连续3天每天一次注射或单天注射3.3mg/kg(除非另外指出)与成熟miRNA-132(AM132)(SEQ ID NO:7)互补的LNA寡核苷酸或灵长类特有的抗miRNA-608(AM608)的控制序列(Exiqon，Vedbaek，Denmark)或DDW。将饲喂常规食物的9周龄野生型C57Bl/6J小鼠用于测试AM132对瘦型小鼠的作用，并且在治疗后2周将其处死。2-O-甲基保护的寡核苷酸具有全长硫代磷酸酯骨架(Sigma-Aldrich，Israel)。在不同的时间点将小鼠处死，并且收集血液和组织样品。以10mg/kg的剂量经静脉内注射针对所选靶标设计的LNA间隙聚体(Exiqon，Vedbaek，Denmark)，并且在治疗后7天处死。

葡萄糖代谢实验：

葡萄糖耐受性测试(GTT)：对于腹膜内GTT(IP-GTT)，使小鼠禁食18小时，然后以1mg/kg剂量注射含10％葡萄糖(右旋葡萄糖，Sigma，St.Louis，MO)的注射用水(Brown)。从尾夹对小鼠进行放血。在注射之前(时间0)以及注射之后15、30、60、90和120分钟使用手持式血糖仪测量血糖。

胰岛素耐受性测试(ITT)：对于腹膜内ITT(IP-ITT)，使小鼠禁食4小时，然后以0.75U/kg剂量注射含胰岛素(Biological industries，01-818-1H)的磷酸盐缓冲生理盐水。从尾夹对小鼠进行放血。在注射之前(时间0)以及注射之后15、30、60、90和120分钟使用手持式血糖仪测量血糖。

胰岛素ELISA：使用酶联免疫吸附测定法(Millipore，目录号EZRMI-13K)，根据制造商的说明书来测定空腹血清胰岛素。

胰岛素抗性测试用体内平衡模型(HOMA-IR)：由空腹血糖(mgl/dL)×空腹血浆胰岛素(ng/ml)除以405来计算HOMA-IR值。

mRNA和miRNA定量：使用TRI试剂(Sigma-Aldrich，Israel)，根据制造商的方案来提取RNA，继而进行RNA浓度测量(Nanodrop，Thermo，Wilmington，DE)和凝胶电泳。进行cDNA合成(Promega，Madison，WI)，并且通过定量实时反转录酶(ABI prism 7900HT，SYBR绿标准混合物，Applied Biosystems，CA，USA)来测定mRNA水平。除非另外指出，否则所有测量值都针对作为管家基因的nDufc进行正规化。使用微RNA定量系统(Quanta Biosciences，MD，USA)来测定微RNA水平。

微RNA-靶标预测结构和结合能：使用RNAhybrid算法来预测miRNA靶向结合能和结构。

胆碱酯酶活性：使用如Hanin等,Hum Mol Genet 23,4569-4580(2014)先前所描述的Ellman测定法来测量小鼠组织和血清中的催化活性水平。

免疫印迹：使用0.01M Tris HCl pH＝7.4、1M NaCl、1mM EGTA和1％TX-100来溶解样品。按照标准程序进行SDS-PAGE分离并且转移至硝化纤维。使用针对SIRT1(ab12193；Abeam，MA，USA；1:2000)、Pten(sc-7974；Santa Cruz Biotechnology，TX，USA；1:200)和正规化用GAPDH(2118；Cell Signaling，MA，USA；1:2000)的一级抗体，继而用辣根过氧化酶缀合的山羊抗兔抗体(Jackson Laboratories，PA，USA，1:10,000)和增强型化学发光(EZ-EC1；Biological Industries，Beit-Haemek，Israel)来观察蛋白质。

免疫组织化学：通过在二甲苯中进行洗涤和乙醇水溶液的连续稀释使石蜡载片再水合。热诱导抗原修复包括使载片在10mM pH 6柠檬酸盐缓冲液中沸腾10分钟。对载片进行过氧化氢甲醇淬灭，稍后用3,30-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色。在洗涤之后，将载片与150ml/载片的阻断缓冲液(4％正常血清、0.05％TWEEN20和0.3％triton X-100)一起孵育60分钟，随后在4℃下与稀释在所述阻断缓冲液中的一级抗体一起进行过夜孵育。然后洗涤载片并且与生物素缀合的二级抗体一起孵育2小时，在此之后利用链霉亲和素缀合的Cy(Jackson，West Grove，PA)进行检测。将利用40,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的核染色用作对比染色。所使用的抗体包括：抗FoxO3(SC-11351，Santa Cruz Biotechnology，TX，USA)、P300(SC-585，Santa Cruz Biotechnology，TX，USA)、精氨酸酶1(SC-13851)。抗体稀释：1:200。

苏木精和伊红染色：从实验动物剖出小块肝脏组织并且固定在4％多聚甲醛中，进行乙醇脱水、石蜡包埋，并且切至7μm的平均厚度。使用苏木精和伊红(H&E)染色来评价形态。

甘油三酯定量：从存储在-80℃的速冻肝组织中提取肝脏甘油三酯。使用甘油三酯定量试剂盒(ab65336，Abeam，MA，USA)进行甘油三酯测量。在溶解于ddw中的5％Nonidet P-40中使样品均质化，并且在水浴中两次加热至80℃后维持5分钟，随后冷却至室温。进行离心以移除任何不溶解的物质之后，用蒸馏水将样品稀释10倍。已经根据制造商的说明书进行了测定程序和检测，并且使用荧光测定法进行了定量。

游离脂肪酸定量：使用试剂盒(ab65341，Abeam，MA，USA)来测量血清和肝脏游离脂肪酸。使用得自每一只小鼠的5至10μL血清或10mg组织，然后进行1:100稀释。根据制造商的说明书进行荧光测定法。

脂质分布测量：使用HDL和LDL/VLDL胆固醇测定试剂盒来测量血清VLDL/LDL和HDL胆固醇浓度(ab65390，Abeam，MA，USA)。将得自每一只小鼠的100μL血清与100μL沉淀缓冲液混合，以分离出HDL和LDL/VLDL。根据制造商的说明书进行测定，并且使用荧光测定法进行定量。

油性红O染色：为了检测肝脏组织中的天然脂质，将冷冻样品包埋在Tissue-Tek(1437365，Fisher Scientific，PA，USA)中，并且切成12μm厚切片，并且在室温下干燥10分钟。然后用油性红O(ORO)(00625，Sigma Aldrich)将载片染色，与ORO溶液溶液一起孵育5分钟，用自来水洗涤30分钟并且装在ImmuMount(Thermo 9990402)中。

天冬氨酸转氨酶活性测定：使用试剂盒(Sigma Aldrich MAK055)测定天冬氨酸转氨酶(AST)活性。在200μL冰冷AST测定缓冲液中使50mg肝脏组织均质化，在13,000g下离心10分钟以移除不溶解的物质。然后将5μL上清液加入45μL AST测定缓冲液中。根据制造商的说明书进行AST定量。

细胞系：使细胞在37℃、5％CO₂下在湿润气氛中生长。使C2C12细胞在DMEM中生长。培养基补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1,000单位/ml青霉素、0.1mg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B(Beit-Haemek，Israel)。使用HiPerfect转染试剂(Qiagen)进行转染。

Fluidigm：使用高通过量微流体qRT-PCR仪器(BioMark，Fluidigm，SanFrancisco，CA)来测定所选miRNA-132靶标的表达和代谢转录物。将预扩增cDNA样品与TaqMan PreAmp标准混合物(Applied Biosystems)和DDW混合，并且吸移至DynamicFluidigm Array 96×96芯片中。使用外切核酸酶I(New England Biolabs，Ipswitch MA)清洁扩增反应产物，并且1:5稀释在Tris-EDTA缓冲液pH＝8中。使用2×低ROX型SsoFastEvaGreen Supermix(Biorad，Hercules CA)来制备qRT-PCR混合物。使用IFC ControllerHX(BioMark)来进行预激和装载。使用GE 96×96PCR+Melt v2.pcl方案来进行所有qRT-PCR反应。数据分析包括BioMark实时PCR分析软件2.0版(Fluidigm)，并且应用ΔCt方法。使用多个管家基因进行正规化。

统计学：适当时，使用学生t检验或者通过单向或双向ANOVA利用LSD事后检验来计算统计显著性。对所有图表都示出了±SEM。

生物信息分析：通过使用以下生物信息工具来鉴别miRNA-132候选靶标：miRanda、microCosm、PITA、miRWalk、DIANA microT CDS算法。查找允许7个碱基对的最小种子区域。然后将所有算法中对每一个靶标的评分乘以miRNA与预测靶标转录物之间的预测结合位点数，并且针对在0与1之间的值进行正规化。为了整合每一种算法的预测值，对每一种相互作用的正规化值进行求和，并且再次将所有预测靶标转录物针对在0与1之间的值进行正规化。为了进行途径富集分析，我们然后选择了0.05组合评分的临界值，然后使用DAVID功能注解分组工具对所选基因进行分组。将基因清单针对充当背景的完整小鼠基因组进行正规化。然后选择最重要的4种发育相关途径，并且针对基因清单进行扩增。为了概括对每一个基因的靶标的预测，我们将无预测评分为0并且将预测评分为1。举例来说，胰岛素信号传导途径包括29个基因，但是只有脂肪酸生物合成和糖解被包括在表中。为了进一步探测基因的表型，使用小鼠基因组数据库针对基因名称来查找敲出或无效突变)。

结果

外周局限性miRNA-132过量诱导NAFLD表型

为了诱导miRNA-132的外周局限性过度表达，对Tet-on首建小鼠进行工程改造以便在Gt(ROSA)26Sor启动子和反向四环素控制型转录激活剂(rtTA)的ColA1基因座-下游β-球蛋白多聚A的控制下过度表达前miRNA-132。使这些小鼠与具有能反式结合TRE_mod元件的多西霉素诱导性rtTA蛋白的组成性表达的另一个品系交配；后代rtTA-miRNA-132小鼠在其内源宿主组织中和ColA1阳性组织中都表达miRNA-132(图1B、图7A)。只有4.8％的后代小鼠是双重转基因的，这与预期的孟德尔50％比率(图7B)不同，可能是由于Tet-on系统的泄漏和过量miRNA-132对胚胎发育的影响。最高miRNA-132表达系的小鼠在心脏、肠、肝脏、脾脏中表现出但在海马体中没有表现出明显miRNA-132过度表达(图1C和图7C)。这种表达模式是可预见的，伴随miRNA-132靶标的肝脏水平与rtTA同窝出生者中的那些相比有所降低(FoxO3、Pten和Sirt1分别是37％、21％和24％，图1D和图7D、图7E)。这种下降导致miRNA-132tg小鼠的肝脏Sirt1和Pten蛋白与rtTA同窝出生者相比大幅降低(图1E)。这种作用延伸至生物功能水平：水解AChE活性在血清、肠和脾脏中被下调，但是在心脏和海马体中却没有(图1F)。可以推断rtTA-miRNA-132小鼠提供了外周局限性和功能有效性miRNA-132过量的真实模型。

使用多重预测算法(miRanda、microcosm、PITA、miRWalk、DIANA microT-CDS)进行生物信息分析以查找预测miRNA-132靶标。此后进行途径富集分析，从而预测在胚胎发生中的多级参与。最重要的发育相关过程包括胰岛素信号传导、脂肪酸生物合成、糖解、轴突引导、背腹轴形成和TGFβ信号传导(本文中的下表1)。

表1：在前4种KEGG途径中被富集的预测miRNA-132靶标。

胰岛素信号传导途径

计数：29，P值：0.002，Benjamini：0.035

为了比较这个模型与全脑miRNA-132过量的影响，利用在组成性H1启动子(也在脑中表达)下进行miRNA-132表达对小鼠进行工程改造。然而，H1-miRNA-132过量会中断正常的胚胎发育：在第E10.5天发现了4/76(5.2％)转基因胚胎和1/32(3.1％)吸收胚胎，但是截至第E14.5天和在P21时，58个胚胎和19个吸收胚胎或84个幼崽中没有转基因携带者。因此，miRNA-132全体过量与在第E10.5天与第E14.5天之间的存活率不相容，可能是由于其遏制缺口信号传导。

饲喂常规食物饮食(RCD)的两个独立品系的RtTA-miRNA-132小鼠表现出多西霉素加强性和年龄相关性体重增加，这与转基因的位置效果或性别无关并且还观察到脱靶多西霉素，但是以相当不明显的方式(图2A)。这两个和额外的pTRE-miRNA-132双重转基因品系还呈现出非常苍白的肝脏，而且组织学分析鉴定出小泡性和大泡性肝脏脂肪变性(图2B至图2D、图7F。肝脏甘油三酯增加(图2E)，但是血清和肝脏游离脂肪酸水平保持不变(图2F)。LDL/VLDL胆固醇增加，但是HDL水平保持(图2G)。流体室RT-PCR分析显示，pTRE-miRNA-132小鼠中的若干种促脂肪变性转录物(包括SREBP1c、FAS和APOB)显著升高。反之，许多抗脂肪变性转录物被下调，包括AOX、ABCA1、PGC1a、PEPCK、Cyp7a1和PPARa。(图2H)，表明miRNA-132的外周局限性过量会引发脑无关的肝脂肪变性并且减少脂解作用。

对miRNA-132的反义寡核苷酸遏制逆转肝脏高脂血症：已经发现转基因miRNA-132的外周过量诱导脂肪肝表型，本发明的诸位发明人接下来讨论内源miRNA-132过量是否因果性地涉及肝脏脂肪变性，并且如果是这样的话，那么遏制此过量是否会逆转肝脏脂肪变性。为了解决这些问题，使用饲喂高脂饮食方案11周的饮食诱导型肥胖(DIO)C57bl/6J小鼠。给这些小鼠注射与miR-132互补的基于16聚体LNA的寡核苷酸(抗miRNA-132，AM132；SEQID NO:7)(图3A)。与饲喂RCD的同窝对照相比，DIO小鼠的体重较重(图3B)。它们还表现出miRNA-132的肝脏水平升高6倍(图3C)，类似于胆汁淤积患者的肝脏miRNA-132升高³⁴。然而，其NAFFD和生物化学参数在静脉内AM132注射(3.3mg/kg，连续三天)后快速且令人印象深刻地降低。截至治疗后7天，DIO小鼠表现出肝脏miRNA-132水平大幅降低(图3D)，表明有效的体内miRNA-132敲低。肝脏大小和重量逐渐降低使所治疗的小鼠达到饲喂RCD的小鼠在治疗后7天至14天之间的值(代表性照片和定量在图3E、图3H、图3I中)。这些结果支持可使用假设，并且表明miRNA-132还因果性地涉及增肥非转基因小鼠的高脂血症。

小鼠中不存在³⁵并且不表现预测代谢相关小鼠靶标转录物的灵长类特有miRNA-608的对照抗miRNA-608(AM608)miRNA拮抗剂表现出与DDW治疗的小鼠类似的肝脏和肝脏重量、肝脏甘油三酯、LDL/VLDL和HDL值(图8A至图8C)，但存在非特异性寡核苷酸作用。相反，得自保持食用高脂饮食的经过AM132治疗的小鼠的肝脏切片的普通组织学和油性红O染色显示逐渐脂肪空泡清除，这由空泡在治疗后第5天较小和其在第7天至第14天完全不存在表示(图3F至图3I)。治疗还诱导肝脏甘油三酯减少，动力学性质与肝脏重量的动力学性质类似；在第7天至第14天达到饲喂RCD的小鼠的水平(图3K)。LDL/VLDL水平同样下降至饲喂RCD的小鼠的水平(图3L)，而HDL保持不变。而且，未治疗的饲喂RCD的小鼠和用AM132或对照LNA治疗的DIO小鼠都表现出类似的天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性，但经过LNA治疗的小鼠存在明显肝脏中毒(图8D)。相较之下，用AM132治疗的饲喂RCD的瘦型小鼠表现出无变化的正常肝脏和肝脏重量、AST活性、肝脏甘油三酯、LDL/VLDL和HDL(图9A至图9D)，表明了AM132治疗对NAFLD肝脏的特异性。可以推断，AM132选择性地减轻DIO小鼠的肝脏脂肪变性。

高脂饮食在DIO小鼠中诱导代谢综合征(MetS)，并且通过胰岛素经由磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT依赖性途径将miRNA-132靶标FoxO3灭活。为了研究miRNA-132是否还有助于MetS表型的这个方面，测量了AM132治疗对葡萄糖体内平衡的胰岛素调控的影响。截至AM132治疗后7天，DIO小鼠呈现出空腹血清胰岛素水平与对照组相比有所下降(1.55±0.17对比2.43±0.16ng/ml，图3M)。而且，其体内平衡模型评价(HOMA)指数与对照组相比减小(0.45±0.05对比0.74±0.05，图3N)，并且静脉内葡萄糖耐受性测试(GTT)显示血糖下降更快(图3O)；共同表明改善的胰岛素敏感性。尽管如此，截至治疗后10天，经过AM132治疗的小鼠表现出与对照小鼠类似的静脉内胰岛素耐受性测试(ITT)值和类似的空腹葡萄糖水平(图8E)。总体上，这些结果表明在其峰值有效时间，AM132通过降低胰岛素抗性而稍微改善了葡萄糖耐受性。

AM132以序列和剂量依赖性方式使miRNA-132靶标升高：为了解决AM132减少NAFLD标志的分子作用机制，使用流体室qRT-PCR测试(Fluidigm)对肝脏miRNA-132靶标转录物水平进行定量。FoxO3、Pten、Sirt1和Cyp2el都被上调(图4A)。截至治疗后7至14天，FoxO3、Pten、Sirt1和P300蛋白的水平还升高(图4B、图4C)。此外，AM132治疗后7天，抗脂肪变性ABCA1、AOX、PEPCK、PGC1a、Ehhadh、L-PK和FXR转录物升高，而粗脂肪变性GPAT和SREBP2转录物降低(图4D)。在一些情况下，AM132治疗完全逆转了在转基因pTRE-miRNA-132小鼠中观测到的转录物水平变化，证明了总体上增强的脂解作用和一定程度的脂肪形成减少。NAFLD标志在这种外周局限性AM132治疗下的全面逆转确定了肝脏miRNA-132因果性涉及NAFLD表型。

为了探测AM132的治疗窗口和化学组成，连续3天经静脉内给小鼠注射0.8、1.6和3.3mg/kg AM132的递增剂量或通过单次10mg/kg剂量。截至治疗后7天，小鼠呈现出肝脏和肝脏重量/体重的剂量依赖性减小，其中一天10mg/kg治疗与3天3.3mg/kg方案同样有效(图10A、图10B)。对于脂肪空泡清除率(图10C)、肝脏甘油三酯(图10D)和LDL/VLDL(图10E)同样观察到剂量依赖性，但对HDL却没有(图10F)。对2-O-甲基和完全硫代磷酸酯化骨架AM132寡核苷酸也实现了类似的治疗效果，诱导了与LNA化合物类似的肝脏重量、肝脏重量/体重和LDL/VLDL降低(图11A、图11B)。因此，AM132以序列和剂量依赖性方式操作，不管其特定化学结构如何。

在另一个实验中，给C57Bl/6小鼠饲喂高脂饮食11周，并且经静脉内注射AM132或对照物(10mg/kg，持续一天)。2周后，给这些小鼠再次注射相同的寡核苷酸和剂量。在第二次注射之后11天，将小鼠处死。经过AM132治疗的小鼠的肝脏重量和肝脏重量/体重显著降低，类似于单次注射AM-132的小鼠(图13A至图13B)。

直接敲低FoxO3和Pten模拟miRNA-132在DIO小鼠中的肝脏影响：

miRNA-132的外周过量可能通过水平在经过工程改造和增肥的小鼠中有所增加的那些miRNA-132靶标中的一个或若干个而潜在地诱导其肝脏后果。为了探测这些靶标中的每一个对脂肪变性发展的相对贡献，将9周高脂饮食后的DIO小鼠暴露于单次静脉内注射10mg/kg经LNA保护的FoxO3、Pten、P300或Sirt1的反义(AS)间隙聚体，这些都是选自若干个候选间隙聚体，通过在C2C12细胞中体外验证敲低效力与负对照间隙聚体相比较(图5A和图12A至图12D)。这种体内治疗也具有外周局限性和肝脏靶向性，因为注射的寡核苷酸倾向于积聚在肝脏中³³并且不能穿透血脑屏障⁴⁰。截至治疗后7天，DIO小鼠中的FoxO3和Pten敲低使肝脏重量/体重显著增加，而P300敲低使其减小并且Sirt1敲低未表现出差异(图5B)。用FoxO3-AS、Pten-AS、P300-AS和Sirt1-AS治疗的小鼠在肝脏切片的苏木精/伊红染色中分别显示出大泡性和小泡性脂肪变性、减少的空泡计数或没有可见变化(图5C)。FoxO3-AS和Pten-AS治疗进一步提高了所治疗的小鼠的LDL/VLDL水平；所有组的HDL水平保持不变(图5D)。肝脏甘油三酯表现出类似的倾向(图12E)。重要的是，敲低FoxO3由此使其水平降低78％还导致Pten和Sirt1水平降低；而且，Pten的37％敲低影响FoxO3达60％，这一水平低于Pten-AS本身，而且P300的33％敲低还减少FoxO3和Pten，然而引起有限的脂肪变性。Sirt1敲低34％不影响其他标靶(图5E)。这些发现支持FoxO3和Pten在肝脏脂肪变性中起关键作用的观点，而P300反向作用以限制这种病变。

AM132选择性地降低患有类家族性高脂血症的LDLR-/-小鼠的LDL/VLDL水平：家族性高胆固醇血症(FH)涉及由于LDL受体(LDLR)基因中的>1400种不同的突变中的一种而损害脂质体内平衡。FH患者往往偏瘦，其BMI无显著差异，却在各种组织中积聚有脂肪。为了确定AM132治疗是否可能对这种疾病也有价值，将具有遗传性高胆固醇血症和高LDL/VLDL水平的饲喂RCD的LDLR-/-小鼠暴露于3.3mg/kg AM132治疗连续3天(图6A)。截至治疗后7天，经过治疗的LDLR-/-小鼠表现出肝脏miRNA-132减少90％(图6B)、正常的肝脏和肝脏重量/体重(图6C)和肝脏LDL/VLDL水平降低但HDL水平不降低(图6D)。肝脏甘油三酯显示倾向于降低(图6E)，而miRNA-132靶标(图6F)和若干种代谢转录物升高(图6E)；表明治疗增强了脂解作用，这又引起LDL/VLDL产生减少^38,39。总而言之，这些发现表明，AM132介导的肝脏抗脂肪变性转录物增加可能对家族性高脂血症患者也是有益的。

虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是很明显，许多替代方案、修改和变更对于本领域技术人员将是显而易知的。因此，意图涵盖属于所附权利要求书的精神和广泛范围内的所有此类替代方案、修改和变更。

本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请在本文中都以全文引用的方式并入本说明书中，达到如同明确地并且单独地指出每一个单独出版物、专利或专利申请以引用的方式并入本文中的程度。另外，本申请中对任何参考文献的引用或鉴定都不应该被视为承认此参考文献可用作本发明的现有技术。在使用部分标题的程度上，其不应该被视为必然具有限制性。

序列表

<110> Yissum Research Development Company of the Hebrew

University of Jerusalem Ltd.

SOREQ, Hermona

HANIN, Geula

GREENBERG, David S.

<120> 为了治疗脂质相关病症而下调MIR-132

<130> 62677

<150> US 62/053,167

<151> 2014-09-21

<150> US 62/079,009

<151> 2014-11-13

<150> US 62/135,206

<151> 2015-03-19

<160> 11

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 1

ggaatcgcgg gcccagtgtc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 2

gggcggagaa tgggcggaac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 3

tactgtggga accggaggta 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 4

tgaaatttgt gatgctattg cttt 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 5

acagtctaca gccatggtcg c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单股DNA寡核苷酸

<400> 6

cgctctgtat ctgcccaaac c 21

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸miRNA拮抗剂

<400> 7

atggctgtag actgtt 16

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸miRNA拮抗剂

<400> 8

cgaccatggc tgtagactgt ta 22

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸miRNA拮抗剂

<400> 9

uaacagucua cagccauggu cg 22

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸miRNA拮抗剂

<400> 10

cgaccatggc tgtag 15

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸miRNA拮抗剂

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> 锁核酸(LNA) (2'-O-甲基)

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> 锁核酸(LNA) (2'-O-甲基)

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> 锁核酸(LNA) (2'-O-甲基)

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> 锁核酸(LNA) (2'-O-甲基)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> 锁核酸(LNA) (2'-O-甲基)

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> 锁核酸(LNA) (2'-O-甲基)

<400> 11

cgaccatggc tgtag 15

Claims

1.一种治疗有需要的受试者的脂肪性肝病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂，从而治疗所述脂肪性肝病。

2.一种治疗有需要的受试者的肥胖症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂，从而治疗所述受试者的所述肥胖症。

3.一种制品，所述制品包含与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂和抗脂质剂。

4.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂下调所述人miR-132的量。

5.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂下调所述人miR-132的活性。

6.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂是双股的。

7.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂是单股的。

8.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂包含如SEQ IDNO:8所示的核酸序列或其至少15个连续碱基。

9.如权利要求8所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂包含如SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:10所示的核酸序列。

10.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂的长度是至少12个核苷酸。

11.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂的长度是至少12至30个核苷酸。

12.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂包含选自以下的经修饰的核苷酸间键联：氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、烷基膦酸酯和亚甲基甲基亚胺基。

13.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂包含选自以下的经修饰的核酸单元：锁核酸单元、2'-O-烷基核糖核酸单元、2'胺核糖核酸单元、肽核酸单元、2'氟核糖核酸单元、吗啉代核酸单元、环己烷核酸单元和三环核酸单元。

14.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述核酸单元包含选自以下的经修饰的核酸单元：锁核酸单元、2'-O-甲基核糖核酸单元和2'O-甲氧基-乙基核糖核酸单元。

15.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂包含锁核酸、2'-O-甲基核糖核酸或混合的核酸-锁核酸。

16.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法或制品，其中所述多核苷酸剂的每一个核苷酸都是锁核酸。

17.如权利要求1或2所述的方法，其中所述施用每天实施一次。

18.如权利要求1或2所述的方法，其中所述施用每周实施一次。

19.如权利要求1或2所述的方法，其中所述施用每两周实施一次。

20.如权利要求1或2所述的方法，其中全身性施用所述多核苷酸剂。

21.如权利要求1、2或17至20中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸剂的剂量在每次施用1μg/kg体重至100mg/kg体重之间。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述多核苷酸剂的所述剂量在每次施用10μg/kg体重至100mg/kg体重之间。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸剂的所述剂量在每次施用100μg/kg体重至100mg/kg体重之间。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述多核苷酸剂的所述剂量在每次施用100μg/kg体重至10mg/kg体重之间。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述多核苷酸剂的所述剂量在每次施用1mg/kg体重至10mg/kg体重之间。

26.如权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者未患眼病。

27.如权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者未患神经退行性疾病。

28.如权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者未患癌症。

29.如权利要求1所述的方法，其中所述脂肪性肝病选自以下项：高甘油三酯血症、脂肪性肝炎、动脉粥样硬化和高胆固醇血症。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述高胆固醇血症是家族性高胆固醇血症。

31.一种与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂，所述多核苷酸剂用于治疗受试者的肥胖症。

32.一种与人miR-132的核苷酸序列基本上互补的多核苷酸剂，所述多核苷酸剂用于治疗受试者的脂肪性肝病。

33.一种治疗有需要的受试者的与体重减轻相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的人miR-132或其模拟物，从而治疗所述疾病。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述疾病选自以下项：癌症、甲状腺机能亢进症和厌食症。