CN106706924A - 一种油佐剂疫苗的竞争elisa定性定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，包括以下步骤：抗原包被、稀释抗体、抗原稀释、抗原标准曲线绘制及待检抗原的定量检测。本发明先将待检抗原与已知浓度的抗体先反应，抗体与抗原先完全中和；再随后将中和后的溶液与固相化吸附在ELISA板中的抗原反应，来测定待检抗原浓度。本发明得到的标准曲线斜率会大于常规间接竞争法，从而大大提高了检测灵敏度；且本发明检测广泛，可对合成肽抗原成品、半成品和疫苗抗原进行检测；而对于疫苗破乳后的水相样品，无需进行纯化处理即可进行测定，相比较其他检测方法花费时间较短；本发明的抗原样品的最低检测限度可达1ng/mL‑1.5ng/mL。
Description
技术领域
本发明涉及口蹄疫合成肽疫苗检测技术领域，具体涉及一种油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法。
背景技术
口蹄疫合成肽疫苗是一种通过人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成的保护性短肽。现有定量测定方法通常有Lowry法、BCA法、HPLC等方法。现有的定量方法中主要是针对纯化后的抗原，若用于疫苗破乳后抗原检测，由于疫苗水相成分较复杂，待检样品通常需要耗费大量时间纯化后才能达到检测目的，且很多常规方法检测灵敏度有限，无法达到检测要求。
酶联免疫吸附试验(ELISA)一起快速、方便、特异、可定量等优点，在很多领域中得到广泛应用。常规的间接竞争ELISA中，抗原与有限浓度的抗体同时加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中进行反应，抗体与游离的抗原、固相化的抗原结合率概率为50％，得到的结果绘制的标准曲线斜率较低，这使得检测灵敏度较低。不能很好的反应口蹄疫合成肽疫苗中有效抗原含量。
目前，对于口蹄疫合成肽抗原成品、半成品和疫苗抗原含量定量检测没有通用准确的方法。为了寻找更加快速，有效，方便的的检测方式，本发明人通过大量实验在常规间接竞争ELISA的基础上进行了改进。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，为一种抗原定量检测方法。通过对间接竞争ELISA方法的改进，先将抗原与有限浓度的抗体先在稀释板中反应，抗体与抗原先完全中和。在随后与固相化吸附有抗原的ELISA板中进行反应，造成固相化抗原、待测抗原与抗体结合的机会不均等。最终，得到的标准曲线斜率会大于常规间接竞争ELISA，从而大大提高检测灵敏度。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，包括以下步骤：
抗原包被：将0.5μg/mL-5μg/mL人工合成的口蹄疫抗原固相化吸附到ELISA板子上；
稀释抗体：将已知效价的抗体进行稀释，抗体稀释后效价为1:250000-1:1100000；
抗原稀释：在血清稀释板上，用稀释液将待检抗原稀释，标准抗原进行不同比例稀释形成不同浓度的标准抗原稀释液；
抗原标准曲线绘制及待检抗原的定量检测：将稀释好的待检抗原和不同浓度的标准抗原稀释液分别与稀释好的抗体在稀释板中进行完全反应，然后将各完全反应后的反应液分别加入到固相化抗原的ELISA板子中继续反应，反应结束后，各加入酶标记物、底物依次反应，再各加入终止液终止，测定OD值，采用不同浓度的标准抗原的对数值为横坐标，标准抗原的OD值为纵坐标绘制抗原标准曲线，然后将待检抗原的OD值带入标准曲线中算出待测对应抗原浓度，再乘以稀释倍数即为待测样品中抗原实际含量。
优选地，所述待检抗原最低检测限度为1ng/mL-1.5ng/mL。
优选地，抗原标准曲线绘制及待检抗原的定量检测步骤中，所述完全反应的时间大于等于60min，反应温度为37℃。该反应时间可尽可能的保证反应完全。
优选地，抗原标准曲线绘制及待检抗原的定量检测步骤中，所述各完全反应后的反应液分别加入到固相化抗原的ELISA板子中继续反应大于等于30min，反应温度为37℃。该反应时间若小于30min，会导致反应不彻底，最终OD值偏低，影响结果的准确性。
优选地，抗原标准曲线绘制及待检抗原的定量检测步骤中，所述酶标记物为SPA-HRP，或者为羊抗猪生物素-IgG和亲和素-HRP。
更优选地，所述酶标记物为羊抗猪生物素-IgG和亲和素-HRP。采用羊抗猪生物素-IgG和亲和素-HRP作为酶标记物，由于生物素亲和素之间高亲和力的牢固结合及多级放大效应，可使抗原的检测限更低。
优选地，所述稀释后酶标记物的用量为100μL，稀释比例为1:5000-1:10000。
优选地，所述底物为：TMB溶液。
优选地，所述终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
优选地，所述待检抗原为：口蹄疫合成肽疫苗经破乳后的水相抗原合成肽抗原成品或半成品中的一种。
本发明的原理是：将抗原与有限浓度的抗体先在稀释板中反应，待抗原抗体反应完全后，将反应液加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中进行反应，之后加入酶标记物进行反应，最后与底物显色进行检测。最终的检测结果表现为抗原浓度越高，显色后检测的OD值越低，成反比关系。将标准抗原进行不同比例稀释进行竞争ELISA检测绘制标准曲线，检测样品与标准曲线关联从而达到定量的要求。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1)本方法先将抗原与有限浓度的抗体先在稀释板中反应，抗体与待检抗原先完全中和，达到完全抑制的目的。在随后固相化吸附有抗原的ELISA板中，固相化抗原与抗体结合随之减少，使得固相化抗原、待测抗原与抗体结合机会不均等。因此，得到的标准曲线斜率会大于常规间接竞争法，从而大大提高检测灵敏度。
2)竞争抑制ELISA对试剂的要求非常少，不管是单抗还是多抗都可以用于实验，更重要的是不管被检对象是大分子物质还是多肽、小分子药物、小分子激素等只有一个表位的分子不能使用夹心ELISA的都可以使用竞争ELISA进行检测。
3)由于抗原抗体反应具有较高特异性，当抗原材料中的干扰物质不易去除，或不易得到足够的纯化抗原时，可用竞争法达到检测目的。同时反应抗体稀释后浓度较低，降低了非特异反应和交叉反应的干扰。
4)本方法可对合成肽抗原成品、半成品和合成肽疫苗抗原有效含量的定量检测，检测范围广。同时疫苗破乳后，水相成分较复杂，该方法简单，操作简便，破乳后水相样品无需进行纯化处理即可达到定量检测目的，相比较其他检测方法花费时间较短。
5)本发明采用间接法，利用很少量的酶可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色现象，使得抗原能在较低浓度下进行定量，灵敏度较高，且重复性好。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1的抗原标准曲线；
图2为实施例2的抗原标准曲线；
图3为对比例1的抗原标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，具体采用以下步骤：
1.抗原包被：将3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；
2.稀释抗体：将已知效价的抗体进行一定比例稀释，稀释后抗体效价为1:250000；
3.待检抗原(所述待检抗原为合成肽抗原成品，待检抗原采用HPLC方法测得其抗原浓度为39.25μg/mL)与标准抗原稀释：在血清稀释板上，用稀释液将待检抗原按1:100稀释，标准抗原分别按稀释后浓度为1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL进行稀释；
4.抗原抗体反应：在稀释板中，将100μL稀释好的待检抗原和标准抗原中分别加入等量稀释好的抗体并混匀，于37℃下孵育60min；
5.孵育结束后，将血清稀释板中的各反应液分别吸取100μL到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育30min；
6.孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μL1:10000稀释好的SPA-HRP，于37℃下孵育30min；
7.孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μLTMB溶液，于37℃下避光显色15min；
8.显色结束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH2SO4溶液终止反应，并于450nm波长下测定OD值；
9.根据测定的OD值，将各标准抗原浓度以10为底对数作为横坐标，各标准抗原测得的OD450为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线的回归方程为y＝-0.3609x+1.4572，如图1所示；将待检抗原的OD值带入标准曲线中算出待测对应抗原浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中抗原实际含量。本实施例中，测得待检抗原的OD值为0.525，计算得样品中抗原的实际含量为38.02μg/mL。该计算结果与采用HPLC方法测得的结果基本一致。
实施例2
本实施例提供了一种油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，具体采用以下步骤：
1.抗原包被：将3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；
2.稀释抗体：将已知效价的抗体进行一定比例稀释，稀释后抗体效价为1:1100000；
3.待检抗原(所述待检抗原为疫苗破乳后的水相样品，破乳效率为89.2％，经纯化后，采用HPLC方法测得其抗原浓度为148.83ng/mL)与标准抗原稀释：在血清稀释板上，将待检抗原用稀释液按1:100稀释，已知标准抗原进行稀释，稀释浓度分别为1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL；
4.抗原抗体反应：在稀释板中，将100μL稀释好的待检抗原和标准抗原中加入等量稀释好的抗体并混匀，于37℃下孵育60min；
5.孵育结束后，将血清稀释板中的反应液吸取100μL到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育30min；
6.孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μL1:10000稀释好的羊抗猪生物素-IgG，于37℃下孵育30min；
7.孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μL1:5000稀释好的亲和素-HRP，于37℃下孵育30min；
8.孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μLTMB溶液，于37℃下避光显色15min；
9.显色结束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH2SO4溶液终止反应，并于450nm波长下测定OD值；
10.根据测定的OD值，以标准抗原浓度以10为底对数作为横坐标，OD450为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线的回归方程为y＝-0.4021x+1.5186，如图2所示；将待检抗原的OD值带入标准曲线中算出待测对应抗原浓度，抗原实际含量＝[(对应抗原浓度×稀释倍数)/破乳效率]/2即为样品中抗原实际含量。本实施例中，测得待检抗原的OD值为1.350，计算得样品中抗原的实际含量为147.43ng/mL。该计算结果与采用HPLC方法测得的结果基本一致。
注：由于疫苗破乳后，油相与水相分离，水相中实际抗原浓度增大1倍，计算疫苗实际抗原浓度需除以2。
采用本实施例方法对该样品的10个平行样进行同时测定，其结果的波动范围在±0.80内，说明其重复性良好。
对比例1
本对比例提供了一种油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，包括以下步骤：
1.抗原包被：将3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；
2.稀释抗体：将已知效价的抗体进行一定比例稀释，稀释后抗体效价为1:250000；
3.待检抗原(所述待检抗原为合成肽抗原成品，待检抗原采用HPLC方法测得其抗原浓度为39.25μg/mL)与标准抗原稀释：在血清稀释板上，用稀释液将待检抗原按1:100稀释，已已知标准抗原进行稀释，稀释浓度分别为1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL；所述待检抗原与实施例1的待检抗原为相同样品；
4.抗原抗体反应：将稀释好的待检抗原和标准抗原中加入等量稀释好的抗体并混匀，取100μL加入到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育60min；
5.孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μL1:10000稀释好的SPA-HRP，于37℃下孵育30min；
6.孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μL底物溶液，于37℃下避光显色15min；
7.显色结束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH2SO4溶液终止反应，并于450nm波长下测定OD值；
8.根据测定的OD值，以标准抗原浓度以10为底对数作为横坐标，OD450为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线的回归方程为y＝-0.2787+1.3962，如图3所示；将待检抗原的OD值带入标准曲线中算出待测对应抗原浓度，再乘以稀释倍数即为样品中抗原实际含量。本实施例中，测得待检抗原的OD值为0.659，计算得样品中抗原的实际含量为44.67μg/mL。该计算结果与采用HPLC方法测得的结果相差了5.42μg/mL。因此，对比实施例1和对比例1的结果可知，采用本发明的方法测定的结果更准确。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
抗原包被：将0.5μg/mL-5μg/mL人工合成的口蹄疫抗原固相化吸附到ELISA板子上；
稀释抗体：将已知效价的抗体进行稀释，抗体稀释后效价为1:250000-1:1100000；
抗原稀释：在血清稀释板上，用稀释液将待检抗原稀释，标准抗原进行不同比例稀释形成不同浓度的标准抗原稀释液；
抗原标准曲线绘制及待检抗原的定量检测：将稀释好的待检抗原和不同浓度的标准抗原稀释液分别与稀释好的抗体在稀释板中进行完全反应，然后将各完全反应后的反应液分别加入到固相化抗原的ELISA板子中继续反应，反应结束后，各加入酶标记物、底物依次反应，再各加入终止液终止，测定OD值，采用不同浓度的标准抗原的对数值为横坐标，标准抗原的OD值为纵坐标绘制抗原标准曲线，然后将待检抗原的OD值带入标准曲线中算出待测对应抗原浓度，再乘以稀释倍数即为待测样品中抗原实际含量。
2.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，其特征在于，所述待检抗原的最低检测限度为1ng/mL-1.5ng/mL。
3.根据权利要求2所述的油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，其特征在于，抗原标准曲线绘制及待检抗原的定量检测步骤中，所述完全反应的时间大于等于60min，反应温度为37℃。
4.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，其特征在于，抗原标准曲线绘制及待检抗原的定量检测步骤中，所述各完全反应后的反应液分别加入到固相化抗原的ELISA板子中继续反应大于等于30min，反应温度为37℃。
5.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，其特征在于，抗原标准曲线绘制及待检抗原的定量检测步骤中，所述酶标记物为SPA-HRP，或者为羊抗猪生物素-IgG和亲和素-HRP。
6.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，其特征在于，所述稀释后酶标记物的用量为100μL，稀释比例为1:5000-1:10000。
7.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，其特征在于，所述待检抗原为：口蹄疫合成肽疫苗经破乳后的水相抗原、合成肽抗原成品或半成品中的一种。
8.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，其特征在于，所述底物为：TMB溶液。
9.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的竞争ELISA定性定量检测方法，其特征在于，所述终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
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